impregnacion argentica

196 LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA

1. I N T R O D U C C I O N G E N E R A L

En h is to tecno logía se d e n o m i n a impregnac ión a toda co lo rac ión espec ia l en la que se ut i l izan sales metál icas (c loruro de oro, nitrato de plata, sales de c r om o , etc.) para or ig inar p rec ip i tados metá l icos en las estructuras q u e van a ser teñidas. El ob jet ivo de la impregnac ión argént ica es precipi tar plata metál ica a partir de sus sales para consegu i r que se depos i te sobre los te j idos.

La sal argént ica más ut i l izada es el nitrato de plata, que t iene la p rop iedad de ser muy so lub le en agua . C o m o la i m p r e g n a c i ó n a r g é n t i c a s e f u n d a m e n t a e n la r e d u c c i ó n d e l n i t r a t o d e p l a t a h a s t a o b t e n e r p l a t a m e t á l i c a y la fo tograf ía en b lanco y negro se basa en hechos s imi lares, c reemos que una breve expos ic ión de los p r inc ip ios básicos de ésta puede servir c o m o aprox imac ión in ic ia l a la impregnac ión argént ica.

En genera l , los ro l los de película fo tográ f ica van impregnados por una de sus caras de una sal inestable de plata, el b romuro argént ico, muy sens ib le a la luz y que por acc ión de ésta es prec ip i tada de forma parcial a plata metál ica cons t i t u y e n d o la d e n o m i n a d a «imagen latente».

A l añadir l uego un agente reductor potente, c o m o el p i roga lo l o la h id roqu i nona , la sal no prec ip i tada l ibera gran can t idad de partículas de plata que se asoc ian a las l iberadas anter iormente, que ac túan c o m o núc leos de prec ip i tac ión . Este p roceso se d e n o m i n a «revelado de la imagen latente».

F ina lmente se emp lean sales sódicas c o m o el t iosu l fa to, que al retirar la plata no reduc ida mediante la f o rmac ión de un ion argént ico comp le jo , a través del p roceso d e n o m i n a d o «f i jación», estabi l iza la imagen revelada imp id iendo la formac ión ulterior de nuevas imágenes.

El p roceso de impregnac ión argént ica que se exp l i ca a con t i nuac ión se basa en mecan i smos semejantes a los descr i tos, a u n q u e en él la acc ión de la luz no suele ser determinante en el p roceso , sa lvo casos a is lados .

2 . F O R M A S D E I M P R E G N A C I O N A R G E N T I C A

Existen d o s t ipos de impregnac ión argént ica:

1. I m p r e g n a c i ó n a r g é n t i c a p o r m e c a n i s m o s p r e d o m i n a n t e m e n t e f í s i c o s y f í s i c o - q u í m i c o s .

2. I m p r e g n a c i ó n a r g é n t i c a p o r m e c a n i s m o s h i s t o q u í m i c o s .

2 . 1 . I m p r e g n a c i ó n a r g é n t i c a p o r m e c a n i s m o s p r e d o m i n a n t e m e n t e f í s i c o s y f í s i c o - q u í m i c o s

En ella sólo se p roducen f e n ó m e n o s d e t i p o f í s i c o y f í s i c o - q u í m i c o , y n o r e a c c i o n e s q u í m i c a s c o n c r e t a s e n t r e l o s t e j i d o s y l a s a l d e p l a t a u t i l i z a d a . Se p roduce , por tanto, la co lo rac ión de las es t ruc turas 'por un m e c a n ismo puro de impregnac ión en el que determinadas estructuras h is to lógicas e lect ronegat ivas atraen, por un mecan i smo electrostát ico, a los iones de plata ca rgados pos i t i vamente ( A g ~ ) que existen en la so luc ión de impregnac ión . Poster iormente estos iones se hacen precipi tar c o m o plata metál ica sobre las

196 LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLO

1. I N T R O D U C C I O N G E N E R A L

En h is to tecnología se d e n o m i n a impregnac ión a toda co lo rac ión especia l =r la que se ut i l izan sales metál icas (c loruro de oro, nitrato de plata, sales m c romo , etc.) para or ig inar prec ip i tados metá l icos en las estructuras que van a so teñidas. El ob jet ivo de la impregnac ión argént ica es precipi tar plata metálico i partir de sus sales para consegu i r que se depos i te sobre los te j idos.

