10
In vitro tolerance to Botrytis cinerea of grapevine 41B rootstock in transgenic plants expressing the stilbene synthase Vst1 gene under the control of a pathogen-inducible PR 10 promoter P. Coutos-The  venot 1,4 , B. Poinssot 1 , A. Bonomelli 1 , H. Yean 1 , C. Breda 2 , D. Buffard 2 , R. Esnault 2 , R. Hain 3 and M. Boulay 1 1 LVMH-Recherche: Moe È t et Chandon, 20 Avenue de Champagne, BP 140 51333 Epernay Ce  dex, France 2 Institut des Sciences Ve  ge  tales, CNRS, Avenue de la Terrasse, 92198 Gif sur Yvette Ce  dex, France 3 Bayer AG, PF-EuFu, Institut fu È r Biotechnologie, D-5090 Leverkusen 1, Germany Received 4 September 2000 ; Accepted 6 November 2000 Abstract Resveratrol is a major phytoalexin in grapevine but its synthesis in response to phytopathogen attack decreases with grape berry ripening. A chimeric gene combining an alfalfa PR 10 promoter and Vst1Vitis stilbene synthase 1) gene was introduced into the genome of 41B rootstock. Transgenic plants were analysed for resveratrol production in leaves infected with Botrytis using an in vitro test. Among the 50 transgenic lines analysed, some exhibited a production lower than the non-transgenic control, but others accumulated resveratrol from 5 ±100-fold. Moreover, in the latter clones, symptoms were highly reduced in response to infection. These results were a good indication that the combination of a pathogen- inducible promoter and a defence gene may increase tolerance against fungi in grapevine. The efficacy of this approach should be further tested by experiments conducted in the vineyard. Key words: Grapevine, Botrytis, stilbene synthase, inducible promoter, `PR' proteins. Introduction Botrytis cinerea, which results in grey mould, and Eutypa lata, which is responsible for wood decay, are two fungi that cause serious diseases for grapevine, an important crop in wine-producing countries. Phytochemicals are largely used to reduce the impact of phytopathogens, but only a few compounds are effective on Botrytis and phytochemical treatments may also have a deleterious ecological impact on the vineyard. In addition, genetic variation of Botrytis under selective pressure leads to the appearance of resistant strains. Since there is no curative chemical treatment against Eutypa lata, infection results in plant death. Therefore, to obtain grapevine varieties resistant to these pathogens is a challenge for the future, but it is also important to keep the qualities of the must, which determine the speci®city of each wine. This speci- ®city is partly due to the use of some varieties precisely de®ned in the A.O.C. Appelation d'Origine Controle Âe) countries. Resistant varieties might be obtained by genetic crossing with wild species, but this method is too cumber- some and long, especially for woody plants, and it may result in taste alterations. Ef®cient tools for the regenera- tion of plants via somatic embryogenesis and genetic transformation of embryogenic cells using Agrobacterium are available for different varieties of grape Coutos- The Âvenot et al., 1992a, b, Mauro et al., 1992, 1995a, b; Maes et al., 1997). It is now possible to transfer resist- ance genes to the genome of these varieties Boulay et al., 1997). Defence mechanisms in grapevine are not well understood, but some relevant genes have been identi®ed. The production of phytoalexins such as stilbenes is one of the major defence pathways which has been shown to 4 Present address and to whom correspondence should be sent: Laboratoire de Physiologie et Biochimie Ve  ge  tales, ESA CNRS 6161, Universite  de Poitiers, UFR Sciences, 40 avenue du Recteur Pineau, 86022 Poitiers Ce  dex, France. Fax: q33 5 49 45 41 86 Journal of Experimental Botany, Vol. 52, No. 358, pp. 901±910, May 2001 ß Society for Experimental Biology 2001

In vitro tolerance to Botrytis cinerea of grapevine 41B rootstock in

  • Upload
    others

  • View
    6

  • Download
    0

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: In vitro tolerance to Botrytis cinerea of grapevine 41B rootstock in

�� ����� ��������� �� ������ ������ � ����� ��

��� ��������� � ������� � ������ ������� � ���

�� ����� �������� ��� ��� ����� ��� ������� �

� �������� ���� ��� �� �� ��������

�� ������� ��! ������"�" �� �� ������" #� �������� �" $� %����" �� �����&" '� �����&"�� (������&" �� $� �) ��� *� �������

� ������������ ��� � �� ������� �� ������ �� ��������� �� ��� �!!! "����# ��$ ��%� &����� '�(�)��� ��( *�)����( ��$ ��$ ��+�(� �,�*� ������ �� +� -��((�� .��./ 0)1 (� 2����� ��$ ��%� &����� ��#� �0� �&�"�&�� '�(�)��� 1� �)������+��)�� 3� �.� ����4�(�� �� 0����#

������� ��� ����� ���� � ����� � � �������� ����

#�������

����������� � � ��+�� ��������� � � ����� �� ��� �� ������� � � �������� �� ������������ ��������������� , �� ���� ����� � ��� �� # �� ��� � ������� � � �� ����� �� �� �������� ��� ��� -������ ����� �������� �. ��� ,�� ��������� ��� �������� � ��� ���������� ������ � ������ ,����������� �� ����������� ������� �� � ������ ������, �� ������ �� � �� �� ����� ����� #��� ���/� ������� � � ��� ��������" ���� ��� � ��� �������� �� ��,�� ���� ��� ����������� � �������"��� ������ ����������� ����������� ��� /0��������*�������" � ��� ������ ������" �������� ,��� � ���������� � �������� �� ���� ��� ���� ������� ,��� ���� �� ��� �� ���� ��� ���� ��� �� � � �������� ���� ��� �������� ��� � ������ ��� ��� ���������������� �� ��� �� � ����� ��� �� � ���� ��� � �������� ������ �� ������ ������ �� ����� �������������� � ��� � �������

��� ����� ���������� ���#�)(� � � ���� ��� !���� ��"��� �

����� ��� #$�% ��� ����&

1�������� ��

�������� ����� ����� ����� �� ��� ���� ��� � ��������� ����� �� ���������� ��� ���� ������ ��� ��� �� �

