INGENIERIA GENETICA

1.-INTRODUCCIÓN

La utilización de organismos vivos o de sus componentes en la obtención de productos útiles para las personas es la base de la biotecnología .Tradicionalmente se utilizaba la fermentación de microorganismos para obtener productos como el yogur, el pan o el vino

El paso de la biología tradicional a la moderna surge con las técnicas que derivan de la ingeniería genética como la tecnología del ADN recombinante

La ingeniería genética puede definirse como un conjunto de técnicas, nacidas de la Biología molecular, que permiten manipular el genoma de un ser vivo.

La ingeniería genética es una técnica que consiste en la manipulación, modificación e introducción de genes en el genoma de un individuo que carece de ellos.

Los organismos que han sido modificados por ingeniería genética se denominan transgénicos La ingeniería genética incluye un conjunto de técnicas biotecnológicas, entre las que destacan:

1.-la tecnología del ADN recombinante: con la que es posible aislar y manipular un fragmento de ADN de un organismo para introducirlo en otro.Se realiza a través de las enzimas de restricción que son capaces de "cortar" el ADN en puntos concretos. Se denomina ADN recombinante al que se ha formado al intercalar un segmento de ADN extraño un un ADN receptor. Por ejemplo, la integración de un ADN vírico en un ADN celular.

2.- Clonación Permite la producción de múltiples copias de un gen específico o de un fragmento de ADN

3.-La secuenciación del ADN: Técnica que permite saber el orden o secuencia de los nucleótidos que forman parte de un gen.

4.- la reacción en cadena de la polimerasa (PCR): con la que se consigue aumentar el número de copias de un fragmento determinado de ADN, por lo tanto, con una mínima cantidad de muestra de ADN, se puede conseguir toda la que se necesite para un determinado estudio.

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El conocimiento del genoma de muchos organismos ha provocado la aparición de nuevas disciplina científicas:

-genómica: rama de la genética que estudia el genoma completo de un organismo

-Proteómica: Estudia, desde el punto de vista estructural y funcional, todas las proteínas codificadas por un genoma concreto

-Farmacogenética: Persigue la fabricación de medicamentos personalizados

2.- TECNOLOGIA DEL ADN RECOMBINNANTEEsta tecnología nos permite obtener fragmentos de ADN en cantidades ilimitadas, que llevará además el gen o los genes que se desee :. Este ADN puede incorporarse a las células de

otros organismos (vegetales, animales, bacterias...) en los que se podrá "expresar" la información de dichos genes. (De una manera muy simple podemos decir que "cortamos" un gen humano y se lo "pegamos" al ADN de una bacteria; si por ejemplo es el gen que regula la fabricación de insulina, lo que haríamos al ponérselo a una bacteria es "obligar" a ésta a que fabrique la insulina).

Lo primero que hay que realizar es un corte específico del ADN en fragmentos pequeños y manejables mediante la utilización de un tipo de enzimas conocidas como enzimas de restricción que pueden considerarse como las "tijeras moleculares". Estas enzimas se aislaron en bacterias y se identifican con distintos nombres, siendo lo característico de ellas estos dos principios:

a) Cada enzima de restricción reconoce una secuencia específica de nucleótidos(4-8 nucleótidos denominado sitio de restricción) y corta en ese punto cada una de las cadenas de ADN

b) Los extremos libres que quedan se llaman extremos pegajosos, porque pueden unirse a otros fragmentos de ADN que hayan sido cortados por la misma enzima de restricción

Estas uniones entre los bordes cohesivos son temporales , pero se pueden hacer permanentes en presencia de la enzima ADN ligasa

La unión del ADN procedente de dos orígenes distintos produce una molécula de ADN recombinante

Los fragmentos obtenidos después de la actuación de las distintas enzimas de restricción, se pueden separar por tamaños, es decir, según el número de pares de nucleótidos que llevan, mediante la técnica de electroforesis y así estudiar los distintos trozos.