La sal argént ica más ut i l izada es el nitrato de plata, que t iene la prop iedad d i ser muy so lub le en agua . C o m o la i m p r e g n a c i ó n a r g é n t i c a s e f u n d a m e n t a e n la r e d u c c i ó n d e l n i t r a t o d e p l a t a h a s t a o b t e n e r p l a t a m e t á l i c a • fo tograf ía en b lanco y negro se basa en hechos s imi lares, c reemos que una brewi expos ic ión de los p r inc ip ios básicos de ésta puede servir c o m o aprox imac DT in ic ial a la impregnac ión argént ica.

En genera l , los ro l los de película fo tográ f ica van impregnados por una de S J E caras de una sal inestable de plata, el b romuro argént ico , muy sens ib le a la luz » que por acc ión de ésta es prec ip i tada de forma parcial a plata metál ica cons t ru y e n d o la d e n o m i n a d a « imagen latente».

A l añadir l uego un agente reductor potente, c o m o el p i roga lo l o la h id roc . nona , la sal no prec ip i tada l ibera gran can t idad de part ículas de plata que m asoc ian a las l iberadas anter iormente, que ac túan c o m o núc leos de precipité-c ión . Este p roceso se d e n o m i n a «revelado de la imagen latente».

F ina lmente se emp lean sales sódicas c o m o el t iosu l fa to, que al retirar la p laa no reduc ida mediante la f o rmac ión de un ion argént ico comp le jo , a través OB proceso d e n o m i n a d o «f i jación», estabi l iza la imagen revelada imp id iendo la formac ión ulterior de nuevas imágenes.

El p roceso de impregnac ión argént ica que se exp l i ca a con t i nuac ión se b a a en mecan i smos semejantes a los descr i tos, a u n q u e en él la acc ión de la luz m sue le ser determinante en el p roceso , sa lvo casos a is lados .

2 . F O R M A S D E I M P R E G N A C I O N A R G E N T I C A

Existen d o s t ipos de impregnac ión argént ica:

1. I m p r e g n a c i ó n a r g é n t i c a p o r m e c a n i s m o s p r e d o m i n a n t e m e r r a f í s i c o s y f í s i c o - q u í m i c o s .

2. I m p r e g n a c i ó n a r g é n t i c a p o r m e c a n i s m o s h i s t o q u í m i c o s .

2 . 1 . I m p r e g n a c i ó n a r g é n t i c a p o r m e c a n i s m o s p r e d o m i n a n t e m e n t e f í s i c o s y f í s i c o - q u í m i c o s

En ella só lo se p roducen f e n ó m e n o s d e t i p o f í s i c o y f í s i c o - q u í m i c c n o r e a c c i o n e s q u í m i c a s c o n c r e t a s e n t r e l o s t e j i d o s y l a s a l d e p la tz u t i l i z a d a . S e p roduce , por tanto, la co lo rac ión de las es t ruc turas 'por un mecan i smo puro de impregnac ión en el que determinadas estructuras histo lógica! e lec t ronegat ivas atraen, por un mecan i smo e lect rostát ico, a los iones de p i s a ca rgados pos i t i vamente ( A g + ) que existen en la so luc ión de impregnacior . Poster iormente estos iones se hacen precipi tar c o m o plata metál ica sobre &

LA IMPREGNACION ARGENTICA 197

estructuras hísticas med ian te reducc ión externa. Esta p rop iedad de ios te j idos de atrapar los iones argént icos ex is tentes en una so luc ión de impregnac ión rec ibe el nombre de a r g i r o f i l i a .

En genera l , la plata metál ica en forma de f inos prec ip i tados t iene espec ia l ape tenc ia por depos i tarse sobre estructuras f ibr i lares f inas y por super f ic ies ce lu lares do tadas de de lgadas p ro longac iones tales c o m o células de la gl ía, neuronas, f ibras ret iculares de l te j ido con jun t i vo , etc., que por este mot i vo rec iben la d e n o m i n a c i ó n de a r g i r ó f i l a s .

