IDENTIFIKASI MOLEKULER GEN CYTOCHROME OXIDASE

SUBUNIT I (COI) LOBSTER GENUS Panulirus

DI YOGYAKARTA:

SEBAGAI DASAR PENGELOLAAN SUMBERDAYA

WIDY TRIAPRILYANTI

DEPARTEMEN MANAJEMEN SUMBERDAYA PERAIRAN

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2016

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN

SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Identifikasi Molekuler

Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) Lobster Genus Panulirus di

Yogyakarta: sebagai Dasar Pengelolaan Sumberdaya adalah benar merupakan

hasil karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan

dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang

berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari

penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di

bagian akhir skripsi ini.

Bogor, Agustus 2016

Widy Triaprilyanti

NIM C24120051

ABSTRAK

WIDY TRIAPRILYANTI. Identifikasi Molekuler Gen Cytochrome Oxidase

Subunit I (COI) Lobster Genus Panulirus di Yogyakarta: sebagai Dasar

Pengelolaan Sumberdaya. Dibimbing oleh NURLISA A BUTET dan

MAJARIANA KRISANTI.

Panulirus homarus (lobster pasir) dan Panulirus penicillatus (lobster batu)

adalah jenis dari crustase laut yang termasuk dalam genus Panulirus Penelitian

ini bertujuan untuk mengidentifikasi lobster genus Panulirus berdasarkan marka

genetik Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) yang dapat membantu

pengungkapan terjadinya fenomena spesies kriptik sebagai informasi dasar dalam

pengelolaan sumberdaya yang akurat. Tahap isolasi dan ekstraksi DNA

menghasilkan dua DNA total yang baik untuk diamplifikasi dengan PCR hingga

tahap sekuensing gen COI. Gen COI P. homarus dan P. penicillatus disejajarkan

dengan beberapa gen COI spesies lain, yaitu genus Palinurus sebagai outgroup

yang didapatkan dari GenBank hingga menghasilkan pohon filogeni dan

membuktikan perbedaan yang jelas antara genus Panulirus dengan genus

Palinurus. Panulirus homarus and Panulirus penicillatus memiliki perbedaan

yang signifikan dari spesies Palinurus. Kedua spesies tersebut berbeda secara

signifikan berdasarkan gen COI.

Kata kunci: Panulirus homarus, Panulirus penicillatus, gen COI, identifikasi

molekuler

ABSTRACT

WIDY TRIAPRILYANTI. Molecular Identification Gene Cytochrome Oxidase

Subunit I (COI) of Lobster Genus Panulirus in Yogyakarta: As The Basis of

Resources Management. Supervised by NURLISA A BUTET and MAJARIANA

KRISANTI.

Panulirus homarus and Panulirus penicillatus are species of marine

crustase included in the genus Panulirus. This research was aimed at identifying

Panulirus lobster based on Cytochrome Oxidase Subunit genetic I (COI) marker

to support for accurate the existence of the species cryptic phenomenon as basic

information in resource management accurately. Isolation and extraction DNA

steps produced two DNA total which was good for amplification using PCR

technique. P. homarus and P. penicillatus COI genes were aligned with some of

the other species, i.e., COI gene of the genus Palinurus as outgroup acquired from

GenBank and to produce a phylogeny tree distinction for genus Panulirus.

Panulirus homarus and Panulirus penicillatus were significantly different from

Palinurus species. The two former spesies were also significantly distinct due to

partial COI gene.

Keywords: Panulirus homarus, Panulirus penicillatus, gene COI, molecular

identification

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Perikanan

pada

Departemen Manajemen Sumberdaya Perairan

IDENTIFIKASI MOLEKULER GEN CYTOCHROME OXIDASE

SUBUNIT I (COI) LOBSTER GENUS Panulirus

DI YOGYAKARTA:

SEBAGAI DASAR PENGELOLAAN SUMBERDAYA

WIDY TRIAPRILYANTI

DEPARTEMEN MANAJEMEN SUMBERDAYA PERAIRAN

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2016

PRAKATA

Puji dan syukur Penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala rahmat

dan hidayah-Nya sehingga Penulis dapat menyelesaikan kegiatan penelitian serta

penyusunan karya ilmiah ini dengan judul Identifikasi Molekuler Gen

Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) Lobster Genus Panulirus di Yogyakarta:

sebagai Dasar Pengelolaan Sumberdaya. Skripsi ini disusun sebagai salah satu

syarat untuk menyelesaikan studi di Departemen Manajemen Sumberdaya

Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Penulis

menyampaikan terimakasih kepada:

1 Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya.

2 Institut Pertanian Bogor yang telah memberikan kesempatan untuk studi.

3 Beasiswa BIDIK MISI yang telah memberikan dana pendidikan perkuliahan.

4 Beasiswa POKJA AMANAH yang telah memberikan dana pendidikan

perkuliahan.

5 Direktur Jenderal Pendidikan Tinggi, Kementrian Pendidikan dan

Kebudayaan atas biaya penelitian melalui biaya Operasional Perguruan

Tinggi Negeri (BOPTN), Anggaran Pendapatan Belanja Negara (APBN),

DIPA IPB Tahun Ajaran 2015 no. 083/SP2H/PL/Dit.Litabmas/11/2015

Penelitian Dasar untuk Bagian, Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi, IPB

dengan judul “Analisis Populasi Lobster Panulirus spp. di Perairan Selatan

Jawa dalam Menunjang Implementasi Pengelolaan Perikanan Lobster

Berbasis Ekosistem” yang dilaksanakan oleh Dr Ir Yusli Wardiatno, MSc

(sebagai ketua peneliti) dan Dr Ir Nurlisa A Butet, MSc, Dr Ir Luky Adrianto,

MSc, Ali Mashar, SPi MSi (sebagai anggota peneliti).

