immunopathological findings in conjunctival cells using IF staining

8/7/2019 immunopathological findings in conjunctival cells using IF staining

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B r i t i s h J o u r n a l o f O p h t h a l m o l o g y 1 9 9 2 ; 7 6 : 5 4 5 - 5 4 9

I m m u n o p a t h o l o g i c a l f i n d i n g s i n c o n j u n c t i v a l c e l l su s i n g i m m u n o f l u o r e s c e n c e s t a i n i n g o f impressionc y t o l o g y s p e c i m e n sC h r i s t o p h e B a u d o u i n , N a s s e r H a o u a t , F r a n c o i s e B r i g n o l e , J a c q u e s B a y l e , P i e r r e G a s t a u d

A b s t r a c tT h e c o n v e n t i o n a l t e c h n i q u e o f i m p r e s s i o nc y t o l o g y p r o v i d e s a n o n - i n v a s i v e m e t h o d f o rt h e e v a l u a t i o n o f c o n j u n c t i v a l e p i t h e l i u ma l t e r a t i o n s . U s i n g i n d i r e c t i m m u n o f l u o r -e s c e n c e p r o c e d u r e s t w o i n f l a m m a t o r ym a r k e r s , c l a s s I MHC a n t i g e n s HLA DR a n dt h e r e c e p t o r t o I g E ( C D 2 3 ) , w e r e s o u g h t i ni m p r e s s i o n c y t o l o g y s p e c i m e n s o b t a i n e d f r o m8 0 p a t i e n t s . I n n o r m a l s u b j e c t s c o n j u n c t i v a le p i t h e l i a l c e l l s d i d n o t s h o w a n y r e a c t i v i t y .O n l y s c a t t e r e d d e n d r i t i c c e l l s w e r e f o u n d t oe x p r e s s c l a s s U a n t i g e n s b u t n o t t h e r e c e p t o r t oI g E . I n c o n t r a s t p a t i e n t s w it h c h r o n i c c o n -j u n c t i v i t i s o f v a r i o u s a e t i o l o g i e s , m a i n l yi n f e c t i o u s o r a l l e r g i c , h a d 4 0 - 1 0 0 % o f b r i g h t l yp o s i t i v e c o n j u n c t i v a l c e l l s f o r o n e o r b o t ha n t i g e n s . I n t h e s e c a s e s e p i t h e l i a l c e l l s a n dg o b l e t c e l l s r e a c t e d s i m i l a r l y . T w e n t y f o u re y e s i n 1 2 p a t i e n t s w i t h i d i o p a t h i c d r y e y es y n d r o m e d i s c l o s e d r e s u l t s s i m i l a r t o t h o s ef r o m n o r m a l c o n j u n c t i v a l s p e c i m e n s . How-e v e r 1 8 o t h e r s p e c i m e n s f r o m p a t i e n t s s u f f e r i n gf r o m i d i o p a t h i c t e a r d e f i c i e n c y b u t u n d e r g o i n gm u l t i p l e s u b s t i t u t i v e t r e a t m e n t s f o r d r y e y eh a d m o d e r a t e t o s t r o n g p o s i t i v i t y f o r HLADRa n d / o r t h e r e c e p t o r t o I g E ( 2 0 - 1 0 0 % o f c e l l s ) .A s t h e s e r e s u l t s w e r e i n d e p e n d e n t o f t h ed e g r e e o f s q u a m o u s m e t a p l a s i a t h e e x p r e s s i o no f t h e s e m e m b r a n e m a r k e r s ma y r e f l e c t l o c a li n f l a m m a t i o n i n a d d i t i o n t o t e a r d e f i c i e n c y ,p o s s i b l y d u e t o s e n s i t i s a t i o n t o t h e e y e d r o p su s e d . T h e s e i m m u n o c y t o l o g i c a l t e c h n i q u e st h u s p r o v i d e u s e f u l m e t h o d s o f i n v e s t i g a t i n gc o n j u n c t i v a l i n f l a m m a t i o n a n d a l l e r g y . T h e yma y c o n s t i t u t e v a l u a b l e a i d i n t h e d i a g n o s i sa n d a p p r o p r i a t e t r e a t m e n t o f o c u l a r s u r f a c ed i s o r d e r s .( B r J 7 O p h t h a l m o l 1 9 9 2 ; 7 6 : 5 4 5 - 5 4 9 )

D e p a r t m e n t o fO p h t h a l m o l o g y , S a i n t -Roch H o s p i t a l , N i c e ,F r a n c eC B a u d o u i nN H a o u a tP G a s t a u dL a b o r a t o r y o fH e m a t o l o g y , C i m i e zH o s p i t a l , N i c e , F r a n c eF B r i g n o l eJ B a y l eC o r r e s p o n d e n c e t o :Dr C h r i s t o p h e B a u d o u i n ,S a i n t - R o c h H o s p i t a l ,D e p a r t m e n t o fO p h t h a l m o l o g y , BP 3 1 9 ,0 6 0 0 6 , N i c e C e d e x 1 , F r a n c e .A c c e p t e d f o r p u b l i c a t i o n1 0 F e b r u a r y 1 9 9 2

I m p r e s s i o n c y t o l o g y i s a q u i c k a n d easy m e t h o do f o b t a i n i n g r e p e a t e d a n d w i d e c o l l e c t i o n s o fs u p e r f i c i a l c e l l s f r o m t h e b u l b a r c o n j u n c t i v a . 1 - " I ta l l o w s q u a n t i t a t i v e a s s e s s m e n t o f t h e n u m b e r o fg o b l e t c e l l s i n c o n j u n c t i v a a n d a q u a l i t a t i v e s t u d yo f e p i t h e l i a l d a m a g e i n v a r i o u s c o n j u n c t i v a ld i s e a s e s . T h i s m e t h o d h a s b e e n m o s t l y u s e d i nd r y ey e s y n d r o m e , a common p a t h o l o g i c a l s t a t ei n w h i c h t h e n o n - k e r a t i n i s e d s t r a t i f i e d c o n j u n c -t i v a l e p i t h e l i u m p r o g r e s s i v e l y l o s e s g o b l e t c e l l sa n d d i f f e r e n t i a t e s i n t o a n o n - s e c r e t o r yk e r a t i n i s e d e p i t h e l i u m . 2A l t h o u g h i m p r e s s i o n c y t o l o g y p r o v i d e sv a l u a b l e i n f o r m a t i o n c o n c e r n i n g d r y n e s s - r e l a t e dc o n j u n c t i v a l d i s e a s e , i n most cases t h i s m e t h o dcannot p o i n t t o t h e e v e n t u a l i n v o l v e m e n t o fi n f l a m m a t o r y p h e n o m e n a , i s o l a t e d or a s s o c i a t e d

