Instituto Nacional de Ecología Libros INErepositorio.inecc.gob.mx/ae/ae_003009.pdf · ii. iii. 83comendaciones para el anali sis de los pabametros pisico-quimicos mas importantes

Instituto Nacional de Ecología

Libros INE

CLASIFICACION

AE 003009

LIBRO

Análisis permanentes einvestigaciones de técnicasanalíticas para la determinación dela calidad del agua

1111111111111111111111111111111111111111111111111111111

TOMO

AE 003009

SECilElARIA OLAllÍCVhIllHA 1 EUHSOS

H1OHAULICOS

ANALISIS PERMANENTES E INVESTIGACIONES DE

TECNICAS ANALITICAS PARA LA DETERMINACION

DE LA CALIDAD DEL AGUA.

CONTRATO DE ESTUDIOS No.

8P-79-C-15

CLAVE POE-79-15

INGGO. 8. C.

5EOETAIIIA OE AOICIILTURA I IIEC~USOSIIIOHIUL1COS

ANALISIS PERMANENTES E INVESTIGACIONES DE

TECNICAS ANALITICAS PARA LA DETERMINACION

DE LA CALIDAD DEL AGUA.

CONTRATO DE ESTUDIOS No .

SP-79-C-15

CLAVE POE-79-15

INGGO. 8. C.

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CONCEP':R'O_-s.

I R3COPILACION Y ANALISIS DE LAINPORMACION . I.1.

II.

III.

83COMENDACIONES PARA EL ANALISIS DE LOS PABAMETROS PISICO-QUIMICOS MAS IMPORTANTES DELA CALIDAD DEL AGUA.

INYESTIOACIONES DE LABORATORIO

II.1.

111 .1 .

CAPITULA PAGINA

2

0 A P I T II L 0

No. 1

RBCOPILACIOHYABALISISD8 LAIBFORI[ACION

3

-- t

El método se aplica a aguas superficiales, potables, naturales y

aguas en las que se desea verificar su potabilidad . El método es aplicable

en un rango de 0 .02 a 0.55 mg/it, para 90 ml. de muestra. Un alcance mayor

se obtiene por medio de diluciones.

II.= Principio del Método.

El método está basado en la reacción que tiene lugar entre el Cro-

mo Rezavalente y la difeniloarbazida, produciendo un color púrpura rojizo

en condiciones ligeramente ácidas.

III.— Muestreo y Almacenamiento.

A) Las muestras deben ser colectadas en envases de plástico perfeó

tamente limpios, de preferencia nuevos.

B) Le ideal es el análisis inmediato, sin embargo si esto no es pó

aible se recomienda un almacenamiento no mayor de 2 6 3 días, pa

ra evitar qae el Cromo se absorbs en la superficie del recipiente.

IV.— Interferencias.

A) El mercurio, como mercúrico o mercuroso da un color azul en con

dioiones semejantes a las de la reacción . Se puede eliminar por

un mayor control de la acidez requerida para la determinación.

B) El fierro en concentraciones mayores de 1 mg/lt, interfiere pro

duciendo un color amarillo con el reactivo.

C) El Vanadio en las muestras, interfiere en la reacción produoien

do una coloración, que sin embargo se pierde rápidamente y es in

significante 10 min . después de la adición de la difeniloarbazida.

V.— Aparatos.

A) Eapectrofotómetro para ser usado a 540 ma. provisto de un paso

de luz de 1 om.

VI.— Reactivos.

A) Estgndares

CROMO ~ÍALBNTñ`'

'_^ ' . ry ^x . a~ñ,~,•

``

L

(Método de la ~eiiiloaiibazida;

,

I .— Alcance y Aplicación .

4

1.- Solución patrón de Cromo.- Pese y disulva 141 .4 mg. de dicromato -

de potasio anhidro, K20r207 , en agua destilada, diluya a 1000 ml.

2.- Solución estandar de Cromo . Diluya 10 ml. de la solución patrón de

Cromo a 100 ml. 1 .00 ml. = 5 .0 pg de Cromo.

Prepárase cada vez que se use.

B) Reactivo de 5-difeniloarbazida .- Disuelva 200 mg. de 5-difeniloar -

bazida (también llamada 1,5 difeniloarbahidrazida) en 100 ml . de al

cohol etílico al 95% o alcohol isopropflioo ; añada, con agitación,-

una solución ácida preparada con 40 ml . de H2SO4. concentrados y -

360 ml . de agua destilada, consérvese en refrigeración . Se puede -

presentar una disminución en el color del reactivo, pero esto no lo

afecta . Es eatable por aproximadamente un mes.

C) Solución de Acido Sulfúrico 111 Prepárese por dilución de H2SO4 con

centrado a partes iguales con agua destilada.

D) Acido fosfórico, H3PO4, concentrado.

VII.- Procedimiento.

A) Curva de Calibración.

1.- De la solución estandar de Cromo, se toman 0,50, 1 .00, 2.00, 3,00, 4.00

5.00, 6.00, 7.00, 8.00, 9.00, 10.0 ml . y se colocan en matraces aforados de

100 ml.

2.- Se agrega agua destilada hasta completar un volumen de 90 ml . o poco me

nos junto oon dos testigos de agua destilada.

3.•- Se adiciona 1 ml . de solución de H2SO4 111 oon agitación.

4.- En seguida se agregan 0 .3 ml . de doido fosfórioo concentrado.

5.- Se agregan 2 ml . de solución de 5-difeniloarbazida, y se agita.

6.- Espere 10 minutos a que se desarrolle el color (este es estable por 30-

minutos aproximadamente).

7.- Atorar a 100 ml . con agua destilada, tapar el matraz y homogeneizar.

8.- Leer inmediatamente las absorbanoias correspondientes en el espeotronio

a 540 nm. calibrando a "0" de absorbancia del aparato con el testigo de --

agua destilada.

9.- Hacer la curva de calibración grafioando los valores de concentración -

contra loe valores de absorbancia . El rango de la curva es de 2 .5 a 50.0 pg

de Cr+6 correspondiendo cornos ues

~~

ml. de soluoi6n estándar

pg de Cr+6

0

00 .5

2 .50

1 .0

5 .00

2.0

10.00

3.0

15.00

4.0

20.005 .0

25.006.0

30.007 .0

35.008.0

40.009,0

45.00

10.0

50.00

B) Desarrollo de color en las muestras

1.— De la muestra libre de color y turbiedad, se toman 90 ml . y se

colocan en un matraz aforado de 100 ml.

2.— Por cada grupo de muestras, corra también un testigo y un es

tándar como mínimo.

3.— Siga exacamente el mismo procedimiento que para la curva de —

calibraci6n incluyendo el tiempo de desarrollo de color y de -lectura.

4.— Si la muestra sale del rango de la curva, se hacen diluciones—

apropiadas para su lectura y se completa a + 90 ml . con agua —

destilada.

5.— Las lecturas de absorbancia de las muestras se llevan a la curva, para determinar sus concentraciones correspondientes y se—

calcula por medio de la siguiente fórmula=

Cr

6 en mg/lt,=. A

Donde :

A = pg. de Cromo hesavalente obtenido en la

gráfica.

B = ml . de nuestra.

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:1 L.' _

ARSENICO

(MPTODO DISTIL DITIOCARBAMATO DE PLATA)

I.- Alcance y aplicación.

El método es aplicable en general a todo tipo de agua, superfioiá

les y subterráneas, incluyendo desechos doméstioos e industriales . Debido

a su precisión y exactitud, es el más recomendado cuando se desee cuanti

ficar la cantidad de arsénico en agua. Su límite de detección se ha estan

darizado en 1 pg. El rango que cubre es de .021. a 0.2 mg/it. Pudiéndose -

ampliar por medio de diluciones.

II.- Principio de Mdtodo.

El método se basa en la arsina gaseosa que se genera cuando una -

muestra conteniendo arsénico se hace reaccionar con Zino ; en medio Acido-

el arsénico es reducido a AsH3 que pasa entonces a travea de un tubo con-

teniendo lana de vidrio empapada con solución de plomo, pasando posterior

mente a un tubo conteniendo solución de distil ditiocarbamato de plata di

suelto en piridina, el cuál reacciona con la arsina para producir un com-

plejo rojo soluble proporcional a la cantidad de arsénico en la muestra -

y adecuado para mediciones fotómetrioas.

III.- Muestreo y almacenamiento.

El muestreo se puede hacer tanto en recipiente de vidrio como de-

polietileno; no requiere cuidado ni preservación especial, más, si es ne-

cesario alamoenar la muestra, mantengáse en refrigeración a 4°C y para -

largos periodos se recomienda agregar ENO 3 hasta un pH a 2. Se recomienda

analizar las muestras antes de seis meses.

IV.- Interferencias.

A) Aunque en una forma no muy significativa algunos metales pesados-

(Iomo aromo, cobalto, cobra, mercurio, molibdeno, níquel, platino,

interfieren con la generación de arsina.

B) Los sulfuros de hidrógeno y otros sulfuros interfieren ; se elimi-

nan normalmente con el tubo de lana de vidrio con acetato de plo-

mo que hace las funciones de un depurador.

C) Sales de antimonio de grandes cantidades interfieren formando -

"estibina" que pasa con el arsénico y reacciona en la misma for-

ma, dando un compuesto rojo con diferentes oaraoterfsticas de -

V.- Aparatos.

A) Generadores de Arsina

ábsorbancia.

,

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,,sit, oon matraa-de réacc#6n'y~os d~-L1!' ? :' ,.

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.

puraderes y absorbentes e equivalents .

B) "Speotrenio 20" marea BauoS , d'Lemb para usares a 535' ' é=

quivaleats.

!' L

C) Parrilla ces central de temperatura,

_ s

VI.- .Rsaotives.

A) Aoide olerbidrioe 001 oenoentrade.

B) Salmons de Iedura de potasio.- Disuelva 15 gr. de Kl en 100 ml.

de agua destilada. Yantóngase an frasca obscure (ámbar).

C) Rosative do elerure estanese .- Disuelva 40 gr. do olerure esta-

nose SmC12. 2820, libre do armonice on 100 ml. de HCL concentrad..

D) Seluoiia distil-ditiooarbamate de plata. Disuelva 1 grpme de di

etilditieoarbamate do plata en 200 ml. de piridina . Seta seluoi$n es esta-

ble per varies mesen si se guarda en fraseo disbar.

S) Seluaiín de Metate do pleas, disuelva 10 gr. de

Pb (023302)2.3320 en 100 ml. do agua destilada.

P) Ciao. granular de 20 a 30 mallas libres do arsini•e.

0) Batáadares$

1 .- Selucids Stook de Anadniee.- Disuelva 1 .320 gr. de tri-

dxide de ars6nice As 203 an 10 ml . de ages destilada qua

eentenga 4 gr. de NaOH y afore a 1000 al . Gen agua lest!

lada . 1 .00 ml . - 1.00 mg. de As.

2.- Salmi&a Intermedia de Arsdniee.- Diluya 5 ml. de la e.-luoiia ntook a 500 ml . eon agua destilada . 1 .00 ml. -10 pg. de As.

Seluoida estándar de Arsdniee.- Diluya 10 ml. de seluoien

intermedia de As. a 100 ml, eon agua destilada.

1 .00 ml. - 1 .00 pg de As.

VII,•. Preoedisisnte.

A) Curva de Calibraoida.

10- Prepare ma eerie do estándares per dilución de les siguientes velimo-

mes de seluoida estándar a 35 ml . Gen agua destilada t 0, 1 .0, 2.0, -

5.0, 7.0, y 10.0 ea les nutraces de les gsneraderes.

2.- Agregue sucesivamente y meseland* any bias despuós de cada adieida.

a. 5 ml. de HCL osnoentrade

b. 2 ml. de seluoión de SI

G. 8 gttas (0.4 ml.) de reactive de SnCl23.- Deje que la r.aooidn se lleve a Gabe per 15 minutes, para reducir tad,

el arsénico a su estado trivalente.

4.- Impregne la lana de vidrio en la soluoión de aoetato de plomo (sólo hu-

medeoerla) e introduzoala en el tubo depurador a formar un buen filtro-

para la arsina.

5.- Ensamble el tubo depurador con el absorbente y pipetee en este 1timo-

4.0 ml . de solución de dietil-ditiooarbamato de plata-piridina.

6.- Pasados los 15 minutos para la reaooión de la solución, agregue 3 gr .-

de sulfato de cinc granular y conecte inmediatamente el matraz a los -

tubos depurador y absorbente.

7.- Deje generar la arsina durante 30 minutos para la reaocidn oompleta, -

calentándola muy ligeramente sobre una parrilla.

8.- Desconecte el tubo absorbente y vaoie el oontenido a las oeldaa del es

peotronic y haga las lecturas de absorbancia calibrando el "0" del am

rato con el testigo . de agua destilada.

9.- Construya la curva de calibración, graficando las lecturas de absorban

cia contra las concentraciones de los estándares correspondiendo de la

siguiente forma:

ml. de solución estándar pg de As.

0 0

1 .0 1 .0

2.0 2.0

5.0 5.0

7 .0 7 .0

10.0

10.0

B) Preparación de las muestras.

1.- Tomó 35 ml . de muestra o alícuota llevada a 35 ml . con agua desti-

lada en el matraz del generador.

2.- Siga exactamente el mismo procedimiento que para la curva de cali-

bración a partir del paso 2 . (VI.A.2.).

3.- Lleve las leoturas de absorbancia de las muestras a la curva de ca

libración para determinar sus concentraciones correspondientes.

4.- Calcule la concentración en mg/it, con la siguiente fórmula:

pg de As de la gráficamg, de As

It

ml. de muestra

9

DI~;IriANDA

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M - . .

(D ~~- -' ._ r ~~~,

~_ _'- -

L- Alcance y aplicación .

e

El procedimiento se aplica a muestras de aguas superficiales, de -

ríos, lagos o de desecho . Es reoomendable para muestras con contenido de -

DQO mayor de 50 mg/lt, aunque es aplicado a valores de 10 mg/it, con bue -

nos resultados ; con concentraciones abajo de 10 mg/lt ., el método pierde -

exactitud.

II.- Principio del Método.

La DQO es una determinación de la cantidad de oxigeno requerida pá

ra oxidar compuestos orgánicos e inorgánicos bajo enérgicas condiciones de

oxidación químicas. La prueba se hace con dicromato de potasio como oxidan

te, agregando a la muestra en cantidad conocida y en medio ácido, con sul-

fato de plata oomo catalizador . Se coloca lp muestra a reflujo por dos ho-

ras y el dicromato de potasio no consumido se cuantifica mediante una sola

cián de sulfato ferroso amoniacal estandarizada.


Coleote la muestra en recipiente de vidrio de preferencia, use re-

cipientes de plástico cuando tenga la seguridad de que estan bien limpios.

Muestras biológicamente activas deben realizarse tan pronto oomo sea posi-

ble. En caso de que sea necesario almacenarse presérvese con 2 ml . de . ..

H2804 por litro, de muestra . Asegdrese que la muestra sea representativa y

homogénea. Y mantengáse en refrigeración a 4°C.


A) Cloruros presentes en la muestra causan interferencias positi -

vas, se puede eliminar mediante la adición de sulfato merodrico al matraz-

de digestión.

B) Compuestos alifáticos de cadena recta, hidrocarburos arómaticos

y piridina son compuestos resistentes a la oxidación, la que se mejora :. ..)

cuando se agrega el sulfato de plata oomo catalizador.

V.- Aparatos.

A) Aparatos de reflujo .- Consistiendo de matraces erlenmeyer de --

500 ml. con boca esmerilada y entrada de 24/40 y un condensador liebig de-

chaqueta de 300 mm . con entrada 24/40 a conectarse con el matraz (condensé

dor Fiederich) . 0 equivalente.

B) Hot Plates con control de temperatura y poder suficiente para -

asegurar la oxidación adecuada de las muestras.

10

VI ._ Reactivos,

A) Solución estándar de dioromato de potasio 0 .25 N. Disuelva . ...

12.259 gr. de K2Cr207, grado estándar primario, previamente secado

a 103°C por 2 horas en agua destilada y afore a 1000 ml.

B) Reactivo de Acido Sulfdrico - sulfato de plata. Disuelva 22 gr.

de sulfato de plata Ag2SO4 en 2.286 it. de H2SO4 concentrado.

C) Soluoián estándar de sulfato ferroso amoniacal Titulante 0 .1 N.

Disuelva 39 gr . de Fe (NH4)2 (SO4) 2. 6H20 en agua destilada.

Agregue 20 ml. de H2SO4 . Enfriar y diluir a 1000 ml . con agua-

destilada.

Solución titularte de sulfato ferroso amoniacal 0 .25 N.- Se di-

suelve 98 gr. de Fe (NH4) 2 (SO4)2. 6 H2 en agua destilada, a -

gregar 20 ml . de ácido sulfdrioo concentrado . Enfriar y diluir-

a 1000 ml . de agua destilada.

3.- Batandarizaoi6n.

Batas soluoiones se estandarizan diariamente contra el estándar

de K2Cr207. como sigues

a) Diluya 10.0 ml. de la solución de K20r207 a aproximadamente 100

ml, agregue 30 ml . de ácido sulfdrioo concentrado y enfríe.

b) Titule con la solución titulante de sulfato ferroso amoniaoal

sardo de 2 6 3 gotas (0 .10 a 0.15 ml .) de indicador de ferroín,

o) Calcule la normalidad con la siguiente f6rmulat

NSulfato Ferroso Amoniacalml . K2Cr207 x 0.25

ml . Fe (NH4) 2 (504)2

'd) Solución de indicador de ferrofn .- Disuelva 1 .485 gr. de 1,10 -

fenantrolina monohidratada junto con 695 mg . de FeSO4. 7B20 en-

agua destilada.

e) Sulfato mercdrioo HgSO4 cristales.

