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Ref.: S2009/AGR-1464
III REUNIÓN CIENTÍFICA
ANALISYC-II
Instituto de Química Orgánica General, (CSIC). Madrid, 12 de Junio de 2012
GRUPO UNED-QA
Separación cromatográfica de los colorantes azoicos (Sudán I-IV y Para Red)
Desarrollo de un sistema de extracción basado en la metodología MSPD para la extracción de Sudán I-IV y Para Red en salsas de tomate, ketchup, curry, etc..
2.
3.
Nuevas síntesis, caracterización y evaluación analítica de MIPs selectivos para la determinación de colorantes
4.
1.
Síntesis de los polímeros de impronta molecular para los estrógenos objeto de estudio
GRUPO UNED-QA
Separación cromatográfica de los colorantes azoicos (Sudán I-IV y Para Red)
Desarrollo de un sistema de extracción basado en la metodología MSPD para la extracción de Sudán I-IV y Para Red en salsas de tomate, ketchup, curry, etc..
2.
3.
Nuevas síntesis, caracterización y evaluación analítica de MIPs selectivos para la determinación de colorantes
4.
1.
Síntesis de los polímeros de impronta molecular para los estrógenos objeto de estudio
GRUPO UNED-QA
Nuevas metodologías selectivas de tratamiento de muestra en continuo aplicadas a la determinación de alteradores endocrinos
en muestras de agua
MIP- DES MIP- E2
MIP- EE2
Analitos
ethynylestradiol (E2), beta-estradiol (EE2), diethylstilbestrol (DES), estriol (E3) y estrona (E1)
Micro-Columna MISPE- Análisis por Inyección en Flujo
MISPE-Multiple-online
MANIFESTACIONES CIENTIFICAS
GRUPO UNED-QA
PROCEDIMIENTO
MIP-Multiple
Disolventes
de lavado y elución
Carga
Eluato
HPLC-DAD Bomba peristáltica
Flujo: 1.7 mL min-1
Micro-Columna
MANIFESTACIONES CIENTIFICAS
GRUPO UNED-QA
Flujo
Microcolumnas de teflón:
Columna A (D 1.5 mm, L 10 mm)
Columna B (D 3 mm, L 4 mm)
Columna C (D 1.5 mm, L 24 mm)
Carga (agua Milli-Q)
Lavado (agua Milli-Q)
Elución (agua/etanol 50:50)
CONDICIONES FIA-MISPE CROMATOGRAFICAS
Flujo: 1 mL/min
Gradiente Fase Móvil:
A (acetonitrilo), B (agua Milli-Q)
35 % A : 65 % B 5 min.
50 % A : 50 % B 5 - 20 min.
35 % A : 65 % B 20 min.
Tª de la columna (fase reversa): 25º C
Longitud de onda: 226, 280 nm
Inyección: 20 microlitros
MANIFESTACIONES CIENTIFICAS
GRUPO UNED-QA
OPTIMIZACION DE VARIABLES
Microcolumnas
Columna A (D 1.5 mm, L 10 mm) Columna B (D 3 mm, L 4 mm) Columna C (D 1.5 mm, L 24 mm)
MANIFESTACIONES CIENTIFICAS
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Columna A Columna B Columna C
Re
cu
pe
rac
ion
es
(%
)
Metanol/acetonitrilo (50:50)
E2
EE2
DES
GRUPO UNED-QA
Elución MANIFESTACIONES CIENTIFICAS
0
50
100
150
200
�E3 �E2 �EE2 �E1 �DES
Re
cu