w i t h t e a r d e f i c i e n c y . T h e e v e n t u a l f u n c t i o n a lc h a n g e s o c c u r r i n g i n c o n j u n c t i v a l e p i t h e l i u m ,e s p e c i a l l y w h e n c e l l m o r p h o l o g y i s n o t i m p a i r e d ,c a n o n l y b e a s s e s s e d b y i m m u n o c y t o l o g i c a lp r o c e d u r e s u s i n g m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s t oi n v e s t i g a t e t h e e x p r e s s i o n o f v a r i o u s c e l l s u r f a c em a r k e r s . U n t i l now s u c h p r o c e d u r e s c o u l d n o tb e r o u t i n e l y p e r f o r m e d i n s t a n d a r d i m p r e s s i o nc y t o l o g y s p e c i m e n s , b e c a u s e c e l l c o l l e c t i o n i su s u a l l y m a d e o n o p a q u e c e l l u l o s e m e m b r a n e sw h i c h m u s t b e c h e m i c a l l y c l e a r e d b e f o r e c y t o -l o g i c a l e x a m i n a t i o n . R o u t i n e c y t o l o g i c a l s t a i n i n gc a n b e p e r f o r m e d i n s u c h a w a y b u t n o t i m m u n o -c y t o c h e m i s t r y , w h i c h i n v o l v e s w e a k a n t i g e n -a n t i b o d y c o m p l e x f o r m a t i o n . F o l l o w i n gp r e l i m i n a r y r e p o r t s 4 ' we r o u t i n e l y d e v e l o p e dn e w i m p r e s s i o n c y t o l o g y p r o c e d u r e s w h i c hp r o v i d e d v a l u a b l e s p e c i m e n s f o r i m m u n o c y t o -c h e m i s t r y , p e r m i t t i n g e x a m i n a t i o n o f c e l ls u r f a c e c h a n g e s i n c o n j u n c t i v a l d i s e a s e s .A s s h o w n i n p r e v i o u s i m m u n o c y t o l o g i c a ls t u d i e s , 6 c l a s s I I h i s t o c o m p a t i b i l i t y a n t i g e n s c a nb e a b n o r m a l l y e x p r e s s e d b y a v a r i e t y o f o c u l a rc e l l s i n d i f f e r e n t p a t h o l o g i c a l c i r c u m s t a n c e s .F u r t h e r m o r e , a s I g E a r e k n o w n t o b e d i r e c t l yi n v o l v e d i n a l l e r g i c p h e n o m e n a a n d a t o p i c k e r a t o -c o n j u n c t i v i t i s , 7 a n i m m u n o c y t o l o g i c a l s t u d yw a s d o n e u s i n g i m p r e s s i o n c y t o l o g y s p e c i m e n so f t h e c o n j u n c t i v a t o i n v e s t i g a t e t h e e x p r e s s i o n o ft h e s e t w o i n f l a m m a t o r y m a r k e r s i n n o r m a l a n dd i s e a s e d c o n j u n c t i v a .M a t e r i a l a n d m e t h o d sA f t e r o b t a i n i n g i n f o r m e d c o n s e n t o c u l a re x a m i n a t i o n s w e r e p e r f o r m e d o n 8 0 p a t i e n t s( 1 6 0 e y e s ) , a g e d 2 0 t o 8 5 y e a r s . T h e r e w e r e 1 7r a n d o m l y s e l e c t e d n o r m a l p a t i e n t s , 2 4 w i t h d r ye y e s y n d r o m e , a n d 3 9 w i t h c o n j u n c t i v i t i s ( o fwhom s e v e n w e r e a f f e c t e d i n o n l y o n e e y e ) .D i a g n o s i s o f d r y e y e w a s m a d e o n t h e b a s i s o fs u b j e c t i v e s y m p t o m s , t h e r e s u l t s o f S c h i r m e rt e s t ( l e s s t h a n 5 mm f o r 5 m i n u t e s ) , a n d t e a rb r e a k u p t i m e ( l e s s t h a n 1 0 s e c o n d s ) . S u b j e c t i v es y m p t o m s r a n g e d f r o m m i l d t o s e v e r e l y d i s a b l i n gf o r e i g n b o d y s e n s a t i o n o r b u r n i n g . O f t h e s e 2 4p a t i e n t s o n l y t w o h a d t h e d i a g n o s i s o f S j o g r e n ' ss y n d r o m e , o n t h e b a s i s o f a s s o c i a t i o n w i t h d r ym o u t h a n d s e r u m a u t o a n t i b o d i e s ( r h e u m a t o i df a c t o r o r a n t i n u c l e a r a n t i b o d i e s ) , a s d e s c r i b e d b yP f l u g f e l d e r e t a l . 8 A n o t h e r h a d S t e v e n s - J o h n s o ns y n d r o m e , r e s p o n s i b l e f o r s e v e r e o c u l a r d r y n e s s .A l t h o u g h s e r u m a n t i b o d i e s w e r e n o t o b t a i n e d i ne v e r y p a t i e n t w i t h t e a r d e f i c i e n c y , t h e o t h e rp a t i e n t s w i t h d r y e y e s h a d n o c l i n i c a l o r b i o -l o g i c a l s i g n e v o c a t i v e o f s y s t e m i c d i s e a s e o r l o c a li n f l a m m a t o r y i m p a i r m e n t .I n t h e o t h e r 3 9 c a s e s c o n j u n c t i v a l s p e c i m e n s

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B a u d o u i n , H a o u a t , B r i g n o l e , B a y l e , G a s t a u dw e r e o b t a i n e d f r o m p a t i e n t s w i t h u n i - o r b i l a t e r a lc h r o n i c c o n j u n c t i v i t i s p r e s e n t f o r m o r e t h a n 2w e e k s b e f o r e e x a m i n a t i o n . A l t h o u g h i n s o m ep a t i e n t s t h e o r i g i n o f c o n j u n c t i v i t i s w a s k n o w no c u l a r a l l e r g y , b a c t e r i a l o r v i r a l i n f e c t i o n , t o p i c a lm e d i c a t i o n , o r c o n t a c t l e n s e s , i n a b o u t 5 0 % n oa c c u r a t e d i a g n o s i s c o u l d b e m a d e .I m p r e s s i o n c y t o l o g y w a s p e r f o r m e d u s i n g t w od i f f e r e n t t e c h n i q u e s . T h e f i r s t o n e w a s d o n e i n1 0 n o r m a l p a t i e n t s a n d f i v e w i t h t e a r d e f i c i e n c y ,f o l l o w i n g t h e p r e v i o u s l y d e s c r i b e d m e t h o d o fI w a t a a n d B u r r i s . 4 F o r t h i s p r o c e d u r e , M i l l i -c e l - C M t r a n s p a r e n t B i o p o r e m e m b r a n e s( P I C M 0 3 0 5 0 , M i l l i p o r e , B e d f o r d , MA) w e r e c u ti n t o a b o u t 1 c m 2 p i e c e s a n d p r e s s e d o n t h es u p e r i o r a n d t e m p o r a l b u l b a r c o n j u n c t i v a , i n a na r e a l o c a t e d a t 2 - 8 mm f r o m t h e l i m b u s . T h em e m b r a n e s w e r e a p p l i e d o n t h e c o n j u n c t i v aa f t e r t o p i c a l a n a e s t h e s i a a n d h e l d t h e r e f o r a f e ws e c o n d s . C y t o l o g i c a l a n d i m m u n o c y t o c h e m i c a lp r o c e d u r e s w e r e t h e n p e r f o r m e d d i r e c t l y o n t h em e m b r a n e s , t h e i r t r a n s p a r e n c y a l l o w i n g m i c r o -s c o p i c e x a m i n a t i o n . H o w e v e r , a s B i o p o r em e m b r a n e s a p p e a r e d t o b e d i f f i c u l t t o u s er o u t i n e l y b e c a u s e o f t h e i r t h i n n e s s a n d t e n d e n c yt o r o l l u p d u r i n g m a n i p u l a t i o n s , we i n v e s t i g a t e da m o d i f i e d i m p r e s s i o n c y t o l o g y t e c h n i q u e w i t h0 - 2 0 i i m c e l l u l o s e a c e t a t e f i l t e r s ( G e l m a n ,A p o t e c h n i a ) , a s u s e d i n s t a n d a r d i m p r e s s i o nc y t o l o g y c o l l e c t i o n , ' 2 c u t i n t o a p p r o x i m a t e l y4 x 8 mm s h e e t s a n d p l a c e d o n t h e b u l b a rc o n j u n c t i v a . I n t h e m o d i f i e d p r o c e d u r e , f i l t e r sw i t h t h e d e t a c h e d e p i t h e l i a l c e l l s w e r e f i r m l ya p p l i e d o n g e l a t i n c o a t e d s l i d e s , a n d i m m e d i a t e l yr e m o v e d , p e r m i t t i n g d i r e c t c y t o l o g i c a l a n di m m u n o c y t o l o g i c a l e x a m i n a t i o n o n t h e s l i d e s .F o r t h i s t e c h n i q u e , i t w a s f o u n d t h a t t h e b e s tc e l l u l a r c o l l e Q t i o n o n g l a s s s l i d e s c o u l d b eo b t a i n e d w h e n c e l l u l o s e a c e t a t e m e m b r a n e s w e r es l i g h t l y w e t . A s t h i s t e c h n i q u e a p p e a r e d t o b em o r e c o n v e n i e n t t h a n t h e B i o p o r e p r o c e d u r e a n dp r o v i d e d g o o d c y t o l o g i c a l r e s u l t s , i t w a s a d o p t e df o r a l l t h e o t h e r p a t i e n t s o f t h i s s t u d y . W i t h b o t hp r o c e d u r e s , t h r e e s p e c i m e n s w e r e c o l l e c t e d i ne a c h e y e ( s i x f o r e a c h p a t i e n t ) , i n t h r e e c l o s e l yl o c a t e d b u t d i f f e r e n t a r e a s o f t h e s u p e r i o r a n dt e m p o r a l b u l b a r c o n j u n c t i v a .