Según donde se hallen las secuencias de reconocimiento, un gen determinado puede estar fragmentado en varios trozos, o bien un trozo puede contener varios genes, posibilidades que hay que confirmar.

El segundo paso es la inserción de los fragmentos de ADN. Esta inserción se realiza en vectores de clonación, que son los agentes transportadores capaces de introducirlos en las células hospedadoras.

Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de ADN capaces de transportar ADN extraño , que tienen capacidad para autorreplicarse dentro de las células hospedadoras.

Además del origen de replicación, los vectores de clonación deben llevar otros genes denominados marcadores, que sirven para identificar las células que contienen el vector de clonación.

Se suelen utilizar como marcadores, Genes de resistencia a antibióticos. Sirven para identificar bacterias que contienen el vector de clonación, porque estas bacterias serán resistentes al antibiótico del gen marcador.

Genes de luminiscencia.. En este caso, la célula que contenga el gen que se quiere clonar, tendrá la propiedad de emitir luz, ya que el marcador que se le incorpora determina que se exprese esa característica. Este sistema se emplea cuando la célula hospedadora es una célula eucariota.

Los vectores de clonación más utilizados

a) Plásmidos. Son moléculas de ADN circular bacteriano, con un tamaño menor que el del cromosoma. Se replican con independencia del cromosoma bacteriano ya que tienen su propio origen de replicación.

La unión del ADN que contiene el gen que se desea clonar con el vector de clonación, se realiza por medio ADN-ligasas, que unen ambos trozos de ADN

.b) Virus bacteriófagos. El proceso es similar, se trata de insertar el gen deseado en un fragmento de ADN vírico Posteriormente se ensamblarán las distintas partes del virus Así quedará el virus completo. En el siguiente paso se insertará este ADN por el proceso de la TRANSDUCCION: proceso en el cual los bacteriófagos transportan genes bacterianos desde una célula huésped a otra

Son capaces de llevar mayor cantidad de ADN que un plásmido

c) Cósmidos: son vectores híbridos entre el fago λ y un plásmido , de modo que su ADN puede replicarse como un plásmido o empaquetarse como un fago

D) Otros vectores: Cromosomas artificiales de levaduras, genomas modificados de adenovirus, retrovirus, cromosomas humanos artificiales.

El siguiente paso será introducir el vector de clonación que contiene el gen que se quiere clonar en la célula hospedadora, para que ésta, al multiplicarse, origine un clon celular que lleve el gen concreto.

Existen varios métodos que dependerán del tipo de célula fundamentalmente. En bacterias (células procariotas), mediante estos procesos:

a) Transformación. Ocurre espontáneamente en ciertos tipos de bacterias y se consigue artificialmente sometiendo a la célula bacteriana a tratamientos físicos y químicos. La célula capta moléculas de ADN que se encuentran en el medio externo, las introduce en su interior y las incorpora a su genoma.

b) Transducción. Este método consiste en introducir el ADN en la célula hospedadora mediante un virus, utilizando como vector de clonación el genoma del virus.

Para poder realizar la clonación génica, el huésped debe ser:

- De crecimiento rápido y en un medio de cultivo barato

- No ser dañino ni patógeno

- Ser capaz de aceptar ADN exógeno

- Tener las enzimas necesarias para la replicación del vector

Los huéspedes más utilizados son las bacterias Escherichia coli (Bacillus subtilis y la levadura Saccharomyces cerevisae

. Una vez que se ha conseguido la población de bacterias transformadas, el siguiente paso es poner a las bacterias en un medio de cultivo apropiado para que se multipliquen. A la vez que se reproducen las bacterias lo hace también el plásmido con el gen que interesa, el resultado es que se obtiene un clon de células que llevan todas ese gen de interés.

Se pueden formar por tanto diferentes clones con genes de interés para el hombre. Este conjunto de clones se denomina biblioteca genómica

3.- REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Es una técnica que permite duplicar un número ilimitado de veces un fragmento de ADN en un tubo de ensayo. Mediante esta técnica pueden generarse millones de moléculas idénticas, a partir de una molécula de ADN. Esto se puede conseguir en unas horas.