pe
rac
ion
es
(%
)
Columna C
agua/acetonitrilo(80:20)
etanol
hexano
agua
0
20
40
60
80
100
120
�E3 �E2 �EE2 �E1 �DES
Re
cu
pe
rac
ion
es
(%
)
Columna A
agua/etanol(50:50)
agua/acetonitrilo(50:50)
MANIFESTACIONES CIENTIFICAS
GRUPO UNED-QA
0
20
40
60
80
100
120
6,2 12,5 25 50 100
Re
cu
pe
rac
ion
es
(%
)
Concentraciones (ng/mL)
E3 E2 EE2 E1 DES
0
20
40
60
80
100
120
E3 E2 EE2 E1 DESR
ec
up
era
cio
ne
s (
%)
agua/etanol (50:50)
agua/acetonitrilo (50:50)
GRUPO UNED-QA
y = 427,83x + 2,8957
y = 183,03x + 5,4957
y = 228,05x + 5,8253
y = 146,57x + 6,55
y = 626,71x + 4,2478
0
10
20
30
40
50
60
70
0 20 40 60 80 100 120
Are
as
Concentraciones (ng/mL)
E3
E2
EE2
E1
DES
Compuesto Rango lineal R2 Limite de detección RSD
E3 12.5 – 100 0,9914 9,1 0,1
E2 12.5 – 100 0,9805 9,3 0,1
EE2 6.2 – 100 0,9902 4 0,15
E1 25 – 100 0,9974 25 0,11
DES 12.5 – 100 0,989 7,8 0,06
MANIFESTACIONES CIENTIFICAS CARACTERISTICAS ANALITICAS
GRUPO UNED-QA
APLICACIONES Recuperaciones (%)
E3 E2 EE2 E1 DES
AGUA DE GRIFO
25 ng/mL 118 98 105 95 89
50 ng/mL 109 106 93 96 80
AGUA DE RIO (Manzanares)
25 ng/mL 97 101 88 98 101
50 ng/mL 91 82 96 98 84
MANIFESTACIONES CIENTIFICAS
GRUPO UNED-QA
Desarrollo de un MIP como material sorbente para la extracción y limpieza selectiva de antibióticos macrólidos en muestras de leche de
oveja.
Control del nivel de residuos
Riesgo para salud pública
Veterinaria
Acumulación en tejido adiposo y órganos diana
Presencia de antibióticos en productos de consumo humano
Terapéutico
Antibióticos Profiláctico Engorde del
animal
MANIFESTACIONES CIENTIFICAS
GRUPO UNED-QA
MANIFESTACIONES CIENTIFICAS
Legislación
• Reglamento CEE 2377/1990:
Define los LÍMITES MÁXIMOS DE RESIDUOS (MRLs) como la concentración
máxima de medicamentos veterinarios permitida en alimentos de origen animal.
• Reglamento CE 1181/2002:
Fija los MRLs de antibióticos macrólidos en muestras de leche.
Tilosina: 50 g kg-1 Eritromicina: 40 g kg-1
Roxitromicina: 200 g kg-1 Espiramicina: - Ivermectina: -
Josamicina: -
GRUPO UNED-QA
Objetivos
- Establecer un método sencillo y selectivo de tratamiento de muestra para la determinación
simultánea de antibióticos macrólidos en leche de oveja desarrollando un proceso MISPE.
- Establecer la estrategia de síntesis más adecuada para el MIP de forma que presente un
adecuado reconocimiento y capacidad de unión específica para la eritromicina.
- Optimización de las etapas del proceso MISPE.
- Optimización del método cromatográfico aplicado a la determinación de los antibióticos.
- Determinación selectiva de antibióticos macrólidos en leche de oveja mediante este método.