C y t o l o g i c a l s t a i n i n g w a s d o n e u s i n g 5% c r e s y lv i o l e t i n 0 ' 9 % N a C l f o r 3 0 m i n u t e s b e f o r e r i n s i n gw i t h t a p w a t e r a n d m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n . B yt h i s m e t h o d n u c l e i w e r e s t a i n e d i n v i o l e t p u r p l ea n d m u c i n s i n p i n k . I n d i r e c t i m m u n o -f l u o r e s c e n c e p r o c e d u r e s w e r e p e r f o r m e d o n t h eo t h e r t w o s p e c i m e n s , a c c o r d i n g t o p r e v i o u s l yd e s c r i b e d m e t h o d s , 6 u s i n g t w o m o n o c l o n a l a n t i -b o d i e s d i r e c t e d a g a i n s t t h e m o n o m o r p h i c r e g i o no f c l a s s I I h i s t o c o m p a t i b i l i t y a n t i g e n s HLA DR( O K D R , O r t h o D i a g n o s t i c S y s t e m ) a n d am e m b r a n e r e c e p t o r f o r I g E , CD23 ( B 6 , C o u l t e rC l o n e ) .P r i m a r y m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s , i n a 1 : 5 0d i l u t i o n , w e r e i n c u b a t e d f o r 1 h o u r , e i t h e rd i r e c t l y o n B i o p o r e m e m b r a n e s o r o n t o g l a s ss l i d e s w i t h c o n j u n c t i v a l c e l l s . A f t e r w a s h i n gt h e m i n p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e ( P B S ) ,s p e c i m e n s w e r e i n c u b a t e d f o r 3 0 m i n u t e sw i t h t h e s e c o n d a r y a n t i b o d y , f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e - l a b e l l e d a n t i - m o u s e i m m u n o -g l o b u l i n a n t i s e r u m ( D a k o p a t t s ) . T h e y w e r ew a s h e d a g a i n i n P B S , c o u n t e r s t a i n e d w i t h

p r o p i d i u m i o d i d e a n d m o u n t e d i n m o u n t i n gm e d i u m ( A F 1 m o u n t i n g m e d i u m , C i t i f l u o rL t d ) b e f o r e e x a m i n a t i o n . F o r m i c r o s c o p ee x a m i n a t i o n , B i o p o r e m e m b r a n e s w e r e p l a c e do n g l a s s s l i d e s a n d s i m i l a r l y m o u n t e d i n g l y c e r o lc o n t a i n i n g m e d i u m . N u c l e u s c o u n t e r s t a i n u s i n gp r o p i d i u m i o d i d e w a s a d o p t e d t o m o r e e a s i l yv i s u a l i s e n e g a t i v e c e l l s a n d p e r m i t a r a p i d a n da c c u r a t e e v a l u a t i o n o f t h e p e r c e n t a g e o f p o s i t i v ec e l l s . P e r c e n t a g e s o f r e a c t i v e c e l l s w e r e d e t e r -m i n e d b y c o u n t i n g a t l e a s t 2 0 0 c e l l s i n e a c hs p e c i m e n . D a m a g e d c e l l s w e r e n o t c o n s i d e r e d .R e s u l t sC y t o l o g i c a l a n d i m m u n o f l u o r e s c e n c e s t a i n i n gu s i n g B i o p o r e m e m b r a n e s o r c e l l u l o s e a c e t a t ef i l t e r s s h o w e d s i m i l a r r e s u l t s . S l i g h t l y m o r eh o m o g e n e o u s a n d c o n t i n u o u s s h e e t s o f c o n j u n c -t i v a l c e l l s w e r e o b t a i n e d w i t h B i o p o r em e m b r a n e s , w h e r e a s a c e t a t e c e l l u l o s e f i l t e r sr e s u l t e d i n l a r g e b u t m o r e o f t e n d i s c o n t i n u o u sa n d i n t e r s p a c e d i s l e t s o f c e l l s , w i t h m o r en u m e r o u s s c a t t e r e d c e l l s . B o t h t y p e s o f mem-b r a n e s s h o w e d g a p s f r e e o f c e l l s b e t w e e n s p o t s o fv a r i a b l e s i z e s . A p p l i c a t i o n o f m e m b r a n e t og e l a t i n c o a t e d s l i d e s d i d n o t r e s u l t i n s i g n i f i c a n tc e l l l o s s , e s p e c i a l l y w h e r e g o b l e t c e l l d e n s i t y w a sc o n c e r n e d , a s a s s e s s e d b y t h e c r e s y l v i o l e ts t a i n i n g p r o c e d u r e . N u m e r o u s f o l d s , h o w e v e r ,w e r e u s u a l l y s e e n w h e n u s i n g t h e v e r y t h i nB i o p o r e m e m b r a n e s , o f t e n a c c o u n t i n g f o r a p o o rq u a l i t y o f s a m p l e c o l l e c t i o n a n d c y t o l o g i c a le x a m i n a t i o n . I m m u n o c y t o l o g i c a l p a t t e r n s w e r ei d e n t i c a l w i t h b o t h t e c h n i q u e s .STANDARD CYTOLOGICAL STAININGA s e x p e c t e d , c y t o l o g i c a l s t a i n i n g o f c o n j u n c t i v a ls p e c i m e n s f r o m n o r m a l p a t i e n t s d i d n o t s h o wa n y m o r p h o l o g i c a l a n o m a l y ( F i g 1 ) . I n c o n t r a s t ,s p e c i m e n s f r o m p a t i e n t s w i t h d r y e y e s y n d r o m es h o w e d v a r i o u s d e g r e e s o f m o r p h o l o g i c a l c h a n g e sk n o w n a s s q u a m o u s m e t a p l a s i a , ' i n c l u d i n g ad e c r e a s e i n g o b l e t c e l l d e n s i t y ( f o u n d i n a l ls p e c i m e n s ) a n d m o r e o c c a s i o n a l l y , a t o t a l l o s s o fg o b l e t c e l l s , a f l a t t e n i n g o f c y t o p l a s m , p y k n o t i cc h a n g e o f n u c l e u s , a n d e v e n c o m p l e t ek e r a t i n i s a t i o n o f c o n j u n c t i v a l e p i t h e l i u m . I ns p e c i m e n s f r o m p a t i e n t s w i t h c h r o n i c c o n -j u n c t i v i t i s , m o r e h e t e r o g e n e o u s r e s u l t s w e r eo b s e r v e d , f r o m n o r m a l f e a t u r e s t o e p i t h e l i a la l t e r a t i o n s c l o s e t o t h o s e d e s c r i b e d a b o v e , s u c h

F i g u r e 1 Tw o g o b k e t c e l l s i n a n i m p r e s s i o n c y t o l o g ys p e c i m e n f r o m n o r m a l c o n j u n c t i v a ( c r e s y l v i o l e t , x 3 3 0 ) .

