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Inmunoanálisis y pruebas de detección de drogas de abuso en el laboratorio de toxicología
Jennifer A. Collins, Ph.D.MEDTOX Laboratories, Inc.
Orden del día
Antecedentes y conceptos básicosTipos de inmunoanálisisTemas de reactividad cruzadaFormatos y modelos de pruebasAplicaciones en el mercado
Antecedentes y conceptosbásicos
Yalow & Berson, 1959: aplicación de radioisótopos en la medición de insulina (RIA) Recibió el premio Nobel en 1977
Conceptos básicos: AnticuerposLos anticuerpos comparten una estructura básica común, pero incluyen regiones variables que les permiten adaptarse a antígenos específicos. Esta flexibilidad proporciona la heterogeneidad requerida para una inmunidad eficaz.
Sitio de unión del antígeno
Regiones variables
Regiones comunes
Conceptos básicos: Antígenos
Los antígenos inducen la formación de anticuerpos cuando se los introduce en un huésped extraño
Interacción entre anticuerpo y antígeno: los antígenos y los anticuerpos muestran comportamientos de afinidad y unión en solución (concepto de cerradura y llave)
La unión de los antígenos y los anticuerpos conduce a la eliminación del inmunógeno
Conceptos básicos: Inmunoanálisis
Los inmunoanálisis son un grupo variado de técnicas analíticas basadas en interacciones específicas de anticuerpo-antígeno que producen una señal mensurable que puede relacionarse con la concentración de un compuesto en solución
Aplicaciones en casi todas las áreas de laboratorio; esta presentación estará limitada a los ensayos y aplicaciones de las drogas de abuso
Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden ser dirigidos a moléculas de drogas muy específicas o a una clase entera de drogas
Inmunoanálisis competitivo
Basado en la competencia entre la droga de la muestra y un derivado de la droga marcado en un reactivo para una cantidad limitada de anticuerpo
Anticuerpo Antígeno en la muestra
Antígeno marcado
Inmunoanálisis no competitivo
En los métodos no competitivos, la mezcla de reacción generalmente incluye un exceso del anticuerpo marcado, de modo que se una la totalidad de la droga y el metabolito. La cantidad del complejo anticuerpo-antígeno se mide luego para determinar la cantidad de droga presente en la muestra.
Inmunoanálisis heterogéneosvs. homogéneos
Los inmunoanálisis heterogéneos requieren la separación de los componentes unidos y separados después de que tuvo lugar la reacción (por ej. ELISA)En los inmunoanálisis homogéneos, la reacción de unión se mide "en el lugar" sin la separación de los componentes de reacción
Inmunoanálisis utilizados en pruebas de detección de drogas de abuso
RIAEIAFPIAKIMS
Flujo lateral
Radioinmunoanálisis (RIA)El RIA utiliza un marcador radiactivo (generalmente 125I, 3H o 14C), que emite una radiación que puede medirse con un contador beta o gammaEn años recientes se ha observado una tendencia que se aleja del RIA y se acerca a las técnicas no isotópicas
Tubo cubierto con anticuerpos
Agregar muestra
Agregar droga 125I
Incubado Decantar y contar
COMPETENCIA
RIA DE TUBO CUBIERTO
Enzimoinmunoanálisis (EIA)
Los enzimoinmunoanálisis utilizan marcadores de enzimas como por ejemplo glucosa-6-fosfato dehidrogenasa(G6PD) y B-galactosidasa para proporcionar una señal mensurable Las reacciones se controlan fotométricamente como cambios en la absorbancia
Ejemplos de EIA: EMITR
La actividad/absorbancia de la enzima es directamente proporcional a la concentración de la droga
La droga de la muestra y la droga marcada con G6PD compiten por los sitios de unión del anticuerpo
La unión inhibe la actividad de la enzima, mientras que las enzimas libres permanecen activas para interactuar con el sustrato
Sustrato que reacciona con la enzimaSustrato
Enzima con droga acoplada
Droga que bloquea la droga acoplada a la enzima
DrogaAnticuerpo
Ejemplos de EIA: CEDIAR
Los fragmentos de la enzima creada por ingeniería genética de la enzima B-galactosidasase vuelven a unir en forma espontánea en la solución para formar una enzima activa
La droga de la muestra compite por los sitios de unión del anticuerpo
La concentración de la droga es directamente proporcional a la actividad de la enzima
Anticuerpo Analito DE Monómero de AE
Conc. alta del analito
Enzima activa
Conc. baja del analito
Sin actividad enzimática
Monómero de AE
Ejemplos de EIA: ELISA
Ensayo inmunosorbenteligado a enzimas: EIA competitivo, heterogéneoLos componentes de reacción se absorben o se unen a la superficie de una fase sólida, generalmente una placa de microtitulación
La absorbancia se mide usando un lector de microplacaLa absorbancia de la muestra es inversamente proporcional a la concentración de la droga
Polarización fluorescente
FPIA: ensayos competitivos, homogéneos queutilizan marcadores fluorescentes. Los resultadosse miden fotométricamente.