Grasa: 6 - 7%
LIMPIEZA - PRECONCENTRACIÓN
MATRIZ COMPLEJA Proteínas: 5 - 6%
MANIFESTACIONES CIENTIFICAS
GRUPO UNED-QA
MANIFESTACIONES CIENTIFICAS
Resultados
1. Carga del analito en acetonitrilo
Metanol (2x2 mL) % Eritromicina recuperada
Polimerización por
calor Polimerización por
radiación UV
MIP 56 73
NIP 10 21
Metanol /Ác. acético (0.5%) (2x2 mL) Metanol /Ác. acético (0.5%)
(3x2 mL)
3. Optimización volumen de elución
2. Optimización elución
% Eritromicina recuperada
Polimerización por
calor
Polimerización por
radiación UV
MIP 99 97
% Eritromicina recuperada
Polimerización por calor
Polimerización por radiación UV
MIP 95 65
NIP 50 43
% Eritromicina retenida
Polimerización por
calor
Polimerización por
radiación UV
MIP 99 74
NIP 55 54
GRUPO UNED-QA
MANIFESTACIONES CIENTIFICAS
CONDICIONES ÓPTIMAS ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO
- 200 mg MIP (polimerización mediante calor) (50-200 µm)
- Etapa acondicionamiento: 3×2 mL MeOH // 3×2 mL ACN
- Etapa de carga: 1 mL 100 ppm ERY
- Etapa lavado: 2×2 mL ACN
- Etapa elución: 3×2 mL MeOH/ HAc (0.5%)
- Evaporación y redisolución de la muestra en 1 mL fase móvil.
CONDICIONES ÓPTIMAS PROCESO MISPE PARA ERITROMICINA
- Columna Hypersil ODS. Dim. (mm): 100×4.6. Particle size (µm): 5
- Temperatura: 60ºC
- Elución gradiente a 1.2 mL/min (ERY)
- Fase móvil: NaH2PO4/ ACN (70:30) pH 7
- Tiempo análisis: 9 min (ERY)
- Detección UV-DAD: ERY (210 nm)
GRUPO UNED-QA
MANIFESTACIONES CIENTIFICAS
Aplicación del método MISPE al análisis de eritromicina en leche de oveja
Leche de oveja 40 ºC, 3 min
Tª amb Estabilización 20 min
1mL
Eritromicina 200 ppm
Leche
Preparación de la muestra
Tampón fosfato 25 mM/ACN (3:1) pH 3.5 (4 mL)
FILTRADO
Proteínas Sobrenadante
CENTRIFUGACIÓN (10 min, 3500 rpm)
Precipitación de proteínas
E T A P A S P R E V I A S
10 min Tª amb
GRUPO UNED-QA
MANIFESTACIONES CIENTIFICAS
Método MISPE optimizado aplicado al análisis de eritromicina en leche de oveja
1. Etapa acondicionamiento: 3x2 mL Metanol // 3x2 mL ACN
2. Etapa de carga: 2 mL muestra de leche desproteinizada
3. Eliminación de grasa: 5x1 mL NaOH 0.5 M
4. Etapa de lavado: 2x2 mL ACN
5. Etapa de elución: 3x2 mL Metanol/Ac. Acético (0.5%)
6. Análisis eluatos mediante método cromatográfico optimizado.
GRUPO UNED-QA
3. Optimización concentración NaOH
2. % Recuperación proceso MISPE tras la eliminación de grasa en continuo
Tipo de polimerización % ERY no retenida % ERY recuperada
Calor 18 39
Radiación UV 8 45
0
20
40
60
80
0 0,5 1 1,5 2 2,5
[NaOH] / M
R %
73%
1. % Recuperación proceso MISPE tras la desproteinización
MANIFESTACIONES CIENTIFICAS
% ERITROMICINA RECUPERADA
NaOH 1 M Hexano
42 30
GRUPO UNED-QA
MANIFESTACIONES CIENTIFICAS
Características analíticas del método desarrollado
• RSD= 1.7% (n= 5, 50 ppb ERY)
• Linealidad: 25-200 ppb
• Límite de cuantificación: 24.7 g kg-1 (MRL- ERY= 40 g kg-1)
• Tiempo vida media MIP: Mínimo 200 ensayos
• Frecuencia de muestreo: 10 ensayos/hora
* Análisis posteriores: Aplicación del método MISPE desarrollado a la
determinación de antibióticos macrólidos en leche de oveja mediante HPLC de
forma directa, sin necesidad de la etapa de desproteinización.
