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 Universidad Andrés Bello

Facultad de Ciencias de la Salud

Departamento de Ciencias Biológicas

Laboratorio de Biología Celular Bio035

“Organización subcelular” 

Observación de componentes subcelulares por medio

de fraccionamiento subcelular y microscopía óptica

Lilly Akentjew

Felipe Chamorro

Claudia Betancourtt

Sección 13

Profesores:

Catalina Fernández

Mauricio Valdivia

Santiago, 10 de Junio de 2013

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Introducción

La célula es la estructura más pequeña capaz de realizar tres funciones vitales: nutrición,relación y reproducción. Todos los organismos vivos están formados por células,algunos organismos como las bacterias y protozoos son unicelulares, es decir, formados

 por solo una célula, en cambio existen otros como las plantas, los animales y los hongosque son pluricelulares, es decir, formados por más de una célula que actúan de formacoordinada.La célula a su vez se puede clasificar de acuerdo a la presencia o ausencia de un núcleoverdadero, en dos grandes grupos, las células procariontes y las células eucariontes. Las

 procariontes son aquellas que tienen un núcleo difuso en el citoplasma, esto se refiere aque no poseen un núcleo celular rodeado por membrana. Este tipo de células estáconstituido por membrana plasmática, pared celular, ribosomas, mesosoma y materialgenético (DNA) que se encuentra libre en el citoplasma sin ninguna estructura que lo

delimite. Otra característica importante es que no presentan organelos membranosos. Encambio las células eucariontes son aquellas que poseen un núcleo celular delimitado por una doble membrana y organelos membranosos (mitocondrias, RER, REL,

 peroxisomas, cloroplastos, Golgi, Pared celular, centriolos, citoesqueleto, núcleo, etc.).Las células del tipo eucariotico se pueden dividir en dos tipos de células distintas lasvegetales y las animales. Las eucariotas vegetales aunque son similares a las animales,

 presentan diferencias como la carencia de centriolos y poseen algunos organelos yestructuras exclusivas como los cloroplastos, pared celular y vacuolas. Las célulaseucarioticas de tipo animal presentan la mayoría de los organelos membranosos

exceptuando los organelos exclusivos de la célula vegetal e incluyendo los centriolos.Se han descrito numerosas tinciones basadas en la permeabilidad selectiva de lamembrana plasmática como por ejemplo la eosina/nigrosina (Colas, 1980) y Tripán azul(Suttiyotin y Thawaiter, 1991) que permiten el estudio de componentes subcelularesmembranosos. Los organelos celulares que conforman las células también pueden ser separados de las células para ser estudiados más detalladamente, este proceso deseparación de organelos se llama fraccionamiento subcelular, proceso que permiteobtener componentes celulares aislados, en grandes cantidades y con alto grado de

 pureza. Esta técnica fue desarrollada entre otros por Alberte Claude y Christian Duveentre 1940 y 1950, y consiste en la separación de los componentes de la célula

 basándose en su tamaño y densidad. Todo proceso de fraccionamiento subcelular tienedos etapas:1) rotura de la células o tejido para obtener un lisado celular en el que lafracción deseada se encuentre en condiciones adecuadas para su purificación 2)separación de la fracción deseada del resto del componente de la célula o tejidomediante algún criterio como puede ser una diferencia de densidad, la presencia dealgún antígeno, etc. Esto se logra mediante instrumentos llamados centrifugas que

 permiten someter a las muestras a intensas fuerzas que producen la sedimentación en poco tiempo de las partículas que tienen una densidad mayor que la del medio que lasrodea. En una centrifuga el elemento determinante es el rotor, dispositivo que gira y en

el que se colocan los tubos. Al terminar la centrifugación se distinguen dos fases; una

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donde al fondo del tubo de ensayo se obtiene un pellet o sedimento, la parte sólida, ysobre él una parte liquida llamada sobrenadante.

ObjetivosEl objetivo general de éste trabajo consiste en el reconocimiento de los componentessubcelulares a través de métodos empíricos y su observación directa por microscopíaóptica.

Objetivos específicos

-  Conocer las técnicas de homogenización en un fraccionamiento subcelular -  Comprender los fundamentos de la utilización de centrifugación en el

fraccionamiento subcelular 

-  Conocer las moléculas marcadoras y su utilización en la evaluación defraccionamiento subcelular 

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Materiales y métodos

Se proporcionó un hígado de rata picado en pequeños trozos contenido en un vaso precipitado, éste se lavó con suero fisiológico (pH 7,2  –  7,4) para eliminar la mayor cantidad de sangre presente en la muestra. Luego el hígado picado se sometió a una

homogenización en Ultraturrex a 1600 rpm manteniendo el vaso en un contenedor conhielo para mantener baja la temperatura de la muestra.

