Il ruolo del genetista nei programmi di diagnosi prenatale

Dr.ssa Eva Pompilii

GynePro Medical Group

Bologna

U.O. Ostetricia e Ginecologia Policlinico S. Orsola Malpighi Bologna

www.gynepro.it

Consulenza genetica.......

“ il ruolo del genetista clinico è quello di stabilire (o verificare) una diagnosi accurata su cui basare la consulenza e definire prognosi e follow-up, identificare il rischio di trasmettere la malattia ed le modalità con le quali questa può essere prevenuta o controllata. Questo processo è di tipo comunicativo e deve essere in grado di fornire adeguato supporto nella comprensione del significato della malattia genetica e sulle conseguenti decisioni da affrontare” (mod. da Kingston, 1994)‏

.........è un vero e proprio atto medico

CONSULENZA GENETICA PRENATALE

Positività/alterazione test combinato

Presenza di anomalie all’esame cromosomico eseguito su villi coriali/liquido amniotico

Presenza di malformazioni all’ecografia

Rischio teratogeno in seguito ad assunzione di

farmaci/esposizione a radiazioni ionizzanti

- Il riscontro di una condizione genetica (o non genetica) nel feto non permette generalmente alcuna terapia in utero

- Può, in alcuni casi, essere utile per una migliore gestione del caso in epoca

neonatale

- Nella maggioranza dei casi, quindi, pone la questione dell’interruzione (volontaria / “terapeutica”) della gravidanza (L. 194/78)

Diagnosi prenatale

Predizione ed incertezza

Non in tutti i casi la diagnosi prenatale

genetica fornisce un dato “incontestabile”

Predizione ed incertezza

Non in tutti i casi la diagnosi prenatale genetica

“incontestabile” comporta una prognosi “prevedibile” (malattia/non malattia)

Mosaico cromosomico

Donna di 39 anni, si sottopone a villocentesi per rischio età materna

Esito del cariotipo fetale: cariotipo maschile a mosaico costituito da linea cellulare normale e da

linea cellulare primaria (16%)

Esegue Amniocentesi: 47,XY,+21[4]/46,XY[29] (12%)

Esegue Funicolocentesi: 47,XY,+21[6]/46,XY[94]

(6%)

Counselling genetico: rischio Down 6% circa …?

Predizione ed incertezza

Non in tutti i casi la certezza di malattia è percepibile come una

disabilità “insopportabile”

Espressività variabile

Donna di 25 anni, si sottopone a CVS per rischio di ricorrenza di neurofibromatosi di tipo 1 (50%). Il coniuge è affetto: presenta chiazze

caffè-latte multiple, un numero moderato di neurofibromi (8), amartomi iridei.

La diagnosi prenatale conferma la presenza della mutazione paterna.

Prognosi: ?

(50% disturbi di apprendimento; 10% tumori maligni dei nervi periferici; 2% displasia tibiale;

2% glioma ottico sintomatico)

MICROSCOPIA OTTICA:

osservazione diretta dei cromosomi bandeggiati con colorazione Giemsa. Limite di risoluzione di 5-10Mb (550 bande).

FISH (Fluorescence In Situ Hybridization):

sonde sito-specifiche, marcate con fluorescenza. Necessarie informazioni a priori sulla localizzazione del riarrangiamento. Risoluzione fino ad 1Mb

CGH (Comparative Genomic Hybridization):

ibridazione competitiva di DNA genomico di un paziente e di un controllo, frammentati e marcati con un fluorocromo diverso, su metafasi di un soggetto sano. Risoluzione di qualche Kb.

Anni80‘‏

Anni 2000

Anni90‘‏

Anni60‘‏

Cariotipo → FISH → CGH-array

Singolo gene

Tutti gli esoni codificanti/ Intero genoma

analisi di sequenza

CARIOTIPO STANDARD

→ Identifica anomalie strutturali bilanciate e sbilanciate

(traslocazioni, inversioni, cromosomi ad anello, isocromosomi, delezioni, duplicazioni)

e anomalie numeriche

ma

→ risoluzione di circa 5-8Mb

E’ POSSIBILE UNA

RISOLUZIONE CITOGENETICA

MAGGIORE?