GRUPO UNED-QA
MANIFESTACIONES CIENTIFICAS
CONDICIONES ÓPTIMAS PROCESO MISPE ANTIBIÓTICOS
CONDICIONES ÓPTIMAS ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO
- 200 mg MIP (polimerización mediante calor) (50-200 µm)
- Etapa acondicionamiento: 3×2 mL MeOH // 3×2 mL ACN
- Etapa de carga: 1 mL 100 ppm (ERY, ROX), 10 ppm (SPI, JOS, TYL, IVER) en ACN
- Etapa lavado: 2×2 mL ACN
- Etapa elución: 3×2 mL MeOH/ HAc (0.5%)
- Columna Hypersil ODS
- Temperatura: 60ºC
- Elución gradiente 1-1.5 mL/min
- Fase móvil: NaH2PO4:ACN (50:50) pH 7
- Tiempo análisis: 35 min (6 antibióticos macrólidos)
- Detección UV-DAD: ERY/ROX (210 nm), TYL (287 nm), SPI/JOS (231 nm), IVER (254 nm)
GRUPO UNED-QA
TYL IVER
JOS SPI
ROX ERY
Cromatogramas de una muestra de leche de oveja dopada con 100 ppm ERY y ROX; 10 ppm SPI, JOS, IVER, TYL y muestra blanco de leche (----). (A) 210 nm, (B) 231 nm, (C) 254
nm, y (D) 287 nm.
MANIFESTACIONES CIENTIFICAS
GRUPO UNED-QA
% Recuperación proceso MISPE antibióticos
Antibiótico % Recuperación
ERY 99
ROX 76
SPI 100
JOS 15
IVER 0
TYL 15
MANIFESTACIONES CIENTIFICAS
*Análisis actuales: Aplicación a las muestras de leche de oveja del método desarrollado para la determinación de los 6 antibióticos macrólidos.
GRUPO UNED-QA
MANIFESTACIONES CIENTÍFICAS
DESARROLLO NUEVOS MATERIALES SELECTIVOS ADSORBENTES PARA TRATAMIENTO DE MUESTRA
1. Síntesis y caracterización de polímeros de impresión molecular para la
determinación de los colorantes azóicos Sudan I y Amaranto
GRUPO UNED-QA
2. Nuevas estrategias de síntesis de polímeros no impresos para mejorar la morfología y textura de los polímeros
MANIFESTACIONES CIENTÍFICAS
EN BLOQUE
NIP ACN(L) MAA(L) EGMA((L) AIBN(mg)
1 960 36 540 12,30
PRECIPITACIÓN
SIN AGITACIÓN
CON AGITACIÓN
NIP %porógeno V ACN(mL) MAA(L) EGMA((L) AIBN(mg)
1 98% 28,2 mL
36 540 12,30 2 97% 18,6 mL
3 96% 13,8 mL
4 95% 10,9 mL
NIP ACN:Tolueno Vporógeno(mL) MAA(L) DVB-80(L) AIBN(mg)
1 3:1 26,8 mL 36 500 10,04
GRUPO UNED-QA
3. Síntesis de membranas poliméricas modificadas con agentes adsorbentes y con distintos grados de selectividad (C8, C18, sílica-gel, alúmina y MIPs) para la determinación de colorantes en alimentos
Desarrollo de nuevos dispositivos para soporte de membranas adsorbentes de microextracción
GRUPO UNED-QA
RELACIONES CON OTROS GRUPOS ANALISYC
Colaboración con el laboratorio de la Universidad Rey Juan Carlos Isabel Sierra
Trabajo de investigación: Desarrollo de un método de extracción MIP-MSPD, para la detección de 17 β-Estradiol en muestras de leche de cabra
Resultados: - Trabajo de fin de Máster de JUDITH GAÑAN Publicación: “Development of a moleculary imprinted polymer-matrix solid phase disprsion methos for selective determination of β-Estradiol as anabolic growth promoter in goat milk” Anal Bioanal Chem: DOI 10.1007/s00216-012-5794-0 Marzo-2012 - Congresos
- RAFA. Praga nov-2011 - ACOFESAL. Madrid Junio-2012
GRUPO UNED-QA
ACTIVIDADES DE DIFUSION Programas de radio
- RNE: “ La congelación de los alimentos”. Junio 2011. Pilar Fernández - RNE: “Utilización de aditivos en alimentos”. Diciembre 2011. Rosa Mª Garcinuño
