IDENTIFIKASI BAKTERI a.k.a PEWARNAAN BAKTERI

Apa itu pewarnaan?

Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri

tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah

untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga

berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri

melalui serangkaian pengecatan / Pewarnaan.

Tujuan Pewarnaan?

Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, maupun fungi.

Memperjelas ukuran dan bentuk jasad.

Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan struktur dalam jasad.

Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik dan

kimia dapat diketahui.

Faktor-Faktor Yang Mempengaruhi Pewarnaan?

Gelas alas Harus bersih dan bebas lemak, untuk itu saat kita memegang preparat,

kita pegang ujungnya karena kulit kita menghasilkan minyak.

Umur biakan 18 – 24 jam, kecuali kuman tahan asam seperti M. Tuberculosis

yang tumbuhnya sangat lambat. Kuman mengalami perubahan dalam morfologi dan

strukturnya, sehingga hasil yang diperoleh kurang tepat, bila menggunakan biakan

berumur lebih dari 24 jam.

Kualitas zat warna Ada zat warna yang harus dibuat sesaat sebelum dipakai dan

ada yang hanya dapat disimpan selama beberapa waktu. Dan ada warna yang tidak

boleh terkena sinar matahari.

Tebal / tipisnya sediaan Bila sediaan terlalu tebal atau tidak rata, maka penetrasi

zat akan berbeda-beda.

Cara Membuat Sediaan?

1. Pemeriksaan langsung

Pada pemeriksaan langsung , bakteri diperiksa dalam keadaan hidup. Kelebihan cara

ini adalah cepat, mudah, dan murah namun harus diperiksa segera dan tidak dapat

dibiarkan lama karena preparat akan cepat kering. Sediaan basah dilakukan dari bahan

pemeriksaan langsung, menggunakan KOH untuk jamur dan NaCl untuk melihat

bakteri dalam keadaan hidup. Cara ini juga dipakai untuk memeriksa gerak kuman

secara mikroskopik. Ada dua cara pemeriksaan mikroskopik yang biasa dilakukan,

yaitu :

a. Sediaan Basah

Caranya :

- ambil 1 ose biakan cair atau dari dari koloni yang disuspensikan pada larutan

NaCl fisiologis, lalu oleskan di atas gelas objek.

- tutuplah biakan tersebut dengan gelas penutup yang telah diolesi vaselin pada

bagian tepinya.

- segera periksa di bawah mikroskop dengan pembesaran 400x.

b. Tetes Gantung

Caranya :

- gunakan gelas objek cekung dan satu gelas penutup.

- tiap ujung gelas penutup diberi vaselin.

- lalu letakkan 1 ose suspensi bakteri ditengah-tengah gelas penutup.

- gelas objek cekung ditutupkan (ditelungkupkan) di atas gelas penutup

sehingga suspensi bakteri berada di antaranya.

- sediaan ini kemudian dipasang pada meja mikroskop dengan gelas penutup

berada di atasnya (dalam keadaan terbalik) sehingga posisi suspensi

tergantung

2. Pemeriksaan Umum

Suspensi kuman, yaitu satu tetes air garam faal diatas gelas alas ditambah biakan

kuman, disebar setipis mungkin sehingga membentuk lingkaran dengan diameter kira-

kira 1cm. Sediaan dibiarkan mengering di udara atau dapat dipercepat

pengeringannya dengan menghangatkan diatas api, kemudian direkat / difiksasi

dengan melewatkan diatas api 3x dan siap untuk diwarnai.

Macam-Macam Pewarnaan?

1. Pewarnaan Negatif (Background Staining)

- Tujuan

Mempelajari penggunaan prosedur pewarnaan negatif untuk mengamati

morfologi organisme yang sukar diwarnai oleh pewarna sederhana. Bakteri tidak

diwarnai, tapi mewarnai latar belakang. Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai,

seperti Spirochaeta.

- Cara pewarnaan negatif

Sediaan hapus Teteskan Emersi Lihat di mikroskop

Siapkan 2 objek glass yang bersih dan bebas lemak.

Letakkan setetes(kira-kira diameter 3 mm) tinta pada ujung kanan gelas benda

pertama.

