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Imagerie de la paroiimmunohistochimie des polysaccharides
de paroi chez les végétaux
Atelier GlycoOuest, Interactions sucres-protéines14-18 Avril 2014, Roscoff
Cécile HervéUMR8227, Roscoff
I. Sondes moléculaires pour la détection des polysaccharides de paroi
• production et caractérisation d’anticorps monoclonaux• utilisation de modules naturels de reconnaissance
(carbohydrate-binding modules, CBM)
II. Utilisation des sondes de paroi en immunohistochimie et microscopie
• principes de l’immunohistochimie
• préparation du matériel végétal
• immunofluorescence indirecte
• microscopie électronique
• observation, interprétation et mise en forme
TP. Imagerie de la paroi par immunofluorescence
Anticorps monoclonaux et CBMs
Interface
Intégrité
Différenciation
Expansion
Signalisation
Adhérence
Morphogenèse
Pourquoi la paroi ?• entoure chaque cellule végétale (algues & plantes)
• rôles dans de nombreuses réponses physiologiques
(compartiment dynamique)
Type cellulaire & diversité pariétale(plasticité spatiale/temporelle)
• les parois végétales sont des structures compactes
composées d’assortiments de polysaccharides complexes
Réseau squelettique cristallin(cellulose-hémicelluloses)
Somerville et al. (2004) Science 306, 2206
dictoylédones
• les parois végétales sont des structures compactes
composées d’assortiments de polysaccharides complexes
Réseau squelettique cristallin(cellulose-hémicelluloses)
+ polysaccharides matriciels(pectines)
Somerville et al. (2004) Science 306, 2206
dictoylédones
• les parois végétales sont des structures compactes
composées d’assortiments de polysaccharides complexes
Réseau squelettique cristallin(cellulose-hémicelluloses)
+ polysaccharides matriciels(alginates/fucanes)
algues brunes
Deniaud-Bouët et al. (2014) Annals of Botany, in press
• La plupart des connaissances dérivent de méthodes
biochimiques, utilisant des polysaccharides purifiés ou des
parois fractionnées sur plantes entières:
� perte de l’information spatiale et de développement� connaissance limitée des configurations in situ
• Quels sont les polymères présents ? En quelles quantités
relatives ? Comment sont-ils organisés les uns par rapport
aux autres ? Quelles variations physiologiques ? –
architectures pariétales & dynamiques
Pourquoi des anticorps ?
� sondes moléculaires pour des analyses in situ
chaîne
légère
région variable
région constante
chaîne
lourde
antigène
épitopes
antisérum
Qu’est-ce qu’un anticorps ?
Sérum d’anticorps polyclonaux
• Facile à obtenir –à partir d’un échantillon sanguin
• Si l’antigène est pur, possible d’obtenir un volume
suffisant d’antisérum à titre élevé et à forte affinité
• Contient des anticorps dirigés contre toute une
série d’épitopes
• Pas 2 animaux identiques
• Quantités limitées
Immunogènes
• Les protéines sont directement immunogènes
• Les glycanes donnent une faible réponse immunitaire
• Les oligosaccharides sont conjugués à une protéine (BSA, KLH) avant injection
chaque lymphocyte secrète un type
d’anticorps, à spécificité unique
cellule 1
cellule 2
cellule 3
Anticorps monoclonaux
• Technologie de l’hybridome
• Les lignées cellulaires secrétant les anticorps de spécificités appropriées sont immortalisées� rate � source de lymphocytes
généralement rongeurs (rats, souris)
� myélome � lignées cellulaires immortelles
• Quantités illimitées• Spécificité définie
Schéma général de production
FUSION
criblage des puits donnant une réponse positive
sélection clonale des lignées
propagation des lignées sélectionnées
anticorps à spécificité unique (un épitope) dans le surnageant hybridomal
cellules Bculture cellulaire de
myélome
Sélection des hybridomes (1)
• les cellules myélomateuses sont immortelles mais
ne synthétisent leurs nucléotides que par la voie de
novo car elles sont HPRT- (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase, i.e. voie de sauvetage)
–génie génétique
• sélection sur milieu HAT (hypoxanthine,
aminopterine, thymidine) : l’aminoptérine bloque la
synthèse de novo, l’hypoxanthine et la thymidine
sont les substrats de la voie de sauvetage
Sélection des hybridomes (2)
• seules les cellules fusionnées pourront survivre : les lymphocytes apportent la HPRT et les cellules du
myélome la capacité à proliférer ���� hybridomes
• les cellules B non fusionnées et les cellules du
myélome (sur milieu HAT) sont éliminées
Anticorps monoclonaux
• Reconnait un épitope –correspond à une région du
polymère cible
• Connaissance a priori de la structure de l’épitope et
de l’antigène
• Difficile dans le cas de polymères où la
connaissance structurale est limitée (cf. algues)
• Une caractérisation après coup est possible, à
l’aide d’haptènes, d’enzymes, etc.
