i

CAMILA ARÃO DEL AGUILA

INFLUÊNCIA DO POLIMORFISMO DO GENE DO CD14 NO RESULTADO DO

TRATAMENTO ENDODÔNTICO

Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Estácio de Sá como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Odontologia (Endodontia).

ORIENTADORES Profª. Drª. Isabela das Neves Rôças Siqueira

Prof. Dr. José Freitas Siqueira Júnior

UNIVERSIDADE ESTÁCIO DE SÁ RIO DE JANEIRO

2013

ii

Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)

A282i AGUILA, Camila Arão Del. Influência do polimorfismo genético do CD14 no resultado do tratamento endodôntico./ Camila Arão Del Aguila - Rio de Janeiro, 2013.

40f; 30cm.

Dissertação (Mestrado em Endodontia) - Universidade Estácio de Sá, 2012.

Bibliografia: f.32 Orientador:. Profª.Drª. Isabela Neves Rôças Siqueira e Prof.Dr. José Freitas Siqueira Júnior

1. Periodontite apical 2. Polimorfismo genético 3. Tratamento do canal radicular I. Título

CDD 617.6342

iii

Dedico este trabalho aos meus familiares, amigos e professores que me ajudaram

na busca desta vitória e que mesmo diante das dificuldades, souberam ter paciência

e transmitiram todo apoio. AGRADECIMENTOS

A Deus que nunca me desamparou.

iv

Ao Programa de Pós-Graduação de Odontologia da Universidade Estácio de

Sá que possibilitou a realização do Curso de Mestrado.

Aos meus orientadores Profª. Drª. Isabela das Neves Rôças Siqueira e Prof. Dr.

José Freitas Siqueira Júnior pelo apoio, competência, inteligência e

compreensão, que foram fundamentais para a conclusão deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Lúcio de Souza Gonçalves pelo apoio na realização da análise

estatística e pelo exemplo de mestre.

À CMG (CD) Helena Rosa Campos Rabang, pela amizade, compreensão,

apoio, incentivo, exemplo de profissional e ser humano que foram essenciais

em toda a minha formação acadêmica.

A todos os professores do mestrado que de alguma forma contribuíram para a

minha formação.

Às minhas amigas que me ajudaram nesta caminhada e tornaram os dias

difíceis mais alegres, que enxugaram as minhas lágrimas e que me deram

palavras de incentivo. Vocês foram fundamentais! Amo vocês!

À minha família e meu noivo que todos os dias demonstram um amor

incondicional. Obrigado por tudo!

ÍNDICE

v

RESUMO................. ................................................................................................... vi

ABSTRACT............................................................................................................ .... vii

LISTA DE ABREVIATURAS.................................................................................. .... viii

LISTA DE TABELAS.................................................................................. .................. x

1– INTRODUÇÃO.................................................................................................. .... 01

2– JUSTIFICATIVA................................................................................................ .... 13

3– HIPÓTESE............................................................................................. ............... 14

4– PROPOSIÇÃO................................................................................. ..................... 15

5– MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................. ....... 16

6– RESULTADOS................................................................................................. .....22

7– DISCUSSÃO................................................................................. ........................ 26

8– CONCLUSÃO.................. ..................................................................................... 31

9 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 32

10 – ANEXOS ........................................................................................................... 40

RESUMO

vi

Objetivo: Diante do consenso científico de que a lesão perirradicular é de

etiologia microbiana, questionamentos têm sido levantados acerca da influência

de outros fatores como, polimorfismo genético, na sua prevalência, severidade

e resposta ao tratamento. A proposta deste estudo foi investigar a influência do

polimorfismo genético do gene do CD14 no sucesso e fracasso do tratamento

endodôntico em indivíduos brasileiros.

Métodos: A população estudada foi composta por 42 pacientes com dentes

apresentando lesão perirradicular pós-tratamento e 41 pacientes com dentes

apresentando canal tratado e saúde perirradicular (controle). Amostras de

saliva dos pacientes foram coletadas, o DNA foi extraído e o polimorfismo

genético do gene do CD14 (-206 T/T) foi avaliado pelo método molecular da

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).

Resultados: Nenhuma diferença estatisticamente significativa foi observada

entre os genótipos CC, CT e TT e os alelos C e T polimórficos (p>0.05) no

sucesso/fracasso do tratamento endodôntico. Na análise bivariada entre o

tratamento endodôntico e as covariáveis, o polimorfismo do CD14 e raça não

demonstraram associação significativa com o prognóstico do tratamento

endodôntico, enquanto que para gênero (p=0,047) e tabagismo (p=0,020) foi

observada associação direta e significativa. Com relação ao gênero, foi

demonstrado que o fracasso no tratamento endodôntico é quase três vezes

maior nos homens quando comparado com as mulheres. No caso do

tabagismo, o fracasso é quatro vezes maior em pacientes fumantes do que em

não fumantes.

Conclusão: O presente estudo sugere que não há associação do polimorfismo

do gene do CD14 com o resultado do tratamento endodôntico. Tabagismo,

também considerado como modificador de doença, foi significativamente

associado com o fracasso endodôntico.

Palavras-chave: periodontite apical; polimorfismo genético; tratamento do

canal radicular.

vii

ABSTRACT

Objective: Although there is a consensus that apical periodontitis has microbial

etiology, other factors such as genetic polymorphisms may influence in the

disease prevalence, severity and response to treatment. The purpose of this

study was to investigate the influence of genetic polymorphism of the CD14

gene in the success and failure of the endodontic treatment in Brazilian

individuals.

Methods: The study population consisted of 42 patients with posttreatment

apical periodontitis and 41 patients showing root canal-treated teeth with

healthy periradicular tissues (control). Samples of saliva were taken from the

patients, DNA was extracted and the genetic polymorphism of the CD14 gene

(-206 T/T) was evaluated by the polymerase chain reaction (PCR) method.

Results: No statistically significant difference was observed between the

genotypes CC, CT e TT and the alleles C and T (p>0.05) in the outcome of the

endodontic treatment. The covariates CD14 polymorphism and race did not

show any association with the treatment outcome, whereas gender (p=0.038)

and smoking (p=0.024) were significantly associated. Regarding gender, it was

demonstrated that the treatment failure was almost three times higher for males

than for females. As for smoking, the chances for failure are four times greater

for smokers than for nonsmokers.

Conclusion: This study suggests that there is no association between

treatment outcome and the polymorphism for the CD14 gene. Smoking, which

is another disease modifier, was significantly associated with the endodontic

treatment failure.

Key Words: apical periodontitis; genetic polymorphism; root canal therapy.

viii

LISTA DE ABREVIATURAS

A Adenina

Alelo N Alelo Normal

Alelo R Alelo Raro

C Citosina

CD14 Cluster of Differentiation (Aglomerado

de Diferenciação)

FCɣ Fragment crystallizable (Receptor

Celular de Superfície)

g Força gravitacional

g Grama

G Guanina

NaOH Hidróxido de Sódio

h Hora

IL Interleucina

IL-1α Interleucina 1 alfa

IL-1β Interleucina 1 beta

IL-6 Interleucina 6

LBP

Lipopolysaccharide Binding Protein

(Proteína Ligante de

Lipopolissacarídeos)

LPS Lipoppolysaccharide

(Lipopolissacarídeos)

µL Microlitro

µM Micromolar

mM Milimol

mM/L Milimol/Litro

Min Minuto

NFKβ Nuclear Factor Kappa β (Fator de

Transcrição Nuclear Kappa β)

ix

Bp Pares de base

PCR Polymerase Chain Reaction (Reação

em Cadeia da Polimerase)

% Porcentagem

TLR-2 Receptor Tipo Toll isoforma 2

TLR-4 Receptor Tipo Toll isoforma 4

SNP Single Nucleotide Polymorphism

(Polimorfismo de um Único

Nucleotídeo)

Taq Thermus aquaticus

T Timina

TLR Toll-Like Receptor (Receptor Tipo

Toll)

TNFα Tumor Necrosis Factor Alpha (Fator

de necrose tumoral alfa)

U Unidade

x

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Sequência de primers, enzima de restrição e genótipo para o

CD14..................................................................................................................20

Tabela 2. Análise descritiva dos 83 pacientes de acordo com as variáveis

estudadas..........................................................................................................23

Tabela 3. Análise bivariada entre tratamento endodôntico e as covariáveis

estudadas..........................................................................................................24

Tabela 4. Modelo logístico não ajustado e ajustado para estimar a associação

entre o resultado do tratamento endodôntico e as covariáveis estudadas........25

11

1- INTRODUÇÃO

O tratamento endodôntico pode ser definido como a combinação de uma

instrumentação mecânica no sistema de canais radiculares dentários, com

debridamento químico e obturação com material inerte, destinados a manter ou

restaurar a saúde dos tecidos perirradiculares (BERGENHOLTZ et al., 1979). O

modo de execução do tratamento é tão diverso quanto os protocolos prescritos,

tornando-se difícil definir algum protocolo mais preciso ou mais aceito no

tratamento endodôntico. De fato, o procedimento é determinado por questões

dentárias, como por exemplo, a complexidade anatômica e questões

biológicas, que são os fatores pré-operatórios. Os fatores pós-operatórios

elucidam o fato do mesmo procedimento ser realizado em duas condições

diferentes de doença: (1) a vitalidade ou doença pulpar onde o principal

objetivo é manter a saúde perirradicular e prevenir a doença; e (2) não-vital ou

necrosada associada à lesão perirradicular, onde o objetivo é restaurar a saúde

dos tecidos perirradiculares (NG et al., 2008; RICUCCI et al., 2009).

É sabido que a necrose pulpar pode ser precedida por cárie, trauma ou

procedimentos iatrogênicos, estabelecendo-se a infecção endodôntica. Um dos

fatores favoráveis que propiciam a colonização destes micro-organismos são

as alterações ambientais nos tecidos pulpares, oferecendo condições nutritivas,

umidade, calor e anaerobiose. Além destes fatores, o microambiente

endodôntico, por sua vez, é um ambiente de difícil acesso às defesas do

hospedeiro (SIQUEIRA & RÔÇAS, 2008a). Os estudos relacionados à

diversidade da microbiota associada à lesão perirradicular atribuem à presença

de fungos, vírus e, principalmente, bactérias como os principais agentes

etiológicos envolvidos na infecção endodôntica (SIQUEIRA, 2008; SIQUEIRA &

RÔÇAS, 2008b). Assim, micro-organismos que colonizam o sistema de canais

radiculares, após a necrose pulpar, atingem os tecidos perirradiculares através

do forame apical, canais laterais e acessórios mais prevalentes no segmento

apical. Como consequência dessa infecção, ocorrem alterações nesses

tecidos, dando origem a diferentes tipos de lesões perirradiculares

(KAKEHASHI et al., 1965; SUNDQVIST, 1976; MÖLLER et al., 1981;

SIQUEIRA & RÔÇAS, 2008a). Quanto à infecção, os mecanismos de defesa

do hospedeiro desencadeiam estratégias através de uma resposta inflamatória

12

próxima ao forame apical, com o intuito de conter a disseminação da infecção

para os tecidos ósseos adjacentes (SJӦGREN et al., 1997; SIQUEIRA &

BARNETT, 2004; SIQUEIRA & RÔÇAS, 2008a; SIQUEIRA & RÔÇAS, 2008b).

O tratamento endodôntico de elementos dentários com lesão

perirradicular tem como objetivo promover o reparo desses tecidos (RICUCCI

et al., 2000). Sinais (radiolucidez, odor) e/ou sintomas (dor) em dentes com

canais tratados indicam que a infecção pode ter surgido após o tratamento ou

ser recorrente (após o tratamento ter gerado o reparo) (SIQUEIRA, 2011).

Quando o preparo químico-mecânico não atinge padrões satisfatórios para

promover a redução dos micro-organismos a níveis incompatíveis com o

desenvolvimento da doença, a lesão perirradicular é mantida ou desenvolvida.

Erros cometidos durante o tratamento endodôntico como instrumentos

fraturados, perfurações, sobreobturações e degraus podem estar associados à

falha da terapia (SIQUEIRA, 2011).

1.1- Sucesso e fracasso em Endodontia

NG et al. (2008) destacaram os principais fatores pré, intra e pós-

operatórios necessários para o sucesso do tratamento endodôntico. Dentre os

fatores pré-operatórios, foram ressaltados: o gênero, condições sistêmicas,

grupo do dente, condições pulpares, condições perirradiculares, e o tamanho

da lesão perirradicular. Os fatores intra-operatórios que devem ser

considerados na terapia endodôntica seriam: o uso do lençol de borracha no

tratamento; o diâmetro e conicidade do canal a ser preparado; obstruções no

canal; erros na técnica, como perfurações e fraturas do instrumento; soluções

irrigadoras; medicação intracanal; testes de cultura bacteriana nos canais

radiculares; seleção do material, da técnica, da extensão e da qualidade para a

obturação; dor exacerbada durante o tratamento e o número de consultas.

Dentre os fatores pós-operatórios, temos a qualidade da restauração coronária.

Os autores também citaram quatro condições necessárias para o sucesso do

tratamento endodôntico. Dentre os fatores mais relevantes para o sucesso,

destacam-se ausência de imagem radiolúcida perirradicular, obturação

endodôntica sem falhas, extensão da obturação apical 0 a 2 mm do ápice

radiográfico e restauração coronária satisfatória. O tratamento endodôntico

13

deve manter o acesso e a anatomia apical durante o debridamento do preparo

químico-mecânico, obturando o canal através da compactação do material para

o término apical sem extrusão para os tecidos adjacentes e prevenindo a

reinfecção com uma restauração coronária de qualidade.

Além dos problemas anatômicos que consistem em áreas inacessíveis

à instrumentação, o fracasso endodôntico pode advir de resistência de

bactérias aos métodos químicos e mecânicos utilizados na terapia endodôntica

convencional (SIQUEIRA, 2001).

Micro-organismos nos canais radiculares apresentam um papel decisivo

no desenvolvimento de lesões perirradiculares (KAKEHASHI et al., 1965;

SUNDQVIST, 1976; DAHLÉN & BERGENHOLTZ, 1980; MÖLLER et al., 1981).

Isto significa que a eliminação dos mesmos durante o preparo químico-

mecânico de dentes necrosados é o fator mais almejado no tratamento

endodôntico. No entanto, o tratamento endodôntico pode falhar quando a

técnica não é capaz de agir na eliminação ou redução da microbiota a níveis

compatíveis que proporcionem o reparo dos tecidos perirradiculares (ZELDOW

& INGLE, 1963; OLIET & SORIN, 1969).