6 Dr Ir Achmad Fahrudin, MSi sebagai Pembimbing Akademik.

7 Dr Ir Nurlisa A Butet, MSc sebagai ketua komisi pembimbing dan Dr

Majariana Krisanti, SPi MSi sebagai anggota komisi pembimbing yang telah

memberikan arahan, masukan serta bimbingan dalam penulisan skripsi ini.

8 Dr Ali Mashar, SPi MSi selaku penguji luar komisi pembimbing dan Dr Ir

Niken Tunjung Murti Pratiwi, MSi selaku perwakilan Komisi Pendidikan

Departemen Manajemen Sumberdaya Perairan.

9 Staf Tata Usaha Departemen Manajemen Sumberdaya Perairan.

10 Agus A Hakim, SPi MSi dan Yuyun Qonita, SPi MSi sebagai pembimbing

laboratorium Biologi Molekuler yang telah memberikan arahan dan masukan.

11 Keluarga: Ibu Wardiah, Bapak Bardiarza, Dian A, Septian N yang telah

memberikan dukungan serta Doa.

12 Sahabat Terbaik: Muggy SM, Ditta AA, Fanisa M, Nurlia A, Budi N, Risna

RS, Nefi I, Agustiani PN, Rahmah S, Lisa M Br P, Yuli FN, Diah S, Endah

SR, Ulfanida R, MSP 49, MSP 50, dan MSP 48.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Agustus 2016

Widy Triaprilyanti

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL ix DAFTAR GAMBAR ix

DAFTAR TABEL x

PENDAHULUAN 1 Latar Belakang 1 Perumusan Masalah 2 Manfaat Penelitian 2

METODE 2 Waktu dan Lokasi 2

Prosedur penelitian 3 Analisis Data 4

HASIL DAN PEMBAHASAN 5 Hasil 5 Pembahasan 8

KESIMPULAN DAN SARAN 10 Kesimpulan 10 Saran 10

DAFTAR PUSTAKA 10 RIWAYAT HIDUP 12

DAFTAR TABEL

Matriks jarak genetik fragmen gen COI pada Panulirus homarus,

Panulirus penicillatus, Palinurus elephas (DQ062206.1), dan

Palinurus mauritanicus (DQ062207.1) berdasarkan metode pairwise

distance 7

DAFTAR GAMBAR

1 Spesies contoh lobster P. homarus (contoh 1) dan P. penicillatus

(contoh 2) 5

2 Hasil pengujian isolasi DNA total otot kaki P. homarus (contoh 1) dan

P. penicillatus (contoh 2) pada gel agarosa 1,2% 5

3 Elektroforesis DNA hasil produk PCR pada gel agarosa 1%, marker 1

kb, P. homarus (contoh 1) dan P. penicillatus (contoh 2) 6 4 Hasil rekonstruksi pohon filogeni gen COI dari dua jenis contoh dan

dua spesies pembanding menggunakan metode NJ dengan bootsrap

1000 7

DAFTAR ISTILAH

BLASTn : (Basic Local Alignment Search Tool-nucleotide) pilihan

menu dari situs NCBI (National Center for Biotechnology

Information) yang digunakan untuk memastikan

kebenaran suatu spesies dan mengetahui kedekatan

dengan spesies lain.

Conserve : urutan basa nukleotida yang dipertahankan dalam jangka

waktu yang sangat panjang pada suatu spesies.

basa nukleotida yang bersifat tetap dari setiap spesies

dalam satu situs hasil pensejajaran.

DNA barcoding : sistem yang dirancang untuk melakukan identifikasi

secara cepat dan akurat berdasarkan urutan basa

nukleotida dari gen penanda pendek yang telah

terstandarisasi.

GenBank

:

situs NCBI yang memuat informasi dasar mengenai

bioteknologi (termasuk informasi dasar DNA).

Sekuensing

: Sebuah prosedur untuk menentukan urutan basa

nukleotida dalam contoh DNA yang berguna untuk

identifikasi.

Spesies kriptik

:

dua atau lebih spesies yang berbeda diklasifikasikan

dalam satu nama spesies akibat karakteristik morfologi

yang samar.

Singleton : satu basa nukleotida yang berbeda dari spesies lain dalam

satu situs hasil pensejajaran.

Variable : basa nukleotida yang berbeda dari setiap spesies dalam

satu situs dari hasil pensejajaran yang merupakan ciri

khusus spesies.

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Udang barong (Spiny lobster) disebut juga udang karang karena hidup di

batu-batu karang dan dasar laut yang berpasir halus (Windyarto 2000). Udang

karang atau lobster merupakan salah satu komoditas yang memiliki nilai

ekonomis tinggi, baik untuk pasar dalam negeri maupun luar negeri. Daerah

penyebaran lobster meliputi daerah berbatu karang, pasir berbatu, karang halus,

dan tempat-tempat berbatu karang yang tidak jauh dari pantai, pulau, dan teluk

(Utami 1999). Lobster genus Panulirus yang terdapat di Indonesia ada tujuh

jenis, yaitu Panulirus versicolor (lobster bambu), Panulirus penicillatus (lobster

batu), Panulirus longipes (lobster batik), Panulirus homarus (lobster pasir),

Panulirus ornatus (lobster mutiara) (Windyarto 2000), Panulirus polyphagus

(lobster pakistan) (Moosa 1984), Panulirus femoristriga (lobster batik) (Chan dan

Ng 2001). Genus Panulirus memiliki keragaman paling besar dari famili

Palinuridae (Abdullah 2009).

