INFORME PRÁCTICA #6

OBTENCIÓN DE PENICILINA Y COMPROBACIÓN DE SU ACCIÓN ANTIBIÓTICA

Por:

Nathalie Zapata Gaviria

Ana Maria Henao Arango

María Alejandra Muñoz Castrillon

Profesor:

Juan Martin Delgado

Asignatura:

Laboratorio de Biotecnología l

Miércoles – jueves

12 - 14

Universidad de Antioquia

Facultad de ciencias farmacéuticas y alimentarias

Departamento de alimentos

Medellín

2015-1

OBJETIVOS

General: Obtener penicilina a partir de una cepa esporulada de Penicillum

Chrysogenum en medio de cultivo sumergido y comprobar su acción

antibiótica a partir de un antibiograma.

Específicos:

Garantizar el proceso de fermentación del Penicillum Chrysogenum para la

obtención de penicilina

Favorecer el crecimiento micelar para favorecer la excreción de la penicilina

en el medio de cultivo

Controlar y condicionar las condiciones ambientales para el crecimiento del

Penicillum Chrysogenum en medio de cultivo sumergido.

Identificar y comparar la acción antibiótica de la penicilina obtenida y un

tipo de penicilina comercial mediante un antibiograma, utilizando como

microorganismo de prueba una cepa de Bacillus Subtilis.

DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO

Inicialmente se obtuvo una cepa esporulada de Penicillum Chrysogenum

cultivada en agar saburaud, a continuación se prepararon para los seis

equipos de trabajo, mil quinientos mililitros (1500 mL) de caldo que contenía

(45 gramos de lactosa, 15 gramos de glucosa, 60 gramos de extracto de

levadura, 4.5 gramos de nitrato sódico, 0.75 gramos deshidrogenofosfato

sódico, 0.45 gramos de fenilacetato, 0.375 gramos de sulfato magnésico y la

punta de la espátula de sulfato de zinc), estos componentes tenían como

función ser fuente de carbono, de nitrógeno molecular, de nitrógeno proteico,

fosforo, azufre y otros minerales; después de homogenizada la mezcla de los

componentes del caldo, se ajustó el pH ( pH:5) para favorecer la esterilidad del

medio de cultivo, además de al crecimiento micelar del hongo. Posteriormente

se racionó para cada equipo doscientos cincuenta mililitros (250mL) de caldo

recibidos en erlenmeyer; a continuación se esterilizaron los medios en

autoclave a 121°C y 15 minutos. Al día siguiente se inocularon las esporas de

Penicillum Chrysogenum, de la siguiente manera, en cabina para evitar

cualquier tipo contaminación ambiental, se adicionó al tubo de ensayo que

contenía al hongo cinco mililitros (5 mL) de agua estéril en dos oportunidades y

se agitó suavemente para liberar las esporas, y posteriormente se adicionaron

al erlenmeyer previamente esterilizado con mechero que contenía el caldo,

luego se tapo el erlenmeyer que garantizaba un espacio de cabeza suficiente

para la presencia de oxigeno necesario para el hongo aerobio con un tapón de

algodón y se dejó desarrollar el micelio del Penicillum Chrysogenum por

quince días en agitación orbital para garantizar la homogeneidad del medio.

Antibiograma

Inicialmente se sembró una suspensión bacteriana de Bacillus Subtilis

(organismo de prueba) en un agar de ensayo para bacterias indicadoras que

contenía (glucosa, peptona, extracto de levadura, agar y agua

desmineralizada), posteriormente se llevó la placa a la incubadora (45°C por 20

minutos) para secarla y que el calor ayudara a la incorporar el microorganismo

al agar y no quedara solo en la superficie, a continuación, se dividió la placa en

dos secciones y en la cabina se ubicaron en una de las mitades tres discos de

papel humedecidos con un tipo penicilina comercial y un blanco ( disco de

papel sin penicilina), y en la otra mitad se ubicaron un blanco y tres discos de

papel humedecidos con el caldo que contenía el micelio del Penicillum

Chrysogenum, ya que en el caldo era donde se encontraba la penicilina

excretada por el hongo. Esta placa de ensayo se incubó a 28°C por dos días y

transcurrido ese tiempo se realizo la medición del diámetro del halo de

inhibición formado alrededor de los discos.

