Universidad de Santiago de Chile

Facultad de Química y Biología

Principios de Sistemas Celulares

EXTRACCIÓN DE ADN

Autores:

- Valentina Cantillán Carrasco.

- Andrés Cerda Alvarado.

Profesor: Hans Köhler.

Ayudante: Camila Sepúlveda.

Fecha Entrega: 4 de Noviembre de 2014.

1 Introducción

El material hereditario de las células que componen a los seres vivos (los genes), se

encuentran codificados en el ADN. El ADN es un ácido nucleico: una unión de

monómeros llamados nucleótidos. Un nucleótido, a su vez, corresponde a una molécula

de fosfato y un nucleósido, el que finalmente es la suma de un azúcar (desoxirribosa) y

una de las cuatro bases nitrogenadas (Adenina, Citosina, Guanina y Timina)(1).

Este importante ácido nucleico se puede extraer de las células de cualquier organismo

vivo. El presente informe centra su foco en la extracción de ADN de un tejido de hígado

de Sus Scrofa L. (domestica)(2) (el tejido hepático es rico en ADN, conteniendo

aproximadamente 15 μg/mg). Para separar ADN o una mezcla de moléculas de ADN, se

utiliza el procedimiento llamado “Electroforesis”(3). Así como el microscopio sirvió para

observar estructuras microscópicas, la electroforesis hace posible observar una gran

cantidad de moléculas, en este caso, el ADN.

Para preparar una muestra para la electroforesis, primero es necesario obtenerla del

tejido o fluido del que se quiera obtener, luego es necesario separar o dispersar la

muestra por maceración, lisar las células por medio de una solución tampón. Al romper un

tejido, comienzan a actuar inmediatamente las enzimas DNAasas(1), que se encargan de

degradar el ADN. Es por esto que es necesario agregar una enzima proteolítica (como la

proteinasa K, que funciona a 63 °C)(1) que logre desnaturalizar las proteínas (las enzimas

son proteínas) y así permitir que el ADN se mantenga intacto. Para eliminar las proteínas

desnaturalizadas y casi la mayoría de los polisacáridos, se agrega acetato de potasio(4).

Luego se centrifuga para que los tejidos, membranas, proteínas y polisacáridos se

separen de los ácidos nucleicos, quedando estos en el sobrenadante(1). Para separar el

ADN de la fase acuosa, hay que precipitarlo por medio de un alcohol, como el etanol, por

ejemplo. El etanol “secuestra” las moléculas de agua que rodean al ADN, aislándolo de la

solución acuosa y liberándolo de impurezas(4).

En resumen, los principios de la electroforesis se basan en el movimiento de moléculas a

través de un medio poroso (generalmente un gel) debido a un campo eléctrico aplicado.

Las moléculas se separan en la matriz de electroforesis de acuerdo a su peso molecular,

tamaño y carga eléctrica. La velocidad de avance de las moléculas en la placa

electroforética es directamente proporcional a su carga e inversamente proporcional a su

tamaño(5). Los fragmentos de ADN ubicados en la matriz poseen carga negativa, debido a

la presencia de un grupo fosfato en cada nucleótido de la doble hebra(1). Como

consideración adicional, se debe tener en cuenta que el tamaño de los cromosomas

eucariontes es muy grande como para ser identificado con el presente proceso, por lo que

generalmente se debe fragmentar el ADN con nucleasas. También, el tamaño de las

moléculas afecta la elección del medio poroso para la electroforesis. Para el caso de

ADN, al ser muy grandes las moléculas (hasta 20 kb)(7), se recomienda el uso de gel de

agarosa.

Para detectar el ADN luego de ser separado, deben ser teñidas o marcadas con algún

reactivo. El reactivo usado para marcar el ADN es el bromuro de etidio, un “agente

intercalante”, que se encarga de desenrollar la doble hélice en un punto, introduciéndose

en el ADN y siendo fluorescente a la luz ultravioleta (color naranja). De haber sido mal

eliminadas las DNAasas, el ADN se encontrará degradado y se observará una mancha

naranja muy difuminada(1). De encontrarse con impurezas, se verán varias manchas en

distintas posiciones de la matriz electroforética, impidiendo distinguir con claridad el ADN.