1.1.1- Etiologia do fracasso do tratamento endodôntico

O fracasso da terapia endodôntica pode ser atribuído, em grande parte,

às deficiências técnicas, como preparo químico-mecânico, onde não houve

êxito na limpeza, desinfecção e modelagem. Todavia, há casos em que os

canais radiculares apresentam-se aparentemente bem tratados e mesmo assim

o sucesso não é obtido. Nessas situações, evidências científicas relacionam

esses casos a fatores microbianos e, em algumas vezes, são relatados o

envolvimento de fatores não-microbianos (SIQUEIRA et al., 2010).

Fatores microbianos: infecção intrarradicular

A infecção intrarradicular é o fator essencial para o desenvolvimento da

lesão perirradicular, afetando dentes que não se submeteram ao tratamento

endodôntico e, provavelmente, a maior causa de persistência da mesma. O

objetivo desejado no tratamento endodôntico tem sido eliminar os agentes

14

responsáveis pela doença ou reduzir substancialmente a carga microbiana dos

canais radiculares, além de prevenir a reinfecção dos canais obturados (NAIR

et al., 2005). O reparo perirradicular da maioria dos casos ocorre somente

quando micro-organismos não estão presentes nos canais radiculares no

momento da obturação (SJӦGREN et al., 1997). Em alguns casos, bactérias

residuais ainda são encontradas, mas mesmo assim o caso resulta em

sucesso. Nestes casos, micro-organismos podem estar presentes em

quantidades consideradas subcríticas para manter a inflamação perirradicular,

ou permanecem em locais sem contato com os tecidos perirradiculares (NAIR

et al., 2005).

Estudos têm constatado que a microbiota oriunda de canais radiculares

com lesão perirradicular persistente difere da microbiota de dentes não tratados

e com polpa necrótica (SUNDQVIST, 1976; MOLANDER et al., 1998). A

infecção presente em canais radiculares necrosados é polimicrobiana, sendo

composta por Gram-positivos e Gram-negativos e, dentre esses, os

anaeróbicos são os mais prevalentes (SUNDQVIST, 1976; WASTY et al.,

1992). A microbiota no retratamento endodôntico é caracterizada como uma

monoinfecção composta predominantemente por micro-organismos Gram-

positivos e com proporções semelhantes de anaeróbios facultativos e estritos

(MOLANDER et al., 1998; SUNDQVIST et al., 1998). O Enterococcus faecalis

parece ser uma das espécies bacterianas mais predominantes em dentes com

insucesso na terapia endodôntica (WASTY et al., 1992), no entanto outras

espécies como: Streptococcus spp., Parvimonas micra, Pseudoramibacter

alactolyticus, Osenella uli, Actinomyces, Propionibacterium spp. e Lactobacilus

spp. também podem ser encontradas (CHAVES DE PAZ et al., 2004).

Fatores microbianos: infecção extrarradicular

As lesões perirradiculares têm sido, há muito tempo, consideradas uma

barreira de defesa contra a invasão de micro-organismos para os tecidos

perirradiculares, tornando-se concebível que os mesmos invadam os tecidos

extrarradiculares durante as fases de expansão e exarcebação do processo da

doença. Com isso, a microbiota extrarradicular na lesão perirradicular (IWU et

al., 1990) pode ser responsável por diversas falhas no tratamento endodôntico

15

e, em alguns casos uma abordagem não cirúrgica é insuficiente, exigindo

cirurgia perirradicular e/ou medicação sistêmica (NAIR, 2006).

Dentre as diferentes formas de manifestação da infecção extrarradicular

o abcesso perirradicular agudo é o mais comum (SIQUEIRA et al., 2010). Na

maioria das vezes, a infecção extrarradicular tem origem numa infecção

intrarradicular (SIQUEIRA et al., 2010). Tem sido considerado que as infecções

extrarradiculares podem ser tanto dependentes quanto independentes da

infecção intrarradicular (SIQUEIRA, 2011). Frente ao exposto, diversos estudos

utilizando métodos de cultura, moleculares e microscópicos têm pesquisado a

ocorrência de micro-organismos extrarradiculares tanto em canais tratados

quanto nos não-tratados (HAPPONEN, 1986; NAIR, 1987; IWU et al., 1990;

TRONSTAD et al., 2000).

Devido ao estabelecimento de micro-organismos nos tecidos

perirradiculares, os mesmos tornam-se inacessíveis aos procedimentos de

desinfecção endodôntica, confirmando a suposição de que a infecção

extrarradicular pode ser a causa do fracasso na terapia endodôntica. Uma

pequena parte dos micro-organismos orais tem a capacidade de superar os

mecanismos de defesa do hospedeiro e também de se estabelecerem em uma

infecção extrarradicular. Atualmente, tem sido considerado que alguns micro-

organismos orais como algumas espécies de Actinomyces e Propinobacterium

propionicus podem estar envolvidos na infecção extrarradicular (HAPPONEN,

1986; NAIR, 1987; IWU et al., 1990; TRONSTAD et al., 2000).

Fatores não- microbianos

SIQUEIRA & BARNETT (2004), em revisão de literatura, constataram

que fatores antimicrobianos podem induzir uma inflamação perirradicular

transitória. Constataram também que nem sempre é desencadeada por uma

agressão microbiana concomitante. Apesar de ser transitória, a inflamação

gerada por fatores antimicrobianos pode ser a causa de dor. As causas

antimicrobianas são representadas por fatores químicos e físicos que podem

impor um dano aos tecidos perirradiculares e, além do mais, podem ser

responsáveis pelo desenvolvimento de dor. De fato, as causas antimicrobianas,

geralmente, estão associadas a eventos iatrogênicos, como por exemplo:

16

sobreinstrumentação, sobreobturação, extrusão de substâncias químicas-

auxiliares e medicação intracanal.

NAIR (2003) sugeriu que cristais de colesterol podem invocar uma

reação de corpo estranho e contribuir para o desenvolvimento de uma

inflamação crônica. Os cristais de colesterol são passíveis de serem

precipitados, acumulados e são liberados a partir da desintegração de células

hospedeiras. Eles podem também ser oriundos de lipídeos circulantes no

plasma. Se as células de defesa são ineficazes em remover os cristais, estes

continuam se acumulando e contribuindo para a manutenção da lesão

perirradicular. No entanto, o autor não constatou evidências do envolvimento

direto dos cristais de colesterol na falha do tratamento endodôntico e tal

participação na lesão perirradicular é bastante especulativa. O “cisto

verdadeiro” é um exemplo de lesão que pode reparar ou não após tratamento

endodôntico adequado. Esta suposição é mantida através da teoria que o “cisto

verdadeiro” pode ser autossustentável em virtude de se manter independente

da presença ou ausência de infecção bacteriana no sistema de canais

radiculares (NAIR, 2003).

RICUCCI et al. (2009), contrariando o estudo de NAIR (2003), não

verificaram nenhuma associação dos cristais de colesterol com o fracasso do

tratamento endodôntico. Diante dos estudos realizados, tem sido estabelecido

que a lesão perirradicular – independente de ser uma infecção primária ou pós-

tratamento – é uma doença causada primariamente por micro-organismos que

podem ser detectados concomitantemente com o cisto. Além disso, não há

nenhuma evidência consistente supondo que cristais de colesterol e cistos

verdadeiros podem ser a causa de doença após o tratamento endodôntico

(NAIR, 2003; RICUCCI & SIQUEIRA, 2008; SIQUEIRA et al., 2010).

1.1.2- Polimorfismo genético: definição e influência na resposta do

hospedeiro

Locus gênicos são locais específicos do cromossomo onde podem ser

encontradas as formas variantes dos genes (polimorfismos). Um locus

polimórfico está presente quando os alelos estão numa distribuição tal que a

variante normal (alelo N) tem frequência menor que 99% na população. Diante

17

disto, em casos de um locus ser dialélico, o alelo mais raro (alelo R) deve ter

uma frequência maior que 1% na população. Frente a estas condições, quando

encontramos diferentes alelos de um gene na população, podemos caracterizar

um polimorfismo genético. Apesar de o indivíduo estar constantemente exposto

a mutações, nem sempre elas são manifestadas. A alteração genética mais

comum é a que muda apenas um único par de bases e é denominada de

mutação de ponto. As transições são o subtipo mais comum de mutação de

ponto, sendo caracterizadas por substituições do par G-C (guanina-citosina)

pelo par A-T (adenina- timina) ou vice-versa (SCHORK et al., 2000).

Fatores de risco genético podem aumentar diretamente a probabilidade

do desenvolvimento de lesão perirradicular e, se ausente, reduzem ou inibem

esta possibilidade. Eles são partes de um risco casual ou exposição do

hospedeiro a este risco. Sendo assim, pode ser possível afirmar que um alelo,

no qual é originalmente definido como R-alelo, está associado com a ausência

de doença e, em alguns casos, o fator genético pode ser considerado protetor

(LOOS et al., 2005).

Há diversos argumentos usados para justificar o motivo pelo qual os

genes modificados para o Fator de Necrose Tumoral-alfa (TNF-α), interleucina-

1α (IL-1α) e interleucina-1β (IL-1β) aparentam ser bons candidatos para os

estudos genéticos em periodontite (KORNMAN et al., 1997). Dentre eles,

destaca-se uma evidência sugestiva que a IL-1 e o TNF-α são potentes

mediadores imunológicos com propriedades pró-inflamatórias (GRAVES &

COCHARAN, 2003). Além do mais, a IL-1 e o TNF-α têm a capacidade de

estimular a reabsorção óssea e regularem a proliferação celular de fibroblatos.

Fatores determinados geneticamente, através de diferenças interindividuais,

podem ser observados na produção de IL-1α, IL-1β e TNF-α de indivíduos com

periodontite e saudáveis. Logo, é concebível que níveis diferenciados desses

mediadores químicos podem ser denominados de fatores de risco (GENCO et

al., 1999).

A lesão perirradicular é a consequência de uma interação genética,

ambiental, fatores microbiológicos e do hospedeiro (WOLFF et al., 1994;

TURNER et al., 1997). A presença de micro-organismos é um fator

determinante na doença periodontal inflamatória, mas a progressão da doença

pode ser determinada através de fatores de risco do hospedeiro como, por

18

exemplo: genética, idade, gênero, tabagismo, fatores socioeconômicos e certas

doenças sistêmicas.

Tabagismo (BERGSTRÖM, 1989; KORNMAN et al., 1997; CULINAN et

al., 2001; LAINE et al., 2001) e diabetes mellitus (COLLIN et al., 1998) são

fatores de risco relatados na literatura como influenciadores da patogênese das

doenças periodontais. Além disso, a capacidade do indivíduo de lidar com o

estresse tem sido associada com o aumento da severidade da doença

periodontal e tem sido sugerida como um fator de risco (GENCO et al., 1999).

Diversas linhas de evidência científica tem enfatizado a influência de fatores

genéticos do hospedeiro na patogênese e no curso clínico da doença

periodontal em adultos (MICHALOWICZ, 1994; LOOS et al., 2005; YOSHIE et

al., 2007).

O mecanismo pelo qual se considera o tabagismo um importante

modificador da doença é relatado por pesquisadores através de sua ação na

vascularização, ao gerar constantes vasoconstricções e diminuir o suprimento

de oxigênio; no sistema imune humoral, ao reduzir a proliferação de células B,

T e imunoglobulinas; na inflamação, ao estimular a destruição tecidual e

aumentar a secreção de mediadores químicos; e, na quimiotaxia, alterando a

fagocitose pelos neutrófilos (BERGSTRÖM, 1989; KORNMAN et al., 1997;

CULINAN et al., 2001; LAINE et al., 2001; SIQUEIRA, 2011).

Atualmente, existem poucos estudos relacionando genes modificadores

de doença com a patogênese da periodontite. Logo, as investigações têm se

concentrado na identificação de polimorfismos genéticos envolvidos em

diferentes aspectos da resposta do hospedeiro e na sua capacidade de gerar

um comprometimento imunológico (LOOS et al., 2010).

Polimorfismo Genético

Cluster of Differentiation 14 (CD14)

O CD14 é uma proteína descrita como o maior receptor de endotoxina e

atuante no sistema imune inato durante o reconhecimento de

lipopolissacarídeos (LPS), um elemento constitutivo da membrana externa da

parede celular de bactérias Gram-negativas. Essa ligação permite o início da

19

resposta imune frente à invasão bacteriana. Essa proteína é expressa,

primeiramente, na superfície de monócitos, macrófagos e neutrófilos, podendo

ser também expresso na superfície de células mielóides, e, em números

reduzidos nos linfócitos B, basófilos e células mamárias. O seu papel na

resposta do hospedeiro é constatado durante a sua participação na fagocitose

de bactérias Gram-negativas, na reabsorção óssea e na interação dos

monócitos com as células endoteliais. Além do mais, mudanças na expressão

do CD14 e dos seus níveis plasmáticos têm sido associadas ao

desenvolvimento de lesões periradiculares (GRUNWALD et al., 1996; ANTAL-

SZALMÁS, 2000; HOLLA et al., 2002; DE SÁ et al., 2007; SIQUEIRA, 2011).

No entanto, o CD14 não consegue se ligar diretamente ao LPS. Uma

molécula chamada proteína ligante de LPS (LBP) necessita primeiro se ligar ao

LPS (YAMAZAKI et al., 1992). O complexo formado pelo LPS-LPB permite a

sua interação com o CD14 e, assim, o complexo receptor-ligante é

internalizado. Todo este processo é responsável por transferir o LPS para o

receptor tipo toll-4 (TLR4). Os receptores TLR têm sido identificados como

sensores primários de infecções microbianas e permitem avanços significativos

na compreensão dos mecanismos envolvidos na imunidade inata e adquirida

(POLTORAK et al., 1998; AKIRA et al., 2001). A ativação de receptores TLR4

pode desencadear diversas vias de sinalização no interior das células de

defesa. Uma das principais vias ativadas pelo LPS é a via do Fator de

transcrição Nuclear β (NFKβ) que, ao se translocar para o núcleo, promove a

transcrição de diversos genes que participam de processos fisiológicos

caracterizados pelos processos inflamatórios e imunes (RAETZ & WHITFIELD,

2002; YOSHIE et al., 2007; SIQUEIRA, 2011).