La Citogenetica Molecolare FISH

Permette un’analisi

mirata di una regione

cromosomica

consentendo di

mettere in evidenza

riarrangiamenti di

alcune centinaia di

chilobasi.

Tale identificazione avviene mediante sonde marcate impiegando fluorocromi che

emettono a diverse lunghezze d’onda.

Principali applicazioni diagnostiche della FISH

1. Diagnosi delle sindromi da microdelezione o da microduplicazione

2. Studio delle delezioni subtelomeriche

3. Caratterizzazione di marker cromosomici

4. Caratterizzazione di riarrangiamenti cromosomici, sia bilanciati che sbilanciati

5. Determinazione della percentuale di mosaicismi cromosomici

L’ array CGH e’ una nuova tecnologia che consente

di evidenziare variazioni del numero di copie

nell’intero genoma

Cariotipo Array CGH

risoluzione + -

CNV = Copy Number Variants = Copy Number Variation

Segmenti di DNA >1kb presenti nel genoma con un

numero variabile di copie (delezioni/duplicazioni)

Il 5-10% del genoma umano e’variabile nel numero di copie

in individui NORMALI

La risoluzione elevata dell’ array CGH ha determinato una

maggiore identificazione di varianti complicando talvolta

l’interpretazione dei risultati

http://projects.tcag.ca/variation/

La complessità del genoma rende difficile stabilire la natura delle CNVs:

differenze fenotipiche tra gli individui

ruolo evolutivo

patogenesi di malattie, sia mendeliane che

multigeniche

predisposizione ad alcune malattie

BENIGNE

PATOLOGICHE

PREDISPONENTI

* http://projects.tcag.ca/variation/

Found in healthy individuals?*

Region associated with a known

syndrome?

Disrupts gene(s) with a clear

functional link to phenotype?

Inherited from an

healthy parent?

BENIGN

BENIGN

PATHOGENIC

UNCLEAR CLINICAL

SIGNIFICANCE (likely pathogenic)

UNCLEAR CLINICAL

SIGNIFICANCE

Parents tested?

YES

YES

YES

YES

YES NO

NO

NO

NO

CNV

AND/OR

Novel microdeletion/duplication syndromes:

Rearrangement Size Phenotype

1 del / dup 1q21.1 1.35 Mb

ASSOCIATED with variable pediatric

phenotype (MR, congenital anomalies,

autism)

2 del 1q21.1 500 kb

ASSOCIATED with TAR

(Thrombocytopenia Absent Radius)

syndrome

3 del 15q13.1-13.3 1.5-3.9 Mb MR, dysmorphisms, epilepsy

4 del 15q24.1-q24.3 1.5-3.9 Mb MR, multiple congenital anomalies

5 del / dup 16p13.3 1.65Mb

MR, autism, dysmorphisms, behavioral

problems

(Rubinstein-Taybi region)

6 del/dup 16p11.2 593 kb

ASSOCIATED with ASD, severe early-onset

obesity (incomplete penetrance and

variable phenotype

7 del / dup 17q12 1.45 Mb Diabetes, renal disease, epilepsy

8 del 17q21.31 500 kb MR, congenital anomalies, epilepsy

-I punti di rottura del riarrangiamento interrompono un gene che determina una malattia a

trasmissione autosomica dominante.

-Effetto di posizione.

-Il riarrangiamento è solo apparentemente bilanciato ma nasconde una perdita o una acquisizione di

materiale genomico non visibile al cariotipo standard.

-Problemi legati alla presenza di UPD.

Quali possono essere le cause della presenza di un quadro clinico in un individuo portatore di

un riarrangiamento de novo bilanciato?

Limiti della consulenza in caso di riarrangiamenti bilanciati de novo

Si può dare solo un rischio empirico

Non è possibile definire un fenotipo e conseguentemente una prognosi

Tempi stretti… sono possibili caratterizzazioni ulteriori a livello molecolare dei punti di rottura?