La reacción es muy sencilla, necesita cantidades de ADN muy pequeñas y sólo se precisa un tubo de ensayo, algunos reactivos, una fuente de calor y unas pequeñas cadena de nucleótidos que actúan como cebadores.

La reacción es un proceso cíclico:

a) La molécula de ADN que va a copiarse se calienta para que se desnaturalice y se separe las dos hebras.

Las cadenas recién formadas son separadas de nuevo por el calor y comienza otro nuevo ciclo de copias. Estos ciclos se repiten hasta que se obtiene el número de copias deseado

b) Se enfría la mezcla para permitir que los cebadores se unan a cada uno de los extremos de las hebras del ADN

c) Cada una de las hebras es copiada por la ADN-polimerasa. (Se utiliza la ADN-polimerasa de una bacteria que vive en aguas termales, Thermus aquaticus, así la enzima puede trabajar a altas temperaturas).

APLICACIONES DE LA PCR Secuenciación

Una de las razones mas comunes para el uso de la PCR es la formación de suficiente cantidad de ADN molde para su secuenciación. Es mucho mas sencillo y rápido que la clonación en células.

Estudios evolutivos Mediante la PCR se pueden amplificar genes de organismos ya extinguidos, como del mamut, o restos antiguos humanos. Se pueden comparar estos genes con los genes semejantes de organismos actuales y poder reconstruir árboles filogenéticos.

El PCR también se ha utilizado para conseguir el mapa del genoma humano.

Huellas dactilares del ADN. Mediante esta técnica es posible comparar muestras diferentes de ADN para comprobar si pertenecen al mismo individuo o no, o si existe parentesco entre ellas. Esta técnica se aplica actualmente en Medicina forense e investigaciones policiales, con el fin de identificar individuos a partir de muestras biológicas, como sangre, semen, piel o cabellos. También se utiliza en las pruebas de paternidad.

Diagnósticos prenatales: Utilizando ADN de células embrionarias

4.- SECUENCIACION DEL ADN

Se realiza con el método didesoxi de Sanger o Método de terminación de la cadena

Se denomina así porque es necesaria la utilización de los didesoxirribonucleótidos que son nucleótidos modificados que han perdido el grupo OH situado en el carbono 3’y que provocan la parada de la copia del ADN por la ADN polimerasa

Para obtener la secuencia de bases nitrogenadas de un segmento de ADN por el método enzimático de terminación de cadena, se necesitan los siguientes compuestos:

El ADN molde o segmento de ADN que se desea secuenciar. Un enzima que replique el ADN, normalmente la ADN Polimerasa I del bacteriofago T4. Un cebador o "primer"Los cuatro nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). A Por último, se necesitan nucleótidos didesoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP) marcados con una molécula fluorescente para cada uno de ellosEl método básicamente consiste en:1º Se desnaturaliza el ADN que se desea secuenciar

2º Se mezclan todos los componentes de la reacción y se forman nuevas cadenas de ADN que utilizan como molde la secuencia del ADN que se quiere secuenciar . La copia continua hasta que por azar se encuentra con un didesoxi. Al final se obtiene una mezcla de cadenas de ADN de longitudes variadas

3.- Se separan las cadenas marcadas cuando la mezcla atraviesa un gel de poliacrilamina, de tal manera que las más cortas se mueven con mayor rapidez

4.- Se obtiene un espectrograma que nos dará la secuencia de bases complementaria de la molde

5.- APLICACIONES MEDICAS DE LA INGENIERIA GENETICA

1.-OBTENCIÓN DE PROTEINAS DE MAMÍFEROS

Una serie de hormonas como la insulina, la hormona del crecimiento, factores de coagulación, etc ... tienen un interés médico y comercial muy grande. Antes, la obtención de estas proteínas se realizaba mediante su extracción directa a partir de tejidos o fluidos corporales.

En la actualidad, gracias a la tecnología del ADN recombinante, se clonan los genes de ciertas proteínas humanas en microorganismos adecuados para su fabricación comercial.