VII .- Procedimiento.

A) En los matraces espeoifioados para el método, colocar aproxima-

damente 0.4 gr. de HgSO4.

Pipetear 20 ml . de muestra, o aliouota aforada a 20 ml . con

agua destilada, en el matraz y mezolar . Corriendo un blanco de-

agua destilada.

C) Agregue 10.0 ml . de la soluoión estándar de dioromato de potasio

K2Cr207 •

~.

. .~~

D) Agregue con mucho cuidado 30 ml . de solución de ácido sulfdrico —

sulfato de plata ; sumerja el matraz en un baño de agua fría mien—

tras agrega este reactivo . Mezclar.

E) Coloque unas perlas de vidrio para controlar la ebullición.

F) Conecte el matraz al condensador sobre el hot plate, empiece a

contar el tiempo a partir del momento en que comience la ebulli —

ci6n.

G) Al cabo de 2 horas suspender la ebullición y dejar enfriar a tem-

peratura ambiente.

H) Lave el condensador, dejando que el agua destilada caiga a el ma-

traz hasta completar un volumen de aproximadamente 200—250 ml.

I) Agregue 2 6 3 gotas de indicador de ferroín, pero siempre la mis

ma cantidad, a muestras y blanco.

J) Titule con la solución de sulfato ferroso amoniacal 0 .1 N.

K) Calcule la DQO como sigues

DQO (melt (A—3) x N z 8000

V

DCNDES

A= ml. de Fe ( NH4 ) 2 (504)2 . 6 H20 usadas para el blanco.

8= ml. de Fe (NH4)2 (SO4) 2. 6 H20 usados para la muestra.

N= Normalidad del Fe (NH4) 2 (SO4) 2 . 6 H2O

V= ml. de muestra .

12

C I A N U R O

( M'áTODO COLORIMnYP:2ICO)

I .- Alcance y aplicación .

Este método es aplicable a todo tipo de agua, superficiales, subterrâ-

neas, desechos domésticos e industriales, agua de mar, etc . Se recomienda espe

oialmente para muestras cuya oonoentración esté por debajo de 1 mg ./lt, alcan-

za un limite de detección de 2 pg/lt = 0 .002 mg./lt.


El cianuro contenido en la muestra, es separado por medio de una des -

tilación en presencia de ácido sulfúrico, donde se desprende como cianuro de -

hidrógeno gas, siendo absorbido posteriormente en una solución de hidróxido de

sodio. El cianuro en estas condiciones es convertido a cloruro de oian6geno --

CNCL por medio del reactivo de cloramina T, posteriormente este cloruro se ha-

ce reaccionar con el reactivo de piridina- pirazolona- para formar un coloran-

te azul proporcional a la concentración de cianuro.


Hágase el muestreo en botella de plástico de 1 lt . de capacidad o ma-

yor, agregue solución de NaOH para tener pHa12 . Analice tan pronto como sea -

posible; si es necesario almacenar, refrigérese a 4°C . o menos.


A) Agentes oxidantes tales como los cloruros, descomponen los cianu-

ros agregue cristales de ácido ascórbico para neutralizarlos.

B) Sulfuros. Estos pasan en el destilado junto con los cianuros, a -

fectando la determinación colorimétrica, posteriormente, trate la

muestra con carbonato de cadmio, loe sulfuros precipitan como sul

furor de cadmio (precipitado amarillo) ; filtre la muestra.

C) Otras interferencias, se eliminan o reducen al mínimo por medio -

de la destilación.

D) Aldehidos.- Convierten los cianuros a nitritos bajo las condicio-

nes de la destilación, en tal caso no se use.

V.- Aparatos.

A) Aparatos de destilación.- Equipo:matraz de 1000 ml . de capacidad,

tubo de entrada a date, conectado a refrigerante enfriado por -

agua, recipiente absorbedor de gas, parrilla o sistema de calen-

tamiento con control de temperatura ; sistema absorbedor de gas,-

juntas "T" con conexiones o entradas de vidrio esmerilado y bom-

ba de vacío .

13

B) "Spectronio 20" Bauoh and Lomb para usarse a 620 nm . ó equiva-

lente.

C) Tubos de reacción de borosilicato de 1 x 8 pulgadas con tapones

de caucho.

D) Papel pH.

VI.- Reactivos.

A) Reactivos para la destilaoión.

1.- Solución de hidróxido de Sodio 1N.- Disuelva 40 gr. de NaOH en agua des

tilada y diluya a 1000 ml.

2.- Solución de cloruro mercdrioo.- Disuelva 34 gr. de HgCl2 en 500 ml. de-

agua destilada (esta solución es tóxica, evite su ingestión).

3.- Reactivos de cloruro de magnesio .- Disuelva 510 gr. de cloruro de magne

sic MgC12. 6H20 en un It ., de agua destilada.

4.- Acido sulfdrico, H2SO4 concentrado.

B) Soluciones estándar.

1 .- Solución stock de cianuro.- Disuelva 2 gr . de KOH aproximadamente

2.51 gr. de KCN, en 1000 ml . de agua destilada 1 .00 ml. = 1 .00 mg. de-

CN.

BSTANDARIZACION DP LA SOLUCION STOCK,

a) Reactivos.

(1) Solución estándar de nitrato de plata AgNO3 0.0192 N. disuelva 3 .27 -

gr. de AgNO3 y diluya a 1000 ml . con agua destilada . Estandarice con,

una solución de NaCl, tal como se hace para cloruros 1 .00 ml. = 1 .00-

pg de CH.

(2) Solución indicadora .- Disuelva 20 mg. de paradimetilaminobenzalrodami

na en 100 ml. de acetona.

b) Procedimiento.

(1) Tome 25 ml . de solución Stook y diluya con agua destilada hasta un vó

ldmen conveniente para la titulación (250 ml).

(2) Ajuste a un pH de 11 6 más con NaOH 1 N.

(3) Agregue 0.5 ml. de soluoión indicador.

(4) Titule eon el estándar de Nitrato de plats hasta un vire de amarillo-

canario a un tinte salmón.

(5) Corra un testigo de agua destilada a través de todo el procedimiento.

(6) Calcdlese por medio de la siguiente fórmula :

Y --

14

mg/ml de CN = (~ -B )

ml

solucidn stock

DONDRt

A = ml . de AgNO3 gastados, en la ti

tulaoidn de la solución stock.

B = ml . de AgNO3gastados en la titu

lación del testigo.

Prepárese y estandaricese semanalmente.

2.- Solución Intermedia de Cianuro .- Diluya un volumen calculado ( aproximada-

mente 10 ml.) de solución stock de KON a 1000 ml. con solución de hidróxi-

do de sodio NaOH 0 .20 N. 1 .00 ml . = 1 0 pg de CN . Prepárese diariamente.

3.- Solución estándar de Cianuro .- Diluya 10.0 ml. de solución intermedia a ,--

100 ml. con solución de NaOH 0 .20 N. 1 .00 ml . = 1 .0 pg de CN. Prepárese -

antes de usarse.

o) Reactivos para desarrollo de color,

1 .- Solución de oloramina T.- Disuelva 1 .0 gr. del reactivo de oloramina T en-

100 ml. de agua destilada . Prepárese diariamente.

2 .- Solución mezclada de piridina - pirazolona.

a) Solución de 1 - fenil, 3-metil, 5 - pirazolona.

Prepárese una solución acuosa saturada (0 .5gr/100 ml. de agua destilada)

agregue la pirazolona al agua a aproximadamente 70°C y agite para su di

solución. Enfrie a temperatura ambiente y filtre.

b) Solución de bispirazolona - piridina .- Disuelva 0 .025 gr. de bispirazo-

lona en 25 ml . de piridina y filtre . Mezcle 125 ml . de la solución . a)-

con la solución b) Prepárese diariamente.

Rate reactivo puede desarrollar un color roas, pero si se emplea dentro

de las 24 horas, no lo afecta.

3.- Acido acético 1t4.- Mezcle una parte de ácido acético concentrado con 4

partes de agua destilada.


A) Destilación Preliminar.

1.- Coloque 500 ml . de muestra en el matraz del aparato de destilaoi6n.

2.- Ponga 50 ml . de solución de NaOR en el recipiente absorbedor de gas

si es necesario agregue agua destilada a fin de obtener un volumen-

adecuado para el burbujeo.

3.- Conecte el aparato y prenda el vacío.

15

4.- Regule el burbujeo a una burbuja por segundo en el matraz de desti-

laoidn.

5.— Agregue 20 ml. de solución de cloruro mercúrico y 10 ml. de solu --

ción de cloruro de magnesio y lave con agua destilada.

6.— Agregue 25 ml . de H2SO4 concentrado a través del tubo de entrada

--

del matraz, enjuague oon agua destilada, deje que el aire mezole la

solución por 3 minutos.

7.— r.npiece el calentamiento y deje el contenido del matraz en ebulli —

oión por 1 hora.

8.- Suspenda el calentamiento, pero continúe con el vacío por 15 minu —

tos más. Apague entonces.

9 .— Lave el condensador con agua destilada, calentándolo en el recipien-

te absorbedor de gas.

B) Curva de Calibración.

1 .— Diluya 10 ml . de la solución estándar de CM a 100 ml . con solución :-

de NaOH 0.2 N. 1 ml . = 0.1 pg de esta solución, prepare mediante di

luciones adecuadas una serie de estándares correspondiendo como si —

guel

ml. de solución pg. de ON

0 0

2 0.2

4 0.46 0 .6

8 0.8

10 1 .0

Diluidos todos a 15 ml. con solución de NaOH 0 .2 N y coloque dentro—

de los tubos de reacción.

2.— Neutralice testigos y estándares con ácido acético 1*4 midiendo con—

papel pH.

3.— Coloque los tubos en baño de agua fria.

4.— Agregue 0 .2 ml . de solución de cloramina T y mezcle bien.

5.-Agregue inmediátamente 5 .0 ml . de solución mezclada de piridina — pi

razolona, mezcle bien.

6.— Coloque los tubos en un baño de agua a 50°C por 20 minutos para el

desarrollo del color.

7.— Lea las absorbancias en el "Spectronio 20" a 620 nm.

16

8.- Construya la curva de calibración grafioando las lectures de

absorbancia contra concentración.

0) Tratamiento para las Muestras.

1.- Del destilado de las muestras obtenido, tome 15 ml . de muestra

o alícuota diluida a 15 con NaOH 0 .25 N y siga ezaotamente el

mismo prooedimiento que para la curva de calibración a partir

del punto 2(VII .B2.).

2.- Llevo las absorbanoias de la muestras a la curva de calibración

y obtenga su lectura correspondiente de concentraoión . Calcule

per fórmula.

cmmgflt . 1sede Cl leidos en la grilles

ml . originales de muestra

ml. originales -

A z B

~ v.-de muestra

A • ml. de muestra ( 15 ml . ) tomados después de la destilaoión.

B . ml. de muestra ( 500 ml. ) tomados pars la destilación.

C . ml. de solución do NaOH 1 N. Absorbentes de la destilación (50).

17

DUREZA TOTAL

( iu:ETODO DaL E.D.T.A)

I.- Alcance y Aplicación.

al método volumétrico de titulación oon la sal de sodio del ácido-

etilendiamino - tetraoetioo disodio (EPA), mide la concentraci6n de los -

iones de calcio y magnesio (considerando como dureza total), y puede ser -

aplioada a todo tipo de aguas.

No es aconsejable para desechos altamente coloreados o con mucha -

turbiedad, de tal manera que interfieran con el cambio de color del indica

dor. Se recomienda dentro de un rango de 1 a 1000 mg/lt, de dureza total .-

Fundamento del Método.

El método requiere el uso de la sal EDTA y el indicador de erío -

cromo negro T, este dltimo al ser agregado a una solución conteniendo io -

nes de calcio y magnesio, reacciona formando complejos de un color rojo vi

vo. Entonces ea agregada la sal de EDTA la cual remueve los iones de cal -

oio y magnesio de los complejos coloridos formando complejos solubles más-

eatables; cuando ha sido agregada suficiente solución de LDTA para liberar

todos los iones de calcio y magnesio, el indicador regresa a su color ori-

ginal azul.

III.- Muestreo y Almacenamiento.

No requiere condiciones especiales de muestreo o almacenamiento.

E muestreo puede hacerse en recipientes de vidrio o plástioo . Manténgase-

en refrigeraoión a 4°C, hasta el momento del análisis . Se recomienda un má

ximo de tolerancia de 7 días.


A) Materia orgánica suspendida o coloidal en la muestra, causando-

turbiedad o color, pueden impedir o dificultar el punto final de titula

ci6n. Esto se elimina oxidando la materia orgánica de la siguiente formal

1.- Tome 50 ml. de muestra en una cápsula de porcelana.

2.- Evapore a sequedad sin proyeociones en un baño maría 6 Hot - Plate. -

3.- Caliente en una mufla a 550°C hasta que la materia orgánica haya sido

completamente oxidada.

4.- Disuelva los residuos en 20 ml . de HC1 1 N.

5.- Neutralice a pH 7 con NaOH 1 N.

6.- Lleve a 50 ml . con agua destilada.

7 .-resfríe a temperatura ambiente y continúe el análisis normalmente.

18

B) Los metales pesados en las cantidades que normalmente se encuen

tren presentes en el agua no interfieren con el método, sin embargo, cier-

tos excesos, alrededor de 0.5 mg/lt . de cualquier metal o combinación de

dos ó más pueden causar cambios indistintos en el punto de vire . Para eli-

minar esta interferencia se recomienda hacer uso de inhibidores, probando

con los tree tipos alternadamente.

V.- Aparatos.

A) Potenoiómetro Spandiomatic 6 equivalente.

VI.- Reactivos.

A) Inhibidores.

1 .- Inhibidor I .- Agregar 250 mg. NaCN en polvo a la solución a

ser titulada.- Agregue suficiente solución buffer para ajustar

el pH a 10 .0 ± 0.1 para compensar la alcalinidad adicional re-

sultante de la hidrólisis del cianuro de sodio.

2.-Inhibidor II.- Disuelva 5 .0 gr. de Na2S. 9 H20 6 3.7 gr. de . ..Na2S . 5 H20 en 100 ml. de agua destilada . Proteja del aire con

un tapón hermético de caucho . El inhibidor se deteriora con la

oxidación del aire . Use 1 ml . de ante inhibidor a un pH de . ..

10.0 10.1.

3 .+ Inhibidor III.- Disuelva 4,5 gr. de cloruro de hidroxilamina

en 100 ml. de alcohol etílico ó isopropilico. Usese 1 ml . a un

pH de 10.0 ± 1.

B) Solución Buffer .- Disuelva 16.9 gr. de cloruro de amonio

NH4C1, en 143 ml. de hidróxido de amonio concentrado, NH4OH, a-

gregue 1 .25 gr. de sal EDTA de magnesio y diluya a 250 ml . con

agua destilada.

C) Indicador de Eriooromo negro T . Puede prepararse de las siguiera

tea dos formaat

1.- Mezcle 0.5 gr. de indicador de eriocromo negro T . con 4.5gr. de hidrooloruro de hidroxilamina NH2OH. HC1. Disuelva

esta mezcla en 100 ml . de alcohol etílico ó isopropilico al

95%.

2.- Mezcle 0.5 gr. del indicador y 100 gr. de NaCl. para prepa-

rar una mezcla en polvo seca.

D) Solución estándar de carbonato de Calcio .- Seque carbonato de -

calcio CaCO3 en polvo a 105°C durante toda la noche y enfríe a

temperatura ambiente en un desecador . Pese 1 .000 gr. de ósta sal

19

seca y pase a un matraz erlenmeyer de 500 ml . Coloque un embudo en el

cuello del matraz y agregue poco a poco HCL 1 :1 hasta que todo el ..

CaCO3 se disuelva . Agregue 200 ml. de agua destilada y hierva por pocos minutos para expeler el CO 2. Enfrie y agregue pocas gotas del in

dicador rojo de metilo y ajuste a un color intermedio,naranja,por a-

dioión de NH4OH 3 N ó HCL 1 :1 . Pase a un Matraz volumétrico de 1000

ml. y afore con agua destilada.

B) Indicador rojo de Metilo.- Disuelva 0.1 gr. de sal de sodio rojo

de metilo y diluya a 100 ml . con agua destilada.

F) Solución de Hidróxido de Amonio 3N .- Agregue 240 ml. de NH4OH cos

centrado alrededor de 700 ml. de agua destilada y diluya a 1 lt.

Filtre en caso de presentarse materia suspendida.

0) Solución Estándar Titulante de E .D.T.A. 0.01 N; pese 3.723 gr. de

sal disódioa de EDTA, grado reactivo Ma2H2C10H1208i2. 2H201 disuel

va a 1000 ml . con agua destilada . Estandarice como sigues

1.- Tome 10.0 ml. de la solución estándar de CaCO3 y diluya 50 ml . con a-

gua destilada en un matraz erlenmeyer de 250 ml.

2.- Agregue de 1 a 2 ml . de la solución buffer (o la cantidad necesaria -

para llevar la solución a un pH de 10 .0 a 10.1).

3.- Agregue 1 a 2 gotas o una cantidad adecuada del indicador en polvo de

eriocromo negro T.

4.- Titule con la solución estándar de EDTA, lentamente con agitación con

tina, hasta el vire rojo-azul.

5.- Calcule el factor F con la fórmula.

mg. de CaCO3 en solución

ml. gastados de la solución EDTA.


