Upload
trantuong
View
224
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 VITAMIN A
Vitamin A merujuk pada semua senyawa isoprenoid dari produk-
produk hewani yang mempunyai aktivitas all trans-retinol ( Rohman dan Ibnu,
2007). Menurut Almatsier (2009), vitamin A merupakan terminologi nama
generik yang menyatakan semua senyawa retinoid dan karotenoid (prekursor/
pro vitamin A) yang mempunyai aktivitas biologis seperti retinol. Bentuk
kimiawi senyawa retinoid berupa retinol (vitamin A bentuk alkohol), retinal
(aldehida), ester retinil dan asam retinoat. Menurut CE (2007) struktur kimia,
rumus empiris dan bobot molekul dari: retinol, retinil asetat, retinil propionat
dan retinil palmitat dapat dilihat pada Gambar 1 dan Tabel 1. Menurut
Eitenmiller dkk, (2008) sifat-sifat kimia-fisika dari retinol dan retinil palmitat
dapat dilihat pada Tabel 2.
CH3H3CCH3 CH3
OR
CH3
Gambar 1. Struktur molekul vitamin A alkohol (retinol) dan ester vitamin A (ester retinil)
Tabel 1. Rumus empiris dan bobot molekul dari vitamin A alkohol (retinol)dan ester vitamin A (ester retinil)
Nama zat R Rumus empiris Bobot MolekulRetinol Retinil asetatRetinil propionatRetinil palmitat
HCO-CH3 CO-C2H5
CO-C15H31
C20H30OC22H32O2C23H34O2C30H40O2
286,5328,5 342,5 524,9
Sumber: CE (2007)
2.1
6
Tabel 2. Sifat-sifat Kimia Fisika Retinol dan Retinil PalmitatSifat Kimia Fisika Retinol Retinil PalmitatBentuk Kristal kuning Kristal, amorf atau cairan
kental berwarna kuningRumus Kimia Bobot Molekul
C20H30O286,46
C36H60O2524,88
Kelarutan Larut dalam: metanol, etanol, propanol, kloroform, eter, hidrokarbon, minyak
Larut dalam: metanol, etanol, propanol, kloroform, eter, hidrokarbon, minyak.
Absorbsi UV:� maks. (etanol)E (1%, 1cm)
325 nm1845
325 nm940
Flourosensi:� eksitasi� emisi
325 nm470 nm
325 nm470 nm
Sumber: Eitenmiller dkk (2008)
Vitamin A pada umumnya stabil terhadap panas, asam, dan alkali,
namun mempunyai sifat yang mudah teroksidasi oleh udara dan akan rusak
bila dipanaskan pada suhu tinggi bersama udara, sinar, dan lemak yang sudah
tengik (Winarno, 2008). Menurut Favaro dkk, (1991) di dalam Hariyadi
(2011) vitamin A yang difortifikasikan ke dalam minyak goreng stabil selama
6-9 bulan jika disimpan dalam wadah tertutup dan terlindung dari cahaya,
vitamin A relatif stabil setelah proses penggorengan.
Menurut CE (2007), aktifitas vitamin A dinyatakan dalam Retinol
Ekivalen (R.E.), 1 mg R.E. sebanding dengan aktifitas 1 mg All-trans retinol.
Aktifitas ester retinol lain dihitung secara stoikiometris, sehingga didapat 1
mg R.E. vitamin A sebanding dengan: 1,147 mg all-trans-retinyl acetate,
1,195 mg all-trans-retinyl propionate dan 1,832 mg all-trans palmitate. Unit
Internasional atau International Units (IU) juga digunakan untuk menyatakan
aktifitas vitamin A. 1 IU Vitamin A ekivalen dengan aktivitas 0,300 �g All-
trans retinol. Aktifitas retinol ester lain dihitung secara stoikiometris,
sehingga didapat 1 IU vitamin A sebanding dengan aktifitas: 0,334 �g all-
trans-retinyl acetate, 0,359 �g all-trans-retinyl propionate, dan 0,550 �g all-
trans palmitate.1 mg R.E. sebanding dengan 3333 IU.
TTTabeSifaBen
RumBobKeKeKel
AbAbAbAbAbAAAbAbbbbAbAbAbAbAbAbAbAbbbAbbbAbbAbAbAbAbAbAbAbAbbAbAbAbAbAbAbbbAbAAbbAbAbAbbAbAAbAbAbAbbbbbAAAbAbAAbbAAAAbbbAAAAbAAbbbAbAbbbbAAAAAbbAAAbAbbbAAAbbbbbAbbbA s��������������������������������������������������������������������������������������������������������� mmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmE EE EE EEEE EEEEEEE E EE E E EEEEE EEEEEEEEEEEE EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEE (((((
FlFlFlFlllllFlllllllllFlFlFlllllllllllllllllllllllllllllllllloooouooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooo������������������������������������������ ekeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeee��������������������������������������������������������������������������� emeeeeeeeeeeeeee
SSSSS
nnnnamamamammmmmmmmmammmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmu
bbibilalalalalalalalallalaallalalaalalalaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaalaaaaallaaalaaaalaaaa d
teeengngngngngngngnggngngngngngngnngngngnggngngnnnngngnngnnggnngngngngngngnnnngnggggngnnggggngnnggngnngnggngnnnnnnngnngnggnnnggnngnggnngggnggnnnnngggnnnnggggggggggi
(201
6666-9 b
vvvvitam
M
EEEEkiv
AAAAktif
mmmgmgmgmgmgmgmgmgmgmgmgmgmgmgmgmgmgggggmgmgggmgmggmgmggggggggggmggmggmgmgmgggmgmgmggmmggggggggggggggggggggggggggg R R RRR R R
111,1,1,,1,,,,,1,1,,1,11,,1,,,,,,,,,,1,,,,1,,,1,,,,11919191991919191191919919199191991919191199991919111919991191119191999911911111111991119911991911119111191111119119191999111119919999995
Innnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnntetetetetetetetetetetetetetetetetetetetetettetetetettetetettetetetetetetteteteetetteteteteeetetetteeeteeettettettetteteeeeeeeeerrnrrr
aaakakkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkktttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttifififififiififififififififfififiifififfffifififififiifififififiiffffifiiififfiffififiiifffiiiififfffffiffifififfffffiiffiiffififffiffffiiiiiii iiii
trrrrrrrrananananananannananananannaaaaaanannnnnnanananananananaanaannnnnanannannnnannnnnnannnnnnnannnnnnnnnnnnnnnannnanaaanaaannsssssssssssssssssssss
ssseeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeehhihhihihihihihihihihhhhihhhhhhhihhihiihhhhhihihihihhihiiihihihhiihhhhhihhiihhih nnn
trrrrrrrrrrrrrrrrrranananananaaanaananaaaananananannnaaaananaaaaaaananaaaaaaaanannnaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa sss
trrrrrrrrrrrrrrraanananananananananaananananaananananananaaanananannanaananananaanaananaananananaaanananananannananannanaaanaaaaanaaaanaaanaananannanaaananaaanannnnaananaanannaaa sss
7
Aktifitas vitamin A ditentukan dengan tujuan untuk menghitung jumlah
yang dibutuhkan pada pembuatan konsentrat. Menurut BP Commision (2009),
aktivitas vitamin A palmitat ditetapkan dengan cara menimbang 25-100 mg
vitamin A dengan akurasi 0,1 %, dilarutkan dengan menggunakan 5 mL
pentana dan diencerkan dengan 2-propanol hingga diperolah konsentrasi 10 -
15 IU/mL. Pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang yang
menghasilkan serapan maksimum pada 326 nm. Aktivitas vitamin A dihitung
dalam satuan internasional unit (IU) per gram dengan persamaan:
A326 = Absorbansi pada panjang gelombang 326 nm
V = total volume pengenceran untuk mendapatkan kadar 10 – 15 IU/mL
1900 = faktor untuk mengkonversi absorbansi spesifik ester retinol menjadi
IU per gram
m = bobot substansi yang di uji (dalam gram).