FPIA
La droga de la muestra compite con la droga marcada con fluoresceína por los sitios de unión del anticuerpoLa mezcla de reacción es excitada por medio de luz polarizada planaCuando el marcador regresa a un estado de menor energía, emite luz; se mide la polarización
El valor de polarización de la muestra es inversamente proporcional a la concentración del analito
Droga marcada con fluorosceína
Anticuerpo contra drogaDroga
Zona de incubaciónAgregar muestra y reactivos
ExcitaciónEmisión
Detección fluorescente
Interacción cinética de micropartículas en solución (KIMS)
La droga de la muestra compite con el derivado de la droga por los sitios de unión del anticuerpoLas micropartículas unidas al anticuerpo forman aglomerados (aglutinados) que aumentan la absorbancia de la mezcla de reacciónLa absorbancia es inversamente proporcional a la concentración de la droga en la muestra
Ensayo en línea (Gen I) - Negativo
Anticuerpo anti-droga Droga unida a micropartículas
Aglomeración
Droga en la muestra
Sin aglomeración
Ensayo en línea (Gen I) - Positivo
Droga unida a micropartículas
Anticuerpo anti-droga
Pruebas de detección de drogas de abuso en centros de atención: Tecnología de flujo lateral
Inmunoanálisis competitivos heterogéneosMarcador: anticuerpos dorados coloidales secados en la almohadilla de la muestraDerivados de drogas "secados" en tira en ubicaciones definidasLa muestra de orina aplicada a una almohadilla de muestra emigra hacia abajo en la tiraLa droga en la muestra se une a anticuerpos que dan como resultado una señal de lectura visual
Inmunoanálisis de flujo lateral
Fortalezas
Aplicaciones en todas las áreas de laboratorioBuena sensibilidad, gran variedad de pruebasFácilmente automatizados con aplicaciones en muchas plataformas de instrumentosEn la mayoría de los casos, no se necesita una preparación de la muestra; eficientes; económicos
Limitaciones
Los inmunoanálisis son más útiles si comprendemos sus limitaciones
Dependiendo del reactivo, pueden tener un rango dinámico limitadoReactividad cruzada y especificidadInterferencias de compuestos sin relaciones estructuralesLa interpretación de los resultados siempre debe efectuarse en este contexto
Reactividad cruzada
Problemas de pruebas de rutina
Reactividad cruzada
Los fabricantes realizan estudios extensivos de reactividad cruzada tanto para compuestos con relaciones estructurales como no relacionados
Sin embargo...
Reactividad cruzadaGeneralmente los estudios se realizan durante el desarrollo del ensayo, no se incluyen los compuestos más nuevosLa mayoría utiliza compuestos precursores, los metabolitos pueden presentar una reactividad cruzada no identificadaPara algunos compuestos, las concentraciones en orina del uso terapéutico pueden alcanzar o exceder los niveles analizados (por ej. efedrina)
Anfetaminas
Dependiendo del reactivo, la especificidad se puede optimizar a anfetamina o metanfetamina sin reactividad cruzada al otro compuesto
por ej. los kits específicos para anfetaminas pueden no responder a muestras que presentan únicamentemetanfetaminas
La capacidad de detectar drogas "de diseño" MDMA y MDA varía según el reactivo
La reactividad cruzada es generalmente un % del compuesto objetivo
AnfetaminasLos kits monoclonales tienen una reactividad cruzada minimizada con otros simpatomiméticoscomo la efedrina y la fenilpropanolamina, sin embargo, las concentraciones en orina pueden alcanzar niveles suficientes como para provocar una respuesta Los ensayos policlonales son menos específicos para las anfetaminas/metanfetaminas y se pueden utilizar como una clasificación general para las aminas simpatomiméticas que es lo que se prefiere en ciertos mercados
OpiatosCROSS-REACTIVITY
Compound ApproximateCross Reactivity
6-Acetylmorphine 77%Codeine 130%Dihydrocodeine 63%Diacetylmorphine 69%Ethyl Morphine 81%Hydrocodone 28%Hydromorphone 19%Morphine-3-glucoronide 53%Thebaine 26%Meperidine <0.3%n-Norcodeine 2%Oxycodone <0.3%
Generalmente optimizado para la morfinaBuena reactividad cruzada con codeína, morfina, hidrocodona, hidromorfonaInsuficiente reactividad cruzada con oxicodona, fentanilo, meperidina y otros opioides
11%Oxicodona
2%n-Norcodeína
<0,2%Meperidina
<0,03%Naloxona
47%Morfina-3-glucoronida
54%Hidromorfona
157%Hidrocodona
<1,5%Oximorfona
2%Nalorfina
94%Dihidrocodeína
167%Codeína
150%6-Acetilmorfina
Reactividad cruzadaaproximada
Compuesto
