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IMUNOFENOTIPAGEM NAS LEUCEMIAS AGUDAS
Curso Pré-Congresso: IMUNOFENOTIPAGEM NAS
DOENÇAS HEMATOLÓGICAS
Mariester MalvezziHospital de Clínicas
Universidade Federal do Paraná
LEUCEMIA AGUDA
Definição
É uma neoplasia de células hematopoéticas precursoras que
apresentam proliferação anormal e parada de maturação
em diferentes estágios de sua diferenciação.
20% LMA
EPIDEMIOLOGIA
• 4/100.000/ano – em geral 13.000/ano/EUA• LLA: 3.200 casos/ano • LMA: 9.700/ano > 60 anos – 10/100.000/ano• Crianças: LLA-B : em 85%
85-90% LLA-B precursoras Linfoma linfoblástico B: < 10%
LLA-T : 15%, em adolescentes Linfoma linfoblástico T: >80% 40% dos linfomas
• Adultos: LMALLA: em 15%: B 75%
T 25%
CARACTERIZAÇÃO LABORATORIAL DE UMA NEOPLASIA HEMATOLÓGICA:
ABORDAGEM INTEGRADA
• Morfologia
• Citoquímica Citometria de fluxo
• Immunofenotipagem
• Citogenética Imunohistoquímica
• Biologia molecular
• Ciclo celular
IMUNOFENÓTIPO DAS NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS
UTILIDADE CLÍNICA DOS ESTUDOS FENOTÍPICOS
- Classificação Diagnóstica
- Avaliação Prognóstica
- Monitorização
Correlação fenótipo X citogenética X prognóstico
IMUNOFENÓTIPO DAS NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS
ESTRATÉGIA
• 1- Estudo do que é Normal
• 2- Estudo do Fenótipo das Doenças
IMUNOFENÓTIPO DAS CÉLULAS LEUCÊMICAS
Célula normal x Célula leucêmica
Identificação
Caracterização
Quantificação
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DAS CÉLULAS LEUCÊMICAS
1. Designação da Linhagem
2. Avaliação da Maturação Celular
3. Pesquisa de Aberrâncias Fenotípicas
1. Antígenos que definem linhagem:
* Mielóide: cyMPO
* Linfóide B: cyCD79a, cyCD22
* Linfóide T: cyCD3
2. Antígenos associados a imaturidade:
nTdT, CD34, CD117
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DAS CÉLULAS LEUCÊMICAS
2. Antígenos associados à maturação das linhagens:
Mielóide: CD11b, CD13, CD33, CD65Monocítica: CD11c, CD14, CD36, CD64, CD68, lactoferrLinfóide B: CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CyIgμ, K, LLinfóide T: CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8Linfóide NK: CD2, CD11b, CD16, CD56, CD57Eritróide: CD36, CD71, CD105, Glicoforina APlaquetária: CD41a, CD42b, CD61Basofílica: CD9, CD13, CD33, CD123, CD203, HLA-DRDendrítica: CD16, CD33, CD117, CD123, HLA-DRMastocítica: CD2, CD25, CD33, CD68, CD117
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DAS CÉLULAS LEUCÊMICAS
3. Pesquisa de Aberrâncias Fenotípicas:• Expressão de antígenos de outra linhagem
* LLA – CD13, CD15, CD33
* LMA – CD2, CD5, CD7 e/ou CD19, CD22, CD56
• Assincronismo de expressão dos antígenos
* CD11b, CD15 ou CD16 em células CD34++
*Ausência de expressão de antígenos. CD13 neg em LMA,
CD5 neg em LLA-T
• Superexpressão de antígenos
* CD34, CD14 na LMA; CD10 na LLA
• Parâmetros de dispersão anormais
* FSC e SSC altos ou baixos
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DAS CÉLULAS LEUCÊMICAS
APLICAÇÃO DA CITOMETRIA DE FLUXOLEUCEMIAS AGUDAS
• Diagnóstico de linhagem linfóide vs mielóide.
• Subclassificação imunológica das leucemias agudas linfoblásticas precursoras B e T.
• Diagnóstico das leucemias agudas M0, M6, M7, dendríticas, mastócitos.
• Diagnóstico das leucemias de linhagem ambígua.