Genus Panulirus telah lama menjadi objek menarik para peneliti dunia

disebabkan oleh tingginya keragaman spesies, daerah penyebaran yang luas, dan

juga nilai ekonominya yang tinggi (Junaidi et al. 2010). Penyebaran udang

karang di Indonesia banyak terdapat di perairan Selatan Pulau Jawa, Pulau

Sulawesi, Ambon dan Pulau Sumatera (Nawangwulan 2001). Daerah penghasil

lobster di Pulau Jawa yang potensial salah satunya adalah di perairan Selatan

Yogyakarta (Fauzi et al. 2013). Pada saat penangkapan dan pemanfaatan lobster

di daerah tersebut melibatkan nelayan setempat. Agar pemanfaatan sumberdaya

lobster di perairan ini tetap lestari maka perlu dilakukan pengelolaan yang rasional

dengan mempertimbangkan masukan dari aspek biologi.

Penelitian mengenai udang barong atau udang karang di Indonesia telah

banyak dilakukan meliputi hubungan panjang-berat (Fauzi et al. 2013), tingkat

pemanfaatan (Utami 1999), genetika molekuler (Abdullah 2009), dan ciri

morfologi (Yusnaini et al. 2009). Penelitian mengenai genus Panulirus belum

banyak dilakukan terutama mengenai keragaman genetik. Oleh karena itu

diperlukan metode yang akurat dalam mengidentifikasi spesies. Pengetahuan

dasar mengenai keragaman populasi genetik diperlukan sebagai acuan dalam

pengelolaan sumberdaya perikanan.

Salah satu teknik identifikasi molekuler yang populer yang dapat digunakan

adalah teknik DNA barcoding. Teknik DNA barcoding dapat digunakan dalam

identifikasi suatu organisme mulai spesies hingga subspesies yang dilakukan

secara akurat terhadap berbagai spesies yang sulit untuk dibedakan secara

morfologi (Tudge 2000). DNA barcoding adalah suatu sistem yang dirancang

untuk identifikasi spesies secara cepat dan akurat sebagai penanda spesies (Hebert

et al. 2005). Sumber DNA pada hewan eukariot terbagi atas DNA inti dan DNA

mitokondria. Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) merupakan bagian dari

DNA mitokondria yang sering digunakan untuk barcoding spesies maupun

subspesies. Menurut Avise et al. (1987) menyatakan bahwa hubungan

kekerabatan dapat dianalisis secara filogenik menggunakan DNA mitokondria.

1

2

Perumusan Masalah

Indonesia memiliki potensi yang besar untuk mengembangkan udang

karang, namun pengembangan dan pemanfaatan genus Panulirus belum banyak

dilakukan di Indonesia. Tahap identifikasi merupakan tahap awal yang penting

untuk kepastian taksonomi spesies. Kepastian taksonomi (taxonomy certainty)

sangat diperlukan dalam menentukan pengelolaan dan konservasi suatu

sumberdaya hayati. Pendekatan molekuler menjadi salah satu cara untuk

mengatasi masalah tersebut. DNA barcoding merupakan salah satu metode untuk

mengidentifikasi spesies secara cepat dan akurat, dengan menggunakan fragmen

sekuen nukleotida.

Salah satu habitat udang karang ditemukan di Yogyakarta yang terletak di

perairan Selatan Jawa. Penentuan klasifikasi genus Panulirus berdasarkan

karakteristik morfologi pernah mengalami ketidakpastian karena fenomena

spesies kriptik yang banyak terjadi pada hewan-hewan akuatik. Oleh sebab itu,

teknik identifikasi yang lebih akurat sangat diperlukan, diantaranya identifikasi

berdasarkan marka molekuler. Teknik identifikasi yang digunakan adalah teknik

DNA barcoding untuk mengetahui situs nukleotida spesifik yang menjadi

pembeda antarspesies di dalam genus Panulirus yang mendiami perairan Selatan

Yogyakarta. Penggunaan marka molekuler ini mampu mengungkap fenomena

spesies kriptik, sehingga pengelolaan sumberdaya genus Panulirus dapat

diterapkan dengan tepat.

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi lobster genus Panulirus

berdasarkan marka genetik Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) yang dapat

membantu pengungkapan terjadinya fenomena spesies kriptik sebagai informasi

dasar dalam pengelolaan sumberdaya yang akurat.

Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai kepastian

spesies dari genus Panulirus yang terdapat di perairan Selatan Yogyakarta

berdasarkan marka genetik Cytochrome Oxidase Subunit I (COI).

METODE

Waktu dan Lokasi

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Oktober 2015 hingga Februari 2016.

Pengambilan contoh dilakukan di perairan Selatan Yogyakarta dan analisis di

Laboratorium Biologi Molekuler Departemen Manajemen Sumberdaya Perairan

3

dan Laboratorium Terpadu Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut

Pertanian Bogor.