5 4 6



3/5

I m m u n o p a t h o l o g i c a l f i n d i n g s i n c o n j u n c t i v a l c e l l s

F i g u r e 4 S i m i l a r g r e e n s t a i n e d r e a c t i v i t y o f c o n j u n c t i v a lc e l l s w i t h a n t i - C D 2 3 m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s i n a p a t i e n t w i t hb i l a t e r a l c h r o n i c c o n j u n c t i v i t i s ( i n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e ,p r o p i d i u m i o d i d e c o u n t e r s t a i n , x 2 2 0 ) .

F i g u r e 2 N e g a t i v ei m m u n o f l u o r e s c e n c e s t a i n i n go f a n i m p r e s s i o n c y t o l o g ys p e c i m e n f r o m a n o r m a lc o n j u n c t i v a w i t h a n t i - H L ADR m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s .N u c l e i are c o u n t e r s t a i n e dw i t h p r o p i d i u m i o d i d e a n da p p e a r i n r e d . C e l lm e m b r a n e s d o n o t e x p r e s sHLADR a n t i g e n s a n dc a n n o t b e s e e n b ye p i - i l l u m i n a t i o n ( i n d i r e c ti m m u n o f l u o r e s c e n c ep r o c e d u r e , x 3 4 0 ) .

F i g u r e 3 HLA DRa n t i g e n e x p r e s s i o n b y a l a r g em a j o r i t y o f c o n j u n c t i v a l c e l l si n a case o f c h r o n i cc o n j u n c t i v i t i s . P o s i t i v ei m m u n o s t a i n i n g a p p e a r s i ng r e e n , w h e r e a s n u c l e i arey e l l o w - o r a n g e b ys u p e r i m p r e s s i o n o f g r e e ni m m u n o r e a c t i v t y o f ce1m e m b r a n e s a n d r e d s t a i n i n go f c o u n t e r s t a i n e d n u c l e i( i n d i r e c t immuno-f l u o r e s c e n c e , p r o p i d i u mi o d i d e c o u n t e r s t a i n , x 2 4 0 ) .

as d e c r e a s e i n g o b l e t c e l l n u m b e r or c h a n g e s i nn u c l e u s c y t o p l a s m r a t i o s .IMMUNOCYTOCHEMISTRYN o a m a l p a t i e n t sT h e i m m u n o c y t o l o g i c a l s t u d y f o r c l a s s I I a n t i g e nHLA DR a n d I g E r e c e p t o r CD 2 3 r e m a i n e dn e g a t i v e i n a l l n o r m a l c o n j u n c t i v a l s p e c i m e n s( F i g 2 ) e x c e p t f o r rare a n d i s o l a t e d d e n d r i t i c c e l l sw h i c h s t r o n g l y r e a c t e d w i t h a n t i - H L A DRm o n o c l o n a l a n t i b o d y b u t n o t w i t h a n t i - C D 2 3m o n o c l o n a l a n t i b o d y . I n some s p e c i m e n s , a veryweak r e a c t i v i t y was seen on a m i n o r i t y o fc e l l s ( l e s s t h a n 1 0 % ) w i t h e i t h e r or b o t h a n t i -b o d i e s .C h r o n i c c o n j u n c t i v i t i sT h e l a r g e m a j o r i t y o f eyes w i t h c o n j u n c t i v i t i s ( 6 5o f 7 1 ) , i n c o n t r a s t , s t r o n g l y r e a c t e d w i t h b o t hm o n o c l o n a l a n t i b o d i e s ( F i g s 3 a n d 4 ) w h i c h weree x p r e s s e d b y 4 0 - 1 0 0 % o f e p i t h e l i a l c e l l s o f t h ec o n j u n c t i v a ( T a b l e 1 ) . When v i s i b l e , g o b l e t c e l l sa l s o e x p r e s s e d b o t h m a r k e r s . I n most s p e c i m e n s ,b o t h a n t i b o d i e s r e a c t e d , b u t HLA DR p o s i t i v ec e l l s were more numerous a n d more o f t e n f o u n d .

I n c a s e s o f u n i l a t e r a l c o n j u n c t i v i t i s , a s t r i k i n gd i f f e r e n c e w a s s e e n b e t w e e n b o t h e y e s , t h en o r m a l o n e r e m a i n i n g n e g a t i v e , w h i l e t h e p a t h o -l o g i c a l o n e s t r o n g l y r e a c t e d . T h e s e r e s u l t s w e r ei n d e p e n d e n t o f t h e c l i n i c a l h i s t o r y , t h e o r i g i n o ft h e c o n j u n c t i v a l d i s e a s e w h e n k n o w n , o r t h ed e g r e e o f c y t o l o g i c a l a n o m a l i e s . C o n j u n c t i v a lc e l l s , h o w e v e r , r e m a i n e d n e g a t i v e f o r b o t hm a r k e r s i n t h r e e p a t i e n t s ( s i x e y e s ) c o m p l a i n i n go f c h r o n i c o c u l a r b u r n i n g a n d r e d n e s s , b u tw i t h o u t a n y o b j e c t i v e s i g n o f o c u l a r d r y n e s s a n dc o n s i d e r e d a s h a v i n g c h r o n i c c o n j u n c t i v i t i s .Two o f t h e m h a d r e c e i v e d s t e r o i d t r e a t m e n tp r i o r t o s p e c i m e n c o l l e c t i o n , w h i c h c o u l d h a v ei n h i b i t e d t h e e x p r e s s i o n o f i n f l a m m a t o r y m a r k e r sb y c o n j u n c t i v a l c e l l s . I t w a s n o t e w o r t h y t h a tn o n e o f t h e p o s i t i v e s p e c i m e n s w e r e o b t a i n e df r o m p a t i e n t s r e c e i v i n g t o p i c a l s t e r o i d s .P a t i e n t s w i t h t e a r d e f i c i e n c yF o r d r y e y e s y n d r o m e v a r i o u s r e s u l t s w e r eo b s e r v e d . T w e n t y f o u r s p e c i m e n s w i t h c l i n i c a ld r y n e s s a n d c y t o l o g i c a l f e a t u r e s o f s q u a m o u sm e t a p l a s i a r e m a i n e d t o t a l l y n e g a t i v e f o r b o t ha n t i g e n s . Two p a t i e n t s w i t h t h e d i a g n o s i s o fS j o g r e n ' s s y n d r o m e w e r e p o s i t i v e f o r HLA DRa n t i g e n s ( 9 0 - 1 0 0 % o f c o n j u n c t i v a l c e l l s o n b o t he y e s ) , b u t n o t f o r I g E r e c e p t o r s ( l e s s t h a n 1 0 % ) .T h e p a t i e n t w i t h S t e v e n s - J o h n s o n s y n d r o m e w a ss t r o n g l y p o s i t i v e f o r b o t h a n t i b o d i e s ( 9 5 % o fp o s i t i v e c e l l s ) . T h e 1 8 o t h e r c o n j u n c t i v a ls p e c i m e n s f r o m p a t i e n t s w i t h c l i n i c a l a q u e o u st e a r d e f i c i e n c y s h o w e d p o s i t i v e b u t o f t e n w e a k e rr e a c t i v i t y ( F i g 5 ) f o r b o t h m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s( T a b l e 1 ) . A g a i n , t h e p a t t e r n o f r e a c t i v i t y a n d t h ep e r c e n t a g e s o f p o s i t i v e c e l l s w e r e n o t r e l a t e d t oc l i n i c a l a n d c y t o l o g i c a l f e a t u r e s a n d r e m a i n e di n d e p e n d e n t o f t h e d e g r e e o f s q u a m o u s m e t a -p l a s i a o b s e r v e d i n c o n j u n c t i v a l c e l l s . C y t o l o g i c a le x a m i n a t i o n d i d n o t s h o w a s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c eb e t w e e n n e g a t i v e a n d p o s i t i v e s p e c i m e n s , a ss o m e s p e c i m e n s w i t h t o t a l g o b l e t c e l l l o s s w e r en e g a t i v e , w h e r e a s v e r y m i l d f o r m s o f s q u a m o u sm e t a p l a s i a c o u l d b e s t r o n g l y p o s i t i v e . I n m o s tc a s e s , p e r c e n t a g e s o f p o s i t i v e c e l l s w e r e s i m i l a rf o r b o t h a n t i b o d i e s , b u t i n f o u r e y e s t h e p r o -p o r t i o n o f CD 2 3 p o s i t i v e c e l l s w a s h i g h e r ( 6 0 t o7 0 % ) t h a n s e e n f o r HLA DR ( 2 0 - 3 0 % ) . I t i sn o t e w o r t h y t h a t , e x c e p t f o r t w o p a t i e n t s ( f o u re y e s ) , a l l t h o s e w i t h p o s i t i v e c o n j u n c t i v a l c e l l sh a d a l o n g t e r m c o u r s e o f t o p i c a l m e d i c a t i o n f o r

