Impedance Analysis of MDCK Cells

8/4/2019 Impedance Analysis of MDCK Cells

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B i o p h y s i c a l J o u r n a l V o l u m e 6 9 D e c e m b e r 1 9 9 5 2 8 0 0 - 2 8 0 7Impedance A n a l y s i s o f MDCK C e l l s Measured b y E l e c t r i c C e l l - S u b s t r a t eImpedance S e n s i n gC h u n - M i n L o , C h a r l e s R . K e e s e , a n d I v a r G i a e v e rD e p a r t m e n t o f P h y s i c s a n d B i o l o g y , S c h o o l o f S c i e n c e , R e n s s e l a e r P o l y t e c h n i c I n s t i t u t e , T r o y , Ne w Y o r k 1 2 1 8 0 - 3 5 9 0 USA

ABSTRACT T r a n s e p i t h e l i a l i m p e d a n c e o f M a d i n - D a r b y c a n i n e k i d n e y c e l l l a y e r s i s m e a s u r e d b y a new i n s t r u m e n t a lm e t h o d , r e f e r r e d t o as e l e c t r i c c e l l - s u b s t r a t e i m p e d a n c e s e n s i n g . I n t h i s m e t h o d , c e l l s are c u l t u r e d on s m a l l e v a p o r a t e d g o l de l e c t r o d e s , a n d t h e i m p e d a n c e i s m e a s u r e d i n t h e f r e q u e n c y range 2 0 - 5 0 , 0 0 0 Hz b y a s m a l l p r o b i n g c u r r e n t . A m o d e l f o ri m p e d a n c e a n a l y s i s o f e p i t h e l i a l c e l l s m e a s u r e d b y t h i s m e t h o d i s d e v e l o p e d . T h e m o d e l c o n s i d e r s t h r e e d i f f e r e n t p a t h w a y sf o r t h e c u r r e n t f l o w i n g f r o m t h e e l e c t r o d e t h r o u g h t h e c e l l l a y e r : ( 1 ) i n t h r o u g h t h e b a s a l a n d o u t t h r o u g h t h e a p i c a l m e m b r a n e ,( 2 ) i n t h r o u g h t h e l a t e r a l a n d o u t t h r o u g h t h e a p i c a l m e m b r a n e , a n d ( 3 ) b e t w e e n t h e c e l l s t h r o u g h t h e p a r a c e l l u l a r space. B yc o m p a r i n g m o d e l c a l c u l a t i o n w i t h e x p e r i m e n t a l i m p e d a n c e d a t a , s e v e r a l m o r p h o l o g i c a l a n d c e l l u l a r p a r a m e t e r s c a n bed e t e r m i n e d : ( 1 ) t h e r e s i s t i v i t y o f t h e c e l l l a y e r , ( 2 ) t h e av erage d i s t a n c e b e t w e e n t h e b a s a l c e l l s u r f a c e a n d s u b s t r a t u m , a n d( 3 ) t h e c a p a c i t a n c e o f a p i c a l , b a s a l , a n d l a t e r a l c e l l m e m b r a n e s . T h i s m o d e l i s u s e d t o a n a l y z e i m p e d a n c e c h a n g e s on r e m o v a lo f C a 2 + f r o m c o n f l u e n t M a r d i n - D a r b y c a n i n e k i d n e y c e l l l a y e r s . Th e m e t h o d shows t h a t r e d u c t i o n o f C a 2 + c o n c e n t r a t i o nc a u s e s j u n c t i o n r e s i s t a n c e b e t w e e n c e l l s t o d r o p a n d t h e d i s t a n c e b e t w e e n t h e b a s a l c e l l s u r f a c e a n d s u b s t r a t u m t o i n c r e a s e .INTRODUCTIONE p i t h e l i a l c e l l s u s u a l l y f o r m a b a r r i e r s h e e t a n d e x h i b i tp o l a r i t y i n t i s s u e c u l t u r e , a s t h e a p i c a l c e l l m e m b r a n e s a r ec o n n e c t ed a n d s e a l e d w i t h t i g h t j u n c t i o n s ( F r o m t e r a n dD i a m o n d , 1 9 7 2 ; P o w e l l , 1 9 8 1 ; G u m b i n e r , 1 9 8 7 ; C e r e i j i d oe t a l . , 1 9 8 8 ; M a d a r a , 1 9 8 8 ; S t e v e n s o n e t a l . , 1 9 8 8 a ) . Ani m p o r t a n t f u n c t i o n i n e p i t h e l i a i s i o n p e r m e a t i o n , a n d , o f t h et h r e e m a j o r p a t h w a y s , t w o a r e t r a n s c e l l u l a r ( t h r o u g h b a s a la n d a p i c a l m e m b r a n e s o r t h r o u g h l a t e r a l a n d a p i c a l mem-b r a n e s ) a n d o n e i s p a r a c e l l u l a r ( t h r o u g h i n t e r c e l l u l a r s p a c ea n d t i g h t j u n c t i o n ) ( F r o m t e r , 1 9 7 2 ; C l a u s e n e t a l . , 1 9 7 9 ;B o u l p a e p a n d S a c k i n , 1 9 8 0 ) . A common m e t h o d t o s t u d yt h e i o n t r a n s p o r t p r o p e r t y o f e p i t h e l i a l c e l l s i s t o m e a s u r et r a n s e p i t h e l i a l r e s i s t a n c e b y u s i n g d i r e c t c u r r e n t ( d c )( C e r e i j i d o e t a l . , 1 9 7 8 ; G u m b i n e r a n d S i m o n s , 1 9 8 6 ;C o n y e r s e t a l . , 1 9 9 0 ) , b u t a s i m p l e a n d a c c u r a t e a l t e r n a t i n gc u r r e n t ( a c ) m e t h o d t o m e a s u r e t r a n s e p i t h e l i a l i m p e d a n c ew o u l d b e u s e f u l f o r s t u d y i n g e p i t h e l i a l t r a n s p o r t a n d m o r -p h o l o g y . I t i s r e l a t i v e l y s i m p l e t o c o n s t r u c t a n e q u i v a l e n te l e c t r i c a l c i r c u i t o f e p i t h e l i a b y u s i n g t h e d c r a t h e r t h a n t h ea c t e c h n i q u e , a n d t h e r e a r e s e v e r a l m e t h o d s t o e s t i m a t e t i g h tj u n c t i o n a l r e s i s t a n c e f r o m t h e e q u i v a l e n t c i r c u i t ( C l a u d e ,1 9 7 8 ; L e w i s a n d D i a m o n d , 1 9 7 6 ; R e u s s , 1 9 9 1 ) . Ac t e c h -n i q u e s c a n , h o w e v e r , p r o v i d e a d d i t i o n a l i n f o r m a t i o n o nb o t h r e s i s t i v e a n d c a p a c i t i v e p r o p e r t i e s o f c e l l m e m b r a n e sb e c a u s e a m e m b r a n e c a n b e m o d e l e d e l e c t r i c a l l y a s a c a -p a c i t o r a n d a r e s i s t o r c o n n e c t e d i n p a r a l l e l ( L i m e t a l . , 1 9 8 4 ;W i l l s a n d C l a u s e n , 1 9 8 7 ; P a p p e n h e i m e r , 1 9 8 7 ) . I n g e n e r a l ,R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 1 6 M a r c h 1 9 9 5 a n d i n f i n a l f o r m I S e p t e m b e r1 9 9 5A d d r e s s r e p r i n t r e q u e s t s t o D r . I v a r G i a e v e r , D e p a r t m e n t o f P hy s i csa n d B i o l o g y , S c h o o l o f S c i e n c e , R e n s s e l a e r P o l y t e c h n i c I n s t i t u t e , T r o y ,NY 1 2 1 8 0 - 3 5 9 0 . T e l . : 5 1 8 - 2 7 6 - 6 4 2 9 ; F a x : 5 1 8 - 2 7 6 - 2 8 2 5 ; E - m a i l :u s e r g a p k @ r p i t s . m t s .C 1 9 9 5 b y t h e B i o p h y s i c a l S o c i e t y0 0 0 6 - 3 4 9 5 / 9 5 / 1 2 / 2 8 0 0 / 0 8 $ 2 . 0 0

t h e s p e c i f i c c a p a c i t a n c e o f c e l l m e m b r a n e s i s a p p r o x i m a t e l y1 t k F / c m 2 ( C o l e , 1 9 6 8 ) b u t c a n a p p e a r t o b e much l a r g e r i ft h e m e m b r a n e i s f o l d e d . A common a c t e c h n i q u e i s t om e a s u r e t r a n s e p i t h e l i a l i m p e d a n c e w i t h t h e c e l l c u l t u r e d o na m e m b r a n e i n a m o d i f i e d U s s i n g c h a m b e r . T h e v o l t a g ea p p e a r i n g a c r o s s t h e c e l l l a y e r s i n r e s p o n s e t o i m p r e s s e d a cc u r r e n t s i s m e a s u r e d a s a f u n c t i o n o f t i m e o r f r e q u e n c y .I m p e d a n c e a n a l y s i s a n d c u r v e f i t t i n g t o o b t a i n t h e e l e c t r i c a lv a l u e s o f c e l l m e m b r a n e s a r e b a s e d o n e q u i v a l e n t c i r c u i t sw i t h l u m p e d o r d i s t r i b u t e d c i r c u i t p a r a m e t e r s ( M a d a r a a n dP a p p e n h e i m e r , 1 9 8 7 ; C l a u s en , 1 989 ; G o r d o n e t a l . , 1 9 8 9 ) .