Centres de ressources
• BioSupplies Abs, Australia
• CCRC-Mx –Georgia, USA
• JIMx (1989-1994) –John Innes, UK
• LMx (1991-onwards) –Leeds, UK
• BAMx (in progress) –Leeds, UKBrown Algae http://www.plantcellwalls.net
http://www.plantprobes.net
http://www.biosupplies.com.au/
http://www.ccrc.uga.edu/
EX. d’anticorps monoclonaux• anti-pectines
JIM5 partially Me-esterified HG
JIM7 partially Me-esterified HG
PAM1 blockwise de-esterified HG
LM7 non-blockwise de-esterified HG
2F4 unesterieid, calcium cross-linked HG
LM8 xylogalacturonan
LM5 (1�4)-b-D-galactan
LM6 (1�5)-a-L-arabinan
LM13 (1�5)-a-L-arabinan
CCRC-M2 RGI
Sous-structure pectique (LM7)homogalacturonan partiellement Me-esterifié
Willats et al. (2001) J. Biol. Chem.; Clausen et al. (2003) Carbohdr. Res.
pea stem
LM11
LM10
LM11
LM10 LM11
• anti-xylanes
Caractérisation des anticorps (1)
• principe de l’ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
-dosage immuno-enzymatique
HRP
S P
HRP
fixation de
l’antigène
reconnaissance
par l’Ac
spécifique
liaison du
conjugué
révélation
lavages lavages lavages
100 %
0 %
concentration en anticorps
90 % du maximum
de fixation
fra
ctio
n l
iée
concentration en
anticorps à utiliser
100 %
0 %
concentration en haptène
50 %fra
ctio
n l
iée
IC50
100 %
0 %
inh
ibit
ion
de
la
fix
ati
on
de
l’a
nti
corp
s
1. déterminer la dilution
appropriée en anticorps
2. déterminer les haptènes
compétiteurs (ELISA compétitif)
Caractérisation des anticorps (2)
LM15, a rat monoclonal antibody directed to the XXXG oligosaccharide of xyloglucan –developed from a XXXG-BSA neoglycoprotein
(Marcus S., Verhertbruggen Y., Hervé C. et al. 2008, BMC Plant Biol 8: 60)
XXXG
forêt tropicale forêt de Laminaires
La dégradation de la biomasse végétale par les microorganismes
est une étape clé dans le recyclage de la matière carbonée
���� évolution de protéines reconnaissant les polysaccharides de paroi
Carbohydrate-binding modules (CBMs)
Glycosyl hydrolases microbiennes
• Structure modulaire :
� module catalytique
� module(s) de fixation des polysaccharides : CBMs –carbohydrate binding module
• module catalytique et CBM associé ont
généralement la même spécificité
• Cellulose et autres polysaccharides de paroi
• le CBM dirige l’enzyme à proximité de son substrat
et la maintien en contact prolongé avec celui-ci
domaine catalytique
séquence
de liaison
Carbohydrate Binding Module
(CBM)
Himmel et al., “Cellulase Animation”, NREL (2000).http://genomics.energy.gov/gallery/b2b/detail.np/detail-24.html
• classés en 68 familles suivant une base de similitude de séquence protéique
http://www.cazy.org
• cellulose, xylane, mannane, glucomannane, β-1,3-glucanes
(callose, laminarine), β-1,3-1,4-glucanes (MLG, lichenane),
xyloglucanes, galactanes, chitine, amidon, agar, etc.