WANG et al. (2003) destacaram que os TLRs medeiam a sinalização

intracelular, a resposta antimicrobiana, a identificação de patógenos e exercem

um papel central na imunidade inata. TLR2 e TLR4, ambos com o co-receptor

para CD-14, estão envolvidos na identificação de patógenos padrões Gram-

positivos e Gram-negativos, formando um grupo de interesse para a

abordagem genética. A ligação desses receptores resulta na ativação de NFKβ,

seguido pela transcrição de diversas citocinas genéticas pró-inflamatórias,

como por exemplo, TNF-α, IL-1α e IL-1β, nas quais codificam proteínas que

têm sido associadas com periodontites. Logo, a expressão de CD14, TLR4 e

20

TLR2 nos tecidos periodontais suportam a importância desses receptores na

patogênese das lesões perirradiculares (JAMES et al., 2007).

HUBACEK et al. (1999) buscaram a identificação do polimorfismo do

CD14 e examinaram o quanto este marcador genético influência na expressão

do CD14 nos monócitos de pacientes com predisposição ao infarto do

miocárdio. Os resultados moleculares revelaram que a região promotora do

polimorfismo do CD14 (-206 C/T) exibiu aumento da transcrição do gene para o

CD14. Indivíduos portadores do genótipo T/T demonstraram níveis

significativamente aumentados do CD14 em monócitos, quando comparados

com os portadores do genótipo C/C e C/T. Frente aos resultados, estes autores

concluíram que além dos fatores de risco bem estabelecidos, uma reação

geneticamente determinada de monócitos/macrófagos a estímulos infecciosos

podem desempenhar um papel importante no processo da aterosclerose.

LAINE et al. (2005) realizaram um estudo com o intuito de avaliar a

influência de genes polimórficos do CD14 e TLR4 em pacientes adultos e com

periodontite. No mesmo, foi realizada a coleta do material genético de 100

pacientes portadores de periodontite e 99 pacientes saudáveis. O polimorfismo

genético foi analisado com auxílio da Reação em Cadeia Polimerase (PCR) e

os resultados permitiram que os autores afirmassem que o genótipo do CD14

(- 206 T/T) contribuiu para a susceptibilidade da periodontite em caucasianos.

Diversos autores têm reconhecido que a produção de medidores

químicos e que a expressão do gene CD14 em células receptoras variam

amplamente entre os indivíduos. Essas diferenças entre os indivíduos podem

ser explicadas, parcialmente, pela presença do polimorfismo genético em

muitos genes (DI GIVIONE et al., 1992; MC DOWELL et al., 1995; TURNER et

al., 1997; YAMAZAKI et al., 2003). Formas variantes do material genético

podem resultar numa expressão alterada dos genes ou em mudanças

funcionais nas moléculas codificadas. E assim, tornando os indivíduos com

aberrações genotípicas mais susceptíveis a adquirirem uma doença ou o

aumento na severidade da mesma (DE SÁ et al., 2007).

O mesmo fato pode ser verificado com o CD14. O gene para o receptor

do CD14 tem sido localizado no cromossomo 5 (região 5q23-21) (ANTAL-

SZALMÁS, 2000; HOLLA et al., 2002). Na região promotora, o gene polimórfico

está presente através da transição da base nucleotídea C-T identificada na

21

posição -159 (HOLLA et al., 2002; TERVONEN et al., 2007). Logo, a alteração

genética supracitada pode exercer forte influência na expressão desta proteína

nos monócitos, neutrófilos e macrófagos (HOLLA et al., 2002; TERVONEN et

al., 2007).

1.1.3. Aplicação de métodos moleculares

Antes do advento dos métodos moleculares, o método de cultura tinha

significativa preferência para a análise da microbiota endodôntica. Os métodos

de cultura permitem a análise de uma gama de informações sobre a etiologia

da lesão perirradicular, composição da microbiota em diferentes condições

clínicas, efeitos terapêuticos na eliminação da microbiota, suscetibilidade dos

micro-organismos endodônticos aos antibióticos, dentre outras (SIQUEIRA &

RÔÇAS, 2004). Estudos que utilizam cultivo apresentam limitações que

dificultam uma análise completa da microbiota endodôntica. A identificação de

micro-organismos não cultiváveis, através de métodos moleculares tem

causado uma revolução no estudo da Microbiologia (SCHORK et al., 2000;

SIQUEIRA & RÔÇAS, 2004; SIQUEIRA & RÔÇAS, 2009).

O método da PCR representa um tipo de método molecular. Este

método possibilita identificar qualquer gene de diferentes organismos, o que

torna esta técnica a mais importante nos projetos de sequenciamento do

genoma. Um grande avanço tecnológico no diagnóstico clínico tem sido

oriundo da aplicação da PCR para a detecção de micro-organismos

patogênicos. Este método é caracterizado pela replicação in vitro do ácido

desoxirribonucleico (DNA) através de repetitivos ciclos de desnaturação do

material genético, anelamento e extensão de novas cadeias de DNA. A análise

da PCR é realizada utilizando-se gel de agarose e visualizado através de um

transiluminador de ultravioleta. Geralmente um padrão de peso molecular é

adicionado em uma das fileiras do gel sendo possível assim avaliar o tamanho

do fragmento amplificado (PEAKE, 1989; LEE & TIRNADY, 2003; SIQUEIRA &

RÔÇAS, 2004).

Variações da tecnologia da PCR têm sido desenvolvidas. As mais

utilizadas são: PCR espécie-específica, PCR multiplex, nested PCR, reverse

22

transcriptase-PCR, PCR quantitativa em tempo real, PCR genotipagem por

PCR e broad-range PCR (SIQUEIRA & RÔÇAS, 2004).

23

2- JUSTIFICATIVA

Modificadores de doença podem influenciar a resposta do hospedeiro ao

tratamento endodôntico. Não há estudos avaliando a associação do

polimorfismo do gene do CD14 com a resposta pós-tratamento endodôntico.

Estudos desta natureza têm o potencial de contribuir para o entendimento da

patogênese das lesões perirradiculares.

24

3- HIPÓTESE

O polimorfismo genético do CD14 tem influência na resposta do

hospedeiro durante o tratamento das lesões perirradiculares, tendo em vista

resultados observados na literatura referente à doença periodontal.

25

4- PROPOSIÇÃO

O objetivo deste estudo retrospectivo foi avaliar se há associação entre

os diferentes genótipos e alelos do gene do CD14 com a resposta ao

tratamento endodôntico.

26

5- MATERIAIS E MÉTODOS

Os critérios de inclusão e a coleta das amostras deste estudo estão de

acordo com a metodologia aplicada por PROVENZANO (2008) e GUILHERME

et al. (2011) e aprovada pelo Comitê de Ética desta Universidade (Anexo 1). Os

pacientes assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo

2).

5.1- Seleção de pacientes

Os pacientes que participaram deste estudo apresentaram o tratamento

endodôntico concluído por especialistas ou por alunos de especialização, há

pelo menos um ano antes da coleta da amostra em uma das seguintes

instituições: Faculdade de Odontologia da Universidade Estácio de Sá

(UNESA) – RJ, Odontoclínica Central do Exército (OCEX) e Hospital Central da

Aeronáutica (HCA). Foram incluídas, neste estudo, alíquotas das amostras da

saliva de 67 pacientes de casos retrospectivos, coletados em estudos prévios

(PROVENZANO, 2008; SIQUEIRA & RÔÇAS, 2009; GUILHERME et al., 2011).

Com a finalidade de aumentar o número de casos e permitir análise estatística

mais robusta, foram também adicionados 16 pacientes oriundos da

Odontoclínica Central da Marinha (OCM). Todas as amostras coletadas e

analisadas seguiram estritamente os critérios de inclusão quanto à qualidade

do tratamento endodôntico e da restauração coronária.

5.1.2- Critérios de Inclusão

Foi preenchido um Questionário de Acompanhamento Clínico

Endodôntico (Anexo 5), o qual contém aspectos gerais de saúde e de hábitos

adquiridos dos pacientes. Os critérios de inclusão e de classificação do

tratamento endodôntico propostos para este estudo foram preconizados por

SIQUEIRA et al. (2009) como descritos a seguir:

Cada indivíduo apresentou somente um dente com canal tratado, ou

mais de um dente tratado, desde que revelasse a mesma condição

27

perirradicular na radiografia de acompanhamento do tratamento

endodôntico (reparo, em reparo ou não reparado).

Todos os indivíduos apresentaram o diagnóstico inicial de necrose

pulpar com lesão perirradicular associada na ocasião do tratamento

endodôntico.

Foram incluídos neste estudo, somente pacientes com tratamento

realizado há mais de um ano.

Os dentes incluídos neste estudo, por sua vez, deveriam apresentar

obturação endodôntica adequada. Foi considerado tratamento

endodôntico adequado quando todos os canais radiculares estavam

obturados, sem espaço vazio (obturação homogênea) e com limite

apical da obturação de 0 a 2 mm aquém do ápice radiográfico. Foi

considerado tratamento endodôntico inadequado quando os canais

radiculares estavam obturados a mais de 2 mm aquém do ápice

radiográfico, apresentaram sobreobturação grosseira, obturação com

espaços vazios, densidade radiográfica inadequada ou dentes

multirradiculares com algum canal radicular não tratado.

Foram incluídos apenas dentes com restauração coronária adequada. A

restauração coronária foi considerada adequada quando não havia lesão

cariosa, estava clínica e radiograficamente intacta e com boa adaptação

marginal. Foi considerada inadequada quando a restauração

apresentava falta de selamento marginal ou cárie recorrente.

5.2- Exame Clínico e Radiográfico

A condição perirradicular dos dentes em questão, bem como a condição

do tratamento endodôntico e da restauração coronária, foram avaliados por

exames clínicos e radiográficos.

Para a realização do exame clínico, foram empregados a sonda

exploradora dupla, o espelho bucal e a pinça clínica. No exame radiográfico,

foram realizadas radiografias periapicais com o auxílio de posicionadores

radiográficos (Maquira, Maringá, PR). As radiografias foram avaliadas por dois

examinadores previamente calibrados com um kit de 100 radiografias. Os

28

casos foram classificados de acordo com a metodologia proposta como

sucesso ou fracasso do tratamento endodôntico.

5.3- Classificação do resultado do tratamento endodôntico

O resultado do tratamento endodôntico foi classificado de acordo com

evidências clínicas e radiográficas. Foi utilizada uma radiografia do término do

tratamento e uma radiografia de acompanhamento do dente tratado para

categorizar o resultado do tratamento endodôntico de acordo com os critérios

de STRINDBERG (1956):

a) Reparo: contorno e espessura do espaço do ligamento periodontal normais,

ou o contorno do espaço do ligamento periodontal espessado, principalmente

em torno de excesso apical da obturação (se presente). Nos casos de

sobreobturação, o osso circunvizinho ao material extravasado deverá

apresentar espessura normal.

b) Em reparo: radioluscência perirradicular claramente em processo de redução

de tamanho.

c) Não reparo: radioluscência perirradicular inalterada ou aumentada na

radiografia de acompanhamento clínico, quando comparada com a radiografia

final ao término do tratamento endodôntico. Também foram categorizados

como não reparados, os casos com mais de quatro anos em que a

radioluscência perirradicular tivesse diminuído, mas não desaparecido

totalmente.

Em dentes com mais de um canal radicular, a referência do resultado do

tratamento foi o canal que apresentou o resultado mais desfavorável.

Desta forma, após o exame clínico e radiográfico, foram julgados como

sucesso os casos em que ocorreu reparo total ou regressão evidente do

diâmetro inicial da lesão perirradicular, quando comparado ao exame

radiográfico inicial à época do tratamento endodôntico. Além disso,

clinicamente não havia presença de dor, tumefação, fístula e mobilidade.

Por outro lado, nos casos tidos como fracasso, houve a presença de dor

espontânea, sensibilidade dolorosa à percussão ou à palpação da região

apical, desconforto à mastigação, presença de tumefação, fístula e/ou o

diâmetro inicial da lesão perirradicular permaneceu igual ou aumentou, quando

29

comparado ao diâmetro à época do tratamento endodôntico. Os casos que

apresentaram lesões perirradiculares com o tamanho reduzido, ou seja, sem a

remissão total da lesão após quatro anos, também foram considerados como

fracasso. Todos os casos de fracasso foram agrupados em lesão perirradicular

≤ 5 mm e lesão > que 5 mm.

5.4- Coleta da Amostra

Os procedimentos de coleta das amostras clínicas foram realizados de

acordo com estudos anteriores (SIQUEIRA & RÔÇAS, 2009; GUILHERME et

al., 2011). Cada indivíduo realizou um bochecho com 10 ml de solução salina

estéril (NaCl) a 0,9% por 1 min. Após o bochecho, o paciente depositou a

saliva em um coletor universal estéril. As amostras foram armazenadas em

temperatura de -20°C até a etapa da extração do DNA.

Cada amostra foi identificada com o nome do paciente e instituição de

origem através de um número sequencial e seus dados serão organizados

numa planilha de Excel 2007 (Microsoft Brasil, São Paulo, SP).

5.5- Extração do DNA

As amostras foram descongeladas por 10 min a uma temperatura de

37°C; então, as células epiteliais orais foram centrifugadas (Eppendorf 5415 C,

Hamburg, Alemanha) em 300 g por 10 min. O pellet foi lavado duas vezes: uma

por centrifugação em solução salina a 0,9%, ressuspenso em 100 µL com 50

mM de hidróxido de sódio (NaOH) e fervido por 10 min. As amostras de saliva

foram neutralizadas com 14 µL de tampão a 1 mol/L Tris (pH 7,5) e

centrifugadas em 14.000 g por 3 min. Os sobrenadantes foram coletados e

armazenados a 4°C até análise posterior (LAINE et al., 2000).

5.6- Análise do polimorfismo genético

O polimorfismo genético foi avaliado pela PCR. A sequência de primers

da PCR com os seus respectivos tamanhos de amplicons é apresentada na

Tabela 1. A PCR foi realizada em um termociclador de DNA (Mastercycler

30

Personal Eppendorf, Hamburgo, Alemanha). A solução para a reação de PCR

consistiu em 2 µL do DNA extraído das amostras, 5 µL de tampão de PCR 10X

(Fermentas, Burlington, Canada), 1 µM de cada primer, 1 U Taq DNA

polimerase (Fermentas), 25 mM de cloreto de magnésio (MgCl2) e 0,2 mM de

cada de cada desoxirribonucleosídeo trifosfatado (Biotools, Madri, Espanha). A

reação foi sujeita a 40 ciclos de amplificação utilizando-se o seguinte perfil de

temperatura: desnaturação a 95°C por 30 s, anelamento dos primers a 59°C

por 30 s e extensão do produto da PCR a 72°C por 1 min. Em seguida, os

produtos da PCR foram analisados em gel de agarose a 2%. Os produtos

foram então digeridos com a enzima de restrição HaeII (New England Labs,

Ipswich, MA, EUA) a 37°C/3h. Os fragmentos gerados foram visualizados em

eletroforese em gel de agarose a 4%. A digestão por Haell gera dois

fragmentos (83 e 24bp) para o alelo C e um fragmento para o alelo T (107bp).