Vitamin A merupakan zat gizi yang penting (esensial) bagi manusia,
karena zat gizi ini tidak dapat disintesa oleh tubuh, sehingga harus dipenuhi
dari luar. Vitamin A penting untuk kesehatan mata dan mencegah kebutaan
dan yang lebih penting lagi vitamin A meningkatkan daya tahan tubuh. Anak-
anak yang cukup mendapatkan vitamin A, bila terkena diare, campak atau
penyakit infeksi lainnya maka penyakit-penyakit tersebut tidak mudah men-
jadi parah, sehingga tidak membahayakan jiwa anak. Dengan adanya bukti-
bukti yang menunjukkan peranan vitamin A dalam menurunkan angka
kematian, maka selain untuk mencegah kebutaan, pentingnya vitamin A saat
ini lebih dikaitkan dengan kelangsungan hidup, kesehatan dan pertumbuhan
anak (Depkes, 2009a). Fungsi vitamin A didalam tubuh adalah untuk diferen-
siasi sel penglihatan, spermatogenesis, perkembangan embrio, imunitas,
mempengaruhi indra perasa, pendengaran, nafsu makan, serta pertumbuhan
(Bagriansky dan Ranum, 1998). Fungsi lain dari vitamin A adalah membantu
memelihara penglihatan di dalam gelap dan mencegah rabun senja serta
xeropthalmia, untuk pertumbuhan, dibutuhkan dalam pertumbuhan tulang dan
mmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmm
8
perkembangan gigi, sebagai koenzim dalam sintesis glikoprotein, memiliki
fungsi seperti hormon steroid, diperlukan untuk pembentukan tiroksin dan
pencegahan goiter, sintesis protein dan sintesis kortikosteron dari kolesterol,
serta sintesis normal dari glikogen (Berdarnier dkk, 2002).
Angka kecukupan gizi untuk vitamin A biasanya dinyatakan dalam satuan
retinol ekivalen (RE). Satu RE setara dengan 1 mikrogram retinol atau 6
mikrogram beta karoten atau 12 mikrogram beta karoten campuran. Status
vitamin A dikatakan baik jika konsentrasi vitamin A dalam hati sebesar 20
mikrogram/gram. Penggunaan setiap harinya adalah sekitar 0,5% dari
persediaan tersebut. Konsumsi vitamin A yang baik adalah jika setengahnya
bisa disimpan didalam tubuh (Muhilal, Jalal dan Hardiansyah, 1998). Angka
kecukupan gizi vitamin A rata-rata yang dianjurkan perhari dapat dilihat pada
Tabel 3.
Tabel 3. Angka Kecukupan Gizi Vitamin AKelompok Usia (tahun) Angka Kecukupan (RE)Bayi 0-0,5 0,5-1
375400
Anak-anak1-2 2-6 6-10
400450500
Pria10-12 12-70
500600
Wanita 10-70 500Wanita Hamil 800Wanita Menyusui0-6 bulan> 6 bulan
850850
Sumber: FAO/WHO (2001) dalam Muhilal dan Sulae-man (2004)
2.2 MINYAK GORENG SAWIT
Menurut Badan POM (2006), minyak goreng (frying oil atau frying fat)
adalah: minyak dan lemak yang digunakan untuk menggoreng yang diperoleh
dari proses rafinasi/pemurnian (refining/purifying) minyak nabati dalam
bentuk tunggal atau campuran. Karakteristik dasar minyak goreng meliputi:
ppperke
ffufufungs
pppenc
ssserta
A
rrretino
mmmimimimmimimiimimimimiimimimimimiimiimimimimimiimimimimimimimimmimiimiimimimmimimimimimiimiimiiimimiimimiimimimmmimmiiimimmmmmmiimikrkrkrkrkrkrkrkrkrkrkrkrrkrkrkkrrkrkrkrrkrkkrkrkrkrkrkrkrrkrkrkrkrkrkrkrkrkrkrkkrkrkrkrrkkkkrkrkkrkkrkrrkkkkkkrkrkrkrkkrrkrrkrrkrrkrrrkrkrkkrrrkkkrr
vvvivitatatatatatatatatatatatatatatataaataatatataaaaaaaatataaataaataaaaaataaaattaaaaatataaaataaattaaatataaaaaaaaataaaaaaattaaataataaaattttaammmmmmmmmmmm
mmmimiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiikrkkkkkkrkrkrkrkrkrkrkkkkrkkrkkrkkkkkkkrkkkkkkrkkkkkkkrkkkrkrkkkkkkkkrkkkkkkkkkkrkkkrrkkkrkkkkkrkrkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkk
ppepeeeeersrsrsrsssrsrsrrsrrsrsrsrrssrsrrrsrssrrsrsrsssrsrsrrrrssssrrsrrrsssrsrsrrsssrssssssrssssrsssssrrrsrssssssrrrrrrrrse
bbbisasasasasasasasasaasasasasassasaaaaaaaaasasaaaaasasaasaaaaaaasasasasaassasaasaassaaasaasaasassaassaassaasss
kkkekeeeecucccucucuccuccucucuucucucuccucucccucucucuucucucucucuccuucccuucuucuucuccuuccccucucccucuucucucuccccccuuccucucccccuccuccccccccc k
TTTTabababababbababbbabababababbbabababbbabbbbabbabababbababbbabbababbababbbbbbbbbabbbbbbbbababbbababbbbbbabbbbbababbabbbbabbbbabbbbabbbbbabbbbabbabbabbbabbbbbbabbbbbeeee
2.2 MMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMININININININININININNININNNINNININNNININNNNINNNNININNNNNINNIIIIIINNINIIINNNIIIIINNNNIIINIINNNNNNNNN
aaadadddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddalalalllalalalalallalalalalalllalaalalllalaallllallllaallallllalallalalallllaallaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
dddadaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaariririririiriririririiriririrriiririiiiriririririririiriririiriiiiirirriiriiiriiiiiiririiririiririirririrrirrirrrrrrriiirirrrrr
bbebeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeentntntntnntnnnntnnnnntnttnntnntnntntnttntnttntuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuu
9
kadar air tidak lebih dari 0,15 %, kadar asam lemak bebas tidak lebih dari 0,3
%, kadar asam lemak linoleat tidak lebih dari 2 % dan bilangan peroksida
tidak lebih dari 10 mek O2/kg.
Minyak kelapa sawit (Refined Bleached Deodorized Palm Oil/RBDPO)
adalah: minyak yang diperoleh dari hasil proses rafinasi/pemurniaan minyak
kelapa sawit mentah. Karakteristik dasar minyak kelapa sawit meliputi:
bilangan penyabunan 190 mg KOH/g, bilangan iod 50 Wijs hingga 55 Wijs,
titik leleh 33 oC hingga 39 oC dan bilangan peroksida tidak lebih dari 10 mek
O2/kg (Badan POM, 2006).
Minyak olein kelapa sawit (Refined Bleached Deodorized Palm Oilein)
adalah fraksi cair minyak kelapa sawit berwarna kekuningan yang diperoleh
dari hasil proses rafinasi/pemurniaan minyak olein kelapa sawit mentah
(Crude Palm Oil/CPO) atau fraksinasi minyak kelapa sawit yang sudah dirafi-
nasi (RBD palm oil). Karakteristik dasar minyak olein kelapa sawit meliputi
titik leleh/lebur tidak lebih dari 30oC, bilangan iod tidak kurang dari 56 Wijs,
bilangan penyabunan 194 mg KOH/g hingga 202 mg KOH/g dan bilangan
peroksida tidak lebih dari 10 mek O2/kg (Badan POM, 2006).
Minyak stearin kelapa sawit (Refined Bleached Deodorized Palm
Stearin) adalah fraksi padat minyak kelapa sawit yang berwarna kekuningan
yang diperoleh dari hasil proses rafinasi/pemurnian stearin kelapa sawit
mentah (Crude Palm Stearin) atau fraksinasi minyak kelapa sawit yang sudah
dirafinasi (RBD palm oil). Karakteristik dasar minyak olein kelapa sawit
meliputi: titik leleh/lebur tidak kurang dari 44oC dan bilangan iod tidak lebih
dari 48 Wijs (Badan POM, 2006).\
Minyak sawit (palm oil) berbeda dengan minyak inti sawit (palm kernel
oil). Minyak sawit diperoleh dari daging buah kelapa sawit bagian mesokarp,
sedangkan minyak inti sawit diperoleh dari biji buah kelapa sawit. Minyak
kelapa sawit diperoleh melalui proses ekstraksi secara rendering atau penge-
presan dan proses pemurnian yang terdiri atas pengendapan dan pemisahan
gum, netralisasi, pemucatan dan deodorisasi. Secara umum minyak kelapa
sawit mempunyai karakteristik warna kuning pucat sampai jingga tua,
10
memiliki aroma yang sedap dan stabil atau tahan terhadap ketengikan
(Winarno, 2008).