• Triagem diagnóstica de alterações cromossômico / genéticas. Ex: LMA-M3 c/ t(15;17); LLA-B c/ 11q23, t(9;22), t(1;19), t(12;21).
CLASSIFICAÇÕES
• FAB – French/American/British1976
• MIC – Morfológica/Imunológica/Citogenética
1986• REAL – Revised European-American
Classification of Lymphoid Neoplasms1994
• OMS – Organização Mundial da Saúde2001 E 2008
CLASSIFICAÇÃO 0MS
• Estratifica as linhagens linfóide, mielóide, histiocítica/dendrítica e mastocítica
• Postula a célula de origem para cada neoplasia
• Define entidades nosológicas
• Utiliza várias áreas do conhecimento: clínica, morfologia, citoquímica, imunofenótipo, biologia molecular
• É mutável
OMS-2008 CLASSIFICAÇÃO DAS LEUCEMIAS AGUDAS
LEUCEMIAS LINFOIDES AGUDAS
LEUCEMIAS MIELOIDES AGUDAS
LEUCEMIA AGUDA DE LINHAGEM AMBÍGUA
LEUCEMIAS AGUDAS DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL
MIELÓIDE??
LINFÓIDE??
LEUCEMIAS AGUDAS DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL
MIELÓIDE!!!
LINFÓIDE!!!
LLA-B
LLA-T
LMA-M0
OMS-2008 CLASSIFICAÇÃO DAS LEUCEMIAS LINFOIDES AGUDAS
1- Leucemia/Linfoma linfoblástico B
2- Leucemia/Linfoma linfoblástico B com
anormalidades genéticas: t(9;22), t(12;21),
t(v;11q23), t(1;19), t(5;14), hiper e
hipodiploide
3- Leucemia/Linfoma linfoblástico T
4- Leucemia/Linfoma linfoblástico NK
Leucemia / Linfoma Linfoblástico B
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD10 FITC ->
CD
20
PE
10 10 10 10 100 1 2 3 4
TdT FITC ->
CD
10
PE
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD34 FITC ->
CD
22
PE
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD34 FITC ->
CD
38
PE
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD34 PE ->
CD
45
Pe
rCP
Esquema de Diferenciação da Célula B Normal
Gate emCD19+
LLA – B
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD34 FITC ->C
D38 P
E -
>
LLA-B Pré-B
• cyIgMμ(mu)+
• CD19+, CD10+, TdT+
CD20-/+d, CD45++,
CD34-/+, smIgM
• t(1;19)
20-25% em crianças
• Não específico
LLA-B 11q23
• CD19+, CD10-,
CD15+, CD20-,
CD34+, CD65+, 7.1+
• 11q23, rearranjo MLL
• Sensibilidade: 95%
• Especificidade: 85%
Khalidi, HS et al, Am J Clin Pathol, 111:467, 1999
LLA-B Comum
Ph+
• CD19+, CD10++,
CD20+, CD34++,
CD38-/+fr, CD13+fr
• t(9;22)
• Adultos
• Sensibilidade: 100%
• Especificidade: >90%
Leukemia, 15:406, 2001
LLA—PH+
CD10++
CD38-/+
CD34++
CD13+fr
LLA-L3 ou Linfoma de Burkitt
• FSC alto
• CD19+, CD20+,
CD22+, CD10+, TdT-
CD34-/+, mIgM+
Kappa ou Lambda+
• Neoplasia de célula B
madura
LLA-L3 ou Linfoma de Burkitt
FSC
CD19
CD79a IgM LAMBDA
CD
34
CD
10
CD45
Leucemia /Linfoma Linfoblástico T
cyCD3+, CD7++, TdT+,
CD1a-/+, mCD3-/+, CD4-/+,
CD5-/+, CD8-/+, CD10-/+,
CD34-/+
Leucemia/Linfoma de Células NK
• São raros tanto em adultos quanto em crianças
• Diagnóstico diferencial com Leucemias de células dendríticas
• Imunofenótipo: cyCD3-, CD2-/+, CD4-/+, CD5-, CD7-/+, CD8-/+, CD16-, CD56+, TdT-, CD11b-/+, CD13-/+, CD33-/+, HLA-DR-/+.
OMS-2008 CLASSIFICAÇÃO DAS LEUCEMIAS MIELOIDES AGUDAS
1- LMA – FAB ou não especificada
2- LMA com anormalidades genéticas: t(8;21), t(15;17), inv16 ou t(16;16), t(9;11), t(6;9), inv3 ou t(3;3), t(1;22).