Las c o n s e c u e n c i a s fundamenta les que deben extraerse de lo expues to s o n :

a) E l t e j i d o n o i n t e r v i e n e a c t i v a m e n t e e n e l m e c a n i s m o d e l i b e r a c i ó n d e la p l a t a m e t á l i c a a p a r t i r d e s u s a l s o l u b l e .

b) N o t o d o s l o s t e j i d o s t i e n e n i d é n t i c a a p e t e n c i a p o r l a p l a t a ; c o m o e n t o d a i m p r e g n a c i ó n , t a n t o la c a r g a e l é c t r i c a c o m o l a t e x t u r a d e l a s c é l u l a s p o r t e ñ i r ( r u g o s i d a d s u p e r f i c i a l , p r e s e n c i a d e p r o l o n g a c i o n e s o v e l l o s i d a d e s , e t c . ) . i n t e r v i e n e n d e m a n e r a d e c i s i v a .

2.2. I m p r e g n a c i ó n a r g é n t i c a p o r m e c a n i s m o s h i s t o q u í m i c o s

S e basa en la ac tuac ión de a lgún c o m p o n e n t e del te j ido sobre el nitrato de plata o sus der ivados a raíz de la cua l ocurre la prec ip i tac ión de plata metál ica a partir de sus co r respond ien tes iones. Por tanto, e l t e j i d o i n t e r v i e n e a c t i v a m e n t e e n e l d e p ó s i t o d e p l a t a m e t á l i c a a t r a v é s d e u n a r e a c c i ó n q u í m i c a d e r e d u c c i ó n .

En genera l son co lo rac iones d iscr iminator ias que permi ten separar c o m p o nentes de las células en f u n c i ó n de que d e s c o m p o n g a n o no el nitrato de plata o sus der ivados (véase más adelante el c o n c e p t o de argenta f in idad) .

2.3. I m p r e g n a c i ó n a r g é n t i c a n o h i s t o q u í m i c a o p o r m é t o d o s p r e d o m i n a n t e m e n t e f í s i c o s y f í s i c o - q u í m i c o s

Los aspec tos esenc ia les de este t ipo de impregnac ión s o n los s igu ientes :

1. La f i jac ión ha de hacerse fundamenta lmen te en fo rmo l , a u n q u e se puede ut i l izar tamb ién el l íqu ido de B o u i n , que además actúa c o m o mord iente.

2. La impregnac ión argént ica puede d iv id i rse en :

a) Impregnac ión argént ica en dos t i empos . b) Impregnac ión argént ica en un t i empo.

A m b a s t ienen en c o m ú n la reducc ión del nitrato de plata a plata metál ica: los métodos en dos t i empos lo J iacen en var ias fases suces ivas , mientras q u e los mé todos en un t iempo real izan una reducc ión más severa.

— I m p r e g n a c i ó n a r g é n t i c a e n d o s t i e m p o s

Ut i l iza p roced im ien tos qu ím icos para obtener plata metál ica a partir de l nitrato de plata mediante var ias reacc iones suces ivas .

LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA

En una pr imera fase es n e c e s a r i o tratar el nitrato de plata c o n bases fuertes c o m p h id róx ido sódico. h**»awio potás ico, h id róx ido amón ico , etc., c o n lo cua l se obt iene ó x i d o de plata que precipita en forma de g ranu lac iones parduzcas .

2 A g N 0 3 - 2 t t a O H «> A g 2 0 + 2 N a N 0 3 + H 2 0

Med ian te la ad ic ión de amoníaco a la so luc ión anterior se ob t iene un c o m plejo ión ico de plata y amonio, el d e n o m i n a d o óx ido d iaminoargén t i co o plata amon iaca l , so lub le en agua aunque muy inestable.

A g 2 0 - 4 N H , o [ A g ( N H 3 ) 2 ] 2 0

El óx i do d iam ino -a rgén t i co se reduce al añadir le fo rmol al 10 por 100 , el cua l t iene la c a p a c i d a d de captar ox ígeno hasta precipi tar la plata d a n d o c o m o p roduc tos de la reacción plata metál ica, ác ido fó rm ico y amoníaco.