Ambil bikan murni dengan menggunakan jarum ose secara aseptic dan campurkan

dengan tinta india tadi.

Gelas benda lainnya (gelas benda kedua) membentuk sudut 450 terhadap gelas

benda pertama sehingga cairan memenuhi area kontak lalu dorong dengan cepat

gelas benda kedua kea rah ujung kiri gelas benda kedua tipis merata.

Kering udarakan dan jangan di fiksasi.

Amatai preparat dengan perbesaran kuat dengan menggunakan minyak imersi.

Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai

latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan

transparan (tembus pandang).

Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada

pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan

bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang

sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan

cat nigrosin atau tinta cina.

Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau negrosin.

Pewarna asam memiliki negatif charge kromogen, tidak akan menembus atau

berpenetrasi ke dalam sel karena negative charge pada permukaan bakteri. Oleh

karena itu, sel tidak berwarna mudah dilihat dengan latar belakang berwarna.

2. Pewarnaan Sederhana

Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen / air fukhsin).

Tujuan : Hanya untuk melihat bentuk sel.

Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan.

Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat

dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri

hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi

dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka

akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana

umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif).

Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam

bahan pelarut. Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat

morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak digunakan

adalah : biru metilen (30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan fukhsin - karbol (5

detik).

3. Pewarnaan Differensial

a. Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram (+) Positif

Pewarnaan Gram (–) Negatif

- Pewarnaan Gram (+) Positif

- Pewarnaan Gram (–) Negatif

Tujuan:

Untuk mengamati bentuk sel dan membedakan garam negatif dan gram positif

Dasar teori:

Pewarnaan gram merupakan pewarnaan difrensial karena dapat di gunakan

untuk membedakan antara bakteri gram negatif dan gram positif. Pewarnaan ini sering

di gunakan untuk identifikasi dan klasifikasi bakteri.

Komposisi dinding sel bakteri gram positif berbeda dengan bakteri gram

negatif sehingga hasil pewarnaan gram akan berbeda.

Pewarnaan gram membutuhkan :

- Gram A (cat kristal violet sebagai cat utama),

- Gram B (lugol iodin sebagai mordan),

- Gram C (etanol : aseton = 1 : 1 sebagai peluntur), dan

- Gram D (cat safranin sebagai cat penutup).

Hasil reaksi pewarnaan Gram, yaitu :

- Bakteri Gram Positif akan berwarna Violet, sedangkan

- Bakteri Gram Negatif akan berwarna Merah.

Hasil pengamatan :

Providensia (gram negatif)

Bacillus (gram positif)

Faktor-faktor yang mempengaruhi hasil pengecatan gram:

- Fiksasi

Jika telalu lama maka dinding sel pecah sehingga yang harusnya gram positif akan

seperti gram negatif.

- Smear terlalu tebal

Gram negatif akan menjadi seperti gram positif.

- Waktu pengecatan tidak tepat

Jika gram C terlalu lama maka gram (+) akan seperti gram (-).

- Konsentrasi reagen

Gram A terlalu encer = Gram (+) Gram (-)

- Konsentrasi peluntur

Semua alkohol = terlalu lambat

Semua aseton = terlalu cepat

- Umur bakteri

Terlalu tua, autolisi = Gram (+) Gram (-)

- Medium

Asam = Gram (+) Gram (-)

Basa = Gram (-) Gram (+)

- Nutrisi

Jika kekurangan Gram (+) Gram (-)

PERBEDAAN GRAM POSTIF

(biru)

GRAM NEGATIF

(merah)

Kadar peptidoglikan Tebal Tipis

Kadar lipid 1-4 % 11-22%

Resistensi terhadap alkali (1%

KOH)

Tidak larut Larut

Kepekaan terhadap iodium Lebih peka Kurang peka

Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotksin

Resistensi terhadap tellurit Lebih tahan Lebih peka

Sifat tahan asam Ada yang tahan asam Tidak ada

Kepekaan terhadap penisilin Labih peka Kurang peka

Kepekaan terhadap streptomisin Tidak peka Peka

b. Pewarnaan Tahan Asam

Pewarnaan ini adalah segolongan bakteri yang sulit diwarnai, tetapi sekali  diwarnai

sulit dihapus. Dinding  sel bakteri tahan asam terdiri dari peptidogikan, arabinogalaktan, dan

lipid, dimana 50% dari lipid ini terdiri dari asam nikolat.