5 4 7



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B a u d o u i n , H a o u a t , B r i g n o l e , B a y l e , G a s t a u dT a b l e 1 I m m u n o s t a i n i n g r e a c t i v i t y o f i m p r e s s i o n c y t o l o g y s p e c i m e n s f r o m n o r m a l c o n j u n c t i v aa n d i n o c u l a r s u r f a c e d i s o r d e r s . M e a n p e r c e n t a g e s o f r e a c t i v i t y w e r e c a l c u l a t e d f o r p o s i t i v es p e c i m e n s o n l yC l i n i c a l No o f Mean p e r c e n t a g e s No o f p o s i t i v ed i a g n o s i s s p e c i m e n s o f c e l l s ( S D ) R a n g e ( % ) s p e c i m e n s

HLA DR CD 2 3 HLA DR CD 2 3 HLA DR CD 2 3N o r m a l ( 4 1 ) * 2 ( 3 6 ) 2 - 5 ( 4 - 3 ) 0 - 1 0 0 - 1 0 7 5C o n j u n c t i v i t i s ( 7 1 ) 7 9 ( 2 2 ) 5 4 ( 2 9 ) 4 0 - 1 0 0 4 0 - 1 0 0 6 5 5 8D r y e y e ( 4 8 ) 5 9 ( 2 7 ) 6 0 ( 1 9 ) 2 0 - 1 0 0 3 0 - 1 0 0 2 4 1 8* 1 7 n o r m a l p a t i e n t s a n d s e v e n c o n t r a l a t e r a l e y e s i n u n i l a t e r a l c o n j u n c t i v i t i s

F i g u r e S W e a k e ri m m u n o f l u o r e s c e n c er e a c t i v i t y o f a n t i - H L A DR d r y eye s y n d r o m e , a n d t h a t a t l e a s t two h a da n t i b o d i e s i n some developed intolerance totheir drugs (Fig 6) .conjunctival cells fromap a t i e n t w i t h d r y e y e s .C o m p a r i n g w i t h F i g u r e 3 orF i g u r e 6 , t h e g r e e n D i s c u s s i o nimmunostaining (arrows) i sw e a k a n d c a n b e s e e n o n l y i n The t e c h n i q u e o f i m p r e s s i o n c y t o l o g y w a s f i r s ta m i n o r i t y o f e p i t h e l i a l c e l l s . d e s c r i b e d b y E g b e r t e t a l ' a n d p r o v i d e d a s i m p l eN u c l e i are c o u n t e r s t a i n e d i n procedure for cytological assessment ofo r a n g e b y p r i d u i u m i o d i d e( x 2 o r ) . m o r p h o l o g i c a l c h a n g e s o c c u r r i n g in c o n j u n c t i v a lF i g u r e 6 I n c o n t r a s t t oF i g u r e 5 , c o n j u n c t i v a l c e l l sf r o m a n o t h e r p a t i e n t w i t h d r ye y e s b u t s h o w i n g c l i n i c a li n t o l e r a n c e t o t o p i c a lm e d i c a t i o n s , s t r o n g l y e x p r e s sHLA DR a n t i g e n s on t h e i rm e m b r a n e ( g r e e ni m m u n o f l u o r e s c e n c es t a i n i n g , orange n u c l e u sc o u n t e r s t a i n , x 2 0 0 ) .

c e l l s . T h e s e a n o m a l i e s , d e s i g n e d as squamousm e t a p l a s i a h a v e b e e n o b s e r v e d i n v a r i o u s t y p e so f d i s e a s e s i n c l u d i n g a t o p i c k e r a t o c o n j u n c t i v i t i s ,k e r a t o c o n j u n c t i v i t i s s i c c a , x e r o p h t h a l m i a , o c u l a rp e m p h i g o i d , S t e v e n s - J o h n s o n d i s e a s e , orc h e m i c a l b u r n s . 2 M o s t o f t h e c y t o l o g i c a l s t u d i e sd o n e i n c o n j u n c t i v a l i m p r e s s i o n c y t o l o g ys p e c i m e n s c o n s i s t e d o f c o u n t i n g g o b l e t c e l l