[ A g ( N H 3 ) J 2 0 * C H O H o 2 A g - 4 N H 3 + H C O O H

Esta plata metál ica es la que se depos i ta sobre el te j ido en forma molecu lar muy estable.

Las técnicas de co lo rac ión para f ibras de ret icul ina son el e jemplo más característ ico de esta forma de impregnac ión .

— I m p r e g n a c i ó n a r g é n t i c a en un t i empo

En ella se sue le partir del nitrato de plata ( A g N 0 3 ) , a u n q u e en ocas iones se emp lean otras sales argént icas.

Esta impregnac ión se f undamen ta en la reducc ión severa y di recta de la sal de plata a plata metál ica a través de la acc ión de un agente reductor potente, que suele ser el p i roga lo l o la h id roqu inona .

A g N 0 3 + agente reductor potente <s> A g - p roduc to de ox idac ión

Es una técn ica más lenta que la de los dos t iempos, ya que el nitrato de plata es más estable que el óx i do d iamino-a rgén t i co , a partir de l cua l se precip i ta la plata metál ica.

La t é c n i c a de B o d i a n para n e u r o f ¡ b r i l l a s y la de Gr ime l ius para argirof i l ia s o n las que emp lean más a m e n u d o la impregnac ión argént ica en un t iempo.

3 . M A N I O B R A S C O M P L E M E N T A R I A S A R E A L I Z A R U S U A L M E N T E E N L A I M P R E G N A C I O N A R G E N T I C A

1. La l impieza del mater ial de v i d r i o ha de ser escrupu losa , ya que cua lqu ie r impureza en él o en el agua dest i lada ut i l izada para lavarlo hace precip i tar la plata amon iaca l .

Por idént icos mot ivos no se d e b e n emplear ob je tos metá l icos en la man ipu lac ión .


2. En la mayor parte de las técnicas es conven ien te realizar un mordenta je previo c o n a l g ú n f i jador, en part icular l íqu ido de B o u i n , d i c romato potás ico, etc., o c o n agentes ox idantes c o m o el permanganato potás ico. El lo hace que aparezcan en las estructuras g rupos qu ímicos part iculares que favorecen la co lo rac ión (pr inc ipa lmente g rupos a ldehíd icos) .

C u a n d o se emp lea permanganato deben b lanquearse los cortes a con t i nuac ión c o n una so luc ión de metabisu l f i to sód ico o ác ido oxál ico.

3. Tras la impregnac ión argént ica suele ser tamb ién conven ien te realizar el l l amado viraje, que se realiza c o n una d iso luc ión acuosa de c loruro de oro a partir de la cua l se p roduce el depós i to de moléculas de oro metá l ico sobre los prec ip i tados de plata.

De esta manera, el co lo r pardo negruzco que conf iere la plata a los tej idos se t ransforma en un co lo r negro azu lado in tenso. A l m i smo t iempo, la d i so luc ión de oro con t r ibuye a retirar los pos ib les prec ip i tados de plata que hayan ocur r ido anómalamente en el c i t op lasma y núcleos celu lares.

4. Tras el viraje puede ser conven ien te realizar un b lanqueamiento c o n metabisu l f i to sód ico o ác ido oxál ico.

5. Por ú l t imo , s iempre hay que fijar la co lo rac ión c o n t iosul fa to sód ico , que retira la sal de plata no reduc ida y la metál ica que no ha impregnado las estructuras por co lorear .

4 . T E C N I C A S P A R A F I B R A S D E R E T I C U L I N A D E L T E J I D O C O N J U N T I V O ( G O M O R I Y G O R D O N - S W E E T )

4 . 1 . G e n e r a l i d a d e s

U n o de los pr inc ipa les p rob lemas que p lantean las técnicas de impregnac ión argént ica es la f i jac ión del corte al por taobjetos. A l realizarse múl t ip les lavados y t ratamientos sobre los cortes, es muy f recuente que se desp rendan , sobre t o d o si son de grosor e levado o si no se ut i l izan por taobjetos a l b u m i n a d o s para su montaje. Por e l lo , el cor te ha de ser lo m á s de lgado posible y ha de montarse necesar iamente en por taobjetos a lbuminados o ge la t inados prev iamente .