Se necessario offrire la ricerca della Disomia Uniparentale

Banda cromosomica

Oligo non deleto (Mb)

Inizio delezione

(Mb)

Fine delezione

(Mb)

Oligo non deleto (Mb)

Dimensione (Mb)

3q13.11q13.31 106,447 106,569 116,763 116,826 10,2

Feto con cariotipo

46,XX,t(3;10)(q27;q22)

(liquido amniotico)

Caso clinico

Donna di 37 anni , PARA 2012

1° grav. Esegue tri test: pos

AF: dup 8 confermata con FISH

46,XY,?dup(8)(p23.2)ish(8)( wcp8+,D8S504+)

Eseguito cariotipo nei coniugi : signora portatrice medesima duplicazione

Bimbo riferito in buona salute

2° grav. AF: dup 8 materna

Bimba riferita in buona salute

3° grav. Aborto spontaneo

4° grav. CVS in altro lab pertanto eseguita conferma cariotipo sulla mamma No duplicazione cr. 8

Eseguito Array-CGH: delezione interstiziale del braccio lungo del cromosoma 7 a livello della banda 7q11.22

Eseguito Array su CVS: confermata delezione

gene AUTS2, variazioni nucleotidiche in tale gene, alcune delle quali riguardanti solo regioni non codificanti, sono associate a disordini dello spettro autistico (ASDs) e disordini neurologici, quali deficit di attenzione, iperattività, epilessia, dislessia, disturbi motori, ritardo del linguaggio, microcefalia e il consumo di alcol.

Donna di 33 anni, in buona salute, primigravida

Non consanguineità con il partner; storia familiare negativa per ritardo mentale, malformazioni congenite, poliabortività.

Villocentesi presso un centro privato senza specifica indicazione:

Riscontro di traslocazione apparentemente bilanciata tra cromosoma 1 e 8, con formula

46,XY,t(1;8)(p36.3;q24.1)

Cariotipo dei genitori nella norma (traslocazione de novo)

Caso clinico

Effettuato array-CGH con risoluzione media di 250 Kb su DNA fetale estratto

dai villi:

Riscontro di una delezione di circa 390Kb nella regione 8q23.3q24.11 (a livello di uno dei breakpoint), contenente un singolo gene

(EIF3H)

Quali implicazioni???

• EIF3H codifica per la subunità H del fattore di inizio traduzione EIF3.

• Ruolo cruciale nel processo di traduzione dell'mRNA in proteina ed è infatti altamente conservato nel corso dell'evoluzione.

• Database: la delezione in questione non è descritta né come polimorfismo né come associata a quadri patologici.

• Pubmed: attribuito un ruolo patogenetico all'over-espressione del gene, ma solamente in associazione ad alcune forme tumorali (cancro colon-

rettale).

• Nessuna segnalazione riguardo la delezione/inattivazione del gene nell'uomo...

• Un solo articolo associa l'inattivazione del gene a problemi nello sviluppo embrionale su un modello animale (zebrafish), ma si tratta di

una loss of function completa, mentre la delezione nel caso in esame è in eterozigosi...

Donna di 43 anni, in buona salute, quartigravida

Non consanguineità con il partner; storia familiare negativa per ritardo mentale, malformazioni congenite, poliabortività.

I grav: nasce una bimba che muore a 6 mesi di vita con diagnosi di RENE POLICISTICO RECESSIVO (25% rischio per

ogni gravidanza)

Test genetico nella bimba: conferma la diagnosi

Confermato stato di portatori nei genitori

II grav: CVS per cariotipo e diagnosi molecolare per Rene Policstico

Bimbo affetto da Rene Policistico Infantile e riscontro di Trisomia 21

III grav: aborto spontaneo

IV grav: in occasione del villo coriale riscontro ecografico di Oloprosencefalia lobare; cvs mostra Trisomia 18 e l’analisi molecolare

mostra un feto affetto da Rene Policistico

Quale potrà essere la percezione del rischio per i signori???

Conclusioni

La diagnosi genetica prenatale:

a. è un percorso individuale (= di coppia)

b. non ammette generalizzazioni

c. necessita di un’appropriata informazione (counselling) pre- e post-test

d. ha implicazioni differenti secondo la categoria di malattie per cui viene richiesta

e. avrà certamente importanti cambiamenti negli anni futuri (più dati da gestire!)

Mente genetica

in un’era genomica

GRAZIE!!!