A) Tome 50 ml. de muestra o alícuota llevada a 50 ml. con agua deati

lada ( es recomendable que el volumen de muestra a tomar no gaste

mas de 15 ml. de solución EDTA).

H) Ajustas : a un pH . 10 1. 0.1 adicionando el volumen necesario de s_luoión amortiguadora ( 1 a 2 ml.).

C) Agregar la oantidad adecuada del indicador de eriocromo negro T.

D) Titular con la solución de E .D.T.A. hasta el vire rojo-azul. Se re

comienda que el tiempo de titulación no pase de 5 minutos (desde

el ajuste del pH).

Fa

20

B) Calcule la Dureza con la siguiente fórmula e

Vx1000IFDureza Total on mg/lt, oomo CaCO3

n].. de la muestra

D011DBa

V s Valiosa gastado do B.D .T.A. on la titulaoiin.

F . Factor do la solución de B.D.T.A.

21

DUREZADñCALCIO

(láh°PODO DEL E. D. T . A.)

I .- Alcance y aplicación.

Ml método ea aplicable a todo tipo de aguas, con excepción de a-

quellas altamente coloridas o turbias, de tal forma que interfieran con

el vire del indicador. Muy usado en trabajos de rutina, dando buenos re

sultados. Por medio de diluciones se puede emplear para todo rango de con

centración.

II.- Fundamento del método.

Bstá basado, al igual que el método de dureza total, en la reao --

oi6n qua sucede entre la sal de BDTA, con el Ca y el Mg, formando comple -

jos solubles, usando como indicador el purpurato de amonio (murexida), el-

cual sólo reacciona con el calcio.

La titulación se hace en unas condiciones de pH de 12 a 13, lo --

cual provoca la precipitación del magnesio como su hidróxido . Lo que per -

mite registrar el cambio de coloración debida únicamente a los iones de

Calcio.


Véase "Muestreo y Almacenamiento" para Dureza Total.


A) Materia orggniaa suspendida o coloidal causando turbiedad o ---

color que interfieren en la apreoiaoión del vire, trátese en

la misma forma que para Dureza Total (IV .A.).

B) Metales como bario y estroncio en altas concentraciones, pue

den oausar cambios indistintos en el punto final del vire.

C) Los ortofoafatos a las condiciones de pH de la determinación

pueden causar cambios indistintos en el punto de vire.

Probar usando inhibidores.

V.- Aparatos.

A) Potenciómetro Beolonan Spandiomatic o equivalente.

VI.- Reactivos.

A) Inhibidores.- Prepárese como Dureza Total (IV .A)

B) Solución de hidróxido de sodio NaOH IN .- Pese 40 .0 gr. de NAOH

y disuelva en 1 It . de agua destilada.

C) Indicador de Murexida (Purpurato de Amonio) . Puede prepararse-

en dos formas=

1 .- Disuelva 150 mg. del indicador en 100 gr. de etilenglicol -

22

absoluta.

20- Mezcle 200 mg . de murezida o.n 100 gr. de NaCl salid. y

pulverizad, a 40 - 50 Mallas.

D) S.luoiin Estándard titulante d. EDTA. 0.01 N.- Prepare y .atan

dariae oeme en Dureza Total (VI . 0).


A) Teme 50 ml. de muestra o aliou.ta llevada a 50 ml. con agua -

destilada (entra un rang* de 5 a 10 mg. de contenida do calcio).

B) Ajustar a un pH d, 12 a 13 oen 2 ml . 4, el vvIdmen necesario de

NaOH 1N.

C) Agregar 1 6 2 gotas, . la cantidad adecuada del indicador de

murezida.

D) Titular inmediatamente d.spuas de estas adioi.nes, hasta el vi

re de reza a viel.ta.

B) Caloular la Dureza de °alai, con la siguiente f6rmulas

Duress de Ca on mgflt, come CaCO3Vz 1000sF

ml . de muestra

DONDEs

V = V.ldnes gastado de EDTA on la titulaeian.F . Faot.r de la solución de EDTA.

23

P H

(lrüyyTODO POTFNCIOMETHICO)

I.— Alcance y Aplicación .,

El método se aplica a todo tipo de aguas, la escala pH se extiende

desde 0 para " muy ácida" hasta 14 para "muy alcalina" correspondiendo a —

el 7 el punto neutro para una temperatura de 25°C.

II.— Fundamento del Mátodo.

Bl valor de pH es el inverso del logaritmo de la ooncentraoión --

del ión hidrógeno libre, expresado en moles por litro . El cual es determi

nado al aplicar una corriente en el agua y midiendo la diferencia de poten

cial que se crea, . Esta diferencia de potencial es registrada mediante el

uso de eleotrodo de vidrio conjuntamente con el electrodo de referencia

(saturado de calomel).


Debido a que el pH puede variar , con cambios de temperatura, real

ciones químicas o gases disueltos, la determinación se debe hacer directa—

mente en el campo. El pH medido en el laboratorio servirá como una referen

cia pero no es posible considerarlo como representativo del cuerpo de mues

treo .

IV.— Interferencias. Las interferencias que se pueden presentar en la medi-

ción del pH son altas concentraciones de sodio o grasa y aceites que forman

una capa alrededor del electrodo causando bajas respuestas.

V.— Aparatos.

A), Potenciómetro Electrónico con ajuste para compensación de ten —

peraturaa.

B) Electrodo de Vidrio.

0) Electrodo de Heferenoia (saturado de calomel).

D) Termómetro.

B) Mufla con control de temperatura hasta 1000°C.

F) Estufa oon control de temperatura hasta 110°C.

VI.— Heaotivos.

A) Soluciones Buffer , para calibraoión del aparato. Generalmente

se venden ya preparadas, y son proporcionadas por el fabricante.

Siempre ea neoesario un mínimo de dos , a diferentes rangos de pH.

(ácido y básico) para la calibraoión del potenoiómetro . Se pueden preparar-

soluciones para todos los rangos de pH . A continuación se resume la preps —

24

ración de doe de ellas:

1.- Solución saturada de tartrato de sodio.- Pese y disuelva agitando vigó

rosamente de 5 a 10 gr. (6.4) de finos cristales de KHC4H4O6 en 100 ó

300 ml . de agua destilada a 25 °C en un matraz de tapón esmerilado . Se

pare la soluci6n clara del material sin disolver por decantación o fil

tración. Esta solución puede emplearse para control de rutina, preser-

vándose por dos meses o más añadiendo un cristal de timol por cada 2C0

ml . de solución . Bata solución tiene un pH de 3.557 a 25°C .

2.- Solución saturada de hidróxido de calcio . Coloque carbonato de calcio,

CaCO3, grado bajo alcalinidad, en un disco de platino y calcine por 1 -

hora a 1000°C. Después enfríe el óxido de calcio, hidrátelo añadiendo

lentamente agua destilada con agitación y calentamiento a ebullición.

Enfríe y filtre la suspensión y colecte el hidróxido de calcio sólido

en un filtro de fibra de vidrio de porosidad media. Seque el hidróxido

de calcio en la estufa a 110°C . Enfríe y pulverice para uniformar a -

-gránulos finos . Disuelva una porción de éstos granulos en agua destila

da (se recomienda 3 gr. para 1000 ml . de agua destilada disolviéndose

aproximadamente a la mitad) agitando vigorosamente. Filtre al vacío a

través de un filtro de fibra de vidrio y use el filtrado como solución

Buffer.

Esta solución tiene un pH de 12 .454 a 25°C. Deseche la solución -

cuando aparezca turbiedad al ponerse en contacto con la atmósfera.


A) Conecte los electrodos al potenciómetro siguiendo las indicado

nea del fabricante, enciéndalo y deje calentar por unos 5 minu-

tos.

B) Enjuague los electrodos con agua destilada y séquelos con un pa

pel suave.

C) Sumerja los electrodos en la solución buffer, tome la tempera tu

ra de la solución y de acuerdo a ella ajuste el compensador de

temperatura del aparato.

D) Calibre de acuerdo al pH de la solución.

E) Repita la operación con otra solución buffer de diferente pH, -

enjuagando y secando los electrodos en cada cambio de solución.

F) Una vez calibrado el potenciómetro, proceda a tomar el pH de las

muestras, enjuagando y secando siempre los electrodos y ajustan

do la temperatura . Espere siempre un tiempo razonable a que el

25

potenciómetro alcance estabilidad, para tomar la lectura.G) Reporte directamente la lectura en unidades de pH.

26

CROMO HEXAVALENTE

I .- Alcance y aplicación.

El método se aplica a aguas superficiales, naturales, potables y

aguas en las que se desea verificar su potabilidad . El método es aplicable

en un rango de 0 .02 a 55 mg/lt para 90 ml . de muestra. Un alcance mayor se

obtiene por medio de diluciones.


El método está basado en la reacción que tiene lugar entre el Cro-

mo hexavalente y la difeniloarbazida, produciendo un color púrpura rojizo

en condiciones ligeramente ácidas.


A) Las muestras deben ser colectadas en envases de plástico perfec

tamente limpios, de preferencia nuevos.

B) Lo ideal es el análisis inmediato, sin embargo, si éste no es -

posible se recomienda su almacenamiento no mayor de 2 6 3 días,

para evitar que el Cromo de absorba en la superficie del recipien

te.


A) El mercurio, como merodrico o merouróso da un color azul en --

condioiones semejantes a las de la reacción . Se puede eliminar

por un mayor control de la acidez requerida para la determinación.

B) El fierro en concentraciones mayores de 1 mg/lt interfiere pro-

duciendo un color amarillo en el reactivo.

C) El Vanadio en las muestras, interfiere en la reacción producien

do una coloración, que sin embargo, se pierde rápidamente y es

insignificante 10 minutos después de la adición de la difenil--

carbazida.

V.- Aparatos.

A) Eapectrofotómetro para ser usado a 540 nm. provisto de un paso

de luz de 1 cm.

VI.- Reactivos.

A) Solución Patrón de Cromo .- Pese y disuelva 141 .4 de dicromato

de potasio anhidro, K2Cr27 , en agua destilada, y diluya a ---

1000 ml. 1 .00 ml . 50.00 pg de Cromo.

B) Solución estándar de Cromo .- Diluya 10 ml . de la solución patrón

de Cromo a 100 ml . 1 .00 ml . = 5 .0 pg de Cromo hexavalente . Pre-

27

párese cada vez que se use.

C) Reactivo de 5 - difeniloarbazida .- Disuelva 200 mg . de 5 - dife

nilcarbazida (también llamada 1 .5 - difeniloarbohidrazida) en

100 ml. de alcohol etilioo al 95% o alcohol isópropilioo; añadir

con agitación una solución áoida preparada con 40 ml . de H2 SO4

concentrado y 360 ml. de agua destilada, consérvese en refrige

ración . Se puede presentar una disminución en el color del reas

tivo, pero ésto no lo afeota . Es estable por aproximadamente un

mes.

D) Soluoión Acido Sulfúrico 1x1 .- Prepárese por dilución de H2SO4

concentrado a partes iguales con agua destilada.

E) Acido fosfórico, H3PO4, concentrado.


A) Preparación de la curva de Calibración.

1.- De la solución estándar de Cromo, se toman 0 .50, 1 .00, 2.00, -

3.00, 4.00, 5.00, 6.00, 7.00, 8.00, 9 .00, 10.00, ml. y se colo-

can en matraces aforados de 100 ml . agregándose agua destilada

hasta completar un volómen de 90 ml . 6 popo menos junto con dos

testigos de agua destilada.

2.- Agregue 1 ml . de solución de H2SO4 181 con agitación y ensegui-

da 0.3 de áoido fosfórico concentrado.

3.- Se agregan 2 ml . de solución de 5 - difeniloarbazida, y se agi-

ta, esperando 10 minutos para que se desarrolle el color (éste

ea estable por 30 minutos aproximadamente .).

4.- Afore a 100 ml. con agua destilada, tapar el matraz y homogenei

zar.

5.- Leer inmediátamente las absorbancias correspondientes en el Spee

tronic a 540 nm. calibrando a "0" de abaorbanoia del aparato --

con el testigo de agua destilada.

6.- Hacer la curva de calibración grafioando los valores de oonoen-

tración contra loa valores de absorbancia . El rango de la curva

es de 2 .5 a 50.0 rg de Cr + 6 correspondiendo como siguen

28

ml . de solución

estándar

0

0.5

1 .0

2 .0

3 .0

4.0

5.0

6.o

7.0

8.o

9.0

10.0

µgg, de Cr+6

0

2 .50

5.0010.00

15 .00

20.00

25.00

30.00

35.00

40.00

45.00

50.00

B) Desarrollo de color en las muestras.

1.- De la muestra libre de color y turbiedad, se toman 90 mi. y

se colocan en un matraz aforado de 100 ml.

2.- Por cada grupo de muestras, se corre también un testigo y un

estándar como mínimo.

3.- Seguir eaectamente el mismo procedimiento que para la curva de

calibración, incluyendo el tiempo de desarrollo de color y de

lectura.

4.- Si la muestra sale del rango de la curva, se hacen diluciones

apropiadas para su lectura y se completa a ± 90 ml. con agua

destilada.

5.- Las lecturas de absorbancia de las muestras se llevan a la curva, para determinar sus concentraciones correspondientes y se

calcula por medio de la siguiente fórmulas

Fg de Cr+6 (leídos en la gráfica)

ml. de muestra.mgflt de Cr+6

29

NITROGENO ORGANICO Y TOTAL KJELDAHL

( METODO VOLIJMETRICO )

I,- Alcance y Aplicaoi6n.

La determinación de nitrógeno orgánico Kjeldahl se aplica a todo

tipo de aguas, potables, desechos industriales y domdatioos, aguas super-

ficiales, subterráneas, y salinas. Se recomienda para concentraciones su-

periores a 1 mg/lt, au limite de detección se ha estandarizado en 0 .5 a . ..

mg/lt, siendo un método volumétrico, resulta muy dtil en aguas cuyo origen

o concentración oe considera muy alto o se desconoce . El nitrógeno total

Kjeldahl está considerado por la suma del nitrógeno amoniacal y el nitróge

no orgánico, se determina analíticamente por digestión directa de la mues-

tra, sin hacer la remoción de nitrógeno amoniaoal, que se realiza cuando -

se desea ouantifioar el nitrógeno orgánico. Sus limitaciones y aplicaoiones

son las mismas para el orgánico o el amoniacal.


La muestra es sometida a una digestión a altas temperaturas en un

medio fuertemente ácido con sulfato mercdrioo como catalizador hasta des ~•

prendimiento de humos blancos con lo que el nitrógeno de loa materiales or,gánicos se descompone oomo amonia . El residuo ea entonces enfriado y anali

zado de la misma forma que para el nitrógeno amoniacal.


Los métodos de muestreo y almacenamiento, son los mismos que para

nitrógeno amoniacal.


A) La digestión preliminar del método permite oonsiderarlo libre

de interferenoias.

B) Con muestras salinas pueden presentarse problemas de proyeccio-

nes especialmente durante la digestión ; se recomienda sujetar -

los matraces al aparato de alguna manera, agregar más perlas de

vidrio o tomar menor voldmen de muestra a fin de ontrolailas.

V.- Aparatos.

A) Aparatos de digestión-destilación KJELDAHL Laboonoo Corp .o equi

valente equipado con matraces Kjeldahl de 800 ml . de capacidad

y equipado para alcanzar un rango de temperatura de 344 a 371°C

para la digestión y matraces erlenmeyer de 500 ml . dé capacidad,

30

con graduación.

VI .- Reactivos.

A) Reactivo de Digestión.

1.- $oluoidn de ácido sulfdrico 6 N .- Diluya 180 ml . de H2SO4

-concentrado a 1000 ml. de agua destilada.

2.- Prepare una solución disolviendo 2 gr. de óxido merodrico-

rojo en 25 ml. de H2SO4 6 N.

3.- Agregue con mucho cuidado 200 ml . de H2SO4 concentrado a--

650 ml . de agua destilada y enfríe a temperatura ambiente .-

4.- Una vez fria, disuelva en esta solución 134 gr . de K2SO4 .-

5.- Agregue con agitación constante esta solución a la solución

de óxido mercúrico . Afore a 1 lt.

6.- Manténgase esta solución arriba de 14°C, para evitar la -

cristalización.

B) Solución de Fenolftaleína .- Prepárese como fosfatos totales y-

orto VI.A.1.

C) Soluoión de hidróxido de sodio - Tiosulfato.- Disuelva 500 gr.

de NaOH y 25 gr . de Na2S203 . 5 H20 en agua destilada y afore a

1 lt.

D) Solución absorbente de ácido bórico .- Prepárese como nitrógeno

amoniacal VI .D.

E) Solución de indicador mixto .- Prepárese como nitrógeno amonia-

cal VI.E.


A) Nitrógeno Total.

1 .- Coloque 500 ml . de muestra, o alícuota apropiada, en un ma-

traz Kjeldahl. En este caso no es necesario completar con -

agua destilada, se recomienda sólo en casos en que se tomen

volúmenes muy pequeños de muestra (menores de 100) para que

la digestión no resulte muy violenta .-Se recomiendan los si

guientes volúmenes.

EAit

de NitrógenoOrgánico en la muestra

Volumen deMuestra a tomar.

0-1 500.0 ml.

1-10 250.0

10-20 100.0

20-50

50.0

50-100

25 .0

31

Tome también un testigo de 500 ml. de agua destilada.

2.- Agregue 50 ml . de reactivo de digestión ó hasta una aoidificaoión

total.

3.- Añada unas perlas de vidrio para controlar la ebullición.

4.- Conecte al aparato de digestión.