Bakteri ini dimasukkan kedalam golongan mikrobacterium yang sebagian besar

bersifat satprofit, dikenal juga golongan atipik , sebagian kecil pathogen bagi manusia yaitu

Mycrobaterrium tuberculosis dan Mycrobacterium leprae. Bakteri genus mycobacterium dan

beberapa spesies nocardia pada dinding selnya mengandung banyak zat lipoid (lemak)

sehingga bersifat permiable dengan pewarnaan biasa. Bakteri tersebut bersifat tahan asam (+)

terhadapa pewarnaan tahan asam. Pewarnaan tahan asam dapat digunakan untuk membantu

menegakkan diagnosa tuberkulosis.

Dari pewarnaan BTA dapat dibedakan 2, yaitu  golongan bakteri tahan asam  yang

akan tetap mengikat zat pewarnaan primer (karbofuksin) dan tidak akan dilepas pada

pencucian alkoholm asam, serta tidak akan mengikat zat warna sekunder ( metilen blue),

sedangkan bakteri tidak  tahan asam akan melepaskan zat warna  primer pada pencucian

alcohol asam  dan akan mengikat zat warna  sekunder. 

Ada beberapa  cara  mewarnai bakteri tahan asam yaitu, menurut Ziehl-Neelseen,

menurut Tan Thiam Hok (1957) yang disebut juga pewarnaan Kinyoun Gabelt, serta

pewarnaan dengan AURAMEN-PHENOL FLUORCHROME.

Pewarnaan Ziehl-Neelsen

Cara Pewarnaan :

Pewarnaan tahan asam menggunakan larutan :

o Ziehl-Neelsen A (cat karbol fuchsin),

o Ziehl-Neelsen B (alkohol asam :HCL 3% dalam metanol 95%), dan

o Ziehl-Neelsen C (cat biru metilen).

Buat sediaan dari sputum dengan cara, bersihkan kaca benda  hingga bebas dari

lemak, bakar ose hingga pijar dan tunggu dingin sejenak, ambil sputum dengan ose

kemudian oleskan diatas kaca benda hingga didapat usapan yang rata dan tipis,

tunggu dan keringkan dan difiksasi diatas api. Ose setelah digunakan dibakar lagi

hingga pajar.

Tuangi sediaan dengan karbol fuksin hingga tergenang, kemudian panaskan  diatas

api  kecil sampai keluar asap lalu tunggu selama 5 menit 

Cuci dengan air mengalir

Celupkan kedalam H2SO4 selama 2 detik untuk kuman M. Leprae.

Celukan kedalam alcohol  60% sehingga tidak ada lagi zat warna merah yang larut.

Tuangi preparat dengan methylen blue selama 1-2 menit.

Cuci dengan air mengalir keringkan tetesi minyal imaersi dan amati dengan

mikroskop pembesaran 10 X 100

Pewarnaan Kinyoun Gabbet atau Tan Thiam Hok

Buat sediaan sputum dan rekatkan.

Sediaan dituangi larutan Kinyoun dan dibiarkan selama 3 menit.

Dicuci dengan air mengalir.

Preparat dituangi larutan Gabbet dan dibiarkan selama 1 menit.

Cuci dengan air mengalir  lalu amati dengan mikroskop dengan pembesaran 10 X 100

Hasil pengamatan :

Hasil pewarnaan :

Bakteri tahan asam akan berwarna merah, dan

Bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru.

Perbandingan antara Ziehl Neelsen & Kinyoun-Gabbet

Dimana pada Kinyoun-Gabbet adalah : Pada zat warna primer / utama, kuman tidak

diberikan jeda/ruang untuk dapat memproses BTA mengambil warna merah.

             Kemudian Kinyoun-Gabbet  komposisi zat warna fenol kembali pada posisi

semula/dingin/ membeku (walaupun pada proses pembuatan reagen Kinyoun, Fenol

dipanaskan terlebih dahulu) sehingga zat warna tidak cepat meresap masuk ke dinding

bakteri, sehingga pada saat pembuangan dan pembilasan dengan air mengalir itulah

bakterinya belum sepenuhnya merah.