3- LMA com alterações relacionadas com Mielodisplasia
4- Neoplasias mieloides relacionadas a terapia
5- Sarcoma mieloide
6- Proliferações mieloides associadas a S. Down
7- Neoplasia de célula dendrítica plasmocitoide
OMS-2008 CLASSIFICAÇÃO DAS LEUCEMIAS MIELOIDES AGUDAS
Classificação FAB ou Não especificada
LMA-M0 ou com diferenciação mínimaLMA-M1 ou sem maturaçãoLMA-M2 ou com maturaçãoLMA-M4 ou mielomonocíticaLMA-M5 ou monoblástica/monocíticaLMA-M6 ou eritroideLMA-M7 ou megacarioblásticaLMA-M8 ou basofílicaPanmielose aguda com mielofibrose
Leucemia Mieloide Aguda
cyMPO+, CD13+, CD33+,
CD34+, CD117+, HLA-DR+,
CD7-/+, CD11b-/+, CD15-/+
cyMPO negativa: M5,
M6, M7, basofílica,
dendrítica
CD45
CD34
CD
13
LMA com anormalidades
citogenéticas recorrentes
• t(15;17)
• inv(16) ou t(16;16)
• t(8;21)
• 11q23
• t(9;11)
• t(6;9)
• inv (3) ou t(3;3)
• t(1;22)
LMA com t(15;17)
• cyMPO+, CD15-
CD13 heterogêneo
CD33 homogêneo
CD34-/+, HLA-DR-SSC alto
• 5-8% dos casos
• Hipergranular/Típica
Hipo/Microgranular
Orfao, A et al, Haematologica, 84:405, 1999
LMA—M3 com t(15;17)
AUTOFLUORESCÊNCIA cyMPO++
DR negCD34 negCD33 homoCD13 het
SSC/CD45
LMA com inv(16) ou t(16;16)
• Mieloblastos:
cyMPO, CD13,CD33,
CD34, CD117
• Monoblastos: CD4,
CD14, CD15, CD36,
CD64, CD68
8-10% dos casos
LMMA c/ eosinofilia
Número variável
LMA—M4 com inv 16
Eosinófilos:12,4%
Mieloblastos:36,0% Monoblastos:
28,2%
NEOPLASIA DE CD PLASMOCITÓIDE
FSC alto
DR++CD123++CD4+
CD45++MPO neg
CD56+
OMS-2008 CLASSIFICAÇÃO DAS LEUCEMIAS AGUDAS AMBÍGUAS
1- Leucemia aguda indiferenciada
2- Leucemia aguda de fenótipo misto B/Mieloide
3- Leucemia aguda de fenótipo misto T/Mieloide
4- Leucemia aguda de fenótipo misto com t(9;22)
5- Leucemia aguda de fenótipo misto com t(v;11q23)
LA de Linhagem Ambígua
Escore Linfóide B Linfóide T Mielóide
2 CyCD79a CD3(cy/m) MPO
CD22,IgM TCR
1 CD19 CD2 CD117
CD20 CD5 CD13
CD10 CD8 CD33
CD10 CD65
0,5 TdT TdT CD14
CD24 CD7 CD15
CD1a CD64ESCORE > 2
Grupo EGIL, Leukemia, 12: 2038, 1998
LA de Linhagem Ambígua
MPO-, cyCD22+d, CD33+d
Doença Residual Mínima
LLA-T
CD7
CD7
CD3
CD3
CD34
CD34
BLASTO: 78,9%
LTN: 11,1%
BLASTO: 0,04%
LTN: 9,37%
A ACURÁCIA NA ESTRATIFICAÇÃO DIAGNÓSTICA DAS LEUCEMIAS AGUDAS LEVARÁ AO MELHOR
MANEJO TERAPÊUTICO
HOSPITAL DE CLÍNICAS DA UFPR
EQUIPE DE IMUNOFENOTIPAGEM
Ana Paula de AzambujaEdna MartinsEliana L LimaElisa NovelloJuli PimentelMaria Tadeu L RochaMiriam P Beltrame Noeli T SilvaSuély K WeissJuliana Y Suzuki
OBRIGADA