2 Objetivos

2.1 Aislar y extraer ácidos nucleicos a partir de una muestra de hígado de S. Scrofa.

2.2 Separar DNA de una mezcla de ácidos nucleicos.

2.3 Someter DNA extraídos al proceso de electroforesis en gel de agarosa.

2.4 Analizar cualitativamente el proceso de electroforesis a partir de la imagen obtenida.

3 Materiales y métodos

Extracción de ADN

Recibimos una muestra de hígado de S. Scrofa y luego la molimos en un mortero de

porcelana. Posteriomente el profesor agregó buffer TE en una cantidad proporcional a tres

veces el volumen de muestra de hígado molido que teníamos. Finalmente, se vació la

muestra en un tubo eppendorf hasta completar 1[mL ] de éste

Se tomaron 20 [μL] de proteinasa K mediante una micropipeta (Labnet – BioPette Plus

20/200 ¿]), además se tomaron 100 [ μL ] de acetato de potasio (CH 3COOK ) mediante la

misma pipeta. Ambas cantidades fueron agregadas al tubo eppendorf que contenía la

muestra. Una vez hecho esto, se mezcló la muestra contenida en el eppendorf mediante

inversión. Se llevó éste a centrifugar (Eppendorf – 54151) a 10000 [rpm] durante 5 [min].

Luego de la centrifugación, se obtuvieron 100[μL] del sobrenadante mediante una

micropipeta (Labnet – BioPette Plus 20/200 ¿]) y fueron traspasados a otro eppendorf.

Luego, se tomaron 100 [μL] de PCI (Fenol-Cloroformo- Alcohol Isoamílico) mediante

misma micropipeta recientemente mencionada, fueron agregados al nuevo eppendorf (el

que contenía el sobrenadante) y finalmente mezclado por inversión. El tubo fue llevado a

centrífuga (Eppendorf – 54151) a 5000 [rpm] durante 5 [min].

Una vez hecha esta centrifugación, se extrajeron 20 [μL] de la fase superior mediante una

micropipeta (Labnet – BioPette Plus 2/20 ¿]) y fueron traspasdos a un nuevo tubo

eppendorf. A éste último se gregaron 20 [μL] de cloroformo que fueron tomados mediante

la misma micropipeta recientemente mencionada y fue mezclado por inversión del tubo.

Éste fue llevado a centrífuga (Eppendorf – 54151) a 5000 [rpm] durante 5 [min].

Luego de traer de la centrìfuga el eppendorf que contenía la muestra, se extrajo la mayor

cantidad posible de la fase superior ( 20 [μL]) usando una micropipeta (Labnet

– BioPette Plus 2/20 ¿]), se agregaron 200 [μL] de etanol frío (otorgado por la ayudante) ,

que fueron tomado mediante la micropipeta recientemente mencionada, y fue mezclado

mediante inversión del tubo.

Finalmente, se botó con cuidado el etanol y para secar el restante, se dejó el tubo

eppendorf abierto.

4 Resultados

Resultado de la electroforesis de ADN de S. scrofa en gel de agarosa.

Figura 4.1: Fotografía de los resultados correspondientes a las muestras de ADN

extraído.

La figura 4.1 muestra el resultado del proceso de la técnica de electroforesis. Esta imagen

fue entregada por el profesor días posteriores a la experiencia.

Se pueden observar bandas difuminadas producto de la contaminación de la muestra y la

ausencia de marcadores de peso molecular.

5 Discusión

El resultado obtenido luego de la extracción de ADN, nos muestra que el método de

electroforesis en gel de agarosa es útil a la hora de verificar que el aislamiento de ADN

fue correctamente ejecutado.

La muestra utilizada en esta experiencia provino de hígado de S. scrofa y, en particular, el

resultado de la electroforesis (Figura 4.1) muestra bandas difuminadas producto de la

contaminación resultado de la prolijidad con que se llevó a cabo la extracción misma.