Prosedur Penelitian

Pengambilan contoh

Spesies contoh genus Panulirus adalah koleksi laboratorium yang diperoleh

dari pengumpul di perairan Selatan Yogyakarta. Spesies yang diperoleh sebanyak

lima spesies yaitu P. versicolor, P. penicillatus, P. longipes, P. homarus, dan P.

ornatus. Spesies tersebut telah diawetkan bagian daging atau otot kaki kemudian

dimasukkan ke dalam tabung koleksi berukuran 100 mL yang berisi alkohol 96%,

proses ini merupakan proses pengawetan dari lobster Panulirus spp. agar contoh

yang akan digunakan untuk proses selanjutnya tidak rusak.

Isolasi dan ekstraksi DNA

Isolasi dan ekstraksi DNA dilakukan terhadap daging dan otot kaki lobster

Panulirus spp. yang telah diawetkan dalam alkohol 96%. Spesies contoh yang

telah diawetkan tersebut ditimbang dengan berat otot 30 mg, dicuci menggunakan

akuades, dan divortex sebanyak 10 kali. Kemudian contoh dikeringkan dan

dimasukkan ke dalam microtube untuk selanjutnya dilakukan proses isolasi dan

ekstraksi DNA. Bahan isolasi dan ekstraksi DNA ini menggunakan kit komersil

(Gene Aid). Prosedur isolasi dan ekstraksi mengikuti instruksi dari manual pabrik

dengan beberapa modifikasi.

Uji kualitas DNA

Pengujian kualitas DNA dilakukan dengan metode elektroforesis

menggunakan gel agarosa 1,2% yang telah diwarnai dengan ethidium bromide

(EtBr), direndam dalam larutan buffer TAE 1x (40 mM Tris-asetat, 1 mM EDTA)

kemudian dialiri listrik 100 volt selama 30 menit. Penggunaan EtBr bertujuan

untuk memberikan warna pada DNA, sehingga pita DNA dapat terlihat saat

dilakukan visualisasi dibawah sinar UV. Volume DNA total yang digunakan

adalah sebanyak 2,5 μl. Gel agarosa kemudian diamati dibawah sinar UV. DNA

total dengan kualitas baik akan memiliki pita DNA yang tebal saat

divisualisasikan di bawah sinar UV.

Amplifikasi DNA dengan metode PCR

Amplifikasi DNA dilakukan dengan metode PCR (Polymerase Chain

Reaction) menggunakan kit komersial Kapa Extra Hot Start. Fragmen DNA yang

diamplifikasi adalah gen COI. Primer yang digunakan adalah primer universal

yang didesain oleh Butet (2013, unpublish data) untuk beberapa biota akuatik.

Amplifikasi DNA dilakukan dalam beberapa tahap, yaitu predenaturasi pada suhu

95 oC selama 3 menit, denaturasi pada suhu 95

oC selama 1 menit, annealing pada

suhu 52 oC selama 1 menit, elongasi pada suhu 72

oC selama 1 menit, post-

elongasi pada suhu 72 oC selama 5 menit, dan penyimpanan pada suhu 15

oC

selama 10 menit.

4

Sekuensing DNA gen marka genetik COI Produk PCR yang memiliki kualitas DNA yang baik dapat dilanjutkan ke

tahap sekuensing atau pembacaan sekuens DNA untuk selanjutnya ditentukan

sekuen basa nukleotida. Proses produk PCR dilakukan dengan menggunakan

metode Sanger (1977) dengan mengirimkan produk PCR tersebut ke perusahaan

jasa pelayanan sekuensing.

Analisis Data

Validasi spesies

Hasil sekuensing data kromatogram berupa urutan basa nukleotida gen COI

pada genus Panulirus divalidasi menggunakan BLASTn (National Center for

Biotechnology Information) dan disejajarkan dengan spesies lain dari GenBank.

Identifikasi molekuler dari genus Panulirus dengan menggunakan sekuen gen

COI telah dipastikan kebenaran dan kedekatannya antarspesies berdasarkan

BLASTn.

Pensejajaran genus Panulirus gen COI lobster genus Panulirus

Hasil sekuensing diedit secara manual untuk mendapatkan urutan basa

nukleotida gen COI dari genus Panulirus. Urutan basa nukleotida genus

Panulirus kemudian akan disejajarkan dengan spesies lainnya menggunakan

metode Clustal W pada software MEGA 5.2 (Tamura et al. 2011). Hasil sekuen

nukleotida gen COI genus Panulirus diedit dan dianalisis untuk mendapatkan

sekuen DNA dari gen COI tersebut.

Jarak genetik

Jarak genetik sekuen gen COI antarspesies Panulirus spp. dihitung

menggunakan metode pairwise distance yang terdapat pada program MEGA 5.2

(Tamura et al. 2011). Hasil Penghitungan jarak genetik disajikan dalam bentuk

matriks data yang digunakan untuk melakukan analisis hubungan kekerabatan

antarspesies berdasarkan pohon filogeni.

Analisis filogeni Pohon filogeni dikonstruksi berdasarkan jarak genetik antarspesies.

Konstruksi pohon filogeni berfungsi untuk mengetahui hubungan kekerabatan

antarspesies. Analisis filogeni dilakukan menggunakan metode bootstrapped

Neighbour Joining Tree dengan 1000 kali pengulangan pada software MEGA 5.2

(Tamura et al. 2011).