Tabela 1. Sequência de primers, enzima de restrição e genótipos para o CD14

Gene Primer Enzima de

Restrição

Genótipos

(Tamanho dos

Amplicons)

CD14

- 260

(C/T)

5’-TCACCTCCCCACCTCTCTT-3’

5’-CCTGCAGAATCCTTCCTGTT-3’

(LAINE et al.,2005)

HaeIII

(37ºC/3h)

TT= 107 bp

CT=24 +83 +

107bp

CC=24+83bp

5.7- Controle da PCR

Para verificar a disponibilidade de DNA humano nas amostras para

análise, alíquotas de 5 µL de DNA extraído de amostras clínicas foram

submetidas a PCR através da aplicação de primers direcionados ao receptor

da célula T do gene Vα22 (V22f:5’-GAT TCA GTG ACC CAG ATG GAA GGG-

3’ e V22r:5’-AGC ACA GAA GTA CAC CGC TGA GTC-3’), o qual amplifica um

fragmento de 270bp (VAN DEN BERG et al., 2001). A amplificação da PCR foi

31

realizada em 50 µL de uma reação de mistura contendo 5 µL de tampão 10X

(Fermentas), 3 mM MgCl2, e 0,2 mM de cada deoxirribonucleosídeo

trifosfatado (Biotools). As condições da PCR foram 94ºC/5 min seguidos de 45

ciclos de 94ºC/45 s, 60°C/30 s, e 72°C/1,5 min, e uma etapa final de extensão

de 72°C/10 min.

5.9- Análise Estatística

Toda a análise estatística empregada no presente estudo foi realizada

utilizando-se o programa estatístico SPSS (Statistical Package for the Social

Sciences, versão 17.0). Na primeira etapa, foi realizada uma análise descritiva

incluindo a variável tratamento endodôntico (fracasso ou sucesso) (variável

dependente, variável desfecho ou variável de interesse), além das covariáveis

(variáveis independentes ou variáveis explicativas) estudadas, tais como

gênero, raça, tabagismo e polimorfismo genético do CD14. Os dados

descritivos foram obtidos através do cálculo da frequência e percentagem das

categorias dentro de cada variável. Na segunda etapa da análise dos dados, foi

aplicado o teste Qui-quadrado (ou teste Exato de Fisher) para cada covariável

em relação ao tratamento endodôntico, com a finalidade de verificar a

existência de associação significativa (p<0,05).

Na etapa seguinte, um modelo logístico binário não ajustado entre o

resultado do tratamento endodôntico e as covariáveis foi aplicado com o

objetivo de medir a associação para o polimorfismo genético do CD14, além

das outras covariáveis, através do cálculo da razão de chances (RC) (Odds

Ratio – OR) e do intervalo de confiança (IC 95%).

A última etapa da análise estatística utilizou um modelo logístico binário

ajustado multivariado para estimar a influência do polimorfismo genético do

CD14 no resultado do tratamento endodôntico, ajustado para as covariávies

gênero, raça e tabagismo. Para esta análise múltipla, só foram utilizadas as

variáveis que apresentaram p<0,20 na análise não ajustada. O método

utilizado para inserir as variáveis no modelo foi o backward stepwise, o qual

envolve inicialmente todas as variáveis escolhidas. Posteriormente, estas vão

sendo gradativamente excluídas até formar o modelo final.

32

6- RESULTADOS

Nenhuma diferença estatisticamente significativa foi observada entre os

genótipos CC, CT e TT e os alelos C e T polimórficos (p>0.05) no

sucesso/fracasso do tratamento endodôntico. A Tabela 2 apresenta as

características descritivas dos 83 pacientes incluídos no estudo. A maioria era

branca (69,9%), não tabagista (82,7%) e pertencia ao sexo feminino (57,8%).

Os pacientes portadores de dentes definidos como fracasso do tratamento

endodôntico representavam 49,4%. No que diz respeito ao polimorfismo do

CD14, o genótipo CT (42,2%) e o alelo C (53,6%) foram detectados com maior

frequência.

O grupo de pacientes portadores de dentes definidos como fracasso do

tratamento endodôntico foi comparado com aquele portador de dentes

considerado sucesso, para todas as variáveis estudadas. Diferença

statisticamente significante foi observada somente para as variáveis gênero

(p=0,047, teste Qui-quadrado) e tabagismo (p=0,020, teste exato de Fisher)

(Tabela 3).

Os resultados da regressão logística binária não ajustada (modelo

simples) e ajustada (modelo multivariado) para estimar a influência do

resultado do tratamento endodôntico estão apresentados com as covariáveis

na Tabela 4. No modelo logístico binário não ajustado, as covariáveis

polimorfismo do CD14 e raça não demonstraram associação significativa com o

resultado do tratamento endodôntico, enquanto para gênero (p=0,038) e

tabagismo (p=0,024) foi observada associação direta significativa. Com relação

ao gênero, foi demonstrado que a chance de fracasso do tratamento

endodôntico é quase três vezes maior nos homens quando comparado com as

mulheres. No caso do tabagismo, a chance de fracasso é quatro vezes maior

em pacientes fumantes do que em não fumantes.

33

Tabela 2. Análise descritiva dos 83 pacientes de acordo com as variáveis

estudadas

Variáveis N %

Gênero

Feminino 48 57,8

Masculino 35 42,2

Raça

Pardo 12 14.4

Branco 58 69,9

Negro 13 15,7

Tabagismo

Não 67 82,7

Sim 14 17,3

Tratamento endodôntico

Sucesso 42 50,6

Fracasso 41 49,4

Polimorfismo genético do CD14

Genótipo

CC 27 32,5

CT 35 42,2

TT 21 24,3

Alelos

C 89 53,6

T 77 46,4

34

Tabela 3. Análise bivariada entre tratamento endodôntico e as covariáveis

estudadas

Covariáveis Tratamento Endodôntico P valor*

Sucesso Fracasso

N(%) N(%)

Gênero¶

0,047

Feminino 29 (60.4) 19 (39,6)

Masculino 13 (37,1) 22 (62,9)

Raça* 0,237

Pardo 4 (33,3) 8 (66,7)

Branco 33 (56,9) 25 (43,1)

Negro 5 (38,5) 8 (61,5)

Tabagismo* 0,020

Não 38 (56,7) 29 (43,3)

Sim 3(21,4) 11 (78,6)

Polimorfismo genético do

CD14

Genótipo¶ 0,308

CC 17 (63,0) 10 (37,0)

CT 16 (45,7) 19 (54,3)

TT 9 (42,9) 12 (57,1)

Alelos¶ 0,909

C 50 (56,2) 39 (43,8)

T

34 (44,2) 43 (55,8)

¶ Teste Qui-quadrado,

*Teste exato de Fisher;

35

No modelo logístico ajustado, foram incluídas todas as covariáveis

estudadas (gênero, raça, tabagismo e polimorfismo genético do CD14), pois

apresentaram p<0,20 no modelo não ajustado. O método backward stepwise

exclui as variáveis gradativamente até chegar ao modelo final. As covariáveis

polimorfismo genético do CD14 e raça foram excluídas no primeiro e segundo

passos, respectivamente. A modelagem se encerrou no terceiro passo e

manteve a associação significativa com o resultado do tratamento endodôntico

somente para as covariáveis gênero (p=0,048) e tabagismo (p=0,030),

demonstrando resultados semelhantes para os valores das RC observados no

modelo não ajustado.

Tabela 4. Modelo logístico não ajustado e ajustado para estimar a associação

entre o resultado do tratamento endodôntico e as covariáveis estudadas

Covariáveis RC não ajustada

(IC 95%)

P

valor*

RC ajustada

(IC 95%)

P valor*

Gênero

Feminino 1 1

Masculino 2,58 (1,05 – 6,34) 0,038 2,6 (1,01 – 6,70) 0,048

Raça

Pardo 1

Branco 0,38 (0,10 – 1,40) 0,146

Negro 0,80 (0,15 – 4,12) 0,790

Tabagismo

Não 1

Sim 4,8 (1,23 – 18,81) 0,024 4,66 (1,16 – 18,75) 0,030

Genótipo

CD14

CC 0,44 (0,14 – 1,41) 0,169

CT 0,89 (0,30 – 2,65) 0,835

TT 1

36

7- DISCUSSÃO

O presente estudo buscou verificar se a susceptibilidade ao fracasso da

terapia endodôntica está ou não associada ao polimorfismo do gene CD14

(-260 T/T). Tal hipótese parte do pressuposto que o fator microbiano é o

principal agente etiológico e que os fatores ambientais e genéticos podem

determinar a predisposição, resistência e severidade de um processo

inflamatório (WOLFF et al., 1994; TURNER et al., 1997; LOSS et al., 2005;

SIQUEIRA, 2011).

A escassez de estudos avaliando a influência do polimorfismo genético

do CD14 no desenvolvimento de lesão perirradicular ou no prognóstico do

tratamento endodôntico prevalece na literatura científica (SIQUEIRA, 2011). No

entanto, as evidências científicas relatadas sugerem que a expressão do

receptor do CD14 pode estar associada com a doença periodontal (HUBACEK

et al., 1999; LAINE et al., 2005; JAMES et al., 2007).

Diante dos aspectos mencionados, as diversidades encontradas nas

frequências dos genótipos TT, CT e CC podem estar fortemente relacionadas

com o fator geográfico (SIQUEIRA et al., 2009). HOLLA et al. (2002) avaliaram

o polimorfismo genético do CD14 em uma população caucasiana e relataram

uma possível associação com a severidade da periodontite marginal. LAINE et

al. (2005) avaliaram a frequência do gene polimórfico CD14 em pacientes

holandeses, adultos e com periodontite severa. Frente aos resultados, os

autores constataram forte associação do polimorfismo na doença periodontal.

YAMAZAKI et al. (2003) encontraram uma significante diferença na distribuição

do genótipo entre os pacientes japoneses com menos de 35 anos quando

comparados com pacientes maiores de 35 anos. Assim, os autores sugeriram

que o polimorfismo pode estar relacionado com a patogenicidade da doença na

fase precoce. A variabilidade de etnias e raças torna-se um grande obstáculo

para os estudos comparativos e obtenção de populações homogêneas. Fato

que não foi observado neste estudo, onde apesar da variabilidade racial

presente no local de coleta das amostras, não foi constatada influência

significativa (p=0,237) da raça com a presença ou ausência de lesão

perirradicular, ou seja, no sucesso ou fracasso do tratamento endodôntico.

37

DE SÁ et al. (2007) não encontraram associação de genótipos e alelos

do CD14 com o desenvolvimento de quadros sintomáticos. Os autores

ressaltaram não haver indícios que poderiam propor uma associação de dor

com as covariáveis raça, gênero e a idade.

LOOS et al. (2005) mencionaram que o alelo-R para o CD14 está

localizado na região promotora (-206) e que o mesmo está vinculado com o

aumento da atividade do gene. Logo, indivíduos homozigotos para o alelo-R

apresentam aumento dos níveis séricos do CD14 na sua forma solúvel e

também na parede dos macrófagos. HOLLA et al. (2002) constataram que nos

pacientes com periodontite marginal severa, indivíduos homozigotos para o

alelo-R do gene do CD14 (-159) apresentavam prevalência de 47,5% e os que

apresentavam periodontite moderada 38,9%. Apesar dos resultados não terem

apresentado diferença estatística, os autores detectaram uma tendência ao

aumento da frequência do alelo-R nos pacientes com a manifestação severa da

doença. Tais resultados corroboram com o presente estudo, que não encontrou

diferença entre as variáveis em casos de fracasso do tratamento endodôntico e

a prevalência do alelo raro (T) (p=0,909).

Neste estudo, nos casos de sucesso após a terapia endodôntica, a

prevalência do genótipo TT foi de 42,9%, e nos que fracassaram a prevalência

foi de 57,1%. Quando os alelos foram avaliados em casos de fracasso do

tratamento endodôntico, a frequência do alelo-R (T) foi de 55,8% e do alelo-N

(C) foi de 44,2%. Apesar dos nossos resultados sugerirem que há um aumento

dos níveis do gene polimórfico (TT) nos casos de fracasso do tratamento

endodôntico, os resultados não foram estatisticamente significativos para a

associação do polimorfismo do CD14 com o sucesso/fracasso do tratamento

endodôntico na avaliação genotípica (p=0,308) e nos alelos avaliados

(p=0,909).

A associação dos níveis elevados do CD14 com a doença periodontal

não é consensual entre os pesquisadores (HOLLA et al., 2002; FOLWACZNY

et al., 2004; LAINE et al., 2005). Estudos comparativos relacionando a

frequência de citocinas e receptores moleculares, como por exemplo para o

CD14 em pacientes com a doença, têm sido realizados (HUBACEK et al.,

1999; LAINE et al., 2005; DE SÁ et al., 2007). Os resultados obtidos nestes

estudos demonstram ausência de diferença estatisticamente significativas e

38

assim condizentes com os resultados observados em nosso estudo (p>0.05).

Diante dos aspectos discutidos, permanece a necessidade de dados adicionais

para que o polimorfismo genético do CD14 possa ser confirmado ou não como

modificador de doença (HOLLA et al., 2002; FOLWACZNY et al., 2004;

TREVONEN et al., 2007).

O polimorfismo genético tem apresentado forte influência em patologias

de caráter sistêmico, visto que também podem interferir na resposta

imunológica e, consequentemente, na patogênese da doença. HUBACEK et al.

(1999) avaliaram a influência do polimorfismo do CD14 como um fator de risco

para o infarto do miocárdio e constataram uma alta frequência do alelo T (-260)

quando comparados com pacientes saudáveis. GAZOULI et al. (2005) reforçam

a questão da interferência do polimorfismo nas doenças sistêmicas. Os autores

buscaram associação deste polimorfismo com a doença de Crohn e

constataram que as frequências do alelo T (50,4%) e do genótipo TT (28,3%)

foram elevadas em pacientes portadores da doença quando comparados com

pacientes saudáveis. Portanto, não há consenso neste aspecto. MOHAMED

ALIZADEH et al. (2006) estudaram o polimorfismo do CD14 em relação à

hepatite B e os resultados não revelaram associação do gene polimórfico TT

(38,1%), pelo contrário, foram encontrados maiores frequências do genótipo

CC (61,9%), que é considerado um genótipo protetor. PASQUALINI et al.