O u r l a b o r a t o r y h a s d e v e l o p e d a new i n s t r u m e n t a l m e t h o dn a m e d e l e c t r i c c e l l - s u b s t r a t e i m p e d a n c e s e n s i n g ( E C I S ) t od e t e c t c e l l m o t i o n a n d m o r p h o l o g y i n t i s s u e c u l t u r e( G i a e v e r a n d K e e s e , 1 9 8 4 , 1 9 8 6 , 1 9 9 3 ) . I n o n e a p p l i c a t i o na s m a l l c u r r e n t a t a c h o s e n f r e q u e n c y i s a p p l i e d t o t h ee l e c t r o d e , a n d t h e d e v i c e m o n i t o r s t h e i m p e d a n c e o f ac e l l - c o v e r e d e l e c t r o d e b y u s i n g a l o c k - i n a m p l i f i e r t h a tr e t u r n s b o t h m a g n i t u d e a n d p h a s e o f t h e v o l t a g e a s a f u n c -t i o n o f t i m e . T h e d a t a o bt a i n ed c a n b e r e l a t e d t o m o r p h o -l o g i c a l c h a n g e s o f t h e c e l l s , a n d t h e s e h a v e b e e n d e m o n -s t r a t e d t o b e r e l a t e d t o m e t a b o l i c a c t i v i t i e s w i t h i n t h e s m a l lp o p u l a t i o n o f c e l l s o n t h e e l e c t r o d e ( G i a e v e r a n d K e e s e ,1 9 9 1 ; Lo e t a l . , 1 9 9 3 ) . I n a n o t h e r a p p l i c a t i o n t h a t i s u s e d i nt h i s p a p e r , E C I S c a n d e t e r m i n e t h e i m p e d a n c e a t v a r i o u sf r e q u e n c i e s b y s c a n n i n g a n e l e c t r o d e b l a n ke t e d w i t h c o n -f l u e n t c e l l l a y e r s . By a n a l y z i n g t h e i m p e d a n c e a s a f u n c t i o no f f r e q u e n c y , o n e c a n d e v e l o p a m o d e l t h a t r e l a t e s t h eo b s e r v e d i m p e d a n c e t o r e l e v a n t c e l l p a r a m e t e r s ( G i a e v e ra n d K e e s e , 1 9 9 1 , 1 9 9 3 ) . We h a v e s u c c e s s f u l l y o b t a i n e dm o r p h o l o g i c a l i n f o r m a t i o n o n f i b r o b l a s t i c c e l l s b y c o m p a r -i n g t h e c a l c u l a t e d i m p e d a n c e v a l u e s w i t h t h o s e m e a s u r e d b yE C I S , u s i n g t w o a d j u s t a b l e i n d e p e n d e n t p a r a m e t e r s ,n a m e l y , a a n d R b ( R b i s t h e r e s i s t i v i t y o f t h e c e l l l a y e r a n da = r c ( p f h ) 1 1 2 , w h e r e r c i s t h e e f f e c t i v e r a d i u s o f t h e s p r e a dc e l l , p t h e r e s i s t i v i t y o f t h e s o l u t i o n , a n d h t h e a v e r a g e

2 8 0 0


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I m p e d a n c e A n a l y s i s o f MD CK C e l l sd i s t a n c e b e t w e e n t h e c e l l s a n d t h e s u b s t r a t u m ; s e e t h e l i s t o fv a r i a b l e s i n t h e A p p e n d i x ) . F o r i n s t a n c e , t h e c o n f l u e n t c e l ll a y e r r e s i s t a n c e ( R b ) o f W I - 3 8 a n d W I - 3 8 VA13 c e l l s i s 0 . 7a n d 2 . 2 f Q c m 2 r e s p e c t i v e l y , a n d t h e a v e r a g e c h a n n e l h e i g h t( h ) b e t w e e n v e n t r a l c e l l s u r f a c e a n d s u b s t r a t u m i s 1 1 3 a n d1 3 n m , r e s p e c t i v e l y , i n t h e t w o c a s e s .We h a v e e x t e n d e d t h e m o d e l t o b e m o r e a p p l i c a b l e t oe p i t h e l i a l c e l l s . I n t h e s i m p l e m o d e l t h e c u r r e n t f l o w s i n t e r -c e l l u l a r l y a n d i n t r a c e l l u l a r l y i n t h r o u g h t h e v e n t r a l mem-b r a n e a n d o u t t h r o u g h t h e a p i c a l m e m b r a n e . I n t h i s m o r ec o m p r e h e n s i v e m o d e l a t h i r d p a t h w a y f o r t h e c u r r e n t s i si n c l u d e d , i . e . , f l o w t h r o u g h t h e l a t e r a l m e m b r a n e a n d o u tt h r o u g h t h e a p i c a l m em b r a n e . I n a s m u c h a s t i g h t j u n c t i o n s i ne p i t h e l i a r e s u l t i n h i g h e r j u n c t i o n a l r e s i s t a n c e t h a n f o r f i -b r o b l a s t o r e n d o t h e l i a l c e l l s , t h i s t h i r d p a t h i s i m p o r t a n t t om a k e m o d e l c a l c u l a t i o n o f e p i t h e l i a l c e l l s f i t t h e e x p e r i m e n -t a l d a t a , p a r t i c u l a r l y i n t h e h i g h - f r e q u e n c y r e g i o n .A f t e r m e a s u r i n g t h e i m p e d a n c e o f a c o n f l u e n t l a y e r o fM a d i n - D a r b y c a n i n e k i d n e y (MDCK) c e l l s ( s t a i n I I ) a tv a r i o u s f r e q u e n c i e s f r o m 2 0 t o 5 0 , 0 0 0 Hz b y E C I S , a v e r yg o o d f i t i s o b t a i n e d b e t w e e n t h e m o d e l c a l c u l a t i o n a n d t h ee x p e r i m e n t a l d a t a . We c o n c l u d e t h a t ( 1 ) j u n c t i o n a l r e s i s -t a n c e o f t h i s l e a k y t y p e o f MDCK c e l l i s 50-60 f Q c m 2 ,( 2 ) t h e d i s t a n c e b e t w e e n t h e v e n t r a l c e l l s u r f a c e a n d s u b -s t r a t u m i s l e s s t h a n 1 n m , a n d ( 3 ) t h e c a p a c i t a n c e o f a p i c a l ,b a s a l , a n d l a t e r a l c e l l m e m b r a n e s i s 4 . 5 , 3 , a n d 1 , A F / c m 2 ,r e s p e c t i v e l y .T o v e r i f y t h i s m e t h o d f u r t h e r , we a l s o m e a s u r e d t h ec h a n g e i n m o r p h o l o g y o f MDCK c e l l s b y f i r s t r e m o v i n ga n d t h e n r e p l a c i n g C a 2 + i o n s i n t h e c u l t u r e m e d i u m .T h e s e d a t a d e m o n s t r a t e t h a t b o t h t i g h t j u n c t i o n s a n d c e l l -s u b s t r a t u m i n t e r a c t i o n c a n b e s t r o n g l y a n d r e v e r s i b l y i n f l u -e n c e d b y C a 2 + .

f i c a t i o n s h a v e r e c e n t l y b e e n i m p l e m e n t e d . G o l d w a s s p u t t e r e d o n t o 2 0 - m i lp o l y c a r b o n a t e s h e e t s t o p r o du c e a n a p p r o x i m a t el y 5 0- n m -t h i c k f i l m . T h e s el a y e r s a r e t h i n e n o u g h t o p e r m i t m i c r o s c o p i c e x a mi n a t i o n o f t h e c e l lt h r o u g h t h e c o l o r e d y e t t r a n s p a r e n t m e t a l l i c f i l m . F o l l o w i n g d e p o s i t i o n o fg o l d , a p h o t o l i t h o g r a p h i c p r o c e d u r e w a s u s e d t o d e l i n e a t e t h e d e s i r e d g o l dp a t t e r n s o n t h e p l a s t i c s u b s t r a t e . A s e c o n d p h o t o l i t h o g r a p h i c s t e p w a s t h e nu s e d t o p r o d u c e 2 5 0 - , u m - d i a m e t e r h o l e s i n a p h o t o r e s i s t f i l m ; t h e s e a r e t h ea c t i v e E C I S e l e c t r o d e s . To f o r m t i s s u e c u l t u r e w e l l s , 1 0 - m m - d i a m e t e rg l a s s c y l i n d e r s a r e m o u n t e d o v e r e a c h e l e c t r o d e p a i r w i t h a s i l i c o n ea d h e s i v e . T h e c o m p l e t e d e l e c t r o d e a r r a y s a r e c l e a n e d a n d s t e r i l i z e dw i t h a n o x y g e n p l a s m a e t c h e r . T h e c o m p l e t e d a r r a y c o n s i s t s o f f i v es t e r i l e w e l l s , e a c h c o n t a i n i n g t h e - 2 5 0 - , u m - d i a m e t e r e l e c t r o d e a n d al a r g e r c o u n t e r e l e c t r o d e .