4 . 2 . M é t o d o d e i m p r e g n a c i ó n a r g é n t i c a d e G o m o r i p a r a f i b r a s r e t i c u l a r e s

S e trata de una técnica de i m p r e g n a c i ó n a r g é n t i c a e n d o s t i e m p o s que uti l iza c o m o base fuerte el h id róx ido potás ico y c o m o agente reductor el fo rmol . A n t e s de la impregnac ión se realiza una ox idac ión c o n permanganato potás ico al 1 por 1 0 0 segu ida de b lanqueamien to c o n metabisu l f i to potás ico al 2 por 1 0 0 y un mordenta je c o n a lumbre férr ico al 2 por 100 .


PROCEDIMIENTO TECNICO

r Fijación: formalina al 10 por 100.

Cortes: en parafina, congelación o en celoidina.

Soluciones:

a) Solución acuosa de permanganato potásico al 1 por 100.

b) Solución acuosa de metabisulfito potásico al 2 por 100.

c) Solución acuosa de alumbre férr ico al 2 por 100 preparada antes de usar.

d) Complejo de plata amoniacal diluido, durante tiempo limitado, en un volumen igual de agua destilada. Se toman 10 mL de una solución de nitrato de plata al 10 por 100, se añaden 2 mL de hidróxido potásico al 10 por 100; el precipitado que se forma se disuelve con amoníaco concentrado, después se añade nitrato de plata hasta que empiece a formarse de nuevo el precipitado; diluir con agua a partes iguales.

e) Formol al 10 por 100.

f) Solución acuosa de hiposulfito sódico al 2 por 100.

Modo de operar:

1. Desparafinar, no colodionar, hidratar. 2. Oxidar durante 1 a 2 minutos con el permanganato potásico. 3. Lavar con agua corriente. 4. Blanquear con metabisulfito. 5. Lavar con abundante agua corriente. 6. Tratar con una solución de alumbre férrico durante 1 minuto. 7. Lavar con agua corriente durante 5 minutos. 8. Lavar dos veces con agua destilada. 9. Tratar durante 1 minuto con el complejo argéntico.

10. Lavar con agua destilada, como máximo 10 segundos. 11. Reducir con formol. 12. Lavar con agua corriente. 13. Pasar rápidamente por la solución de hiposulfito. 14. Lavar con abundante agua corriente. 15. Deshidratar y montar.

Resultados:

— Fibras reticulares Negro — Fibras colágenas Amarillento

• Observaciones:

1. En caso de un viraje con el oro, como en el método de Ramón y Cajal, las fibras colágenas muestran una tonalidad más purpúrea. Hay que resaltar que el resultado ópt imo de este método depende del lavado que precede a la reducción por el formol, debiendo determinarse empíricamente la duración de este lavado.


4 . 3 . T é c n i c a de i m p r e g n a c i ó n a r g é n t i c a de G o r d o n - S w e e t para f ibras ret iculares

S e trata de una impregnac ión argént ica en d o s t i empos que emplea c o m o base fuerte el h id róx ido sód ico y c o m o agente reductor el fo rmo l . A n t e s de la impregnac ión se real izan man ipu lac iones semejantes a la de la técnica de G o -mor i , sus t i tuyendo el metabisu l f i to por ác ido oxá l ico . F ina lmente se realiza un cont ras tado sup lementar io c o n c loruro de oro al 2 por 100 .


Fijadores: varios líquidos fijadores (carnoy, formol, etc.).

Soluciones:

Solución A: baño argéntico de Wilder. Se prepara:

1. — Nitrato de plata 1.0 g — Agua destilada 10 mL

2. — Hidróxido sódico 0.3 g — Agua destilada 10 mL

Se toman 5 mL de solución de nitrato de plata; añadir amoníaco gota a gota hasta que el precipitado casi se disuelva.

Se precipita de nuevo la solución con 5 mL de hidróxido sódico y a continuación amoníaco gota a gota hasta que la solución quede clara.

