1

GRUPPO DI LAVORO IMMUNODEFICIENZE

ASSOCIAZIONE ITALIANA DI EMATOLOGIA ED ONCOLOGIA PEDIATRICA

Sindrome IPEX

(Immunodysregulation, Polyendocrinopathy, Enteropathy, X-linked)

Raccomandazioni diagnostiche e terapeutiche

Versione definitiva: 9-10 Dicembre 2009

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Coordinatore del Gruppo di Lavoro AIEOP Immunodeficienze:

Prof. Alessandro Plebani Clinica Pediatrica Brescia

Responsabili: Redazione del documento:

R. Bacchetta (MI) E. Gambineri (FI) R. Bacchetta, A. Aiuti (MI) E. Gambineri (FI) A.Tommasini (TS) A. Plebani, R. Badolato, A. Soresina (BS)

Data Review Committee:

R. Bacchetta (MI) E. Gambineri (FI) A. Soresina (BS) R. Rondelli (BO)

Raccolta-Gestione-Analisi Statistica dei dati:

Centro Operativo AIEOP-FONOP presso l'Oncologia ed Ematologia pediatrica "Lalla Seragnoli" del Policlinico Sant'Orsola Malpighi di Bologna Via Massarenti, 9 40138 Bologna

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CENTRI PARTECIPANTI CSS ID AIEOP

CODICE AIEOP CITTA’ ISTITUZIONE RAPPRESENTANTI

0901 ANCONA Clinica Pediatrica Ospedale dei Bambini “G. Salesi” Via F. Corridoni 11 60123 ANCONA Tel. 071 5962360 - 5962130 Fax 071 36363 Cell. Albano: 333 2515636 e-mail: paolopierani@libero.it, vero_nica_72@yahoo.com

Prof. Paolo Pierani Dr.ssa Veronica Albano

1308

BARI

Dipartimento Biomedicina dell’Età Evolutiva Clinica Pediatrica I P.zza G. Cesare 11 70124 BARI Tel. 080 5478973 - 5542867 Fax 080 5592290 e-mail: demattia@bioetaev.uniba.it, baldo.martire@bioetaev.uniba.it

Prof. Domenico De Mattia Dr. Baldassarre Martire

1307

BARI

Clinica Pediatrica III Università di Bari P.zza Giulio Cesare 11 70124 BARI Tel. 080 5426802 Fax 080 5478911 e-mail: fabiocardinale@libero.it

Prof. Lucio Armenio Dr. Fabio Cardinale

1306

BARI

Dip.di Scienze Biomediche e Oncologia umana - Sezione Medicina Interna - Policlinico P.zza G. Cesare 11 70124 BARI Tel. 080 5478828-862 Fax 080 5478820 e-mail: g.ranieri@dimo.uniba.it

Prof. Francesco Dammacco Prof. Giuseppe Ranieri

0603

BOLOGNA

Clinica Pediatrica Via Massarenti 11 40138 BOLOGNA Tel. 051 6364678 Fax 051 6364679 Cell. Masi: 335 6847050 / 051 307162 e-mail: massimo.masi@unibo.it

Prof. Massimo Masi Dr.ssa Angela Miniaci

0605

BOLOGNA

Divisione di Pediatria - Ospedale “Maggiore” Largo Nigrisoli, 2 40133 BOLOGNA Tel. 051/6478564 fax 051/6478949

Prof. Gabriele Ambrosioni

4

0305

BRESCIA

Clinica Pediatrica Spedali Civili P.le Spedali Civili, 1 25123 BRESCIA Tel. 030 3995700 - 3995715 Fax 030 3388099 Cell. Plebani: 338 9339859 e-mail: plebani@med.unibs.it, soresina@med.unibs.it vlougarisbs@yahoo.com badolato@med.unibs.it

Prof. Alessandro Plebani Dr.ssa Annarosa Soresina Dr. Vassilios Lougaris Prof. Raffaele Badolato

BRESCIA

Servizio di Reumatologia e Immunologia Clinica Spedali Civili P.le Spedali Civili 1 25123 BRESCIA Tel. 030 3995486 Fax 030 3995085 Cell. Airò: 349 6846054 e-mail: airo@bresciareumatologia.it

Prof. Roberto Cattaneo Dr. Paolo Airò

1602

CAGLIARI

Centro TMO Ospedale Regionale Microcitemie Clinica Pediatrica Università di Cagliari Via Jenner 09121 CAGLIARI Tel. 070 6095512 Fax 070 6095694 e-mail: fcossu@mcweb.unica.it

Prof. Antonio Cao Dr. Fausto Cossu

1603

CAGLIARI

Allergologia e Immunologia Clinica Policlinico Universitario Via S. Giorgio 12 09124 CAGLIARI Tel. 070 51096240 Fax 070 51096128 e-mail: manconip@pacs.unica.it

Prof. Sergio Del Giacco Prof. Paolo Emilio Manconi

1401

CATANZARO

U.O. Ematologia e Oncologia Pediatrica Azienda Ospedaliera “Pugliese-Ciaccio” Viale Pio X 88100 CATANZARO Tel. 0961 883069 - 205 Fax 0961 883250 Cell. Consarino: 348 2695100 Cell. Dello Russo: 347 7140224 e-mail: cconsar@tin.it

Dr.ssa Caterina Consarino Dr.ssa Anna Maria Dello Russo

1404

CATANZARO

U.O. di Pediatria Univ. Studi di Catanzaro Ospedale Pugliese Viale Pio X 88100 CATANZARO Tel. 0961 883007 Fax 0961 883489 Cell. Anastasio: 335 8364937 e-mail elisa.anastasio@tin.it

Dr.ssa Elisa Anastasio

5

1502 CATANIA Divisione Ematologia-Oncologia Pediatrica Clinica Pediatrica - Università Catania Via Santa Sofia 78 95123 CATANIA Tel. 095 3782536 - 3782490 Fax 095 222532 Cell. Licciardello: 338 9606916 e-mail: schiliro@unict.it, marialicciar@yahoo.it

Prof. Gino Schillirò Dr.ssa Maria Licciardello

1003

CHIETI

Dipartimento di Medicina Centro di Immunologia Clinica e Reumatologia Palazzina SEBI, Università G. d'Annunzio Via dei Vestini 66013 Chieti scalo (CH) Tel. Amb. 0871 358412 Fax 0871 3556706 e-mail: rpaganel@unich.it

Prof. Roberto Paganelli

0312

COMO

Divisione Pediatria Azienda Ospedaliera “Sant’Anna” Via Napoleone 60 22100 COMO Tel. 031 5855353 Fax 031 5855948 e-mail: pediatria@hsacomo.org

Dr. Maurizio Sticca

1403

COSENZA

U.O. Pediatria - Ospedale "Annunziata" Via Migliori 1 87100 Cosenza Tel. 0984 681343 Fax 0984 681315 Cell. Carpino: 347 9363550 e-mail: d.sperli@virgilio.it, luicarp@libero.it

Dr. D. Sperlì Dr. L. Carpino

701

FIRENZE

Dipartimento A.I. Oncoematologia Pediatrica e Cure Domiciliari U.O. Oncoematologia Pediatrica Azienda Ospedaliero-Universitaria Meyer Viale Pieraccini, 24 50139 Firenze Tel.: 055/5662489 - 2416 TeleFax: 055/5662746 - 2400 E-Mail: m.arico@meyer.it

Dott. Maurizio Aricò

FIRENZE

Dipartimento di Pediatria Ospedale “A. Meyer” Viale G. Pieraccini 24 50139 FIRENZE Tel. 055 5662542 - 2405 Fax 055 4221012 e-mail: azzaric@unifi.it, c.azzari@meyer.it, eleonora.gambineri@unifi.it

Prof.ssa Chiara Azzari Dr.ssa Eleonora Gambineri

6

FIRENZE

Dipartimento di Biomedicina SOD Immunoallergologia Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi SOD Immunologia e Terapie Cellulari Azienda Opsedaliero-Universitaria Careggi Viale Morgagni 85 50134 FIRENZE Tel. 055 4296426 - 4296495 Fax 055 7947425 Tel Day Hospital 055 7947421 e-mail: a.matucci@dmi.unifi.it

Prof. Enrico Maggi Prof. Sergio Romagnani Dr. Andrea Matucci Dr.ssa Alessandra Vultaggio

0202

GENOVA

Seconda Divisione di Pediatria Divisione Malattie Infettive Istituto G. Gaslini Largo G. Gaslini 5 16147 GENOVA Tel. 010 5636793 FAX 010 5636211 e-mail: eliocastagnola@ospedale-gaslini.ge.it, marcogattorno@ospedale-gaslini.ge.it

Dr. Marco Gattorno Dr. Elio Castagnola

L’AQUILA

Clinica Pediatrica Università degli studi dell’Aquila L’AQUILA Tel. 0862/312029 Fax 0862/312029

Prof. Giovanni Nigro

LECCE

Unità Operativa di Pediatria - UTIN Azienda Ospedaliera "Cardinale G. Panico" Via San Pio X 4 73039 Tricase (LE) Tel. 0833 544104 Fax 0833 543561 e-mail: acivino@piafondazionepanico.it

Dr. Giuseppe Presta Dr.ssa Adele Civino

0315

MANTOVA

Pediatria - Ospedale Poma Via Albertoni 1 46100 MANTOVA Tel. 0376 201454 Fax 0376 201772 e-mail: silvia.fasoli@tin.it

