IN screening drugs, determination of LD50 (the dose which has proved to be lethal (causing death) to 50% of the tested group of animals) is usually an initial step in the assessment and evaluation of the toxic characteristics of asubstance. It is an initial assessment of toxic manifestations (provides information on health hazards likely to arise from short-term exposure to drugs) and is one of the initial screening experiments performed with all compounds.Data from the acute study may: (a) Serve as the basis for classification and labelling; (b) Provide initial informationon the mode of toxic action of a substance; (c) Help arrive at a dose of a new compound; (d) Help in dose determination in animal studies; (e) Help determine LD50 values that provide many indices of potential types of drug activity.Aim of acute toxicity testTo determine the therapeutic index, i.e. ratio between the lethal dose and the pharmacologically effective dosein the same strain and species (LD50/ED50). The greater the index, safer is the compound. LD50 with confidence limits is to be established on one common laboratory species such as mouse/rat using the standard method. The LD50 dose thus found was administered to guinea pigs, rabbits, cats or dogs on weight basis (on basis of relative surface area gives better results).To determine the absolute dose for a species in the column, the absolute dose given to the species in a row was multiplied by the factor given at intersection of the relevant row and column (Table 1). Because of species variation, several species of animals (one rodent and one non-rodent) were used to determine LD50. When a clearly different response was observed in any of these species, a larger number of that species needs to be tested to establish the approximate LD50 value1. Test procedureThe test substance was administered orally/intraperitoneally in graduated doses to several groups of experimentalanimals, one dose being used per group. Dose selection: This is based on the results of a range finding test. Animals showing severe and enduring signs of distress and pain were killed after anaesthesia. Animal selection: (i) Species and strain Two species were selected, one rodent and other non-rodent, because species differ in their response to toxic agents. Animals were obtained from random breeding in a closed colony,because the aim was to discover new and unexpected effects of a drug in groups of animals of wider variability or F/1 hybrids of two inbred strains2. (ii) Number and sex of animals At least five rodents were used at each dose level. They were all of the same sex.After completion of the study in one sex, at least one group of five animals of the other sex was dosed1,2. The females were nulliparous and non-pregnant1. In acute toxicity tests with animals of a higher order than rodents, theuse of smaller numbers may be considered. A drug effect that is seen in say, both a rat and a dog, probably involvesa common physiological mechanism that is likely to be present in humans. Whereas an effect seen only in one ofthe two species indicates that it is peculiar to that species and is less likely to be present in the third species1.(iii) Age If a compound is to be administered in infants under six months of age, the LD50 values in newborn ratsunder 24 h of age, were compared with those of mature rats in order to assess any difference in sensitivity due toage1.Assignment of animals Each animal was assigned a unique identification number. A system to assign animals to test groups and control groups randomly is required. Housing Animals were group-caged by sex, but the number of animals per cage must not interfere with clearobservation of each animal. The biological properties of the test substance or toxic effects (e.g. morbidity, excitability, etc.) may indicate the need for individual caging. Administration The compound was administered once1, orally or parenterally, to rats that have been fasted for18 h. Dose levels and dose selection:The substance used in the toxicity tests should be as pure as the material eventually to be given to humans3.At least three to four dose levels were used, spaced appropriately to produce test groups with a range of toxiceffects and mortality rates. The data should be sufficient to produce a dose-response curve and permit1,2an acceptable estimation of LD50.If the lethality of the groups is such that only one group has a lethality falling between 4 and 6 probits, moregroups may be required3. Solvent Where necessary, the test substance was dissolved or suspended in a suitable solvent.Volume: This depends on size of the test animal. In rodents1,4, it should not exceed 1 ml/100 g body weightmaximum of 50 