Completar con agua destilada hasta 50 mL.

Solución B:

— Cloruro de oro 0.02 g

— Agua destilada 10 mL

Solución C:

— Acido oxálico 0.5 g

— Agua destilada 1 0 m L

Solución D:

— Alumbre de hierro 0.2 g

— Agua destilada 1 0 m L

Solución E:

— Tiosulfato sódico 0.5 g

— Agua destilada 10 mL

Solución F:

1. — Permanganato potásico 0.5 g — Agua destilada 100 mL 2. — A c i d o sulfúrico al 3 por 100 — Mezclar 47.5 mi de la primera con 2.5 mL de

la segunda

Solución G: formol al 10 por 100, 100 mL.


Modo de operar:

Cortes muy bien adhei calientes.

1. Desparafinar e hidratar. 2. Oxidar con permanganato potásico (solución F) durante 5 minutos. 3. Lavar con agua destilada. 4. Blanquear con ácido oxálico durante 1 minuto. 5. Lavar en tres cambios de agua destilada. 6. Trata con mordiente de alumbre de hierro en solución acuosa al 2 por 100

durante 30 minutos. 7. Lavar bien en dos cambios de agua destilada. 8. Tratar con el baño argéntico de Wilder durante unos segundos. 9. Lavar brevemente y a fondo en agua destilada.

10. Tratar con formol al 10 por 100 durante 10 minutos. 11. Lavar en agua. Si los cortes aparecen poco impregnados, repetir desde el

paso séptimo. 12. Contrastar suplementariamente en cloruro de oro al 2 por 100 durante 5

minutos. 13. Lavar en agua destilada. 14. Fijar en tiosulfato sódico durante 10 minutos. 15. Lavar en agua destilada. 16. Deshidratar, aclarar y montar.

Resultados (fig. 11.1):

— Fibras reticulares Negro azulado — Resto de estructuras Sin teñir

Figura 11.1. Técnica de reticulina (Gordon-Sweet) para visualizar la trama reticulínica en el ganglio linfático de un enfermo con el síndrome de

inmunodeficiencia adquirida (SIDA).

LÁ~~tMPREGNACION ARGENTICA 203

5. C O N C E P T O S D E A R G E N T A F I N I D A D Y A R G I R O F I L I A

5 .1 . A r g e n t a f ¡ n i d a d

Es la prop iedad que t ienen a lgunos tej idos de reducir el ni trato de plata amoniaca l a plata m e t á l i c a sin i n t e r v e n c i ó n de agentes reducto res externos. Esta p rop iedad es característ ica de determinadas g ranu lac iones c i top lasmát icas presentes en células cutáneas c o m o los me lanoc i tos , que secretan melan ina , y en ciertas células de secreción endocr ina presentes en el t ubo d iges t ivo y que rec iben el nombre de células argentafines, entero-cromafines o células de Kultschitzky. Estas células se encuent ran sobre todo en las g lándu las pi lór icas del es tómago, cr iptas de L ieberkun y m u c o s a del apéndice. La reducc ión de la plata amon iaca l a plata metál ica depende esenc ia lmente del con ten ido de sus g ranu los de secrec ión, por lo cua l la imagen que aparece tras la impregnac ión es una imagen granular c i top lasmát ica.

El m e c a n i s m o prec iso que desencadena esta reacción no se c o n o c e c o n exact i tud, aunque parece depender de la presencia de 5-h idrox i t r ip tamina (5 -T H ) , que es conver t ida en te t rah íd ro-4-carbo l ina por el fo rmo l . La técnica más emp leada para demostrar esta p rop iedad es la de M a s s o n - F o n t a n a .

5 .2 . A r g i r o f i l i a

Es, c o m o ya se ha m e n c i o n a d o , la prop iedad que poseen determinadas est ructuras t isulares de unirse a los iones de plata der ivados del n i t rato de plata o plata a m o n i a c a l , de forma que , poster iormente, los iones de plata atraídos por el te j ido s o n prec ip i tados a plata metál ica por acc ión de un agente reductor externo c o m o el p i roga lo l o la h id roqu inona . Las técnicas ut i l i zadas para la de te rminac ión de f ibras de ret icul ina pueden cons iderarse, en sent ido amp l io , c o m o técnicas de argirof i l ia. S i n embargo , para demostrar a rg i rofi l ia en g ranu lac iones in t rac i top lamát icas se emplean otros métodos c o m o el de Gr ime l ius o el de S e v i e r - M u n g e r .