Prof. Giorgio Zamboni Dr. G. Gambaretto Dr.ssa Silvia Fasoli

1504

MESSINA

Genetica e Immunologia Pediatrica Azienda “G. Martino” Via Consolare Valeria Gazzi 98100 MESSINA Tel. 090 2213114 Fax 090 2213788 Cell. Gallizzi: 347 4341001 e-mail: carmelo.salpietro@unime.it, rgallizzi@unime.it

Prof. Carmelo Salpietro Dr.ssa Romina Gallizzi

0314

MILANO

Clinica Pediatrica II Università di Milano Via Commenda 9 20122 MILANO Tel. 02 55032496 Fax 02 50320210 e-mail: mariacristina.pietrogrande@unimi.it,

Prof.ssa Maria Cristina Pietrogrande Dr.ssa Rosa Maria Dellepiane Dr.ssa Cristina Panisi

7

rosamaria.dellepiane@policlinico.mi.it

0316

MILANO Medicina Interna Ospedale Maggiore Policlinico IRCCS Via F. Sforza, 35 20122 MILANO Tel. 02 55033563 - 3353 Fax 02 50320236 Cell. Carrabba: 335 6779228 e-mail: giovanna.fabio@unimi.it, maria.carrabba@gmail.com

Dr.ssa Giovanna Fabio Dr.ssa Maria Carrabba

0317

MILANO

Dipartimento di Medicina e Chirurgia Università di Milano Policlinico San Marco Corso Europa 7 24040 ZINGONIA-OSIO SOTTO Tel. 035/886308 FAX 035/886308 Cell. Pietrogrande: 335 5464082 e-mail: maurizio.pietrogrande@unimi.it

Prof. Maurizio Pietrogrande

0318

MILANO

Unità di Ricerca Clinica Pediatrica HSR-TIGET Istituto Scientifico San Raffaele Via Olgettina 58 MILANO Tel. 02 26434875 - 4669 - 4387 Fax 02 26434668 Cell. Bacchetta: 348 9004403 E-mail: m.roncarolo@hsr.it, a.aiuti@hsr.it, rosa.bacchetta@hsr.it

Prof.ssa Maria Grazia Roncarolo Prof. Alessandro Aiuti Dr.ssa Rosa Bacchetta

0302

MONZA

Clinica Pediatrica Ospedale “S. Gerardo” Via Donizetti 106 20052 MONZA Tel. 039 2333513 Fax 039 2301646 Cell. Vallinoto: 339 4906457 e-mail: g.masera@hsgerardo.org

Prof. Giuseppe Masera Prof. Andrea Biondi Dr.ssa Cristina Vallinoto

1207

NAPOLI

Unità Specialistica di Immunologia Dipartimento di Pediatria Università Studi di Napoli “Federico II” Via Pansini 5 80131 NAPOLI Tel. 081 7464340 Fax 081 5451278 e-mail: pignata@unina.it

Prof. Claudio Pignata

1203

NAPOLI

Divisione di Pediatria-Ematologia Ospedale “Pausilipon” Via Posillipo 226 80123 NAPOLI Tel. 081 2205410 Fax 081 2205418 e-mail: vinpog@iol.it

Prof. Vincenzo Poggi Dr. Giuseppe Menna

8

1208

NAPOLI

I Divisione Medica Pediatrica Ospedale Santobono Via M. Fiore 6 80100 NAPOLI Tel. 081 2205636 - 5584058 Fax 081 2205608 Cell. Sottile: 347 6683074 e-mail: ritasottile@libero.it

Dr. Rocco Di Nardo Dr.ssa Rita Sottile

1209

NAPOLI

Pediatria - Ospedale S. Leonardo ASL NA5 Via Castellammare di Stabia 80054 GRAGNANO (NA) Tel. 081 8711782 Fax 081 8729341 e-mail: adapuzzo@libero.it

Dr. Alfonso D’Apuzzo

1210

NAPOLI

I Divisione di Pediatria - Ospedale SS. Annunziata Via Egiziaca A Forcella 80139 NAPOLI Tel. 081 2542504 - 2600 Fax 081 2542635 e-mail: antpelliccia@tiscali.it

Dr. Antonio Pelliccia

1204

NAPOLI

II Pediatria - Ospedale SS. Annunziata ASLNA1 Tel. 081 2542544 - 634 Fax 081 2542635

Dott. Antonio Correra

1211

NAPOLI

Centro per la diagnosi e la cura delle Immunodeficienze Primitive Immunologia e Allergologia Clinica Università degli Studi di Napoli “Federico II” Via Pansini 5 80131 NAPOLI Tel. e fax 081 7462261 Fax 081 2203998 e-mail: spadaro@unina.it

Prof. Gianni Marone Dott. Giuseppe Spadaro

0401

PADOVA

Clinica Oncoematologica Pediatrica Università di Padova Via Giustiniani 3 35128 PADOVA Tel. 049 8218003 FAX 049 8213510 e-mail: modesto.carli@unipd.it, luigi.zanesco@unipd.it, giuseppe.basso@unipd.it, mariacaterina.putti@unipd.it

Prof. Modesto Carli Prof. Luigi Zanesco Prof. Giuseppe Basso Dr.ssa Maria Caterina Putti

0410

PADOVA

Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale Immunologia Clinica Via Giustiniani 2 35128 PADOVA Tel. 049 8756523 FAX 049 8754179 Cell. Agostini: 339 2074486 e-mail: carlo.agostini@unipd.it

Prof. Gianpietro Semenzato Prof. Carlo Agostini

9

1505

PALERMO

U.O. Clinica Pediatrica Via Benedettini 1 90100 PALERMO Tel 091 6666247 - 038 FAX 091 6666202 e-mail: istped@unipa.it

Prof. G M. Amato

1501

PALERMO

Oncoematologia Pediatrica Via Benedettini 1 90100 PALERMO Tel. 091 6666130 - 015 Fax 091 6666001 e-mail: oncoematoped@ospedalecivicopa.org

Dr. Paolo D’Angelo Dr. Antonino Trizzino

0601

PARMA

Oncoematologia Pediatrica Dipartimento di Pediatria Azienda Ospedaliera di Parma Via A. Gramsci 14 43100 PARMA Tel. 0521 702222 - 702210 Fax 0521 702360 e-mail: gcizzi@ao.pr.it, pbertolini@ao.pr.it

Dr. Giancarlo Izzi Dr.ssa Patrizia Bertolini

0303

PAVIA

Oncoematologia Pediatrica IRCCS Policlinico San Matteo P.le Golgi, 2 27100 Pavia Tel. 0382 502607 Fax 0382 501251 e-mail: f.locatelli@smatteo.pv.it, m.zecca@smatteo.pv.it

Prof. Franco Locatelli Dr. Marco Zecca

0319

PAVIA

Clinica Pediatrica - Policlinico “S.Matteo” P.le Golgi 2 27100 PAVIA Tel. 0382 502770 - 557 - 629 Fax 0382 527976 Cell. Bossi: 347 6836146 e-mail: gl.marseglia@smatteo.pv.it, r.maccario@smatteo.pv.it, g.bossi@smatteo.pv.it

Prof. Giorgio Rondini Dr. Gianluigi Marseglia Prof.ssa Rita Maccario Dr.ssa Grazia Bossi

0903

PESARO

U.O. Pediatria Neonatologia Azienda Ospedaliera San Salvatore P.le Cinelli 4 61100 PESARO Tel 0721 362459 Fax 0721 362460 e-mail: pediatria.ps@abanet.it, l.felici@ospedalesansalvatore.it

Dr. Leonardo Felici

0703

PISA

Clinica Pediatrica III Via Roma 66 56100 PISA Tel. 050 992840 - 2222 Fax 050 888622 Cell. Consolini: 349 6444236 e-mail: c.favre@clp.med.unipi.it, rita.consolini@clp.med.unipi.it

Dr. Claudio Favre Dr.ssa Rita Consolini

10

0607

RIMINI

Divisione Pediatria Ospedale “Infermi” Via Settembrini 11 47900 RIMINI Tel. 0541 705210 Fax 0541 705360 Cell. Sacchini: 333 2947863 e-mail: vvecchi@auslrn.net, psacchini@auslrn.net

Prof. Vico Vecchi Dr.ssa Patrizia Sacchini Dr.ssa Gloria Rinaldi

1110

ROMA

Dipartimento Pediatrico Ospedale Bambino Gesù P.zza S. Onofrio 4 00165 ROMA Tel. 06 68592508 - 2020 - 2006 Fax 06 68592508 Cell. Cancrini: 347 8866298 Cell. Finocchi: 339 7163380 e-mail: ugazio@opbg.net, rossi@opbg.net, cancrini@med.uniroma2.it, livadiotti@opbg.net, andrea.finocchi@uniroma2.it

Prof. Alberto G. Ugazio Prof. Paolo Rossi Dr.ssa Susanna Livadiotti Dr.ssa Caterina Cancrini Dr. Andrea Finocchi

1107

ROMA

Clinica Pediatrica Università Cattolica Sacro Cuore Largo Gemelli 8 00135 ROMA Tel. 06 30514348 - 4290 Fax 06 3051343 e-mail: iclpe@rm.unicatt.it

Prof. Achille Stabile

1108

ROMA

Istituto di Clinica Pediatrica Università “La Sapienza” Viale Regina Elena 325 00163 ROMA Tel. 06 4404994 Fax 06 490274 Cell. Iacobini: 338 8396363 e-mail: marzia.duse@uniroma1.it, metello.iacobini@uniroma1.it