REACTIVIDAD CRUZADA al límite de 300 ng/mL*
* Tabla de reactividad cruzada de opioides paraAbbott Architect c8000
Benzodiazepinas
Reactividades cruzadas variables dependiendo del reactivo; la reactividad cruzada del lorazepam puede ser insuficiente, la mayoría son inadecuadas para el flunitrazepamVariabilidad adicional en respuesta a la droga conjugada contra la no conjugadaLas pruebas de detección de reactividad cruzada generalmente superan los componentes de prueba de confirmación estándar
Metadona
El anticuerpo es dirigido a la droga precursoraLa reactividad cruzada con el metabolito es insuficiente; puede dar como resultado un negativo falso en pacientes que están tomando dosis entre bajas y moderadas de metadona o de metabolizadores rápidos
También es un problema para el control de la desviación de la droga en programas de tratamiento con metadona
Fenciclidina
La PCP está plagada de reactividades cruzadas con drogas bastante comunes (venlafaxina, dextrometorfano, difenhidramina)La prevalencia es muy baja, la mayoría de los resultados positivos no son confirmados por GCMS
Es interesante destacar que en poblaciones donde la prevalencia de la droga es mayor (ciertas ubicaciones geográficas en los EE.UU.) los índices de confirmación mejoran en forma significativa
Cocaína, THC
CocaínaLas pruebas se optimizan a benzoilecgonina; reactividad cruzada insuficiente con la cocaína precursora (Cedia es una excepción)Muy poca reactividad cruzada con otros compuestos, los índices de confirmación son altos
Metabolitos de THC (marihuana)Muy pocas reactividades cruzadas documentadas con compuestos no cannabinoideos, los índices de confirmación son altos
Formatos y modelos de pruebas
Cualitativos y semicuantitativosPruebas clínicas y forenses
Componentes del programa
Formatos de pruebas
La mayoría de los sistemas de reactivos de inmunoanálisis para las pruebas de detección de drogas de abuso son aptos para los formatos de resultados o calibración tanto cualitativos como semicuantitativosLa elección del formato depende de las preferencias individuales del laboratorio, el tipo de cliente y el diseño y compatibilidad del programa con otros sistemas de pruebas que puedan encontrarse en el analizador
Cualitativos
Punto de calibración único en un límite específicoLos resultados son "positivos" o "negativos"; por ejemplo por encima o por debajo del límiteLos requisitos de control de calidad también son cualitativosAplicación muy sencillaMuchos laboratorios de gran volumen operan de este modo
SemicuantitativosPuntos de calibración múltiplesProporcionan resultados numéricos que son una estimación de la concentración de la droga; esto se ve dificultado por la reactividad cruzada de drogas múltiples dentro de una clase El control de calidad se evalúa de forma cuantitativaPueden ser un mejor método de predicción de diluciones en pruebas de confirmaciónSe pueden usar con la normalización de creatinina para controlar la eliminación de la droga con el paso del tiempo
Reactividad cruzada de drogas múltiples dentro de una clase
Recordatorio de que cuando varias drogas dentro de una clase reaccionan en forma cruzada, ni los formatos cualitativos ni los semicuantitativos son buenos métodos de predicción de la concentración real de la droga
MORPHINE vs SCREEN
0300060009000
120001500018000210002400027000
30000330003600039000420004500048000
51000540005700060000
120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350
SCREEN RESULT
GC
/MS
QU
AN
T
MORPHINE
MORFINA vs DETECCIÓN
MORFINA
RESULTADO DE DETECCIÓN
CG
/EM
CU
ANTI
TATI
VAS
Clínico vs. forense
En general, el término prueba forense de droga en orina se utiliza para referirse a los programas de pruebas donde los resultados pueden estar sujetos a litigios y/o tener implicaciones punitivas para el donante
El ejemplo más común son las pruebas de detección de drogas en el lugar de trabajo
Clínico vs. forense
Pruebas clínicas se refiere generalmente a las pruebas utilizadas en diagnóstico y tratamiento
Un ejemplo común son las pruebas utilizadas para controlar individuos en tratamiento por abuso de sustanciasMenos probabilidad de estar sujetas a litigio, sin embargo, eso no es incuestionable; existe cruzamiento entre los dos tipos de pruebas
Modelos de programas de pruebas de detección de drogas de abuso
Pruebas de detección por inmunoanálisis con confirmación automática