5.- Lleve la digestión hasta que quede un voldmen de aproximadamente-

de 3-5 ml . , transparente, después del desprendimiento de humos -

blanoos.

6.- Suspenda la digestión y deje enfriar a temperatura ambiente.

7.- Agregue 500 ml. de agua destilada y 2 gotas de fenoiftaleína.

8.- Agregue 50 ml. de solución de hidróxido de sodio-tiosulfato ó -

hasta que se tome una coloración rosa intenso.

9.- Conecte enseguida a el aparato de destilación previamente limpio

y haga la determinación y cálculos de la misma forma que para ni

trógeno amoniacal.

B) Nitrógeno Orgánico.

1.- Hágase la determinación de nitrógeno amoniacal a la muestra.

2.- La muestra restante en el matraz Kjeldahl después de la destila-

ción es la que se emplea para la determinación del nitrógeno or-

gánico.

3.- Una vez fria se le agrega los 50 ml, de la solución de digestión

y se procede en la misma forma que para el nitrógeno total a par

tir del punto 2 .(VII .A.2.).

Cáloulost

N orgánioo melt = ( D - Ta ) x 14 x 1000 x N

ml . de muestra

Donde :

D = voldmen gastado de H2804 en la muestra.

B = voldmen gastado de H2SO4 en el testigo.

N = Normalidad del H2SO4

NT mg ~:- Norgánico mg + Namoniacal m~-It

It

It

32

NITROOENO DE NITRATOS

(METODO DE LA BRUCINA)

I.. Aloance y Aplicación.

El método ha sido aplicado a todo tipo de aguas, presenta muchas

variaciones debido a que no obedece la ley de Beer . Sin embargo, a exoeg

oión del método del electrodo de idn especifico es el más rápido y fácil

Es recomendado en un ámbito de 0.1 a 2 mg. NO3 - N/lt, sin embargo, ha-

ciende diluciones es posible aplicarlo a muestras con mayor concentración.


Este método se basa en la coloración amarilla que produce el coa

plejo resultante de la reacción del ión nitrato con el sulfato de . bruci-

na a una temperatura alta en un medio fuertemente ácido.


El análisis de nitratos se debe realizar tan pronto como sea po-

sible, Si el almacenamiento ea necesario se refrigera a 4°C . Se puede --

preservar por adioi6n de 2 ml . de H2SO4 cono./lt, o por adioi6n de 40 mg.

/it, de Hg C12.

IV,- Interferencias.

A) Altas concentraciones de materia orgánica pueden interferir

causando ausencia de color, esto puede corregirle por compen-

saoi6n de color.

B) Agentes fuertes tanto oxidantes como reductores interfieren,

éstos pueden detectarse por la adición de reactivo de ortoto-

lsdina.

C) La interferencia de cloro libre residual puede eliminarse por

adición de arsenito de sodio en proporoi6n de 0 .05 ml. de so-lución de arsenito de sodio ( 1 gota ) por cada 0 .10 mg. de -

Cl mezclando bien.

D) El ión férrico, ferroso, fierro y manganeso en estado ouadri-

valente dan interferenoias positivas , pero en concentraciones

menores de 1mg ./lt, no son significativas.

E) Las interferencias por salinidad pueden eliminarse por adición

de NaCl a blancos, estándares y muestras.

F) Las interferencias más comunes y generales de color y turbie-

dad, pueden eliminarse por filtración milipore 6 bien por coa

33

gulación oon AL (OH) 3 y filtrando con papel filtro "Watbmaii"

posteriormente. En casos en que éstos no sean suficientes, se

emplea la corrección por color.

G) Este método de determinación, ea un método considerado adn co.mo "Tentativo" . Es necesario una uniformidad y control de la

temperatura durante todo el procedimiento para no tener resul

tados erróneos . Es recomendable correr siempre todas las mueá

tras por duplicado con uno 6 das estándares en cada grupo de

muestras ya que date método no sigue la ley de Beer,

V.— Aparatos.

A) Spectronia 20, marca Bauch & Lomb para usarse a 410 nm, provis

to de un paso de luz de 1 om . p equivalente.

B) Baño de agua frío. Se adaptó oon una palangana de plástico con

agua a mitad o 3/4 de su capacidad, manteniéndola permanente—

mente dentro de un refrigerador a 4°C.

C) Baño de asa para una temperatura de 100°C. Para tal fin se u

tilizan vasos de precipitado de 1000 ml . de capacidad con agua,

calentándola hasta temperatura de ebullición.

D) Tubos de reacción. Tubos de vidrio con una capacidad aproximé

da de 25 — 30 ml . con tapón de rosca.

VI.— Heactivos.

A) Estándares.

1.— Solución Stook de nitratos .— Se pesan 721 .8 mg. de nitrato

de potasio anhidro KNO3 se disuelve y se afora con agua —

destilada a 1000 ml . en matraz volumétrico 1 ml . v 0.1mg—N.

2.— Solución Estándar de NO3.— Diluya 10.0 ml. de solución —stock de nitrato a 1000 ml . con agua destilada en matraz

aforado. Prepárese inmediatamente antes de usar,

B) Solución de arsenito de sodio.— Disuelva 5,0 gr. de NaAsO2 y

diluya a 1 It., con agua destilada.

C) Solución de cloruro de Sodio .— Disuelva 300 gr. de NaCl y di=

luya a 1000 ml. con agua destilada.

D) Solución de Brucina .— Acido Sulfanilico .— Disuelva 1 gr . de —

sulfato de brucina y 0 .1 gr. de ácido sulfanilico en aproximé

damente 70 ml . de agua destilada caliente . Agregue 3 ml . de rHC1, enfríe y afore a 100 ml . Esta solución es eatable por vé

ríos meses ; el color rosa que se desarrolla no interfiere.

34

Se guarda en frasco de vidrio ámbar y se conserva en refrige

ración.

E) Solución de ácido Sulfúrico .- Agregue cuidadosamente 500 ml.

de H2SO4 concentrado a 125 ml . de agua destilada . Enfríe a -

temperatura ambiente y manténgase en envase cerrado.



1.- De la solución estándar de NO3 tome 1 .00, 2.00, 4.00, 7 .00,

y 10.00 ml. y coloque en tubos de reacción, completando hasta

10 ml. con agua destilada . Llevando tambián un blanco con agua

destilada.

2.- Añada 2 ml . de solución de NaCl, mezcle vigorosamente . Có

loque la gradilla de loa tubos en el baño de agua fria.

3.- Agregue cuidadosamente 10 ml . de solución de H2SO4 y mez-

cle agitando en forma de remolino evitando invertir los tubos.

4.- Añada 0.5 ml . del reactivo de bruoina-ácido sulfanilioo a

cada tubo.

5.- Coloque los tubos en el vaso de precipitado con el agua -

ya en ebullición y se empieza a tomar el tiempo.

6.- Los tubos se dejan en el baño en ebullición por ezactamen

te 25 minutos al cabo de los cuales se sanan y se sumerjen en

un baño de agua hasta alcanzar la temperatura ambiente.

7.- Se leen las absorbaiicias de los estándares en el espectro

nio 20 y con los valores de concentración se construye la cur

va de ooncentraoión contra absorbancia . El rango de la curva

es de 0.1 a 1 mg/lt., correspondiendo de la siguiente forma:

ml. de solución

Standard de NO3

. NO3- N

mg/lt NO3 N

para 10 ml . de muestra

0.00 0.00 0.0

1 .00 1 .00 0.1

2.00 2.00 0.2

4.00 4.00 0.4

7 .0o 7.00 0.7

10.00 10.00 1 .0

Calibrando a "0" de absorbancia con el blanco de agua destilada.

1

35


1.— Se toman 10 ml. de muestra y se colocan en los tubos de

reacción, llevando también un blanco de agua destilada y

uno o dos estándares.

2.— Se sigue exactamente el mismo procedimiento que para la

curva de calibración.

3.— Si la muestra sale del rango de la curva, se hacen dilu-

ciones apropiadas para su lectura, y se completa a 10 ml,

con agua destilada.

4.— Las lecturas de abaorbancias de las muestras se llevan a

la ourva de calibración para determinar sus concentracio-

nes correspondientes . Se puede leer directamente la conoeñ

traci6n en la curva, si se graficó en mg/lt ., y se emplea

ron 10 ml . de muestra. En caso contrario se calcula por la

siguiente formulas

NNO3 — mg/ltp NO3 — N en la gráfica

ml. de muestra.

NO3

mg/lt

=

mg/it NNO3x

4.43

36

NITROGENODaNITRITOS

( MTsTODO DEL ETILLITDIAiiINA)

I.- Alcance y Aplicaoi6n.

El método se aplica a todas las aguas analizadas en general . Su-

rango recomendado ea de 1 a 25 pg/it, sin embargo, para aguas,no poca -

bles resulta inoperante, por lo que se trabaja con un rango 10 veces ma-

yor (10. a 250 pg/lt) . Dando buenos resultados aún para mayores concsn -

traciones. Su limite de deteocidn estándar es de 1 pg/it . pudiéndose me-

jorar en la práctica.


El método se basa en la formación del colorante azo-rojo púrpura

que se .forma en un pH de 2,0 a 2 .5 por el enlazamiento del ácido sulfaní

lico diazotinizado con el N-(l-naftil) etilendiamina dihidrocloruro.

La coloración que se forma obedece la ley de Beer y ea apta para

medidas fotomótricas.


Las muestras deben analizarse siempre lo más pronto posible . Si-

se requiere almacenamiento se puede preservar con HgC1 2 (40 mg/lt) y re-

frigerarse a 4°C.


A) S1 trioloruro de nitrógeno imparte un color rojo falso al a-

gregar los reactivos, este efecto puede minimizarse invirtien

do el órden de adición de los reactivos.

B) Interferencias de precipitación pueden presentarse debido a -

iones de antimonio, oro, bismuto, fierro, plomo, merourosos,-

plata, cloroplatinato y metavandato, por lo tanto deben elimi

narse antes de hacer la prueba.

C) Las interferencias de color y turbiedad se eliminan de la mis

ma forma que en la determinación de NNO3.

V.- Aparatos.

A) Speotronio 20 para usarse a 543 nm, provisto de un paso de -

luz de 1 cm.

B) Tubos Hessler pareados de 50 ml. con tapones de caucho.

VI.- Reactivos.

Prepare todas las soluciones a partir de reactivos cuyo color -

sea blanco .

A) Estándares

1 .— Solución Stock de Nitrito .— Disuelva 1 .232 gr. de NaNO2

grado reactivo y afore con agua destilada a 1000 ml

1 .00 ml . = 250 Fg N. Se preserva con 1 ml . de cloroformo,

sin embargo, para cada curva se recomienda preparar nuevos

estándares.

VALOHACION DE LA SOLUCION STOCK

a) Reactivos.

a.1 .) Solución estándar 0 .05 N de KMnQ4. Disuelva 1 .6 gr. de . ..

KmnO4 en 1 it. de agua destilada . Guárdese en un frasco ám

bar de tapón esmerilado y déjese reposar por lo menos una

semaña . Después de lo cual se decants o pipetea el sobren

dante sin agitar ni levantar el sedimento . Bata solución,

debe valoraras frecuentemente de la siguiente maneras

a.1 .1 .) Haga varias pesadas (4 ó más) de oxalate de sodio anhidro

de 0.1 mg. ( de 100 a 200 mg.) y disuelva con agua destile

da llevando con un voldmen de 100 ml.

a.1 .2.) Agregue 10 ml . de H2SO4 111 y caliente rápidamente a 90 —

95°C de temperatura . Titule rápidamente con la solución de

KMnO4, con agitación constante. El punto final de la titu-

lación ea cuando un ligero color rosa persista por lo menos

un minuto. La temperatura no debe bajar de 85 0C durante to

do el procedimiento, calentando durante la titulación si —

es necesario, 100 mg. de oxalato de sodio, gastan alrededor

de 30 ml . de solución de KMnO4 se corre tarsbién un blanoo

de agua destilada y H2SO4 1 :1

Normalidad del KmnO4 =

gr. Na C

(A—B) x 0.06701

A = ml. gastados en la titulación para la muestra.

B = ml. gastados en la titulación para el blanco.

Promedie las normalidades resultantes de las diferentes pe

sadas.

a.2.) Solución de oxalate de sodio 0.05 N.— Pese 3.350 gr. de . ..

3 8

Na2C2O4 grado estándar primario, disuelva y afore a 1000 ml.

con agua destilada.

a .3.) H2SO4 Concentrado

b) Procedimiento.

b.1.- Pipetee 50 ml. de la solución de IcínO4 0.05 N.

b.2.- Agregue 5 ml . de H2SO4 concentrado.

b.3.- Agregue 50m1 . de la solución Stook de nitritos introdu

tiendo la punta de la pipeta en la solución ácida de -

KMnO4.

b.4.- Mezcle cuidadosamente y caliente en una parrilla a 70 0

- 800C.

b.5.— Descargue el color del permanganato por suficiente a -

dioión de la solución de oxalato de sodio 0 .05 N en -

porciones de 10 ml.

b.6.- Titule el exceso de oxalato de sodio con el estándar -

de permanganato 0.05 N.

b.7.- Calcule el contenido de nitrógeno de nitritos en la só

lución stook con la siguiente fórmula ; (ecuación)

A

( B X C) - (D X B )X_1

F

DONDn;

A = mg/ml. de nitrógeno de nitrito en la solución stock

B = Total de ml . del estándar de MnO4, usados.

C Normalidad del estándar de KgnO4.

D = Total de ml . del agente reductor agregado (Na 2C204)

B = Normalidad del agente reductor agregado.

F = ml. de solución Stock de NaNO 2 tomados para la titu

laoión.

Siempre que vaya a iniciar la técnica de N-NO 2, es-

conveniente llevar a cabo esta valoración . Aunque para-

fines prácticos no se haga.

2.- Solución Intermedia de Nitritos .- Calcule el voldmen 0-

de solución Stook de Nitritos necesario para la solu --

ción intermedia por medio de la siguiente ecuación:

39

G12.5

Diluya a 250 ml . el volúmen calculado G (aproximadamente 50

ml .) en matraz aforado. Prepare el mismo dia que se use.

1 .00 ml . - 50.00 f► g N.

3,.. Solución Standar de Nitritos . Diluya 10 ml. de solución inter

media de Nitritos a 1000 ml . 1 .00 ml . = 0.50011g. Prepáre-

se el día que se use.

B) Reactivo de Sulfanilamide.- Disuelva 5 gr . de sulfanilami-

da en una mezcla de 50 ml . de ácido clorhídrico concentra-

do y aproximadamente 300 ml . de agua destilada . Diluya a

500 ml. con agua destilada . Rata solución es estable por

varios meses.

C) Soluoión de dihidrooloruro de N (naftil).. etilendiamina.

Disuelva 500 mg . de dihidrooloruro en 500 ml . de agua des-

tilada. Bata solución debe renovarse mensualmente o inme-

diatamente que se desarrolle una coloración oafó fuerte.



1.- De la solución estindar de nitritos se preparan una serie

de estándares, tomando 0 .1, 0.5, 1 .0, 2.0, 4.0, 7 .0, 10.0,

14.0, 17.0, 20.0, y 25.0 en los tubos Nessler de 50 ml . y

se aforan hasta la marca con agua destilada . Se corre un

blanoo de agua destilada.

2.- Se agrega un ml . de la solución de sulfanilamida y mezcle

inviertiendo loa tubos.

3.- Espere a que la reacción se lleve a cabo por un periodo de

2 a 8 minutos.

4.- Agregue 1 .0 ml . de la solución de 1 (naftil) etilendiamina

y mezcle inmediátamente.

5.- Haga la lectura en el espeotrónio, dentro de un periodo de

10 minutos a 2 horas, en absorbancia.

6.- Se construye la curva, graficando los valores de ooncentrá

oión contra loa valores de absorbancia . El rango de la cur

va es de 1 a 250 rg/lt correspondiendo de la siguiente for

mas

40

ml. de aolución

Estándar de NO2 fag NO2-N

rtelt NO2-N

Para 50 ml. de M

melt NO2-N

Para 50 ml . de M

0.1 0.05 1 0.001

0 .5 0.25 5 0.005

1 .0 0.50 10 0.01

2.0 1 .00 20 0.02

4.0 2.00 40 0.04

7.0 3.50 70 0.07

10.0 5.00 100 0.1

14.0 7.00 140 0.14

17 .0 8.50 170 0.17

20.0 10.00 200 0.20

25.0 12.50 250 0.25

DONDE :

M m muestra.

Usando el blanoo de agua destilada para calibrar a "0" de absor-

bancia del aparato.


1.- Se ajusta el pH de las muestras claras o ya clarificadas a

7 y se colocan en loe tubos Nessler.

2.- Se desarrolla y se lee el color exactamente en la misma for

ma y a los mismos tiempos que para la ourva de oalibración

(a partir del punto 2)

3.- Si las muestras se salen del rango de la curva, se hacen

las diluciones apropiadas para que caigan dentro del rango,

y se completa hasta la marca de 50 ml . con agua destilada.

4.- Los lecturas de absorbancia de las muestras se llevan a la

curva de oalibraoión para determinar sus concentraciones

correspondientes.

Cálculos .

mg .

jug de NO2 leidos en la gráficaN(NO )

2

It

ml. de muestra

41

SUSTANCIAS ACTIVAS AL AZUL DE METILENO (SAAM)

I.— Alcance y Aplicación.

El método se aplica a todo tipo de agua, con excepción de aguas éa

lines. En él se determina el contenido de alkil—benoen sulfonatos (ABS),

de alkil sulfonato linear (LAS) y sus compuestos e isómeros en general, —

que son materia prima de detergentes y jabones . El método es recomendado

para un rango de 0.025 a 100 mg/it de SAAR que se puede ampliar por medio

de diluciones.