6. P R E C A U C I O N E S G E N E R A L E S E N L A R E A L I Z A C I O N D E T E C N I C A S D E A R G E N T A F I N I D A D

a) T o d a s las aconse jadas para cua lqu ier impregnac ión argént ica ( l impieza esc rupu losa del mater ial , no uti l izar ins t rumentos metál icos, etc.) .

b) F i jac ión. N o deben emplearse l íqu idos f i jadores que con tengan a l coho l , pues las g ranu lac iones argént icas s o n so lub les en él . El f i jador de e lec c ión es la fo rmal ina t a m p o n a d a al 10 por 100. S in embargo , hay que tener en cuen ta que tras esta f i jac ión los g ranu los muestran auto f luores-cenc ia , lo que puede ser de ut i l idad para su demost rac ión tras observa c ión c o n m i c r o s c o p i o de f luo rescenc ia , f i l tro exc i tador Sco t t U G - 2 y secc iones inc lu idas en paraf ina y mon tadas en med io de Apa thy .

6 . 1 . T é c n i c a d e M a s s o n - F o n t a n a p a r a a r g e n t a f i n i d a d

S e trata de una i m p r e g n a c i ó n a r g é n t i c a en dos t i empos , en la cua l el amoníaco realiza la pr imera reducc ión del nitrato de plata a óx ido d iaminoargén-


t i co y el te j ido la s e g u n d a , prec ip i tándose plata metál ica sobre las g ranu lac iones do tadas de c a p a c i d a d reductora.

Es de destacar que la i n c u b a c i ó n del te j ido c o n la plata amon iaca l es pro longada (24 horas) y debe realizarse en la oscur idad para evitar prec ip i tad o s a causa de la acc ión de la luz solar.

La pr inc ipa l d i f i cu l tad de la técn ica se encuent ra en la preparac ión de los react ivos, ya que hay que l levar la s o l u c i ó n de plata hasta un m o m e n t o en que es té a punto de precipi tar s in que l legue a hacer lo en real idad (so luc ión de apar ienc ia n u b o s a ) .


Fijación: formalina al 10 por 100.

Soluciones:

a) Solución de nitrato de plata (Fontana):

Disolver:

— Nitrato de plata 5 g — Agua destilada 100 mL

Añadir a 95 mL de esta solución hidróxido amónico hasta obtener una solución clara sin precipitados. Luego añadir gota a gota lo necesario de ios restantes 5 mL de la solución de nitrato de plata hasta que la solución se vuelva ligeramente turbia (opalescente).

Dejar reposar 1 ó 2 horas en la oscuridad antes de usar.

b) Solución de cloruro de oro: — Cloruro de oro acuoso al 1 por 100 10 mL — Agua destilada 40 mL

c) Solución de tiosulfato sódico al 5 por 100: — Tiosulfato sódico 5 mL — Agua destilada . . . 100 mL

d) Solución de rojo nuclear rápido (Kernechtrot)

Modo de operar: Usar cortes de control. Emplear material de vidrio químicamente limpio. Evitar

el contacto con metales.

1. Desparafinar y rehidratar los cortes hasta agua destilada. 2. Incubar en solución de nitrato de plata a 56 °C durante 1 hora o bien de

24 a 48 horas a temperatura ambiente (en oscuridad). Los cortes deben ser de color marrón claro.

3. Lavar en agua destilada. 4. Colocar en solución de cloruro de oro durante 5 minutos. 5. Lavar tres veces en agua destilada. 6. Colocar en solución de tiosulfato sódico durante 5 minutos. 7. Lavar en agua destilada. 8. Contrastar con solución de rojo nuclear rápido durante 5 minutos. Lavar

bien.


9. 10.

Lavar en agua destilada dos veces. Deshidratar, aclarar y montar.


