In vitro DNA AMPLİFİKASYONUPCR

Doç.Dr.Öztürk ÖZDEMİR

In vitro DNA Amplifikasyonu

1- Moleküler klonlama, DNA parçalarının, bakteri gibi basit yapılı

organizmalarda çoğaltılmasıdır.

Bu yöntemde çoğaltılacak hedef DNA,

vektör adı verilen ekstra kromozomal DNA molekülüne

(plazmid) transfer edilir.

Oluşan rekombinant plazmid ise uygun bir bakteri hücresine

sokularak bakterinin çoğaltılmasıyla in vivo olarak amplifiye

edilmiş olur

http://www.nobel.se/chemistry/laureates/1993/mullis-autobio.html

Kary Mullis c1983

POLYMERASE CHAIN REACTION - PCR

2. DNA’nın çoğaltılabileceği bir teknik, 1983 de Kary Mullis adlı bir biyokimyacının geliştirdiği Polimeraz Zincir Reaksiyonu’dur. İlk kez başarılı in virto DNA amplifikasyonu Saiki ve ark. Tarafından 1985 yılında gerçekleştirildi.

• Amplifikasyon yöntemlerinin gelişmesinde iki önemli nokta

– termofilik Thermus aquaticus ‘tan ısıya stabil DNA polimeraz

– bilgisayar kontrollü termal döngü cihazlarının geliştirilmesi

PCR’nun Kullanıldığı Alanlar

PCR’nin geliştirilmesi, moleküler biyoteknolojinin ve kullanım

alanının da genişlemesine yol açmıştır

•Moleküler biyoloji ve biomedikal araştırmalar

•Bakteriyel, viral, fungal ve protozoal hastalık etkenlerinin teşhisi

•Gıda, su ve yiyeceklerde bulunan mikroorganizmaların tanısı

•Genetik bozukluklar ve kanser taramaları

Prenetal tanı ve cinsiyet belirlenmesi

Gen tedavisi ve DNA aşıları

Adli tıp’da suçlu teşhisi

Antropoloji

PCR’nun Çalışma Prensibi

PCR küçük volumlar halinde hazırlanır(0.5 ml’lik mikrofüj tüpüne, 100 ml hacminde materyal konur)

PCR için gerekli malzemeler:

1- Hedef diziyi taşıyan kalıp DNA

(az miktarda ve ilgisiz DNA’larla kontaminasyon sorun

değildir)

2- Kalıp DNA çift iplikleri ile eşleşebilen 2 tür

oligonükleotid primeri (15-30 bazlık ve tek iplikli)

3- Dört tür dNTP (dATP,dCTP,dGTP,dTTP)

4- Termostabil DNA polimeraz enzimi (Taq, Vent)

Bu materyaller bir tampon çözeltisi içinde karıştırılır.

MgCl2 gereklidir.

Thermal Cycler adı verilen özel bir cihaz kullanılarak

DNA’nın amplifikasyonu gerçekleştirilir.

Bu cihaz, PCR örneğini programlanan ısı derecelerinde ve

istenilen sürelerde tutmaya yarar.

Her bir PCR döngüsü üç aşamada gerçekleştirilir.

1- Hedef DNA’nın denatürasyonu (95 oC de 5 dak.)ds DNA’ nın birkaç saniyede ısı ile ss DNA’ ya ayrılmasıdır. (döngüye başlamadan 3-5 dk ön ısıtma yapılabilir)

2- Primerlerin bağlanması (42-52 oC de 5 dak.)

örnek 1-2dk bu ısıda tutularak primerlerin (spesifik sentetik oligonükleotitler) ss DNA’ daki hedef bölgelere hibridizasyonu sağlanır.

3- Polimerizasyon (65-72 oC de 5 dak.)

polimeraz enzimi yardımı ile ss DNA kalıplarına bağlanan primerlerin 5’ 3’ yönde uzatılmasıdır.

Her döngüde elde edilen yeni DNA’lar bir sonraki için kalıp görevi

gördüklerinden, 25-30 döngü sonunda, DNA’nın milyonlarca kopyası elde

edilir.

• Taq DNA polimeraz optimal uzama sırasında yani 72-78 °C arasında 2000 nükleotid/dakika hızında çalışır.

Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction

5’ 3’

3’ 5’

DNA

3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’

>90°

• In vitroIn vitro DNA (gene) amplifikasyon tekniği DNA (gene) amplifikasyon tekniği

5’ 3’

3’ 5’

40–60°

Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction

5’ 3’

3’ 5’

72°

Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction

5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’

72°

40–60°

>90°

Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction

72°

40–60°

>90°

5’ 3’

3’ 5’

Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction

72°

40–60°

>90°

Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction

Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction

2n x

PCR: 3 steps

PCR’nun Avantajları

Çabuk

Duyarlı

Yüksek özgüllüğe sahip

PCR’nun Dezavantajları

Pahalı

Kros reaksiyonlar/non-spesifik DNA amplifikasyonu Sterilite

Yalancı pozitif/negatif değerlendirme Deneyimli personel

Her teknikte olduğu gibi PCR’da da optimizasyon şarttır.

Yüksek özgüllüğü ve duyarlılığına rağmen;

düşük ürün miktarı

primerlerden kaynaklanabilen non-spesifik ürün eldesi

kontaminasyon sonucu yalancı pozitif sonuçlar

gibi sorunlar yaşanabilmektedir.

İyi bir teknik kadro ve pozitif/negatif kontroller kullanılarak bu

sorunlar giderildiği taktirde PCR, biyoteknologların hayatını

kolaylaştıran bir tekniktir.

PCR ile Saptanan Bakteriyel Patojenler

•Bacillus antracis

•Corynebacterium diphtheriae

•Shigella sp

•Vibrio cholerae

•Mycobacterium avium

•Mycobacterium tuberculosis

PCR ile Saptanan Viral Patojenler

•Hepititis A,B,C,E,G

•İnsan papillomavirus

•HIV-I,II

•Influenza virus

•Rubella virus

•Herpes simplex virus

PCR ile Saptanan Fungal Patojenler

•Blastomyces dermatitis

•Histoplasma capsulatum

•Candida albicans

•Pneumocyctis carinii

PCR ile Saptanan Protozoal Patojenler

•Plasmodium falciparum

•Leishmania sp

•Toxoplasma gondii

•Trypanosoma sp.

Amplifikasyon Ürünlerinin Tespit Edilmesi

• PCR ile amplifiye edilen DNA’yı tespit etmenin bir yolu :

»Elektroforez

Elektroforez prensibi

powder

+ ion

Cathode Anode

• DNA proteinler ve birçok biyomoleküller gibi elektriksel yük taşır.

• DNA negatif yüklüdür.Bu nedenle anoda doğru hareket eder.Yükleme katod tarafına yapılmalıdır.

• DNA molekülleri şekilsel ve elektrik yükü bakımından benzer olduğundan elektroforez kriterlerine göre ayrılmaz

• DNA molekülleri büyüklüklerine göre ancak bir jel içinde ayrılabilirler.

• DNA molekülleri genellikle agaroz ya da poliakrilamid jel içinde elektroforez edilir.

• Jellerin içerisinde DNA moleküllerinin girip hareket edebilecekleri porlar vardır.

• Elektroforez ile ayrılan DNA’ yı görmek için ise etidyum bromid ile boyanır.(UV boya)

PCR - analiziJel-elektroforez

PCR: Viral detection

Tüm Aşamaları Özetleyecek Olursak

Thermal Cycler Elektroforez

Ürinlerin değerlendirilmesi

(Agaroz jel)

UV translüminatör

3-4 hours