Se exige para todas las pruebas de detección de drogas en el lugar de trabajoSe recomienda para cualquier tipo de prueba con implicaciones legales o cuando las consecuencias son graves
Pruebas de detección por inmunoanálisis con confirmación a pedido
Se utiliza frecuentemente en la justicia penal y en los mercados de rehabilitaciónSe solicitan las confirmaciones después de consultar con el donante o antes de tomar alguna medida
Modelos de programas de pruebas de detección de drogas de abuso
Pruebas de detección por inmunoanálisissolamente
Se pueden usar en aplicaciones de sala de emergencia cuando el tratamiento no depende de una identificación específicaJusticia penal y mercados de rehabilitaciónSe puede utilizar en marcados afectados por el costo
Pruebas integrales utilizando inmunoanálisis y técnicas cromatográficas adicionales
Se pueden utilizar cuando se debe controlar un espectro de compuestos más amplio; por ej. clínicas para el dolor, profesionales de atención a la salud
Aplicaciones
Lugar de trabajoProfesionales con problemas
Clínicas de tratamiento del dolorJusticia penal
Tratamiento de abuso de sustanciasToxicología de urgencia
Pruebas de detección de drogas en neonatos
Pruebas de detección de drogas en el lugar de trabajo
Gran mercado en los Estados Unidos, desarrollado a principios de la década del 80, presenta una gran evoluciónCon frecuencia es un criterio para la contratación; los motivos para realizar las pruebas incluyen evaluaciones previas a la contratación, después de un accidente, aleatoriamente, al regresar a las tareasLas pruebas son consideradas forenses; se requiere una cadena de custodia para la documentación
Pruebas de detección de drogas en el lugar de trabajo
Extremadamente reguladasEl programa federal de pruebas de detección de drogas en el lugar de trabajo cubre a la mayoría de los empleados federales y los individuos que trabajan en industrias reguladas por el gobierno federal (por ej. el transporte)Administrado por SAMHSA en el Departamento de Salud y Servicios HumanosLos laboratorios debe estar certificados por la agenciaLas drogas, límites y metodología se establecen en pautas escritas que deben cumplirse
Pruebas de detección de drogas en el lugar de trabajo
Pruebas no federalesA menudo se las denomina "no reguladas", pero es inexacto. Los parámetros para las pruebas están cubiertos por otros organismos reguladores o certificadores (por ej. CAP, CLIA, leyes estatales)Incorpora una gama más amplia de compuestos, límites y metodología
Pruebas de detección de drogas en el lugar de trabajo
ModelosTodas son pruebas de detección por inmunoanálisis iniciales con confirmación automática de presuntos resultados positivosLa mayoría de los laboratorios utilizan un formato de ensayo cualitativo
Los límites estándares están disponibles, satisfacen la mayoría de las necesidades
Se usan modelos semicuantitativos en menor medida
Proporciona una variedad más amplia de límitesPara algunos compuestos, presenta información comparativa más específica para revisión e informe de resultados
Profesionales con problemas
Este es un mercado más selectivo; profesionales de atención a la salud en tratamiento por problemas de abuso de sustanciasSe requieren pruebas en orina de detección de drogas, de rutina y aleatorias, para poder conservar la licenciaLas pruebas son consideradas forenses; si se detecta un incumplimiento puede revocarse la licencia
Profesionales con problemas
ModelosPruebas de detección por inmunoanálisisiniciales con confirmación automática de presuntos resultados positivosSe utilizan formatos tanto cualitativoscomo semicuantitativos
Manejo del dolorLas pruebas de detección de drogas en pacientes con dolor crónico son un mercado emergente en los EE.UU. No es necesariamente una prueba "clínica"; el problema: abuso de drogas y desviación de drogasMuchas clínicas de tratamiento del dolor exigen que los pacientes que están recibiendo tratamiento a largo plazo con opiatos firmen un "contrato sobre opiatos"
Exige que el paciente revele todo el uso de las drogasEstipula la posible terminación del paciente según el cumplimiento con las pruebas de orina de detección de drogas
Manejo del dolor
Desafíos en el control del cumplimiento en pacientes con dolor crónico:
Requiere la detección de una amplia gama de opioidesincluida oxicodona, tramadol y fentanil
Actualmente hay disponibles ensayos homogéneos más nuevos para opiatos sintéticos más esotéricos