d e n s i t y a n d d e t e r m i n i n g c e l l u l a r c h a r a c t e r i s t i c s ,s u c h a s m o r p h o l o g i c a l c h a n g e s o f t h e n u c l e u s ,n u c l e u s c y t o p l a s m r a t i o s , m e t a c h r o m i c c h a n g e so f c y t o p l a s m i c c o l o u r , a n d e m e r g e n c e o fk e r a t i n i s a t i o n . ' 3 A c l a s s i f i c a t i o n s y s t e m d e f i n i n gs i x s t a g e s i n s q u a m o u s m e t a p l a s i a l p r o v i d e d a na d d i t i o n a l a p p l i c a t i o n f o r i m p r e s s i o n c y t o l o g y b ya l l o w i n g e s t i m a t i o n o f t h e s e v e r i t y o f t h e c o n -j u n c t i v a l d i s e a s e a n d a n e v a l u a t i o n o f p r o g r e s s i o no r i m p r o v e m e n t o f c o n j u n c t i v a l c h a n g e s .I n a d d i t i o n t o m o r p h o l o g i c a l a n a l y s i s , t h e u s eo f m o d i f i c a t i o n s i n c o n v e n t i o n a l i m p r e s s i o nc y t o l o g y p r o c e d u r e t o p e r f o r m i m m u n o c y t o -l o g i c a l s t u d i e s w a s t h u s o f i n t e r e s t , b y p e r m i t t i n gi n v e s t i g a t i o n o f t h e e x p r e s s i o n o f v a r i o u s c e l lm a r k e r s i n n o r m a l a n d d i s e a s e d c o n j u n c t i v a .T r a n s f e r r i n g c o n j u n c t i v a l c e l l s f r o m c e l l u l o s ef i l t e r s o n t o g e l a t i n c o a t e d s l i d e s w a s a s i m p l e w a yo f o b t a i n i n g a l a r g e n u m b e r o f c e l l s o n t r a n s -p a r e n t h o l d e r s , a v o i d i n g f i x a t i v e o r c h e m i c a lc l e a r i n g a g e n t s f o r f i l t e r s t r i p s t h a t w o u l d n o t b ec o m p a t i b l e w i t h i m m u n o c y t o c h e m i s t r y . Wef o u n d t h i s p r o c e d u r e t o b e m o r e c o n v e n i e n t t h a nt h e u s e o f t r a n s p a r e n t B i o p o r e m e m b r a n e s , f i r s td e s c r i b e d b y I w a t a a n d B u r r i s , 4 a n d m o r e r e c e n t l yu s e d b y P f l u g f e l d e r e t a l 1 , b e c a u s e o f t h ee x c e s s i v e t h i n n e s s o f t h e s e m e m b r a n e s , w h i c hf r e q u e n t l y r o l l u p d u r i n g s p e c i m e n c o l l e c t i o na n d i m m u n o s t a i n i n g p r o c e d u r e s r e s u l t i n g i n c e l ld a m a g e a n d p o o r e r q u a l i t y o f c o n j u n c t i v a l c e l ls h e e t s . C y t o l o g i c a l e x a m i n a t i o n o f s p e c i m e n sa f t e r t r a n s f e r o n g l a s s s l i d e s s h o w e d a g o o dc o l l e c t i o n o f e p i t h e l i a l a n d g o b l e t c e l l s , p e r -m i t t i n g g o o d q u a l i t y c y t o l o g i c a l a n d i m m u n o -c h e m i c a l e x a m i n a t i o n . A l t h o u g h b o t h m e t h o d sp r o v i d e d i n t e r e s t i n g r e s u l t s , we a d o p t e d t h et r a n s f e r p r o c e d u r e f o r r o u t i n e c o l l e c t i o n a n ds t a n d a r d i m m u n o c h e m i s t r y .C l a s s I I h i s t o c o m p a t i b i l i t y a n t i g e n s a r em e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s w h i c h a r e n o r m a l l yr e s t r i c t e d t o c e l l s o f t h e i m m u n e s y s t e m , s u c h a sm a c r o p h a g e s , B l y m p h o c y t e s , a n d a c t i v a t e d Tc e l l s , o n w h i c h t h e y p l a y a m a j o r r o l e i n t h ei n i t i a t i o n o f t h e i m m u n e r e s p o n s e t o a n a n t i g e n .T h e i r d e v i a n t e x p r e s s i o n h a s b e e n o b s e r v e d o nv a r i o u s t y p e s o f e p i t h e l i a l o r m e s e n c h y m a l c e l l si n v o l v e d i n a u t o i m m u n e d i s e a s e s , 9 ' a n d i t h a sb e e n s u g g e s t e d t h a t t h e a b e r r a n t e x p r e s s i o n o fHLA DR b y t h e t a r g e t c e l l s c o u l d p l a y a c r u c i a lr o l e i n t h e a c t i v a t i o n o f t h e i m m u n e s y s t e m a n dd e v e l o p m e n t o f i n f l a m m a t o r y p h e n o m e n a . " I np r e v i o u s i m m u n o c y t o l o g i c a l s t u d i e s p e r f o r m e di n i n t r a o c u l a r p r o l i f e r a t i v e d i s e a s e s , w e f o u n dc l a s s I I a n t i g e n e x p r e s s i o n a t t h e s u r f a c e o fd i f f e r e n t t y p e s o f c e l l s , s u c h a s v a s c u l a r e n d o -t h e l i a l c e l l s i n p r o l i f e r a t i v e d i a b e t i c r e t i n o p a t h ya n d r e t i n a l o r c i l i a r y p i g m e n t e p i t h e l i a l c e l l s i np r o l i f e r a t i v e v i t r e o r e t i n o p a t h y . 6H i s t o l o g i c a l e x a m i n a t i o n s o f b i o p s y o r a u t o p s ys p e c i m e n s h a v e s h o w n t h a t n o r m a l c o n j u n c t i v ad o e s n o t e x p r e s s c l a s s I I a n t i g e n s . ' 2 1 3 C l a s s I Ia n t i g e n e x p r e s s i o n b y c o n j u n c t i v a l e p i t h e l i a lc e l l s h a s b e e n p r e v i o u s l y f o u n d u s i n g i m p r e s s i o nc y t o l o g y p r o c e d u r e s i n p a t i e n t s w i t h t w oa u t o i m m u n e o c u l a r s u r f a c e d i s o r d e r s , S t e v e n s -J o h n s o n , a n d S j o g r e n ' s s y n d r o m e . ' 4 I n a n o t h e rs t u d y , s w a b s f o r d e t e c t i o n o f c l a s s I I e x p r e s s i o nb y c o n j u n c t i v a l c e l l s h a d b e e n t a k e n f r o m p a t i e n t sw i t h t r a c h o m a a n d d e m o n s t r a t e d a s t r o n ge x p r e s s i o n a s s o c i a t e d w i t h a c t i v e t r a c h o m a , " b u t