Melalui proses rafinasi, pemucatan dan penghilangan bau atau disingkat
RBD (Refined, Bleached, Deodorized), minyak kelapa sawit dapat diubah
menjadi produk yang bernilai tinggi. Proses rafinasi dan fraksinasi
menghasilkan minyak yang tidak berwarna, jernih dan bersih dari kotoran
yang dikenal dengan RBD oil. Kehilangan beta karoten yang terkandung
dalam minyak kelapa sawit banyak terjadi selama proses-proses tersebut
berlangsung (Muchtadi, 1996).
Menurut Olson (1990), minyak kelapa sawit yang tidak mengalami
proses penjernihan dan bleaching memiliki warna merah karena banyak
mengandung karoten (� dan � karoten) dalam jumlah yang banyak.
Kandungan karotenoid sebanyak 0,5 mg/mL minyak kelapa sawit. Kebutuhan
vitamin A pada anak usia pra-sekolah dapat dicukupi dari konsumsi 7 mL
minyak kelapa sawit merah per hari. Menurut Martianto, Marliyati dan
Komari (2007), walaupun memiliki kandungan karotenoid yang tinggi,
minyak kelapa sawit merah tidak dapat diterima dalam banyak penggunaan
karena warna merah yang kuat dan rasanya yang sangat khas.
Menurut Kemperin (2010), minyak goreng sawit adalah: bahan pangan
dengan komposisi utama trigliserida berasal dari minyak sawit, dengan atau
tanpa pengubahan kimiawi, termasuk hidrogenasi, pendinginan dan telah
melalui proses pemurnian dengan penambahan vitamin A. Komposisi minyak
goreng sawit terdiri atas bahan baku minyak sawit dan bahan tambahan
pangan (BTP) yang penggunaannya disesuaikan dengan ketentuan yang
berlaku untuk diizinkan penggunaannya pada minyak goreng sawit. Adapun
persyaratan mutu minyak goreng sawit sesuai dengan RSNI 3 Minyak goreng
sawit 2010 dapat dilihat pada Tabel 4
mmmmem
(WWin
RRRRBD
mmmmenjn
mmmmeng
yyyayaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaangngngngngngngngngngngngngngngngnggngngngngngngnngngngngngnnnngggngngngngngngnggnngnnngngnngnnnggnngngnnnggnngnnggngnggggggggngggnnggngnng
dddadaaaaalalalallalalalalalalalalalallalallalalalaalllllalalalalalalalllalllallllalalallalaalallallalalaaallaalallllaallalalaaallaaalalaaalllaallallllaalallaallllllalalaalllalammm
bbebeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeerlrlrlrlrlrlrlrrlrlrlrlrlllrllrlrlrlrlrllrrrlrlrlrrlrllllrrllllrlrlrlllrlrlllrllrlrllllrlrlrllrrllrlrlllrlrrlrrrrrlrllrlrrrrlrlrrlrrrrllrr aaaaaaaaaaaa
pprprrosososososoooosososoososoosoooosssossososooooooosssoooosooooosooosoosooosoooosoooosoooooooosoosooo e
mmmemeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeengnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn
KKKaKaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaannnnndndnnnnnnnndnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn
vvvivitatatatatataatatatattaatatataataatatattataatatatataaatattaaaataaataaaaaaaaaaaaaatattttaaattaaaaaaataaaaammmmmmmmmmmmmmmmmmmmm
mmmimiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiinynynynynynynynynnynnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnynnnnnynnnnnnnnnnnnnnnnnnny
KKKoKooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooommmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmm
mmmimiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiinnnnnynnnnnnynnynynynynnynnnynnynnnnnynnnnnnnnynnnynynnnnnnnnnyynynynnnnynynnnnnnnnnnnnnynnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn
kkkakaaaarerererrerererererererereererrreeerrerereereerrererrrerereerererreeeerrrrrrreeererrrrrrrererreerereerrrerrreerrrrererrrereererren
ddddeng
taaanpa
mmmmela
ggggoren
pppang
bbebeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeerllrlrlrrlrlrlrllrlrlrlrlrlllrlrlrlrlrlrlrllrrllrlrlrlrlrllrlrllrlrlrlrrlrlrlrllrlrrlrllrrlrrrrlrlrlrrllllrlrllllrllrrrrrrrrrlllrlrllrrlllaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
ppppepepepepepeepepepepepepeeepepepepepeeeepepepepepeepepepeeeeeeepeeeepepeeeeeeeppepeppepepeeepepeeepeepepepepeepepeepeeepeepeeeep rsrsrsrsrsrsrsrsrsrssrsrsrsrsrsssrsrsrsrrrrsssrsrrsrsrrsrrrsrsssssrsrrrsrsrssrsssrsssrsrssssssrssssssrssssrssy
sssaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaawiwwwwwwwwwwwwiwiwwiwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwiwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwww t
11
Tabel 4 RSNI 3 Persyaratan Mutu Minyak Goreng SawitNo. Kriteria Uji Satuan Persyaratan1 Keadaan1.1 Bau - Normal1.2 Rasa - Normal1.3 Warna (merah/kuning) (Lovibond 5,25
cell)maks. 5,0/50
2 Kadar air dan bahan menguap % (b/b) maks. 0,13 Asam lemak bebas (dihitung
sebagai asam palmitat)% maks. 0,3
4 Bilangan peroksida mek O2/kg maks. 10*5 Vitamin A IU/g min. 45*6 Minyak pelikan - negatif7 Cemaran logam7.1 Kadmium (Cd) mg/kg maks. 0,27.2 Timbal (Pb) mg/kg maks. 0,17.3 Timah (Sn) mg/kg maks. 40,0/250,0**7.4 Raksa (Hg) mg/kg maks. 0,058 Cemaran arsen (As) mg/kg maks. 0,1
Catatan:* pengambilan contoh di pabrik** dalam kemasan kaleng
2.3 FORTIFIKASI PANGAN
Menurut Soekirman (2003), kekurangan zat gizi mikro dapat diatasi
dengan berbagai pendekatan seperti diversifikasi pangan, suplementasi dan
fortifikasi pangan. Fortifikasi adalah penambahan satu atau lebih zat gizi
mikro tertentu ke dalam bahan pangan dengan tujuan utama adalah mening-
katkan mutu gizi makanan. Fortifikasi dapat bersifat sukarela maupun wajib.
Fortifikasi yang dilakukan secara sukarela adalah fortifikasi yang dilakukan
oleh produsen untuk meningkatkan nilai tambah produknya, sedangkan
fortifikasi wajib merupakan fortifikasi yang diharuskan dan terdapat dalam
undang-undang maupun peraturan pemerintah dengan tujuan melindungi
rakyat dari kurang gizi. Target utama dari fortifikasi wajib ini adalah
masyarakat miskin yang umumnya menderita kekurangan gizi mikro seperti
kekurangan yodium, zat besi, dan vitamin A. Bahan pangan yang dapat
dilakukan fortifikasi harus memenuhi beberapa kriteria yaitu:
1. Bahan pangan harus dikonsumsi oleh semua atau sebagian besar populasi
sasaran.
2. Bahan pangan harus dikonsumsi secara rutin dalam jumlah yang tetap.
2.2.2.22.22.2.2.2.222.2.2.2.2.22.2.2.2.2222222222.222222222.22222.2.22.2.222222222222222 333333
12
3. Rasa, penampakan dan bau bahan pangan yang difortifikasi tidak boleh
berubah.
4. Zat yang digunakan untuk fortifikasi harus stabil pada kondisi yang
ekstrim seperti pemasakan, pemrosesan, pengangkutan dan penyimpanan
5. Harga bahan pangan hasil fortifikasi tidak naik secara berarti.
Menurut Soekirman (2003) syarat-syarat bahan pangan yang akan
dilakukan fortifikasi adalah produsen yang memproduksi dan mengolah bahan
pangan tersebut terbatas jumlahnya, tersedianya teknologi fortifikasi untuk
bahan pangan yang dipilih dan bahan pangan tersebut tetap aman untuk
dikonsumsi dan dan tidak membahayakan kesehatan.
Menurut Martianto (2011), minyak goreng merupakan bahan pangan
yang diproduksi secara terpusat dan dikonsumsi secara luas oleh masyarakat,
sehingga dapat dipakai sebagai alternatif bahan pangan untuk difortifikasi.