Impedance measurementsF o r i m p ed a n c e m e a s u r e m en t s t h e e l e c t r o d e a r r a y s w e r e p l a c e d i n a ni n c u b a t o r a n d a m e d i u m ( 0 . 5 m l ) w a s a d d e d o v e r t h e e l e c t r o d e i n e a c h w e l l .T h e l a r g e e l e c t r o d e a n d o n e o f t h e s m a l l e l e c t r o d e s w e r e c o n n e c t e d v i a ar e l a y b a n k t o a p h a s e - s e n s i t i v e l o c k - i n a m p l i f i e r , a n d a n a c c u r r e n t w a sa p p l i e d t h r o u g h a 1-MW l o a d r e s i s t o r ( s e e F i g . 1 ) . F o r m o n i t o r i n g c e l lm o t i o n a n d a c t i v i t i e s o f MDCK c e l l s , t h e m e a s u r e m e n t w a s g e n e r a l l yc a r r i e d o u t w i t h a n a p p l i e d p o t e n t i a l o f 0 . 5 V a t 7 0 0 H z . F o r t h e f r e q u e n c ys c a n s s h o w n i n F i g . 3 b e l o w , h o w e v e r , t h e f o l l o w i n g a c f r e q u e n c i e s a n dr e s p e c t i v e a m p l i t u d e s w e r e u s e d : 2 2 Hz a n d 0 . 1 2 V , 4 4 Hz a n d 0 . 1 2 V ,8 8 Hz a n d 0 . 1 2 V , 1 7 6 Hz a n d 0 . 1 2 V , 3 5 2 Hz a n d 0 . 1 2 V , 7 0 4 Hz a n d0 . 1 5 1 V , 1 4 0 8 Hz a n d 0 . 2 1 1 V , 2 8 1 6 Hz a n d 0 . 2 9 5 V , 5 6 3 2 Hza n d 0 . 4 1 3 V , 1 1 , 2 6 4 Hz a n d 0 . 5 78 V , 2 2, 5 2 8 Hz a n d 0 . 8 1 0 V , 4 5 , 05 6Hz a n d 1 . 1 3 4 V .A l l c o n n e c t i o n s w e r e m a d e w i t h c o a x i a l c a b l e t o m i n i m i z e a n y e x t e r -n a l l y i n d u c e d e l e c t r i c a l n o i s e . C e l l s w e r e a l l o w e d t o a t t a c h , s p r e a d , a n do r g a n i z e f o r a t l e a s t 2 4 h b e f o r e a n y o f t h e i m p e d a n c e m e a s u r e m e n t sr e p o r t e d i n t h i s p a p e r w e r e t a k e n .

M o d e l d e r i v a t i o nT h e m o d e l t h a t we u s e d t o c a l c u l a t e t h e s p e c i f i c i m p e d a n c e ( i m p e d a n c e f o ra u n i t a r e a ) o f a c e l l - c o v e r e d e l e c t r o d e a s a f u n c t i o n o f f r e q u e n c y , Z c , i s

MATERIALS AND M E T H O D ST i s s u e c u l t u r eAs a r e s u l t o f d i f f e r e n t passage n u m b e r s , t h e r e ar e two k i n d s o f MDCKc e l l , r e f e r r e d t o as s t r a i n s I a n d I I . E p i t h e l i a f o r m e d b y s t r a i n s I a n d I I o fMDCK c e l l s s h o w h i g h ( - 4 0 0 0 - Q cm2) a n d l o w ( - 8 0 - _ f 1 c m 2 ) j u n c t i o n a lr e s i s t a n c e , r e s p e c t i v e l y ( S i m m o n s , 1 9 8 1 ; H a n d l e r , 1 9 8 3 ; F u l l e r e t a l . ,1 9 8 4 ) . I n t h i s s t u d y we u s e d MDCK c e l l s ( s t r a i n I I ) o b t a i n e d f r o m ATCC( R o c k v i l l e , M D ) . C e l l s we r e n o r m a l l y c u l t u r e d a t 3 7 C a n d 5 % CO2 i nD u l b e c c o ' s m o d i f i e d E a g l e ' s medium ( G I B C O , G r a n d I s l a n d , NY ) w i t h10% f e t a l b o v i n e s e r u m ( G I B C O ) a n d 5 0 - , u g / m l g e n t a m i c i n . I n o c u l a t i o n o fe l e c t r o d e - c o n t a i n i n g d i s h e s was a t 1 0 5 c e l l s / c m 2 . I n e x p e r i m e n t s i n w h i c hc e l l s w e r e d e p r i v e d o f c a l c i u m , c e l l s w e r e f i r s t grown t o c o n f l u e n c e i nD u l b e c c o ' s m o d i f i e d E a g l e ' s m e d i u m . A f t e r two t o t h r e e d a y s ( a f t e r t i g h tj u n c t i o n s h a d f o r m e d ) t h e medium was c h a n g e d t o E a r l e ' s b a l a n c e d s a l ts o l u t i o n ( E B S S ) w i t h 1 . 8 - m M C a 2 ' . T w e n t y - f o u r h o u r s l a t e r t h e m e d i u mwa s c h a n g e d t o EBSS w i t h o u t C a 2 + . F o l l o w i n g exposure o f MDCK c e l l st o a C a 2 + - f r e e medium f o r 2 0 h , t h e C a 2 1 c o n t a i n i n g EBSS was r e t u r n e dt o t h e c e l l s , a n d t h e i r recovery f o l l o w e d . A l l s a l t s o l u t i o n s c o n t a i n e dn o r m a l l e v e l s o f M g 2 + .

E l e c t r o d e f a b r i c a t i o nE l e c t r o d e s we r e f a b r i c a t e d b y p h o t o l i t h o g r a p h y p r o c e d u r e s e s s e n t i a l l y asp r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( G i a e v e r a n d K e e s e , 1 9 9 2 ) ; h o w e v e r , s e v e r a l m o d i -

-I S S U E CULTURE MEDIUM( E L E C T R O L Y T E )- CELLS

_1/////////X 1/ / /1A=I1 / / / /SUAL GOLD LARGE GOLDELECTRODE COUNTER ELECTRODE

FIGURE 1 S c h e m a t i c o f t h e e x p e r i m e n t a l s e t u p . T h e l o c k - i n a m p l i f i e r i sc o n t r o l l e d b y a c o m p u t e r t h a t p e r m i t s v a r i o u s m o d e s o f d a t a c o l l e c t i o n . T h e1-MW s e r i e s r e s i s t a n c e p r o v i d e s a n a p pr o x i ma t el y c o n s t a n t c u r r e n t s o u r c et h a t m a k e t h e m e a s u r e d i n - p h a s e v o l t a g e e s s e n t i a l l y p r o p o r t i o n a l t o r e s i s -t a n c e a n d t h e o u t - o f - p h a s e v o l t a g e p r o p o r t i o n a l t o r e a c t a n c e .

L o e t a l . 2 8 0 1


3/8

V o l u m e 6 9 D e c e m b e r 1 9 9 5b a s e d o n t h e m e a s u r e d v a l u e s o f a c e l l - f r e e e l e c t r o d e , Z n . T h e v a r i o u sc u r r e n t p a t h s a r e s k e t c h e d i n F i g . 2 . T o m a k e t h e c a l c u l a t i o n s t r a c t a b l e ,s e v e r a l s i m p l i f y i n g a s s u m p t i o n s m u s t b e m a d e : 1 ) T h e c e l l s a r e a s s u m e d t oh a v e a c y l i n d r i c a l s h a p e w i t h r a d i u s r r , 2 ) t h e c u r r e n t f l o w s r a d i a l l y i n t h es p a c e f o r m e d b e t w e e n t h e v e n t r a l s u r f a c e o f t h e c e l l a n d t h e s u b s t r a t u m ,a n d 3 ) t h e c u r r e n t d e n s i t y u n d e r t h e c e l l s d o e s n o t c h a n g e i n t h e v e r t i c a ld i r e c t i o n . 4 ) T h e e l e c t r o d e p o t e n t i a l V c i s a c o n s t a n t t h a t i s i n d e p e n d e n t o fp o s i t i o n , a n d 5 ) t h e p o t e n t i a l i n s o l u t i o n o n t h e d o r s a l s i d e o f t h e c e l l s i sl i k e w i s e t r e a t e d a s a c o n s t a n t , V . ( f o r c o n v e n i e n c e we s e t V s = 0 ; t h i sa s s i g n m e n t w i l l n o t a f f e c t t h e c a l c u l a t e d i m p e d a n c e ) . F i n a l l y we a s s u m e 6 )t h a t t h e e l e c t r i c a l p o t e n t i a l i n s i d e t h e c e l l s , V 1 , i s a c o n s t a n t a n d 7 ) t h a t t h ep r e s e n c e o f t h e c e l l s d o e s n o t a f f e c t t h e e l e c t r o d e p o l a r i z a t i o n . T h e l a s ts i m p l i f y i n g a s s u m p t i o n m a y n o t a l w a y s b e a p p r o p r i a t e ( S c h w a n , 1 9 9 2 ) .