             Pada zat warna pembanding / kedua, tidak dapat menghasilkan latar yang bagus oleh

karena zat warna primer belum terlalu bersih pada proses pencucian sehingga menimbulkan

penimpaan/bertumpuk (merah ditambah biru menghasilkan warna ungu).

             Dan pada komposisi zat warna antara methylen blue dan alkohol absolut juga asam

sulfatnya tidak pisah, sehingga tidak memberikan ketegasan antara zat warna primer dan zat

warna pembandingnya.

             Dari penjabaran diatas tentang Kinyoun-Gabbet tersebut di atas bila dibandingkan

dengan perbedaan kedua metode, maka Ziehl Neelsen secara pewarnaan lebih baik, walaupun

tidak memberikan pengaruh yang signifikan pada hasil kuman yang diperoleh dari pewarnaan

Kinyoun-Gabbet.

            Kelemahan dan Kelebihan Pewarnaan Kinyoun-Gabbet antara lain adalah: latar

belakang berwarna ungu dan buram, basil kurang merah, lekosit ungu, reagen jarang

dijumpai karena itu mahal harganya, komposisi dari fenol kristal/bubuk murni dan pada saat

pembuatan reagen sebelum proses homogenisasi zat warna primer denagn carbol fuchsin

dipanaskan/dilelehkan pada penangas atau autoclaf, dan terakhir pada proses pewarnaan lebih

mudah, cepat dan praktis.

            Adapun kelemahan dan kelebihan Ziehl Neelsen yakni: latar belakang berwarna biru

terang, basil merah jelas, reagen terjangkau dan mudah didapat, fenol diencerkan 5% dan

tidak dipanaskan karena pemanasan dilakukan pada proses pewarnaan sedian zat warna

utama maka dari itu agak lama waktu yang dibutuhkan.

4. Pewarnaan Khusus (Special Staining)

Flagel

Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak stabil,

sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.

Kapsul

Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai

pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air

dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang. Yang

berwana biru gelap.

Ada beberapa metode pengecatan kapsul, diantaranya :

1. Metode Buri

Yang dipakai : Nigrosin, Methilene Blue.

2. Metode Hiss

Yang dipakai : Basic Fucsin (dengan  pencuci alcohol).

3. Metode Welch

Yang dipakai : Carbol Fuchsin (dengan pencuci NaCl).

4. Metode Antony

Yang dipakai : Cristal violet (dengan pencuci CuSO4).

Tujuan :

Untuk mengetahui adanya kapsul pada bakteri

Hasil Pengamatandan Cara Kerja :

Spora

Spora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan

teknik pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling banyak

digunakan.

Endospora sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk pewarnaan endspores, perlu

dilakukan pemanasan supaya cat malachite hijau  bisa masuk ke dalam spora, seperti halnya

pada pewarnaan  Basil Tahan Asam dimana cat  carbol   fuschsin  harus dipanaskan untuk

bisa menembus  lapisan lilin asam mycolic  dari Mycobacterium.

Prinsip kerja :

Spora kuman mempunyai dinding yang tebal sehingga diperlukan pemanasan agar

pori-pori membesar zat warna fuchsin dapat masuk, dengan pencucian pori-pori kembali

mengecil menyebabkan zat warna fuchsin tidak dapat dilepas walaupun dilunturkan dengan

asam alkohol, sedangkan pada badan bakteri warna fuchsin dilepaskan dan mengambil warna

biru dari methylen blue.

Cara Kerja :

Dibuat suspensi kuman, ditambah dengan carbol fuchsin sama banyak.

Dipanaskan selama 6 menit pada api kecil atau pada pemangas air 80C selama 10

menit.

Dibuat sediaan dan dikeringkan.

Dimasukkan kedalam H2SO4 1% selama 2 detik.

Dimasukkan kedalam alkohol sehingga tidak ada lagi warna merah mengalir.

Sediaan dicuci dengan air.

Diwarnai dengan methylen blue selama 1 menit kemudian dicuci dan dikeringkan.

Diperiksa dibawah mikroskop.