Fortifikasi vitamin A ke dalam minyak goreng sawit perlu dilakukan dengan
alasan: (1) Produk makanan Indonesia sebagian besar menggunakan minyak
goreng; (2) Untuk mengurangi penyakit akibat KVA, maka perlu adanya
kebijakan yang tepat untuk menanggulangi masalah KVA; (3) Salah satu
kebijakan yang ditempuh adalah fortifikasi vitamin A dalam minyak goreng,
dan (4) Pemerintah akan menetapkan standar yang mewajibkan kepada
seluruh produsen minyak goreng sawit untuk melakukan fortifikasi vitamin A
ke dalam produknya.
Menurut Hariyadi (2011), fortifikasi vitamin A pada minyak goreng
dapat dilakukan dengan alasan: (1) Vitamin A dan pro-vitamin A sangat
mudah larut dalam minyak goreng; (2) Vitamin A umumnya lebih stabil
dalam minyak goreng dari pada dalam bahan pangan lainnya; (3) Minyak
goreng (lipida) membantu proses absorbsi dan pemanfaatan vitamin A; (4)
Minyak goreng digunakan oleh masyarakat luas; (5) Teknologinya tersedia
dan sederhana, dan (6) Biaya fortifikasi terjangkau.
3333. R
b
4444. Z
e
5555. H
dddidiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiilalalalaalalalallalallalallallalalalalallalalallalalalalalalalalalllalllalalalllalallalalaalaalalaalalaaalaallaalallalalllalllalaaaaakkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkk
ppapaaaaangngngngnnngnngngnngngnnngnnnnnnnnnnnnngnnngnnnnnnnnnnnnnnnnngnnnnnnnngnnngnnnnnnnngnnnnnnnnnnnnnngnnnngnnngnnnnnnnnnnnnnnnnngnnggggggggg
bbabaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaahahahhhahahahahhhahahahahahhhahahhahahahhhhhhhahhhhhhahhhhhhahhhahahhhhhahhhahahhhahhhhhahhaaahhahahhhhhaaahhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh n
dddidikokokokokokookokokokkokokookkokookkokokokokookokokkkkokokookokokkoooooooooooooooooookokkkookkkookkokkokokkkkkkoooooon
yyyayaaaaangnnngngngnngnngngngngngngngnngngnnngngngnngngngnngngnngngnnngnngngngngnnnggnnnnnngngnnnnnggnnngngnnnnnnggnngngnnnnngnnnnnnnnnnnng
ssseeehihihihihhihihiihihihihhhihihhhhihihihihihihihihihihhihihihhihihhhhiihihihhhihihhhhihhhhhhhhhhhihhhhhhhihhihhihihihhihhihhhihhhhhhhihhhhhhiihihihhhhhhhhhihhhiiinnnn
FFFoFooooooooooooooooooooooortrtrtrtrtrtrtrtrtrtrtrtrrtrrtrtrrrtrtrrtrrttrtrtrtrtrttrtrtrtrtrtrtrtrrrtrrtrrrtrrrrtrtttrtrttrtrtrrtrttrrrrrrrrrtrtrti
aaaalasasasasasasssasasasassaasasasassssaasasasassssasassassasssaaasaassssssaassssssasssssssssassassassasasssssssssassassssassaasssasaaaaaaaa
gggogooorereererererrerreereereeeerrerereerererereereeereereerreereereeeereerererrrrerrrerrrrrrrrrrrerrrerrrrrrrrrrrrrererrrrerrrrrr n
kkkekeeeebibibibibibibibibibibibbibibibibbibibibibibibibbibbibibibibibbbbbbbbbbibibibibbbiibbibibbibibbbibibibbibbibbbibibbiibibibibbbibbbbbbibibbbbbibbbbbbbbbbbbbbbbb jjjjj
kkkekeeebibibibibibbbibbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbibbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbb jjj
ddddan
ssselur
kkkke da
ddddapat
mmmmuda
dddadaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaalallalallalalalaalalalalalaalalalalalallalallaalalalalalalaallalaalalaalallalalalalallaalallaalalallalaalaaalalaaaaalalaaaalaalllllaaaalalaaallaaammmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmm
ggggogogogogogogogogogogogogogogogogoogoogogoogogoggooogogogoooogoooogooogoogoogooogoooogogogogooogoogoggoogoooogggogogggoogoooooogogoooogooogoog rerrererererererererererererereerererrrreeerererrerrrrerereeeerrrerrererreererrerererrereereeeerrerrreerereeren
MMMiMiMiMiMiMiMiMiMiMiiMiiMMMiiMMiMMMiMMMiiiiiiiiiMiiiMiMMiMiMMiMMMMMMMMMiinynynynnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn
dddadadadadaadaaadaaaadaadaaadadaaadaadaaadaaadaaaaaaaaaadaaaaaaaaadddadaaaaaaaadaadaaaaaaaaddaaaannnnnnnnnnnnnnn nn nnnnnnn nnnnnnnnn n nnn nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn s
13
2.4 METODE ANALISIS PENETAPAN KADAR VITAMIN A
Secara umum pengujian vitamin A dalam bahan pangan terdiri atas 3
tahap yaitu: tahap saponifikasi, tahap ektraksi, tahap pemekatan atau
penguapan pelarut organik dan tahap pengukuran menggunakan instrumen.
Saponifikasi dilakukan dengan menggunakan kalium hidroksida dengan
pelarut campuran etanol dan air, penambahan zat anti oksidan (asam askorbat,
pirogalol, butil hidroksi toluena) dan pemanasan pada suhu 60–80oC
(Eitenmiller, 2008). Tahap ekstraksi dilakukan menggunakan pelarut organik
seperti petroleum eter (Eitenmiller, 2008); eter, campuran etanol dengan tetra
hidrofuran (USP Convention 2008). Selanjutnya dilakukan pemekatan atau
penguapan terhadap pelarut organik yang digunakan, lalu dilarutkan kembali
dengan pelarut lainnya seperti metanol atau etanol dan selanjutnya siap untuk
ditetapkan kadarnya menggunakan instrumen seperti: spektrofotometri atau
kromatografi cair kinerja tinggi. Metode penetapan kadar vitamin A
menggunakan instrumen akan dijelaskan sebagai berikut:
2.4.1 Metode Spektrofotometri
2.4.1.1 Pengukuran secara langsung.
Spektrum absorbsi ultraviolet vitamin A dan vitamin A asetat
mempunyai absorbsi maksimal pada panjang gelombang antara 325
sampai 328 nm dalam berbagai pelarut. Larutan vitamin A dalam
isopropanol absorbansinya diukur pada panjang gelombang maksimal
(�maks) dan pada dua titik, yaitu satu disebelah kanan �maks dan satunya
pada sebelah kiri �maks. Absorbansi pada �maks dikoreksi terhadap
senyawa pengganggu dengan menggunakan formula koreksi karena
senyawa-senyawa ini akan ikut menyerap pada daerah UV. Beberapa
pengganggu terutama pada minyak ikan adalah vitamin A2, kitol,
anhidro vitamin A dan asam polien. Pada vitamin A sintetik senyawa
pengganggunya adalah senyawa-senyawa antara (Rohman dan
Sumantri, 2007).
2.4
14
2.4.1.2 Pengubahan retinol atau akseroftol menjadi anhidroakseroftol
Akseroftol mudah diubah menjadi anhidroakseroftol dengan
bantuan sejumlah kecil asam mineral atau asam organik kuat. Metode
Budowski dan Bondi, akseroftol diubah menjadi anhidroakseroftol
dalam pelarut benzen dengan katalisator asam toluen-p-sulfonat pada
temperatur kamar. Kenaikan absorbansi pada 399 nm merupakan hasil
dehidrasi yang berbanding langsung dengan jumlah akseroftol yang
terkandung. Reaksi ini dapat dihentikan dengan penambahan alkali.
Pengukuran absorbansi pada 358 nm, 377 nm dan 399 nm dalam
benzen merupakan cara yang baik untuk mengetahui kemurnian
akseroftol yakni dengan melihat bahwa A399 nm/A377 nm sebesar 0,868
dan A358 nm/A377 nm sebesar 0,692 (Rohman dan Sumantri, 2007).