Prof.ssa Marzia Duse Dr. Metello Iacobini

1109

ROMA

Dipartimento di Medicina Clinica Università “La Sapienza” Viale dell’Università 37 00186 ROMA Tel. 06 49972007 Fax 06 4463877 e-mail: isabella.quinti@uniroma1.it

Prof.ssa Isabella Quinti

1111

ROMA

Centro Interdisciplinare Pediatria Policlinico Tor Vergata Viale Oxford 81 00133 ROMA tel. 06 20900736 fax 06 20900530 Cell. Aiuti: 347 0926831 e-mail: moschese@med.uniroma2.it

Prof. Paolo Rossi Prof.ssa Viviana Moschese

1212

SALERNO

Pediatria AORN “S.Giovanni di Dio E. Ruggi d’Aragona” Via S. Leonardo

Dr. Francesco Cecere

11

84100 SALERNO tel. 089 200486 fax 089 200486 e-mail: pedsalerno@libero.it, francescocecere@hotmail.com

0702

SIENA

Dipartimento di Pediatria Università degli studi di Siena V.le Bracci 16 53100 SIENA tel 0577 581640 fax 0577 586152 e-mail: pediatria@unisi.it

Prof. Guido Morgese Dr. Antonio Acquaviva

0408

TREVISO

Divisione Pediatrica Ospedale Regionale Treviso Via Ospedale 7 31100 TREVISO Tel. 0422 322266 Fax 0422 322232 e-mail: gdezan@ulss.tv.it

Dr. Giuseppe De Zan Dr.ssa Stefania Strafella

0501

TRIESTE

U.O. Emato-oncologia Pediatrica Ospedale Infantile “Burlo Garofolo” Via dell’Istria 65/I 34137 TRIESTE Tel. 040/3785342 Fax 040/3785494 Cell. Tommasini: 349 5330829 e-mail: tamaro@burlo.trieste.it, rabusin@burlo.trieste.it, tommasini@burlo.trieste.it

Prof. Paolo Tamaro Dott. Marco Rabusin Dr. Alberto Tommasini

0105

TORINO

Dipartimento di Scienze Pediatriche e dell’Adolescenza Ospedale Infantile Regina Margherita Piazza Polonia 94 10126 TORINO Tel. 011 3135798 Fax 011 3135015 Cell. Martino 338 1269750 e-mail: pierangelo.tovo@unito.it, silvana.martino@unito.it

Prof. Pierangelo Tovo Dr.ssa Silvana Martino

0309

VARESE

Clinica Pediatrica Ospedale “Filippo Del Ponte” P.zza Biroldi 1 21100 VARESE Tel. 0332 285300 - 299247 Fax 0332 235904 e-mail: luigi.nespoli@ospedale.varese.it

Prof. Luigi Nespoli Dr.ssa Maddalena Marinoni

0405

VENEZIA

Dip.to Oncologia ed Ematologia Oncologica Ospedale P.F. Calvi Largo S. Giorgio 2 NOALE (VE) Tel. 041 5896221 Fax 041 5896259 e-mail: emanoale@tin.it, a.porcellini@libero.it

Prof. Adolfo Porcellini

0409

VERONA

Centro Fibrosi Cistica

Dr. Giantonio Cazzola

12

Ospedale Civile di Verona P.le Stefani 1 37126 VERONA Tel. 045 8123740 FAX 045 8122042 Cell. Cazzola: 348 6117514 Cell. Tacchella: 349 2559308 e-mail: giantonio.cazzola@azosp.vr.it, naitac@yahoo.it

VERONA

Clinica Pediatrica Policlinico G.B. Rossi P.le L.A. Scuro, 10 37126 Verona Tel. 045 8124392 Fax 045 8124779 Cell. Degani: 333 4499112 e-mail: daniela.degani@azosp.vr.it

Prof. A. Boner Dr.ssa Daniela Degani

13

INDICE

1. OBIETTIVI………………………………………………………………………….……..… 14

2. INTRODUZIONE: stato dell’arte

2.1 MANIFESTAZIONI CLI NICHE…………………………………………………..…….. 15

2.2 LA FUNZIONE DEL GENE FOXP3 E LA PATOGENESI DI IPEX……………..…….. 16

2.3 ESAMI DI LABORATORIO…………………………………………...…………..…….. 18

2.4 DIAGNOSI DIFFERENZIALE………………………………………….……………….. 19

3. PROTOCOLLO DIAGNOSTICO

3.1 CRITERI D’INCLUSIONE…………………………………………..…………………… 20

3.2 DIAGNOSI DI CERTEZZA…………….………………………………………………... 21

3.3 INVIO DEI CAMPIONI……………………………………………..…….……................ 21

3.4 ESAMI DA ESEGUIRE ALLA DIAGNOSI……………………………………………... 22

3.5 ESAMI DA ESEGUIRE DURANTE IL FOLLOW-UP ……………………………….. 23

4. STUDI MMUNOLOGICI …………………………………………………………………... 23

5. STUDIO FAMIGLIARE E DEI PORTATORI……………………………………………... 25

6. DIAGNOSI PRENATALE ………………………………………………………………….. 25

7. SUGGERIMENTI TERAPEUTICI………………………………………………………….. 26

8. BIBLIOGRAFIA ESSENZIALE……………………………………………………………. 36

14

1. OBIETTIVI

La sindrome IPEX (Immunodisregolazione, Poliendocrinopatia, Enteropatia legata al cromosoma X), causata

da mutazioni del gene FOXP3, è una malattia genetica autoimmune rara ad esordio precoce e ad elevata

mortalità, con un’incidenza precisa non chiara, ma la cui insorgenza è spesso sottostimata e non

correttamente diagnosticata. Il progetto di ricerca da noi svolto negli ultimi quattro anni sulla sindrome

IPEX, ha contribuito in maniera significativa ad aggiornare e correlare dati clinici, biologici e molecolari

della malattia. Questo ha condotto ad una migliore comprensione delle manifestazioni cliniche e dei

meccanismi immunologici responsabili della patogenesi, e alla definizione di più precise indicazioni per una

diagnosi tempestiva e corretta, favorendo quindi un approccio terapeutico più mirato.

In base alle attuali conoscenze, gli obiettivi principali di questo protocollo diagnostico e di ricerca sono di:

• raccogliere una casistica omogenea per quanto riguarda quadro clinico all'esordio e difetto genetico

di base (correlazione genotipo-fenotipo);

• definire e applicare raccomandazioni diagnostiche e assistenziali uniformi su tutto il territorio

nazionale;

• valutare l'eventuale eterogeneità di presentazione o evoluzione in funzione del tipo di mutazione;

• valutare l'evoluzione della malattia in funzione della risposta alle diverse terapie e del tipo di

mutazione;

• monitorare i pazienti e proporre degli schemi efficaci di follow-up al fine di migliorare la

sopravvivenza e la qualità di vita di questi pazienti, mediante l’aggiornamento periodico dello stato

clinico e dei dati di laboratorio dei pazienti che verranno registrati.

Nella parte introduttiva viene riassunto lo stato dell' arte della sindrome di IPEX, con le attuali conoscenze

cliniche, genetiche, immunopatogenetiche e le terapie attualmente disponibili.

A seguire, viene proposto il protocollo diagnostico con i criteri di inclusione, diagnosi di certezza, le

indicazioni per l'invio dei campioni ed infine gli esami da eseguire alla diagnosi e durante il follow-up.

Vengono quindi brevemente illustrati gli studi immunologici da eseguire. Successivamente, vengono date indicazioni per lo studio famigliare e dei portatori e la diagnosi prenatale.

Infine, vengono proposti alcuni suggerimenti terapeutici.

15

2. INTRODUZIONE

2.1 MANIFESTAZIONI CLINICHE

La sindrome IPEX (Immune dysfunction - Polyendocrinopathy – Enteropathy – X-linked) è una

malattia genetica autoimmune dovuta a mutazioni del gene FOXP3 (Bennett C.L. and Ochs H.D.

2001; Bennett C.L. et al. 2001; Wildin R.S. et al. 2002). Tipicamente l’esordio della malattia, nella

sua forma grave, si verifica nei primi mesi di vita e può avere un decorso rapidamente fatale. La

triade dei sintomi nei casi gravi e ad esordio precoce, è costituito da enterite che si manifesta come

diarrea secretoria spesso intrattabile con arresto dell’accrescimento, diabete di tipo 1 (DMT1),

generalmente di difficile controllo metabolico, ed eczema. L’enteropatia si manifesta anche durante

l’allattamento materno ed è indipendente dall’introduzione del latte vaccino o del glutine nella

dieta. L’esordio dell’enteropatia può precedere o seguire a breve quello del DMT1, anch’esso

presente nella maggior parte dei pazienti, talvolta anche in assenza delle varianti alleliche HLA di

suscettibilità al diabete. Inoltre, insieme all'eczema, elevati livelli sierici di Immunoglobuline (Ig) E

ed eosinofilia sono pressoché sempre presenti (Gambineri E. et al. 2008). Più rari sono all'esordio

anemia emolitica, neutropenia, trombocitopenia e ipotiroidismo.