Un ejemplo típico es la producción de insulina que se obtiene a partir de la levadura Sacharomyces cerevisae, en la cual se clona el gen de la insulina humana.

OBTENCIÓN DE VACUNAS RECOMBINANTES

El sistema tradicional de obtención de vacunas a partir de microorganismos patógenos inactivos, puede comportar un riesgo potencial. Muchas vacunas, como la de la hepatitis B, se obtienen actualmente por ingeniería genética. Como la mayoría de los factores antigénicos son proteínas lo que se hace es clonar el gen de la proteína correspondiente.

DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES DE ORIGEN GENÉTICO:

Conociendo la secuencia de nucleótidos de un gen responsable de una cierta anomalía, se puede diagnosticar si este gen anómalo está presente en un determinado individuo.

OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES. (TERAPIA GÉNICA)

Este proceso abre las puertas para luchar contra enfermedades como el cáncer y diagnosticarlo incluso antes de que aparezcan los primeros síntomas

La terapia génica se define como técnica terapéutica mediante la cual se inserta un gen funcional en las células de un paciente humano para corregir un defecto genético o para dotar a las células de una nueva función

6.- APLICACIONES EN LA AGRICULTURA

Mediante la ingeniería genética han podido modificarse las características de gran cantidad de plantas para hacerlas más útiles al hombre, son las llamadas plantas transgénicas. Las primeras plantas obtenidas mediante estas técnicas fueron un tipo de tomates, en los que sus frutos tardan en madurar algunas semanas después de haber sido cosechados.

Recordando que la célula vegetal posee una rígida pared celular, lo primero que hay que hacer es obtener protoplastos (los protoplastos son células desprovistas de pared celular, que se consigue empleando enzimas que destruyen la lámina media y desorganizan la parte de celulosa).

PLANTAS TRANSGÉNICAS Entre los principales caracteres que se han transferido a vegetales, merecen destacarse:

Resistencia a herbicidas, a insectos y a enfermedades microbianas.

Ya se dispone de semillas de algodón, que son insensibles a herbicidas. Para la resistencia a los insectos se utilizan cepas de Bacillus thuringiensis que producen una toxina (toxina - Bt) dañina para las larvas de muchos insectos, de modo que no pueden desarrollarse sobre las plantas transgénicas con este gen. Respecto a los virus se ha demostrado que las plantas transgénicas con el gen de la proteina de la cápsida de un virus, son resistentes a la invasión de dicho virus.

Incremento del rendimiento fotosintético

Para ello se transfieren los genes de la ruta fotosintética de plantas C4 que es más eficiente.

Mejora en la calidad de los productos agrícolas

Tal es el caso de la colza y la soja transgénicas que producen aceites modificados, que no contienen los caracteres indeseables de las plantas comunes.

Síntesis de productos de interés comercial

Existen ya plantas transgénicas que producen anticuerpos animales, interferón, e incluso elementos de un poliéster destinado a la fabricación de plásticos biodegradables

Asimilación de nitrógeno atmosférico

Aunque no hay resultados, se ensaya la transfección del gen nif responsable de la nitrogenasa, existente en microorganismos fijadores de nitrógeno, y que permitiría a las plantas que hospedasen dicho gen, crecer sin necesidad de nitratos o abonos nitrogenados, aumentando la síntesis de proteinas de modo espectacular.

7.-APLICACIONES EN ANIMALES

La transgénesis se puede definir como la introducción de ADN extraño en un genoma, de modo que se mantenga estable de forma hereditaria y afecte a todas las células en los organismos multicelulares. Generalmente, en animales, el ADN extraño, llamado transgen, se introduce en zigotos, y los embriones que hayan integrado el ADN extraño en su genoma, previamente a la primera división , producirán un organismo transgénico; de modo que el transgén pasará a las siguientes generaciones a través de la linea germinal (gametos).

Entre las aplicaciones de los animales transgénicos se pueden destacar:

La posibilidad de estudiar a nivel molecular el desarrollo embrionario y su regulación.