2.4.1.3 Metode Maleat anhidrat untuk isomer vitamin A
Maleat anhidrat bereaksi dengan all-trans dan 9-cis isomer
vitamin A menghasilkan senyawa yang tidak memberikan warna biru
ketika diuji dengan menggunakan antimon (III) klorida. Potensi
kehilangan terhadap all-trans dan 9-cis isomer dapat terjadi, sehingga
perlu dilakukan dua kali pengukuran nilai antimon (III) klorida,
pertama untuk isomer campuran dan setelah penghilangan kedua
isomer tersebut. Dari perbedaan nilai pengukuran ini, maka komposisi
isomer dalam campuran dan potensi biologisnya dapat ditentukan.
2.4.1.4 Penentuan secara simultan retinol (vitamin A1) dan dehidro-
retinol (vitamin A2)
Prinsip dari metode ini adalah perbedaan panjang gelombang
maksimum dan nilai ekstinsi dari masing-masing vitamin A1 dan A2.
Vitamin A1 mempunyai panjang gelombang maksimum pada 326 nm
sedangkan vitamin A2 mempunyai panjang gelombang maksimum
pada 351 nm.
15
2.4.2 Metode kolorimetri
2.4.2.1 Metode Carr-Price
Metode Carr-Pierce mencakup perlakuan vitamin A dengan
antimon (III) klorida; warna biru yang timbul memberikan serapan
maksimum pada panjang gelombang 620 nm dan mematuhi hukum
Lambert-Beer. Antimon (III) klorida yang digunakan sebagai reagen
penghasil warna bersifat korosif, dan membutuhkan penanganan secara
khusus dan kadang-kadang menyebabkan kerusakan terhadap peralatan
spektrofotometer. Dilihat dari formasi antimon (III) klorida, zat ini
sulit untuk untuk dibersihkan dari kuvet dan juga peralatan preparasi.
Warna biru yang timbul sangat tidak stabil dan pengukuran absorbansi
harus dilakukan antara 5-10 detik dari penambahan reagen (Rohman
dan Sumantri, 2007).
2.4.2.2 Pengukuran secara spektrofotometri dengan menggunakan
Asam trifluoro asetat
Asam trifluoro asetat bereaksi dengan vitamin A dan turunannya
sehingga mengasilkan warna biru yang memberikan serapan maksi-
mum pada panjang gelombang 616 nm. Reaksi warna yang terjadi
mematuhi hukum Lambert-Beer pada kisaran konsentrasi vitamin A
sebesar 10-6 dan 10-5 M (Libman, 1966).
2.4.2.3 Pengukuran secara spektrofotometri dengan menggunakan
gliserol diklorohidrin aktif
Gliserol diklorohidrin aktif bereaksi dengan vitamin A dalam
kloroform untuk menghasilkan warna ungu yang stabil dan mem-
punyai serapan maksimum pada panjang gelombang 555 nm. Reaksi
warna yang terjadi mematuhi hukum Lambert-Beer pada kisaran yang
lebar. Intensitas warna yang timbul 1/3 jika dibandingkan dengan
intensitas warna biru dari metode Carr-Pierce yang menggunakan
antimon (III) klorida. Reaksi bergantung pada suhu pengujian dan
disarankan pembuatan kurva kalibrasi dan analisis sampel dilakukan
pada suhu yang sama (Libman, 1966).
16
2.4.2.4 Pengukuran dengan menggunakan Asam fosfotungstat
Vitamin A dalam kloroform bereaksi dengan asam fosfotungstat
dalam etil asetat dengan adanya asetat anhidrat maka menghasilkan
warna biru dan memberikan serapan maksimum pada panjang gelom-
bang 620 nm. Reaksinya mematuhi hukum Lambert-Beer. Pada pema-
nasan dengan suhu 50°C menggunakan penangas air, warna biru yang
ada akan berubah menjadi biru keunguan, ungu, dan akhirnya menjadi
merah dan mempunyai serapan maksimum pada 530 nm. Warna merah
yang timbul juga mematuhi hukum Lambert-Beer dan cocok untuk
pengujian vitamin A, akan tetapi metode ini kurang sensitif untuk
bahan dengan kadar vitamin A rendah (Libman, 1966).
2.4.2.5 Pengukuran secara kolorimetri dengan aluminium klorida
Metode ini mencakup reaksi larutan jenuh aluminium klorida
dalam kloroform anhidrat dengan vitamin A. Warna yang timbul
mempunyai serapan maksimum pada panjang gelombang 618 nm dan
mematuhi hukum Lambert-Beer (Libman, 1966).
2.4.2.6 Pengukuran menggunakan asam fosfomolibdat
Metode ini melibatkan reaksi vitamin A dengan asam fosfo-
molibdat; warna biru yang timbul memberikan serapan maksimum
pada panjang gelombang 700 serta mematuhi hukum Lambert-Beer
(Libman, 1966).
2.4.3 Metode Spektrofluorometri
Berdasarkan sifat vitamin A yang dapat memberikan flourosensi,
maka vitamin A dalam bahan pangan yang telah diekstrasi dapat diu-
kur menggunakan spektrofluorometer pada panjang gelombang eksi-
tasi 330 nm dan emisi 480 nm. Pengukuran dengan metode spektro-
fluorometri lebih spesifik dibandingkan cara spektrofotometri, karena
banyak senyawa yang memberikan serapan pada daerah UV, namun
tidak memberikan sifat flourosensi (Angustin dkk 1985).
2222.4.3
17
2.4.4 Metode Kromatografi
2.4.4.1 Pengukuran dengan kromatografi lapis tipis
Vitamin A dapat dipisahkan dengan komponen lainnya secara
kromatografi lapis tipis menggunakan fase diam silika gel F254 dan fase
gerak campuran siklo heksana dan eter dengan perbandingan 4:1, noda
yang telah terpisah dideteksi menggunakan asam fosfomolibdat dan
bercak biru hijau yang terjadi menunjukkan adanya vitamin A.
Perkiraan harga Rf vitamin A dalam bentuk alkohol, asetat dan
palmitat berturut-turut adalah 0,1; 0,45 dan 0,7 (Depkes 1995). Untuk
mendeteksi noda vitamin A dapat juga digunakan larutan antimon (III)
klorida yang akan memberikan warna biru (Depkes 1979) atau
menggunakan UV pada pada panjang gelombang 254 nm (CE 2007).
Sebagai fase gerak selain menggunakan campuran siklo heksana dan
eter, juga dapat digunakan campuran siklo heksana dan etil asetat
dengan perbandingan 9:1 (Libman 1966).
2.4.4.2 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Vitamin A dapat ditetapkan kadarnya menggunakan KCKT
menggunakan kolom fase normal atau kolom fase terbalik. Dengan
menggunakan kolom fase normal, vitamin A ditetapkan kadarnya
menggunakan fase diam kolom silika, fase gerak n-heksana dan
dideteksi menggunakan UV 325-nm (USP Convention 2008). Sebagai
fase gerak dapat juga digunakan campuran heptana dan diisopropil
eter, 95:5; heksana dan dietil eter 98:2; 1-5 % 2-propanol dalam
heptana; heksana dan metil etil keton, 90:10 (Nollet 2000). Dengan
kolom fase terbalk, vitamin A ditetapkan kadarnya menggunakan fase
diam kolom C18, fase gerak campuran metanol dan air dengan
perbandingan 860:140 dan dideteksi menggunakan UV 328-nm atau
313-nm (AOAC International, 2005). Sebagai fase gerak dapat juga
digunakan campuran asetonitril dengan air 90:10 (Eitenmiller, 2008);
campuran asetonitril dengan air, 90:10 atau campuran metanol dengan
air, 80:20 (Augustin dkk 1985). Persiapan sampelnya terdiri atas
18
proses saponifikasi, ekstraksi, pemekatan dan melarutkan kembali
menggunakan pelarut yang sesuai.
2.5 INTRUMENTASI KCKT
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut
dengan HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan teknik
pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa
tertentu dalam suatu sampel. Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan
senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis. KCKT merupakan
metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kuali-
tatif maupun kuantitatif (Rohman 2007).
Kromatografi adalah suatu prosedur pemisahan zat terlarut oleh suatu
proses migrasi difrensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau
lebih, salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah
tertentu dan di dalam zat tersebut menunjukkan perbedaan morbilitas disebab-
kan adanya perbedaan dalam adsorbsi, partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran
molekul atau kerapatan muatan ion (Depkes 2009b)
Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas komponen pokok yaitu
wadah fase gerak, sistem penghantaran fase gerak, alat untuk memasukkan
sampel kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, tabung peng-
hubung dan suatu komputer atau integrator atau perekam (Johnson, 1991).