II.— Principio del Método.

El método se basa en la reacción que tiene lugar entre los surfac

tantas aniónicos y el azul de metileno para formar una sal azul soluble —

en cloroformo, la coloración producida es proporcional a la concentración

de SAAM y adecuada para la medición fotómátrica.


Se recomienda tener el mismo cuidado que para fosfatos, tanto en

el muestreo y almacenamiento como en el lavado . Realice el análisis dentro

de las 24 hrs. siguientes al muestreo.

IV.— Interferencias.

A) Interferencias Positivas .— Son mucho más comunes que las nega-

tivas, causadas por sulfatos orgánicos, sulfonatos, carboxila-

tos y fenoles, que forman complejos con el azul de metileno.

Compuestos orgánicos de cianatos, cloruros, nitratos y tiocia-

natos que forman iones pares con el azul de metileno.

B) Interferencias Negativas .— Causadas por materiales orgánicos —

especialmente aminas que reaooionan ,laon el azul de metileno.

V.— Aparatos.

A) "Spectronic" 20 Bauch and Lomb para usarse a 625 nm . con un pé

so de luz de 1 cm. 6 equivalente.

B) Embudos de separación de 500 ml . de capacidad.

VI.— Reactivos.

A) Estándares.

1 .— Solución Stook de ABS.— Pese una cantidad del material de re-

ferencia (puede ser ABS puro o simplemente un detergente cuya

concentración de ABS es conocida) equivalente a 1 .000 gr. de

ABS disuelva y afore a 1000 ml . con agua destilada, guárdese

42

en refrigeración.

2.- Solución estándar de A .B.S.- Diluya 10.0 ml. de soluoi6n stock,

de ABS a 1000 ml . con agua destilada.

B) Solución indicadora de fenolftaleina .- Prepárese como en fosfatos

totales y orto.

C) Solución de hidróxido de sodio 1 N .- Pose y disuelva 40 gr. de ..

NaOH en agua destilada y complete a 1 lt.

D) Solución de ácido sulfúrico H2SO4 1 N.- Diluya 28 ml. de H2SO4 -

concentrado a 1000 ml. con agua destilada.

S) Cloroformo.

F) Reactivo de azul de metilo.- Disuelva 100 mg. de azul de metileno

en 100 ml. de agua destilada . Pase 30 ml. de esta solución a un ma

tras aforado de 1000 ml . Agregue 500 ml, de agua destilada, 6 .8 ml.

de H2SO4 concentrado y 50 gr. de NaH2PO4.H20 (fosfato monosódico

dihidrogenado monohidratado) . Agite hasta diluoi6n completa . Afore

hasta la mama.

0) Soluoi6n de lavado.- Agregue 6.8 ml. de H2SO4 concentrado a 500 ml.

de agua destilada en el matraz aforado de 1000 ml . Agregue enton-

ces 50 gr. de NaH2PO4.H20 y agite hasta disolución completa . Afore

hasta la marcos.

Vll.- Procedimiento.

A) Curva de cálBbaaofón.

1.- Prepare una eerie de estándares por dilución de los siguientes -

volúmenes de solución estándar de ABS a 100 ml . con agua destila

da en embudos de separación de 500 ml . 0.0, 1 .00, 3.00, 5.00, 7 .00,9 .00, 11 .00, 13.00, 15.00 y 20,00 ml.

2.- Agregue 2 6 3 gotas de indicador de fenolftaleína.

3.- Agregue :: solución de NaOH 1 N hasta la aparición de un ligero co

lor rosa.

4.- Elimine el color por la adición de unas gatas de H2SO4 1 N.

5.- Agregue 10 ml . de cloroformo.

6,- Agregue 25 ml. de reactivo de azul de metileno.

7,- Tape el embudo y agite vigorosamente por 30 segundos.

8,- Deje reposar para separar las fases

9.- Pase la capa de cloroformo a un segundo embudo de separación.

10.- Haga dos lavados sucesivos más a la solución del primer embudo con

10 ml . de cloroformo en cada lavado, repitiendo la extracción 3

veces al segundo embudo de separación.

43

11.— Combine todos los extraotos de cloroformo en el segundo embudo

de separación.

12.— Agregue 50 ml . de soluoi6n de lavado y agite vigorosamente por

30 segundos.

13.— Deje reposar para separar las fases.

14.— Prepare una serie de 10 embudos de talle corto con lana de vi-

drio previamente lavada con cloroformo.

15.— Pase la fase de cloroformo del embudo de separación a matraces

aforados de 100 ml. filtrándola a través de la lana de vidrio.

16.— Lave la solución del segundo embudo de igual forma que el pri-

mero con dos adiciones de 10 ml, de cloroformo c/u, pasando el

matraz aforado de 100 ml.

17.— Enjuague la lana de vidrio y el embudo con cloroformo.

18.— Colecte todos los lavados en el matraz, y afore con cloroformo

Mezole bien.

19.— Pase a las celdas, evitando cualquier presencia de agua.

20.— Lea en el "speotronic" a 652 nm . calibrando a "0" de absorban-

oia con el testigo de agua destilada.

21.— Construya la curva de calibración grafioando las concentracio-

nes de los estándares contra sus lecturas de abaorbanoia co —

rrespondiendo como sigues

ml. de solución estándar de ABS1

de ABS

0 0.0

1 .00 10.0

3.00 30.0

5.00 50.0

7 .00 70.0

9.00 90.0

11 .00 110.0

13 .00 130.0

15.00 150.0

20.00 200.0

B) Determinación en las muestras.

1 .— Se toman 100 ml. de muestra, o aliouota diluida a 100 ml . con

44

agua destilada, y se sigue exactamente el mismo procedimiento

que para la curva de calibración a partir del punto 2.

(VII .A.2).

2.— Se determina la ooncentraoi6n llevando las lecturas de absor-

bancia a la ourva de calibración, se obtiene la leotura co

rrespondiente en pg de A .B.S. y se caloula la oonoentraoión —

con la siguiente fórmulal

µg de ABS de gráfioaS.A:A.M. en mg/lt

= Jml. de muestra.

43

NITROOEENO Ai,áONIACAL

(1r1ET0D0 VOLUhrL•TRICO)

I .- Alcance y Aplicación.

El nitrógeno amoniacal determinado en el aparato de destilación-

Kjeldahl es aplicable a aguas potables, aguas superficiales, desechos, do

mésticos e industriales, corrientes subterráneas y aguas salinas . Este -

método es principalmente aplicable a muestras de agua con concentracionesaltas (mayores de 5 mg/lt).

Es rápido, fácil y económico, particularmente útil para muestras-

cuya concentración se desconoce . Se alcanza un limite de hasta 0.05 mg/lt,

dependiendo de la normalidad de la solución titulante y del volómen de -

muestra.


El desprendimiento del nitrógeno amoniacal de una muestra se ha-

ce sometiendo la muestra a una destilación en condiciones alcalinas (pH -

de 9.5), el amonio es destilado y absorbido en una solución de ácido bóri

co, para titularse entonces con una solución de ácido valorado.


Se recomienda hacer el análisis lo más pronto posible, para la ob

tenci6n de mejores resultados, deben ser analizados dentro de las 24 ho-

ras siguientes al muestreo, se pueden preservar por adición de 2 ml . de -

H2SO4 ó bien de 40 mg . de HgC1 2 por litro de muestra y almacenarse a 4°C.

para evitar la conversión de nitrógeno orgánico a amoniacal . Si se emplea

la preservación con ácido, neutralice la muestra antes de empezar el aná-

lisis.


A) La urea, ácido glutámico, cianatos, y acetamidas, hidrolizan -

muy lentamente o no lo hacen en las condiciones en que se hace

la destilación.

B) Compuestos volátiles alcalinos, como hidracinas y aminas, pue-

den interferir en los resultados de la titulación.

C) Cloro libre residual debe ser eliminado de la muestra antes de

hacer el análisis (se recomienda emplear tiosuifato de sodio).

D) Compuestos de nitrógeno de fuentes ajenas (muy comunmente del-

aparato de destilación) pueden ocasionar resultados falsos.

V.- Aparatos .

46

A) Aparato de destilación Kjeldahl Laboonoo Corp . o equivalente

quipado con matracas Kjeldahl de 800 ml . de capacidad y matra-

ces erlenmeyer de 500 ml . de capacidad con graduaciones.

VI.- Reactivos.

A) Solución de tetraborato de sodio 0.025M, Pese y disuelva 5 .0

gr. de Na2B407 6 bien 9.5 de Na2B407.10H20 y diluya a 1 it.

B) Solución Buffer de Boratos .- Agregue 88 mi . de solución de . ..

NaOH 0.1 N a 500 mi, de soluoión de tetraborato de sodio.

C) Solución de Hidróxido de sodio 6 N .- Disuelva 240 gr. de NaOH

en 1000 ml . de agua destilada.

D) Solución absorbente de ácido bórico .- Pese y disuelva 20 gr. de

H3BO3 en 1 lt. de agua destilada.

E) soluoión de Indicador Mixto .- Disuelva 200 mg. de indicador

rojo de metilo en 100 ml . de alcohol etílico 6 isopropilico.

Disuelva 100 gr . de azul de metileno en 50 ml . de alcohol etí-

lico 6 isopropílico, combine las dos soluoiones . Prepárese mea

sualmente.

F) Solución de anaranjado de metilo .- Disuelva 0 .125 gr. de recto..

tivo de anaranjado de metilo y afore a 1000 ml.

0) Solución de H2SO4 0.1N.- Diluya 3.0 ml. de H2SO4 concentrado -

en 1000 ml . de agua destilada.

H) Solución de H2SO4 0.02 N.- Diluya 200 ml . de soluoión de H2SO4

0.1 N a 1000 ml . con agua destilada . Eatândarice como sigues

1.- Haga un mínimo de 4 pesadas de carbonato de sodio previamen

te senado a 103 0C, durante dor horas y enfriado en deseca-

dor, de 0,088 ± 0 .001 gr.

2.- Disuelva y pase a matracas Erlenmeyer enjuagando el vaso -

varias veces y adicione los lavados al matraz, agregue agua

destilada hasta ± 100 ml.

3.- Agregue 1 6 2 gotas de anaranjado de metilo.

4.- Titule con la solución de H2SO4 0.02 N hasta el vire de a-

marillo a canela.

5.- Calcule la normalidad del ácido sulfúrico mediante la si-+

guiente fórmulas

47

NH2 SO4 a

DONDE:

B = gramos de Na 2CO2 pesados

C Mililitros de solución de H2SO4 empleados en la titulación.

Haga un promedio de todas las pesadas.

I) Solución de fenolftaleína,- Prepárese Domo en fosfatos totales y orto.

(VI.A.1 .).


A) El destilador Kjeldahl . deberá ser lavado previamente a la deter

minación como sigues

1.- En un matraz Kjeldahl se ponen 500 ml . de agua destilada.

2.- Se agregan•20 ml . de solución buffer de boratos.

3.- Se agregan unas gotas de fenolftalefna.

4.- Se agrega solución de NaOH 6 N, hasta una coloración rosa -

fuerte.

5.- Se adicionan unas perlas de vidrio para controlar la ebull i-

ción.

6.- Se conecta a el aparato de destilación y se destila, recibiera

do el destilado en 50 ml . de ácida bórico, con 0 .5 ml . del -

indicador mixto.

7.- Lave de esta manera hasta que el destilado no presente ningu-

na traza de amonio.

B) Una ves limpio el destilador, se toman 500 ml . de muestra, o una ali--

cuota apropiada llevada a 500 ml . Don agua destilada, y se colocan en

un matraz Kjeldahl.

C) Se sigue exactamente el mismo procedimiento que para el lavado a par-

tir del punto 2.

D) Corra siempre un testigo de agua destilada con cada grupo de muestras.

E) Destile, recibiendo el destilado con el tubo sumergido en la solución

de ácido bórico-indicador mixto hasta un volúmen de 300 ml . como míni-

mo.

F) Titdlese este destilado con solución de ácido sulfúrico 0 .02 N, hasta

el vire verde-gris-violeta.

G) Calcule la conoentraoión de la muestra por medio de la siguiente fór

mula :

48

N(NH3) mg/lt.

(A—B) x N x 14 x 1000

V

DONDNs

A = mi . de H2SO4 gastados a la muestra.

B = ml. de H2SO4 gastados en el testigo.

N = normalidad del H2SO4 titulante.

V = mililitros de muestra.

n.

49

C A P I T U L O

No. I I

RECOMENDACIONES PARA EL ANÁLISIS DE LOS PARÁMETROS

FISICOS — QIIIMICOS MAS IMPORTANTES DE LA CALIDAD

DEL AGUA.

50

CLORUROS

(METODO ABGElTTOMSTEICO)

I.– Alcance y Aplioaoi6n .

-

El método es aplicable a aguas potables superficiales, cuerpos de

agua subterráneos y algunas aguas de deseobo . Cubre un rango de 0.25 a 50

mg/lt, de Cl, un alcance mayor puede lograrse por diluciones de la muestra

original.

II.– Fundamento del Método.

La determinaoión volumétrica de los cloruros se basa en la forma-

ción de una coloración rojiza debida al cremate de plata, cuando al agua

se adicionan iones cremate (indicador) y iones argéntioos (reactivo predi

pitante) .

Como el coeficiente de solubilidad del cloruro de plata ea inferior

al de armaste de plata, el líquido tomará una coloración rojiza, por la –

formación del oloruro de plata, cuando todos los iones cloro estén preci-

pitados. Del voidmen de eoluoión de nitrato de plata titulante gastado se

calcula la concentración de cloruros existentes en el agua.

III.– Muestreo y Almacenamiento.

Se puede muestrear en recipientes tanto de plástico como de vidrio

no requiere de preservaoión especial y es posible el almacenamiento con n

na tolerancia hasta de 7 di ga, manteniendo en refrigeración a 4°C.

IV.– Interferencias.

A) Bromuros, Ioduros, Cianuros y Sulfuros ocasionan interferencias

positivas.

B) Los ortofosfátos y fosfatos interfieren en cantidades mayores

de 25 mg/lt por precipitación del fosfato de plata.

C) Sulfites y Tiosulfatos interfieren, se pueden eliminar mediante

tratamiento con peróxido de hidrógeno.

D) Color, Turbiedad, a tal grado que impidan apreciar el vire de

la titulación.

V.– Aparatos.

No se requieren.

VI.– Reaotivos . A) Solución indicadora de cremate de potasio. Disuelva 50

gr. de g2CrO4 en un litro de agua destilada . Agregue –

solución de nitrato de plata hasta que se forme un pro

5].

oipitado rojo. Deje reposar 12 hrs. filtre y diluya a 1 lt. -

con agua destilada.

B) Solución titulante de Nitrato de Plata 0 .0141 Ns Disuelva

2 .395 gr. de AgNO3 en agua destilada y diluya a 1000 ml . estan

dance como sigues

ESTANDAHIZACICN

1 .- Eeactivoa.

a.- Soluoi6n estándar de NaCl 0 .0141 N.- Disuelva 824.1 mg. de ..

NaCl (secado a 1400 C durante dos horas y enfriado en deseca-

dor) en agua destilada y diluya a 1000 ml.

b.- Solución indicadora de cromato de potasio.

2.- Procedimiento:

a.- Tome 10 ó 20 ml . de solución estándar de NaCl en un matraz ..

Erlenmeyer.

b.- Agregue agua destilada hasta completar aproximádamente 100 ml.

o.- Agregue 1 .0 ml. de solución de cromate de potasio.

* d.- Titule con la solución de Nitrato de plata hasta un vire de á

macillo- rojo salm6n.

e.- Calcule la normalidad de la solución de Nitrato de Plata como

signe :

VI

x N-NAg NO3

V2

DONDEs

V1 - Voldmen gastado de NaCl.

N

Normalidad del NaCl (0 .0141)

V2 - Voldmen gastado de AgNO3

o) Suspensión de Hidróxido de Aluminio .- Disuelva 125 gr. de sul-

fato de aluminio y Potasio Alg(SO4)2 . 12 H20 6 Sulfato de Alu

minio y amonio Al NH4 (SO4 ) 2 . 12 H20 en 1 it . de agua deatilá

da. Caliente a 600C y agregue 55 ml. de NH4OH concentrado len-

tamen te con agitación . Deje reposar la solución 1 hr. aproxi-

mádamente, decante el agua sobrenadante y lave con agua destila

da, deje reposar y vuelva a decantar, haga varios lavados con

agua destilada dejando reposar y decantando sucesivamente hasta

52

que se considere libre de cloro (aproximadamente 6).

D) Soluoión indicadora de fenolftaleina .- Disuelva 0.5 gr. de fe

nolftaleina en 50 ml. de alcohol etílico y agregue 50 ml. de

agua destilada . Agregue después una solución de hidróxido de

sodio 0.02 N hasta que aparezca un tono rosa pálido.

B) Solución de Hidróxido de sodio de NaOH 1N.- Pese y disuelva

40 gr. de NaOH en 1 lt. de agua destilada.

F) Solución de Hidróxido de Sodio NaOH 0 .02 N.- Tome 20 ml . de -

la solución de NaOH 1 N y diluya a l lt.

0) Solución de Acido Sulfdrioo H2SO4 1 N.- Tome 30 ml . de H2SO4

concentrado y diluya a 1 lt.

VII.- Prooedimieto.

A) Si la muestra presenta color o turbiedad trátese como sigues

1.- Tome 100 ml. de muestra.

2.- Agregue 3 ml. de suspensión de Al (OH) 3

3.-- Agite y;deje reposar para que se asiente.