El homogenizado se filtró a través de una gasa y se transfirió a un tubo Falcon de propileno para ser sometido a una centrifugación inicial de 2500 rpm por 6 minutos enuna ultracentrífuga, el sobrenadante 1 (SN1) se mantuvo en un tubo en hielo y el pellet1 (P1) fue resuspendido con suero fisiológico para luego volver a centrifugar durante 20min a 2500 rpm (sobrenadante 2, SN2 y pellet 2, P2). Por último se mezcló SN1 conSN2 y se sometieron a una última centrifugación, esta vez a 6000 rpm por 20 min.(obteniéndose SN3 y P3)

Todas las centrifugaciones se realizaron a 4º C y los tubos se mantuvieron en hielo entrecada proceso.

Las fracciones nuclear y mitocondrial fueron observadas en un microscopio óptico cony sin tinción (azul de tripan)

Se observó además una muestra fijada previamente de un corte de hígado de ratautilizando el objetivo de inmersión (100x)

Para observar la reacción de las diferentes fracciones frente a otros compuestos se prepararon 4 tubos de ensayo de la siguiente forma:

Luego de añadir la fracción correspondiente en cada tubo, se agregaron 2 ml de vaselinalíquida para evitar que la muestra reaccione con el oxígeno del aire.

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Resultados

Contenido de los pellet obtenidos tras cada centrifugación:

P1: Fracción nuclear 

P2: Fracción mitocondrial

P3: Fracción microsomal

Observación de las fracciones nuclear y mitocondrial:

Pellet 1 (Fracción nuclear)

Muestra: Fresca

Objetivo: 40xTinción: Ninguna.Observación: Es posible distinguir glóbulos rojos en movimiento en la muestra.También se observan trozos de membranas.

Muestra: FrescaObjetivo: 40xTinción: Azul de tripán

Observación: Se distinguen esferas de color azul que corresponden a los núcleos de lascélulas del hígado teñidos.

Pellet 2: Fracción mitocondrial

Muestra: FrescaObjetivo: 40xTinción: Ninguna.Observación: No se pudieron observar estructuras

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Muestra: FrescaObjetivo: 40xTinción: Azul de tripánObservación: No se observaron estructuras

Corte de hígado fijado

Muestra: FijaObjetivo: 100XTinción: Sin tinción

Observación: En las células del hígado, llamadas hepatocitos, se visualizan claramentelos núcleos. También se ve la división entre el citoplasma y el núcleo que corresponde ala membrana nuclear. Se identifica además la membrana plasmática.

En el experimento de las diferentes fracciones frente al Succinato y Azul de metileno seobservaron cambios con la exposición al calor en los tubos que contenían la fracciónnuclear (verde azulado), la fracción mitocondrial (azul opaco) y la fracción microsomal(celeste), el blanco tomó la coloración azul típica de la tinción.

Discusión

La centrifugación es un método por el cual se pueden separar diversos componentesde diferente densidad mediante una centrifugadora, la cual imprime a la mezcla un

movimiento rotatorio con una fuerza de mayor intensidad que la gravedad, provocandola sedimentación del sólido o de las partículas de mayor densidad. Este es uno de los principios en los que se basa la densidad: Todas las partículas, por poseer masa, se venafectadas por cualquier fuerza (origen de una aceleración). La centrifugación impone,gracias a la aceleración centrífuga, un efecto parecido al gravitacional: Las partículasexperimentan una aceleración que las obliga a sedimentar. La centrifugación

 puede dividirse en primera instancia en dos grandes grupos: La preparativa y laanalítica. En la primera, se obtienen grandes cantidades del material que se deseaestudiar (pellet), mientras que en la segunda (sobrenadante) se procede al análisis de lasmacromoléculas por medio de una ultracentrifugación.

El objetivo de la centrifugación es separar partículas de diferentes características. Paraello, se aplica un fuerte campo centrífugo, con lo cual las partículas tenderán adesplazarse a través del medio en el que se encuentren con la aceleración de gravedad.

¿Por qué el procedimiento de fraccionamiento se realiza a temperatura baja?

Se suele aplicar en frio el procedimiento de fraccionamiento para evitar elsobrecalentamiento de las muestras que podría provocar la desnaturalización de las

 proteínas y en este caso de deja a 4 ºC ya que minimiza la activación de daño generado por fosofolipasas y proteasas.

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 El suero fisiológico funciona en este caso como buffer, éste es un sistema constituido

 por un ácido débil y su base conjugada o por una base y su ácido conjugado que tienecapacidad "tamponante", es decir, que puede oponerse a grandes cambios de pH en unadisolución acuosa, en este caso se utiliza para homogenizar la muestra.

¿Por qué la tinción con azul de tripano nos permite tener una mejor visualización delnúcleo?