T h e o b j e c t i s t o u s e t h e m e a s u r e d i m p e d a n c e o f a n a k e d e l e c t r o d e , Z n ,t o c a l c u l a t e t h e s p e c i f i c i m p e d a n c e o f t h e c e l l - c o v e r e d e l e c t r o d e , Z c( e l e c t r o d e a r e a ) ( V c - V s ) / I c = i r r r 2 V c / I c t . I c i s t h e t o t a l c u r r e n t f l o w i n g f r o mt h e e l e c t r o d e , I , , i s t h e c u r r e n t f l o w i n g f r o m t h e a r e a o f a s i n g l e c e l l , a n dt h e e q u a t i o n i s t r u e a s l o n g a s we d e a l w i t h c o n f l u e n t c e l l l a y e r s . T h u s , i ft h e c u r r e n t f l o w i n g f r o m t h e a r e a o f a s i n g l e c e l l c a n b e c a l c u l a t e d a s af u n c t i o n o f V c , t h e p r o b l e m i s s o l v e d . F r o m F i g . 2 we g e t b y s i m p l y w r i t i n gO h m ' s l a w f o r a n a c c i r c u i tdV pd r h2wr'

Zn2 ' i r r d r c ,Zb2'rr d I i ,

a n dd I = d I l - I i .

E q u a t i o n sequa t io n

1 - 4 c a n b e c o m b i n e d t o y i e l d t h e f o l l o w i n g d i f f e r e

d 2 V I dVd r 2 +-d-r2V+3 = 0 ,

w h e r e

7 2 h V Z n Z b Ja n d

h ( Z n Z b )T h e g e n e r a l s o l u t i o n o f E q . 5 i s

V = A I o ( y r ) + B K o ( y r ) + ,,

( 1 )

( 2 )h

( 3 ) FIGURE 2 S c h e m a t i c d i a g r a m o f MDCK c e l l s i n t i s s u e c u l t u r e , i l l u s -t r a t i n g t h e v a r i o u s c u r r e n t p a t h s . Th e c e l l s ar e r e g a r d e d as d i s k s h a p e dw h e n v i e w e d f r o m t h e t o p , a n d t h e s c h e m a t i c s i d e v i e w d i a g r a m o f c e l l s i s( 4 ) u s e f u l i n c o n s t r u c t i n g t h e d i f f e r e n t i a l e q u a t i o n s , E q s . 5 a n d 1 2 . Th ei n c r e a s e d i m p e d a n c e o f a c e l l - c o v e r e d e l e c t r o d e i s i n l a r g e p a r t d u e t o t h en t i a l current f l o w u n d e r t h e c e l l s a n d comes i n a d d i t i o n t o t h e t r a n s c e l l u l a r a n d

p a r a c e l l u l a r p a t h w a y s .( 5 )

a n dZl

2 , u r r d z ) ( 1 1 )( 6 )By c o m b i n i n g E q s . 1 0 a n d 1 1 we o b t a i n t h e f o l l o w i n g d i f f e r e n t i a le q u a t i o n

( 7 )

( 8 )w h e r e I O ( y r ) a n d K O ( y r ) ar e m o d i f i e d B e s s e l f u n c t i o n s o f t h e f i r s t a n ds e c o n d k i n d s , r e s p e c t i v e l y . H o w e v e r , K O ( y r ) goes t o i n f i n i t y as r goes t oz e r o , a n d r c 2 r 0 ; h e n c e , B =0 . T h u s t h e s o l u t i o n o f E q . 5 i s

V = A I O ( , y r ) + , f . ( 9 )F o r t h e i n t e r c e l l u l a r l a t e r a l p a t h t h e two e q u a t i o n s r e l a t e d t o t h e para-c e l l u l a r c u r r e n t c a n b e e x p r e s s e d as

d 2 V IdZ2-i2=,

w h e r e/ 4r 4 R w f ) l / 2

T h e s o l u t i o n o f E q . 1 2 i sV I = V i + C e k z + D e & z .

( 1 2 )

( 1 3 )

( 1 4 )We h a v e f o u r c o n s t a n t s , A , C , D , a n d V i , t h a t must b e d e t e r m i n e d , a n dt h e f o u r b o u n d a r y c o n d i t i o n s ar e

V(r = r c ) = V I ( z = 0 ) ,I ( r = r c ) = I , ( z = 0 ) ,

( 1 5 )

did - 2 I I R 1 ,dz( 1 6 )

( 1 0 ) I l ( z = I ) X R * = V l ( z = 1 ) , ( 1 7 )

APICALCURRENT

B a s a l Me m bra n e v i

2 8 0 2 B i o p h y s i c a l J o u r n a l

WWW V C1-r d r - * i


4/8

I m p e d a n c e A n a l y s i s o f M D CK C e l l sa n d

I c = I +I i ( Z =) . ( 1 8 )I t i s s t r a i g h t f o r w a r d t o s o l v e t h e s e e q u a t i o n s i n c l o s e d f o r m , b u t t h e

a n s w e r s a r e r a t h e r c o m p l e x . By u s i n g m a t r i x a l g e b r a , w h i c h i s p a r t o f m a n yc o m p u t e r p r o g r a m s , a n u m e r i c a l s o l u t i o n c a n b e r e a d i l y o b t a i n e d . S y m -b o l i c a l l y we may w r i t e

MX = Y X = M - 1 Y ,w h e r e X a n d Y a r e t w o v e c t o r s a n d t h e m a t r i x M-1 i s t h e i n v e r s e o f t h em a t r i x M . F r o m t h e f o u r b o u n d a r y c o n d i t i o n s we o b t a i n t h e f o l l o w i n gm a t r i x e q u a t i o n

- 2 ( 7 r hI O (

y r c I ( y r c ) Ap 2 R ,

( > Y r c ) -1e M ( l A R b )

( ( y r c ) A e A ln ' Y r c 2 R 1 r r

t r o d e . I n a d d i t i o n we h a v e a s s u m e d t h a t t h e s p e c i f i c m e m-b r a n e r e s i s t a n c e , R m , o f t h e c e l l s i s 1 0 0 0 f Q c m 2 , a n d b e-c a u s e t h i s i s l a r g e c o m p a r e d w i t h t h e r e a c t a n c e l / 2 7 r v C m a tm o s t f r e q u e n c i e s i t h a s l i t t l e e f f e c t o n t h e r e s u l t s . ( T h em e m b r a n e i m p e d a n c e , Z m , i s l / Z m = ( 1 / R m ) + i 2 7 T V C m ) .To g e t a f e e l f o r how t h e many p a r a m e t e r s a f f e c t t h er e s u l t we s h a l l d o a f e w m o d e l c a l c u l a t i o n s . F i g . S a a n d bs h o w t h e n o r m a l i z e d r e s i s t a n c e a n d c a p a c i t a n c e a s a f u n c -t i o n o f f r e q u e n c y f o r a r a n g e o f R b v a l u e s 2 0 , 4 0 , 6 0 , a n d 8 0Q _ c m 2 , w i t h a = 2 0 f 1 1 2 c m , C a = 4 , u F / c m 2 , a n d C b = 3

- A2 R ,-1

-A e l Mb

2 R , , T r I c

0Z b ,

Z n + Z b1

- ( Z a + Z b + Z n )( Z n + Z b ) Z a[ ACD =V j 0- V c Z bZ n + Z b0

- V cA Z n + Z b ,

( 1 9 )

T h e n u m e r i c a l c o n s t a n t s A , C , D , a n d V i a r e f o u n d b y s o l v i n g t h i se q u a t i o n , a n d f i n a l l y t h e c u r r e n t f l o w i n g o u t o f t h e e l e c t r o d e u n d e r a s i n g l ec e l l c a n b e f o u n d b y i n t e g r a t i n g E q . 2 :

f r c 2 1 T r r V ) 2 d

t = Z I ( V r c ) +Z n +Zb (Vc-Vi),Z n Y ?

6

5( 2 0 ) 4

3a n d t h e i m p e d a n c e i s o b t a i n e d b y d i v i d i n g V , b y I c t2

RESULTSModel a n a l y s i s o f E C I SF i g . 3 a a n d b p l o t t h e r e s i s t a n c e a n d c a p a c i t a n c e o f t h et r a n s e p i t h e l i a l i m p e d a n c e as a f u n c t i o n o f f r e q u e n c y . B o t ho f t h e s e f i g u r e s s h o w e x p e r i m e n t a l d a t a f o r c e l l - f r e e e l e c -t r o d e s a n d e l e c t r o d e s c o n f l u e n t w i t h MDCK c e l l s ( s t r a i n I I )m e a s u r e d i n t h e c o m p l e t e m e d i u m , a n d c a l c u l a t e d v a l u e s( p o i n t s ) . F i g . 4 a a n d b d i s p l a y n o r m a l i z e d r e s i s t a n c e a n dc a p a c i t a n c e o b t a i n e d b y d i v i d i n g t h e i m p e d a n c e v a l u e sf r o m e l e c t r o d e s c o n f l u e n t w i t h MDCK c e l l s b y t h e corre-s p o n d i n g q u a n t i t i e s f o r t h e c e l l - f r e e e l e c t r o d e s .T h e c a l c u l a t e d v a l u e s are b a s e d on t h e i m p e d a n c e o f t h en a k e d e l e c t r o d e . B e c a u s e t h e s o l u t i o n r e s i s t a n c e ( c o n s t r i c -t i o n r e s i s t a n c e ) i s a s i g n i f i c a n t p a r t o f t h e m e a s u r e d i m p e d -a n c e , i t must f i r s t b e s u b t r a c t e d f r o m t h e m e a s u r e d i m p e d -a n c e b e f o r e t h e c a l c u l a t i o n s are d o n e a n d t h e n a d d e d b a c kf o r c o m p a r i s o n w i t h t h e e x p e r i m e n t a l r e s u l t s ( G i a e v e r a n dK e e s e , 1 9 9 1 ) . T h e n u m e r i c a l v a l u e o f t h e c o n s t r i c t i o n r e -s i s t a n c e i s s i m p l y e q u a l t o t h e a s ym p t o t ic v a l u e a t h i g hf r e q u e n c y o f t h e m e a s u r e d r e s i s t a n c e f o r a c e l l - f r e e e l e c -