4.- Filtre con papal filtro "Whatman"

5.- Si es necesario repita el procedimiento.

6.- Si es necesario afore a 100 ml . con H20 destilada.

B) Tome 100 ml . de muestra o alícuota llevada a 100 ml . con agua

destilada.

C) Ajuate-,el pH de la muestra 7 y 10 con H2SO4 1 N y/o NaOH 1 N.

D) Agregue 1 .0 ml. de g2CrO4 indicador.

E) Titule con la solución de AgNO3 valorada hasta el vire de ame

rallo a amarillo - rosado (color salmón).

F) Corra un testigo de agua destilada tomando el puento de vire

de dote Domo referencia para loa vires de las muestras.

0) Calcule la concentración de cloruros por la fórmulas

Cl mg/1

-(A - B) x N x 35 450

ml. de muestra

DONDBs

A • ml. de solución de AgNO3 gastada en la muestra.

B • ml. de solución de AgNO3 gastada en el testigo.

N - Normalidad de la solución de AgNO3.

53

DEMANDABIOQUIMICADE OXIGENO

( D B 0 )

I,- Alcance y Aplicación.

Esta prueba se aplica en general s todo tipo de agua, incluyendo

desechos tanto industriales como domésticos . Su principal aplicación es

en los efluentes e influentes de las plantas de tratamiento de agua, así

oomo en diferentes pasos del proceso como parámetro determinants en el -

tratamiento.

II,- Principio del Método.

La determinación de la D B 0 , es una prueba empírica que mide el

oxigeno disuelto consumido por la vida bacteriana al mismo tiempo que la

asimilaoión y oxidación de la materia orgánica presente.

La completa estabilización de una muestra dada puede requerir un

tiempo indefinidamente largo, pero para fines práotiaos, se ha tomado 0ómo tiempo estándar un periodo de 5 días a 20°C en un medio obsouro.


Debido a que la prueba de la D B 0 ea una prueba de la acción baó

teriana, se recomienda hacer la prueba tan pronto oomo sea posible, para

reducir los cambios en el consumo de oxigeno que puedan sucederse entre .el

muestreo y la determinación¡ un tiempo de 24 hrs . se acepta domo toleran

oia, en refrigeración a 4°C ó menos.


A) Muchos desechos industriales traes como componentes agentes -

no biodegradables o bien con ausencia de loa microorganismos

apropiados para la biodegradaoión o con agentes tóxicos a da-

tos, trayendo como consecuencia la ausencia parcial o total -

del consumo de oxigeno.

B) El cloro libre residual debe estar ausente de las muestras.

C) Cuando una muestra contiene sulfuros, sulfitos, o iones ferró

son, pausan una demanda inmediata de oxigeno disuelto (DIOD),

que no es el valor buscado de D B O . El valor arbitrario seleo

oionado para la DIOD, es aquel que tiene la muestra a los 15

minutos de incubación.

V.- Aparatos.

A) Botellas de incubación estandarizadas Winkler con una capaoi$

dad de 300 ml. de tapón esmerilado.

54

B) Incubadora a 20°C + 1, con control de lus que permita la incu

baoióm en la obscuridad.

VI.— Heactivoa.

A) 8eaotivos para el agua de dilución.

1.— Agua destilada de buena calidad.

2.— Solución amortiguadora de Fosfatos .— Pese y disuelva en á

proximadamente 500 ml. de agua destilada loa siguientes:

8.5 gr. de fosfato dihidrogenado de potasio KH 2PO4

21 .75 gr . de fosfato monohidrogenado de potasio K2HPO4

33 .4 gr. de fosfato heptahidratado diaódico hidrogenado

Na2HPO4 . 7 B20

1 .7 gr . de cloruro de amonio NH4C1. Y afore a 1 it . El pH

de esta solución debe ser de 7 .2 sin necesidad de ajuste

posterior.

3o- Solución de sulfato de Magnesio .— Disuelva 22 .5 gr .. de ..

Mg SO4 . 7 H20 en agua destilada y afore a 1 it.

4.— Solución de oloruro de Calcio.— Disuelva 27 .5 gr. da Ca012

anhidro y afore a 1 lt. con agua destilada.

5.— Solución de Cloruro Férrico .— Disuelva 0 .25 gr. de FeC13.6H20

en agua destilada y afore a 1 lt.

6.— Acido Sulfárioo 1 H.— Diluya 30 ml. de H2SO4 concentrado

a 1 it.

T.— Hidróxido de sodio 1 N .— Peas y disuelva 40 gr. de NaOH en

un litro de agua destilada.

B) 8eaotivos para fijar el Oxigeno.

1 .- Solución Sulfato Mangan000.— Pese y disuelva cualquiera de

los siguientes reactivoa$

480 gr. de Mn SO4 . 4 H20

6

400 gr . de Mn SO4 . 2 H20

6

364 gr . de Mn SO4 . H20

Con agua destilada y lleve a 1 it . No debe dar ningdn color

eon el almidón cuando se le añade solución de Ioduro de Po-

tasio'en medio ácido.

2.— Solución de Álcali — Ioduro — Nitraro.— Disuelva 500 gr . de

NaOH (6 700 gr. de KOH) y 135 gr. de NaI (6 150 gr. de KI)

en agua destilada y afore a 1 1t. agregue 10 gr. de ácida

de sodio, NaN3, disuelta en 40 ml . de agua destilada.

55

3.- Acido Sulfdrico concentrado H2SO4.

4.- Almidón.- Prepárese una solución acuosa, añadiendo 5 gr.

de almidón soluble a aproximadamente 800 ml . de agua des-

tilada hirviendo y con agitación, caliéntese unos minutos

más y déjese reposar toda la noche. Usese el sobrenadante

clarificado, presérvese por adición de unas gotas de tolue

no 6 1 .25 gr. de ácido salicilioo por litro.

5.- Solución Patrón de Tiosulfato de Sodio 0 .10 N.- Disuelva

24.82 gr. de Na2S2O3 . 5 H20 en agua destilada hervida y

enfriada y diluya a un litro . Presérvese por adición de

5 ml. de cloroformo 6 1 gr. de NaOH por litro.

6.- Solución estándar de Tiosulfato de Sodio. 0.025 N, prepárá

se por dilución de 250 ml. de la Solución Patrón a 1000 ml.

(6 6.205 gr. de Na2S203 . 5 H20 a 1000 ml.) con agua des -

tilada hervida y enfriada . Se preserva por adición de 5 ml.

de cloroformo. 1 .00 ml . s 200 rg. de OD.

Estandarización de la Solución . Veáse oxigeno disuelto.


,A) Preparación del Agua derDiluci6n.

1.- Teniendo en cuenta el número de muestras a analizar, se pre

para la cantidad necesaria de agua de dilución . Se reco-

mienda sembrar un mínimo de tres diluciones por muestra, y

por duplicado cada dilución en caso de determinarse la —

DIOD, se hace por triplicado.

2.- Una vea calculado el voldmen de agua de dilución requerido

se pone en un garrafón, lo suficientemente grande para in-

troducir un sifón conectado a una comprasdnawde aire lim-

pio, se recomienda colocar siempre una trampa a la via del

aire para asegurarse de ello.

3.- Por cada litro de agua de dilución se añade 1 ml . de las -

siguientes solucionas

Solución Amortiguadora de Fosfatos.

Solución de Sulfato de Magnesio.

Solución de Cloruro de Calcio.

Solución de Cloruro Ferroso.

4.-• Se coneota la corriente de aire, y se deja airear por lo

menos 1 hr.

56

B) Preparación de las Muestras.

1 .• Muestras de agua consideradas como potables, puras o no con

taminadas, generalmente se siembran al 100 `%. En general pá

ra aguas cuyo contenido se desconoce se recomiendan las sir-

guientea dilucioness

TIPO DE

MUESTRA $ DE DIL .

ml . A PIPETEAR

DENTRO DE LA

BOTELLA DE DBO

DBO ESPE

RADA.

0.01 0.03 20000 a 70000Desecho

0.05 0.15 4000 a 14000industrial

0.1 0.3 2000 a

7000concentrado 0.2 0.6 1000 a 3500

0.5 1 .5 400 a

1400

Aguas residuales 1 .0 3.0 200 a

700

Doméstioas 2.0 6.0 100 a

350

5.0 15.0 40 a

140

Efluentea tratados 10.0 30.0 20 a

70

20,& 60.0 10 a

35

Aguas superficiales 50.0 150.0 4 a

14

100.0 300.0 0 a

7

Se coloca la cantidad de muestra requerida para la dilución y se -

completa hasta llenar la botella con agua de dilución, lentamente de tal -

manera que no se formen burbujas ni haya agitación del liquido.

2.- En los casos cuya dilución requiera de menos de 1 mi . de mues :•

tra'deberd hacerse en probeta o matraz aforado, completando con

agua de dilución y de aqui pasar a la botella Winkler.

3.- Los frascos deberán llenarse de tal modo que al taparse se der

rrame unp000 del liquido.

4.- Se corre cuando menos un testigo de agua de diluoi6n por dupli

cado, para ratificar su calidad.

57

5.- Determínese el OD en una de las botellas de cada dilución, y -

la otra se coloca a inoubaoidn por 5 días.

6.- La muestra debe estar bien tapada y libre de burbujas, no debe

tener oontaoto con el aire por lo que siempre se pone agua des

tilada sobre el tapón de la botella (Bello hidradlico).

7.- Para la determinación de la DIOD, caso en el que se debe de há

oer tres veces cada dilucida, se determina el segundo O .D. 15-minutos despuds de determinar el primero.

8.- Determine el O .D. final, a los 5 días y cuantifique la D B 0 --

y la DIOD como sigues

( V 1 - V3 ) FDBO mg/lt.

% Dil. en decimales.

Cuando se determine DIOD.

( V1 - V2 ) FDIOD mg/lt .

-

% Dil . en decimales.

( V2 - V3 ) F. DBO mg/lt. -

%Dilo en decimales.

DONDPI

V1 - ml . de Nat S2 03 gastadas en la titulaoión inioial.

V2 - ml. de N2 S2 03 gastados en la titulación a los 15 min.

V3 - ml. de N2 82 03 gastadas en la titulación al 50. dia.

F, - N x8 z1000 „

Vo

DONDE:

N - Normalidad de la solución de N6 28203.

Vo = VolQmen corregido (factor)

Vo a

300

a

100

A = 98.7300-4

X

58

T U E B I E D A D

(MET0D0S DE U T J •r SiO2)

I,— Alcance y Aplicación.

La determinación de turbiedad se lleva a cabo con dos métodos, el

del turbidimetro Jackson y el del comparador Hellige de turbiedad . Depen-

diendo de la muestra ea el método a emplear . Las muestras de ninguna o po-

ca turbiedad basta una turbiedad media son analizadas primero con el turba

dimetro Hellige el cual reporta la turbiedad de un rango de 0 a 60 ppm

SiO2. Aquellas muestras que por su grado de turbidez no alcanzan a ser leí

das en el Turbidimetro Hellige, son analizadas por medio del Turbidimetro

Jackson, cuyo rango de trabajo ea de 25 a 5000 Unidades Turbidimétrioaa --

Jackson (U T J ).

II.— Fundamento del Método.

El funcionamiento del turbidimetro Hellige, está basado en el paso

de luz a través de una celda de turbiedad que contiene la muestra . Está

provisto de un botón de ajuste con escala, y un visor por el cual se ve el

haz de luz que pasa a través de la muestra . Al iniciar el análisis de esos

la del botón es colocada en cero, apreciándose en el campo de luz un disco

obscuro, se mueve entonces el botón, hasta que el campo se iguale.

La lectura que se tiene en la escala se lleva a gráficas donde nos

da una lectura correspondiente de turbiedad en mg/lt de SiO 2. El turbidime

tro de Jaokson tiene el mismo fundamento del paso de las a través de la --

muestra . En este caso se emplea una vela hecha con cera de abejas y esper -

ma de ballenas, diseñada para quemarse entre 6 .84 y 7.56 gr/hr; colocada

bajo un tubo de vidrio calibrado, mediante un soporte que los mantiene cen

trados en posición vertical . La muestra es entonces vaciada dentro del tu-

bo hasta que la luz producida por la vela desaparezca de la vista . La lec-

tura se hace en la graduación del tubo.


No es recomendable almacenar las muestras. En caso de ser necesario

refrigérese a 40C no mis de 24 horas . Se recomienda siempre analizar el --

mismo dia del muestreo, homogeneizando perfeótamente antes del análisis.

IV.— Interferencias .

A) Material de vidrio sucio.

B) Burbujas de aire, causan errores positivos.

C) Material en suspensión que sedimente rápidamenteo

59

GRASAS Y ACEIThS

(MITODO DE EXTHACCION SOXHLET)


El método se aplica a todo tipo de agua, potable, superficial o --

subterránea, de desechos domésticos e industriales y salinas . Ya que en es

te método la grasa se separa del agua por medio de filtraciones, muestras-

de agua con concentraciones que saturen el medio filtrante no es recomendé

ble analizarlas por date método, así también aquéllas que presentan gran -

des concentraciones de sólidos ocasionando el mismo problema . Tampoco es -

recomendable para muestras cuyos compuestos grasos volaticen a temperatura

oercanas a el punto de volatilización del solvente . Bl método es recomendé

ble dentro de un rango de 5 a 1000 mg/lt. de material extractable.


En este método, la muestra es primeramente acidificada para remo—

ver las grasas y aceites en solución, la grasa es entonces separada por

filtraoi& y extraída con un solvente (hexane), para posteriormente evapo-

rar date y cuantificar gravimdtricamente el material extraído.


Bs muy importante cuidar que la muestra sea representativa ya que-

la característica de las grasas y aceites es agruparse en las superficies-

de los cuerpos de agua formando natas en determinadas zonas . Ya que el --

muestreo es superficial, se hace en frascos de boos ancha, de vidrio para-

evitar la adsorción en las paredes del recipiente.

Es conveniente tomar siempre 1 it . de muestra especialmente para—

esta determinación . Hágase la determinación tan pronto Domo sea posible, -

preservando con 10 ml. de H2SO4 6 HCl concentrado por litro de muestra y -

refrigerando a 4°C, se recomienda no almacenar más de 24 horas.


A) Ya que el método es totalmente empírico, y estâ basado en la ex

tracción que se hace con el solvente (hexane), cualquier com -

puesto soluble en 61, puede ser extraído como grasa y aceite.

B) La precisión del Método depende mucho de llevar a cabo los anO-

lisis siempre, bajo las mismas condiciones de tiempo, reactivos

y temperaturas.

C) Todo el material deberá tener siempre un enjuague adicional del

solvente y evitar el contacto con la piel o cualquier otra cosa

61

V.— Aparatos.

A) Turbidímetro Hellige con bulbo tipo A—O873 y celda de 50 milí-

metros.

B) Turbidímetro Jackson con vela y tubos graduados de 25 a 100 y —

de 100 a 5000 Unidades Turbidímetricas Jackson (UTJ).

VI.— Reactivos.

No se requieren.

VII.— Procedimiento.

A) Turbidímetro Hellige.

1 .— Vaciar la muestra en la celda, debidamente limpia y enjuagó

da con agua destilada, hasta la marca.

2.— Taparla y colocarla dentro del turbidimetro.

3.— Cerrar el aparato, prenderlo.

4.- Con el botón de ajuste en cero de la escala, buscar que apá

rezca el disco obscuro variando las posiciones de ventana abierta o cerrada, y los filtros ya sea obscuro, claro o sin

filtro.

5.— Una vez localizado el disco obscuro, mueva el botón de ajus

te hasta igualar el campo de luz.

6.— Tome la lectura de la escala del botón de ajuste.

7.— Haga la lectura correspondiente en la gráfica adecuada a las

condiciones en que se trabajó (ventana abierta o cerrada, ti

po de filtro y tipo de bulbo).

8.- Reporte el resultado en ppm de 3i0.

B) Turbidimetro Jackson.

1 .— Monte el aparato con los tubos bien limpios y enjuagados con

agua destilada.

2ó.-Prenda la vela.

3.— Agregue poco a poco la muestra a el tubo con el vaso de pre-

cipitado.

4 .— Al aceroarse el punto donde desaparece la luz de la vela es—

recomendable seguir agregando la muestra con pipeta.

5. — Cuando desaparezca la luz de la vela a la vista, tome la lec

tura de la graduación del tubo, al nivel donde haya llegado—

la muestra.

6.— Reports el resultado en U T J.

NOTA: Las UTJ no son equivalentes a las ppm . de SiO2

60

que pudiera contaminar de grasa ocasionando resultados más al--

tos de los reales (se recomienda emplear guantes).

V.- Aparatos.

A) Aparato de extracción Soxhlet equipado con matraces, sistema

de extracción, refrigerantes.

B) Vari Heat oon control de temperatura.

C) Bomba de vacío u otra fuente de vacío.

D) Embudos Buclner de 12 cm . de diámetro.

E) Kitazato de 2 lt.

F) Estufa para secar a 103°C.

G) Desecadores.

H) Balanza analítica con precisión de 0 .1 mg.

I) Estufa de vacío con capacidad para hacer vacío de 15 a 20 -psig y control de temperatura.

VI.- Reactivos.

A) Acido Clorhídrico 6 sulfdrioo concentrado.

B) Solvente Hexano.

C) Suspensión de Diatomeas - Sílice (l flo - super cel 6 equina

lente) . 10 gr. en 1 lt . de agua destilada.


1.- Si la muestra no viene preservada, acidifique oon 10 ml . de

H2SO4 6 HCl concentrado hasta un pH menor de 2.