El azul de tripano[4] se utiliza para diferenciar células vivas de células muertas. Lascélulas vivas o tejidos con la membrana celular intacta no son coloreados debido a quelas células son muy selectivas a los compuestos que dejan pasar a través de lamembrana. En las células viables el Azul de Tripano no es absorbido; sin embargo,atraviesa la membrana de las células muertas. Por lo tanto, las células muertas se

muestran de un distintivo color azul bajo el microscopio. Debido a que las células sonexcluidas de la tinción, este método también es llamado Método de tinción por exclusión. Así las células que aparecen en la imagen visualizada en el microscopio (eneste caso en 40x), claramente de color azul, son consideradas no viables (núcleo).

Al visualizar la muestra del pellet homogenizado de hígado de rata con 1 ml de buffer en un microscopio a 40x del pellet del núcleo sin tinción, es muy difícil poder observar el núcleo, ya que se visualiza con poca nitidez, en cambio en la muestra que fue teñidacon una gota de azul de tripano se puedo observar claramente como fue absorbido por los núcleos de la célula y gracias a ello se pudo observar con mayor nitidez.

¿Por qué reacción el tubo de fraccionamiento de núcleo y no el de fraccionamientomitocondrial?La reacción debiese ocurrir con la fracción mitocondrial debido a que el succinatodeshidrogenasa, es una flavoproteína (proteínas que contienen un ácido nucleícos)ligada a la membrana interna mitocondrial que interviene en el ciclo de Krebs y en lacadena de transporte de electrones.Pero la reacción que se obtuvo fue de la fracción nuclear lo cual podría ser explicandoque La mayoría de las proteínas mitocondriales están codificadas en genes nucleares, y

su mRNA es traducido en el citosol. Esto hace necesaria la existencia de "péptidos guía"o secuencias guía, que señalan el destino de estas proteínas mitocondriales que sesintetizan en el citosol. De esta forma estas proteínas mitocondriales codificadas en elgenoma nuclear llegan a su destino correcto; es decir, al lugar donde llevarán a cabo sufunción estructural y/o metabólica, sea la matriz mitocondrial, la membrana interna, elespacio intermembrana o la membrana externa.Solo una pequeña parte de las proteínas mitocondriales son codificadas por el genomamitoocondrial en humano. Sin embargo esto no ocurre igual en todos los organismos; enlos organismos menos evolucionados la mitocondria tiene un gran genoma que codifica

un gran número de proteínas, aparte de otros elementos como rRNAs, tRNAs y RNA, pero este genoma es reducido drásticamente en el curso de la evolución hasta alcanzar 

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su mínima expresión en la especie humana.

Conclusión

En síntesis podemos mencionar que la identificación de una fracción subcelular son desuma importancia ya que permiten identificar las distintas funciones que poseen losorganelos celulares y la importancia de su existencia en la célula debido a que estos

 producen en general todas las reacciones de una célula.

De una manera general, podemos constatar que finalizada la actividad práctica, se pudoestablecer un análisis a cerca del fraccionamiento subcelular, permitiéndonos distinguir e identificar los componentes del una fracción subcelular y los organelos presentes encada uno de ellos siendo parte de los componentes celulares, los cuales cumplenimportantes funciones para el buen funcionamiento celular.

Posteriormente se pudo identificar mediante investigaciones los principales elementosque conforman a los distintos organelos (enzimas, ribosomas, membrana, etc.) yconocer cada uno de los metabolismos existentes en ellos.

Como fue de esperar pudimos comprobar que los conocimientos, estudios y posterioresinvestigaciones al terminar el práctico nos dio paso a la comprobación de la hipótesis

 planteada con antelación. Obteniendo que el fraccionamiento subcelular es una técnicaque nos permite obtener diferenciadamente cada uno de los organelos celulares, los

cuales poseen diferentes componentes los que reaccionaran de distinta manera según seasu metabolismo enzimático.

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Bibliografía

[1] TOOD, STANFORD. Diagnóstico y tratamiento clínico por el laboratorio. 1988.Salvat. Tomo I. Pág 14.

[2] DEVLIN, THOMAS. Bioquimica. 1999. Revertré. Pág. 4.

[3] BEYNON RJ Y EASTERBY JS. Basic Concepts. En: Buffer Solutions: The Basics.Oxford: BIOS Scientific, Publishers; 1996.

[4] RUIZ, LOURDES Y MARTÍNEZ, ALBERTO. BIOQUÍMICA EXPERIMENTALIII. Departamento de Biología Molecular.

[5] COLAS B. & MAROUX S., (1980) Simultaneous isolation of brush border and basolateral membrane from rabbit enterocytes. Presence of brush border hydrolases in

the basolateral membrane of rabbit enterocytes. Biochim Biophys Acta. 1980 Aug 4;600(2): 406-20 pp.

[6] SUTTIYOTIN D. & THAWAITER C., (1991) The ability of trypan blue todifferentiate live and dead ram spermatozoa. Anim. Reprod. Sci., 25: 209-224 pp.