Ad oggi, una precisa correlazione tra il genotipo delle mutazioni e il fenotipo clinico della sindrome

non è ancora stata definita. La tipica triade sintomatologica con diarrea, diabete insulino-dipendente

ed eczema, è più comunemente riscontrabile in pazienti portatori di mutazione all’interno del

dominio funzionale “forkhead” o mutazioni che abrogano completamente l’espressione della

proteina. Tuttavia, il sito di mutazione non può ancora considerarsi predittivo della gravità della

malattia e, indipendentemente dal tipo di mutazione, la sindrome IPEX può essere rapidamente

fatale soprattutto nel periodo subito successivo all’esordio. Inoltre vi sono pazienti che, pur avendo

la stessa mutazione, presentano un’evoluzione diversa della malattia; in particolare vi sono pazienti

che superano meglio di altri la grave fase di esordio e rispondono meglio alla terapia (Gambineri E.

et al. 2008).

In seguito al sempre più frequente ricorso alla diagnosi genetica in pazienti con sintomatologia

variabile, è stato possibile riscontrare mutazioni di FOXP3 anche in forme cliniche meno gravi, ad

esordio più tardivo, e con quadro clinico non ancora ben caratterizzato. In tali casi l’enterite sembra

presentarsi con un quadro meno devastante ed a carattere intermittente. Altri sintomi, riscontrabili

oltre a quelli precedentemente citati, possono essere artrite poliarticolare, glomerulonefropatia e

nefrite interstiziale, linfoadenopatia, epatopatia ed alopecia. I problemi di malnutrizione, il mancato

16

accrescimento e la terapia immunosoppressiva possono poi determinare, a medio e lungo termine,

un’aumentata suscettibilità alle infezioni, generalmente a carico dell’apparato respiratorio e

dell’intestino. Infine, vi sono pazienti con sintomi tipici di IPEX nei quali il gene FOXP3 non

risulta mutato: si parla di sindromi IPEX-like causate da mutazioni delle regioni regolatorie del

gene FOXP3 o di geni diversi, ma correlati funzionalmente a FOXP3, come per esempio il gene

della catena alfa del recettore per la interleuchina-2 (CD25).

2.2 LA FUNZIONE DEL GENE FOXP3 e LA PATOGENESI di IPEX

Il gene FOXP3 è situato sul cromosoma X, pertanto solo i figli maschi sono malati, mentre le

femmine portatrici sono sane. Il gene codifica per un fattore di trascrizione definito come fattore

essenziale per la funzione delle cellule T regolatorie (Treg) periferiche CD4+CD25+ (2-4% dei

linfociti CD4+ nel sangue periferico), importante sottopopolazione linfocitaria di origine timica,

preposta al mantenimento della tolleranza periferica e al controllo delle risposte T effettrici verso

patogeni esterni o verso antigeni autologhi. Il mutante murino naturale, detto topo “scurfy”,

manifesta una grave linfoproliferazione conseguente alla mancanza delle cellule Treg, dimostrando

quindi una chiara correlazione tra la mutazione del gene FOXP3, la mancanza delle cellule Treg e

lo sviluppo della patologia autoimmune (Godfrey V.L. et al. 1991; Fontenot J.D. et al. 2003; Khattri

et al. 2003; Ramsdell S. et al. 2003). Inoltre, è stato recentemente dimostrato sia nel topo che nelle

cellule umane, che il trasferimento genico di FOXP3 in cellule T naive, induce un fenotipo cellulare

soppressivo, a supporto del ruolo chiave svolto da questo gene nella funzione delle cellule Treg

(Hori et al. 2003; Allan S. 2008). Alla luce delle attuali conoscenze quindi, nel topo, la patogenesi

della malattia da mutazione del gene FOXP3 è da ricondurre ad una assenza delle cellule Treg in

grado di modulare il funzionamento delle cellule T effettrici e di mantenere i meccanismi di

tolleranza immunologia. Nell’uomo, una chiara indiretta dimostrazione che FOXP3wild type (wt) è

essenziale per le cellule Treg normali, in grado di mantenere il controllo di cellule effettrici e di

prevenire lo sviluppo dell'autoimmunità, deriva dal fatto che, come recentemente dimostrato, nelle

mamme portatrici sane le cellule Treg esprimono solo il FOXP3wt, mentre tutti gli altri linfociti

periferici presentano una distribuzione random della forma mutata e della forma wt del gene

(DiNunzio S. Blood 2009). Inoltre, studi sul chimerismo post-trapianto nei pazienti IPEX, hanno

messo in evidenza che anche poche cellule Treg con FOXP3wt sembrano essere sufficienti per il

controllo della malattia dopo trapianto di cellule staminali emopoietiche (HSCT). E' pertanto

verosimile pensare che la patogenesi della sindrome di IPEX sia riconducibile, almeno in parte

anche nell'uomo, ad un difetto delle cellule Treg esprimenti FOXP3mut, con un meccanismo che

17

rimane ancora da chiarire.

Ad oggi circa 50 mutazioni sono state riportate tra cui mutazioni “missense”, dei siti di “splicing” o

delezioni, e non è ancora stato possibile definire una precisa correlazione tra genotipo e fenotipo

(Ziegler S.F. 2006; Gambineri E. 2008). Nell’uomo la mutazione del gene, nella maggior parte dei

casi, non determina la completa abrogazione dell’espressione della proteina FOXP3, che rimane

quindi reperibile. Inoltre, le cellule Treg possono essere presenti in normale proporzione nel sangue

periferico e nei tessuti dei pazienti IPEX (Bacchetta R.et al. 2006; Gambineri E. et al. 2008). Tale

osservazione ha importante rilevanza diagnostica in quanto indica la necessità dell’analisi genetica

per una corretta diagnosi. Le cellule Treg con FOXP3 mutato sono tuttavia difettive nella loro

funzione soppressiva, come dimostrato anche in vitro (Bacchetta R. et al. 2006). L’alterazione

funzionale è ovviamente più grave dei pazienti con assenza della proteina e può essere parzialmente

corretta in vitro in presenza di IL-2 o in presenza di rapamicina, suggerendo che a seconda delle

mutazioni può persistere un funzione residua che può essere modulata da appropriati agenti esterni.

Ad oggi tuttavia non esistono test facilmente accessibili per la determinazione della funzione

proteica residua.

L'espressione di FOXP3 è soggetta a regolazione epigenetica ed è stato recentemente descritto che

Il gene FOXP3 delle cellule T regolatorie timiche mantiene uno stato di demetilazione di una zona

specifica del DNA (TSDR) che permette la costante espressione del gene stesso. Il gene FOXP3

può essere anche espresso dalle cellule T effettrici dopo attivazione cellulare. Tale espressione nelle

cellule attivate, non regolatorie, è transitoria ed è associata a metilazione del gene e della TSDR

(Baron U. et al. 2008). Pertanto la determinazione della percentuale di FOXP3 demetilato nella

TSDR è rilevante per determinare la proporzione delle cellule bona fide T regolatorie in periferia e

per distinguerle dalle cellule T attivate esprimenti FOXP3. Studi preliminari ci hanno permesso di

determinare che nei pazienti IPEX la percentuale di TSDR è normale, confermando che anche in

presenza di mutazione le cellule Treg possono differenziare (Passerini L., manoscritto in

preparazione).

L' aumento dell'espressione di FOXP3 nelle cellule effettrici attivate, inizialmente di non facile

interpretazione, ha ricevuto particolare attenzione in seguito al riscontro di un’azione repressoria

diretta tra FOXP3 e RORC2, fattore di trascrizione per lo sviluppo delle cellule Th17 che sembrano

svolgere un ruolo patogeno importante in varie patologie autoimmuni, come sclerosi multipla e

artrite reumatoide (Zhang F. et al. 2008). Questo dato, insieme alla dimostrazione che nei pazienti

IPEX vi è un’alterata produzione di citochine Th1, IL-2 e IFN-gamma, fa ipotizzare che il FOXP3

mutato possa non solo causare un deficit delle cellule Treg ma anche favorire lo sviluppo di cellule

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Th17 con funzione patogena.

2.3 ESAMI DI LABORATORIO

Da un punto di vista di laboratorio, i parametri correlati alle disfunzioni d’organo risultano alterati

ma non esiste un esame specifico diagnostico della malattia di base, se non l’analisi genetica

molecolare del gene FOXP3 (Wildin R.S. et al. 2002; Gambineri E. et al. 2008; Patey-Mariaud de

Serre N. et al, 2009). Nei casi in cui è presente l’enterite secretoria, le ricerche microbiologiche su

materiale fecale risultano generalmente negative. Frequentemente sono presenti autoanticorpi, ad

esempio quelli associati a diabete autoimmune (anti-insulina, anti-IA2, anti-GAD, anti-ICA), gli

anticorpi anti-enterociti, anti-cellule mucipare (goblet cells), anti-antigene 75kDa, anti-piastrine,

anti-eritrociti e anti-tiroide (anti-tireoglobulina, anti-mieloperossidasi tiroidea, anti-

tireoperossidasi), quest’ultimi anche in assenza delle alterazioni funzionali. Permangono invece

negativi gli anticorpi anti-transglutaminasi. Presenti, anche se a livelli non elevati, gli anticorpi anti-

nucleo. L’eczema è costantemente associato ad eosinofilia e a elevati livelli sierici di IgE, mentre le

altri classi di immunoglobuline rimangono nella norma. Nella fase acuta, il numero assoluto dei

linfociti T è generalmente aumentato, la percentuale delle diverse sottopopolazioni linfocitarie

(CD3, CD4, CD8, CD16, CD19) non è alterata. Il rapporto CD4/CD8 è mantenuto, il repertorio T è

policlonale come di norma, le cellule naive e memory sono per lo più paragonabili a controlli di

pari età. Come detto precedentemente, le cellule CD4+CD25+FOXP3+ possono essere presenti a

livelli normali, tuttavia risultano sensibilmente ridotte qualora la mutazione prevenga l'espressione

di FOXP3 o in caso di terapia immunosoppressiva in atto. La proliferazione in vitro ai mitogeni può

risultare nella norma o aumentata. La produzione in vitro di citochine evidenzia una diminuzione

delle citochine Th1. Il cariotipo linfocitario risulta normale.