Diagram blok untuk sistem kromatografi cair kinerja tinggi ditunjukkan pada
Gambar 2.
2.5 IIIINTR
ddddeng
ppepeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeemimmimimimimimimimimimimimimimmmmimimimimimimimimimmmmimimmmmimimiimimimimmimimimmimimmmmimimmimmmiimimimimmiiimiiimimmimmmmmmimimimmmmmmmimmm
teeertrtrtrtrtrrtrttrtrttrtrttrtrtrtrttrttrtrtrtttrttrtrtttttrtrrttrtrrtrtttrtttrtttrrrtttrtrttrrtttrtrtrtrttrtttttrtttrtrttttrrrrtrrttrtrtrtttrttttrrttteeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeen
ssseeenynynnnynynynynynnynynynynynynynynynynynynynynynnnnynynynnnynynynyynnnynnnynynynnnynynnynynynyyynnnnyyynynyyyyynynynyynnyyynynyyyyyyyyyya
mmmemeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeettttttttotottttttotttttttttttttttttottttttttttttttttttttttttttttt
taaatitititititittiittiiiitititiititiitiitittttiiiiiiitiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiitiiiiiiif f f ff ff fffffffffffffffff fffffffffffffffffffffff fffffffffffffffffff m
pprprrososososososooososososososososoosoooosooooooosooooosoooooooooossooooooooooooooooooooooooooooooosoooosoooooosoooosoososse
leeeebibibibibibibibbbibibibibibbbbiiibibibbibbbibiiibibbibibiibibiibbibibibibibbibibibiibibbbbbbibbbibbibbbibibbbiibiibbbiiibiibiiiibbbiiiiibibbbihhhhhhhhhhhhhhhhhhh
teeertrtrtrtrtrtrtttttttrttttttttrtrttrttrttttttrtrtrttrtttrtttttrtrttttttttrtrttrrtttrttttttrtttrttttrtttrtttttrtttrtttttrtrtrtrtrtttttttttteeeneeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeee
kkkakaaaan n nnnnnnnnn n n nnnnnnnn n n nnnnnnnnn nnnnnnnnnnnnnnn nnn nnnn n nnnnnnn nnnnn a
mmmomoooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooleleleleleleelleelllellllllllllllllllllllllelellllelllellllllell
wwwwada
sssamp
hhhhubu
DDDDiagr
GGGGam
19
Gambar 2. Diagram Blok Sistem KCKT
2.5.1 Wadah Fase Gerak pada KCKT
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah ini
biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.
Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilang
gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul
dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan
mengacaukan analisis.
2.5.2 Fase Gerak Pada KCKT
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut
yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya
elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas
keseluruhan pelarut, polaritas fase diam dan sifat komponen-kompo-
nen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase
20
gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas
pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar dari-
pada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya
polaritas pelarut.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan
dengan fase terbalik adalah campuran larutan buffer dengan metanol
atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase
normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran
pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau
menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol.
2.5.3 Pompa pada KCKT
Pompa yang digunakan untuk KCKT adalah pompa yang
mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni pompa
harus inert terhadap fase gerak. Pompa yang digunakan sebaiknya
mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan
fase gerak dengan kecepatan alir 1-3 mL/menit. Untuk tujuan prepa-
ratif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak
dengan kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak
adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung
secara tepat, reproduksibel, konstan dan bebas dari gangguan.
2.5.4 Injektor/Penyuntikan Sampel Pada KCKT
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke
dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom
menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan
katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sampel loop)
internal atau eksternal.
Pada saat pengisian sampel digelontor melewati keluk sampel
dan kelebihannya dikeluarkan ke pembuang. Pada saat penyuntikan,
katup diputar sehingga fase gerak mengalir melewati keluk sampel dan
2222.5.5.5.5.5.555555555555555555555555555555555.5555555555555555555555555555555555 33333333333333333333333333
2222.5.4
21
menggelontor sampel ke kolom. Presisi penyuntikan dengan keluk
sampel ini dapat mencapai nilai RSD 0,1%.
2.5.5 Kolom Pada KCKT
Kolom KCKT pada umumnya terbuat dari pipa baja tahan karat.
Panjang kolom antara 10-30 cm dengan diameter dalam 4,5-5,0 mm.
Kolom diisi dengan yang sesuai untuk pemisahan sampel tertentu.
Kolom untuk pemisahan analitik umumnya mempunyai diameter
dalam 2-4 mm. Kolom dapat dipanaskan sampai 60oC agar dihasilkan
pemisahan yang lebih efisien. Jika tidak dinyatakan lain, kolom
dipertahankan pada suhu kamar.
Fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara
kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren
dan divinil benzene. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam
karena adanya residu gugus silanol (Si-OH), Oktadesil silan (ODS atau
C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena
mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah,
sedang, maupun tinggi. Fase diam eksklusi dan penukar ion dapat
menggunakan silika atau polimer.
2.5.6 Detektor KCKT
Detektor pada KCKT ada 2 yaitu (1) Detektor universal (yang
mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik dan tidak
bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri
massa, dan (2) Detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi
analit secara spesifik dan selektif, seperti detector UV-VIS, detektor
fluoresensi dan elektro kimia.
2.5.7 Komputer, Integrator atau Rekorder.
Alat pengumpul data seperti komputer, integrator atau rekorder,
dihubungkan dengan detektor. Alat ini akan mengukur sinyal elektro-
nik yang dihasilkan oleh detektor lalu memplotkannya sebagai suatu
kromatogram.
22
2.6 VALIDASI METODE ANALISIS
Suatu metode analisis terdiri atas serangkaian langkah yang harus
diikuti untuk tujuan analisis kualitatif dan kuantitatif dengan menggunakan
teknik tertentu. Faktor-faktor yang harus diperhatikan dalam melakukan
pemilihan metode analisis adalah: tujuan analisis, biaya yang dibutuhkan,
serta waktu yang diperlukan; level analit yang diharapkan dan batas deteksi
yang diperlukan; macam sampel yang akan dianalisis serta pra-perlakuan
sampel yang dibutuhkan; jumlah sampel yang dianalisis; ketepatan dan
ketelitian yang diinginkan untuk analisis kuantitatif; ketersediaan bahan
rujukan, senyawa baku, bahan-bahan kimia, dan pelarut yang dibutuhkan;
peralatan yang tersedia; kemungkinan adanya gangguan pada saat deteksi
atau pada saat pengukuran sampel. Menurut Rohman dan Ibnu (2007),
kriteria yang harus dipenuhi suatu metode analisis yang baik adalah:
1. Peka (sensitive) artinya metode harus dapat digunakan untuk mene-
tapkan kadar senyawa dalam konsentrasi yang kecil.
2. Selektif, artinya untuk penetapan kadar senyawa tertentu, metode
tersebut tidak banyak terpengaruh oleh adanya senyawa lain.
3. Tepat (precise) artinya metode tersebut menghasilkan suatu hasil
analisis yang sama atau hampir sama dalam satu seri pengukuran
(penetapan).
4. Teliti (accurate) artinya metode dapat menghasilkan nilai rata-rata
(mean) yang sangat dekat dengan nilai sebenarnya (true value).
5. Kasar (rugged) artinya ada perubahan komposisi pelarut atau variasi
lingkungan tidak menyebabkan perubahan hasil analisis.
6. Praktis artinya metode tersebut mudah dikerjakan serta tidak banyak
memerlukan waktu dan biaya.