(2012), ao avaliarem a associação entre saúde oral, lesão perirradicular,

polimorfismo do CD14 e doença cardíaca em pacientes de meia idade,

constataram uma relação positiva entre a lesão perirradicular, a periodontite

marginal crônica e a doenças cardíacas. No entanto, quando a relação era feita

com o polimorfismo de gene CD14, os resultados não foram estatisticamente

significativos.

Frente ao exposto, parece válido sugerir que os fatores sistêmicos

influenciam no comportamento da doença. Apesar desses fatores não terem

sido incluídos nas variáveis do presente estudo, torna-se relevante à correlação

dos fatores sistêmicos no prognóstico do tratamento endodôntico.

Para a obtenção de amostras do DNA no presente estudo, o método

aplicado já foi descrito na literatura (LAINE et al., 2000; DE SÁ et al., 2007;

SIQUEIRA et al., 2009; GUILHERME et al., 2011). Sendo caracterizado pela

coleta da saliva do paciente, este procedimento demonstra uma alternativa

39

menos invasiva e consideravelmente econômica (LAINE et al., 2005; DE SÁ et

al., 2007; SIQUEIRA et al., 2009). No entanto, alternativas de obtenção do

material genético como: a coleta de fluido gengival (HOLLA et al., 2002) e de

sangue (HUBACEK et al., 1999; PASQUALINI et al., 2012) são amplamente

utilizadas.

Em busca de adequada padronização dos pacientes, os estudos que

avaliam a influência dos polimorfismos em genes relacionados à inflamação na

susceptibilidade ou severidade das lesões perirradiculares relatam a dificuldade

de obtenção de casos dentro dos critérios estabelecidos (PROVENZANO,

2008; SIQUEIRA et al., 2009; GUILHERME et al., 2011). Dificuldade também

encontrada no presente estudo, o que justifica o tamanho amostral

relativamente baixo.

Dentre os fatores que justificam tal ocorrência, seriam: as amostras

serem obtidas por indivíduo e não por dente e a presença de condições

perirradiculares opostas no mesmo indivíduo (um tratamento adequado

associado à saúde e um tratamento com doença). Esses foram excluídos do

estudo. Os fatores de inclusão também contribuíram para a obtenção reduzida

das amostras. A qualidade da obturação endodôntica, selamento coronário e

as dificuldades na obtenção de radiografias no período de realização do

tratamento, de acordo com os autores, podem afetar significativamente a

aquisição de amostras padronizadas (HOLLA et al., 2002; DE SÁ et al., 2007;

SIQUEIRA et al., 2009).

Os pacientes inseridos neste trabalho foram oriundos da mesma região

(Brasil) e se enquadravam em características socioeconômicas semelhantes. A

seleção consistiu na coleta de dados pessoais dos pacientes como: sexo,

idade, hábitos adquiridos, raça, doenças sistêmicas e aspecto clínico do

elemento em análise. Este estudo demonstrou que dentre todos os pacientes

tabagistas 78,6% estavam diretamente associados com o fracasso da terapia

endodôntica, estabelecendo assim uma diferença estatisticamente significativa

e a constatação da influência do tabagismo no prognóstico do tratamento.

Um grande obstáculo encontrado na literatura tem sido os estudos que

investigam a interferência dos fatores genéticos no prognóstico do tratamento

sem considerar outros aspectos como o tabagismo e o sexo. Indivíduos

fumantes parecem ter um risco aumentado para o desenvolvimento de doença

40

periodontal (LAINE et al., 2001). Isso indica que a interação gene-tabagismo é

fortemente aceita na determinação da susceptibilidade para a doença

(BERGSTRӦM, 1989; KORNMAN et al., 1997; CULLINAN et al., 2001).

Similarmente, o presente estudo constatou que, no caso do tabagismo, a

chance de fracasso é aproximadamente quatro vezes maior em pacientes

fumantes do que em não fumantes. Isto está de acordo com estudos prévios

(KIRKEVANG & WENZEL, 2003; SIQUEIRA et al., 2009).

O presente estudo encontrou associação positiva entre o sexo masculino

e a presença de lesão perirradicular em dentes com canal tratado. Não há

razões aparentes para tais resultados. O sexo do paciente não tem sido um

fator relacionado com o fracasso do tratamento (FRIEDMAN, 2009). Em

doença periodontal, desconsiderando a higiene oral entre os gêneros, os

autores ressaltam que fatores fisiológicos (p.ex., níveis de estrogênio) podem

contribuir para o menor risco da doença em mulheres do que em homens

(FOLWACZNY et al., 2004).

Fatores modificadores da doença não são agentes etiológicos, mas

podem amplificar alguns mecanismos patológicos e, consequentemente, gerar

uma resposta imunológica alterada. Além do CD14, outros mediadores

químicos têm sido analisados, como por exemplo, a IL-1, IL-6 (interleucina -6),

TLR-4, TNF –α (WANG et al., 2003; LOOS et al., 2005; YOSHIE et al., 2007).

Esses e tantos outros mediadores têm o potencial de servir como fatores de

risco para as lesões perirradiculares. HOLLA et al. (2002) estão entre os

primeiros autores que documentaram o polimorfismo do CD14 na periodontite

marginal. Em Endodontia, os estudos associando o polimorfismo do gene

CD14 com o sucesso ou fracasso do tratamento endodôntico são escassos

(PASQUALINI et al., 2012). Logo, mais estudos devem ser realizados com uma

amostragem maior de pacientes e em diferentes populações, com o intuito de

gerar mais entendimento da patogênese das lesões perirradiculares.

41

8-CONCLUSÃO

Diante da metodologia empregada e dos resultados obtidos, destacamos

as seguintes conclusões:

1. Não foi constatada interferência significativa do polimorfismo do gene do

CD14 no sucesso/ fracasso do tratamento endodôntico;

2. Pacientes tabagistas demonstraram predisposição quatro vezes maior

para o fracasso da terapia quando comparados com pacientes não-

tabagistas;

3. Pacientes do sexo masculino apresentaram, estatisticamente, maior

predisposição para o insucesso quando comparados com o sexo

feminino.

42

9- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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50

10-ANEXOS

51

ANEXO 1

APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA

Projeto - CAAE - 0018.0.308.000-08

Título do Projeto de Pesquisa

IDENTIFICAÇÃO DE FATORES RELACIONADOS AO SUCESSO DO

TRATAMENTO ENDODÔNTICO

Situação Data Inicial no

CEP

Data Final no

CEP

Data Inicial

na CONEP

Data Final na

CONEP

Aprovado no CEP 18/03/2008

07:50:58

16/04/2008

11:05:41

Descrição Data Documento Nº do Doc Origem

2 - Recebimento de

Protocolo pelo CEP

(Check-List)

18/03/2008

07:50:58

Folha de

Rosto

0018.0.308.000-

08 CEP

1 - Envio da Folha de

Rosto pela Internet

10/03/2008

14:49:57

Folha de

Rosto FR180529 Pesquisador

3 - Protocolo Aprovado

no CEP

16/04/2008

11:05:41

Folha de

Rosto 0029 CEP

52

ANEXO 2

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PÓS-

INFORMAÇÃO PARA PARTICIPAÇÃO EM PESQUISA, CONFORME

RESOLUÇÃO NÚMERO 196 DE 10/10/96, DO CONSELHO NACIONAL DE

SAÚDE.

Título da pesquisa: Fatores modificadores da doença em Endodontia

Pesquisador responsável: Camila Arão Del Aguila

Orientadores: José Freitas Siqueira Júnior

Isabela das Neves Rôças Siqueira

Introdução: Antes de consentir com a sua participação nesta pesquisa como

voluntário (a) é importante e necessário que você leia atentamente as

informações contidas neste documento. Aqui estão os esclarecimentos sobre

os objetivos, os benefícios, os riscos, os desconfortos e os procedimentos

deste estudo. Esclarece-se também o seu direito de interromper a sua

participação no estudo a qualquer momento, bem como liberdade de se

recusar a participar sem qualquer prejuízo para você. Sempre que quiser

poderá pedir mais informações sobre a pesquisa através do telefone de contato

dos pesquisadores responsáveis e, se necessário, por meio do telefone do

Comitê de Ética em Pesquisa.

Objetivos: Este estudo tem por objetivos avaliar se algumas condições

sistêmicas apresentadas pelo paciente como diabetes tipo 2 ou tabagismo

influenciam o resultado do tratamento endodôntico como fatores de severidade

da doença ou modificadores da doença.

Procedimentos: Foram selecionados para esta pesquisa indivíduos que

apresentem tratamento endodôntico realizado há pelo menos um ano. Estes

deverão ter o diagnóstico inicial de necrose pulpar com lesão perirradicular na

época da realização do tratamento. Será realizado exame clínico e radiográfico,

com o intuito de verificar as condições clínicas e radiográficas do(s) dente(s)

em questão, para certificar que estes estão dentro do “critério de inclusão”

proposto no protocolo de pesquisa. Após os exames clínico e radiográfico,

cada indivíduo deverá realizar um bochecho com 10ml de solução salina estéril

53

a 0.9% (soro fisiológico) por 1minuto, que será coletado em um frasco coletor

universal estéril.

Risco e Desconforto: Os procedimentos realizados nesta pesquisa não

oferecem risco e desconforto para você. Estes obedecem aos Critérios da Ética

na Pesquisa com Seres Humanos conforme resolução n.196/96 do conselho

Nacional de Saúde – Brasília – DF

Confidencialidade: Todas as informações coletadas neste estudo são

estritamente confidenciais. Os dados do(a) voluntário(a) serão identificados

com um código, e não com o nome. Apenas os membros da pesquisa terão

conhecimento dos dados, assegurando assim sua privacidade.

Benefícios: Estes procedimentos irão avaliar se o resultado do tratamento

endodôntico pode ser alterado por condições sistêmicas apresentadas pelos

pacientes. Desta forma estas podem atuar como fatores de severidade ou

modificadores da doença. Esperamos que este estudo traga informações

importantes sobre os fatores de severidade da doença em Endodontia, de

forma que o conhecimento que será construído a partir desta pesquisa possa

contribuir para um diagnóstico mais preciso evitando a indicação errônea da

necessidade de retratamento endodôntico e a perda do dente permanente.

Deste modo, os pesquisadores se comprometem a divulgar os resultados

obtidos.

Pagamento: Você não terá nenhum tipo de despesa ao autorizar sua

participação nesta pesquisa, bem como não receberá qualquer remuneração

por esta participação.

Liberdade de recusar ou retirar o consentimento: Você tem a liberdade de

retirar seu consentimento a qualquer momento e deixar de participar do estudo

sem penalidades.

Contato com os pesquisadores: Poderá ser feito através da Clínica de

Endodontia da Odontoclínica Central da Marinha cujo telefone é 2104-6595, e

da secretaria de PPGO da UNESA cujo telefone é 2497-8988. Em caso de

dúvidas quanto aos seus direitos como participante da pesquisa, você deverá

ligar para o Comitê de ética em Pesquisa da UNESA cujo telefone é 3231-

6153.

Consentimento: Li e entendi as informações contidas neste documento. Tive a

oportunidade de fazer perguntas e todas as minhas dúvidas foram respondidas

54

satisfatoriamente. Estou participando desta pesquisa por minha vontade, até

que eu decida o contrário.

Após estes esclarecimentos, solicitamos o seu consentimento de forma

nome livre para permitir sua participação nesta pesquisa. Portanto, preencha

os itens que seguem:

CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Eu________________________________________, RG____________

após a leitura e compreensão destas informações, entendendo que a

participação do(a) menor, ________________________________ sob minha

responsabilidade, é voluntária, e que ele(a) pode sair a qualquer momento do

estudo, sem prejuízo algum. Confiro que recebi cópia deste termo de

consentimento, e autorizo a execução do trabalho de pesquisa e a divulgação

dos dados obtidos neste estudo.

Obs.: Não assine este termo se ainda tiver dúvidas a respeito.

Rio de Janeiro,___/___/______.

Telefone para contato:____________________________________________.

Nome do Voluntário:______________________________________________.

Assinatura do Voluntário ou do Responsável pelo Voluntário:_______________

______________________________________________________________.

Assinatura do Pesquisador:_________________________________________.

Assinatura do Orientador:__________________________________________.

55

ANEXO 3

CASOS RETROSPECTIVOS

Radiografia de

Proservação Dados Gerais Dados Clínicos Resultado

Caso: 1P

Idade: 65

Sexo: Feminino

Raça: Branca

Doenças: Não

Hábitos: Não

Dente: 31

Lesão após: Sim

Dor: Não

Mobilidade: Sim

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa

definitiva

Fracasso

Caso: 2P

Idade: 48

Sexo: Feminino

Raça: Negra

Doenças: Não

Hábitos: Não

Dente: 15

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa

definitiva

Sucesso

Caso: 3P

Idade: 14

Sexo: Feminino

Raça: Branca

Doenças: Não

Hábitos: Não

Dente: 12 / 14

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: 12 –

Boa / 14 – ausente

Sucesso

56

Caso: 4P

Idade: 12

Sexo: Masculino

Raça: Branca

Doenças: Não

Hábitos: Não

Dente: 22

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação: além

Restauração: Boa

definitiva

Sucesso

Caso: 5P

Idade: 50

Sexo: Feminino

Raça: Branca

Doenças: Não

Hábitos: Não

Dente: 12

Lesão após:

Regredindo

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa

definitiva

Sucesso

Caso: 6P

Idade: 49

Sexo: Feminino

Raça: Branca

Doenças:

Hipertireoidismo

Hábitos: Não

Dente: 12

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa

definitiva

Sucesso

Caso: 8P

Idade: 57

Sexo: Masculino

Raça: Branca

Doenças:

Hipertensão

Dente: 34

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Sucesso

57

Hábitos: Não Satisfatória

Restauração: Boa

definitiva

Caso: 9P

Idade: 36

Sexo: Feminino

Raça: Branca

Doenças: Não

Hábitos: Não

Dente: 27

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa

definitiva

Sucesso

Caso: 10P

Idade: 48

Sexo: Feminino

Raça: Branca

Doenças: Não

Hábitos: Não

Dente: 12

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Ausente

Sucesso

Caso: 11P

Idade: 11

Sexo: Masculino

Raça: Branca

Doenças: Não

Hábitos: Não

Dente: 46

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Ruim

definitiva

Sucesso

58

Caso: 13P

Idade: 54

Sexo: Feminino

Raça: Branca

Doenças:

Hipertensão

Hábitos: Não

Dente: 11

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Ausente

Sucesso

Caso: 14P

Idade: 30

Sexo: Feminino

Raça: Branca

Doenças: Não

Hábitos:

Fumante

Dente: 22

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa

definitiva

Sucesso

Caso: 15P

Idade: 48

Sexo:Masculino

Raça: Branca

Doenças:

Hipertensão

Hábitos:

Fumante

Dente: 44

Lesão após: Sim

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa

definitiva

Fracasso

Caso: 16P

Idade: 58

Sexo: Feminino

Raça: Branca

Doenças: Não

Hábitos: Não

Dente: 35

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Sucesso

59

Restauração: Boa

definitiva

Caso: 18P

Idade: 14

Sexo: Masculino

Raça: Branca

Doenças: Não

Hábitos: Não

Dente: 11

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Ausente

Sucesso

Caso: 20P

Idade: 41

Sexo: Feminino

Raça: Branca

Doenças: Não

Hábitos:

Onicofagia

Dente: 15

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa

provisória

Sucesso

Caso: 21P

Idade: 10

Sexo: Feminino

Raça: Branca

Doenças: Não

Hábitos: Não

Dente: 36

Lesão após:

Regredindo

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Ausente

Sucesso

Caso: 22P

Idade: 32

Sexo: Feminino

Raça: Branca

Doenças: Não

Dente: 14 / 15

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Sucesso

60

Hábitos:

Onicofagia

Obturação:

Satisfatória

Restauração: 14 -

Boa provisória / 15 –

Ausente

Caso: 24P

Idade: 41

Sexo: Masculino

Raça: Branca

Doenças: Não

Hábitos:

Onicofagia

Dente: 24

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa

provisória

Sucesso

Caso: 25P

Idade: 18

Sexo: Masculino

Raça: Branca

Doenças: Não

Hábitos:

Fumante

Dente: 45

Lesão após:

Regredindo

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Ausente

Sucesso

Caso: 26P

Idade: 22

Sexo: Masculino

Raça: Branca

Doenças:

Diabetes

Hábitos:

Bruxismo

Dente: 36

Lesão após: Sim

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Sim

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa

provisória

Fracasso

61

Caso: 28P

Idade: 22

Sexo: Feminino

Raça: Branca

Doenças: Não

Hábitos:

Bruxismo

Dente: 46

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração:Boa

definitiva

Sucesso

Caso: 30P

Idade: 46

Sexo:Masculino

Raça: Branca

Doenças: Não

Hábitos:

Fumante

Dente: 16

Lesão após: Sim

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa

definitiva

Fracasso

Caso: 31P

Idade: 66

Sexo: Feminino

Raça: Branca

Doenças:

Hipertensão

Hábitos: Não

Dente: 41

Lesão após:

Regredindo

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa

definitiva

Sucesso

Caso: 33P

Idade: 43

Sexo: Masculino

Raça: Negra

Doenças: Não

Dente: 46

Lesão após: Sim

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Fracasso

62

Hábitos: Não Obturação:

Satisfatória

Restauração:Boa

definitiva

Caso: 34P

Idade: 56

Sexo: Feminino

Raça: Branca

Doenças: Não

Hábitos: Não

Dente: 45

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Ausente

Sucesso

Caso: 35P

Idade: 65

Sexo: Masculino

Raça: Branca

Doenças:

Hipertensão/

Diabetes

Hábitos: Não

Dente: 14

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa

definitiva

Sucesso

Caso: 36P

Idade: 77

Sexo:Masculino

Raça: Negra

Doenças: Não

Hábitos: Não

Dente: 26

Lesão após: Sim

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa

definitiva

Fracasso

63

Caso: 37P

Idade: 40

Sexo: Feminino

Raça: Negra

Doenças: Não

Hábitos: Não

Dente: 41

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa

definitiva

Sucesso

Caso: 38P

Idade: 62

Sexo: Feminino

Raça: Branca

Doenças: Não

Hábitos: Não

Dente: 44

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração:Boa

definitiva

Sucesso

Caso: 39P

Idade: 44

Sexo: Feminino

Raça: Branca

Doenças: Não

Hábitos:

Fumante

Dente: 43 / 44

Lesão após: Sim

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação: 43-

aquém/ 44-além

Restauração: Boa

definitiva

Fracasso

Caso: 40P

Idade: 65

Sexo: Feminino

Raça: Negra

Doenças: Não

Hábitos: Não

Dente: 37

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Sucesso

64

Restauração: Boa

definitiva

Caso: 42P

Idade: 73

Sexo:Masculino

Raça: Branca

Doenças: Câncer

de próstata

Hábitos: Não

Dente: 34

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa

definitiva

Sucesso

Caso: 43P

Idade: 68

Sexo:Masculino

Raça:Negra

Doenças:

Hipertensão

Hábitos: Não

Dente: 32

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação: Satisfatória

Restauração:Boa

definitiva

Sucesso

Caso: 44P

Idade: 31

Sexo:Masculino

Raça: Negra

Doenças: Não

Hábitos: Não

Dente: 34

Lesão após: Sim

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa

definitiva

Fracasso

Caso: 1R

Idade: 27

Sexo: Feminino

Raça: Branca

Doenças: Não

Dente: 26

Lesão após: Sim

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Fracasso

65

Hábitos: Não Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa

definitiva

Caso: 7R

Idade: 45

Sexo: Feminino

Raça: Branca

Doenças: Não

Hábitos: Não

Dente:13

Lesão após: Sim

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa

definitiva

Fracasso

Caso: 10R

Idade: 32

Sexo: Feminino

Raça:Negra

Doenças: Não

Hábitos: Não

Dente: 11

Lesão após: Não

Dor: Sim

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa

definitiva

Sucesso

Caso: 11R

Idade: 53

Sexo: Feminino

Raça: Branca

Doenças:

Diabetes

Hábitos:

Fumante

Dentes: 37 e 38

Lesão após: Sim

Dor: Sim

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa

definitiva

Fracasso

66

Caso: 12R

Idade: 50

Sexo: Feminino

Raça: Branca

Doenças: Não

Hábitos:

Fumante

Dente: 22

Lesão após: Sim

Dor: Não

Mobilidade: Sim

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa

definitiva

Fracasso

Caso: 13R

Idade: 30

Sexo:Masculino

Raça:Negra

Doenças: Não

Hábitos: Não

Dente: 36

Lesão após: Sim

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa

definitiva

Fracasso

Caso: 16R

Idade: 31

Sexo: Feminino

Raça: Branca

Doenças: Não

Hábitos: Não

Dente:36

Lesão após: Sim

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa

definitiva

Fracasso

67

Caso: 17R

Idade: 50

Sexo: Feminino

Raça: Branca

Doenças:

Diabetes

Hábitos:

Fumante

Dente: 23 e 25

Lesão após: Sim

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa

definitiva

Fracasso

Caso: 18R

Idade: 52

Sexo: Feminino

Dente: 13

Raça: Branca

Doenças:

Hipotireoidismo

Hábitos: Não

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa e

Definitiva

Sucesso

Caso: 19R

Idade: 40

Sexo: Feminino

Dente: 24

Raça: Negra

Doenças: Não

Hábitos: Não

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa e

Definitiva

Sucesso

Caso: 20R

Idade: 36

Sexo: Feminino

Dente: 11

Raça: Branca

Doenças:

Hipertensão

Hábitos: Não

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração:

Temporária

Sucesso

68

Caso: 21R

Idade: 62

Sexo: Feminino

Dente: 12

Raça: Branca

Doenças: Não

Hábitos: Não

Lesão após: Sim

(Em reparo)

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa e

Definitiva

Sucesso

Caso: 22R

Idade: 50

Sexo:Feminino

Dente: 45

Raça: Branca

Doenças:

Hipertensão

Hipotireoidismo

Hábitos: Não

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração:

Definitiva

Sucesso

Caso: 23R

Idade: 50

Sexo: Masculino

Dente: 25

Raça: Pardo

Doenças: Não

Hábitos: Não

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa e

Definitiva

Sucesso

Caso: 24R

Idade: 50

Sexo: Feminino

Dente: 45

Raça: Branca

Doenças:

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Sucesso

69

Diabetes

Hipertensa

Hábitos: Não

Restauração: Boa e

Definitiva

Caso: 25R

Idade: 34

Sexo: Feminino

Dente: 37

Raça: Branca

Doenças: Não

Hábitos: Não

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa e

Definitiva

Sucesso

Caso: 26R

Idade: 74

Sexo: Masculino

Dente: 43

Raça: Branca

Doenças:

Diabetes

Hipertensão

Hábitos: Não

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Sim

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa e

Definitiva

Sucesso

Caso: 27R

Idade: 49

Sexo: Masculino

Dente: 27

Raça: Branca

Doenças:

Hipertensão

Hábitos: Não

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa e

Definitiva

Sucesso

70

Caso: 28R

Idade: 72

Sexo: Feminino

Dente: 15

Raça: Branca

Doenças:

Diabetes (?)

Nódulos na

Tireóide

Hábitos: Não

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula:Não

Obturação:Satisfatória

Restauração: Boa e

Definitiva

Sucesso

Caso: 29R

Idade: 56

Sexo: Masculino

Dente: 22

Raça: Branco

Doenças: Não

Hábitos: Não

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Sim ( usa

prótese com apoio

neste dente)

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa e

definitiva

Sucesso

Caso: 30R

Idade: 59

Sexo: Feminino

Dente: 45

Raça: Branca

Doenças:

Hipertensão

Hábitos: Não

Lesão após: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa e

Definitiva

Sucesso

71

Caso: 31R

Idade: 38

Sexo: Feminino

Dente: 11

Raça: Negra

Doenças: Não

Hábitos:

Fumante

Lesão após: Sim

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração:

Definitiva

Fracasso

Caso: 32R

Idade: 45

Sexo: Masculino

Dente: 11

Raça: Branca

Doenças: Não

Hábitos: Não

Lesão após: Sim

Dor:Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração:Boa e

Definitiva

Fracasso

Caso: 33R

Idade: 33

Sexo: Feminino

Dente: 12

Raça: Negra

Doenças: Não

Hábitos: Não

Lesão após: Sim

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa e

Definitiva

Fracasso

Caso: 34R

Idade: 67

Sexo: Feminino

Dente:32

Raça: Branca

Doenças: Não

Hábitos: Não

Lesão após: Sim

Dor: Não

Mobilidade: Sim

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa e

Definitiva

Fracasso

72

Caso: 35R

Idade: 41

Sexo: Masculino

Dente: 41/ 31

Raça: Pardo

Doenças: Não

Hábitos: Não

Lesão após: 41- Sim/

31- Sim

Dor: Não

Mobilidade: 41 e 31-

Sim

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa e

Definitiva

Fracasso

Caso: 36R

Idade: 39

Sexo: Feminino

Dente: 16

Raça: Branca

Doenças: Não

Hábitos: Não

Lesão após: Sim

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa e

Definitiva

Fracasso

Caso: 37R

Idade: 45

Sexo: Masculino

Dente: 27

Raça: Branca

Doenças: Não

Hábitos:

Fumante

Lesão após: Sim

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa e

Definitiva

Fracasso

Caso: 38R

Idade: 54

Sexo: Masculino

Dente: 22

Raça: Branca

Doenças: Não

Hábitos: Não

Lesão após: Sim

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa/

Fracasso

73

Definitiva

Caso: 39R

Idade: 69

Sexo: Masculino

Dente: 23/22

Raça: Branca

Doenças:

Diabetes

Hipertensão

Hábitos: Não

Lesão após: 23/22

SIM

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa e

Definitiva

Fracasso

Caso: 40R

Idade: 45

Sexo: Masculino

Dente: 41

Raça: Branca

Doenças: Não

Hábitos: Não

Lesão após: Sim

Dor: Não

Mobilidade: sim

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração:

Temporária

Fracasso

Caso: 41R

Idade: 78

Sexo: Feminino

Dente: 22/23

Raça: Branca

Doenças: Não

Hábitos: Não

Lesão após: 22/23-

Sim

Dor: Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração:

Definitivas

Fracasso

Caso: 42R

Idade:50

Sexo:Masculino

Raça:Negra

Doença:Não

Hábitos: fumante

Dente:11

Lesão após: Sim

Dor:Não

Mobilidade: Não

Fístula:Não

Obturação:

Fracasso

74

Satisfatória

Restauração: Boa

definitiva

Caso: 43R

Idade:30

Sexo:Feminino

Raça: Branca

Doença:Não

Hábitos: Não

Dente:24

Lesão após: Não

Fístula:Não

Dor:Não

Mobilidade: Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração:

Temporária

Sucesso

Caso: 44R

Idade:37

Sexo:Masculino

Raça: Branco

Doença:Não

Hábitos: Não

Dente:21

Lesão após: Sim

Fístula:Não

Dor:Não

Mobilidade:Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa

definitiva

Fracasso

Caso: 45R

Idade:36

Sexo:Masculino

Raça: Branco

Doença:Não

Hábitos:

Fumante

Dente:36

Lesão após: Não

Fístula:Não

Dor:Não

Mobilidade:Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa

temporária (NP)

Sucesso

75

Caso: 46R

Idade:28

Sexo:Feminino

Raça: Negra

Doença:Não

Hábitos: Não

Dente:41 e 42Lesão

após: Não

Fístula:Não

Dor:Não

Mobilidade:Não

Fístula: Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa

definitiva

Sucesso

Caso: 48R

Idade:46

Sexo:Masculino

Raça: Negra

Doença:Não

Hábitos: Não

Dente:46

Lesão após: Não

Dor:Não

Mobilidade:Não

Fístula:Não

Obturação: 0-2mm

Restauração: Boa

definitiva

Sucesso

Caso: 49R

Idade:42

Sexo:Masculino

Dente:11

Raça: Negro

Doença:Não

Hábitos: Não

Lesão após: Sim

Dor:Não

Mobilidade:Não

Fístula:Não

Obturação:

Satisfatória

Restauração: Boa

definitiva

Fracasso

Caso: 52R

Idade:52

Sexo:Masculino

Raça:Pardo

Doença:hiperten

so e diabético

Hábitos: Não

Dente:14

Lesão após: Sim

Dor:Não Fístula:Não

Mobilidade:Não

Restauração: Boa

definitiva

Fracasso

76

Caso: 53R

Idade:50

Sexo:Feminino

Raça: Negro

Doença:Não

Hábitos: Não

Dente:12

Lesão após:Sim

Dor:Não

Mobilidade: Não

Fístula:Não

Restauração: Boa

definitiva

Fracasso

Caso: 55R

Idade:45

Sexo:Maculino

Raça: Branco

Doença:Não

Hábitos: Não

Dente:31

Lesão após:Sim

Dor:Sim

Mobilidade:Sim

Fístula:Sim

Restauração: Boa

definitiva

Fracasso

Caso: 56R

Idade:35

Sexo:Feminino

Raça:Branca

Doença:Não

Hábitos: Não

Dente:46

Lesão após:Sim

Dor:Não

Mobilidade:Não

Fístula:Não

Restauração: Boa

definitiva

Fracasso

Caso: 57

Idade:28

Sexo:Feminino

Raça: Negra

Doença:Não

Hábitos: Não

Dente:16

Lesão após:Sim

Dor:Não

Mobilidade: Não

Fístula:Não

Restauração: Boa

definitiva

Sucesso

Caso: 59R

Idade:29

Sexo:Feminino

Raça: Negra

Doença:Não

Dente:36

Lesão após:Sim

Dor:Sim

Mobilidade: Não

Fístula:Não

Fracasso

77

Hábitos: Não Restauração: Boa

definitiva

Caso: 61R

Idade:45

Sexo:Masculino

Raça: Negro

Doença: Nega

Hábitos: Nega

Dente:46

Lesão após:Sim

Fístula:Não

Dor:Não

Mobilidade: Não

Restauração: Boa

definitiva

Fracasso

Caso: 63R

Idade:48

Sexo:Feminino

Raça: Negro

Doença:Nega

Hábitos:

Fumante

Dente:22

Lesão após: Sim

Fístula: Não

Dor: Não

Mobilidade: Não

Restauração: Boa

definitiva

Fracasso

Caso: 64R

Idade:34

Sexo:Masculino

Raça: Branco

Doença:Nega

Hábitos: Nega

Dente:46

Lesão após: Sim

Dor:Não

Mobilidade:Não

Fístula:Não

Restauração: Ruim

Fracasso

78

ANEXO 5

CLÍNICA DE ENDODONTIA

FICHA DE ACOMPANHAMENTO CLÍNICO ENDODÔNTICO

Nome:

Endereço:

Idade:

Sexo: ( )Fem. ( )Masc.