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I m m u n o p a t h o l o g i c a l f i n d i n g s i n c o n j u n c t i v a l c e l l su n t i l now i m p r e s s i o n c y t o l o g y s p e c i m e n s h a dn o t b e e n u s e d r o u t i n e l y f o r t h e i m m u n o c y t o -l o g i c a l i n v e s t i g a t i o n o f c l a s s I I a n t i g e n e x p r e s s i o ni n o c u l a r s u r f a c e d i s o r d e r s . T h e p r e s e n t s t u d yc o n f i r m s t h e h i s t o l o g i c a l a s s e s s m e n t t h a t c o n -j u n c t i v a l e p i t h e l i u m d o e s n o t n o r m a l l y e x p r e s sHLA DR a n t i g e n s , e x c e p t i n r a r e s c a t t e r e d c l a s sI I p o s i t i v e d e n d r i t i c c e l l s , w h i c h a c t a s a n t i g e n -p r e s e n t i n g c e l l s t o t h e i m m u n e s y s t e m . We a l s od e m o n s t r a t e d t h a t c o n j u n c t i v a l e p i t h e l i a l c e l l sc a n e x p r e s s c l a s s I I a n t i g e n s i n v a r i o u si n f l a m m a t o r y c o n d i t i o n s c l i n i c a l l y d e f i n e d a sc h r o n i c c o n j u n c t i v i t i s , i n w h i c h c l a s s I I a n t i g e ne x p r e s s i o n p r o b a b l y r e p r e s e n t s m o r e o f a ne p i p h e n o m e n o n r e l a t e d t o l o c a l i n f l a m m a t i o n ,t h a n a c a u s a l i n v o l v e m e n t o f t h e c o n j u n c t i v a .M o r e i n t e r e s t i n g l y , p a t i e n t s w i t h d r y e y es y n d r o m e s h o w e d d i f f e r e n t i m m u n o c y t o l o g i c a lf e a t u r e s . T h e i m m u n o r e a c t i v i t y p a t t e r n s w e r en o t r e l a t e d t o c y t o l o g i c a l r e s u l t s a n d d e g r e e o fs q u a m o u s m e t a p l a s i a . I n 2 4 e y e s w i t h d r y e y es y n d r o m e , c o n j u n c t i v a l e p i t h e l i a l c e l l s d i s c l o s e di m m u n o r e a c t i v i t y s i m i l a r t o t h a t o b s e r v e d i nn o r m a l p a t i e n t s . S i x e y e s o f p a t i e n t s w i t hS t e v e n s - J o h n s o n o r S j o g r e n ' s s y n d r o m e a n d 1 8o t h e r s p e c i m e n s f r o m p a t i e n t s w i t h i d i o p a t h i cd r y e y e s y n d r o m e , h o w e v e r , s h o w e d a n a b n o r m a le x p r e s s i o n o f c l a s s I I a n t i g e n s . T h e s e p a t i e n t sh a d c l i n i c a l d i a g n o s i s o f d r y e y e s y n d r o m e a n dv a r i o u s d e g r e e s o f s q u a m o u s m e t a p l a s i a o n c y t o -l o g i c a l e x a m i n a t i o n . A s HLA DR e x p r e s s i o n w a si n d e p e n d e n t o f t h e s t a g e o f c o n j u n c t i v a lk e r a t i n i s a t i o n , i t ma y b e h y p o t h e s i s e d t h a t c o n -j u n c t i v a l c e l l s w e r e n o t i n d u c e d t o e x p r e s s c l a s sI I a n t i g e n s b y o c u l a r d r y n e s s i t s e l f , b u t t h a ti n f l a m m a t o r y p h e n o m e n a w e r e a s s o c i a t e d ,p o s s i b l y r e s u l t i n g f r o m c o n c o m i t a n t i n f e c t i o n ,a l l e r g y , t o x i c e f f e c t s o f t o p i c a l m e d i c a t i o n s , o rd i r e c t a u t o i m m u n e i n v o l v e m e n t o f c o n j u n c t i v ai n S t e v e n s - J o h n s o n o r S j o g r e n ' s s y n d r o m e .M e c h a n i s m s o f e x p r e s s i o n o f c l a s s I I a n t i g e n s a r en o t w e l l k n o w n , b u t i n t e r f e r o n - y h a s b e e n s h o w nt o b e a m a j o r i n d u c e r o f s u c h e x p r e s s i o n b y t h et a r g e t c e l l s , b o t h i n v i v o , i n a n i m a l m o d e l s , ' 6 a n di n v i t r o , o n a l a r g e v a r i e t y o f o c u l a r c e l l s . ' 7 1 8S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b s e r v e d w i t h a n o t h e ri n f l a m m a t o r y m a r k e r , CD 2 3 , w h i c h a c t s a s l o wa f f i n i t y r e c e p t o r t o I g E , a n i m m u n o g l o b u l i nw h i c h m e d i a t e s t y p e I h y p e r s e n s i t i v i t y a n d i si n c r e a s e d i n s e r u m a n d t e a r s a m p l e s f r o m p a t i e n t sw i t h a t o p i c k e r a t o c o n j u n c t i v i t i s . 6 T h i s c e l ls u r f a c e a n t i g e n h a s b e e n m a i n l y s t u d i e d i n c e l l so f t h e i m m u n e s y s t e m o n w h i c h i t s e x p r e s s i o n i se n h a n c e d b y m e d i a t o r s o f i n f l a m m a t i o n , s u c h a sp l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r . 1 9 P l a t e l e t a c t i v a t i n gf a c t o r i s a p o t e n t m e d i a t o r t h a t i n d u c e s p l a t e l e ta g g r e g a t i o n a n d a c t i v a t i o n o f t h e i m m u n e s y s t e m ,a n d c r e a t e s c o n j u n c t i v a l i n f l a m m a t i o n w h e nt o p i c a l l y a d m i n i s t e r e d t o r a b b i t s o r h u m a n s . 2 0T h e p r e s e n c e o f t h i s r e c e p t o r a t t h ec o n j u n c t i v a l l e v e l , a s w e l l a s HLA DRe x p r e s s i o n , i n s o m e p a t i e n t s w i t h c l i n i c a l d r y e y es y n d r o m e , ma y t h e r e f o r e b e r e l a t e d t o a na s s o c i a t e d t o p i c a l i n f l a m m a t i o n , t h a t s h o u l d b et r e a t e d c o n c o m i t a n t l y , p o s s i b l y w i t h a n t i -i n f l a m m a t o r y a g e n t s a n d b y a v o i d i n g a d d i t i o n a ls e n s i t i s a t i o n w i t h i n a p p r o p r i a t e s u b s t i t u t i v em e d i c a t i o n s f o r t e a r d e f i c i e n c y . I t w a s n o t

p o s s i b l e i n t h i s p r e l i m i n a r y r e p o r t t o a s s e s s morep r e c i s e l y t h e c o n s e q u e n c e s o f s t e r o i d t r e a t m e n t so n c l a s s I I a n t i g e n e x p r e s s i o n b y c o n j u n c t i v a le p i t h e l i u m , b u t i t w a s n o t e w o r t h y t h a t t w o o f t h eo n l y t h r e e p a t i e n t s w i t h c h r o n i c c o n j u n c t i v i t i swho e x h i b i t e d n e g a t i v e r e a c t i v i t y h a d r e c e i v e dt o p i c a l s t e r o i d s p r i o r t o s p e c i m e n c o l l e c t i o n .A l t h o u g h a d d i t i o n a l s t u d i e s n e e d t o b ep e r f o r m e d t o e v a l u a t e t h e e f f e c t o f s p e c i f i ct h e r a p e u t i c a g e n t s f o r t o p i c a l i n f l a m m a t i o n , t h eu s e o f i m m u n o c y t o l o g i c a l p r o c e d u r e s i n a d d i t i o nt o t h e c o n v e n t i o n a l i m p r e s s i o n c y t o l o g y t e c h -n i q u e ma y now o f f e r v a l u a b l e i n f o r m a t i o ni n c o n j u n c t i v a l d i s e a s e s . R o u t i n e i m m u n o -c y t o l o g y ma y b e h e l p f u l i n e v a l u a t i o n a n dt r e a t m e n t o f c h r o n i c o c u l a r s u r f a c e d i s o r d e r s ,e s p e c i a l l y d r y e y e s y n d r o m e , w h e n c l i n i c a l a n dc u r r e n t l a b o r a t o r y c r i t e r i a d o n o t p r o v i d e t h ea c c u r a t e d i a g n o s i s a n d w h e n t r e a t m e n t c a n n o tl e a d t o s i g n i f i c a n t r e l i e f .