Las pruebas de detección de drogas están diseñadas para detectar la presencia de drogas; las clínicas de tratamiento del dolor están interesadas en la ausencia de drogas críticas
Manejo del dolor
Puede requerir un enfoque más amplio para la realización de las pruebas que incluya inmunoanálisis y métodos de detección cromatográficos
La detección de drogas secundarias (antidepresivos, anticonvulsivos, sedantes, medicamentos de venta libre, etc.) da una buena indicación del cumplimiento general con los regímenes de drogas prescritos y el uso de otras drogas
Justicia penal
Gran mercado en los Estados UnidosArresto/etapa previa al juicioPrisionerosPersonas en libertad condicional
Relaciones significativas entre el delito y el uso/abuso de sustanciasAmplias variaciones en modelos de prueba, se realizan generalmente de modo forense con cadena de custodia para la documentación
Justicia penal
Los modelos de prueba van desde pruebas de detección con confirmación automática a pruebas sólo de detecciónSon comunes las pruebas de detección por inmunoanálisis con confirmación a pedido
Los resultados de las pruebas de detección de drogas se entregan al oficial que hace el seguimiento de la persona en libertad condicionalLas personas en libertad condicional a menudo admiten el consumoLas confirmaciones se solicitan únicamente cuando se niega el consumo o cuando es posible el encarcelamiento
Justicia penal
Se utilizan modelos tanto cualitativoscomo semicuantitativosLos valores cuantitativos se pueden corregir a la concentración de creatininaSeguir concentraciones corregidas en serie puede ser útil para determinar un nuevo consumo de marihuana
Tratamiento de abuso de sustancias
Si bien los formatos de pruebas se asemejan mucho a las pruebas de la justicia penal, las pruebas de los servicios de rehabilitación generalmente se consideran clínicas; los resultados se utilizan en el diagnóstico y tratamiento de un trastorno de abuso de sustanciasSin embargo, si los resultados tienen implicaciones punitivas, las pruebas se deben manejar de acuerdo con los estándares forenses
Toxicología de urgencia
Pruebas de abuso de sustanciapuramente clínicasLas pruebas se utilizan conjuntamente con la observación clínicaEn muchos casos, el tratamiento de urgencia se determina por los síntomas clínicos; la prueba de detección de drogas puede confirmar o refutar el diagnóstico clínico pero es probable que no afecte el tratamiento en general
Toxicología de urgencia
Generalmente los modelos son sólo de detección; pueden dar una confirmación con motivos puramente informativos
Son comunes los paneles de inmunoanálisis discretosLos paneles amplios proporcionan mejor información, sin embargo, generalmente no están disponibles en los laboratorios hospitalarios de rutina
Pruebas de detección de drogas en neonatos
Otro mercado selectivo para pruebas de abuso de drogasLas pruebas están diseñadas para bebés en riesgo de exposición a drogas en forma intrauterinaLas muestras pueden ser orina o meconio
La orina da sólo la exposición recienteLas pruebas en meconio pueden medir la exposición desde el segundo trimestre en adelante
Pruebas de detección de drogas en neonatosLas pruebas a menudo se realizan para que los esfuerzos de intervención temprana puedan tener efecto sobre posibles problemas médicos y de desarrolloEn algunos casos, las pruebas tienen implicaciones legales
Retiro de los niños del hogarClasificación delictiva de la exposición a drogas intrauterina
Por lo tanto, si bien las pruebas se pueden realizar en un laboratorio clínico, se pueden aplicar estándares forenses
Pruebas de detección de drogas en neonatos
El modelo es una prueba de detección por inmunoanálisis con confirmación automática, se recomienda una cadena de custodiaLos problemas de matriz y la preparación de la muestra requerida presentan problemas exclusivos para el laboratorio Los protocolos utilizan en forma rutinaria pruebas FPIA semicuantitativas para proporcionar una sensibilidad adecuada
Resumen
El inmunoanálisis es una poderosa herramienta para las pruebas de abuso de drogasComprender la reactividad cruzada de los ensayos es fundamental para comprender e interpretar los resultadosMuchos modelos de programas diferentes, los formatos tanto cualitativos como semicuantitativos son útiles en mercados específicos
Gracias por su atención