IIIa )\ 11 W i t h c e l l s

W i t h o u t c e l l sC o n s t r i c t i o n r e s i s t a n c e

1 2 3 4 5L o g F r e q u e n c y ( H z )

7 . 5 ,T - 8 . 08

- g - 8 . 5bo - 9 . 0 _

- 9 . 5 _1 2 3 4

L o g F r e q u e n c y ( Hz )5

FIGURE 3 ( a ) R e s i s t a n c e a n d ( b ) c a p a c i t a n c e as a f u n c t i o n o f f r e q u e n c yo b t a i n e d f r o m f r e q u e n c y s c a n measurement f o r a n e l e c t r o d e w i t h a n dw i t h o u t a m o n o l a y e r o f MDCK c e l l s . T h e p o i n t s ar e c a l c u l a t e d v a l u e sb a s e d on t h e m e a s u r e d i m p e d a n c e o f t h e c e l l - f r e e e l e c t r o d e a n d u s i n g t h em o d e l i n t h i s paper. N o t e t h a t t h e r e s i s t a n c e i s a sum o f t h e e l e c t r o d er e s i s t a n c e a n d t h e f r e q u e n c y - i n d e p e n d e n t s o l u t i o n r e s i s t a n c e ( c o n s t r i c t i o nr e s i s t a n c e ) . A t l o w f r e q u e n c y t h e e l e c t r o d e r e s i s t a n c e d om in a t e s, a n d a th i g h f r e q u e n c y t h e c o n s t r i c t i o n r e s i s t a n c e d o m i n a t e s .

( b )W i t h o u t c e l l sW i t h . c e l l s

W i t h c e N s

I

L o e t a l . 2 8 0 3

- 2 .Z i

5I


5/8

V o l u m e 6 9 D e c e m b e r 1 9 9 51 5

1 0

5

0 1 2 3 4

B i o p h y s i c a l J o u r n a l

c)AC A-4

. _ * 4

z

1 5

1 0

5

05L o g F r e q u e n c y ( Hz )

3L o g F r e q u e n c y ( H z )

4

1 . 00Q- 0

c o =0N

z

0 . 80 . 60 . 40 . 20 . 0

5 1

L o g F r e q u e n c y ( Hz )

2 3 4L o g F r e q u e n c y ( Hz )

FIGURE 4 ( a ) N o r m a l i z e d r e s i s t a n c e a n d ( b ) n o r m a l i z e d c a p a c i t a n c e f o ra n e l e c t r o d e w i t h a c o n f l u e n t MDCK c e l l l a y e r . T h e curves ar e o b t a i n e df r o m F i g . 3 b y d i v i d i n g t h e m e a s u r e d v a l u e s o f t h e c e l l - c o v e r e d e l e c t r o d eb y t h e c o r r e s p o n d i n g v a l u e s o f t h e c e l l - f r e e e l e c t r o d e . A g a i n t h e p o i n t s ar ec a l c u l a t e d v a l u e s . T h e reason f o r t h e p e a k i s t h a t t h e c o n s t r i c t i o n r e s i s t a n c em a s k s t h e e l e c t r o d e r e s i s t a n c e a t h i g h f r e q u e n c y .

, u F / c m 2 . When R b i n c r e a s e s , t h e l o w - f r e q u e n c y v a l u e s o ft h e n o r m a l i z e d r e s i s t a n c e i n c r e a s e w h i l e t h e h i g h - f r e q u e n c yv a l u e s d e c r e a s e . F i g . 6 a a n d b s h o w a n o t h e r c a l c u l a t i o n ,w h e r e a t a k e s t h e v a l u e s o f 1 0 , 2 0 , 3 0 , a n d 4 0 f l " 2 c m ,R b = 6 0 f Q c m 2 , a n d C a a n d C b h a v e t h e same v a l u e s as i nF i g . 5 . F i n a l l y , F i g . 7 a a n d b s h o w a t h i r d c a l c u l a t i o n , w h e r eC a t a k e s t h e v a l u e s o f 1 , 2 , 3 , a n d 5 A F / c m 2 , R b = 6 0 f l c m 2 ,a = 2 0 f l " 2 c m, a n d C b = 3 , u F / c m 2 . B e c a u s e C a a n d C b ar ei n s e r i e s , c h a n g e s i n C b o n l y r a t h e r t h a n i n C a g i v e s i m i l a rr e s u l t s . T h i s i s n o t t r u e w h e n we c o n s i d e r t h e l a t e r a l m e m b r a n ec a p a c i t a n c e C l , w h i c h b e c o m e s i m p o r t a n t when R b i s l a r g e . I ng e n e r a l , v a l u e s f o r C b a n d C 1 t h a t g i v e t h e b e s t f i t t o e x p e r i -m e n t a l d a t a w i l l b e s m a l l e r t h a n t h e v a l u e u s e d f o r C b a b o v e .

B e c a u s e many p a r a m e t e r s n e e d t o b e a d j u s t e d , i t i s con-v e n i e n t when f i t t i n g e x p e r i m e n t a l d a t a t o s t a r t b y i g n o r i n gt h e l a t e r a l i m p e d a n c e . A f t e r r e a s o n a b l e v a l u e s o f R b , a, C a ,a n d C b are o b t a i n e d , R I a n d C l c a n b e u s e d f o r f i n e t u n i n g t oa r r i v e a t t he b e s t f i t .V a l u e s f o r MDCK c e l l sWe a n a l y z e d t h e t r a n s e p i t h e l i a l i m p e d a n c e o f c o n f l u e n tMDCK c e l l l a y e r s as d es c r i be d a b o v e. T h e b e s t f i t o b t a i n e dw i t h f o u r p a r a m e t e r s i s R b , a, C a , a n d C b a t 6 2 f Q . c m 2 , 2 0n 1 1 2 -cm, 5 , u F / c m 2 , a n d 3 t t F / c m 2 r e s p e c t i v e l y . From an-

FIGURE 5 ( a ) N o r m a l i z e d r e s i s t a n c e a n d ( b ) n o r m a l i z e d c a p a c i t a n c ef r o m m o d e l c a l c u l a t i o n f o r d i f f e r e n t j u n c t i o n a l r e s i s t a n c e s ( R b ) c o r r e s p o n d -i n g t o 2 0 , 4 0 , 6 0 , a n d 8 0 f Q c m 2 . T h e o t h e r p a r a m e t e r s . a C a . , a n d C b . we r es e t t o b e 2 0 W ' 2 % c m , 4 g F / c m 2 , a n d 3 g F / c m 2 r e s p e c t i v e l y ; t h e s e v a l u e s ar ec l o s e t o t h e e x p e r i m e n t a l r e s u l t s o f MDCK c e l l s .o t h e r r e p o r t ( C e r e i j i d o e t a l . , 1 9 8 3 ) we know t h a t t h e a p -p r o x i m a t e r a d i u s a n d t h i c k n e s s o f MDCK c e l l s are 7 a n d 5, u m , r e s p e c t i v e l y . T h e area o f l a t e r a l c e l l membrane i s t h e ne a s i l y c a l c u l a t e d , a n d t h e b e s t f i t s o f R b , a, C a , C b , a n d C 1are 6 2 f Q c m 2 , 1 9 fl2 -cm, 4 . 5 p , F / c m 2 , 3 . 0 , u F / c m 2 , a n d 1 . 0t F / c m 2 r e s p e c t i v e l y . H o w e v e r , t h e v a l u e 6 2 f l Q c m 2 i n c l u d e st h e l a t e r a l p a r a c e l l u l a r r e s i s t a n c e b e t w e e n t h e c e l l s . Toc a l c u l a t e R I we a s s u m e t h a t t h e w i d t h o f t h e i n t e r c e l l u l a rl a t e r a l s p a c e i s 15-20 nm ( G e i g e r e t a l . , 1 9 8 5 ) . T h e f i n a lr e s u l t s o f R b , a, C a , C b , a n d C 1 f o r a MDCK ( s t r a i n I I )c o n f l u e n t c e l l l a y e r are 5 5 f Q c m 2 , 1 8 1 1 / 2 ' c m , 4 . 5 p u F / c m 2 ,3 . 0 A F / c m 2 , a n d 1 . 0 , t F / c m 2 , r e s p e c t i v e l y . T h i s j u n c t i o n a lr e s i s t a n c e R b i s s i m i l a r t o t h o s e v a l u e s f r o m t r a n s e p i t h e l i a lr e s i s t a n c e measurements o b t a i n e d , f o r e x a m p l e , b y R i c h -a r d s o n e t a l . ( 1 9 8 1 ) a n d S t e v e n s o n e t a l . ( 1 9 8 8 b ) . B e c a u s ea = r c ( p / h ) 1 / 2 , b y u s i n g t h e v a l u e s o f aa n d r c d e s c r i b e da b o v e a n d b e c a u s e p i s m e a s u r e d t o b e 5 4 f l - c m , we c a nc a l c u l a t e t h e average h e i g h t b e t w e e n b a s a l c e l l s u r f a c e a n ds u b s t r a t u m a n d g e t t h e average h o f r o u g h l y 1 n m . T h i sd i s t a n c e i s s u r p r i s i n g l y s m a l l , i m p l y i n g t h a t t h e v e n t r a l s u r -f a c e s o f t h e c e l l a n d t h e s u b s t r a t u m are e s s e n t i a l l y i n c o n t a c t .C a 2 + R em ov a l a n d a d d i t i o nF o l l o w i n g t r a n s e p i t h e l i a l i m p e d a n c e measurement f o rMDCK c e l l s i n t h e c o m p l e t e m e d i u m , we r e p l a c e d t h e