Una de las razones por las cuales se observa una difuminacaión por contaminación de la

muestras puede ser el manejo incorrecto de la enzima proteinasa K. Es probable que la

enzima no haya actuado todo el tiempo que se necesita para, efectivamente, degradar

todas las proteínas presentes en la muestra, por sobre todo las DNAasas, que al

encargarse de degradar el ADN reducen el material genético disponible para observar,

dejándolo en proporciones muy pequeñas en comparación al resto de componentes de la

muestra(1). Además, otro motivo de contaminación pudo haber sido el tratado de muestras

demasiado pequeñas. Al hacer la última separación de la fase superior se pudo haber

traspasado con la micropipeta la zona de separación y haber llevado consigo

contaminantes provenientes de la zona no requerida.

Al observar una zona con mayor densidad en las columnas difuminadas, se deduce que

es ahí donde el ADN se encuentra, por lo tanto, la electroforesis fue exitosa a pesar de

que la preparación de la muestra fue deficiente(1). Entonces, es posible decir que se

comprobó que las moléculas de ADN migran hacia el ánodo de la matriz electroforética

debido a las cargas negativas que posee, producto de las cargas negativas de los grupos

fosfato(1).

Como la difuminación se extiende más allá de la zona densa del ADN y compone, al

menos, la mitad de la fotografía, se deduce que gran parte de la contaminación producida

se debe a moléculas con una menor relación carga/peso en comparación con el ácido

nucléico en cuestión(3), debido a que las moléculas que con esta característica migran con

mayor facilidad, pues al tener más carga, se ven más atraídas por el polo positivo (ánodo)

e inclusive, al tener menor peso, la matriz de agarosa ofrece menor resistencia mecánica

al movimiento.

6 Conclusiones

Se logró aislar y posteriormente extraer ácidos nucleicos proveniente de células de hígado

de S. Scrofa. Luego, se consiguió separar ADN de la mezcla de ácidos nucleicos para su

posterior análisis.

Además, se entregó la muestra aislada de ADN para que el profesor la sometiera al

proceso de electroforesis en gel de agarosa. Luego de la entrega, en ésta se detectó que

hubo una manipulación deficiente de las muestra porque el resultado arrojó bandas

difuminadas, esto quiere decir que había presencia de contaminantes en el extracto de

muestra.

No fue posible caracterizar cualitativamente el tamaño de los fragmentos de ADN ya que

la fotografía recibida no captura las bandas marcadoras de peso molecular.

7 Referencias

7.1 LUQUE, J., HERRÁEZ, A. “Texto ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería

Genética – Conceptos, técnicas y aplicaciones en ciencias de la salud”. [Formato

PDF, Disponible en línea] <

http://www.ciens.ucv.ve:8080/generador/sites/geneticamolecular/archivos/

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7.2 ÁLVAREZ-ROMERO, J. “Sus scrofa (doméstica) Linnaeus, 1758”. [Formato PDF,

Disponible en línea]. <

http://www.conabio.gob.mx/conocimiento/exoticas/fichaexoticas/Susscrofa_domestic

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7.3 YILMAZ, M., OZIC, C., GOK, I. “Principles of Nucleic Acid Separation by Agarose

Gel Electrophoresis” [Formato PDF, Disponible en línea], <

http://www.intechopen.com/books/gel-electrophoresis-principles-and-basics/

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7.4 VELASCO, R. “Marcadores moleculares y la extracción de ADN”. [Formato PDF,

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http://www.unicauca.edu.co/biotecnologia/ediciones/vol3/Art32.pdf >. Fecha de

consulta: 30 de Octubre del 2014.

7.5 Instituto Nacional de Salud, Lima – Perú. “Manual de procedimientos de

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http://www.ins.gob.pe/insvirtual/images/otrpubs/pdf/Manual%20Electroforesis

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7.6 TAN, A. “¿Cuál es la función de una solución buffer Tris en la extracción de ADN?”,

[Disponible en línea]. < http://www.ehowenespanol.com/funcion-solucion-buffer-tris-

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7.7 EDVOTEK. The Biotechnology Education Company. “Principles and Practice of

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Consulta: 27 de Octubre del 2014.

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EE.UU. Jones & Barlett Learning, 2006, 362 p.

7.9 ROE, B., CRABTREE, J., KHAN, A. “DNA isolation and sequencing”. EE.UU.

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7.10 GÓMEZ, M., ECHENIQUE, V. “Herramientas básicas de ingeniería genética”.

[Formato PDF, Disponible en línea] < http://www.biblioteca.org.ar/libros/150406.pdf

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