RESULTADOS

Tabla 1. Medidas de los diámetros del halo de inhibición tanto para penicilina

comercial como para la penicilina obtenida a partir de Penicillum Chrysogenum.

Penicilina Comercial Penicilina Obtenida

Diámetro (cm) Diámetro (cm)

Blanco 0,6 0,6

Disco de papel 1 1,7 0,7

Disco de papel 2 1,1 0,6

Disco de papel 3 1,4 0,6

ANÁLISIS DE RESULTADOS

A partir de los resultados obtenidos (Tabla 1) del diámetro del halo de inhibición

para penicilina comercial y la obtenida en el laboratorio mediante la

fermentación del Penicillum Chrysogenum se concluye que el diámetro los

halos de inhibición para la penicilina obtenida son menores en comparación de

la penicilina comercial. La penicilina comercial produjo un halo de un diámetro

visible alrededor del disco de papel mientras que la obtenida se quedo solo en

la superficie, por lo que concluimos que la penicilina obtenida en el laboratorio

debido a que se encontraba dispersa y en solución junto con el micelio del

hongo y no se sometió a proceso de purificación la concentración no fue

suficiente para producir un diámetro de halo mayor en comparación con la

penicilina comercial, la cual fue sometida a una serie de procesos para su

obtención debido a que esta se realiza con mayor aislamiento y control del

proceso, entre otros factores que pueden mejoran el producto final. El efecto

que produjo la penicilina sobre el Bacillus Subtilis fue un rompimiento o lísis de

la pared celular del microorganismo, produciendo una inviabilidad celular a

medida que la penicilina se iba expandiendo a lo largo del disco de papel. Al

ser una bacteria Gram (+), indica que su tamaño de su pared celular es mayor

en comparación con las Gram (-) por esta razón la penicilina necesitaba más

tiempo para producir la lisis y por lo tanto tampoco se logró obtener un mayor

diámetro de hablo de inhibición teniendo en cuenta también las

concentraciones. Los compuestos adicionados en el medio de cultivo como

fuente de fosforo y nitrógeno fueron indispensables, el nitrógeno para la

formación y fuente de aminoácidos esenciales para la producción de la

penicilina y el fosforo como interventor en la fermentación; además con la

adición de la fuente de fenilacetato se garantizo que la penicilina obtenida fuera

penicilina G, esto debido a que para obtener un tipo determinado de penicilina

este tipo de compuestos se debe adicionar inicialmente ya sea fenilacetato o

fenoxiacetato.

CONCLUSIONES

El medio cultivo favoreció la fermentación del Penicillum Chrysogenum

debido a la presencia de glucosa y lactosa, pero además gracias a la

presencia de los demás nutrientes se ayudo y se garantizó una producción

significativa de penicilina.

El tamaño del micelio de Penicillum Chrysogenum obtenido en el medio de

cultivo favoreció la excreción del la penicilina en el medio de cultivo

consumido que además contenía los demás metabolitos resultantes del

proceso oxido-fermentativo favorecido por la presencia de oxigeno

representado en el espacio de cabeza.

Se logró diferenciar mediante el antibiograma la acción antibiótica de la

penicilina comercial en comparación con la penicilina obtenida en el

laboratorio, debido a las diferencias de concentraciones y a las condiciones

físicas de cada una.

Se pudo reconocer que la penicilina no solo ejerce su acción antibiótica

sobre agentes o microorganismos que producen virulencia o que no solo

puede ser utilizada para prevenir o solucionar enfermedades de salud, sino

que también puede ser aplicada en otro tipo de microorganismos no

patógenos, por lo que podría tener otras aplicaciones industriales.

BIBLIOGRAFÍA

COOMBS, J. Diccionario de biotecnología. Editorial Labor, S.A. 1ª edición

1989. España.

CRUEGUER, Anneliese. Manual de Microbiología Industrial. Editorial

Acribia S.A. Zaragoza España. 3ª edición. 1989.

JAGNOW, Gerhard. Biotecnología “Introducción con experimentos modelo”.

Editorial Acribia S.A. Zaragoza España. 1991.

STIEL, Néstor. Blog. Producción de penicilina. Esquema y proceso. Capitulo

9. Disponible en: www.academia.edu