2.- Preparar un medio filtrante en un embudo buckner con un papel filtrante Whatman No . 40 de 11 cm. de diámetro y filtre

suspensión de diatomeas -ailice hasta la saturaoi6n de los-

poros (oon bomba de vacío).

"3•- Filtre la muestra a través de este medio, recibiendo el fil

trado en un kitazato de 2 lt . de capacidad.

4.- Con pinzas, pase este medio filtrante a un cartucho de celu

loas.

5.- Limpie todo el buckner, y el recipiente donde estuvo la --

muestra especialmente en el cuello de éste dltimo con dis -

cos de papel filtro empapados con hexano.

6.- Colecte todo el papel filtro empleado en el cartucho de ce-

lulosa, evitando el manejo manual.

7.- El filtrado del Kitazato es medido con probeta para cuanti-

ficar el voldmen de muestra.

62

8 .+b Coloque loa cartuchos de celulosa en vasos de precipitado mar

cadoa con el ndmero de muestra y lleve a sequedad metiendo en

la estufa a 103°C por 30 minutes (nunca marque el cartucho).

9.— Coloque los cartuchos en el aparato de extracción Soxhlet, con

el matraz previamente tarado.

10.— Adioione hexano directamente alcartucho, dejando caer el heze

no al matraz, hasta completar el voldmen necesario para dos

oblea. Conecte el aparato y encienda el Vari Heat.

11.— empiece a contar el tiempo de extracción cuando tenga lugar el

primer oislo.

12.— Deje a reflujo por 4 his. controlando las condiciones de tem-

peratura a tener un ciclo cada 3 minutos aproximadamente.

13.— Suspenda el reflujo deje enfriar y vacíe el hexano que quede

en el aparato a el matraz.

14.— Evapore el hexano a baño marla.

15.— Pase a la estufa de vacío y deje el matraz a 15 — 20 psig y

60°C de temperatura por 30 minutos.

16.— Deje enfriar en un desecador hasta peso constante.

17.— Calcule la concentraoión de grasas y aceites por medio de la

eiguimnte fórmulas

GRASAS Y ACEITES mg/lt .

DONDSt

P2 •• 1 x 1000

ml. de muestra

P1

P2

• Peso del matraz vaófo en gr.

Peso del matraz con muestra en gr.

63

S U L F A T O S

(Mls'TODO TURBIDIMIs°PRICO)


El método se aplica a aguas potables, de desecho doméstico e indus

trialea, aguas superficiales y subterráneas . Se cubre un rango de 1 a 40

mg/it de SO4, ampliándose por medio de diluciones.

La ooncentración minima aceptable como estándar es de 1 mg/lt.


El método se basa en la reacción que tiene lugar entre los iones

sulfato y el cloruro de bario en un medio de ácido clorhídrico, para for-

mar un precipitado de sulfato de bario. Este precipitado en suspensión es

adecuado para medidas fotométricas, y proporcional a la concentración de

sulfatos en la muestra.


Se puede hacer el muestreo tanto en recipientes de plástico como

de vidrio. Preserve la muestra a 4°C, en aguas contaminadas con altas con.

centraoiones de materia orgánica, mantenga el pH abajo de 8 .0, para preve

nir la'conversión de sulfitos a sulfatos.


A) Las principales interferencias en este método son el color y -

la turbiedad, ya que la muestra debe estar clara para la medi-

ción fotométriaa . Remueva par filtración. Si la interferencia

es poca, en comparación con la concentración de sulfato, se hece una corrección por dolor . No decolore con hidróxido de aloa

minio.

B) Silice en exceso de 500 mg/lt puede interferir inhibiendo la -

precipitación del sulfato de Bario.

V.- Aparatos.

A) "Speotronia 20" Bauch and Lomb 6 equivalente para usarse a 420

mm. provisto de un paso de luz de 1 cm.

B) Agitador Magnético con capacidad de 0 .2 a 0.3 ml.

C) Reloj con segundero o cronómetro.

VI.- Reactivos.

A) Solución Acondicionadora .- Mezcle 50 ml. de glicerina con una

solución conteniendo 30 ml . de HC1 oonaentrado, 300 ml. de a-

gua destilada, 100 ml. de alcohol etilioo al 95 % 6 alcohol

64

isopropflioo, y 75 gr. de NaCl.

B) Cloruro de Bario Cristales Ba C12 de 20 a 30 mallas.

C) Satándares.

1 .— Solución estándar de sulfato.— Disuelva 147.9 mg. de sulfato

de sodio anhidro en agua destilada y afore a 1000 ml.

1 ml. = 100 pg de SO4.

VII,— Procedimiento.


1 .— Prepare una ourva por dilución de diferentes volúmenes de solu

ción estándar a 100 ml . Se recomienda cubrir un rango de 1 a

40 mg/lt en intervalos de 5 mg/lt es decir 1 .00, 5 .00, 10.00,

15.00, 20.00, 25.00, 30.00, 35 .00 y 40.00 mi. de solución es-

tdndar de sulfatos .

2.— Coloque en matraces erlenmeyer de 250 ml.

3.— Agregue 5.0 ml. de solución aoondioionadora.

4.— Coloque con agitación constante.

5.— Agregue una cucharadas de cristales de BaC1 2 y en ese instante

empiece a contar el tiempo.

6.— Suspenda la agitación a los 60 segundos exactamente, pase s la

celda y lea en el speotronio au absorbancia s intervalos de 30

segundos durante 4 minutos.

7 .— Utilice aquellas lecturas que hayan registrado la turbiedad —

máxima de los estándares para construir la curva de calibración

y graffquela contra las concentraciones de los estándares coa

rrespondientes como sigues

ml. de solución

estándar

eg de mg/lt de SO4

SO4

para 100 ml. de muestra.

0 0 0

1 .00 100 1 .0500 5.0

10,00 1000

~ 10.015.00 1500 15.020.00 2000 20.025.00 2500 25.030.00 3000 30.0

35 .00 3500 35.o40.00 4000 40.0

65

B) Muestras.

1.- Tome 100 ml. de muestra o una aliouota diluida a 100 ml.

con agua destilada en matraces erlenmeyer de 250 ml .co-

rriendo un testigo don 100 ml . de agua destilada.

2.- Siga exactamente el mismo procedimiento que para la cur-

va de calibración, registrando laa leoturas más altas de

las muestras.

3.- Lea en la curva las concentraciones correspondientes, ya

sea en mg/lt directamente, o bien en pg de SO4 y aplicando

la fórmula'

SO4

mgflt =pg de 304 ( de la gráfica )

ml . de muestra.

66

CODTDUCTIVIDAD


El análisis de conductividad se aplica a todo tipo de aguas . La una

prueba rutinaria dentro del control de la calidad del agua destilada cuya —

conductanoia se encuentra entre 0 .5 y 2 pmho/om . El agua potable debe tener-

una oonduotividad entre 50 y 1500 pmho/om . El rango máYimo alcanzado por el-

aparato es de 2,500 .000 pmho/om.

II.- Fundamento del Método.

La conductividad ea una medida de la oapaoidad de una muestra o so--

luci6n para conducir la corriente eléctrica, dependiendo ésta de la natura-

leza y concentración de las substancias disueltas en la muestra o soluoi6n .-

El aparato estandarizado para medirla es un conduotímetro cuyo funcionamien-

to es por medio de un puente de Wheatstone conectado a una celda de conduc-

tancia el cual da los valores de conductividad directamente en ¡amho/cm . para

una temperatura de 25 0C. Cuando la temperatura de la muestra o solución di-

fiere de 25°C es necesario hacer una correción del valor de conductividad ob

tenido por medio de tablas.


Puede muestrearse en recipientes de vidrio o pléstico . Se recomienda

hacer el análisis tan pronto como sea posible . Cuando sea necesario almaoe -

nar refrigérese a 4°C no más de 24 hrs . teniendo el recipiente hSrfeétioamen-

te cerrado.


El método no muestra interferencias en si . En general para obtener -

buenos resultados se debe tener una celda bien limpia, oheoarla frecuentemen

te.

V.-Aparatos .

A) Conduotimetro modelo YSI con celda de conductividad con electrodo

de platino y K = 1,6 equivalente.

B) Termómetro.

VI.-Eeaotivos.

A) Solución Esténdar de Cloruro de Potasio para cheoar la celda de-

conductividad.- Disuelva 745 .6 mg. de KC1 anhidro en agua desti-

lada cuya conductividad sea de 1 pmho/om . como máximo y afore a-1000 ml . Bata solución tiene una conductividad de 1413o/cm.a 25°C.

67


A) Prenda el aparato debidamente conectado a la celda, y deje calen—

tar por 5 minutos.

B) Enjuague la celda e introduzca en la muestra sumergiendo la cel-

da completamente, sin que quede ninguna burbuja de aire dentro de

ella.

C) Busque la sombra máxima primero oon el botón de ajuste grueso y

después con el ajuste fino.

D) Tome la lectura directamente del aparato en pmho/om . también tome

la temperatura de la muestra.

E) Haga corrección de temperatura y/o de constante de la oelda en e.g.

so neoeaarío.

F) Reporte en pmho/em .

68

E S T R E P T O C O C O S

(TECNICA DE DILUCION EN TUBOS MULTIPLES )

I,- Alcance y Aplicaoión.-

La técnica de dilución en tubos múltiples para determinación de Es-

treptococos, es aplicable a todo tipo de aguas . Su presencia en aguas da

una completa seguridad de contaminación fecal . Por tener un periodo de su

pervivencia mda corto que el grupo coliforne, la presencia de estrept000+

cos indica una contaminación fecal reciente, ya que no se les encuentra -

en aguas limpias o lugares fuera del contacto humano . Su identificación -

puede dar una idea de la fuente de contaminación de que provienen . Su alta

reaistenoia a bactericides los hace especialmente peligrosos para la salud

pdblica, siendo de especial aplicación en estudio de aguas de albercas, -

balnearios y de aguas salobres.


La identificación de Estreptococos se hace por medio de la propiedad

qua tienen éstos de formar ácido con la dextrosa, sembrándose en un medio

rico en ella, y la formación de ácido se hará evidente por la presencia -

de turbiedad en el medio . La presencia de estreptococos se confirma por la

proliferaoión que tienen dates en un medio de cloruro de éodio con azul -

de metileno - agar - leche y 40 % de bilis. Reportándose en MMP/100 ml.

de muestra.

III .- Definiciones.

1.- Estreptococos Fecales.- Es sinónimo de "Grupo D Estreptococos de

Lancefield" . Son cocos, gram positivos, agrupados en pares o cadenas aor-

tas, crecen en presencia de sales biliares, producen acidez pero no gas,

en manitol y lactosa.

2.- NMP/100 ml . de muestra. Es el número aproximado de bacterias que

existen en 100 ml. de muestra . NMP (Ndmero Más Probable).

IV.- Aparatos y Equipos,

1.- Incubadoras que mantengan temperatura constante y uniforme en tó

das sus áreas con termostato y termómetro de funcionamiento per-

fecto.

2.- Estufas de esterilización con capacidad para alcanzar temperatu-

ras en el rango de 160 a 180 0C.

69

3.- Autoclave para esteriliaaoión a temperatura de 121°C o mayor y

suficiente capacidad para evitar amontonamiento de material o

reaotivoa.

4.- Potenoiómetro con una exactitud de 0 .1 unidades de pH.

5.- Balanza con una exactitud de 0.1 gr. como mínimo.

6.- Pipetas graduadas, cuyo error de calibración no exceda del . ..

2.5 %

7.- Recipientes para pipetas, pipeteros, de acero inoxidable o -

bien papel aluminio o papel kraft.

8.- Frascos de dilución de vidrio de .borosilicato con tapón eame*

rilado.

9.- Tubos de ensayo para la fermentación de la aapaoidad necesaria

(25 x 200 mm, 25 x 150 mm, 20 x 150 mm) de cristal pyrex con

tapón.

10.- Asas de siembra, de cromo o platino - iridio con un diámetro -

minino de 3 mm.

11.- Gradillas metálicas, algunas con forro de plástico para evitar

la oxidación en los banca.

12.- Mecheros Bunsen de alto poder.

Notas Todo el matrial a usarse debe ser de vidrio de borosilicato o acere

inoxidable, libre de residuos o cualquier material entraño.

V.- Material y Reactivos.

1.- Agua destilada o desmineralizada, oompletamente libre de trazas

de metales disueltos o compuestos bactericidas o inhibidores.

2.- Medios de cultivo.- Estos medios se encuentran preparados comer

cialments, en forma deshidratada, y se preparan hidratando y -

esterilizando de acuerdo a las inatruooicnea del fabricante.

A) Caldo Asida Dextrosa .- Que en 1 it. de agua destilada consta de:

Extracto de carne 4.5 gr.

Triptona 6 Polipeptona 15.0 gr.

Glucosa 7 .5 gr.

NaCl 7 .5 gr.

Asida de Sodio NaN3 0.2

gr .

70

Con un pH de 7.2 después de la esterilización.

B) Caldo Asida de Violeta de Etilo (EVA) . Que en 1 lt . de agua destilada

consta de=

Glucosa 5.0 gr.

Triptona 20.0 gr.

NaCl 5.0 gr.g2HPO4 2.7 gr.

KH2PO4 2.7 gr.

Ma N3 0.4 gr.

Violeta de Etilo 0.00083 gr .

Con un pH de 7.0 deapuéa de la esterilización.

3 .— Agua de diluoióna

A) Solución Madre de Fosfatos .— Disuelva 34 gr. de fosfato monobdsico de

potasio (K H2 PO4) en 500 ml . de agua destilada, ajustando el pH a 7.2

NaOH 0.1 N y diluya a 1 lt. con agua destilada.

B) Solución de Sulfato de Magnesio .— Disuelva 50 gr. de sulfato de magne-

sio, Mg 504 . 7 H20 en 1 lt . de agua destilada.

C) Agua de dilución .— A 1 lt . de agua destilada agregue 1 .25 ml . de solu-

ción madre de fosfato y 5.0 ml . de Sulfato de Magnesio. Vaoie en frascos

o tubos de tal manera que permita tener cantidades de 99 ± 2 .0 ml. 6

9 ± 0.2 ml . despuéa de esterilizar en autoclave durante 15 minutos.

VI.— Preparación y Conservación de la Maestras

! .— La muestra daba tomarse en frasco de vidrio resistente, de ta-

pón esmerilado de boca anona, perfectamente lavados, enjuagados

oon agua destilada y esterilizados a 121°C por 30 minutos. A el

frasco se agrega ya de rutina, tiosulfato de sodio previo a la

esterilización a razón de 100 mg/lt de muestra, oomo agente de

olorinante.

2.— Debe tenerse buen cuidado en que al muestreo sea representativo

en frecuencia y lugar. Hl frasco debe esterilizaras tapado y —

71

mantenerlo asf. En el momento del muestreo el frasco se sumerge -

cerrado con la boca abajo y se destapa dentro del agua, se gira -

de modo que el cuello quede ligeramente más elevado que la base y

dirigida contra la corriente . Se deja llenar hasta 2/3 partes, se

taps y se saca.

3.- Para muestrear llaves y tomas de agua es necesario purgar primero

el sistema, dejando correr el agua a toda su capacidad durante 2-

a 3 minutos, cerrando entonces la llave hasta donde sea necesario

para tomar la muestra sin que se derrame . Todas las muestras de -

ben ir acompañadas de un informe de campo . donde se anote sus da -

tos exactos de identifioaoián y deaoripoi6n.

4.- B1 análisis debe hacerse inmediatamente después del muestreo, de-

no ser posible, refrfgerese a 4°C por un máximo de 6 horas.

VII.- Interferencias.

1.- Aguas con alto contenido en metales pesados como cobre o fie-

rro causan efectos de toxicidad . Se debe agregar un agente --

quelante que reduzca la toxicidad al frasco de muestreo antes

de la esterilizaoidn . Como PDTA a razón de 327 mg/lt de mues-

tra.

2.- Los problemas más freáuentes son causados por mala esteriliza

oi6n, material sucio, inadecuado control en la temperatura o-

contaminaoi6n por alguna fuente externa.

3.- Bl tiempo de supervivencia en el agua, no está determinado a-

decuadamente, por lo que es muy importante el análisis de las

muestras lo más pronto posible.

VIII.- Procedimiento;

1 .- Prueba presuntiva.

A) Al igual que en el análisis de coliforms totales y fecalesse hacen 3 o más diluciones múltiplos de 10, y por cada diluoidn 3 6 5 tubos.

B) Se inocula la muestra en la serie de tubos de fermentación

con caldo anida dextrosa . Mezclar cuidadosamente.

C) Se colocan a inoubaoi6n a 35 + 0 .5°C.

72

D) Transcurridas 24 + 2 hrs. se observan los tubos ; loa tubos que

presentan turbiedad se consideran positivos . Aquellos que no -

presentan turbiedad se colocan a incubación por 24

hr . mds.

B) Trasourridas 48 ± 3 hrs. se vuelve a hacer la lectura de loa •N

tubos. Aquellos que presentan formaoión de turbiedad se consi-

deran positivos, estreptococos fecales presentes . Los que no -

presentan ninguna turbiedad, tubos negativos, estreptococos fe

Gales ausentes.

2) Prueba confirmative.

A) Los tubos positivos de la prueba presuntiva son inoculados con

una asa en tubos con caldo de anida - etil - violeta de etilo

(EVA).

B) Be ooloaan a incubación a 35 10.5 °C.

C) Transcurridas 24 ± 2 hrs. se observan los tubos, la presencia

de turbiedad o la formación de un botón púrpura en el fondo de

al tubo se considera prueba positiva, estreptococos fecales -

presentee . En caso contrario se colocan nuevamente a incubación.