���� ���� ������ �������� ��� ��������� �� ������������� �� ������������ ��������� ������������� ����� �� ��� �� ����� ��� ������ �� ���������� ���� ����� � ��� �������� ��� ��������� �� �������� ��������������� ���������� ��� ��� ���� � ������������� ��� ������ �� ��� ��������� �� ��������� ��������������� �� �������� ���� �������� ������� ���� �� ������������� �� ��������� �������� ����� ����� �� �� �������������� ��������� � ����� � ���� ����� ��������� ������� ���� ������ ���������� �� ������ �������� ������������������ �� ����� ����� ��� �� � ����� � ��� ��� ������� �� �� ��� ��������� �� ���� ��� ������� �� ��� ��������� ��������� ��� ���������� �� ���� ����� ���� ����������� �� ����� �� �� ��� �� �� ���� ��������� �������������� �� ��� �!�"� # �������� �$!�� ��� "������%�&��������� '�������� ��������� �� �� �� �������� �� ������������� ���� ��� �������� �� ���� ������ �� ��� ���������� ��� �� � �������� ��� ����� ������ ��� �� ������� �� ����� ����������� (������� ���� ��� ��� �� ���������� �� ����� ��� ������� ������ ������ ��� �������������������� �� ������ ���� ��� ��� ���������� ���� ������� ��� ��������� ��������� �� ���� #"��������%����� � ���� )**+�� �� ,��� � ���� )**+� )**-�� �.,��� � ���� )**/&� �� �� ��� ������� �� �������� ����������� ���� �� ��� ����� �� ����� ��������� #0��� � ����)**/&� 1������ ���������� �� �������� ��� ��� ������������ �� ���� ������� ���� ���� ���� ������������� ��������� �� �������2��� ��� �� �������� �� ����� ��� ��3�� ������� �������� ����� ��� ���� ����� ��

$����� ����� �� � �!�� ������������� �!�" �� ��� � '����� ���� � $!���� �(�� � )���!���� *�+ (�+ � ��� ,�� -��� ����� .������� �+ �

$�� ����� ./� ��������� � ����"� " ��� �"� $����"� 0���� $�� ���� -�+ �1� /�����& /�1� ��� 2 3 2 � 0�

5����+ �1 "%��)�����+ �����#� ��+6 �� ,�6 ! /� ��6 .��7.��� ��# ����

� ����� � 4�� ,1������� � )�� �(� ����

Page 2: In vitro tolerance to Botrytis cinerea of grapevine 41B rootstock in

���� �� ���� #4�� ���� ��� ������ )*//. 4�� �����)*5). ���� ��� ��6��� )**7. ��6�� ��� ����� )**-. ����� � ���� )**8� )**/. "��������%����� � ���� )**5&����� ��������� �� �������� �� � ��� ��6���� ���������������� ����� ���� � �� � ��� ���� ����� #9����� ���� )**:&� ����� ���� ������� ����� �����2������� �������� �������� ��� ���� ���� ���� ���������� � ������������� #;��� � ���� )**<. =������ ��� ;���� )**:&�������� �������� ��������� ����� ����� "� ���������� ��� ����� �� "����� "� �� ������ ������������ ���� ������� ������� �� �������6��� �������� ����������� #������6�����&� ������������ #����������&

��� ������� � ���������� ������ #=� � )&� ����� ��������� ��������� ��� ��3�� ����� �� �������2��� �� ����� '��������� ��������� ���������� ���������)8 ����� �����>������ #0��� � ���� +777&� ��� �� ������ 3�� ������ �������� ���� �������� ��� �� �� ��� ��������� �� �������� ����������� ����� ��� ���������� ���� ��������� ��������� �� ������ "� �������� "� �� ���� ����������� ������� ��������������� ��� ������� �������� ��� ��� ���� ���������#=������ � ���� )**/& #=� � )&��� ��� ���� ���������� ��� ����� ������� �� ���)

���� �������� #9���� � ���� )**:& ��� ���� ���� ��

���� �� ������� ��� ������� ������������ �������� �� ���� ��� ��3�� ���������� ������� ���� �����������

3�� �����(�-�$ ����� � � &

Page 3: In vitro tolerance to Botrytis cinerea of grapevine 41B rootstock in

� �� ��������� �������� #"������������� � ���� )**5.(���� � ���� )**5&� ��� �������� ��� ���� � �� ����� )7 �' #����� ������ ������� ��������� �����?*558/& ��� �2������� �� ����� ��� ���������������������� ���� �� ������ ������ ��� ���� #(����� ���� )**<. 0���� � ���� )**8&� ���� ������ ��������������� ��� ���������� � �������� ���� �������� �� ������� ������� �� � ����� ���� �� ��������� ���� �������� ������� ���� ���������� � ��� ���� �������� �� ����������������� ��������� ��� ��� �2���� �� ���������

*���� ��� ��� �������

&���)

��� �������� ���� ������ *)8� #0 1���� �@' � 0�����2&��� ��� � ���� ���� 0A )+< 5 � ������ #B� ������ (@� ,��@' � ,��������& ���� ������� �� *�- �� ����� ������ ����+7 � ��������� �� C5 ���� ����� #��������� �� �����3��� C5& ���������� ���� - �) A;+�!:� <7

�) ������ �� #�; 8�7& ��� ������� ���� ������ "������ ���������� �� �������� ��� �������� �� �2����� ����� ������ �� ���� ���

&����( ��8� )�)9)�)��

�� � ����� ��� ����� �� ��� ������ �� � ����� ������������� � ����� �� ���� ����� #)- �) ��� �2������+7 �) ����� � ��� �; 8�7& ���������� ���� ��������� ��������������� �� ����������� �����6�� �� ������ #)� ���������������� �� ��� ����� �� ���� �����&� ��� ��������� ���������� ���� ��� ���� ������� �� ������� =� � ����� ��� �2������� �� ��� �������� �� ��� ������ ��������� ���� ��� ����� ������ D����� ���������� ��� �������� �� ���������� ���� ��� ������ ������ ��������������������

0��� ���(1����)�� ��� ��+��� ����)�)��(

��� :)0 ��������� #����� ������ ��� "������������� ��������� & ��� ������ �� �� �2��������� ����� � ������ ������ ��������� ���� ��� ��������� �� ��������� ��������#,��� � ���� )**+� )**-�&� ���� �� ��������� ��� �������� ���� ���� �� +- � �� ������� ,� ���� ���� �����#"������������� � ���� )**+�& ���������� ���� ����������2�� #�������2� ������ ����� @! � ) � �)& �� ��� �����(����� ���� ��� ���� ����������� ��� �� ���������� ������������ ������ #,��� � ���� )**-�&� ��� ����� ���������� ����� ���� ������� ���� �� �������� �� ������� ������� ������ #"������������� � ���� )**+�& ��� ����� ���� ��� ����� ���������� �� (��� ����� ���� ��� ������� ���� ��������� ���������� � ������� ����� ����� ��������� ���� ����������� ��������� #-7 ��������� ����� ��� ���������������2��������&�=�� � ��� �2��������� ��������� ����� ��������� ���� �����

��� ��� ������� ������������� ���� ������� �� ������������������� � �� ,� ���� ����� #,����� � ��� ���� �)*8+& ���������� ���� /�- �) � ��� �; -�5 ��, D(@� �

��2�� #�� ��&� ��� ���������� � ���� ���������� ��� :- ��� +: �" ���� ��� ��� ��� )5 �" �� �� ��� )8 � � �� ��+-7 �( ��+� ��� ��� ����� �������� �� ���� ��� ���� ��� ����2����������

�)��)� ��� �9)��)� (��((�(

���������� �� �������� �������� ���� �� ������ ��� ������� �� ��������� �������� #(���� � ���� )**<&� D������������� �� �������� �� ����������� �� EC � �� ���� ����������� ��� ��������� ����� #���� ����&� ����� ���� ��� ���������� :-����� ������ =�� �������� ���������� +- � �� ���������������� #)7: ������� ��)& �� )- �) ��� �2����� ��� 7�) , ���� ����� ���� �������� �� ��� ������ �� ��� �������� � ���������� ��� ����� ���� �������� � ����� ��, D(@� � ��2�� #�� ��&� ���� * � �� ���������� ����������� ����� ���� �2������ ���6�� �� ���� ����� �� ��������� �� �57 �"� ������ ������ ��� �������� �� ���������� ��������� ���� ���� EC � �� �� +-: �� ��� 5 ��� ���� �� ���� � ��+/7 �9 ��+� ������ ���� ������� )/ � ����� ����������� ����������� ������

��(�����+ :����)1)���)��

=��6�� ����� ���� ���� ���� � ������ ��� ����� �� ��������� �� ��� ���������� ��� �2������� ���� ) � �� ���������� )77 � =9� ��� ��������� ��������� ��� ����������� ��(�������� ���� ��� ������� �� )7 ��� �� )< 777 �� �� ���������������� ��� ���������� ��� ������ ���� � � ���������

"�)5 ������� � #9������ E� & ���������� ���� �������� ��������� ��� ���������� ���� ����� �� >2 ��� ��� �2����� ��������6�� �� ) � �� ������� ��� ������� �� ������������ � ,��2 =D� 7�++ �� #,������& ������ ;�4" ��������'��������� ��� �������� ���� �� ;�4" ������ #,����

4�-+77& ����� �� �� �������� ��3����� #,��� ��:777 �4&������� #+- � �� ����& ���� ����� ���� � ����� "�)5 ������������ ���� #A������ "�)5� +-7�< ��� - ��& �������������� �� ������������;+! #-�*- ���& ����� ����� #������ & ��� >�� ���� �� 7�5 � ����)� ��� ���� ������ ���� �������� � ���� ������� �� ������ 0 #������������;+!� *-�- ���&���� ������� ��� ������ �������� �� ��� ������ �����F7G)7 ���� <-� �� 0. )7G+7 ���� -7� �� 0. +7G<7 ���� 57��� 0� (���� ��� ��������� �� !1 ��� <7- ��� ��� ���������������� �� ����������� H����������� ��� �������� �������3������ �� ��������� ��������� �� <�:�-���������2�������������� #**� �����&� ��� ����� ���������� #�� ��& �� ��������� ��� ���������� ���� �� � ������� �� ���� ����� ���� �����'���� ���� �2������� �� � �� ���������� �) 19� �� ����������� ���� ������������ �� ����������� ��� EC ����������������� ������� +77 ��� :77 �� #����� ����� #9������ E� &����� �� ��� ;�4"& �� ���� ���� ���� ��� �������� ������� ������� �������� ���� ��� ��������� ���������

�,� 9+��(

���� '@ � ���� �2������� ���� ) �� ����� �������� �� ��������� ��������� ������ #������I�� ��� C����� )**)&� 4��������� ���� �� ���� ����� �� �� � ��� ������ ��� ����� ���6�� �� �2�������� ����� #7�+ , �'���;"� )�-� �1� #���&�7�< , 4�"� 7�7) , (1� � )� ����� ���2�������� ) �,������������2��� ����� - �, �������� ��� )� @������ ��:7#���&&� ���� ������� ������ ��� ���������� ��� ������ ���������� ��� ���������������������� ����� #+-�+:�) �� ��&�2��������� ��� ��� ����� ����� ���� ������ ������������� ���'@ � ���� ���� ������ �� � 4�" #+ , ���& ������������������������ ��� �������� �� !1 �� +87 ������ ���) ������� �������� ����� ������� #���������

����� �8<++-& ��� �2����� ���� C��) ������ # ��� �� 0�����D������& ��� ������� �� ��� �"1@ �� ������ #��������E� & �� �� (��'������ ��� ���� # �"1@ ���C��)&� '@ ��������� 1�D #�� �2� ����& ����� ����� ��� ������� ��

5� �� �� ��+����� �� )� �� �� )� �����)�� 3��

Page 4: In vitro tolerance to Botrytis cinerea of grapevine 41B rootstock in

� ����� ������������� #1�D '@ ����� ���� 0������ ��& ��� �/ '@ ��������� ����� (��'� ������ ������6������'@ � ���� ����� #+- � ��� ���& ���� � ���������� )�+�

� ����� �� ��������� ,!�� )� � <5�-� #���& ��������� ���+�+ , ����������� #,������� � ���� )*5+&� ���� �� ������� ���'@ � ���� ������ ���� ;����� @� # �������& ������������� ����������� �� �2����� �� EC � �� �� +-: ����� �������� �� ������� #,������� � ���� )*5+&� ���� ������ �� ��������� �� ��� ������ �� '@ � ���� ����� ������ ���� ��� �������� ��� �������6�� #1�D ���� ;�� ������0������ ��& �� -7 �" ������ ��� ������ ����� �� 7�-���"� 7�)��1� �� ���� ���������� ��� ���� �� 7�)���"� 7�)� �1� ��-7 �"� ��� �������6����� ��� ������� �� � ���������������������� ��� ��� 1�D ��������� ��� #0������ ��& ��� ���"1����� �������������� �������� #0������ ��&�

0�( ���)�)�#

���������� ���� ����� ��������� ����� ���� ������� ���� + ��� DE� ������ #-7 �, @�;+�!:� ) �, ?� �� 7�- �,A<=�#"@&8� ��� 7�- �, A:=�#"@&8 #B�������� � ���� )*5/& ����������� ������ �� �� </ �"� ���� ������ ���� �2�� �� )7 ��� /7� ������ ������ #���&�

��+���+� ����):��(

������ ������ �� ����� ��� �������� ��� � �1@ ������� � ���� )7 �' ������� #,��')7�)� ��������� ����� ?*558/�0���� � ���� )**8& ��� � )�- �� �������� ��� ���� #��)7����&��� ����� �� �0A�� ������ �� ��������� �������� #(����� ���� )**5&� �' )7 �������� ��� ������� �� �� (��')�A��)��� ���� �� ��� �0�@ )* ������ ������� ���� ��� C��) ����� �������� ��� �������� ���������� �� ���� �������� ����������� �������� #"������������� � ���� )**5&� ��� ��������� # �0�@�)*���)7�����C��)& ��� ����������� ���� 40 ::7: ���������� � ������ �� ���������� ���3 ������ ����7 �������� �������� ����� ����������� �� ��� �������� ��� ��)7����� �� � ���� �������� �� 1� � '����#������� �������� C�% �%���� "@'�&� ������� ������� ���������� ���� ��� �� �� �� �� �� �������� ����� ������ �������� ��� ���� ������� ������ �� ��� DE� �������� ������������ �� �) ������

�������

'�)9)�)�� �1 �#��+)�� ��8� 9# �(�����+

��� ���������� ������ �� ���������� �� �������� ������ ����� ��� ���� � ������ �� ������ #���� ��� ��6��� )**7. ����� � ���� )**/&� �� ���� �����2�� ������ �������� ��� ������ �������������� �� ����� ������ �������������� ����������� ���������������� #�� ��& ���� ������ �� �������� ������� �� ���� ������ �� ��� ��� ���� ����������� ��� ������� �������� ��� � ����� ���� ������� �������� ����� ��������� ����������� =� � ����� ����2������� �� ��� �������� �� ��� ������ �������� ���� ��� ����� ����� �� ��������� �� ,������� ����������� =�� ���� �� �� � �� ������� ��� ��������� ����� ���������� ��� �������� ��� �������������� ���� �� ������� /- ��� -77 �, ���������� #=� � +&� � ����� ���� �������������� ������ #����� -77 �,&� ������������� �� ��� ��� �������� ���� ��� � ����� �� �� �� ����

��� ���� ���������� ��������� ���� ��� �� �� �� ����� ������� �� ����������� ����� ����� �� ��� ������������������� ����� -77 �,� ���� �� +� ���������� ������� �� ���������� �� ������� ���������� ����

������ �� ��� ���� ���������� #���� �����&� ���������� �������� �� -77 �, ���������� ���� ��� �� ��������� �� ����� ����������� ������ ����� �������� � ��������� �������� �� ��� ������ #���� ��������&�

������)�� �1 �(�����+ ��� (�)+9��� (#���(����(�)�� ������+��)�� ���� 9)��)� ��� �9)��)�(��(( ����)�)��(

(2�������� �� ��� ������� �������� ��� ���� ��� �������� ��� ��� �������� �� ������� �� � ������ ������ ����������� ��������� ��� ��� �� �� ������� ������ #EC � ���� +-: ��&� 0����� ������� ������ �� ����� ���� ���������� ���������� ��������� �� ��� � ����� :)0 ������������ �� ��������� ��������� �� �������� ��� ������� ��������� ��� ����� �������2�� ��������� �� ��� ���������� ������� ���� #���� )&�@��������� � ����� ����� �� ��� ������ ���������

���� �� ����������� E���� ����� ����������� �� ��������������� ����������� ��� �� �������� �� '@ ����������� #=� � <� ��� )&��� ��� ��������� ���� ����� �������� �� ���������

���������� �������������� �� ����� �� ��������� ��������� �������� � ����� �� , D(@� � ��2�� ���� ����� ��� � �� :7G):7 � �) 19� ��� ��������� ������ ������ ������ �� �������� �� ����� ��������������� ����������� ���������� ���� +7 � �� ����� ������ ���������� ��� �� �������� ��� ������ ���� ��������� ��� � ����� ���������� ��� #�� � ������� ����������� �� ������ �� ��� ���� ���� �����&�

���� �� D����� ���������� �� �������� ���� ��� � ���� ���� �������� � ������� �� ���������� �������������� '��������� ��� �����6���� )� ������ #��� �������������& �� ����� �� ���� ������ ��������� ��� ���������� ���� ��� ���� ������� �� ������� ��� ��������� � �� ���������� ��� ������� ��F � �� ����������� # ������������� �� ��� ������&�# ����� �������� �� ��� �������&�# ������������� �� ��� ������&�)77� D����� �������� ��� ��� ��� ����� � ����� ����������� �������� ����������� �� ��� ������ ������1��� ��� ����� �� ��� ����������� �2����������

3� �����(�-�$ ����� � � &

Page 5: In vitro tolerance to Botrytis cinerea of grapevine 41B rootstock in

=�� EC ����������� :-����� ����� ���������� ������ , D(@� � ��2�� ���� ������ ��� ������� ����������� �� ,������� ��� �������� ��� ��������������� ��� �������� ���������� �� �������� �� EC� ��� �� ��� ��� �� ��������� �������� �� ���������� #���� )&� ���� '������� +)- ���� ��� ����� ����������� #<-7�))- � �) 19&� ��� =�� 0�����

��� ����� ��� #:7�)) � �) 19&� C��������� ���������������� ����� �� ��� ���� ������� ��� �� �� ����� ������ �������� �������� ��� EC ������ #��� ��� )**<&� ����� :)0 ���������� ��� ���� �� ������� �������� ������������ ���� �� �������� ��������� �� ���� �� : � �����EC ���������� ��� � ��� ����� �� ��������� ����������� �� )/ � #=� � <&�

�+1�+1� �� �� ������ ���)�)�# )� ��9����

�� ����� #������� ������&� �� ������ ������ ������� ������ � �������������� �������� #;'& �� �� ������������� �������� ������� ��� ��������� �� �������' �������� #(���� � ���� )**<&� ��� ����� ������������� �� � ���� )7 �' ������� �� ����� � �2������������ ��� �������� 6���� #0���� � ���� )**8&� � ����� ������ ��� ���� �� 8�) �� ��������� ��� ,� �')7�) ��� ������� ��� ���� ������ �������� �������� ������� ��� ,� �')7�) �������� #)�- �� 1@ ��� ����&�� ���� ���� � �� ��� ��� ���� ��� �� ����������������� ������������� �� ����� �� ���� ���������������� ���� ����������� ���� ����� ���� ������������ ����� ����� ���� �������� ����� ���� �� ������������ ��� ���� ������ � �� � �2�������� �� ��� �� ��� �� ������� ��� ��� �� ��� ����� #=� � :0& ��������� �� ������ ����� ��������� ���� )7 �, , "+#=� � : &� ����� ����� ��������� ���� ��� ����� ��������� ��� �� �� ������ ���� ����G����� �� ������������ ��� �� �� �� ��� �� �� ��� �2�������� �� �������������� ���� �� � ������ �������������� ��� ������

"%��(()�� �1 �� �)��)� ���� ��������(�� )����(���)� ��� ���(���4 ����( ��� ������+��)�� �1�(�����+ )� +����(

���� ������ �������������� �� :)0 ������ ���� ������ �� ��������� �� ����� ���� ���� ����� �������� ����� ������ �������� ��������� #"������������� � ����)**+�� �. ,��� � ���� )**+� )**-�� �&� -7 ���������������� ���� ���� ���� ��������� ��� ������� �������������� ���� ���������� ���� �� ��������� �� ,���������� �������� (���� ������� �������� ���� ��� ��������� ��� �������� ����� �� �� �� ������ ��������������� ���� ����� ��� /7� �������� �� ������� ���������� ���� ��� ���� �� ������ �� ��������� ����������� �������� ���� ��� ���) ������ ���� �� ����������� ����� ����� ���� ���� ������������ � ���������� ������� ��� ��������� ��� ��� ���� #��������������������������& ��� �� � ����� #���� ��� �����&� ��� � ��� �� �� �� ���� ����� �� �� ���������������� �� ���� �������������� �� ��� �������� �������� �������� ��� �������� �� ���������� �� ����������� ��������� #=� �-&� (2�������� �� ��� ��)7�����C��) �������� ��� ���� ��������� ������ ���������� ���������� '@ ��� ������� ������� ���� ������� ��������� ����������� ���� �� �� ������ �� EC ������ �� ���

��� �� ������ �� 0������� ������ �� �� ������ ���������� ��� � ����� �� ����� � ������� ������ � �������

1��� ��� ����� �� ��� ����������� �2�����������( #�������� �����&�

C������ "����� ���������

��������'���������#� �) 19&

EC � ��'���������#� �) 19&

'������� �� �� <-7�))-:)0 '�������� �� ))+�<7 +:7�)+7E �� ���� :/* �� 58�:- +)7�/:����� ���� <58 �� )7<�<) 5/�:*=�� ������ �� )7)�)8 <5�))

��������� ��� � ������� �� ���� ���� �������� ��� ���������� ��������� �� �� �� !" � #$%�%� ����� & ������� � ����� �����&����� �� �������� ��� ������' (����&���� ���� ���)���� �) � ����� ����� ���*� &���� )�� ) � ��))����� ����� ) ������&���� + � �)��� ��& ���� ���� �������� � , � �)��� -. ���������' ��/�� ����&���'

���� �� '@ ��� ������� �� ������� �������� ����������� �� ������ ���EC ������� :)0 ������ @�������������� :)0 ���������� ���� � ������� ��������� �� ��� ,������ ��� ������� ���� ��� �� ������� �������� ���� ��� +5 ��� ������������ ��� �������� �0�@ )*���)7 �����C��) �������� ���� +- � �� ���� '@ ���� ����� �� ���� ���� # &;������6����� ���� ��� ������� �1@ ���) ��� ���� �� � ������ #0&,������� �� ������� �

5� �� �� ��+����� �� )� �� �� )� �����)�� 3�2

Page 6: In vitro tolerance to Botrytis cinerea of grapevine 41B rootstock in

����� ���� ��� +5 #=� � <� �� �� ����& �� ���� �� 5 � �������� �� ����� �� ���������� ��� �������� �� ��������� )/ �� '@ ������� �� ������� �������� ����� ����������������� ��� ��� ������� �� �� ��� ����� '@ �� �������� �������� �� �������� ������ ������ ����������� ���������� ��������� ��� ������� : � ��������������� ������� �� ��� ����� �� ������ ��� )- ������������������ ����� ���� ���� �������� ���� ��� �� �#=� � -&������ ���� ����� �������� ���� �� ����� ���� �����

��� ���� ��� #��� �2����� ��� )+& �������� ����������� �� ��� ���� ��� #+7 � �) 19& �� ��� ���� ���������� �� ������� ��� #���� ���� +� )5� +)&� ������������������� ��� +G)7���� �� ��� ���� �� ��� ����������� ���������� ��� �� ������� ��� ���� �� ����� ������������ ������ �� �2���������� �� ��� ����� ��� #��� +5&����������� �������� �� � ���� �� � �������������#+777 � �)&� ���� )77���� ���� ��� ������ : � �������� �� ����� �� ����������'���������� � ������� ������ >������� �� ����

�� �� �2����� �� <8- ��� ���� ���� ��� �����6����� �� ��������� �� ���>��������� ����������� C����6����� ������������ �� ��� ����� �� ��� ����� ���� ��� +5 ������� ���� ������� �� >��������� �� ��� ������� �������� ��� ������� �� ���������� ��� ��� �� ��� �����#=� � 80& ���� �������� �� ��� ������ #=� � 8 &���� ����������� �������� ��� ���� +5� - ��� )+ #����

����� ��� �������� �� ��� ������ �� ����� �� ����������

���������& ��� �������� ���� +) � �� ���� #=� � /&������ ����� �� ���� ��� ���� ������ ��� ��� �2����������� �������� ����� ����� ������������� ��� ������

���� � (2�������� �� ��� �� ��� ���� ��� ������ �� ��� �' )7 �������� �� ����� �� ����� ������������ �������� ����� ����� ���������� ����� �� ������ ������� C����6����� �� ��� DE� �������� ��� ��������� �� ��������� �� ��� ,������ ��� �������� # & "����� ��� ���������#�����& ���� , "+ )7 �,� #0& 4��� �� ���� ��������� ���� ��� ��������� �JF ��������� 6����

���� �� ���������������� �� ���������� ��������� �� ��������� �������� ����������� ���� ��� ��)7 ���������������� �������� ������������ ����� �������� � ����� �� ��������� �� ��� ,������� ��� ����������� �������� ���� +77 ������� �� ��� ����� ��� ��� ������ ���� : ��� ���������� ����� ���� ������� ���������� �2������� ��� ���������� ;�4"�

3�� �����(�-�$ ����� � � &

Page 7: In vitro tolerance to Botrytis cinerea of grapevine 41B rootstock in

���� #=� � / & �2������� ���� ������ �������� �� ���������� ��� ������ ������������ ��� ������ �� ������� ���� ������ =�� ����� ���� ��� +5� ��� ���������� ������ ��� ��� ��������� ������������� #=� � /0&��� ���� ����� ��� ��� �������� �������� �� � ���������������� ������� !� ��� ����� �� ����� ������ ���� ������ �������� ����� ���� ��� ���� �� ��� ����

�� ���������� ����� ����� ��������� ���� ��� +5 ���������� �� �������� ��������� ���� � ����� �����������,�������� ��� ���� ���� �������� ���� ��� - ������������� ��� -���� ���������� �������� �� ��������� ������� � �������� �� ��� �������� #=� � /"&��� ���� ������ ������ ��� ������ �� ����� �� ��� ����� ��� �2�������� �� ���� ����� ��� ��� ���������

���� �� C����6����� �� ���������� �� ��� ������� �� :)0 ����� ����� ��������� ���� �������� ���� �������� =�� ���� ����� ���������� ��������� �������� ���� � >��������� ���������� #�2�������� ��� �2�� �� <8- �� ��� �������� ��� �� ��� ���� ::7 ��&� 0� ���� �������������� ����� ������ ��� ��� ���� �� ���������� ���� ��������� ������� ��������� ����� # & :)0 ��������� ���� ����� #������&� #0& ����� ������� +5�

5� �� �� ��+����� �� )� �� �� )� �����)�� 3�6

Page 8: In vitro tolerance to Botrytis cinerea of grapevine 41B rootstock in

=�� ��� ����� ���� ��� )+ #=� � /1& ���� ��� � ������������� ���� ���� ��� ������� � ��� ���� ����� ���������� �������� �������� ����� )7 � �� ������� ���� ���������� ����������� ���� ����� ���� ���

+5 ����� �� ��������� ���������� �� ��������� )- ����� ������ ��������� ���� ��� ����� ���� ��� +5 ���� ��������� ���� ������� �� ��� ���� ���������� �� ������ �������������� ������� �� �������� ��� �������� ���

< ������ ������������ �� ��� ��� ��������� ��� �������� �� ��� ���������� �� ������ �� �������� ������ ���� ) ����� ����������� ������� ������ ��� ���� +5���� ��������� #���� +&� � ��� ��� �� ��� ����� ��������� ����� �� ������ #:-�:-& ���� ������������� ���� ��� ����� ���� ���� +5 ��� ����� �� ��������� ���� �� ��� ��� �������� �� ���� ���� :7� ���������� ������ =�� ����� ������ ��� ��������� ��

���� �� ,���������� �������� �� � ����� :)0 ����� +7 � ����� ����������� ���� �������� ����� ����� ���� �������� ���� +77 ������� �� ,� �����

��2� # & :)0 ������������ ���� �� ������� #0& ����� ���� :)0 ��� +5� #"& ����� ���� :)0 ��� -� #1& ����� ���� :)0 ��� )+�

3�0 �����(�-�$ ����� � � &

Page 9: In vitro tolerance to Botrytis cinerea of grapevine 41B rootstock in

���� �������� ����� ��� ��� �������� �� ��� ��������� ���������� ����� ��������� �� � �� ��� ����� �� ���������� ���� +5 �2������ �������� � ����� ��� ��� ����� ����� �����������

' ����� ��

��� ����� �������� ���� �������� ���� ������ ��������������� �� �������� ���� ��� �������� ��)7�����C��)�������� ��������� ���������� ��������� ���� �� ����������� �� �� ��� �2�������� �� ��� ������� �������� ��� ���� ��� ������ �� ���� ����� ���������� ���������� ��� ��� <7 ������������� ������� �� ;�4"��� �� ����� ������ �� �������������� �� ������������� ��������� ����� ���� � ����� ���� ���������� ����������� ��� ���� ������� �� ��������� ��� ���� �������� ��� �� �� �� ������� �������� ��� �� �2����� ��� ��� ��� �� �������� �� ����� �� ������� ,������������������ �� ������ ������� �� ���� #)7 � �) �� �������& ��� ��� ���� ����� �� ��� � ����� ����������������� �������� ��� �������� �������� #=����� � ����)**<. "�������� � ���� )**/&���� �������� �� �������� ��������� ��� ��� ����� ����

���� +5 ��� - #=� � /. ���� +& ����� �� �� ������ �� ��� ��� ��� �� ���������� �� ��� ����� ���� ����� #=� � -&������ ��� )+� ���� � ���� �� ��� �� ������������ ������ ��� ���������� �� ��������� ���������� ������������� �� ��� �� � ��������� �������� ��� � ���� ����� � ����� #=� � +&� D����� ���������� �� ��� �� �� ����� ��� �������� �� �� � ���������� ��������������#)77 �, ��� �� ���&� �� ��� ����� ���� ��� +5� ����2����� ���������� ��� ��������� �� +777 � �) 19#=� � -&� ����� ���� ����� ���������� *7G*-� �� ������ ����� #� �����&� ��� ���������� ��� �� ����� ����� ����� +5 ��� ����2������ +77 � �) =9� ��� � ������ � ���� ����������� ���������� ������������� �� ��� -��� �� ����� 7�) �,� ��� �������� �� ��� � ����������������� �� ���������� �� ��� +5 ��� �� ��� ��� ��� ��� � ����� ������������� ��������� ������ ������������� �� =� � +� �� � ���������� ��� �� ���� �������� ��������� ��

���� #�� � ������ ��� �2����& ��� ���� ����� �� ������� �������� �� ������� ����� #��� �� �����& ���

����� ����� #���������� ��������& #1�KL� )**:&� 9��������� ����� ���� ����� �������� �� ��� ������� ���� ����2����� ���� �������� �� ����� ����� �������� ���� ��������� �� ��� �����1��� ��������� ���� ���� �������� � ����� ��� �� ��

�� ��������� �� ��������� �� ��� ����� ���� ��������� ���� �� ��� ��������� ��� ���� ��������� �������� ����������� ������� ������� ���� �������� �� ������ �� ����������� ��� ���� ���� �� �������� ���������� �� �������E����������� �� �� ��������� �� ���� < �� : ����� ��� ������� >������ ������ ����� ������ � ����� �2������������ ���� ������ �� ��� ��������� �� ��������� ��� ������ �� �� �

���������� ��������� �� ���� ��� ������� � �� ��� ���� �� ��� ��� ��� ��� ������� �� ��� ���� "����������� �2�������� �� ������� �������� ���� ��� �������� ��� <-� �������� ���� ��� ���� ��� ����� ����� ��������� ����� #;��� � ���� )**<& �� �� ��� ���� ������ �������� ������ �������� �� ���������� �� �������� ��� ���� �� ��� >������ ���� ���� ���������� ����� �� ��� ��������� ��� ������� ���� ����>����� #=����� � ���� )**/&� ����� �������� ������� ���� � ����������� ������� ������� �������� ��� ��������������� ��� ������� "� � ��� ���� ��� �� �� ��������������� �� �������������� �2���������� M��� ��� ������ ���������� ��������� �� ��� �')7 �������� ���������6� ����� ������� �� �� ������ ����� ������� ��������� �2�������� ��� ���������� ��������� ��� �������� ��� ���� ��� ������� �� ���������� =����� �� ���� ��������� �� ��������� �� ���������� ����� ��������������� ��������� �� ��� ��� ���� �����

#����,���������

9� ����� ��������� � 1���� ��� ������� ������ �� ��� ����������� 1� � '���� ��� ��� �� ��)7����� �� ����� ������������ ��������� ��������� ' ��6�� ��� �������� �������� ;�4" ������� ��� ��������� ( A��� ��� ��� ��� ���� ���� ���3����

���������

������ �� ������� �� ������ �� ������ ��� )**8� �������� ���������2�� #����������& ��������� �� �������� ����� ����������� ������ ������� # "<&� ������ �� ����� ��� ���������� � ��� )*/*G)*5)�

������ �� ������� �� ������ �� ����� !�� ������ �� )**/�0��� ��� �������� �� ����������� � �������� ������� ���� ���������� � ����� �������� ����� ��� ���� � ��� ��� ������� ������ �� ������ ������ � ��� )85*G)/7)�

���� ��� ���"#$ ��� %�$ &�� +777� ��� ������ �� ������� ������� �������2�� ������������ �� ����� ������ ���� ���� ����� ����������� ��� ����� ������ �� ���� ��������� ��� :+-G:<<�

����$ �� ��� �� ����� �'� '�����(�#�)*���� �� )**/� 4���� ��� ����� �%�����F ���%�������� ��� ���� ���%����� ��� ���%����� �2 ������� ��� ������� ������� ��� ��%�� ���� ��� �����%��%��I������� �� ����� ��F �� �� ��� ��� ��� ���

��� �� ! ����������� �� ������� �� "# �� 0������� ����������

��������� ������� ������

@���� �� ����� ������ �������������� ����� �� ��������� ���������� ���������

: � / � )7 � )- � +) �

"����� :- 7 +8 <- <5 :-"��� +5 :- 7 )+ +: +: +8

0�)���� ����� ���� �������� �� ������� ���� ��� ��& ���� ������������ &����� �� ���&����� �� �������� ��� ������'

5� �� �� ��+����� �� )� �� �� )� �����)�� 3�3

Page 10: In vitro tolerance to Botrytis cinerea of grapevine 41B rootstock in

� ����� �� �� �������� � ���� ��� 0������ "��� ����������"���� ��� ���������� @������� �� ���������� ��� ����������� ++/G+</�

����� '� +���� '� ,(���- �� ��..��� %� �� /�0�- &� ,����� ��/�������� �� )**8� 1������ ��������� �� ������� ������F � ��� ������� � ���� )7 �' ������� �� �2������� �� ������������ �������� ���� ������ �� ��� ���� �� /)<G/)*�

'�������� ��� !���� '!� ������� !� ������ '� ��1#� �������� 2� %����� �� %��1�3"� �� )**/� ������������� �������� ������� �������� ��������� ��� �����2����� ���������� ����� ��� ������� ( �� ���������� ���������� ������� ���� �� ��� ���������� "+���2���6������F ��������2�������� �� ������� �������� ������� ������ �� �������� � � ��� ��� 85+G8*7�

'�����(�#�)*������2���(������� &�������'�����������������$ �� %����� �� 2���� �� )**+�� ������� ������ ���������� �������� ���� �� ����������� �� ������ ������������ ���� �� �� ���� ����������� ���� ����! "����� ��� #����� �� ��� )+-G)<<�

'�����(�#�)*���� �� ���4� 5� ������� �� ����� �'�����$ �� %����� �� 2���� �� )**+�� (2������� ��������������� �� �������� �� ���������� �� ������ ���� ������������� ���� ���������� ���� $������ � )</G):-�

'�����(�#�)*���� �� 6��� �� +1#����� �� ����$ �� )**5�E���6����� � �I�� �����I�� �������� �� �� �� C��) ��0����� �������%�I� �������� ��������� �� �� � ��' ��6����� ��� ������� �� �� �� ����� �%���� ���%������2 �������� ���� �� �� ������� ��� ����� 0�����'��F *8:+,;�9� ��'�C��)F 1�%��N �F)<�7+�)**5�@��%��*57)/:+�

%�74 26� )**:� (��� ��� ������� ����������� �� ��%���������� � �� �� #����� ���& � ����� #���������� ��������&����I�� �� �������� �� $(��� @������� ���%����� �������� �� ,���������

,����� �� ��..��� %� ����� '� '�����(�#�)*���� �� ����$ ��)**5� E��������� ���� �� ����������� �������%� �I � ��������������� �%��%���� �� � �� ��� �$� �������� �' ����������� � ������� ����% �� � 46����� 0����� '��F *8:),;�9���' 46����F 1�%��N�F )<�7+�)**5�@��%��F *57)/:)�

,����� �� ��..��� %� ����� '� +���� '� ,(���- ��/�������� �� )**<� ������ ��� ��� ������ �����������6������ �� ����� ������������ ���� ��������� ��� ������������ ��������� $�������� ��������� ��� ������� ����� ������ ������ ��� ����� �������� ���� �������� ��� ���� � 8--G88:�

���1#�� �� ����� &� 6��� �� )**/� ������� �������� ����2�������� ����� ���� �� �� >���� ���� ��� ��� ���������� �������� "�� ���� ������ ��� :5*G:*5�

���1#�� �� 6��� �� )**:� ���� ������� ���������� ������ ������� �2�������� �� ����� � �������2���� ���� #������ ����� �������� �� )+-G)<7�

����-� ,8� /����� �� 2��3�� ��� ���-� ,� /����� �,�)**<� ���������� �� �2������� �� ���� ����������

���������� �� ������� ��������� �� ��� ����� %���� ����:-:G:-/�

6��� �� ���. 6�� /����� ,� !��������� �� /��� 6� ���3�� �� ���� � +1#3�0�� ,� +1#����� �� +���41-�� �� +���0� /�)**<� 1������ ���������� ����� ���� ����� � �������2���2�������� �� � ���� ����� � �� ��� )-<G)-8�

��..����� ��� /�*����# ��� ��*�� � � )*5/� DE� ������F����� ��������� �� � ��������� ��� �������� ��� ����������� �� �� ��� ������ ���# ������ � <*7)G<*7/�

!���1�-� �� )*5)� 1������ ���������� �� �������� ��� ��� ���������� �� ����������� ������������ ����������� ��� �������������� ������������ ���� �� ����� �� +)<G++8�

!���1�-� �� ��$1� ��� )*//� ��� ���� �� �������2��� ���� ���������� �&����� �� ��� )-)G)-+�

���4� 5� '�����(�#�)*���� �� ������� �� ����$ �� 2���� ��)**/� ��>���� �� �2������� ��������� ��������� ��� ��������� ���������� �� �������� ������� ������ ������� ����%��& '��� �� (��� % �� � ��� */G)7-�

�������� �� �����1# ,�� +�3��1- �� )*5+� �������� ������!� ����� �� ������� "�� ����� ;����� 4��������� ������

����� �'� %����� �� '�����(�#�)*���� �� )**+� "�����������%� �$� ��% ��� ������� �� �����%��% �� ��%������������� �������� �I ������ �$�� ����� ��������� �I�� �������% �I� ��% �%��%������ �� � �� ��� 0����� '��F +<<8+/1� ):)-8 =�F1�%��N �F )+�7-�)**+�@��%�� *+ 7-/+:�

����� �'� '�����(�#�)*���� �� ����$ �� )**-�� ������������� ������ �� �����F ������ ��� ������ ���������������� ��F ��������� �� �� ' � ������� ������ ����� ��������� @���� =������ )*G+<�

����� �'� ������� +� ���� �� ���1- !� 5���� !� '�����(�#�)*���� �� %����� �� ������ �� )**-�� ;� � ����������� ��������� �� �������� ����� ����������� ���� ��� D=4C���� ������� ���� ���� $������ ���� */G)78�

�����#��� �� +-��� �� )*8+� ������� ����� ��� ����� �������� ��������� ���� ������� ����� ������ �������������� ��� ��� :/<G:*/�

��0�� �� ���� �� )**-� ,��� �� ��2�� ������ �� C��������������� �� �� � ����(������) �� ��� ����&�� �� ���������� �� ���� <)/G<<)�

���� �� ��0�� �� )**7� '������ ������� ��� ������� �������� ��� ��� ���� ��� �������� �� �����2��������� � ������������� ����� ������ �� ��� ��� ����� ���� )G5�

+��#� �� )**<� ������ ������� ���� �� ������������� $����������� �� ����������� ����� ���I�� �� �������� ��$E���������% �� 0�� � ��� 1�3���

������9�� '� ��$�� �,� )**)� ,����� ��� �������� �� �� ������� '@ ���� ���� ����� ������ ������ ������������ ������� �� �������������� ���� �������� ������ *��� ��� +:+G+-)�

���� � �����3 �� /����� ,� /��� 6� )**:� ��������� ���6����� ��� ����������� �2�������� �� ����� ��������������� ���� ������ �� � )< �� �������� 1@ ��� ��������� �������� ������ �� 88/G8//�

3�� �����(�-�$ ����� � � &