5

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil

DNA total

Isolasi dan ekstraksi DNA P. homarus dan P. penicillatus (Gambar 1)

merupakan contoh koleksi laboratorium yang berasal dari perairan Selatan

Yogyakarta. Hasil isolasi dan ekstraksi DNA P. homarus dan P. penicillatus

menghasilkan kualitas DNA yang cukup baik.

Contoh 1 Contoh 2

Gambar 1 Spesies contoh lobster P. homarus (contoh 1) dan P. penicillatus

(contoh 2)

Kualitas DNA yang baik dapat ditentukan melalui pengujian terhadap DNA

total pada agarosa 1,2%. Adanya pita DNA yang tebal dan terang merupakan

hasil kualitas DNA total yang baik (Gambar 2). Kualitas DNA total tersebut

diperoleh dari hasil isolasi dan ekstraksi DNA. DNA total yang memiliki kualitas

yang baik layak dijadikan sebagai cetakan amplifikasi gen COI dengan

menggunakan teknik PCR.

Gambar 2 Hasil pengujian isolasi DNA total otot kaki P. homarus (contoh 1) dan

P. penicillatus (contoh 2) pada gel agarosa 1,2%

6

Amplifikasi DNA gen COI genus Panulirus Amplifikasi DNA gen COI dilakukan dengan menggunakan teknik PCR

dengan penempelan primer pada suhu optimum 54oC dan 53

oC. Panjang urutan

basa nukleotida gen COI dari hasil amplifikasi kedua contoh Panulirus tersebut

berukuran antara 500-750 pb (pasang basa) (Gambar 3). Produk PCR yang baik

dari ke 2 contoh DNA tersebut dimurnikan sehingga diperoleh kualitas yang baik

dan layak dijadikan sebagai cetakan dalam proses sekuensing untuk memperoleh

fragmen gen COI dari lobster genus Panulirus.

Gambar 3 Elektroforesis DNA hasil produk PCR pada gel agarosa 1,2%, marker 1

kb, P. homarus (contoh 1) dan P. penicillatus (contoh 2)

Sekuensing dan validasi DNA gen marka genetik COI genus Panulirus

Data urutan nukleotida fragmen gen COI lobster genus Panulirus dari hasil

sekuensing, dianalisis menggunakan program BLASTn (Basic Local Alignment

Search Tool-nucleotide) yang tersedia di GenBank. Sekuen nukleotida gen COI

P. homarus dan P. penicillatus diunggah pada BLASTn pada situs NCBI (National

Center for Biotechnology Information) untuk validasi dari kedua spesies tersebut

serta mengetahui kekerabatan kedua spesies tersebut dengan spesies lain.

Berdasarkan hasil sekuensing dalam fragmen gen COI, basa-basa nukleotida

gen COI tersebut disejajarkan dengan primer forward dan reverse menggunakan

program MEGA 5.2 (Tamura et al. 2011). Diperoleh hasil panjang nukelotida

dari P. homarus dan P. penicillatus, yaitu masing-masing sebesar 658 pb dan 667

pb. Kedua sekuen nukleotida contoh tersebut disejajarkan dan didapatkan hasil

sepanjang 660 pb nukleotida fragmen gen COI lobster genus Panulirus.

Hasil analisis dari komposisi basa P. homarus dan P. penicillatus,

selanjutnya dilakukan pensejajaran sekuen nukleotida gen COI dengan spesies

dari famili Palinuridae pada genus yang berlainan, yaitu genus Palinurus. Urutan

basa gen COI Palinurus elephas (DQ062206.1) dan Palinurus mauritanicus

(DQ062207.1) yang diperoleh dari GenBank, kemudian dijadikan sebagai

outgroup untuk analisis kekerabatan. Berdasarkan hasil analisis dari pensejajaran

basa nukleotida menghasilkan nilai conserve sebesar 35,58% (185/520), variabel

sebesar 64,43% (335/520), dan singleton sebesar 22,08% (120/520). Dari

informasi tersebut dapat diketahui bahwa nilai variabel terdapat variasi basa

nukleotida antara spesies ingroup, yaitu P. homarus dan P. penicillatus dengan

spesies outgroup, yaitu Palinurus elephas (DQ062206.1) dan Palinurus

mauritanicus (DQ062207.1) yang merupakan pembeda dari masing-masing

spesies.

7

Jarak genetik dan analisis filogeni gen COI genus Panulirus

Penghitungan jarak genetik antara genus Panulirus spp. dan Palinurus spp.

menghasilkan nilai antara 0,759 dan 0,782. Nilai jarak genetik yang tinggi ini

menunjukkan kepastian pemisahan genus. Penghitungan jarak genetik

interspesies Panulirus spp. yang berasal dari perairan Selatan Yogyakarta

menunjukkan kekerabatan yang rendah dengan nilai jarak genetik sebesar 0,132

(13,2%) (Tabel 1). Menurut Hebert et al. (2003), jarak genetik melebihi 3%

menunjukkan spesies yang berbeda. Kemiripan morfologi berhasil dibuktikan

perbedaan spesies antara P. homarus dan P. penicillatus.