ml/kg. Injection was given slowly and uniformly. This will avoid undue killing by a drug havingpredominant action on the CNS/heart1. Route of administration: The LD50 value depends on the route of administration. Usually the values are found to increase with the following sequences of routes: intravenous,intraperitoneal, subcutaneous and oral3. The intravenous route is preferable to the intraperitoneal route (because many drugs get detoxified by the liver if the intraperitoneal route is employed)1.Signs recorded during acute toxicity studies: These are increased motor activity, anaesthesia, tremors, archingand rolling, clonic convulsions, ptosis, tonic extension, lacrimation, Straub reaction, exophthalmos, pilo-erection,salivation, muscle spasm, opisthotonus, writhing, hyperesthesia, loss of righting reflex, depression, ataxia, stimulation, sedation, blanching, hypnosis, cyanosis and analgesia1.Observation period: After the test the animal is the sole occupant of the cage, with free access to food and waterduring the observation period of 12 h, and thereafter at intervals3. At the end of the test surviving animals were weighed and sacrificed. A gross necropsy was performed, all gross pathology changes were recounted. If necropsy cannot be performed immediately after the death of the animal it should be refrigerated to minimize autolysis. Necropsies must be performed no later than 16 h after death1,2.Before the actual LD50 determination, a pilot study was conducted on a small group of mice mainly to select thedose ranges for the subsequent study. The compound was administered intravenously to pairs of mice in ascendingand widely spaced doses. The injected mice were observed continuously for 2 h and then occasionally for further4 h, and finally overnight mortality was recorded. The dose killing one out of two mice in such experiments givesan approximate estimate of LD50. In another method each dose was given to one animal only, and LD50 estimated from the mean of the logarithms of the smallest effective dose and the largest ineffective dose1.A simple method is the up and down or the staircase method. Two mice were injected with a particular dose andobserved for a period of 24 h for any mortality. The subsequent doses were then increased by a factor 1.5 if thedose was tolerated, or decreased by a factor of 0.7 if it was lethal. The maximum nonlethal and the minimum lethal doses were thus determined using only about ten mice1. Once the approximate LD50 or the range between themaximum nonlethal and minimum lethal doses was found, a final and more reliable LD50 assay was planned using atleast three or four dose levels within this range, with a larger number of animals in each group1.Calculation of LD50 for zinc sulfateFive animals in each group (inbred mice, 1012 weeks old) obtained from the Institutional Animal House, KasturbaMedical College, Mangalore were used. Arithmetical method of Karber4The interval mean of the number dead in each group of animals was used as well as the difference between dosesfor the same interval. The product of interval mean and dose difference was obtained. The sum of the product was divided by the number of animals in a group and the resulting quotient was subtracted from the least lethal dose in order to obtain LD50 value.LD50 = The apparent least dose lethal to all in a group

where N is the number of animals in each group, a the dose difference and b the mean mortality (Table 2).Disadvantage When we look back this was the dose which had not killed a single mouse; hence too manyanimals were unnecessarily sacrificed. Graphical method of Miller and Tainter4The observed percentage mortality was converted into probit referring to the probit table (Table 3). The valuesthus obtained were plotted against log dose. The LD50 value and its standard error were determined from thegraph, if the line was straight enough (Table 4). Transformation of percentages to probits was done based on the table of probits (Table 3). For 96%, the value that is present at the intersection of 90 on the vertical line on the left and 6 in the horizontal line on the top was taken. If decimal was present, e.g. 97.5, then the value against 90 and 7 + 90 and 8 was taken, and average of the two considered as the probit. The probit value was plotted against the logarithm of dose. The dose correspondingto 50% or probit 5 was taken as LD50. Disadvantage Too many animals had been utilized. Determination of median lethal dose (Lorke5)Phase 1: Three-groups of three mice/group. One dose was given to each group intraperitoneally. The treated micewere monitored for 24 h for mortality and general behaviour. Phase 2: After 24 h 34 groups of one mouse