0u._

:

0z

1 . 5c)

c l i0w

0z

1 . 0 V

0 . 5 F

( b )

0 . 0 L1 2 5

2 8 0 4


6/8

I m p e d a n c e A n a l y s i s o f M D C K C e l l s1 5

1 0

5

O L11 . 00 . 80 . 60 . 40 . 20 . 0

2 3 4L o g F r e q u e n c y ( Hz )

3L o g F r e q u e n c y ( H z )

FIGURE 6 ( a ) N o r m a l i z e d r e s i s t a n c e a n d ( b ) n o r m a l i z e d c a p a c i t a n c ef r o m m o d e l c a l c u l a t i o n f o r d i f f e r e n t p a r a m e t e r s a c o r r e s p o n d i n g t o 1 0 , 2 0 ,3 0 , a n d 4 0 W ' X 2 cm. T h e o t h e r p a r a m e t e r s , R b , C a , a n d C b , w e r e s e t t o b e6 0 f l Q c m 2 , 4 , u F / c m 2 , a n d 3 g F / c m 2 r e s p e c t i v e l y .

med ium w i t h E a r l e ' s b a l a n c e d s a l t s o l u t i o n ( E B S S ) c o n t a i n -i n g 1 . 8 - m M C a 2 + . A f t e r 2 4 h i n E a r l e ' s b a l a n c e d s a l ts o l u t i o n t h e t r a n s e p i t h e l i a l i m p e d a n c e d i d n o t c h a n g e s i g -n i f i c a n t l y , a n d a l l m o r p h o l o g i c a l p a r a m e t e r s f r o m i m p e d -a n c e a n a l y s i s w e r e s i m i l a r t o t h o s e o b t a i n e d f r o m c e l l s i nc o m p l e t e D u l b ec co ' s m o di f i e d E a g l e ' s m e d i u m . H o w e v e r ,when t h e medium was c h a n g e d t o EBSS w i t h o u t C a 2 + , b o t ht h e j u n c t i o n a l r e s i s t a n c e R b a n d t h e p a r a m e t e r a ( o b t a i n e df r o m d a t a f i t t i n g ) d r o p p e d q u i c k l y , as shown i n F i g . 8 ( f i l l e dc i r c l e s ) . T w e n t y h o u r s l a t e r , when R b a n d ah a d d e c r e a s e dt o 0 . 8 f Q cm2 a n d 3 . 5 f 1 1 2 _ c m , r e s p e c t i v e l y , EBSS w i t h o u tC a 2 + was a g a i n r e p l a c e d w i t h EBSS c o n t a i n i n g 1 . 8 - m MC a 2 + . As shown b y F i g . 8 ( o p e n c i r c l e s ) , t h e j u n c t i o n a lr e s i s t a n c e R b a n d t h e p a r a m e t e r ai n c r e a s e d s l o w l y i n t h ef i r s t f e w h o u r s a n d t h e n more q u i c k l y f o r a c o m p l e t e recov-ery i n a p p r o x i m a t e l y 2 0 h . F i g . 9 i l l u s t r a t e s how t h e a v e r a g eh e i g h t ( h ) ( c a l c u l a t e d f r o m a ) b e t w e e n t h e b a s a l c e l l s u r f a c ea n d t h e s u b s t r a t u m d e p e n d s on t h e r e m o v a l ( f i l l e d c i r c l e s )a n d r e p l a c em en t ( o p e n c i r c l e s ) o f C a 2 + i n t h e m e d i u m .DISCUSSIONT r a n s e p i t h e l i a l i m p e d a n c e measurement u s i n g t h e E C I S t e c h -n i q u e i s a s i m p l e m e t h o d f o r s t u d y i n g t h e t r a n s p o r t a n d mor-p h o l o g i c a l p r o p e r t i e s o f e p i t h e l i a . I t i s e a sy t o c u l t u r e c e l l s ont h e e l e c t r o d e s , t h e m e a s u r e m e n t s are n o t t i m e c o n s u m i n g , a n d ,

2 50u :

a )

N

z

2 01 51 0

505 1

L o g F r e q u e n c y ( Hz )1 . 0

a )

C .C)

CSN

z

0 . 8

0 . 60 . 4 -0 . 20 . 0 L

1 2 3 4 5L o g F r e q u e n c y ( H z )

FIGURE 7 ( a ) N o r m a l i z e d r e s i s t a n c e a n d ( b ) n o r m a l i z e d c a p a c i t a n c ef r o m m o d e l c a l c u l a t i o n f o r d i f f e r e n t a p i c a l membrane c a p a c i t a n c e s ( C a )c o r r e s p o n d i n g t o 1 , 2 , 3 , a n d 5 , i F / c m 2 . Th e o t h e r p a r a m e t e r s , R b , a, a n dC b , w e r e s et t o b e 6 0 f Q c m 2 , 2 0 f l " 2 c m, a n d 3 t t F / c m 2 , r e s p e c t i v e l y .

a l t h o u g h t h e i n t e r p r e t a t i o n may seem c o m p l e x , i t i s a s t r a i g h t -f o r w a r d n u m e r i c a l c a l c u l a t i o n w i t h t h e d e v e l o p e d m o d e l .

D i f f e r e n t c e l l t y p e s d i s p l a y d i f f e r e n t i m p e d a n c e s as af u n c t i o n o f f r e q u e n c y . Th e p e a k v a l u e o f t h e n o r m a l i z e dr e s i s t i v e c u r v e i n F i g . 3 a , f o r MDCK c e l l s a p p r o x i m a t e l y1 5 a t 7 0 0 H z , i s q u i t e d i f f e r e n t f r o m t h a t f o r f i b r o b l a s t i cc e l l s , i . e . , WI-38 VA13 c e l l s , f o r w h i c h t h e p e a k v a l u e o ft h e n o r m a l i z e d r e s i s t a n c e i s 6 a t a p p r o x i m a t e l y 4 0 0 0 H z( G i a e v e r a n d K e e s e , 1 9 9 1 ) . Th e s h i f t i n t h e p e a k r e s u l t sb a s i c a l l y f r o m i n c r e a s e s i n b o t h R b a n d a, as shown i n F i g s .5 a a n d 6 a . C o m p a r e d t o WI-38 VA13 f i b r o b l a s t s , MDCKc e l l s h a v e a l a r g e r j u n c t i o n a l r e s i s t a n c e a n d are s p a c e dmuc h c l o s e r t o t h e s u b s t r a t u m , b a s e d on m o d e l c a l c u l a t i o n s .T h e c a p a c i t i v e v a l u e s o f t h e c e l l m e m b r a n e s o b t a i n e d f r o md a t a f i t t i n g i n d i c a t e t h a t t h e a p i c a l c e l l s u r f a c e o f a MDCKc e l l ( s t r a i n I I ) h a s more f o l d s t h a n t h e b a s a l membrane a n dt h a t t h e l a t e r a l c e l l membrane i s t h e l e a s t c o n v o l u t e d . Ass e e n , t h e d e v e l o p e d m o d e l c a n b e made t o f i t t h e d a t a v e ryw e l l . W h e r e a s f i b r o b l a s t i c a n d most o t h e r c e l l s w i t h o u t t i g h tj u n c t i o n s c a n b e f i t t e d ve r y w e l l w i t h o n l y t h r e e p a r a m e t e r s ,i . e . , R b , a, a n d C a , i t i s n e c e ssa ry t o use a l l t h e p a r a m e t e r st o g e t a s i m i l a r l y g o o d f i t f o r c e l l s w i t h t i g h t j u n c t i o n s .B e c a u s e o f t h e s i m p l i c i t y o f t h e ECIS i n s t r u m e n t a l systema n d t h e g o o d agreement b e t w e e n t h e o r y a n d e x p e r i m e n t , wee x p e c t t h a t i m p e d a n c e a n a l y s i s o f c e l l s b y ECIS w i l l f i n dmany a p p l i c a t i o n s i n t h e f u t u r e .

C . )u zcnC )

5)

C u

C SQ1 05)N

z

2 8 0 5o e t a l .


7/8

2 8 0 6 B i o p h y s i c a l J o u r n a l V o l u m e 6 9 D e c e m b e r 1 9 9 57 0 -6 050-

o 4 0 -3 0 -

a C 20-0

0

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5T i m e ( h r s )

20-1 8 -1 6 -1 4 -1 2 -l o ( b )8 -6-4

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5T i m e ( h r s )

FIGURE 8 C h a n g e i n ( a ) j u n c t i o n a l r e s i s t a n c e a n d ( b ) p a r a m e t e r a a s af u n c t i o n o f t im e d u r i n g C a 2 + r e m o v a l ( f i l l e d c i r c l e s ) a n d r e p l a c e m e n t( o p e n c i r c l e s ) .