Nella Tabella 1 è fornita una sintesi dei più comuni reperti di laboratorio riscontrabili nella

sindrome IPEX.

La biopsia intestinale è caratterizzata da atrofia dei villi totale o subtotale a livello duodenale ed

infiammazione, con distruzione ghiandolare, in tutte le parti del tratto gastroenterico. In particolare,

sono stati identificati tre distinti aspetti istopatologici nei pazienti IPEX: “graft-versus-host disease -

like”, “coeliac disease - like” (anche se eseguita precedente alla introduzione del glutine nella dieta

oppure in assenza di anticorpi anti-transglutaminasi e in assenza di risposta alla dieta priva di

glutine) ed “enteropatia con anticorpi anti-goblet cell” (Patey-Mariaud de Serre N. et al, 2009). La

Tabella 2 riassume i risultati del recente studio che ha descritto tali quadri istopatologici.

19

2.4 DIAGNOSI DIFFERENZIALE

In presenza di enteropatia ad esordio precoce devono essere escluse le più comuni cause di diarrea

persistente, tra cui quelle di origine infettiva, alimentare, metabolica, da disordini dei sistemi di

trasporto, da alterazioni anatomiche o della motilità intestinale (Murch S. et al. 2006). In presenza

di DMT1 come unico sintomo, devono essere escluse altre cause di diabete neonatale (diagnosticato

nei primi 6 mesi di vita, sebbene in alcuni casi sia possibile una diagnosi più tardiva). Tra queste, vi

sono mutazioni delle subunità (Kir6.2 e SUR1) del canale del potassio sensibile all’ATP (KATP),

mutazioni del cromosoma 6q24 e mutazioni del gene dell’insulina (Valamparampil J.J. et al. 2009;

Greeley S.A.W. et al. 2010). La gravità della diarrea protratta, con possibili complicanze settiche

sovrapposte, può condurre a dover escludere anche immunodeficienze combinate gravi (SCID) o

forme intermedie di immunodeficienza combinata (CID) (Ghea R.S. et al. 2007). Inoltre,

l'associazione con elevati livelli sierici di IgE, eosinofilia ed eczema può porre il sospetto di

sindrome di Wiskott-Aldrich, di Omenn o da Iper-IgE. Queste condizioni devono essere escluse

attraverso l’esecuzione degli esami immunologici consigliati dal protocollo e/o dei rispettivi test

genetici.

La malattia celiaca può solitamente essere esclusa in base alla precoce insorgenza dell'enteropatia

da mutazione di FOXP3 già prima dell’introduzione del glutine nella dieta del lattante, ma nelle

forme di IPEX a esordio tardivo occorre effettuare i riscontri diagnostici per questa patologia.

Disfunzioni paratiroidee o insufficienza surrenalica sono difficilmente riscontrabili in IPEX, ma si

riscontrano generalmente nelle poliendocrinopatie autoimmuni, in particolare nella APECED. La

Tabella 3 riassume le caratteristiche più rilevanti per le diagnosi differenziali citate.

20

3. PROTOCOLLO DIAGNOSTICO

ELEMENTI DI SOSPETTO DIAGNOSTICO

Il sospetto diagnostico di IPEX può essere posto in presenza di

almeno una delle manifestazioni cliniche "maggiori":

- diarrea protratta intrattabile ad esordio precoce (ad etiologia non infettiva e con biopsia non

indicativa per altre cause)

- diabete di tipo I ad esordio neonatale o comunque entro i primi due anni di vita

in associazione a una o più delle manifestazioni “minori”, quali:

- manifestazioni cutanee (per esempio, eczema atopico o psoriasico)

- tiroidite autoimmune

- anemia emolitica, piastrinopenia, granulocitopenia

- glomerulopatia o nefrite interstiziale

- epatite autoimmune

- poliartrite

- alopecia

- aumento dei livelli sierici di IgE isolato o associato ad eosinofilia.

Si raccomanda inoltre un'attenta anamnesi familiare che potrebbe evidenziare nella linea materna, la

presenza di soggetti maschi con analogo fenotipo clinico oppure una poli-abortività.

Nei bambini di età più avanzata, l’associazione di diarrea protratta (non infettiva e non responsiva

alla dieta priva di glutine) e/o diabete esordito dopo il 2° anno di vita con una o più manifestazioni

“minori”, potrebbe ugualmente indurre il medico curante a richiedere l’analisi genetica, con lo

scopo di non mancare la diagnosi di forme lievi, tardive e/o con un quadro clinico incompleto, ad

oggi ancora di difficile definizione.

3.1 CRITERI DI INCLUSIONE

La diagnosi di certezza di IPEX può essere posta con l’analisi di mutazione del gene FOXP3.

Dopo aver escluso in diagnosi differenziale le altre possibili malattie (di cui sopra), nel sospetto di

sindrome di IPEX, verranno considerati candidabili all'analisi molecolare del gene FOXP3 e

all’inclusione nel protocollo, i pazienti di sesso maschile con:

presenza di almeno una delle manifestazioni cliniche "maggiori":

- diarrea protratta intrattabile ad esordio precoce (ad etiologia non infettiva e con biopsia non

specifica per altre cause)

- diabete di tipo I ad esordio neonatale o comunque entro i primi due anni di vita

21

3.2 DIAGNOSI DI CERTEZZA

La diagnosi di certezza di sindrome di IPEX può essere posta in presenza di:

• soggetto di sesso maschile

• mutazione del gene FOXP3 (indipendentemente dal grado di espressione della proteina)

Per i pazienti che soddisfano questi criteri di inclusione verranno compilate la scheda di

registrazione (Mod. 1.01) e la scheda di diagnosi (Mod. 31.01); in seguito, andranno compilate le

schede di follow-up annuale (Mod. 31.02), tutte da inviare al Centro Operativo AIEOP/ FONOP di

Bologna.

3.3 INVIO DEI CAMPIONI

Su richiesta del Centro afferente, l’analisi di mutazione del gene FOXP3 sarà eseguita presso uno dei seguenti Centri:

Dr. Eleonora Gambineri

A.O.U. Meyer - Laboratorio di Immunologia

Viale G. Pieraccini, 24

50139 FIRENZE

tel.: 055 5662464

email: eleonora.gambineri@unifi.it

• 1 provetta con 2 ml di sangue in EDTA (per analisi della mutazione)

• 1 provetta con 5-10 ml di sangue in eparina (per analisi dell’espressione genica,

eventualmente effettuabile con un successivo prelievo)

Dr.ssa L. Perroni

Ospedali Galliera- Laboratorio di Genetica Umana

ViaVolta, 8

16128 Genova

tel.: 010 5634376 (77)

email: lucia.perroni@galliera.it

• 1 provetta con 2 ml di sangue in EDTA (per analisi della mutazione)

22

E’ necessario che l’invio dei campioni sia preceduto da specifico consenso informato di ciascuna

famiglia, ottenuto e conservato dal Centro afferente per ciascuno dei propri pazienti arruolati.

I campioni di sangue vanno inviati al centro prescelto dal lunedì al mercoledì di ogni settimana

attraverso corriere TRACO 10 (a carico del destinatario) che garantisce la consegna dei campioni

entro le ore 10 del giorno successivo.

L'invio dei campioni dovrà essere accompagnato da n° 1 impegnativa del Servizio Sanitario

Nazionale debitamente compilata (data del prelievo, generalità del paziente con luogo e data di

nascita e luogo di residenza, numero di tessera sanitaria, numero di codice fiscale; causale: analisi

di mutazione del gene FOXP3).

I risultati dell’analisi di mutazione verranno comunicati nel più breve tempo possibile, o comunque

entro un massimo di 30 giorni.

3.4 ESAMI DA ESEGUIRE ALLA DIAGNOSI

Esami ematochimici all’esordio:

- emocromo con formula

- indici di flogosi

- proteine totali e protidogramma

- enzimi epatici

- IgM, IgA, IgG

- IgE

- glicemia

- dosaggio ormoni tiroidei e TSH

- creatinina

- azotemia

- elettroliti

- immunofenotipo (CD3, CD4, CD8, CD16, CD56, CD19, CD25. HLA DR, CD45RA,

CD45RO, CD4/CD25/FOXP3)

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Esami ematochimici di approfondimento (selezionati in base al quadro clinico e all’esito degli

esami precedenti):

- anticorpi anti-insulina (IAA), IA-2, GAD, ICA

- alleli HLA associati al diabete (DR3, DR4, DQ2, DQ8) (se presente diabete)

- anticorpi anti-enterociti

- anticorpi anti-transglutaminasi

- anticorpi anti-LKM

- anticorpi anti-microsomi tiroidei

- anticorpi anti-tireoglobulina

- anticorpi anti-tireoperossidasi

- anticorpi anti-nucleo

3.5 ESAMI DA ESEGUIRE DURANTE IL FOLLOW-UP

Gli esami ematochimici eseguiti all'esordio, verranno ripetuti ogni 6-12 mesi in base alle condizioni

cliniche del paziente e alla terapia in atto.