weregiven doses based on the findings of phase 1, intraperitoneally. The mice were again monitored for 24 h. Thegeographic mean of the least dose that killed mice and the highest dose that did not kill mice was taken as the median lethal dose6,7.Advantage Fewer animals were sacrificed. Disadvantage Accuracy, reproducibility and reliability are questionable.Recommended methodology(i) There could be only two animals per group. A wide range of doses can be tested, starting from the lowestdose, with increments of two (so that the minimum dose which is lethal to one rodent is not missed). (ii) At a time there should be not more than five groups (so that there are not many groups showing mortality). Mice were monitored for 24 h for mortality. (iii) If there is no mortality noted, the experiments was continued with another five groups. At no point of time there should be more than two groups showing >1 mortality. The lowest dose which had killed one animal and the highest dose which had not killed any animal was noted. The geographic mean of these two doses gave LD50. This is a simple and reliable method which uses lesser number of animals and hence unnecessary exploitation of animals is avoided. The research and development sector will have to spend less on animal maintenance and will.To determine the absolute dose for a species in the columns, multiply the absolute dose given to the species in a row by the factor given at the intersection of the relevant row and column. Thus an effect is produced in a 12 kg dog by a dose of 10 mg/kg; the absolute dose to the dog is 120 mg. Extrapolated to man by surface area, the effect might be expected at a dose of 120 mg 3.1 = 372 mg, as opposed to 700 mg, given by the ratio of weights2

DI skrining obat, penentuan LD50 (dosis yang telah terbukti mematikan (menyebabkan kematian) sampai 50% darikelompok diuji hewan) biasanya merupakan langkah awal dalam penilaian dan evaluasi karakteristik beracun darisubstansi.Ini adalah penilaian awal manifestasi beracun (memberikan informasi tentang bahaya kesehatan yang mungkin timbul dari paparan jangka pendek terhadap obat) dan merupakan salah satu eksperimen pemeriksaan awal dilakukan dengan semua senyawa.Data dari studi akut dapat: (a) Sajikan sebagai dasar untuk klasifikasi dan pelabelan, (b) Menyediakan informasi awalpada modus tindakan beracun dari zat, (c) Membantu sampai pada suatu dosis senyawa baru, (d) Bantuan dalam penentuan dosis pada hewan percobaan, (e) Membantu menentukan nilai LD50 yang menyediakan indeks banyak jenis potensial obataktivitas.Tujuan dari uji toksisitas akut Untuk menentukan indeks terapeutik, yaitu rasio antara dosis yang mematikan dan dosis farmakologi yang efektif di strain yang sama dan spesies (LD50/ED50). Semakin besar indeks, aman adalah senyawa. LD50 dengan batas keyakinan yang akan dibentuk pada satu spesies laboratorium umum seperti mouse / tikus menggunakan metode standar.Dosis LD50 demikian menemukan diberikan kepada kelinci percobaan, kelinci, kucing atau anjing secara berat (atas dasar luas permukaan relatif memberikan hasil yang lebih baik). Untuk menentukan dosis mutlak bagi spesies dalam kolom, dosis mutlak diberikan kepada spesies berturut-turut dikalikan dengan faktor yang diberikan di persimpangan dari baris dan kolom yang relevan (Tabel 1). Karena variasi spesies, beberapa spesies hewan (tikus satu dan satu non-tikus) digunakan untuk menentukan LD50. Ketika respon yang jelas berbeda diamati pada salah satu spesies, sejumlah besar spesies yang perlu diuji untuk menetapkan LD50 nilai1 perkiraan. prosedur ujiSubstansi uji diberikan secara oral / intraperitoneal dalam dosis lulus untuk beberapa kelompok eksperimentalhewan, satu dosis yang digunakan per kelompok.Dosis pemilihan: ini didasarkan pada hasil dari berbagai menemukan tes. Hewan menunjukkan tanda-tanda parah dan abadi penderitaan dan rasa sakit tewas setelah anestesi.Pemilihan Animal: (i) Spesies dan ketegangan - Dua spesies yang dipilih, salah satu hewan pengerat dan non-tikus, karena spesies berbeda dalam respon mereka terhadap agen beracun. Hewan yang diperoleh dari peternakan acak di sebuah koloni tertutup,karena tujuannya adalah untuk menemukan efek baru dan tak terduga dari obat dalam kelompok hewan variabilitas yang lebih luas atau F / 1 hibrida dari dua strain inbrida.