Fumante: ( )SIM ( )Não Ex fumante há______anos

Etnia:

Condição Sistêmica:

PRÉ-TRATAMENTO (caso Clínico na época do Tratamento Endodôntico)

Elemento Dentário:

Diagnóstico:

Lesão Perirradicular: ( )Ausente ( )Presente – Diâmetro (em mm x mm)

( )Sintomático ( )Assintomático ( )VAS

Presença de tumefação: ( )SIM ( )Não

Observações:

Presença de fístula: ( )SIM ( )NÃO

TRATAMENTO

Início do tratamento endodôntico: _____/_____/_____

Término do tratamento endodôntico:____/____/____

Técnica de instrumentação:

Preparo Apical:

Medicação Intracanal:

Sensibilidade Pós- PQM: ( )SIM ( )NÃO

VAS:

Técnica de obturação:

Material obturador:

Limite Apical da obturação: ( ) 0 a 2mm ( ) aquém-sobreobturação

79

Sensibilidade Pós-Obturação: ( )SIM ( )NÃO

VAS:

Observações:

PÓS-TRATAMENTO (Proservação 1)

Data do retorno: ___/___/___

Dor Espontânea: ( )SIM ( )NÃO

Sensibilidade à Percussão: ( )SIM ( )NÃO

Sensibilidade à Palpação: ( )SIM ( )NÃO

Mobilidade: ( )SIM ( )NÃO

Presença de Tumefação: ( )SIM ( )NÃO Fístula: ( )SIM ( )NÃO

Restauração Coronária: ( )Presente ( )Ausente ( )Boa ( )Ruim ( )Definitiva

( )Temporária

Presença de Núcleo: ( )SIM ( )NÃO Reabsorção Radicular: ( )SIM ( )NÃO

Lesão Perirradicular: ( )Ausente ( )Presente – Diâmetro (em mm x mm)

Observações:

PÓS-TRATAMENTO (Proservação 2)

Data do retorno: ___/___/___

Dor Espontânea: ( )SIM ( )NÃO

Sensibilidade à Percussão: ( )SIM ( )NÃO

Sensibilidade à Palpação: ( )SIM ( )NÃO

Mobilidade: ( )SIM ( )NÃO

Presença de Tumefação: ( )SIM ( )NÃO Fístula: ( )SIM ( )NÃO

Restauração Coronária: ( )Presente ( )Ausente ( )Boa ( )Ruim ( )Definitiva

( )Temporária

Presença de Núcleo: ( )SIM ( )NÃO Reabsorção Radicular: ( )SIM ( )NÃO

Lesão Perirradicular: ( )Ausente ( )Presente – Diâmetro (em mm x mm)

Observações:

PÓS-TRATAMENTO (Proservação 3)

Data do retorno: ___/___/___

Dor Espontânea: ( )SIM ( )NÃO

Sensibilidade à Percussão: ( )SIM ( )NÃO

80

Sensibilidade à Palpação: ( )SIM ( )NÃO

Mobilidade: ( )SIM ( )NÃO

Presença de Tumefação: ( )SIM ( )NÃO Fístula: ( )SIM ( )NÃO

Restauração Coronária: ( )Presente ( )Ausente ( )Boa ( )Ruim ( )Definitiva

( )Temporária

Presença de Núcleo: ( )SIM ( )NÃO Reabsorção Radicular: ( )SIM ( )NÃO

Lesão Perirradicular: ( )Ausente ( )Presente – Diâmetro (em mm x mm)

Observações:

81

ANEXO 6

Elsevier Editorial System(tm) for Journal of Endodontics

Manuscript Draft

Manuscript Number:

Title: Polymorphism of the CD14 and TLR4 genes and post-treatment apical

periodontitis

Article Type: Clinical Research

Keywords: post-treatment apical periodontitis; genetic polymorphism; CD14;

TLR4

Corresponding Author: Dr. Jose F. Siqueira, Jr., Ph.D.

Corresponding Author's Institution: Estacio de Sa University

First Author: Isabela Rôças

Order of Authors: Isabela Rôças; Jose F. Siqueira, Jr., Ph.D.; Camila Del

Aguila; José Provenzano; Bianca Guilherme; Lucio Gonçalves

Manuscript Region of Origin: Latin & South America

Abstract: Introduction This study investigated the association of

polymorphisms of the CD14 and TLR4 genes with post-treatment apical

periodontitis in Brazilian individuals.

Methods The study population consisted of 41 patients with post-treatment

apical periodontitis and 42 individuals with root canal-treated teeth exhibiting

healed/healing periradicular tissues (controls). All teeth had apical periodontitis

lesions at the time of treatment, which was completed at least 1 year previously.

Saliva was collected from the participants, DNA was extracted and used for

CD14 and TLR4 genotyping. Results No specific genotype or allele of the CD14

and TLR4 genes nor any

combination thereof was positively associated with post-treatment apical

periodontitis (p>0.05).

82

ANEXO 7

Conclusions Data from the present study suggest that polymorphism in the

CD14 and TLR4 genes does not influence the response to endodontic

treatment of teeth with apical periodontitis.

Polymorphism of the CD14 and TLR4 genes and post-treatment

apical periodontitis

Isabela N. Rôças, PhD 1

José F. Siqueira Jr, PhD 1

Camila A. Del Aguila, MSc 1

José C. Provenzano, MSc 1

Bianca P. S. Guilherme, MSc 1

Lúcio S. Gonçalves, PhD 1

1 Department of Endodontics and Molecular Microbiology Laboratory, Estácio

de Sá University, Rio de Janeiro, RJ, Brazil.

Author’s address:

José F. Siqueira Jr, DDS, MSc, PhD

Faculty of Dentistry, Estácio de Sá University

Av. Alfredo Baltazar da Silveira, 580/cobertura

Recreio, Rio de Janeiro, RJ

Brazil 22790-710

e-mail: jf_siqueira@yahoo.com; jose.siqueira@estacio.br

Running title: Polymorphisms of CD14 and TLR4 genes

ACKNOWLEDGEMENTS

This study was supported by grants from Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) and Fundação Carlos

Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ),

Brazilian Governmental Institutions.

The authors deny any conflicts of interest.

83

ABSTRACT

Introduction This study investigated the association of polymorphisms of the

CD14 and TLR4 genes with post-treatment apical periodontitis in Brazilian

ndividuals.

Methods The study population consisted of 41 patients with post-treatment

apical periodontitis and 42 individuals with root canal-treated teeth exhibiting

healed/healing periradicular tissues (controls). All teeth had apical periodontitis

lesions at the time of treatment, which was completed at least 1 year previously.

Saliva was collected from the participants, DNA was extracted and used for

CD14 and TLR4 genotyping.

Results No specific genotype or allele of the CD14 and TLR4 genes nor any

combination thereof was positively associated with post-treatment apical

periodontitis (p>0.05).

Conclusions Data from the present study suggest that polymorphism in the

CD14 and TLR4 genes does not influence the response to endodontic

treatment of teeth with apical periodontitis.

Key words: post-treatment apical periodontitis; genetic polymorphism; CD14;

TLR4

84

INTRODUCTION

Persistence of apical periodontitis following adequate root canal treatment can

occur in approximately 10% to 15% of the cases (1). Intraradicular bacterial

infection is the primary cause of persistent disease (2), but the possibility

certainly exists that acquired habits and host-related factors, collectively

referred to as disease modifiers, can influence the healing of apical periodontitis

lesions (3). Disease modifiers include habits (eg, smoking), systemic conditions

(eg, diabetes, stress, other immunocompromising conditions, etc) and the

genetic background (eg, gene polymorphism). Disease modifiers may help

explain the different responses to treatment in different patients (4).

Polymorphism of a gene related to inflammation, repair or host defense

to infection may result in an altered response to treatment among individuals.

Only a few studies have searched for relationships between genetic

polymorphism and post-treatment apical periodontitis (5-7). Our group

investigated the association of polymorphisms in the genes for two Fc

receptors, interleukin(IL)-1α and IL-1β with post-treatment apical periodontitis.

The only genetic conditions associated with persistent disease were carriage of

allele H131 of the Fc RIIa gene and a combination of this allele with allele Na2

of the Fcɣ RIIIb gene (5). Further, we failed to show any association between

the specific genotypes or alleles of Fc RIIIA and posttreatment apical

periodontitis (7). In another study, Morsani et al. (6) observed that individuals

with the polymorphic allele (allele 2) of IL-1β were 7 times more likely to exhibit

post-treatment disease as compared with individuals homozygous for allele 1.

Innate immunity has components capable of recognizing structures

typical of microbial substances, which are known as pathogen-associated

molecular patterns (PAMPs). These components are in turn called pattern

recognition receptors (PRRs) and trigger the innate immune response after

binding to PAMPs. Two important PRRs are CD14 and Toll-like receptor 4

(TLR4), which are involved in recognition and host response to

lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria. LPS is an important

bacterial virulence factor and its concentration in endodontic infections has

been associated with diverse clinical conditions (8). After released from

bacteria, LPS initially binds to a plasm protein called LPS-binding protein and is

then delivered to CD14, a cell receptor for LPS expressed primarily on the

85

macrophage surface (9). CD14 can also occur in a soluble form present in

serum, which mediates the response to LPS in cells lacking membrane-bound

CD14, including endothelial and epithelial cells (10). Subsequent activation of

the macrophage by LPS is a result of signal triggered by the signal-transducing

receptor TLR4. Therefore, in the response of macrophages to LPS, CD14 acts

as the recognizing receptor, while TLR4 functions as the signal-transducing

component (11). Recognition of LPS by engagement to these PRRs leads to

activation of transcription factors, and consequent expression of

proinflammatory cytokines and chemokines.

A single nucleotide polymorphism (SNP) in the promoter region of the

CD14 gene at position -260 (CD14-260C>T) has been shown to influence the

transcriptional activity of the gene and the density of CD14 in monocytes, with

the rare allele showing an increase in both effects and leading to increased

inflammation (12). Furthermore, subjects carrying the T allele have significantly

higher soluble CD14 levels than carriers of the C allele (13). This SNP has been

associated with increased risk of myocardial infarction (12), Crohn’s disease

(14) and marginal periodontitis (15-18). TLR4+896A>G SNP is probably the

most intensively investigated polymorphism in the TLR4 gene, and has been

shown to affect the extracellular domain of the TLR4 protein, resulting in

reduced efficacy of LPS signaling and a consequent decrease in the ability to

evoke inflammation (19). TLR4+896A>G SNP has been correlated with

hyporesponsiveness to inhaled LPS (20), sepsis and infections caused by

Gram-negative bacteria (21), and risk for some types of cancer (22). This TLR4

gene polymorphism has also been suggested as a potential genetic risk factor

for susceptibility to chronic marginal periodontitis (23).

Because there is a paucity of studies reporting on the influence of

disease modifiers on the endodontic treatment outcome, this study was

undertaken to evaluate the relationship between CD14 and TLR4 genotypes

and allele carriage rates and the occurrence of post-treatment apical

periodontitis in a Brazilian population. The hypothesis was that individuals with

CD14-260C>T and TLR4+896A>G gene polymorphisms have an increased

response to LPS contributing to altered response to endodontic treatment.

86

MATERIAL AND METHODS

Study population and inclusion criteria

Eighty-three adult Brazilian individuals (48 females and 35 males; 58

white and 25 African-Brazilians) who lived in the city of Rio de Janeiro and met

the inclusion criteria described below were included in this study. Information

was gathered about general health and acquired habits that might serve as

potential disease modifiers (and thereby as covariates), including diabetes (9

individuals), hypertension (13 individuals), HIV infection (none reported), and

smoking (14 individuals). The protocol for this study was approved by the Ethics

Committee of the Estácio de Sá University.

Individuals were selected according to rigid inclusion criteria as

determined previously (5,7). Each individual should exhibit at least one tooth

with endodontic treatment ranked as adequate according to the following

radiographic parameters: all canals were filled, having no voids in the filling

mass, and with the apical terminus of the filling located at 0 to 2 mm short of the

radiographic apex. No obvious reason for post-treatment disease was apparent

based on the radiographic and clinical observations. All individuals presented

with pulp necrosis and apical periodontitis at the time of treatment, which was

finished at least one year previously. Teeth were treated either by graduate

students or specialists under faculty supervision. Treated teeth had coronal

restorations ranked as adequate according to the following parameters: the

restoration was permanent and appeared clinically and radiographically intact,

with no detectable signs of overhangs, open margins or recurrent caries.