• utilisation analogue aux anticorps
monoclonaux :� test immuno-enzymatique (ELISA, etc.)
� microscopie (localisation des ligands in
planta)
• les CBMs sont produits de façon recombinante,
avec une étiquette permettant leur (purification et)
immunodétection
Utilisation des CBMs en tant que sondes moléculaires
S P
CBM
HRP
ex. His-tag
• spécificité connue• quantité illimitée• immunisation
animale
• protéine recombinante
• reconnaissance différentielle in situ
• couverture polysaccharidique
Anticorps monoclonaux
CBMs
②Utilisation des sondes sur matériel végétal
particules d’or
• La détection des antigènes d’intérêt par l’utilisation
des sondes (anticorps/CBM) nécessite l’emploi d’un
système de révélation
• tests immuno-enzymatiques = enzymes telles que
peroxydase et phosphatase alcaline
• microscopie à fluorescence = fluorochromes tels
que FITC, Alexafluors
• microscopie électronique =
• Dans la majorité des cas un protocole
d’immunomarquage indirect est utilisé
Immunohistochimie indirecte• incubation avec un anticorps
primaire/CBM contre l’antigène
d’intérêt
• puis incubation avec un anticorps secondaire qui reconnait la région
constante de l’anticorps primaire
(étiquette dans le cas d’un CBM),
couplé au traceur
• Ce système est très versatile : combinaisons
multiples pour un même AcI + nombreux AcII
disponibles commercialement
• Des témoins doivent toujours être réalisés lors d’un
protocole d’immunomarquage
• Un CONTRÔLE NEGATIF peut inclure un anticorps
primaire qui ne reconnait pas le matériel d’étude
où, plus simplement, omettre l’anticorps primaire
• Un contrôle positif est un anticorps primaire qui
reconnait le matériel d’étude ; il peut être utile dans
la phase initiale d’immunohistochimie sur des
antigènes encore non étudiés
Préparation pour la microscopie
• fixation
• coupes
• immunomarquages
La littérature sur la préparation des échantillons pour
la microscopie (fixation/inclusion/coupes) est très
abondante. Le choix dépend du but recherché.
• Fixer = rester le plus proche possible de l’état vivant,
stabiliser l’ultrastructure et protéger des dommages
• aldéhydes fréquemment utilisés
• attention aux conditions physicochimiques, notamment équilibre osmotique
plante ~300 mOsm, algue marine ~1100 mOsm
• échantillons aussi petits que possibles <2x2x2 mm
• plusieurs types d’inclusion/coupes suivant la
résolution souhaitée (à la main, inclusion en
paraffine/résine LR-white, etc.) -plus elle est
importante, plus le temps de préparation sera long
Immunomarquage
• le matériel doit fermement adhérer à la lame : certains réactifs tels que la poly-L-lysine et le
Vectabond améliorent l’adhérence
• des immunomarquages en tubes eppendorf sont
également possibles (coupes à la main, graines, etc.)
• Le matériel végétal doit toujours resté hydraté
• l’immunomarquage peut être combiné à des
marquages chimiques (ex. anticorps couplé au FITC
+ calcofluor white pour la cellulose) –longueurs
d’onde d’émission différentes
Microscope à fluorescence
1. seule la lumière bleue ayant une longueur d’onde comprise entre 450 et 490 nm passe à travers le filtre
2. reflète la lumière en dessous de 510 nm et transmet celle au-dessus de 510 nm
3. ne laisse passer que les longueurs d’onde comprises entre 500 et 550 nm, dont le signal fluorescent vert
Asplenium aethiopicumred channel
Asplenium aethiopicumCalcofluor stain
Asplenium aethiopicumanti-1,5-arabinan
calcofluor (cellulose)
LM10 (xylane)
fibres phloémiennes
vaisseaux xylémiens
Les inclusions permettent de réaliser des coupes fines
ou semi-fines et offrent une résolution intéressante.
Néanmoins les coupes manuelles sont rapides et
peuvent permettre un premier criblage. Certains
échantillons peuvent même être utilisés entiers.
graine d’Arabidopsis embryon de Fucus
filaments d’Ectocarpus
poil absorbant
de carotte
Pour des analyses très fines au niveau cellulaire, la
microscopie électronique est requise.