Pengembangan metode analisis biasanya didasarkan pada metode yang
sudah ada menggunakan instrumen yang sama atau hampir sama. Pengem-
bangan metode analisis biasanya membutuhkan syarat-syarat metode
tertentu dan memutuskan jenis alat yang akan digunakan. Pada tahap
pengembangan metode, keputusan yang terkait dengan pemilihan kolom,
2.6 VVVVAL
diik
tek
pepp m
sesesseseseesesesesesesesesesseseeseseseseseseeseseeseseeseseesessesesesseeeseseesseseessseeseseeesseeeeeeeeeeseeeseesseeseesses rrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrr
yayayayayayyayyayayyayayyyayayayayayayyayyayyyayyyayyyyyayyayayyyyyyaayayayyyayyyyayayyayayyayyyyayyyyyyayyyyyyyyayaayayyayyyyyayyayyyyyyyyyyayyaaayyyyyyyyyyyyyy n
sasasasasasasasasasasasssasasasasaasassasaasaaaasasasasasasaaaassaaassassassasssaaassssaasasssassssassssaassasasassasassam
kekekekekekeekekekekkekekeekkekeekkekekekekekkekekkkkkkeekekekkkkekekkkekeeekkeekekeeeekekkkkkkkkeekkekkkkekkkkkkkkkeeet
rururururururururururururururrurruuuuuuuruurururrururuururuuurrruuurruuuurururruruurrurururuurruuurruurruurrrurrruurruurruurrr jjjjjjjjjjj
pepepepppepepeppeppepepepepepeppepepppepeepeepepepepepepepeppeepeepeepeppeepppepepepppepeeppepepeppppppeeppeeppppeppepppppppppppppppppp r
atatatatataatatattatatattatatataatatatatatataataattataaaaaaatatattataataatatatataaatataaaataataaattatataataattaaattataaaataatattaataattaattaatataataaaaaatattatttttaaa
kkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkkrirrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrr
1.1.1.1.1.1.111.111111.11.11111111.1.11.1.1.11111111.111.1.11111111.11111111.1111111.1111111.1111111
2.2.2222.2.222.2222.2.222222.222222222.2222.2.2.22.2.2222222222222222222222222222222222222222222222222
3.
4.
5.
6.6.6.6.6666.6.66666.66666666.6666.66.6.66666.6666666.6666.666.6.6.6666.666.66666.6.6.6.6...66
sususuususuuususuuuuusuuuuuuuususuusuuusuuusususuuuusuuusuuuuuususuuuuusuuuusuuuuus dddddddddddddddddddd
bababababababababababababbabbbbbbbababbbbbbabbbbbbbbbbbbbbbbaaaaaaaaan
tetettetetetetetttetttettttettttttttttetteeeteteteteeteeeteeerrr
pepepepepepeppeppepepepepepeppepeepepepepppepepepepeppeppepppppppppppppeeeeeppeeeepppppepepepeeennnn
23
fase gerak, detektor dan metode kuantisasi harus diperhatikan. Ada beberapa
alasan tertentu untuk pengembangan metode analisis yang baru, yaitu:
1. Belum ada metode yang sesuai untuk analit tertentu dalam suatu matriks
sampel tertentu.
2. Metode yang sudah ada terlalu rumit, terlalu banyak tahap perlakuan
yang dapat menimbulkan kesalahan atau metode yang sudah ada tidak
reliabel (presisi dan akurasinya rendah).
3. Metode yang sudah ada terlalu mahal, membutuhkan waktu dan energi
yang besar atau tidak dapat diotomatisasikan.
4. Metode yang sudah ada tidak memberikan sensitivitas atau spesifisitas
yang mencukupi pada sampel yang dituju.
5. Adanya kebutuhan untuk pengembangan metode alternatif, baik untuk
alasan legal atau alasan saintifik.
Suatu metode perlu divalidasi terlebih dahulu sebelum metode
tersebut digunakan untuk penggunaan lebih lanjut, sehingga metode tersebut
dapat menjamin bahwa analisis yang dilakukan dapat dipercaya dan sesuai
dengan tujuan penggunaanya serta dapat diandalkan untuk mengambil
keputusan. Metode analisis yang akan digunakan harus disesuaikan dengan
kondisi laboratorium, peralatan dan pereaksi yang tersedia. Walaupun
metode analisis vitamin A dalam minyak goreng sawit masih sulit didapat,
namun metode analisis vitamin A dalam produk pangan dengan meng-
gunakan peralatan moderen, diantaranya dengan menggunakan KCKT sudah
banyak yang dikembangkan oleh peneliti terdahulu. Namun kelemahanya
dari metode yang ada adalah kerumitan dalam penyiapan sampel (saponi-
fikasi, ekstraksi dan pemekatan atau penguapan pelarut organik yang
digunakan). Metode analisis yang dikembangkan oleh peneliti ini dipilih
karena memiliki banyak kelebihan, yaitu metodenya tanpa proses saponi-
fikasi, ekstraksi dan penguapan pelarut organik yang digunakan sehingga
waktu analisinya relatif lebih cepat.
Menurut Gunzler (1996), validasi metode adalah menetapkan dengan
percobaan laboratorium yang sistimatik, pemenuhan karakteristik unjuk
kerja metode terhadap spesifikasi yang dikaitkan dengan penggunaan hasil
24
pengujian yang dimaksudkan. Karakreristik unjuk kerja (parameter) yang
ditetapkan mencakup: presisi, akurasi, selektivitas dan spesifisitas, batas
deteksi, batas kuantisasi, rentang, linieritas, sensitivitas dan kekasaran
(ruggedness). Menurut Harmita (2004), beberapa parameter analisis yang
harus dipertimbangkan dalam validasi metode analisis yaitu kecermatan
(akurasi), keseksamaan (presisi), selektivitas (spesifisitas), linearitas dan
rentang, batas deteksi dan batas kuantitasi, ketangguhan metode
(ruggedness) dan kekuatan metode (robustness).
Validasi metode adalah konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan
bukti yang objektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu tujuan khusus
dipenuhi. Proses validasi suatu metode biasanya sangat dekat dengan proses
pengembangan suatu metode. Sebuah metode harus divalidasi bila kinerja
parameter metode uji tersebut belum valid atau belum dibuktikan valid
untuk penggunaan analisis khusus (BSN 2005).
Tujuan memvalidasi metode adalah untuk mengetahui sejauh mana
penyimpangan suatu metode tidak dapat dihindari pada kondisi normal,
dimana seluruh elemen terkait telah dilaksanakan dengan baik dan benar.
Dengan memvalidasi metode, tingkat kepercayaan yang dihasilkan oleh
suatu metode pengujian dapat diperkirakan dengan pasti ( Hadi, 2007)
Menurut USP Convention (2009), presisi adalah derajat kesesuaian
diantara hasil uji individu (berdiri sendiri) jika metode uji dilakukan
berulang-ulang terhadap multi sampling dari suatu sampel yang homogen.
Presisi biasanya dinyatakan sebagai simpangan baku atau simpangan baku
relatif (koefisien variasi) dari serangkaian pengukuran. Presisi hendaknya
dilakukan pada tiga tingkat berbeda yaitu: ripitabilitas, presisi intermediat
dan reprodusibilitas. Ripitabilitas adalah penggunaan metode pengujian di
dalam satu laboratorium dalam satu periode waktu yang singkat menggu-
nakan personel penguji yang sama, dengan peralatan yang sama di bawah
kondisi sekonstan mungkin. Presisi intermediat dilakukan dengan berbagai
variasi di dalam laboratorium, seperti pada hari yang berbeda atau personil
penguji yang berbeda atau alat yang berbeda dalam laboratorium yang sama.