1 E g b e r t P R , L a u b e S , M a u r i c e DM . A s i m p l e c o n j u n c t i v a lb i o p s y . AmJ O p h t h a l m o l 1 9 7 7 ; 8 4 : 7 9 8 - 8 0 1 .2 T s e n g S C G . S t a g i n g o f c o n j u n c t i v a l s q u a m o u s m e t a p l a s i a b yi m p r e s s i o n c y t o l o g y . O p h t h a l m o l o g y 1 9 8 5 ; 9 2 : 7 2 8 - 3 3 .3 R o l a n d o M, T e r r a g n a F , G i o r d a n o G , C a l a b r i a G . C o n j u n c t i v a ls u r f a c e d a m a g e d i s t r i b u t i o n i n k e r a t o c o n j u n c t i v i t i s s i c c a .An i m p r e s s i o n c y t o l o g y s t u d y . O p h t h a l m o l o g y 1 9 9 0 ; 2 0 0 :1 7 0 - 6 .4 I w a t a R T , B u r r i s T E . I m p r e s s i o n c y t o l o g y i m m u n o c h e m i s t r yt e c h n i q u e s . I n v e s t O p h t h a l m o l V i s S c i 1 9 8 9 ; 3 0 ( s u p p l ) : 5 2 1 .5 P f l u g f e l d e r S C , H u a n g A J W , F e u e r W, C h u c h o v s k i P T ,P e r e i r a I C , T s e ng S C G. C o n j u n c t i v a l c y t o l o g i c f e a t u r e s o fp r i m a r y S j o g r e n ' s s y n d r o m e . O p h t h a l m o l o g y 1 9 9 0 ; 9 7 : 9 8 5 -9 5 .6 B a u d o u i n C h , F r e d i - R e y g r o b e l l e t D , G o r d o n WC, e t a l .I m m u n o h i s t o l o g i c s t u d y o f e p i r e t i n a l m e m b r a n e s i n p r o -l i f e r a t i v e v i t r e o r e t i n o p a t h y . Am J O p h t h a l m o l 1 9 9 0 ; 1 1 0 :5 9 3 - 8 .7 T u f t S J , K e m e n y DM , D a r t J K G , B u c k l e y R J . C l i n i c a lf e a t u r e s o f a t o p i c k e r a t o c o n j u n c t i v i t i s . O p h t h a l m o l o g y 1 9 9 1 ;9 8 : 1 5 0 - 8 .8 P f l u g f e l d e r S C , T s e n g S C G , P e p o s e J S , F l e t c h e r MA, K l i m a sN , F e u e r W. E p s t e i n - B a r r v i r u s i n f e c t i o n a n d i m m u n o l o g i cd y s f u n c t i o n i n p a t i e n t s w i t h a q u e o u s t e a r d e f i c i e n c y .O p h t h a l m o l o g y 1 9 9 0 ; 9 7 : 3 1 3 - 2 3 .9 H a n a f u s a T , P u j o l - B o r r e l l R , C hi o v a t o L , R u s s e l l R C G ,D o n i a c h D , B o t t a z z o G F . A b e r r a n t e x p r e s s i o n o f HLA DRa n t i g e n o n t h y r o c y t e s o f G r a v e s ' d i s e a s e : r e l e v a n c e f o ra u t o i m m u n i t y . L a n c e t 1 9 8 3 ; i i : 1 1 1 1 - 5 .1 0 F o u l i s A K , F a r q u h a r s o n MA. A b e r r a n t e x p r e s s i o n o f HLADR a n t i g e n s b y i n s u l i n c o n t a i n i n g c e l l s i n r e c e n t o n s e t t y p eI d i a b e t e s m e l l i t u s . D i a b e t e s 1 9 8 6 ; 3 5 : 1 2 1 5 - 2 5 .1 1 B o t t a z z o G F , P u j o l - B o r r e l R , H a n a f u s a T , F e l d m a n n M. R o l eo f a b e r r a n t HLA DR e x p r e s s i o n a n d a n t i g e n p r e s e n t a t i o n i ni n d u c t i o n o f e n d o c r i n e a u t o i m m u n i t y . L a n c e t 1 9 8 3 ; i i : 1 1 1 5 -8 .1 2 R o d r i g u e s M M , R o w d e n G , H a c k e t t J , B a k o s I . L a n g e r h a n sc e l l s i n n o r m a l c o n j u n c t i v a a n d p e r i p h e r a l c o r n e a o f s e l e c t e ds p e c i e s . I n v e s t O p h t h a l m o l V i s S c i 1 9 8 1 ; 2 1 : 7 5 9 - 6 5 .1 3 B a u d o u i n C h , F r e d j - R e y g r o b e l l e t D , G a s t a u d P , L a p a l u s P h .HLA DR a n d DQ d i s t r i b u t i o n i n n o r m a l h u m a n o c u l a rs t r u c t u r e s . C u r r E y e R e s 1 9 8 8 ; 7 : 9 0 3 - 1 1 .1 4 B l o d i B A , P f l u g f e l d e r S C , C r o u s e C , L e v i n e J , A t h e r t o n S S .I m m u n o c y t o l o g i c a l e v a l u a t i o n o f c l a s s I I MHC a n t i g e ne x p r e s s i o n o n t h e c o n j u n c t i v a l e p i t h e l i u m . I n v e s t O p h t h a l -m o l V i s S c i 1 9 9 0 ; 3 1 ( s u p p l ) : 6 2 .1 5 M a b e y DCW, B a i l e y R L , Dunn D , e t a l . E x p r e s s i o n o f MHCc l a s s I I a n t i g e n s b y c o n j u n c t i v a l e p i t h e l i a l c e l l s i n t r a c h o m a :i m p l i c a t i o n s c o n c e r n i n g t h e p a t h o g e n e s i s o f b l i n d i n g d i s e a s e .J C l i n P a t h o l 1 9 9 1 ; 4 4 : 2 8 5 - 9 .1 6 H a m e l C h , D e t r i c k B , H o o k s J J . E v a l u a t i o n o f I a e x p r e s s i o n i nr a t o c u l a r t i s s u e s f o l l o w i n g i n o c u l a t i o n w i t h i n t e r f e r o ng a m m a . E x p E y e R e s 1 9 9 0 ; 5 0 : 1 7 3 - 8 2 .1 7 F o e t s B J J , V a n D e n O o r d J J , B i l i a u A , V a n Damme J V ,M i s s o t t e n L . H e t e r o g e n e o u s i n d u c t i o n o f m a j o r h i s t o -c o m p a t i b i l i t y c o m p l e x c l a s s I I a n t i g e n s o n c o r n e a le n d o t h e l i u m b y i n t e r f e r o n g a m m a . I n v e s t O p h t h a l m o l V i s S c i1 9 9 1 ; 3 2 : 3 4 1 - 5 .1 8 B a u d o u i n C h , F r e d j - R e y g r o b e l l e t D , J a m b o u D , G a s t a u d P ,L a p a l u s P h . HLA DR a n d DQ e x p r e s s i o n o n h u m a n r e t i n a lp i g m e n t e p i t h e l i a l c e l l s i n v i t r o . G r a e f e s A r c h C l i n E x pO p h t h a l m o l 1 9 9 0 ; 2 2 8 : 8 6 - 9 .1 9 W a r d l a w A J , M o q b e l R , K u r i h a r a K , W a l s h G , K a y B . R o l e o fP A F - a c e t h e r i n l e u c o c y t e a c t i v a t i o n a n d c h e m o t a x i s . I n :B r a q u e t , P e d . T h e r o l e o f p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r i n i m m u n ed i s o r d e r s . B a s e l : K a r g e r , 1 9 8 8 , v o l 2 , 1 - 9 .2 0 G e o r g e MA, S m i t h LM, B e r d y G J , A b e l s o n MB. P l a t e l e ta c t i v a t i n g f a c t o r i n d u c e d i n f l a m m a t i o n f o l l o w i n g t o p i c a lo c u l a r c h a l l e n g e . I n v e s t O p h t h a l m o l V i s S c i 1 9 9 0 ; 3 1 ( s u p p l ) :6 3 .

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immunopathological findings in conjunctival cells using IF staining