Finally, individuals with only one root canal-treated tooth or more than one

treated teeth exhibiting the very same periradicular status at the follow-up

examination were selected. For instance, if the individual had two teeth

adequately treated and restored but with ambiguous periradicular conditions, ie,

one healed and the other diseased, then he or she was excluded from the

study.

Determination of the periradicular status of treated teeth was made

based on radiographic and clinical evaluations. Recall radiographs were

compared with immediate postoperative radiographs taken at the time of

87

treatment. All radiographs were taken using film holders. On the basis of

radiographs, the periradicular status was classified as follows:

a) Healed: contour and width of the periodontal ligament space (PDL)

were normal or PDL contour was widened mainly around excess

filling. Appearance of the surrounding bone was normal. These cases

were categorized as favorable outcome (controls);

b) Healing: periradicular radiolucency was clearly decreasing in size. For

the purpose of this study, these teeth were also categorized as

favorable outcome (controls), because a significant level of healing

was observed. Cases with uncertain healing were excluded;

c) Diseased (not healed): periradicular radiolucency was unchanged or

increased in size.

Radiographs were analyzed independently and under magnification by 2

experienced endodontists and a third observer was consulted for the discordant

cases. Multirooted teeth were classified according to the root with the worst

outcome. Determination of treatment outcome was also based on clinical

examination, and cases presenting with signs or symptoms typical of active

infection, such as pain, swelling and sinus tracts, were classified as diseased.

Following the inclusion criteria, the diseased group was composed of 41

patients and the healed/healing group had 42 individuals.

Sample taking and processing

Saliva was used as a source of host cells for genotyping and was

collected from the individuals at the time of follow-up examination. Sampling

and DNA extraction procedures were performed as described previously

(5,7,24). Samples from 68 individuals, stored at -20°C and available from

previous investigations (5,7,24), were used along with fresh saliva samples

taken from 15 additional individuals.

CD14-260C>T Gene Polymorphism

CD14 genotyping (NCBI SNP CLUSTER ID: rs2569190) was performed

by PCR with specific primers followed by restriction length fragment

polymorphism analysis as described elsewhere (16). Aliquots of 2 µl of DNA

extract was added to 50 μl polymerase chain reaction (PCR) mixture containing

5 µl of 10X PCR buffer (Fermentas, Burlington, ON, Canada), 1 μM each of

forward (5´- TCA CCT CCC CAC CTC TCT T– 3´) and reverse (5´- CCT GCA

88

AA TCC TTC CTG TT – 3´’) primers, 5 U Taq DNA polymerase (Fermentas),

2.5 mM MgCl2, and 0.2 mM of each deoxyribonucleoside triphosphate

(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). PCR conditions were as follows:

initial denaturation at 95°C/30 sec followed by 36 cycles at 95°C/30 sec,

59°C/30 sec, and 72°C/1 min, ending with an extension step at 72°C/10 min.

One negative control consisting of sterile ultrapure water instead of the sample

was included for every 10 samples in all batches of samples analyzed. To

confirm amplification, PCR products were subjected to electrophoresis on a 2%

agarose gel in Tris-borate/EDTA buffer. Next, the PCR products were digested

with HaeIII (New England Labs, Ipswich, MA) and the restriction pattern

visualized by electrophoresis in a 4% agarose gel which was stained with

GelRed (Biotium, Hayward, CA) and visualized under UV illumination. HaeIII

digestion yields two fragments of 83 bp and 24 bp (normal C allele) or 107 bp

(rare T allele).

TLR4 +896A>G gene polymorphism

TLR4 genotyping (NCBI SNP CLUSTER ID: rs4986790) was performed

on DNA extracted from saliva samples using a pre-designed Taqman SNP

Genotyping assay (rs4986790, assay code C_11722238_20)(Applied

Biosystems, Foster City, CA). The assay uses two TaqMan® probes that differ

in nucleotide sequence only at the SNP site; one probe labeled with VIC dye

that detects the normal allele A and the other labeled with FAM dye to detect

the rare allele G. Reactions and allelic discrimination were carried out on an ABI

7500 real-time PCR instrument (Applied Biosystems). Genotyping was done in

duplicate and negative controls (ultrapure water instead of samples) in triplicate.

Data acquisition and analysis were performed using the ABI 7500 software

v2.0.6 (Applied Biosystems).

PCR Controls

In order to determine that human DNA was really available for

genotyping, 2 μl of the DNA extract were subjected to separate PCR reactions

using primers directed to the T-cell receptor Vα22 gene (25) and the β-globin

gene (26). Negative controls consisted of sterile ultrapure water instead of the

sample. PCR products were subjected to electrophoresis in a 2% agarose gel–

89

Tris-borate-EDTA buffer, which was stained with GelRed (Biotium) and

visualized under UV illumination.

Statistical analysis

The data concerning distribution of CD14 and TLR4 alleles and

genotypes between disease (post-treatment apical periodontitis) and control

(healed/healing teeth) groups were statistically analyzed by means of the

Pearson chi-square test (3x2 contingency tables for specific genotype

frequencies and 2x2 contingency tables for allele frequencies). Composite

CD14 and TLR4 genotypes were also evaluated as to the association with

disease. All possible combinations involving alleles and genotypes of CD14 and

TLR4 genes were evaluated. Other factors (systemic conditions, and smoking)

were also evaluated for associations with treatment outcome in order to check if

they could act as covariates by using the chi-square and the Fisher´s exact

tests. Unadjusted univariate logistic regression was applied between the

dependent variable and the covariates in order to evaluate the association of

the polymorphisms and each covariate with healthy periradicular conditions

through calculation of odds ratio and 95% confidence interval (CI 95%). Finally,

adjusted multivariate logistic regression was used to deduce the influence of the

genetic polymorphisms on treatment outcome, adjusted for covariates that

presented p<0.2 in the unadjusted analysis. The method used to insert the

variables in the logistic model was the backward stepwise, which involved all

variables chosen. Further, these variables were gradually excluded until the

final model was formed. Significance level was set at p<0.05. Statistical

analyses were performed using the SPSS software (Statistical Package for the

Social Sciences, version 17.0, IBM, Chicago, IL).

RESULTS

The results of genotyping for the CD14-260C>T and TLR4+896A>G

gene polymorphisms of individuals with post-treatment apical periodontitis and

healed/healing controls are depicted in Table 1. Genotyping for the CD14-

260C>T SNP revealed that the most frequent allele found in the study

population was allele C (53.6%) and the heterozygous genotype was the most

prevalent (42.2%). No significant associations were found between the 3

90

specific genotypes of CD14-260C>T (p=0.3) or the 2 alleles (p=0.1) and

posttreatment apical periodontitis.

As for TLR4+896A>G, the most prevalent allele in the study population

was also allele A (79.4%), and the homozygous genotype for this same allele

was the most common (62%). No significant associations were found between

any specific genotype of TLR4+896A>G (p=0.7) or allele (p=0.4) and

posttreatment apical periodontitis. It was not possible to successfully genotype

4 individuals for the TLR4+896A>G polymorphism (3 from the diseased group

and one from the healed/healing group).

No possible genotype combinations of CD14 and TLR4 exhibited

significant association with disease (p>0.05) (Table 2). Individuals presenting

the composite genotype comprising at least one rare allele of each target gene

were not linked to disease either (p>0.05)(Table 3).

Of the other factors tested for association with post-treatment disease

(systemic conditions, race and smoking), only smoking showed a significant

result (p=0.02). Of the 14 smokers, only 3 (21%) showed a favorable outcome,

while 39/69 (56.5%) of the nonsmokers showed healed/healing conditions.

Association of smoking with post-treatment disease was confirmed in the

unadjusted logistic regression, which showed that smokers were 4 times more

likely to have post-treatment disease than nonsmokers. Adjusted multivariate

logistic regression analysis kept the association of smoking with post-treatment

disease (p=0.03). Because smoking could be a confounding factor, statistical

analysis was also performed after exclusion of smokers. Data revealed no

significant effects on the results, since no significant associations for the

genotypes and alleles under study and post-treatment disease were still evident

(p>0.05).

DISCUSSION

It has been demonstrated that polymorphism in certain genes related to

inflammation, pathogen recognition and healing may influence the development,

progression, severity and healing of several inflammatory diseases. As for

marginal periodontitis, a disease that shares some similarities with apical

periodontitis, some of these genetic polymorphisms have been shown to serve

as potential disease modifiers (19). Regarding apical periodontitis, it has been

91

shown that the polymorphism of some genes related to inflammatory mediators

may influence the development of symptoms (27-28). Response to endodontic

treatment is another situation where polymorphism may lead to different

responses between individuals. Polymorphisms in receptors for the Fc portion

of immunoglobulin G and pro-inflammatory cytokines has been recently

suggested as potential factors influencing host response to root canal treatment

(5-6).

Genetic polymorphism affecting the response to treatment might help

explain why some cases with adequately treated root canals still result in failure

and why some lesions may take too long to completely heal. Bacterial infection

of the apical root canal is the main cause of treatment failure (29), but it has

been proposed that the bioburden inflicted by residual bacteria must be kept

above a certain threshold for disease to persist (2). The possibility exists that

this threshold, in addition to depending upon the virulence of residual bacterial,

is also related to the ability of the host to cope with infection. This ability may

differ from individual to individual because diverse factors, including

polymorphism in certain genes (3).

The two polymorphisms analyzed in this study are related to molecules

involved with pathogen recognition. Actually, both CD14 and TLR4 play an

essential role in the host response to LPS, the main virulence factor of Gram-

egative bacteria. No previous study has as of then tested the association of

these genetic polymorphisms and post-treatment apical periodontitis. Our

findings revealed that no genotype or allele of both the CD14-260C>T and the

TLR4+896A>G SNPs, nor any combination thereof, was significantly associated

with a poor outcome of the endodontic treatment. Although marginal and apical

periodontitis are different in some aspects, including the anatomy of infection,

shared features included most bacterial species involved and host immune

response. As for the periodontal literature, some studies have reported an

association of CD14 and TLR4 polymorphisms with some forms of marginal

periodontitis (16-18,23); however, our findings are in line with many others that

found no associations (16,30-33).

One possible reason for the lack of association of these

polymorphisms with persistent disease might be related to the low prevalence of

Gram-negative bacteria among the species that usually are found in

92

persistent/secondary infections. Studies have demonstrated that Gram-positive

bacteria are more prevalent and dominant in samples taken after treatment

procedures and in retreatment cases (34-35). Even so, Gram-negative bacteria

have also been detected in many cases (36). Bacterial identification was not

performed in this study because it should also have included samples taken

from the canals of teeth from the healed/healing group, which represents an

obvious ethical restriction. Further studies evaluating the bacteria persisting in

the root canals and the concomitant host responses in genotyped individuals

would provide an interesting contribution to the understanding of the host-

pathogen relationship.

One important limitation of this study is the relatively small sample size.

Case selection followed extremely rigid inclusion criteria in order to avoid

conditions that clearly affect treatment outcome, ie, inadequately

treated/restored cases. Also, to eliminate ambiguity, only cases with the very

same periradicular status were included. These specific criteria substantially

reduced the sample size, especially for the diseased group, since teeth

presenting those adequate conditions of root canal treatment and restoration

have a high success rate (37). In addition, healed and healing individuals were

grouped together to minimized the problem of low sensitivity of radiographs to

detect subtle bone chances.

Of the possible disease modifiers that could act as confounding factors,

only smokers were positively associated with post-treatment disease. Previous

reports on association of tobacco using with post-treatment apical periodontitis

are conflicting (38-39). The number of smokers in this study is too low for a

robust statistical analysis, since this was not the purpose of this study, and

further investigations should address this specific issue. In the present study,

smoking was not found to affect the results for the gene polymorphisms under

analysis, since exclusion of smokers did not alter the results in statistical terms.

In conclusion, the current study found no association between CD14 and

TLR4 genotypes or alleles and post-treatment apical periodontitis. Future

studies targeting other genetic polymorphisms that may influence disease

severity and response to treatment are encouraged in order to serve as

potential biomarkers to project prognosis.

93

REFERENCES

1. Friedman S. Expected outcomes in the prevention and treatment of apical

periodontitis. In: Ørstavik D, Pitt Ford T, eds. Essential endodontology. Oxford,

UK: Blackwell Munksgaard Ltd, 2008: 408-69.

2. Siqueira JF, Jr., Rôças IN. Clinical implications and microbiology of bacterial

persistence after treatment procedures. J Endod 2008; 34: 1291-301 e3.

3. Siqueira JF, Jr. Treatment of endodontic infections. London: Quintessence

Publishing, 2011.

4. Fouad AF, Huang GT. Inflammation and immunological responses. In: Ingle

J, Bakland LK, Baumgartner JC, eds. Ingle´s endodontics. 6th ed. Hamilton: BC

Decker Inc, 2008: 343-75.

5. Siqueira JF, Jr., Rôças IN, Provenzano JC, Daibert FK, Silva MG, Lima KC.

Relationship between Fcgamma receptor and interleukin-1 gene polymorphisms

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97

Table 1

Distribution of CD14 and TLR4 genotypes and alleles in subjects with treated

root canals associated or not with apical periodontitis

Genotype Patients

(diseased)

Controls

(healed/healing) Total

N % N % N %

CD14 41 42 83

C/C 10 24.4 17 40.5 27 32.5

T/T 12 29.3 9 21.4 21 25.3

C/T 19 46.3 16 38.1 35 42.2

Allele 82 166

C 39 47.6 50 59.5 89 53.6

T 43 52.4 34 40.5 77 46.4

TLR4 38 41 79

A/A 25 65.8 24 58.5 49 62

G/G 1 2.6 2 4.9 3 3.8

A/G 12 31.6 15 36.6 27 34.2

Allele 76 82 158

A 62 81.6 63 76.8 125 79.1

G 14 18.4 19 23.2 33 20.9

98

Table 2

Distribuition of CD14 and TLR4 genotype combinations in individuals with treat

root canals associated or not with apical periodontitis

Patients with disease

TLR4 A/A TLR4 A/G TLR4 G/G

Patients with no disease

TLR4 A/A TLR4 A/G TLR4 G/G

CD14 C/C 6 3 1 9 6 1

14 C/T 12 5 0 12 3 1

CD14 T/T 7 4 0 3 6 0

Table 3

Frequency of composite CD14 and TLR4 genotype in individuals with treat root

canals associated or not with apical periodontitis

Genotype

Patients with disease

Patients with no disease

N % N %

Positive* 9 53 8 47

Negative** 6 60 4 40

*Carryng both rare alleles of CD14 and TLR4. **Not carryng any rare allele of

CD14 and TLR4.

99

ANEXO 8