Tabel 1 Matriks jarak genetik fragmen gen COI pada P. homarus (contoh 1), P.

penicillatus (contoh 2), Palinurus elephas (DQ062206.1), dan Palinurus

mauritanicus (DQ062207.1) berdasarkan metode pairwise distance

Panulirus

homarus

1

Panulirus

penicillatus

2

Palinurus

elephas

Palinurus

mauritanicus

Panulirus homarus 1 Panulirus penicillatus 2 0.132

Palinurus elephas 0.760 0.759

Palinurus mauritanicus 0.782 0.769 0.051

Hasil Penghitungan jarak genetik pada matriks tersebut kemudian dapat

dijadikan sebagai data untuk analisis hubungan kekerabatan berdasarkan pohon

filogeni. Hasil analisis tersebut menunjukkan tingkat kekerabatan ingroup. Nilai

jarak genetik menjadi dasar untuk merekonstruksi pohon filogeni famili

Palinuridae (Gambar 4). Konstruksi pohon filogeni famili Palinuridae

menghasilkan DNA kelompok berbeda yang masing-masing mewakili genus

Panulirus dan Palinurus.

Gambar 4 Hasil rekonstruksi pohon filogeni gen COI dari dua jenis contoh dan

dua spesies pembanding menggunakan metode NJ dengan bootsrap

1000

Nukleotida spesifik dan situs mutasi gen COI genus Panulirus

Situs nukleotida spesifik dan situs mutasi gen COI P. homarus, P.

penicillatus dari genus Panulirus dilakukan melalui pensejajaran sekuen

nukleotida gen COI dengan spesies dari genus Palinurus. Setelah dilakukan

pensejajaran basa nukleotida fragmen gen COI antargenus dari famili Palinuridae,

didapatkan hasil sebesar 120 situs nukleotida spesifik yang menunjukkan adanya

perubahan spesifik pada genus Panulirus tersebut. Situs spesifik menunjukkan

Panulirus homarus

Panulirus penicillatus

Palinurus elephas (DQ062206.1)

Palinurus mauritanicus (DQ062207.1)

8

bahwa basa nukleotida dari genus Panulirus sebagai penciri yang dapat

membedakan dengan spesies dari genus Palinurus.

Pensejajaran sekuen nukleotida gen COI P. homarus dan P. penicillatus dari

genus Panulirus didapatkan hasil dari situs mutasi sebesar 22 situs nukleotida.

Situs mutasi tersebut merupakan basa nukleotida dari spesies P. homarus dan P.

penicillatus yang mengalami perubahan delesi dan insersi. Situs mutasi yang

mengalami perubahan delesi terdiri dari 15 situs nukleotida, sedangkan situs yang

mengalami perubahan insersi terdiri dari 7 situs nukleotida.

Pembahasan

Identifikasi molekuler dari genus Panulirus, yaitu P. homarus dan P.

penicillatus menggunakan fragmen gen COI memberikan informasi mengenai

kepastian spesies dari genus Panulirus khususnya yang terdapat di perairan

Selatan Yogyakarta. Menurut FAO (1998), P. homarus memiliki panjang baku

maksimum 31 cm, panjang karapas 12 cm serta panjang total rata-rata antara 20-

25 cm, sedangkan P. penicillatus memiliki panjang baku maksimum 40 cm dan

panjang total rata-rata 30 cm. Spesies P. homarus dan P. penicillatus termasuk

dalam filum Arthropoda, kelas Malacostraca, ordo Decapoda, famili Palinuridae

dan genus Panulirus (Lovett 1881). Penentuan klasifikasi genus Panulirus

berdasarkan karakteristik morfologi pernah mengalami ketidakpastian karena

fenomena spesies kriptik yang banyak terjadi pada hewan-hewan akuatik. Oleh

sebab itu, teknik identifikasi yang lebih akurat sangat diperlukan.

Menurut Tudge (2000), teknik DNA barcoding dapat digunakan dalam

identifikasi suatu organisme secara akurat terhadap berbagai spesies yang sulit

dibedakan secara morfologi. Kepastian kedua spesies ini diidentifikasi

berdasarkan marka genetik Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) dengan spesies

P. homarus dan P. penicillatus menggunakan BLASTn pada situs NCBI dengan

masing-masing nilai sebesar 97% dan 99% yang terbukti sangat akurat bahwa

hasil identifikasi kedua contoh tersebut termasuk dalam satu genus, yaitu genus

Panulirus dalam famili Palinuridae (Hajibabaei et al. 2006). Hasil tersebut

menunjukkan bahwa lobster genus Panulirus khususnya P. homarus dan P.

penicillatus berbeda dengan spesies lobster lainnya.

Hubungan kekerabatan antarspesies di dalam famili Palinuridae dapat

dianalisis melalui pensejajaran basa nukleotida fragmen gen COI, menggunakan

program MEGA 5.2 melalui metode pairwise distance (Tamura et al. 2011).

Urutan basa nukleotida pada kedua spesies dari genus Panulirus disejajarkan

dengan spesies Palinurus elephas (DQ062206.1) dan Palinurus mauritanicus

(DQ062207.1) sebagai outgroup yang didapat dari GenBank. Menurut Maddison

(1984), adanya penggunaan outgroup bertujuan sebagai faktor koreksi dalam

penentuan suatu karakter diantara ingroup yang ada.

Hasil jarak genetik terbesar antara genus Panulirus spp. dan Palinurus spp.

adalah 0,782. Jarak genetik tersebut diperoleh antara P. homarus dengan

Palinurus mauritanicus (DQ062207.1). Menurut Hebert et al. (2003), perbedaan

jarak genetik antara P. homarus dengan Palinurus mauritanicus (DQ062207.1)

dengan spesies lainnya yang dapat diperoleh dari GenBank sebesar 3% atau lebih

maka secara molekuler dipastikan bahwa P. homarus dan P. penicillatus berbeda

9

dari spesies Palinurus elephas (DQ062206.1) dan Palinurus mauritanicus

(DQ062207.1). Hal ini menunjukkan bahwa teknik molekuler mampu

mengidentifikasi perbedaan antara kedua spesies tersebut dengan spesies outgroup

diwakili oleh jarak genetik antara kedua spesies tersebut.