Manipular de forma específica la expresión génica in vivo.

Estudiar la función de genes específicos.

Poder utilizar a mamíferos como biorreactores para la producción de proteinas humanas.

La corrección de errores innatos de metabolismo mediante terapia génica.

El principio de la clonación está en la obtención de organismos idénticos genéticamente, y por tanto morfológica y fisiológicamente, como lo son dos gemelos univitelinos. Esto ha sido el sueño de muchos ganaderos, que han deseado que todo su ganado tuviera las cualidades de algún ejemplar especialmente bueno.

Se pueden utilizar dos métodos para conseguir clones de animales:

Por disgregación de células embrionarias .Se basa en el mismo principio por el que nacen gemelos de forma natural.Se pueden separar las células de un embrión en diferentes estados de desarrollo, desde el estado de 2 células hasta el estado de mórula. Cada célula separada puede funcionar como un zigoto que puede desarrollarse para dar un individuo completo.

Por TRANSFERENCIA NUCLEAR. Se toman células embrionarias en fase de mórula o blástula, obtenidas por disgregación, se cultivan in vitro,y después se transfieren a ovocitos a los que se les ha quitado el núcleo. Se provoca la fusión de las dos células animales de modo que el núcleo de la célula embrionaria quede en el interior del ovocito, pudiendo éste empezar a funcionar como un zigoto.

8.-APLICACIONES DE LA INGENIERÍA GENÉTICA EN EL MEDIO AMBIENTE

Microorganismos modificados genéticamente están siendo utilizados para limpiar el medio ambiente de ciertos contaminantes , ya que tienen la capacidad de transformarlos en sustancias no contaminantes o de adsorberlos. Su acción se realiza de dos maneras

-Biorremediación : bacterias transgénicas que degradan la materia orgánica como los hidrocarburos con un gran rendimiento y en diversas condiciones

-Bioadsorción: Bacterias genéticamente modificadas son capaces de adsorber ciertos metales pesados que contaminan el suelo

8.-PROYECTO GENOMA HUMANO

El Proyecto Genoma Humano comenzó en 1990 en los Estados Unidos con un presupuesto de 375.000 millones de pesetas y un plazo de 15 años, con el objetivo de analizar molecularmente la herencia genética humana. Se trata de realizar mapas de cada uno de los cromosomas humanos. Implica dividir los cromosomas en pequeños fragmentos que puedan ser caracterizados y posteriormente ordenados en el cromosoma.

Este proyecto supone la realización de dos tipos de mapas:

Mapas genéticos: Estos mapas simplemente indican la posición relativa de los diferentes genes. Para esta confección se están estudiando la transmisión de caracteres hereditarios, capaces de ser objetivados de una generación a otra en grandes familias. En 1994 se terminó el primer mapa genético de todo el genoma humano.

Mapas físicos: De mayor resolución, pues muestra la secuencia de nucleótidos en la molécula de ADN que constituye el cromosoma. Se obtiene la secuencia de nucleótidos de un gen. Se realiza fundamentalmente mediante la electroforesis en geles de distintos fragmentos de ADN y la ayuda de ordenadores. El completar este mapa se ha conseguido cinco años antes de lo que se esperaba

CARACTERÍSTICAS PRINCIPALE DEL GENOMA HUMANO

-Sólo 20000 a 25000 genes codifican proteínas, mucho menos de lo que se esperaba

-Los seres humanos son idénticos en un 99,9% y nos diferenciamos en apenas unos tres millones de nucleótidos

-La mayor parte de estas diferencias se encuentran localizadas en los llamados polimorfismos de un único nucleótido que son variaciones que afectan a un solo par de bases

. La mayor parte del genoma no es codificante y se le denomina ADN basura que parecía que no tenía ninguna función los últimos estudios los relaciona con funciones de regulación de la expresión de los genes

La genómica estudia ese genoma y sus objetivos principales son:

a) Identificar los genes codificadores de proteínas

b) Estudiar las interacciones de los genes entre sí