Le principe d’immunomarquage est identique.
L’anticorps secondaire est couplé à des particules d’or
denses aux électrons.
Knox et al., 1990. Planta 181(4):512
espace
intercellulaire
cellule 1
cellule 2
cellule 3
paroi
JIM5/7 – reconnaissent des pectines (HG) ayant différents
degrés d’estérification
L’observation d’échantillons
prélevés à différents temps
permet de suivre la
localisation des polymères
au cours du développement
–lien fonctionnel?
0 24h
cellulose
M-alginate
fucanes sulfatés
Un échantillon soumis à des
conditions
environnementales
différentes peut présenter
des variations pariétales
–lien fonctionnel?
1 cm
1 cm
100 % edm
5 % edm
fucanes sulfatés
fucanes sulfatés
Distinguer autofluorescence & fluorescence !
• certains composés cellulaires peuvent émettre de la
fluorescence à des longueurs d’onde qui interfèrent
avec le fluorochrome
• le glutaraldéhyde intensifie cet artéfact
• ce problème est particulièrement marqué chez les algues brunes et rouges
• le choix préalable du fluorochrome et du mode de détection ne doit pas être négligé
filtre d’émission >515 nm
Chondrus
Ceramiale
filtre d’émission 500-550 nm
Ex. autofluorescence chez les algues rouges
Prudence sur l’interprétation !
• le signal observé est-il bien lié au fluorochrome ?
(témoin négatif pour contrôler l’autofluorescence)
• l’absence de détection ne signifie pas forcement absence d’épitopes
� antigène soluble
� expression transitoire liée au développement
� épitope non accessible/masqué par d’autres polymères
cp
x
LM15
_
+
PL
Xyloglucan detection
&
pectate lyasetreatment
cl ppcp xe ipMarcus S., Verhertbruggen Y., Hervé C. et al. 2008, BMC Plant Biol 8: 60
JIM5 – pectic HG LM15 – xyloglucan
C
C
is
pectate lyase/JIM5 pectate lyase/LM15
HG-masked xyloglucan
+ pectate lyase+
pfx
cl
JIM5 JIM5
CjCBM15 CjCBM15
pf
x
cl
pfx
cl pfx
cl
- pl
Hervé C., Rogowski A., Gilbert H.J. and Knox J.P 2009, The Plant Journal 58(3): 413-422
nu
mb
er
of
pix
els
fluorescence intensity
34%
Quantification de l’immunofluorescence
nu
mb
er
of
pix
els
fluorescence intensity
100%
Hervé C., Rogowski A., Gilbert H.J. and Knox J.P 2009, The Plant Journal 58(3): 413-422
+ enzyme + enzyme
Autres sondes/utilisations
• anticorps par phage display, autres protéines
recombinantes d’origine bactérienne (SusD),
évolution dirigée de modules d’intérêt (ex.
aptamères par SELEX), enzymes modifiées, etc.
• ces sondes moléculaires sont également des outils performants pour détecter des épitopes dans des mélanges complexes
� glycoarrays (CoMPP)
� Epitope Detection Chromatography (EDC)
Pour aller plus loin• protocoles : Hervé C., Marcus S.E. and Knox J.P. (2011) Monoclonal
antibodies, carbohydrate-binding modules, and the detection of
polysaccharides in plant cell walls. Methods Mol Biol, 715, 103-113.
• évolution et diversité des parois de plantes et macroalgues : Popper Z.A., Michel G., Hervé C., Domozych D.S., Willats W.G.T., Tuohy M.G., Kloareg B. and Stengel D.B. (2011) Evolution and diversity of plant
cell walls: from algae to flowering plants. Annual Review of Plant
Biology, 62, 567-590.
• les sondes pariétales (très exhaustif avec production, utilisation,
articles scientifiques) : sites de J. P. Knox avec
http://www.plantprobes.net et http://www.personal.leeds.ac.uk
Most of my talk’s content has been inspired by Paul’s lectures, so
thanks Paul ☺
• My email: [email protected]