Pohon filogeni dikonstruksi berdasarkan jarak genetik. Konstruksi pohon

filogeni fragmen COI menunjukkan adanya pemisahan yang jelas antara genus

Panulirus dengan genus Palinurus. Rekonstruksi pohon filogeni digambarkan

berdasarkan adanya hubungan kekerabatan analisis filogeni dengan menggunakan

metode Neighborjoining. Pemisahan yang terjadi disebabkan masing-masing

spesies mempunyai situs nukleotida spesifik. Perbedaan urutan basa nukleotida

antarspesies yang menyebabkan jarak genetik antarspesies semakin besar,

sehingga hubungan kekerabatan antarkeduanya semakin jauh.

Situs nukleotida spesifik merupakan penciri yang membedakan spesies pada

genus Panulirus dengan spesies lainnya pada genus Palinurus. Situs nukleotida

spesifik menandakan adanya pembeda dari kedua contoh yang diteliti, yaitu P.

homarus dan P. penicillatus dengan spesies yang dibandingkan, yaitu Palinurus

elephas dan Palinurus mauritanicus. Situs nukleotida spesifik tersebut dapat

ditemukan sebanyak 120 situs spesifik yang berarti bahwa dengan adanya situs

tersebut juga terjadi mutasi yang spesifik terhadap genus Panulirus, sehingga

mampu membedakan antara genus Panulirus dengan genus Palinurus.

Situs nuklotida spesifik sebanyak 120 situs menjadi penciri pada kedua

spesies genus Panulirus tersebut. Pada level spesies, sekuen nukleotida pada gen

COI P. homarus dan P. penicillatus menunjukkan adanya urutan nukleotida yang

bersifat conserve. Sekuen nukleotida gen COI genus Panulirus mengalami delesi

dan insersi. Situs mutasi insersi adalah mutasi yang terjadi karena adanya

penambahan satu atau lebih basa nukleotida ke dalam urutan DNA, sedangkan

mutasi delesi adalah mutasi yang menjadi karena kehilangan satu atau lebih basa

nukleotida di dalam DNA. Mutasi menjadi penyebab utama perbedaan variasi

nukleotida pada gen COI, sehingga menyebabkan variasi pada susunan

nukleotida, variasi yang kecil dapat mempengaruhi keidentikan suatu spesies

(Sala dan Knowlton 2006). Hasil situs nukleotida mutasi terdapat 22 situs

nukleotida mutasi gen COI genus Panulirus. Terdapat 15 situs nukleotida delesi

dan 7 situs nukleotida insersi.

Tahap identifikasi merupakan tahap awal yang penting untuk kepastian

taksonomi suatu spesies yang sangat diperlukan dalam pengelolaan dan

konservasi sumberdaya hayati. Penentuan klasifikasi genus Panulirus

berdasarkan karakteristik morfologi pernah mengalami ketidakpastian karena

fenomena spesies kriptik yang sering terjadi pada biota perairan (Bickford et al.

2006). DNA barcoding merupakan salah satu metode yang akurat dan cepat

untuk mengidentifikasi spesies dengan menggunakan fragmen sekuen nukleotida.

Penelitian ini berhasil mengidentifikasi spesies P. homarus dan P.

penicillatus dengan akurat, diharapkan permasalahan pengelolaan yang kurang

tepat (mismanagement) yang bersumber dari kesalahan identifikasi spesies dari

genus Panulirus dapat dihindarkan. Pada umumnya kesalahan dalam pengelolaan

suatu stok atau spesies bersumber dari ketidakpastian spesies, karena fenomena

spesies kriptik dan kompleks menjadi permasalahan utama dalam identifikasi

biota perairan.

10

KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan

Marka gen COI mampu membedakan spesies P.homarus dan P. penicillatus

secara akurat, sehingga permasalahan fenomena spesies kriptik dapat diatasi

secara molekuler. Adanya kepastian status taksonomi ini, maka pengelolaan

kedua spesies dari genus Panulirus dapat dibedakan.

Saran

Informasi molekuler dari marka gen selain COI dapat diperoleh lebih lanjut

untuk mendukung pengelolaan sumberdaya lobster, selain itu perlu dilakukan

penelitian lebih lanjut mengenai kajian aspek biologi lobster seperti reproduksi,

dinamika populasi, dan lain-lain di perairan Selatan Yogyakarta sehingga

diperoleh informasi lebih lengkap mengenai kepastian lobster genus Panulirus.

DAFTAR PUSTAKA

Abdullah MF. 2009. Molecular Genetic Relationship of The Spiny Lobster

Genus Panulirus In Pacific And Indian Oceans Using RAPD Method.

[skripsi]. Bogor (ID): Bogor Agricultural University.

Avise JC, Arnold J, Ball AM, Bermingham E, Lamb T, Neigel JE, Reeb CA,

Saunders NC. 1987. Intraspecific Phylogeography: The Mitochondrial

DNA Bridges I Between Population Genetics and Systematics. Ann. Rev.

Ecol. Syst. 18:489-522.