— Sustancias reductor as de la plata, incluidos granulos argén-tafines y melanina Negro

— Núcleos Rosa

Figura 11.2. Técnica de Masson-Fontana para identificar células argenta-fines en las glándulas del intestino delgado.

• Observaciones:

Este procedimiento es inespecífico, ya que muchos pigmentos, incluidos el formol, hierro, pigmento lipofucsínico y granulos argentafines, pueden ser positivos. Aunque se usa con frecuencia para demostrar melanina, es preciso realizar otras técnicas para confirmar los resultados positivos. Como otros pigmentos no reaccionan con la plata a pH 3.3, se puede demostrar selectivamente la melanina usando un método de Warthin-Starry modificado a este pH. La prueba histoquí-mica crucial para las melaninas es la reducción del nitrato de plata (0.1 M o 1.7 por 100) en tampón acetato (0.1 M pH 4), en 1 hora o menos, a temperatura ambiente en la oscuridad.

I

6.2. M é t o d o de Gr ime l ius para argirof i l ia

Se trata de una i m p r e g n a c i ó n a r g é n t i c a en un t i e m p o c o n reducc ión del nitrato de plata mediante la h id roqu inona .

Las p iezas f i jadas en formol t a m p o n a d o al 10 por 1 0 0 deben ser refi jadas toda la n o c h e en l íqu ido de B o u i n antes de su t i nc ión .

P rocesamien to normal . Inc lus ión en paraf ina.



Soluciones:

a) Solución de tampón acetato 0.1 M a pH 5.8:

Solución 1:

— Acetato de sodio puro 1.64 g — Acetato de sodio trihidrato 2.72 g — Agua destilada 100 mL

Solución 2:

— Acido acético glacial 1.2 mL — Agua destilada 98.2 mL

Solución de trabajo:

— Solución 1 95.0 mL — Solución 2 5.0 mL — Agua destilada 100 mL

b) Solución de impregnación:

— Tampón acetato 0.1 molar a pH 5.8 100 mL — Nitrato de plata 0.05 g

c) Solución reductora de Bodian:

— Sulfito de sodio anhidro 5 g — Hidroquinona 1 g — Agua destilada 100 mL

d) Solución fijadora:

— Tiosulfato sódico 2 g — Agua destilada 100 mL

Modo de operar:

1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada. 2. Lavar cuatro veces en agua destilada. 3. Colocar en la solución de impregnación durante 3 horas a 60 °C (los

portaobjetos y la solución han de ir alcanzando progresivamente la temperatura).

4. Transferir durante 5 minutos a la solución reductora de Bodian recién preparada y previamente calentada a 60 °C. Examinar al microscopio. Si no aparece color negro, lavar en cuatro cambios de agua destilada. Fijar en tiosulfato sódico al 2 por 100 de 30 segundos a 1 minuto. Volver a colocar en la solución de impregnación recién preparada a temperatura ambiente durante 30 minutos. Transferir a la solución reductora de Bodian recién preparada durante otros 5 minutos.

5. Lavar en agua destilada. 6. Fijar en tiosulfato sódico al 2 por 100 durante 30 segundos. 7. Lavar en agua destilada. 8. Deshidratar, aclarar y montar.


— Células argirófilas — Células alfa 2 de los islotes pancreáticos

Negro Negro


9 •

Figura 11.3 Técnica de Grimelius para identificar las células argirófilas del intestino delgado.

Observaciones:

1. Es fundamental emplear soluciones tamponadas, pues el resultado de la técnica depende del correcto equilibrio del pH.

2. Se utiliza nitrato de plata en muy pequeña cantidad para evitar que los iones de plata en exceso saturen la proliferación.

3. Se obtiene un resultado excelente tratando los cortes, una vez desparafina-dos con fijador de Bouin, durante 1 hora a 37 °C, y pasándolos luego por alcohol de 70° hasta que desaparezca el color amarillo. La incubación se realiza en una solución de nitrato de plata al 0.1 por 100 aproximadamente (casi el doble de la recomendada) durante 4 horas a 60 °C. El resto de la técnica es igual a la descrita. (Modif icación realizada en el departamento de anatomía patológica del Hospital universitario de Granada).

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