4. STUDI IMMUNOLOGICI

I pazienti IPEX possono essere sottoposti ai seguenti studi immunologici volti a caratterizzare la

disfunzione immunologica a livello cellulare, possibilmente prima dell’inizio della terapia

immunosoppressiva:

1. valutazione della presenza di cellule Treg CD4+CD25+FOXP3+ (se non ancora eseguita) sia

con immunofenotipo che con analisi di demetilazione della TSDR di FOXP3;

2. valutazione della funzione soppressiva in vitro delle cellule Treg CD4+CD25high, eseguita sia

su cellule fresche sia su linee cellulari;

3. studio dell’espressione di FOXP3 nelle cellule Treg e nelle cellule T effettrici attivate;

4. studio della funzionalità delle cellule T effettrici, in particolare studio della produzione di

citochine Th1, Th2 e Th17 e della presenza di cellule Th17, in cellule fresche o linee cellulari;

5. studio del repertorio Vbeta;

6. studio delle sottopopolazioni cellulari non-T, quali cellule B e cellule dendritiche;

7. studio delle citochine nel siero.

In un campione rappresentativo di pazienti, qualora venga identificata una disfunzione in vitro

dell’attività regolatoria, si eseguiranno studi volti a valutare i meccanismi responsabili di tale

24

mancata funzione e verrà testata la possibilità di restaurare tale funzione in vitro.

A questo riguardo, campioni selezionati verranno utilizzati per un’analisi del profilo di espressione

genica differenziale in popolazioni cellulari con mutazione rispetto a cellule sane. Inoltre, verranno

messi a punto protocolli di terapia cellulare dopo espansione delle cellule T regolatorie ed infine

verranno eseguiti studi di trasferimento genico nelle cellule T mutate con vettori lentivirali

contenenti FOXP3.

I risultati di tali ricerche verranno condivisi con i gruppi partecipanti, singolarmente e attraverso

riunioni periodiche. I progressi ottenuti verranno presentati durante le riunioni del Gruppo di

Lavoro Immunodeficienze AIEOP.

Per gli studi cellulari immunologici dei pazienti arruolati, l’invio dei seguenti campioni verrà

effettuato all’ HSR-TIGET, previo accordo:

• un prelievo eparinato sterile di 10 cc.

• un prelievo in EDTA di 1-2 cc

• un prelievo privo di anticoagulante per siero di 1-2 cc.

I campioni devono essere spediti refrigerati (in ghiaccio) immediatamente dopo l’esecuzione del

prelievo con servizio DHL (numero 103187420) a carico del destinatario che prevede (a richiesta)

la consegna entro le 10 del giorno successivo, al seguente indirizzo:

Dr.ssa Rosa Bacchetta

Istituto San Raffaele Telethon per la Terapia Genica

(HSR-TIGET)

Ospedale San Raffaele DIBIT, 2A2

Via Olgettina,58

20132 Milano

Telefono: ++39-02 2643 4669 (o -4703)

Fax: ++39-02 2643 4668

email: rosa.bacchetta@hsr.it

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5. STUDIO FAMILIARE E DEI PORTATORI

L'identificazione dello stato di portatore della malattia, indispensabile per un corretto consiglio

genetico, è indicato per le madri dei pazienti e per i soggetti collaterali di sesso femminile del ramo

materno del paziente.

Per la diagnosi molecolare dei portatori, i prelievi devono essere inviati presso lo stesso centro che

ha eseguito la diagnosi molecolare del paziente (previo accordo con il centro stesso).

I portatori possono successivamente essere inclusi negli studi cellulari immunologici, svolti presso

l’HSR-TIGET . I tempi per l’invio di tali prelievi deve essere concordato con la dr.ssa Bacchetta.

6. DIAGNOSI PRENATALE

La diagnosi prenatale di sindrome IPEX è possibile solo in quei casi in cui sia già stata identificata

la mutazione in un altro membro affetto della famiglia. Infatti, ogni tecnica di diagnosi prenatale

invasiva (prelievo di villi coriali o amniocentesi) comporta un rischio di interruzione della

gravidanza che, seppure basso, è giustificato solo da una chiara evidenza che la famiglia sia

effettivamente affetta da sindrome IPEX.

In ogni caso, prima di procedere alla diagnosi prenatale (e al termine della stessa), è indispensabile

che la coppia venga avviata alla consulenza genetica, nel corso della quale dovranno anche essere

illustrate in dettaglio le problematiche della malattia e le possibilità di cura attualmente disponibili.

Nel caso di famiglie con sindrome IPEX e mutazione nota, la diagnosi prenatale si effettua sul

prelievo di villo coriale (dalla 10a settimana di gestazione) o di liquido amniotico (alla 16a - 18a

settimana di gestazione).

Sul materiale ottenuto si procederà all’analisi del cariotipo fetale ed all’estrazione del DNA. In

caso di feto maschio, sarà effettuata ricerca della mutazione sul DNA già estratto.

In previsione della diagnosi prenatale va contattato il Centro coordinatore per definire i dettagli

tecnici di prelievo e di invio del materiale. Su richiesta del Centro afferente, l’analisi di mutazione

del gene FOXP3 per diagnosi prenatale sarà eseguita presso in seguente Centro, che garantirà

l’esito entro 1 settimana:

Dr.ssa L. Perroni , Ospedali Galliera- Laboratorio di Genetica Umana

ViaVolta, 8 , 16128 Genova

tel.: 010 5634376 (77) , email: lucia.perroni@galliera.it

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7. SUGGERIMENTI TERAPEUTICI

Considerato il limitato numero di casi descritti in letteratura, le terapie utilizzate non sono state

studiate su trial controllati, quindi, le raccomandazioni al trattamento dei pazienti IPEX si basano,

tutt’ora, su esperienze cliniche in singoli pazienti o piccoli gruppi. Inoltre, data la mancata

correlazione genotipo-fenotipo e l’eterogeneità del decorso clinico, la risposta alla terapia può

essere variabile da caso a caso. Pertanto, il procedimento terapeutico dovrà adeguarsi allo spettro di

manifestazioni cliniche presentato dal singolo paziente ed alla gravità delle stesse.

Nonostante tali premesse, possono essere formulate delle indicazioni generali di approccio al

bambino con sindrome IPEX. Gli approcci terapeutici ad oggi praticati sono rappresentati da:

terapia sostitutiva e di supporto, terapia immunosoppressiva e trapianto di cellule staminali

ematopoietiche.

A parità di fenotipo clinico l’outcome è fortemente influenzato dalla tempestività e

dall’aggressività della terapia nutrizionale ed immunosoppressiva. In particolare, la nutrizione

parenterale totale, insieme alla terapia corticosteroidea ed immunosoppressiva sono i cardini di un

approccio integrato finalizzato al controllo della malattia e al raggiungimento di condizioni elettive

per il trapianto. L’utilizzo di antibiotici, antimicotici e antivirali può trovare fondamento su base

clinica-microbiologica e nei casi più gravi, su base empirica. Una sindrome da consumo di risorse

(wasting syndrome) può influenzare acutamente l’outcome di questi pazienti: il trattamento deve

perciò coinvolgere clinici con esperienza sia nel campo gastroenterologico che immuno-

ematologico e infettivologico.

Terapia di supporto, sostitutiva e anti-infettiva

All’esordio, il paziente deve essere ospedalizzato in quanto necessita di un’assistenza

multidisciplinare mediante:

- terapia di supporto precoce e ad ampio spettro (reintegro di liquidi, nutrizione parenterale

totale, albumina ed emoderivati);

- terapia sostitutiva per i disordini endocrinologici (insulina e/o ormoni tiroidei);

- terapia dei disordini ematologici (se non controllabili con lo steroide, potranno richiedere

terapia con immunoglobuline endovena);

- la profilassi anti-infettiva deve essere valutata caso per caso, pensando sia a possibili sovra

infezioni della cute che a colonizzazioni intestinali, con eventuali sepsi legate anche

all’utilizzo del catetere venoso centrale (indispensabile sia per la nutrizione parenterale che

per la somministrazione di terapie farmacologiche). Ciò determina il preferenziale

27

coinvolgimento di Stafilococchi, Enterococchi, CMV, Candida. Tale precauzione può avere

notevole importanza, poiché un episodio infettivo in un paziente così debilitato potrebbe

essere difficilmente risolvibile e potrebbe peggiorare la sintomatologia di base.

Terapia immunosoppressiva

La terapia immunosoppressiva deve essere intrapresa quanto prima. Non vi è un farmaco o una

combinazione di farmaci che si sia dimostrata uniformemente efficace nei pazienti trattati.

Frequentemente è necessario l'utilizzo di una terapia immunosoppressiva multipla, tuttavia la

risposta alla terapia, anche multipla, rimane variabile (Gambineri E. et al. 2008; ).

Glucocorticoidi.

Terapia d’attacco: elevate dosi di glucocorticoidi (prednisone o metilprednisolone).

Razionale: ottenere un’azione rapida, limitare precocemente le manifestazioni e la progressione del

danno d’organo (Gambineri E. et al. 2008).

Se mancata o scarsa risposta al prednisone: betametasone (per via orale in dose equipotente) ha

dimostrato un’efficacia notevolmente maggiore (Taddio A. et al. 2007; Kobayashi I. et al. 2001).

Intensificazione terapeutica: steroide + secondo farmaco (generalmente un immunosoppressore).

Razionale: contribuire ad un miglior controllo della malattia per giungere in condizioni elettive al

trapianto e/o ridurre il dosaggio dello steroide somministrato.

Immunosoppressori.