(ii) Jumlah dan jenis kelamin hewan - Setidaknya lima tikus yang digunakan pada setiap tingkat dosis. Mereka semua jenis kelamin yang sama.Setelah selesai studi di satu jenis kelamin, setidaknya satu kelompok dari lima hewan dari jenis kelamin lainnya adalah dosed1, 2. Para perempuan yang nulipara dan non-pregnant1. Dalam uji toksisitas akut dengan hewan dari suatu tatanan lebih tinggi daripada tikus, yangpenggunaan angka yang lebih kecil dapat dipertimbangkan. Sebuah efek obat yang terlihat di mengatakan, baik tikus dan anjing, mungkin melibatkanmekanisme fisiologis umum yang kemungkinan akan hadir pada manusia. Sedangkan efek terlihat hanya di salah satudua spesies menunjukkan bahwa itu adalah khusus bagi spesies dan lebih kecil kemungkinannya untuk hadir dalam spesies ketiga.(iii) Umur - Jika senyawa adalah untuk diberikan pada bayi di bawah usia enam bulan, yang LD50 nilai pada tikus baru lahirdi bawah 24 jam usia, dibandingkan dengan orang-orang dari tikus dewasa untuk menilai perbedaan dalam sensitivitas karena usia.Penugasan hewan - hewan yang tidak diberi nomor identifikasi yang unik. Sebuah sistem untuk menetapkan hewan kelompok uji dan kelompok kontrol secara acak diperlukan.Perumahan - Hewan yang dikurung oleh kelompok-seks, tetapi jumlah hewan per kandang tidak harus mengganggu pengamatan yang jelas setiap binatang. Sifat biologis dari zat uji atau efek toksik (misalnya morbiditas, rangsangan, dll) dapat mengindikasikan kebutuhan untuk kandang individu.Administrasi - Senyawa diberikan once1, secara oral atau parenteral, untuk tikus yang telah berpuasa selama 18 jam.Dosis tingkat dan pemilihan dosis: Substansi yang digunakan dalam uji toksisitas harus murni seperti bahan akhirnya diberikan kepada humans3. Pada setidaknya tiga sampai empat tingkat dosis yang digunakan, spasi tepat untuk menghasilkan kelompok uji dengan berbagai efek toksik dan angka kematian. Data harus cukup untuk menghasilkan kurva dosis-respon dan permit1, 2 perkiraan diterima LD50. Jika mematikan dari kelompok adalah sedemikian rupa sehingga hanya satu kelompok memiliki lethality jatuh antara 4 dan 6 probits, kelompok lebih mungkin diperlukan. Solvent - Jika diperlukan, substansi uji dilarutkan atau disuspensikan dalam pelarut yang sesuai.Volume: Hal ini tergantung pada ukuran hewan uji. Pada rodents1, 4, tidak melebihi 1 ml/100 g tubuh maksimal berat 50 ml / kg. Injeksi diberikan perlahan dan merata. Ini akan menghindari pembunuhan yang tidak semestinya oleh obat yang memiliki aksi dominan di CNS/heart1 tersebut. Cara pemberian: Nilai LD50 tergantung pada rute administrasi. Biasanya nilai-nilai yang ditemukan meningkat dengan urutan sebagai berikut rute: intravena, intraperitoneal, subkutan dan oral3. Rute intravena adalah lebih baik untuk rute intraperitoneal (karena banyak obat bisa didetoksifikasi oleh hati jika rute intraperitoneal digunakan) 1. Tanda direkam selama studi toksisitas akut: Ini aktivitas motorik meningkat, anestesi, tremor, melengkung dan bergulir, kejang klonik, ptosis, ekstensi tonik, lakrimasi, Straub reaksi, exophthalmos, Pilo-ereksi, air liur, kejang otot, opisthotonus, menggeliat, hyperesthesia , hilangnya refleks meluruskan, depresi, ataksia, stimulasi, sedasi, blansing, hipnosis, sianosis, dan analgesia.Periode pengamatan: Setelah tes hewan adalah penghuni tunggal kandang, dengan akses gratis ke makanan dan air selama periode pengamatan 1-2 jam, dan setelahnya di intervals3. Pada akhir tes hewan hidup ditimbang dan dikorbankan. Sebuah nekropsi kotor dilakukan, semua perubahan patologi kotor yang menceritakan. Jika nekropsi tidak dapat dilakukan segera setelah kematian hewan itu harus didinginkan untuk meminimalkan autolisis. Necropsies harus dilakukan selambat-lambatnya 16 jam setelah death1, 2.Sebelum penentuan LD50 yang sebenarnya, pilot studi dilakukan pada sekelompok kecil tikus terutama untuk memilih rentang dosis untuk studi selanjutnya. Senyawa diberikan intravena untuk pasang tikus secara ascending dan dosis banyak spasi. Tikus yang disuntik diamati terus menerus selama 2 jam dan kemudian sesekali untuk lebih lanjut4 jam, dan kematian akhirnya semalam tercatat. Dosis membunuh satu dari dua tikus dalam eksperimen tersebut memberikan perkiraan perkiraan LD50. Dalam metode lain dosis masing-masing diberikan kepada satu-satunya hewan, dan LD50 diperkirakan dari mean dari logaritma dari dosis efektif terkecil dan terbesar dose1 efektif.Sebuah metode sederhana adalah 'naik turun' atau 'tangga' metode. Dua tikus disuntik dengan dosis tertentu dan diamati selama 24 jam untuk kematian apapun. Dosis berikutnya kemudian meningkat dengan faktor 1,5 jika dosis ditoleransi, atau menurun dengan faktor 0,7 jika itu mematikan. Maksimum mematikan dan dosis mematikan minimal dengan demikian ditentukan dengan menggunakan hanya sekitar sepuluh mice1. Setelah LD50 perkiraan atau kisaran antara dosis maksimum dan minimum mematikan mematikan ditemukan, alat tes LD50 final dan lebih handal direncanakan menggunakan setidaknya tiga atau empat tingkat dosis dalam kisaran ini, dengan sejumlah besar hewan di setiap group1.