Bickford D, Lohman DJ, Sodhi NS, Ng PKL, Meier R, Winker K, Ingram KK,

Das I. 2006. Cryptic species as a window on diversity and conservation.

Ecology and Evolution. 22(3):148-155.

Chan TY dan Ng PKL. 2001. On The Momenculture of The Commercially

Important Spiny Lobster Panulirus longipes femoristriga (Von Martens,

1872), P. bispinosus Borradaile, 1899, and P. albiflagellum Chan & Chu,

1996 (Decapoda, Palinuridae). Koninklijke Bril NV Leiden. Crustaceana

74(1): 123-127.

FAO. 1998. The Living Marine Resources of The Western Central Pacific

:Volume 2. Cephalopods, Crustaceans, Holothurians And Sharks.

Carpenter KE, Niem VH, editor. Rome (IT): FAO.

Fauzi M, Prasetyo AP, Hargiyatno IT, Satria F, Utama AA. 2013. Hubungan

Panjang-Berat Dan Faktor Kondisi Lobster Batu (Panulirus Penicillatus)

Di Perairan Selatan Gunung Kidul Dan Pacitan. Bawal. 5(2): 97-102.

Hajibabaei M, Smith MA, Janzen DH, Rodriguez JJ, Whitfield JB, Hebert PDN.

2006. A Minimalist Barcode Can Identify A Specimen Whose DNA Is

Degraded. J Compilation Blackwell Publishing. 6: 959-964.

Hebert PDN, Cywinska A, Ball SL, DeWaard JR. 2003. Biological

Identifications Through DNA Barcodes. Proceedings of the Royal Society

of London Series B, Biological Sciences. 270: 313- 321.

11

Hebert PDN dan Gregory TR. 2005. The Promise of DNA Barcoding for

Taxonomy. Syst. Biol. 54(5): 852-859.

Junaidi M, Cokrowati N, Abidin Z. 2010. Aspek Reproduksi Lobster (Panulirus

sp.) di Perairan Teluk Ekas Pulau Lombok. Kelautan. 3(1):29-36.

Lovett DL. 1981. A Guide to The Shrimps, Prawns, Lobster and Crabs of

Malaysia And Singapore, Faculty of Fisheries And Marine Science.

Universiti Pertanian Malaysia. Malaysia.

Maddison WP, Donoghue MJ, Maddison DR. 1984. Outgroup Analysis And

Parsimony. Syst Zool. 33:83-103.

Moosa MK. 1984. Udang karang (Panulirus Spp.) Dari Perairan Indonesia.

Lembaga Oseanologi Nasional, LIPI, Jakarta : 40 p.

Nawangwulan S. 2001. Analisis Sistem Penangkapan Lobster (Panulirus Sp.) Di

Perairan Pengandaran Kabupaten Ciamis Jawa Barat [Skripsi]. Bogor (ID):

Institut Pertanian Bogor.

Sala E dan Knowlton N. 2006. Global Marine Biodiversity Trends. Annu Review

of Environment and Resources. 31:93-122.

Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. 1977. DNA Sequencing with

Chainterminating Inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA. 74: 5463-5467.

Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. 2011. Mega 5: Molecular Evolutionary

Genetics Analysis Using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance,

and Maximum Parsimony Methods. J Mol Biol Evol. 28(10):2731–2739.

Tudge C. 2000. The Variety of Life. New York (US): Oxford University Press.

Utami DDY. 1999. Analisis Sumberdaya dan Tingkat Pemanfaatan Lobster

(Panulirus Sp.) yang didaratkan di Pangandaran, Ciamis, Jawa Barat.

[skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Windyarto A. 2000. Studi Tentang Perikanan Udang Karang (Spiny Lobster,

Panulirus Spp) di Daerah Pameungpeuk Kabupaten Garut, Jawa Barat.

[skipsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Yusnaini, Nessa MN, Djawad MI, Trijuno DD. 2009. Ciri Morfologi Jenis

Kelamin dan Kedewasaanlobster Mutiara (Panulirus ornatus) Sex

Morphologycal Characteristics and Maturity of The Ornated Lobster

Panulirus ornatus. Torani. 19 (3): 166– 174.

12

RIWAYAT HIDUP

Penulis bernama lengkap Widy Triaprilyanti, lahir di

Lampung Barat, 17 April 1994, merupakan anak ketiga dari

tiga bersaudara dari ibu bernama Wardiah dan ayah

Bardiarza. Penulis mulai mengikuti pendidikan sekolah

dasar di SDN 1 Liwa dan lulus pada tahun 2006.

Melanjutkan di SMPN 1 Liwa dan lulus pada tahun 2009

serta dilanjutkan di SMAN 1 Liwa dan lulus pada tahun

2012. Penulis lulus seleksi menjadi mahasiswa di Institut

Pertanian Bogor melalui jalur Seleksi Nasional Masuk

Perguruan Tinggi Negeri (SNMPTN) Undangan pada tahun 2012 sebagai

mahasiswa Departemen Manajemen Sumberdaya Perairan, Fakultas Perikanan

dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Kegiatan di luar akademik, Penulis

aktif dalam organisasi seni khususnya dalam bidang seni Tari Kreasi Tradisional

dan dalam bidang Olahraga. Selain mengikuti perkuliahan, Penulis

berkesempatan menjadi asisten mata Kuliah Biologi Populasi Ikan (2014/2015).

Penulis juga aktif berpartisipasi dalam berbagai kepanitiaan di lingkungan kampus

IPB.