When C a 2 + i s r e m o v e d a n d t h e n a d d e d b a c k t o t h em e d i u m , o p e n i n g a n d r e s e a l i n g o f t h e t i g h t j u n c t i o n s c a u s e st h e j u n c t i o n a l r e s i s t a n c e t o d e c r e a s e a n d t h e n r e c o v e r( C e r e i j i d o e t a l . , 1 9 7 8 ; G o n z a l e z - M a r i s c a l e t a l . , 1 9 9 0 ;C o n t r e r a s e t a l . , 1 9 9 1 ) . T h e d a t a s h o w n i n F i g . 8 a c o n f i r mt h i s . F u r t h e r m o r e , t h e E C I S e x p e r i m e n t a l r e s u l t s a l s o d e m -o n s t r a t e t h a t , i n a d d i t i o n , t h e p a r a m e t e r a d e c r e a s e s i n aC a 2 + - f r e e m e d i u m , a s s h o w n i n F i g . 8 b . D a t a ( n o t s h o w n )s u g g e s t t h a t c h a n g e s i n C a 2 + c o n c e n t r a t i o n d o n o t r e s u l t i ns i g n i f i c a n t c h a n g e s i n t h e c a p a c i t a n c e o f t h e c e l l m e m b r a n e s

2 5 -20-1 51 05-0

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5T i m e ( h r s )

FIGURE 9 A v e r a g e h e i g h t ( h ) b e t w e e n b a s a l c e l l s u r f a c e a n d s u b s t r a t u ma s a f u n c t i o n o f t i m e d u r i n g C a 2 + r e m o v a l ( f i l l e d c i r c l e s ) a n d r e p l a c e m e n t( o p e n c i r c l e s ) .

o r i n t h e a v e r a g e r a d i u s o f t h e i n d i v i d u a l c e l l s . A s a r e s u l t ,c h a n g e s i n p a r a m e t e r a m u s t b e a t t r i b u t a b l e m a i n l y t oc h a n g e s i n t h e s p a c i n g b e t w e e n t h e c e l l s a n d t h e i r s u b s t r a -t u m . U s i n g t h e r e l a t i o n a = r c ( p / h ) 1 1 2 , we c a l c u l a t e d t h ea v e r a g e h e i g h t b e t w e e n t h e b a s a l c e l l s u r f a c e a n d s u b s t r a -t u m ( h ) a s s h o w n i n F i g . 9 . T h i s a v er a ge h e i g h t c h a n g e df r o m a p p r o x i m a t e l y 1 t o 2 2 n m a s MDCK c e l l s w e r e c u l -t u r e d i n C a 2 + - f r e e EBSS f o r 2 0 h . B e c a u s e t h e s p e c i f i c r o l eo f C a 2 1 i n c e l l - s u b s t r a t u m a d h e s i o n i s n o t w e l l k n o w n , t h em e t h o d p r o v i d e d h e r e may b e a n i m p o r t a n t w a y t o s t u d y t h em e c h a n i s m s o f c e l l - s u b s t r a t u m a d h e s i o n .APPENDIXL i s t o f S y m b o l s

Z ( Q 1 _ c m 2 ) s p e c i f i c i m p e d a n c e ( i m p e d a n c e f o r a u n i t a r e a ) o f t h ec e l l - f r e e e l e c t r o d eZ a ( Q ~ c m 2 ) s p e c i f i c i m p e d a n c e t h r o u g h t h e a p i c a l c e l l m e m b r a n eZ 4 ( Q . c m 2 ) s p e c i f i c i m p e d a n c e t h r o u g h t h e b a s a l c e l l m e m b r a n eZ j ( Q . c m 2 ) s p e c i f i c i m p e d a n c e t h r o u g h t h e l a t e r a l c e l l m e m b r a n e4 ( Q c m 2 ) s p e c i f i c i m p e d a n c e o f t h e c e l l - c o v e r e d e l e c t r o d eV c ( V ) a p p l i e d v o l t a g e a c r o s s t h e c e l lV 1 ( V ) p o t e n t i a l i n s i d e t h e c e l lV , ( V ) p o t e n t i a l i n t h e l a t e r a l p a r a c e l l u l a r p a t hV I ( A ) t o t a l c u r r e n t a c r o s s t h e c e l l - c o v e r e d e l e c t r o d ei c ( A ) t o t a l c u r r e n t f r o m t h e a r e a o f a s i n g l e c e l lI , ( A ) t r a n s c e l l u l a r c u r r e n t t h r o u g h t h e a p i c a l c e l l s u r f a c e

1 ( A ) p a r a c e l l u l a r c u r r e n t t h r o u g h t h e i n t e r c e l l u l a r l a t e r a lp a t hR 1 ( Q ~ c m - 1 ) l a t e r a l p a r a c e l l u l a r r e s i s t a n c e f o r a u n i t l e n g t h

R b * f Q ) j u n c t i o n a l r e s i s t a n c e b e t w e e n a d j a c e n t c e l l sR b ( f l c m 2 ) j u n c t i o n a l r e s i s t a n c e b e t w e e n a d j a c e n t c e l l s o v e r au n i t c e l l a r e a

p ( Q u c m ) r e s i s t i v i t y o f t h e c e l l c u l t u r e m e d i u mr c ( , u m ) c e l l r a d i u s

I ( , u m ) l e n g t h o f t h e l a t e r a l p a r a c e l l u l a r p a t hh ( n m ) h e i g h t b e t w e e n t h e b a s a l c e l l s u r f a c e a n d t h es u b s t r a t u m

REFERENCESB o u l p a e p , E . L . , a n d H . S a c k i n . 1 9 8 0 . E l e c t r i c a l a n a l y s i s o f i n t r a e p i t h e l i a lb a r r i e r s . C u r r . T o p . M e m b r . T r a n s p . 1 3 : 1 6 9 - 1 9 7 .C e r e i j i d o , M . , E . S . R o b b i n s , W. J . D o l a n , C . A . R o t u n n o , a n d D . D .S a b a t i n i . 1 9 7 8 . P o l a r i z e d m o n o l a y e r s f o r m e d b y e p i t h e l i a l c e l l s o n ap e r m e a b l e a n d t r a n s l u c e n t s u p p o r t . J . C e l l B i o l . 7 7 : 8 5 3 - 8 8 0 .C e r e i j i d o , M . , L . G o n z a l e z - M a r i s c a l , a n d L . B o r b o a . 1 9 8 3 . O c c l u d i n gj u n c t i o n s a n d p a r a c e l l u l a r p a t h w a y s s t u d i e d i n m o n o l a y e r s o f MDCKc e l l s . J . E x p . B i o l . 1 0 6 : 2 0 5 - 2 1 5 .C e r e i j i d o , M . , L . G o n z a l e z - M a r i s c a l , G . A v i l a , a n d R . G . C o n t r e r a s . 1 9 8 8 .T i g h t j u n c t i o n s . CRC C r i t . R e v . A n a t . S c i . 1 : 1 7 1 - 1 9 2 .C l a u d e , P . 1 9 7 8 . M o r p h o l o g i c a l f a c t o r s i n f l u e n c i n g t r a n s e p i t h e l i a lp e r m e a b i l i t y : a m o d e l f o r t h e r e s i s t a n c e o f t h e z o n u l a o c c l u d e n s .J . M e m b r . B i o l . 3 9 : 2 1 9 - 2 3 2 .C l a u s e n , C . , S . A . L e w i s , a n d J . M . D i a m o n d . 1 9 7 9 . I m p e d a n c e a n a l y s i s o f

a t i g h t e p i t h e l i u m u s i n g a d i s t r i b u t e d r e s i s t a n c e m o d e l . B i o p h y s . J .2 6 : 2 9 1 - 3 1 8 .

C l a u s e n , C . 1 9 8 9 . I m p e d a n c e a n a l y s i s i n t i g h t e p i t h e l i a . M e t h . E n z y m o l .1 7 1 : 6 2 8 - 6 4 2 .C o l e , K . S . 1 9 6 8 . M e m b r a n e s , I o n s a n d I m p u l s e s . U n i v e r s i t y o f C a l i f o r n i aP r e s s , B e r k e l e y . 1 2 p p .C o n t r e r a s , R . G . , A . P o n c e , a n d J . J .B o l i v a r . 1 9 9 1 . C a l c i u m a n d t i g h tj u n c t i o n s . I n T i g h t J u n c t i o n s . . C e r e i j i d o , e d i t o r . C R C , B o c a R a t o n ,

F L . 1 3 9 - 1 4 9 .