Reprodusibilitas atau disebut juga ruggedness adalah penggunaan metode
pen
dite
det
(ru
har
(((ak
rerererererererererererererererrererererererererereererererrerreerererererererrrrerererererererererrererererererererrerrerrerereerereeeeeennnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn
(r(r(r(r(r(r(r(r(r(r(r(r(r((((((rr(r(((r(r(r(r(r(r((r(r(((((r(r((r(((r(r(r(r(r((r(rr(r(r((r(r(rr(rrr(r(r(r(r(r(rrr((r(r(rrrrr(r(rrr(r(r(rrr(rr((rr(r(r((rr(rr(r(r(r((r(r(r((((r((((r(r(((((( uuuuuuuuuuuuuuuuu
bubububububuububububbububuubububuubbububububuubububbbbububuuuubuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuububbuubbbuubbubbububbbbuuuuuuuuk
dididididididididididididididdiddiiididddididididdddddididdididididdididididdididdiddddididiidiididddddiddddidiiddddiiddddiiddiippppppppppppppppppppppppppp
pepepepppepepepepeepepepepepepeppepeppepeepeepeepeepepepeepepepeepeepeepeepeeppeepepeppepepeepepepeppppppeepeeeeeeepeppppppppeeppppppppp n
papapapapapapapapapapapapapaapapppppapapapaapapappapappapapapapappapapapppapappapaapapappapaaaappappaaapapppapapappaapappapaaappaappapappapappaaaapaaaaappppppppppp r
unununununununnunununununununuuununnunnunununnunnunnunnnuuuunuunnnnunnnunuunuunuunnnnnunuunnuuununnnununnuuunnuunnt
pepepeepepepepepepepeeeeeppepeepeeeeeeppepepepepepeepepepepepeeepepeepeepepepeeepeepeppeppeppepppeepepppeppepeeeeppppeeeeepepepepppppepppepppppppppppppppp n
dididididididididididddiddididididididididididididididdididddiidididddidiiiidiididiiddidiidiididididiiiiiddddddiididiiddiiiiidididddiiididdddidiiiiididiidiiiiddddidddddddidd mmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmm
DeDeDeDeDeDDDeDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD
sua
dia
ber
Pre
rela
dididdididididdidididididddidididididiidididdiidididdidiididididiiididdididddidddidddiddddididdddidiiddddiiiiidddiddidiididiiidddddiiidddddddiiiiddd lllllllllllalalllalllalllallllllllllllllllllllllllllllllllllll
daddadadadaddadadadadadadddddddddadadddadadddaddadadddadadadaddadadadaddadaddaaddadadadaddadaddaddadadadaadadadaaddaadaadaadadaaadadaaaaadaad n
dadadadadadadaddadadadadadadadadadaddaaddadadadadadaddadadadadaddadadadadaddadddddadaddadadadaaddaaaadadaaadadaaaaaaaaaaaaal
nananananannnnanannanannannaaanananannnnannnanannnnnnnanannannannnannnnannnnnnannnnnannnnnnnnnnnnnnnnananannannaakkkkkkkkkkkkkkkkkkkk
kokokokokookokokokookokokokookokokokookokookookookokokokokokokookoooookooooookokoookookokokookokooookoonnnnn
vvavvavavavavavavvvvavavvavvavavvvavavvvvvvavvvvvvavvvvavvvvvvvaavvvaavaar
pepeppepepepepeppeppepeppepppeppeppppeppeppppppepppppppepepepppepepppeepepepepepepepeeeppp n
ReRReReReRReReReReReReReRReReReReRRRReReReRRReRReRRRRRReReRRRReRRRRReRRRRRReRRRRRRRRRRRRRRRRReRRRRRRRRRRReRRReReRReRRRReReeeppp
25
pengujian dalam berbagai laboratorium yang berbeda seperti dalam uji
kolaborasi.
Akurasi adalah ukuran ketepatan dari suatu metode pengujian, atau
kedekatan antara nilai hasil uji yang diukur dengan nilai benar, atau nilai
nilai konvensional atau nilai acuan yang dapat diterima (USP Convention
2009). Akurasi dari suatu metode dapat dilakukan dengan cara: mengguna-
kan bahan acuan bersertifikat, membandingkan hasil yang benar-benar telah
dikarakterisasi dan akurasinya telah ditetapkan atau dengan cara menghitung
persen perolehan kembali terhadap sampel yang sudah dispike (Wood R
1998). Kriteria kecermatan dalam persen perolehan kembali sangat tergan-
tung kepada konsentrasi analit dalam matriks sampel dan pada keseksamaan
metode (RSD) (Oktavia, 2006). Persen rekoveri rata-rata untuk tiap level
konsentrasi dinilai terhadap rentang % rekoveri pada Tabel 5.
Selektivitas menunjukkan kemampuan suatu metode membedakan
antara analit yang dituju dan komponen lain / bentuk-bentuk analit lain yang
mungkin ada dalam matrik untuk mengukur secara akurat dan spesifik analit
dalam matriks sampel dengan adanya zat pengganggu. Selektivitas sering-
kali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan (degree of bias) metode
yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan
berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, dan
dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan
lain yang ditambahkan (Oktavia, 2006).
Tabel 5. Keberterimaan akurasi berdasarkan % rekoveri
No % Analit Rasio Analit SatuanRentang
keberterimaan (% Rekoveri)
1 100 1 100 % 98 – 1022 10 10 -1 10 % 98 – 1023 1 10 -2 1 % 97 – 1034 0,1 10 -3 1000 ppm 95 – 1055 0,01 10 -4 100 ppm 90 – 1076 0,001 10 -5 10 ppm 80 – 1107 0,0001 10 -6 1 ppm 80 – 1108 0,00001 10 -7 100 ppb 80 – 1109 0,000001 10 -8 10 ppb 60 – 115
10 0,0000001 10 -9 1 ppb 40 – 120
26
Linieritas adalah kemampuan untuk menghasilkan hasil uji yang
sebanding/berbanding lurus terhadap konsentrasi analit dalam sampel pada
kisaran konsentrasi tertentu. Menentukan kemampuan suatu metode untuk
mendapatkan respon yang proporsional terhadap konsentrasi analit (Oktavia,
2006).
Rentang yaitu kemampuan untuk memperoleh hasil uji yang kadar
analitnya masih linier dengan presisi dan akurasi yang masih dapat diterima.
Ditetapkan bersamaan dengan penetapan linieritas dengan melakukan peng-
ujian terhadap sampel yang kadarnya dibawah dan diatas normal. Rentang
metoda menjelaskan rentang konsentrasi dimana metode uji diaplikasikan
yang dinyatakan dalam presisi, akurasi (trueness) dan linieritas (Oktavia,
2006).
Batas Deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat
dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingan dengan
blanko. Batas deteksi merupakan parameter uji batas. Batas kuantitasi
merupakan parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas
terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan
seksama. Penentuan batas deteksi suatu metode berbeda-beda tergantung
pada metode analisis itu menggunakan instrumen atau tidak. Pada analisis
yang tidak menggunakan instrumen batas tersebut ditentukan dengan
mendeteksi analit dalam sampel pada pengenceran bertingkat. Pada analisis
instrumen batas deteksi dapat dihitung dengan mengukur respon blanko
beberapa kali lalu dihitung simpangan baku respon blanko. Batas deteksi
dan kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui garis regresi linier dari
kurva kalibrasi (Oktavia, 2006).
seb
kis
me
200
ananananananananananananaananananananananannananannaaananannanananananaananannanaanananananaaannnanannaanannaannnnaanannnaananannannannannaannaanaanaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
DiDiDiDiDDDDiDiDiDiDDiDDiDDDiDDDiiDiDDiDDDDDiiDiDiDiDiDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDit
ujujujujujujujuujujujujujujujujujujujujujujujujuujujujujjuujujuujjjuujjujujujujujujujjjujujjjujjujjujjjujujjuuujjujujujujuujujuujuujuuuujujjujjujuuuujjujuujujuuujujuuujujjjjjjjiiaiiiiiiiiiii
memememmmmmemmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmm
yayayayayayayayayayayaayayyayayyayyyaaaaayaayayayyayyayayaaayyyaaayyyaaayayayyayaayyayayyaayyyyayyaayyaayyyayayyaayyaayyaayyayyy n
20202020202020022020202002020220202020202022020202020202020200020202000202000200202020020002002002002000200220202020222220020000000222222200
didididdidididddidididdididdididiididdididdididddddddddiddiddididididdiiididdiiididdididddddididiidiiiddidiididiiiddddidiidddidiiid dddddddddd
blblblbblblbblblblbblblblbllblblblblblblbblbllllblbblbbblblbllblblblblllbllbllblblbbllblbbbbllbbbllblbbbllblbbbblllbblblblllbllllbbblbbbllllllllllllbllllllblblbbbb aaaaaaaa
mememmmmememememmmmmeemmmmemmmmeemmmmmmmmmmemmmmmmemmmmmememmemememmemmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmm
tetetetetetetteeteteteeteteteeteeeeeteeeeeteteeeeteeeeteeeeeteteeeteeeeteeeeeeeeeeteteteeeeeeeeteeeeeeeteeeeeteeeeeeeeeeeeeerkrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrr
sesesesssesesesesesesssseeseessseseseeessesesseseseessseeesesseseeeeseeeeeeeeeseseeeseeeseeeeeessseesessssssekkkk
pad
yan
me
inst
beb
dan
kukukkukukukukukkukukukukukukukukukukuukukukkukukukukukuukukukukukuukukkkukukuukukukukukukukukukukukkukkukukukkkuuukukukukuuuukuuuukuukkuuuukuuukkkkkkkukuukukkkukukuuurrrrrrrrrrrrrrrr