3/22/16

1

Immundiagnosztikai módszerek

Katona Éva 2015-03-24

Western blot/immunoblot

Ag

Primer At

Másodlagos, jelzett At

Enzim/Fluorochrome/izotóp

• Fehérje tisztítás/extrahálás -Totál protein – standard lízis puffer

• A degradáció megakadályozására -a mintákat mindig 40C-on centrifugáljuk -proteáz inhibitor pl. Pefabloc (Roche diagnostics) legyen a rendszerben

• fehérje tartalom meghatározás : Bradford reagens Standard BCA assay (Pierce)

Western Blotting –fehérje/Ag preparálás (1)

• Poliakrilamid gél • a fehérjéket denaturáljuk (disszociáljuk): anionos detergens (SDS), redukáló ágens és hő • a polipeptidek kötődnek az SDS-hez: negatív töltés • SDS-polipeptid komplexek a méretük alapján vándorolnak a gélben –a polipeptid módosulásai pl. foszforiláció és glikoziláció hatással lehet

Western Blotting – Elektroforézis (2)

3/22/16

2

• SDS-PAGE-et diszkontinuous puffer rendszerben végezzük – Minta puffer és tömörítő gél Tris-HCl (pH:6.8) – Szeparáló gél Tris-HCl (pH:8.8) – Puffer tartály Tris-glycine (pH:8.3)

Western Blotting – Elektroforézis (3)

tömörítő gél (akrilamid <5%) PH=6.8

szeparáló gél (akrilamid >5%) PH=8.8

Összetétel : Bis : az akrilamid monomereket keresztköti SDS : denaturáló reagens, Tris-HCl : klorid ion front vezeti a fehérjéket a pozitív elektród felé Amonium perszulfát : szabad gyököt biztosít TEMED : stabilizálja a polimerizációt

Western Blotting – Elektroforézis (4)

- Nedves transzfer

- Félszáraz transzfer

3MM papír

3MM papír

membrán Gél

+-

Western Blotting –Protein transzfer (5)

• Nitrocellulóz (pórus méret 0.45 µm) – standard membrán

• Nylon membránok – Nagyobb affinitással kötik a proteineket, magas háttér

• Polyvinylidene fluoride (PVDF) – nagy Affinitású kötés, előkezelés methanollal

– Az immobilizált protein láthatóvá tehető ponceau S festékkel (nylon membránoknál nem)

Western Blotting –Membrán típusok (6)

3/22/16

3

• Western Blotting – Torma peroxidáz (HRPO) jelölés esetén

• 5% zsírszegény tejpor, bovine serum albumin, BLOTTO

– Alkalikus foszfatáz jelölés esetén • 6% kazein, 1% polyvinylpyrrolidone, 10mM EDTA PBS-ben, 1 óra 650C hőkezelés, tárolás 40C-on

• Immunhisztokémia – Normál szérum abból az állatfajból, melyben a második antitest készült

Western Blotting –blokkolás (7)

• Izotóppal jelzett antitestek • Enzimekkel konjugált antitestek

– Horseradish peroxidase (HRPO) – Alkaline phosphatase

• Biotinált antitestek • Fluorochrome-jelzett antitestek : FITC, PE, EC5,

PC5, stb.

Western Blotting –Detektálás (8)

Hosrseradish peroxidase/Alkaline phosphatase 1. Kromogén detektálás: HRP: Diaminobenzidine (DAB)-barna csapadék AP: BCIP/NTP- liláskék precipitátum 2. Kemiluminescens detektálás HRP: Luminol- az oxidált luminol kék fényt emittál

ECL reagens (Pierce) AP: AMPPD – a defoszforilált termék fényt bocsát ki

Western Blotting – enzim konjugátumok (9) Western Blotting – Detektálás (10)

3/22/16

4

-A hiperimmun antiszérum a cél antigénen kívül más antigének ellen is tartalmaz IgG-t -Az antiszérum alacsony affinitással más, nem cél antigénekhez is kötődhet -Elfogadhatatlanul magas hátteret ad az antiszérum

Hibalehetőségek : Nem-specifikus kötődés

Metszetek: • Kriosztátos (~7µm) fagyasztott szövetekből, • Paraffinba ágyazott (~ 5µm)