I farmaci corticosteroidei sono stati più comunemente associati a ciclosporina e/o tacrolimus

(Baud O. et al. 2001; Wildin RS e al 2002; Mazzolari E. et al 2005; Taddio A. et al. 2007;

Gambineri E. et al. 2008). L’utilizzo di questa combinazione, può, inizialmente, attenuare le

manifestazioni, ma non consente di ottenere la remissione (Wildin R.S. et al. 2002; Gambineri E. et

al. 2008) né di prevenire la progressione di malattia (Bindl L. et al. 2005; Wildin R.S. et al. 2002).

Per tali farmaci, dai dati riportati in letteratura non è possibile stabilire il dosaggio ottimale da

utilizzare. In linea generale il dosaggio iniziale può essere aumentato, fino ad un sostanziale

miglioramento della sintomatologia clinica, in assenza di effetti collaterali. Nella Tabella 4 sono

riportati i dettagli dei regimi terapeutici descritti in letteratura e relativo risultato.

Svantaggi degli inibitori della calcineurina:

- efficacia solo parziale,

- elevata tossicità,

- azione soppressiva sulle cellule T effettrici, ma, contemporanea interferenza con

28

l’espressione di FOXP3 e la funzione delle cellule T regolatorie.

In alcuni casi, l’azatioprina è stata anche utilizzata in associazione allo steroide e/o al tacrolimus

con risultati di parziale controllo della patologia (Bindl L. et al. 2005)

Altri farmaci immunosoppressori, come rapamicina e micofenolato mofetile, agiscono

selettivamente sulle cellule T effettrici patogeniche e non interferiscono con la funzione delle

cellule T regolatorie (Battaglia M. et al., 2005; Allan S.E. et al., 2008). Recentemente, l’utilizzo di

rapamicina (da sola o in associazione ad azatioprina o steroide) ha dato risultati clinici promettenti

in quattro casi (Bindl L., 2005; Yong PL, 2008; Gambineri E. et al., 2008). Secondo quanto

riportato, la rapamicina, non è stata utilizzata come prima scelta, ma sostituita agli inibitori della

calcineurina perché non efficaci. Il dosaggio utilizzato (circa 0,15 mg/kg/die) deve essere adeguato

in modo da mantenere livelli sierici tra 8 e 12 µg/L. In 3 pazienti con sindrome IPEX le associazioni

rapamicina + steroide + metotrexate (in un caso) e rapamicina + steroide + azatioprina (negli altri

due), hanno consentito di ottenere la remissione clinica in tutti i casi (anche istologica nel primo

paziente) e di mantenerla nel tempo (follow-up a 5 anni, 1,5 anni e 6 mesi rispettivamente) (Bindl

L. et al. 2002). Il medesimo effetto positivo è stato ottenuto anche in due pazienti con rapamicina +

steroide (scalato progressivamente fino alla dose di 5 mg/die); il secondo ha ricevuto rapamicina in

monoterapia. Entrambi hanno dimostrato remissione clinica ad un follow-up di 21 e 15 mesi

rispettivamente (Yong P.L. et al. 2008).

In generale, è importante sottolineare che l’enteropatia, caratteristica di questi pazienti, può

determinare effetti negativi sull’assorbimento intestinale dei farmaci. Pertanto, indipendentemente

dal farmaco utilizzato, se somministrato per via orale, può essere necessario effettuarne

frequentemente il dosaggio nel siero, con lo scopo di mantenere livelli efficaci.

La Tabella 4 fornisce una sintesi dei dati presenti in letteratura in merito alle terapie

immunosoppressive adottate nei pazienti IPEX.

Trapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSCT)

Attualmente, l’unica cura definitiva per la sindrome IPEX è il trapianto allogenico di cellule

staminali emopoietiche. E’ importante che sia eseguito precocemente, quando ancora la patologia

d’organo non è avanzata, sottolineando come sia fondamentale giungere alla diagnosi quanto prima

possibile. La Tabella 5 fornisce una sintesi dei dati presenti in letteratura in merito alle esperienze

trapiantologiche nei pazienti IPEX.

Dati della letteratura e di survey internazionali dimostrano come HSCT, da donatori HLA-identici

familiari (prima scelta) o da donatori volontari da registro e da sangue di cordone ombelicale, sia

una cura efficace (Mazzolari E. et al. 2005; Lucas K.G. et al. 2007; Rao A. et al. 2007; Gambineri

29

E. et al. 2008; Zhan H. 2008; Seidel M. et al. 2009; Dorsey M.J. 2009). Pertanto, seppur le

informazioni derivino ancora da una casistica limitata, l’HSCT dovrebbeessere sempre consigliato

come la terapia elettiva. Per il condizionamento pretrapianto sono stati utilizzati sia regimi

mieloablativi che non-mieloablativi (Tabella 5) allo scopo di ridurre le complicanze associate al

trapianto. I regimi non-mieloablativi hanno permesso di

- ridurre le complicanze infettive legate al post-trapianto,

- ridurre la tossicità da chemioterapia ad alte dosi, considerando che tali pazienti hanno già un

rischio aumentato, legato al danno d’organo che può derivare anche dalla terapia

immunosoppressiva.

L’utilizzo di un condizionamento non mieloablativo può più facilmente risultare in un chimerismo

parziale, il cui outcome a lungo termine non è ancora valutabile. Ad oggi è stato dimostrato in due

pazienti che, l’attecchimento delle sole cellule T regolatorie del donatore è sufficiente per ottenere

la remissione della malattia (Seidel M.G. et al. 2009; Bacchetta R., IEWP 2008).

Pertanto futuri approcci di terapia cellulare o genica, mirati a ripristinare selettivamente il repertorio

delle cellule T regolatorie rappresentano una promettente possibilità.

In conclusione, IPEX, nella sua forma grave, può essere sospettata sulla base delle caratteristiche

cliniche e di laboratorio descritte e il tempestivo riconoscimento della malattia può portare ad

importanti benefici terapeutici. L’identificazione e lo studio di una più ampia casistica ci permetterà

di definire meglio i dati di laboratorio che risultano alterati sia alla diagnosi sia in fase più avanzata

di malattia, consentendo un migliore follow-up e una migliore comprensione dei fattori che

condizionano l'efficacia delle terapie e la prognosi.

30

Tabella 1 – Sintesi dei più comuni reperti di laboratorio riscontrabili nella sindrome IPEX.

Esami di laboratorio Reperti

Esame emocromocitometrico

con formula leucocitaria

eosinofilia

talvolta: neutropenia, anemia, trombocitopenia

Glicemia e anticorpi anti-insulina, GAD , ICA , IA2 diabete mellito di tipo 1

Funzionalità tiroidea e anticorpi anti-TPO e anti-TG tiroidite autoimmune

Anticorpi anti-enterociti possono essere positivi

IgE elevate

IgA, IgG, IgM. IgA elevate o normali, IgG e IgM nella norma

Fenotipo e test funzionali cellule B e T normali (possibile alterazione della produzione di citochine)

Fenotipo e test di soppressione cellule Treg difetti quantitativi e/o qualitativi

Endoscopia con biopsia intestinale vd. Tabella 2

Biopsia cutanea infiltrati linfocitari

Esame diagnostico Reperti

Sequenziamento genico di FOXP3 mutazione del gene FOXP3

GAD = glutammic acid decarboxilase ; ICA = islet cells antibodies ; IA2 = protein tyrosine phosphatase ; TPO = tireoperossidasi ; TG = tireoglobulina.

31

Tabella 2 – Possibili reperti istologici in biopsie del tratto digerente. (Patey-Mariaud de Serre N. et al., 2009)

Quadro istologico GVHD – like (9/12) Coeliac disease – like (2/12) Enteropatia con anticorpi

anti-cellule mucipares (1/12)

Duodeno

- Totale atrofia dei villi con infiltrato infiammatorio (da moderato a marcato) nella lamina propria ( L, Pl, N, Eo) - Cellule epiteliali apoptotiche (proporzionale ad attività infiammatoria), indistinguibili da quelle della GVHD - Ipoplasia delle cripte con infiltrato infiammatorio (L, N, Eo) e ascessi criptici (sempre presenti) - N° linfociti intraepiteliali: normale (in 3/9 pz), poco aumentato con 30-60 L su 100 cell epiteliali (in 6/9 pz)

- Totale o subtotale atrofia dei villi con infiltrato infiammatorio nella lamina propria (L, Pl, N, Eo) - Iperplasia delle cripte

- N° linfociti intraepiteliali: molto aumentato con 80 L su 100 cell epiteliali

- Subtotale atrofia dei villi con moderato infiltrato infiammatorio nella lamina propria ( L , Pl) - Deplezione totale di cellule mucipare - N° linfociti intraepiteliali: aumentato con 55 L su 100 cell epiteliali

Stomaco - Gastrite moderata (2/9 pz) o severa (4/9 pz) - Necrosi proporzionale al grado di infiammazione

Gastrite moderata con assenza di cellule mucipare

Colon

- Colite (7/9 pz) con lesioni acute e croniche, con infiltrato infiammatorio di L, Pl, N, Eo - Apoptosi, necrosi e distruzione ghiandolare totale o parziale (nelle coliti più severe)

Moderata infiammazione con infiltrato polimorfo nella lamina propria

- Ulcerazioni con infiltrato infiammatorio (Eo++, L+, Pl+) - Marcata riduzione cellule mucipare

L = linfociti; Pl = plasmacellule; N = neutrofili; Eo = eosinofili; pz = pazienti.