Congresos
RAFA Praga Noviembre 2012 1. “Development of a moleculary imprinted polymer-matrix solid phase disprsion
methos for selective determination of β-Estradiol as anabolic growth promoter in goat milk”
2. “Characterization of Spanish honeys with protected designation o origen “miel de Granada” according to their mineral content”
- ALCOFESAL. Madrid Junio 2012 3. “Optimización de un método de extracción en fase sólida utilizando un polímero de
impresión molecular para la determinación de antibióticos macrólidos en muestras lácteas mediante HPLC”
4. “Nuevas metodologías selectivas de tratamiento de muestra en continuo aplicadas a la determinación de alteradores endocrinos en muestras de agua”
5. - “Preparation and evaluation of selective moleculary imprinted polymers for the azoic dye amaranto”
GRUPO UNED-QA
Publicaciones Científicas
1. “Rapid and interference-free determination of illegal dyes in sauces and condiments by matrix solid phase dispersion (MSPD) and liquid chromatography (HPLC-DAD)” Food Chemistry . Aceptado _ 2012 DOI: 10.1016/j.foodchem.2012.04.065
2. “Matrix Solid-Phase Dispersion Method for the Determination of Macrolide Antibiotics in Sheep′s Milk” Food Chemistry: Aceptado febrero 2012. DOI: 10.1016/j.foodchem.2012.02.120
1. “Characterization of Spanish honeys with protected designation o origen “Miel de
Granada” according to their mineral content” Food Chemistry. Aceptadp Marzo 2012
2. “Molecularly imprinted solid phase extraction and micellar electrokinetic chromatography with online sample preconcentration for the determination of digoxin in human fluids” Eletrophoresis. Aceptado Marzo 2012. DOI: 10.1002/elps.201100588
3. “Development of a moleculary imprinted polymer-matrix solid phase disprsion methos for selective determination of β-Estradiol as anabolic growth promoter in goat milk”. Anal. Bioanal. Chem. Aceptado Enero 2012. DOI 10.1007/s00216-012-5794-0
GRUPO UNED-QA
Formación
- 9 Trabajos de fin de master - 2 DEAs - 1 Tesis Doctoral
Cursos de verano: CP de Cáceres “Alteraciones de los alimentos”
Cursos de Master - Toxicología Analítica - Química y Análisis de los alimentos
Programa de Doctorado
GRUPO UNED-QA
Problemas encontrados para alcanzar los objetivos
- Falta de personal/becarios para llevara a cabo el trabajo de laboratorio - Contaminación de la bomba del inyector del HPLC-MS. Causa de interferencia en
la detección de algunos colorantes por ejemplo el amaranto.
Propuestas para mejorar el programa ANALISYC
- Mayor numero de colaboraciones con otros grupos - Programas de radio o TV (recursos UNED)
Internacionalización
Estancia de 2 meses de OLIVA LUCIA ATIAGA FRANCO (Quito- Ecuador) Trabajo de Fin de Master: “Síntesis de nuevos materiales selectivos para microextacción utilizando membranas poliméricas”
GRUPO UNED-QA
Gracias
Senén Durand Alejandrina Gallego Rosa Mª Garcinuño Lola Picón Juan Carlos Bravo Gema Paniagua Pilar Fernández Leonardo Enriquez Asunción Garcia Ana Mª Montero Aitor Barrilero Oliva Aitaga Judith Gañan