Perhitungan LD50 untuk seng sulfatLima hewan di masing-masing kelompok (tikus inbrida, 10-12 minggu) yang diperoleh dari Animal House Kelembagaan, Kasturba Medical College, Mangalore digunakan.Aritmatika metode KarberRerata interval jumlah mati di setiap kelompok hewan yang digunakan serta perbedaan antara dosis untuk interval yang sama. Produk dari rata-rata interval dan perbedaan dosis diperoleh. Jumlah produk tersebut dibagi dengan jumlah hewan dalam kelompok dan kecerdasan yang dihasilkan dikurangi dari dosis yang mematikan paling untuk mendapatkan nilai LD50.LD50 = Dosis paling jelas mematikan untuk semua dalam kelompok

di mana N adalah jumlah hewan di masing-masing kelompok, perbedaan dosis dan b angka kematian rata-rata (Tabel 2).Kerugian - Ketika kita melihat kembali ini adalah dosis yang tidak membunuh satu mouse, maka hewan terlalu banyak yang perlu dikorbankan.Grafis metode Miller dan Tainter. Persentase Mortalitas diamati dikonversi menjadi probit mengacu pada tabel probit (Tabel 3). Nilai-nilai yang diperoleh diplotkan terhadap dosis log. Nilai LD50 dan standard error yang ditentukan dari grafik, jika jalur ini cukup lurus (Tabel 4).Transformasi persentase untuk probits dilakukan berdasarkan tabel probits (Tabel 3). Untuk 96%, nilai yang hadir di persimpangan 90 pada garis vertikal di sebelah kiri dan 6 di garis horizontal di atas diambil. Jika desimal hadir, misalnya 97,5, maka nilai terhadap 90 dan 7 + 90 dan 8 diambil, dan rata-rata dari dua dianggap sebagai probit tersebut. Nilai probit diplot terhadap logaritma dari dosis. Dosis yang sesuai dengan 50% atau probit 5 diambil sebagai LD50. Kerugian - Terlalu banyak hewan telah dimanfaatkan. Penentuan dosis yang mematikan median (Lorke5)Tahap 1: Tiga-kelompok tiga tikus / kelompok. Satu dosis diberikan kepada masing-masing kelompok secara intraperitoneal. Tikus diobati dimonitor selama 24 jam untuk kematian dan perilaku umum. Tahap 2: Setelah 24 jam kelompok 3-4 dari satu tikus yang diberi dosis didasarkan pada temuan dari fase 1, intraperitoneal. Tikus-tikus tersebut kembali dipantau selama 24 jam. Itugeografis berarti dosis paling bahwa tikus dibunuh dan dosis tertinggi yang tidak membunuh tikus diambil sebagai dosis yang mematikan median 6,7. Keuntungan - hewan sedikit dikorbankan. Kerugian - Akurasi, reproduktifitas dan keandalan dipertanyakan.Direkomendasikan metodologi(I) Hanya ada dua binatang per kelompok. Berbagai dosis dapat diuji, mulai dari dosis terendah, dengan penambahan sebesar dua (sehingga dosis minimum yang mematikan bagi salah satu hewan pengerat tidak terjawab). (Ii) Pada suatu waktu harus ada tidak lebih dari lima kelompok (sehingga tidak ada banyak kelompok menunjukkan mortalitas). Tikus dimonitor selama 24 jam untuk kematian. (Iii) Jika tidak ada kematian dicatat, percobaan dilanjutkan dengan lima kelompok. Tanpa titik waktu harus ada lebih dari dua kelompok menunjukkan> 1 kematian. Dosis terendah yang telah menewaskan salah satu hewan dan dosis tertinggi yang tidak membunuh binatang apapun tercatat. Mean geografis kedua dosis LD50 memberi. Ini adalah metode yang sederhana dan dapat diandalkan yang menggunakan jumlah yang lebih kecil dari hewan dan karenanya tidak perlu eksploitasi hewan dihindari. Sektor penelitian dan pengembangan akan menghabiskan kurang pada pemeliharaan hewan dan akan.Untuk menentukan dosis mutlak untuk spesies dalam kolom, kalikan dosis mutlak diberikan kepada spesies berturut-turut oleh faktor diberikan di persimpangan dari baris dan kolom yang relevan. Jadi efek diproduksi di anjing kg 12 dengan dosis 10 mg / kg, dosis mutlak untuk anjing adalah 120 mg. Diekstrapolasikan ke manusia dengan luas permukaan, efeknya mungkin diharapkan pada dosis 120 mg 3.1 = 372 mg, sebagai lawan dari 700 mg, diberikan oleh rasio bobot