32

Tabella 3 – Caratteristiche più rilevanti per la diagnosi differenziale. (Bacchetta R. et al., 2010, in corso di stampa)

IPEX IPEX-LIKE APECED OMENN’S WAS HIES

Esordio neonatale / 1 anno

1 anno /

prima infanzia

prima infanzia neonatale / 1 anno 1 anno /

prima infanzia

neonatale / 1 anno

Enteropatia sempre presente frequente rara frequente possibile rara

Endocrinopatia

DMT1 frequente

possibile tiroidite

DMT1 frequente

possibile tiroidite

frequenti ipoparatiroidismo

e/o insuff. surrenalica,

possibili

DMT1 e/o tiroidite

assente assente assente

Lesioni cutanee eczema frequente

eczema frequente

possibile candidiasi eritrodermia eczema

frequente sempre eczema

Infezioni rare / secondarie

rare / secondarie rara gravi frequenti

cutanee e polmonari da S. aureo

Anemia possibile possibile rara frequente possibile assente

Trombocitopenia possibile possibile rara possibile sempre presente assente

Neutropenia possibile possibile possibile rara rara rara

Numero di linfociti

normale / aumentato

normale / aumentato normale

cell. T normali/ridotte

cell. B ridotte/assenti

normale / ridotto

normale / aumentato

IgG, IgA, IgM normale normale normali Basse

IgG normali/elevate

IgA e IgM basse

normali / basse

IgE elevate elevate normali elevate elevate elevate

Eosinofili elevati elevati normali elevati elevati elevati

Autoanticorpi comuni comuni sempre presenti assenti possibili assenti

Ereditarietà X-linked autosomica recessiva / sconosciuta

autosomica recessiva autosomica recessiva X-linked

autosomica dominante / sconosciuta

GENI FOXP3 IL-2RA / sconosciuto AIRE

RAG1/2 (90%) DCLREIC / ligaseIV RMRP/IL7RA/ADA

WASP STAT-3 / Tyk-2 /

sconosciuta

33

Tabella 4 – Regimi terapeutici descritti in letteratura e relativo risultato.

Autori N° pz Terapia Risultato

Baud O. et al. 2001 1 1°) MPD 250 mg/m2/die

2°) MPD 2 mg/kg/die + MPD 25 mg/kg/sett + FK506 0,3/kg/die Remissione transitoria

Mazzolari E. et al. 2005 1 1°) MPD 10 mg/kg/die per 2 gg

2°) MPD 2 mg/kg/die + CSA 5 mg/kg/die

Remissione (con ricomparsa dei sintomi dopo 2 mesi, alla riduzione dello steroide)

Taddio A. et al. 2007

1 1°) Betametasone 0.1 mg/kg/die 2°) Betametasone 0,05-0,025 mg/die + FK506 0,1 mg/kg x2vv/die

Riduzione della sintomatologia (assenza enteropatia, presenza eczema e alopecia), non remissione completa.

Yong P.L. et al. 2008 2

Caso 1: Rapamicina (livelli sierici tra 8 e 10 ng/mL) + 6-MP + PD 5 mg/die Caso 2: Rapamicina (livelli sierici tra 8 e 10 ng/mL) monoterapia

Riduzione della sintomatologia

Bindl L. et al. 2005 3

Caso 1: PD 2 mg/kg/die (gradualmente ridotto in 12 mesi e poi sospeso) + MTX 15 mg/m2/sett + Rapamicina 0,15 mg/kg/die (livelli sierici tra 8 e 15 ng/mL) Caso 2 e 3: 1) Steroide (gradualmente ridottio in 4 mesi e poi sospeso) + AZA + FK506 (livelli sierici tra 6 e 10 ng/mL) 2) AZA + Rapamicina 0,15 mg/kg/die (livelli sierici tra 8 e 12 µg/L)

Remissione clinica (casi 1,2,3,) e istologica (casi 2,3)

MPD = metilprednisolone, FK506 = tacrolimus, CSA = ciclosporina A, 6-MP = 6-mercaptopurina, PD = prednisone, MTX = metotrexate, AZA = azatioprina.

34

Tabella 5 – Esperienze trapiantologiche nei pazienti IPEX.

Baud O., 2001 Wildin R.S., 2002 Mazzolari E., 2005 Lucas K.G., 2007

Età esordio 1 m 3 m 2 m 4 m 1° anno

Età trapianto 4 m 13 a 10 a 1a 6 a

Mutazione FOXP3

esone 10 (F371C)

+1040 G>A (R347H)

748delAAG (∆K250)

promotore (ATG -6600bp) non identificata

IS pre-trapianto PD, MPD, FK506 PD, CSA, FK506

Steroidi, CSA, FK506, MTX, rituximab

MPD, CSA,

Tipo di condizionamento Mieloablativo Non mieloablativo Mieloablativo Non mieloablativo

Condizionamento

ATG 10mg/kg/die (da -14 a-10) Bu 5mg/kg/die (da -9 a -6) Cx 50mg/kg/die (da -5 a -2)

Cx TBI ATG

Flu 30mg/m2/die (da -13 a -10) Bu 5mg/kg/die (da-9 a -6) Cx 50mg/kg/die (da-5 a -2) ATG 2,5mg/kg/die (da -5 a -4)

Flu 30mg/m2/die (x 6gg) Bu 0,8mg/kg/die (ogni 6h x 2gg) ATG 3mg/kg/die (x 4gg)

Fonte CD34+ MO MO MO MO Cordone ombelicale

Donatore MSD MSD MUD MSD MUD 5/6 identico

Dose CD34+ 217 x106/kg Nd Nd 7,85 x106/kg 3 x105/kg

Attecchimento + 19 g + 10 g Nd + 18 g +14 g mieloide + 56 g completo

Chimerismo 95% T30%; B3%; PMN15%

100% (+10) 50% (+90)

100% 70% (+90) T 70%;B30%;PMN50% 98%

Remissione Si Si Si (parziale) Si Si

GVHD No No No Cutanea e intestinale (II°) Intestinale

Durata follow-up - - - 16 m 15 m

Decesso -causa- 3 a (+29 m) -emofagocitosi-

14 a (+194 g) -infezione-

10 a (+94 g) -infezione- - -

m = mesi ; a = anni , IS = immunosoppressori ; GVHD = graft-versus-host disease ; PD = prednisone ; MPD = metilprednisolone ; FK506 = tacrolimus; ATG = siero anti-linfocitario ; Bu = busulfano ; Cx = ciclofosfamide ; Flu = fludarabina ; MTX = metotrexate ; MO = midollo osseo; MUD = matched unrelated donor ; MSD = matched sibling donor ; g = giorno.

35

(Tabella 5 - continua)

Rao A., 2007 Zhan H., 2008 Seidel M.G., 2009 Dorsey M.J., 2009

Età esordio 4 m Neonatale Neonatale

Età trapianto 7 a 1 a 6 m 4 a 6 m 5 m 11 m 7 m

Mutazione FOXP3 introne 9 sito di splicing A>G

303-304 del TT

1271 G>A (C424Y)

1226 A>G (D409G)

esone 10 (T380I) Nd polyA

AATAAA>AATAAG

IS pre-trapianto imuran, CSA, PD

CSA, rituximab

FK506, MMF, PD

FK506, rituximab, PD,alemtuzumab

PD, FK506 Nd Rapamicina, MTX, PD

Tipo di condizionamanto Non mieloablativo Non

mieloablativo Non mieloablativo Non mieloablativo

Condizionamento

Alemtuzumab 48 o 33 mg/die (da -21 a -19) Flu 150mg/m2 (da -8 a -4) Melphalan 140 o 70 mg/m2/die (-3)

Alemtuzumab 0,6 mg/kg Flu 150 mg/m2

Cx 1200 mg/m2

Alemtuzumab 5 x 0,2 mg/kg Flu 6 x 30 mg/m2 Melphalan 140 mg/m2

Alemtuzumab 30 mg/die (da -21 a -19) Flu 1 mg/kg/die (da -8 a -4) Melphalan 4,7 mg/kg/die (-3)

Fonte CD34+ MO MO MO MO Sangue periferico

Sangue periferico MO

Donatore MUD 8/8 identico

MUD 7/8 identico

MUD 8/8 identico

MUD 8/8 identico

MUD MUD 10/10 identico

MUD 10/10 identico

Dose CD34+ 34,7 x106/kg

5,8 x106/kg

5,04 x106/kg

12,7 x106/kg 2,7 x107/kg 2 x107/kg 4,72 x106/kg

Attecchimento + 12 g + 16 g + 13 g + 12 g + 18 m + 12 g + 15 g mieloide + 28 g completo

Chimerismo 100% 100% 89% 84,6% 100% Dopo 1 anno 10% T,B,NK,PMN 90% Treg

100%

Remissione Si Si Si Si Si Si Si

GVHD

Cutanea estesa e intestinale (II°)

No No No Cutanea e intestinale (II°-III°)

Cutanea (II°) Cutanea

Durata follow-up 25 m 19 m 11 m 6 m 3 a 6 a 4 m

Decesso - - - - - - -

IS = immunosoppressori ; GVHD = graft-versus-host disease ; PD = prednisone ; MPD = metilprednisolone ; FK506 = tacrolimus ; ATG = siero anti-linfocitario ; Bu = busulfano ; Cx = ciclofosfamide ; Flu = fludarabina ; MTX = metotrexate ; MO = midollo osseo; MUD = matched unrelated donor ; MSD = matched sibling donor ; m = mesi ; g = giorno.

36

8. BIBLIOGRAFIA ESSENZIALE

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