Blokkolás: endogén peroxidáz, H202 ; nemspecifikus kötés, a második antitestet termelő állat normál széruma Első antitest (1-5µg/ml) Inkubálás 20 antitest, peroxidáz konjugált/biotinált –At Detektálás DAB-al (barna) Festés haematoxylin-nal (kék)

Immunhisztokémia

3/22/16

5

Immunkromatográfia

CARDIAC READER CARDIAC READER MŰKÖDÉSI ELV- REAKCIÓ

Reakció Üvegszálas szűrő Sejtes elemek feltartóztatása

Plazma

Plazma Detektálási zóna

Marker: cTnT Mioglobin D-Dimer

3/22/16

6

CARDIAC READER MŰKÖDÉSI ELV- DETEKTÁLÁS

Kontroll: Az arannyal jelzett anti-marker MAB2 (az adott markerre specifikus monoklonális antitest 2) a szintetikus peptidhez kötődik Negatív reakció: A streptavidinnel fedett felszínhez csak a biotinált anti-marker MAB1 kötődik Pozitív reakció: A streptavidinnel fedett felszínhez biotinált anti-marker MAB1-marker- arannyal jelzett anti-marker MAB2 komplex kötődik Marker: kardiális Troponin T

Mioglobin D-Dimer

CARDIAC READER szükséges anyagok

Code chips • Minden doboz tesztcsík tartalmaz egy chip-et. • A tesztcsíkok első használata előtt be kell helyezni a készülékbe. • A Lot-specifikus adatokat a készülék leolvassa és eltárolja. Tesztcsíkok: Cardiac M, Cardiac T Quantitative, Cardiac D-Dimer • Minden tesztcsík alsó oldalán van egy “bar code”, amit a készülék leolvas. • A bar code adatainak meg kell egyezniük a tesztcsík adataival. Qualyti Control • Liofilizált kontroll szérumokkal (Cardiac reader célértékkel). • A kontroll szérumok oldása 1 mL desztillált vízben történik. • 150 µL kontroll szérum szükséges egy méréshez.

A CARDIAC READER KEZELÉSE Code chip és tesztcsík behelyezése

A tesztcsíkok dobozában található code chip-et kattanásig illesszük be a képen

látható résbe

A tesztcsíkot helyezzük be a készülékbe Nyomjuk meg a “start” gombot, ekkor a tesztcsík mintafelviteli

pozícióba fordul

A CARDIAC READER KEZELÉSE A minta felvitele

Minta: Heparinos, vénás, teljes vér

Szívjunk fel 150 ± 15 µl vért pipettába v. fecskendőbe

Mérjük be a mintát a teszt csík piros háromszöggel jelzett minta- felviteli helyére

A mintafelviteli eszközt tartsuk függôleges pozícióban

A mintafelviteli eszközt tartsuk függőleges pozícióban

3/22/16

7

A CARDIAC READER KEZELÉSE Minták mérése

Az eredmények megjelenítése-kinyomtatása • A minta felvitele után nyomjuk meg a “start” gombot

• A kijelzőn az eredményközlésig hátralévő idő látható

• Az eredmény csatolt (külső) printeren ki is nyomtatható

Amikor a tesztcsík visszafordul a kiindulási pozícióba, a készülék felszólít, hogy távolítsuk el.

CARDIAC READER Teszt paraméterek

Cardiac T Quantitative •  Heparinos teljes vér •  Mérési tartomány:

0.1-2.0 µg/L •  Mérési idő: 12 perc

Cardiac M •  Heparinos teljes vér •  Mérési tartomány:

30-700 µg/L •  Mérési idő: 8 perc

Cardiac D-Dimer •  Heparinos teljes vér •  Mérési tartomány:

0.1-4 mg/L •  Cut-off: 0.5 mg/L •  Mérési idő: 12 perc

Vérvétel Heparinos csőbe vagy fecskendôbe

Szívjunk fel 150 µl (± 15 µl) vért pipettába v. fecskendőbe

Mérjük rá a mintát a teszt csík piros háromszöggel jelzett minta- felviteli helyére és 15 perc után olvassuk le az eredményt

a) Egy vonal (kontroll vonal) = negatív teszt eredmény

b) Két vonal (kontroll és teszt) = pozitív teszt eredmény

c) Nincs kontroll vonal = nem valós eredmény! Ismételjük meg a tesztet!

A GYORSTESZT KIVITELEZÉSE