8/8

L o e t a l . I m p e d a n c e A n a l y s i s o f M D CK C e l l s 2 8 0 7C o n y e r s , G . , L . M i l k s , M . C o n k l y n , H . S h o w e l l , a n d E . C r a m e r . 1 9 9 0 . Af a c t o r i n s e r u m l o w e r s r e s i s t a n c e a n d o p e n s t i g h t j u n c t i o n s o f MDCKc e l l s . A m . J . P h y s i o l . 2 5 9 : C 5 7 7 - C 5 8 5 .F r o m t e r , E . 1 9 7 2 . T h e r o u t e o f p a s s i v e i o n m o v e m e n t t h r o u g h t h e e p i t h e -

l i u m o f N ec t u r u s g a l l b l a d d e r . J . M e m b r . B i o l . 8 : 2 5 9 - 3 0 1 .F r o m t e r , E . , a n d J . M . D i a m o n d . 1 9 7 2 . R o u t e o f p a s s i v e i o n p e r m e a t i o n i ne p i t h e l i a . N a t u r e Ne w B i o . 2 3 5 : 9 - 1 3 .F u l l e r , S . , C . - H . v o n B o n s d o r f f , a n d K . S i m o n s . 1 9 8 4 . V e s i c u l a r s t o m a t i t i sv i r u s i n f e c t s a n d m a t u r es o n l y t hr o u gh t h e b a s o l a t e r a l s u r f a c e o f t h ep o l a r i z e d e p i t h e l i a l c e l l l i n e , MDCK. C e l l . 3 8 : 6 5 - 7 7 .G e i g e r , B . , Z . A v n u r , T . V o l b e r g , a n d T . V o l k . 1 9 8 5 . M o l e c u l a r d o m a i n s

o f a d he r en s j u n c t i o n s . I n T h e c e l l i n C o n t a c t . G . M . E d e l m a n a n d J . - P .T h i e r y , e d i t o r s . J o h n W i l e y & S o n s , Ne w Y o r k . 4 6 1 - 4 8 9 .G i a e v e r , I . , a n d C . R . K e e s e . 1 9 8 4 . M o n i t o r i n g f i b r o b l a s t b e h a v i o r i n t i s s u ec u l t u r e w i t h a n a p p l i e d e l e c t r i c f i e l d . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . ( U S A ) .8 1 : 3 7 6 1 - 3 7 6 4 .G i a e v e r , I . , a n d C . R . K e e s e . 1 9 8 6 . U s e o f e l e c t r i c f i e l d s t o m o n i t o r t h ed y n a m i c a l a s p e c t o f c e l l b e h a v i o r i n t i s s u e c u l t u r e . IEEE T r a n s . B i o m e d .

E n g . 3 3 : 2 4 2 - 2 4 7 .G i a e v e r , I . , a n d C . R . K e e s e . 1 9 9 1 . M i c r o m o t i o n o f m a m m a l i a n c e l l sm e a s u r e d e l e c t r i c a l l y . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . ( U S A ) . 8 8 : 7 8 9 6 - 7 9 0 0 .G i a e v e r , I . , a n d C . R . K e e s e . 1 9 9 2 . T o x i c ? C e l l s c a n t e l l . C h e m t e c h . F e b .1 1 6 - 1 2 5 .G i a e v e r , I . , a n d C . R . K e e s e 1 9 9 3 . C o r r e c t i o n P r o c . N a t l . A c a d . S c i . ( U S A ) .9 0 1 6 3 4 .G o n z a l e z - M a r i s c a l , L . , R . G . C o n t r e r a s , J . J . B o l i v a r , A . P o n c e , B . C h a v e zd e R a m i r e z , a n d M. C e r e i j i d o . 1 9 9 0 . R o l e o f c a l c i u m i n t i g h t j u n c t i o nf o r m a t i o n b e t w e e n e p i t h e l i a l c e l l s . A m . J . P h y s i o l . 2 5 9 : C 9 7 8 - C 9 8 6 .

G o r d o n , L . G . M . , G . K o t t r a , a n d E . F r o m t e r . 1 9 8 9 . E l e c t r i c a l i m p e d a n c ea n a l y s i s o f l e a k y e p i t h e l i a : t h e o r y , t e c h n i q u e s , a n d l e a k a r t i f a c t p r o b -l e m s . M e t h . E n z y m o l . 1 7 1 : 6 4 2 - 6 6 3 .G u m b i n e r , B . 1 9 8 7 . S t r u c t u r e , b i o c h e m i s t r y , a n d a s s e m bl y o f e p i t h e l i a lt i g h t j u n c t i o n s . A m . J . P h y s i o l . 2 5 3 : C 7 4 9 - C 7 5 8 .G u m b i n e r , B . , a n d K . S i m o n s . 1 9 8 6 . A f u n c t i o n a l a s s a y f o r p r o t e i n si n v o l v e d i n e s t a b l i s h i n g a n e p i t h e l i a l o c c l u d i n g b a r r i e r : i d e n t i f i c a t i o n o f

a u v o m o r u l i n - l i k e p o l y p e p t i d e . J . C e l l B i o l . 1 0 2 : 4 5 7 - 4 6 8 .H a n d l e r , J . S . 1 9 8 3 . U s e o f c u l t u r e d e p i t h e l i a t o s t u d y t r a n s p o r t a n d i t sr e g u l a t i o n . J . E x p . B i o l . 1 0 6 : 5 5 - 6 9 .

L e w i s , S . A . , a n d J . M . D i a m o n d . 1 9 7 6 . Na + t r a n s p o r t b y r a b b i t u r i n a r yb l a d d e r , a t i g h t e p i t h e l i u m . J . M e m b r . B i o l . 2 8 : 1 - 4 0 .L i m , J . J . , G . K o t t r a , L . K a m p m a n n , a n d E . F r o m t e r . 1 9 8 4 . I m p e d a n c ea n a l y s i s o f N e ct u r u s g a l l b l a d d e r e p i t h e l i u m u s i n g e x t r a - a n d i n t r a c e l l u l a rm i c r o e l e c t r o d e s . C u r r . T o p . M e m b r . T r a n s p . 2 0 : 2 7 - 4 6 .L o , C . - M . , C . R . K e e s e , a n d I . G i a e v e r . 1 9 9 3 . M o n i t o r i n g m o t i o n o fc o n f l u e n t c e l l s i n t i s s u e c u l t u r e . E x p . C e l l R e s . 2 0 4 : 1 0 2 - 1 0 9 .M a d a r a , J . L . 1 9 8 8 . T i g h t j u n c t i o n d y n a m i c s : i s p a r a c e l l u l a r t r a n s p o r tr e g u l a t e d ? C e l l . 5 3 : 4 9 7 - 4 9 8 .M a d a r a , J . L . , a n d J . R . P a p p e n h e i m e r . 1 9 8 7 . S t r u c t u r a l b a s i s f o r p h y s i o -l o g i c a l r e g u l a t i o n o f p a r a c e l l u l a r p a t h w a y s i n i n t e s t i n a l e p i t h e l i a .J . M e m b r . B i o . 1 0 0 : 1 4 9 - 1 6 4 .P a p p e n h e i m e r , J . R . 1 9 8 7 . P h y s i o l o g i c a l r e g u l a t i o n o f t r a n s e p i t h e l i a l i m -p e d a n c e i n t h e i n t e s t i n a l m u c o s a o f r a t s a n d h a m s t e r s . J . M e m b r . B i o l .1 0 0 : 1 3 7 - 1 4 8 .P o w e l l , D . W. 1 9 8 1 . B a r r i e r f u n c t i o n o f e p i t h e l i a . A m . J . P h y s i o l . 2 4 1 :G 2 7 5 - G 2 8 8 .R e u s s , L . 1 9 9 1 . T i g h t j u n c t i o n p e r m e a b i l i t y t o i o n s a n d w a t e r . I n T i g h tJ u n c t i o n s . M. C e r e i j i d o , e d i t o r . C R C , B o c a R a t o n , F L . 4 9 - 6 6 .R i c h a r d s o n , J . C . W . , V . S c a l e r a , a n d N . L . S i m m o n s . 1 9 8 1 . I d e n t i f i c a t i o n

o f t w o s t r a i n s o f MDCK c e l l s w h i c h r e s e m b l e s e p a r a t e n e p h r o n t u b u l es e g m e n t s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 6 7 3 : 2 6 - 3 6 .

S c h w a n , H . P . 1 9 9 2 . L i n e a r a n d n o n l i n e a r e l e c t r o d e p o l a r i z a t i o n a n db i o l o g i c a l m a t e r i a l s . A n n . B i o m e d . E n g . 2 0 : 2 6 9 - 2 8 8 .S i m m o n s , N . L . 1 9 8 1 . I o n t r a n s p o r t i n t i g h t e p i t h e l i a l m o n o l a y e r s o fMDCK c e l l s . J . M e m b r . B i o . 5 9 : 1 0 5 - 1 1 4 .

S t e v e n s o n , B . R . , J . M. A n d e r s o n , a n d S . B u l l i v a n t . 1 9 8 8 a . T h e e p i t h e l i a lt i g h t j u n c t i o n : s t r u c t u r e , f u n c t i o n , a n d p r e l i m i n a r y b i o c h e m i c a l c h a r a c -t e r i z a t i o n . M o l . C e l l . B i o c h e m . 8 3 : 1 2 9 - 1 4 5 .S t e v e n s o n , B . R . , J . M. A n d e r s o n , D . A . G o o d e n o u g h , a n d M . S . M o o s e k e r .1 9 8 8 b . T i g h t j u n c t i o n s t r u c t u r e a n d Z O - 1 c o n t e n t a r e i d e n t i c a l i n t w os t r a i n s o f M a d i n - D a r b y c a n i n e k i d n e y c e l l s w h i c h d i f f e r i n t r a n s e p i t h e -l i a l r e s i s t a n c e . J . C e l l B i o . 1 0 7 : 2 4 0 1 - 2 4 0 8W i l l s , N . K . , a n d C . C l a u s e n . 1 9 8 7 . T r a n s p o r t - d e p e n d e n t a l t e r a t i o n s o fm e m b r a n e p r o p e r t i e s o f m a m m a l i a n c o l o n m e a s u r e d u s i n g i m p e d a n c ea n a l y s i s . J . M e m b r . B i o l . 9 5 : 2 1 - 3 5 .

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Impedance Analysis of MDCK Cells