D) Al cabo de 48 ± 3 hrs . de incubaoión se observan loa tubos nue

vamente, la presencia de turbiedad o la formación de un botón

púrpura en el fondo del tubo, tubos positivos, estreptococos -

fecales presentes, tubos negativos cuando no hay presencia de

turbiedad ni formación de botón púrpura en el fondo del tubo.

IX.- Cálenlos .

1.- La forma de interpretación, lectura y expresión de resultados

es exactamente igual que para la determinación de ooliformes

totales.

2.- Las lecturas se hacen en la misma tabla que para ooliformea

totales, se puede estimar también por medio de la fórmula sin

ple de Thomas.

73

COLIFORMES FECALES

(METODO DE TUBOS DE FERMENTACION)

1.- Alcanoe y Aplicación.

El análisis de Coliformes Fecales se aplica a todo tipo de aguas,

cuando se investiga contaminación de cuerpos de agua . No se debe usar nun-

ca como un sustituto del análisis de coliformes totales ya que las bactese

risa coliformes proceden de muchas fuentes y no se ha encontrado ninguna -

correlaoión entre unos y otros.

2.- Fundamento del Método.

El análisis está basado en el hecho de la fermentación de la lac-

tosa con producción de acidez y gas, elevando la temperatura de la prueba

para la separación de organismos del grupo coliforme, en loe de origen feo

cal y loa derivados de otras fuentes . Reportándose en la misma forma que -

los coliformes totales (como NMP/100 ml . de muestra).

3.- Definiciones.

3.1 . Coliformes Fecales .- Los coliformes fecales comprenden todas

aquellas bacterias aerobias ó facultativas anaeróbioas gram-negativas, no

eeporuladaa con forma de bastones de origen fecal que fermentan la lactósa

con formación de gas dentro de 48 hrs . a 35 + 0.5 y 44.5°C .

3.2. liMP. Es el número de bacterias coliformes aproximado que e=ia

te en un volúmen determinado de muestra . Como medida estándar se tiene . ..

NO/100 ml. de muestra.

4,.. Aparatos y Equipos.

4.1 .- Incubadora que mantenga temperatura constante y uniforme en

todas sus áreas, por medio de circulación de aire 6 mediante baño de agua

con termostato y termómetro de perfecto funcionamiento.

4.2.- Estufas de esterilización con capacidad para alcanzar tempo

ratura en el rango de 160 a 180°C.

4.3.- Autoclave para esterilización a temperatura de 121°C o ma-

74

yor y de suficiente capacidad para evitar amontonamientos de material o --

reactivos.

4.4.- Potenciómetro con una exactitud de 0 .1 unidades de pH.

4.5 .- Pipetas graduadas, cuyo error de calibración no exoeda del.

2.5%.

4.6.- Recipientes para pipetas, pipeteros de acero inoxidable o

bien papel kraft.

4.7.- Frasco de dilución de vidrio de borosilicato con tapón esme

rilado.

4.8.- Tubos de ensaye para la fermentación de la capacidad necesa

ria (25 x 200-mm, 25 x 150 mm, 20 x 150 mm) de cristal pyrex con tapón.

4.9.- Tubos Durham o de Hem6lisis.

4.10.- Asas de siembra, de cromo o platino - iridio con un diáme,

tro mínimo de 3 mm.

4.11 .- Gradillas metálicas, algunas con forro de plfistioo para e-

vitar la oxidación, en los baños.

4.12.- Mecheros bunsen de alto poder.

NOTAS Todo el material a usarse, debe ser de vidrio de borosilicato o ace-

ro inoxidable, libre de residuos o de cualquier material extraño.

5.- Materiales y Reaotivos.

5.1 .— Agua destilada o deamineralizada, completamente libre de

trazas de metales disueltos 6 compuestos bactericidas 6 inhibidoree.

5.2.— Medios de Cultivo . Estos medios se encuentran preparados comercialmente, en forma deshidratada, y se preparan, hidratando y esterili-

zando, de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

5.2.1 .- Caldo Lactosado 6 Caldo de Lauril Triptosa.

5.2.1 .1 .- Caldo Lactosado. Que en 1 lt . de agua destilada consta

des

Extracto de carne 3.0 gr.

Peptona 5.0 gr.

Lactosa 5.0 gr .

Con un pM de 6 .9 + 0.1 después de la esterilización.

75

5.2.1 .2.— Caldo de Lauril Triptosa. Que en 1 lt. de agua destila

consta des

Triptosa 20.0 gr.

Lactosa 5.0 gr.

Fosfato Dipotisico hidrogenado K 2HPO4 2.75 gr.

Fosfato

de Potasio dihidrogenado KH2PO4 2.75 gr.

Cloruro de sodio MaCl ' 5.0 gr.

Lauril — Sulfato de Sodio 0.1 gr.

Con un pH de 6 .8 despuds de la esterilización .

5.2.2.— Medio E.C. Que en 1 it. de agua destilada consta de:

Triptosa o Tripticosa 20.0 gr.

Lactosa 5.0 gr.

Mezcla de sales biliares 1 .5 gr.

K2 HPO4 4.0 gr.

KH2PO4 1 .5 gr.

Cloruro de Sodio 5.0 gr.

Con un ppH de 6 .9 después de la esterilización.

5.3.— Agua de Dilución.

$.3.1 .— Solución Madre de Fosfatos.— Disuelva 34 gr. de fosfato —

monobásioo de potasio ( K H2 PO4 ) en 500 ml. de agua destilada, ajustando

el pH a 7 .2 con NaOH o .1 M 'y diluya a 1 it. con agua destilada.

5 .3.2.— Solución de Sulfato de Magnesio .— Disuelva 50 gr. de.h . ..

Mg SO4. 7 H20 en 1 it. de agua destilada.

5.3.3 .— Agua de dikadión.— A 1 it. de agua destilada agregue 1 .25

ml . de solución madre de Fosfatos y 5 .0 ml . de sulfato de magnesio . Vacíe

en frascos y tubos de tal manera que permita tener cantidades de 99 + 2.0

ml . 6 9 + 0.2 ml. despuds de esterilizar en autoclave durante 15 min

6.— Preparación y Conservación de la Muestra.

6,1,— La muestra debe tomarse en frascos de vidrio resistente, de

tapón esmerilado de boca ancha, perfectamente lavados, enjuagados con agua

76

destilada y esterilizados a 121°C por 30 minutos . A el frasoo se agrega,

ya de rutina, tiosulfato de sodio previo a la esterilizaoi6n a razón de

100 mg/lt de muestra, como agente declorinante.

6.2. Debe tenerse buen cuidado de que el muestreo sea representativo

en frecuencia y lugar. El frasoo debe esterilizarse tapado y mantenerse -

asi; en el momento del muestreo, el frasoo se sumerge cerrado con la boos

hacia abajo y se destapa dentro del agua, se gira de modo que el cuello -

queda ligeramente más elevado que la basé, y dirigido contra la corriente.

Se deja llenar hasta 2/3 partes, se tapa y se saca.

6.3.- Para maestrear llaves y tomas de agua es necesario purgar pri-

mero el sistema, dejando correr el agua a toda su capacidad durante 2 a 3

minutos, cerrando entonces la llave hasta donde sea necesario para tomar

la muestra sin qua se derrame. Todas las muestras deben ir acompañadas de

un informe de campo donde se anoten sus datos exactos de identiftcaoi6n y

descripción.

6.4.- El análisis debe hacerse inmediatamente después del muestreo,

de no ser posible, refrigérese a 4°C por un máximo de 6 horas.

7.- Interferencias.

7.1 .- Agua . con alto contenido en metales pesados como cobre o fierro,

causan efectos de toxicidad. Se debe agregar un agente quelante, que la -

reduzoa, al frasco de muestreo antes de la esterilización. Por ejemplo

SDTA a razón de 327 mg/lt de muestra.

7.2.- Loa problemas más frecuentes son los causados por mala esterili

nación, mate*ial sucio, inadecuado *control en la temperatura o contamina-

oión por alguna fuente externa.

7 .3.- Algunas otras bacterias como las pseudomas dan resultados iguá

lea a los coliformea fecales.

8.- Procedimiento.

8.1 .- El procedimiento en el análisis de conformes fecales consta de

dos pruebas, la presuntiva y la confirmativa, solamente . La prueba pro-

77

suntiva es exactamente en la misma forma que para coliformes totales, difi

riendo tan solo en la prueba confirmativa en el medio de cultivo y la tem-

paratura de incubaoión . De tal forma que una sóla prueba presuntiva es ne-

cesaria para la determinaoión de coliformes fecales y totales.

8.2.- Prueba Presuntiva.

8.2.1 .- Se utilizan 3 diluciones o más, múltiples de 10, con 3 a-

5 tubos por cada diluoión.

8.2.2.- Se inocula la muestra con las diluciones escogidas en tu-

bos de fermentaoidn con caldo lactosado :o Câldo de Lauril Triptosa. Mezcle

cuidadosamente.

8.2 .3.- Se colocan los tubos a inonbaoi6n a 35 jr 0.5°C.

8.2.4.- A las 24 ± 2 hrs ., se observan loa tubos agitando suave -

mente . Tubos oon formación de gas se consideran positivos . Los Tubos sin -

formaoi6n de gas se dejan en inoubaoidn otras 2412 hrs.

8.2.5.- Los tubos que despuds de 48 ± 3 hrs. de incubación no pre

senten formaoi6n de gas se consideran negativos grupo coliforme total au -

sente y por lo tanto grupo fecal ausente . Los tubos que a las 24 ± 2 o bien

a las 48 ± 3 hrs . presentan formaoi6n de gas se consideran positivos grupo-

coliforme presente, suceptible de tener grupo coliforme fecal presente.

8.3.- Prueba Confirmativa.

8.3 .1 .- pe los tubos positivos de la prueba presuntiva, resembrar-

inoculando con asa en medio B.C.

8.3.2.- Colocar los tubos a inoubaoi6n a 44.5 ± 0.2°C en baño ma -

ria. El nivel del agua de la incubadora debe ser lo suficiente para sumer -

gir los tubos por arriba del nivel del medio . Dejar en inoubaoi6n por 24 +

2 hrs .

78

8.3 .3.— Leer a las 24 ± 2 hrs. Los tubos con formación de gas se

consideran positivos, grupo coliforme fecal presente . Los tubos que no pre

rentan formación de gas grupo coliforme fecal ausente, lo que significa --

que la fuente del grupo coliforme no son desechos de animales de sangre ca

liente.

9 .— Cálculos.

9.1 .— La forma de Interpretación lectura y expresión de resultados

es exactamente igual que para la determinación de coliformes totales.

9.2.— Las lecturas se hacen en la misma tabla que para coliformes

totales, en caso de no encontrarse aquí la lectura, se puede estimar también

por medio de la fórmula simple de Thomas.

79

COLIFO$MES TOTALES

(MÉTODO DE TUBOS DE FEEMENTACION)

1.- Alcance y Aplicación.

La prueba bacteriológiaa. para detección de coliformes totales se

aplica a todo tipo de agua.

Está reconocida como norma oficial y se ha establecido como un ea

tándar de la calidad bacteriológica de las aguas . Los resultados se repor-

tan como N .M.P.

2.- Fundamento del Método.

El método se basa en el hecho que el grupo coliforms, que está -

presente en loe intestinos y feces de animales de sangre caliente incluyen

organismos capaces de fermentar la lactosa produciendo gases y acides en -

un medio de cultivo especifico.

3.- Definiciones.

3.1 .- Coliformea . El grupo de coliformes comprende todas aquellas

bacterias aeróbiaa 6 facultativas anaeróbicas gram - negativas, no esporu-

ladas con forma de bastones que fermentan la lactosa con formación de gas

dentro de 48 brs . a 35°C.

3.2.- H.M.P. Es el ndmero de bacterias coliformes aproximado que

existen en un voldmen determinado de muestra . La medida estándar es el lid-

mero Más Probable (H.M.P.) en 100 ml. de muestra.

4.- Aparatos y Equipos.

4.1 .- Incubadoras que mantengan temperatura constante y uniforme

en todas sus áreas, ya sea por medio de circulación de aire ó de preferen.

cis, mediante baño de agua, con termostato y termómetro de perfecto funoió

namiento .

4.2.- Estufas de esterilización con capacidad para alcanzar tem-

80

peraturas en el rango de 160 a 180°C.

4.3.- Autoclave para esterilización a temperatura de 121°C 6 ma-

yor y de suficiente capacidad para evitar amontonamientos de material 6 -

reactivos .

4.4.- Potenciómetro con una exactitud de 0 .1 unidades de pH.

4.5.- Balanzas con una exactitud de 0.1 gr. como minimo.

4.6.- Pipetas graduadas, cuyo error de calibración no exceda del

2 .5%.

4.7.— Recipientes para pipetas, pipeteros de acero inoxidable 6

bien papel aluminio 6 papel Kraft.

4.8.- Frascos de dilución de vidrio de borosilicato con tapón es

merilado.

4.9.- Tubos de ensaye para la fermentación de la capacidad nece-

saria (25 x 200 mm., 25 x 150 mm., 20 x 150 mm .) de cristal Pyrex con ta-

pón.

4.10.- Tubos Durham o de hem6lisia.

4.11 .- Asas de siembra, de cromo 6 platino - iridio - con un d1á

metro minima de 3 mm.

4.12.- Gradillas metâlicas, algunas con forro de plástico, para

evitar la oxidación, en los baños.

4.13.- Mecheros Bunsen de alto poder.

4 .14.- Cajas Petri de unos 100 mm. de diámetro y paredes de unos

15 mm.

NOTAt Todo el material a usarse, debe ser de vidrio de borosilioato 6 ace

ro inoxidable, libre de residuos 6 cualquier material extraño.

5.- Materiales y Reactivos .81

5.1 .- Agua destilada 6 desmineralizada, completamente libre de -

trazas de metales disueltos 6 compuestos bacterieidas 6 inhibidores.

5.2.- Medios de Cultivo .- Estos medios se encuentran preparados

comercialmente, en forma deshidratada, y de preparan, hidratando y estera

lizando, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

5.2.1 .- Caldo Lactosado 6 caldo de Lauril Triptosa.

5.2.1 .1 .- Caldo Laotosado, que en 1 lt. de agua destilada consta

des

Extracto de Carne 3.0 gr.

Peptone 5.0 gr.

Lactosa

5.0 gr.

Con un pH de 6.9 + 0.1 después de la esterilización.

5.2.1 .2.- Caldo de Lauril Triptosa . Que en 1 It. de agua destiló

da 'sonata des

Triptosa 20.0 gr.

Lactosa 5.0 gr.

Fosfato Dipotáeico hidrogenado gePo4 2.75 gr.

Fosfato de Potasio dihidrogenado KH2PO4 2.75 gr.

Cloruro de Sodio NaCl 5.0 gr.

Lauril Sulfato de Sodio 0.1 gr.


5.2.2.- Caldo laotosado Bilis Verde Brillante (LBOB) . Que en 1 -

It . de agua destilada consta des

Peptona 10.0 gr.

Lactosa 10.0 gr.

Verde Brillante 0.0133 gr.

Bilis de Buey deshidratada 20.0" gr.


82

5.2.3.— Agar Eosina Azul de )Estilen (B A M) 6 Agar B N D O.

5.2.3 . 1 .— Agar Tonina Azul de Metileno (E A M) . Que en I it. de

agua destilada consta des

Peptona 10.0 gr.

Lactosa 10.0 gr.

Fosfato dipotdsico hidrogenado K 2HPO4 2.0 gr.

Agar 15.0 gr.

Bocina 0.4 gr.Azul de Metileno 0 .065

gr.

Con un pH da 7.1 después de la esterilización.

5.2.3.2 . — Agar B N D O . Que en I it. de agua destilada consta del

Peptona 10.0 gr.

Lactosa 10.0 gr.

Fosfato hidrogenado dipotásioo K 2HPO4 3.5 gr.

Agar 15.0 gr.

Sulfito de Sodio 2.5 gr.

Fucaina básica


0.5 gr.

5.2.4. —Agar Inclinado. Para el que continuamente se usa el Agar

Nutritivo, que en 1 lt. de agua destilada consta de s

Extracto de Carne 3 .5 gr.

Peptona 5.0 gr.

Bacto — Agar 15.0 gr.

Con un pH de 6.8 a 7 .0 después de la esterilización.

Beactivos para Tincida de Gram.

5.3.1 .— Cristal violeta.

5.3.1 .1 .— Disuelva 2 gr . de cristal violeta (90 % de contenido

83

seno) en 20 ml . de alcohol etilico al 95 %.5 .3 .1 .2 Disuelva 0.8 gr. de oxalato de amonio monohidratado en

80 ml. de agua destilada.

5.3.1 .3.- Mezcle las dos soluciones y deje reposar por 24 hrs. -

antes de usarla; filtre a través de papel dentro de un frasco dmbar.

5.3.2.- Solución de Lugol .- Triturar 1 gr . de cristales de iodo

y 2 gr. de ioduro de potasio en un mortero.

Trasferir a un matraz erlenmeyer de 500 ml . Adicionar ag

gas destilada en pequeñas porciones, mezclando bien después de cada adición

hasta completar un voidmen total de 300 ml.

5 .3.3 . Soluoión de Safraraina. Disuelva 2 .5 gr. de safraniaa en -

100 ml. de alcohol etílico al 95 % Agregar 10 ml . de la solución aloohóli

ca de safrantna a 100 ml. de agua destilada.

5.3.4.- Alcohol - Acetona . Mazola voldmenes de alcohol etílico -

al 95 % y acetona.

5.4.- Agua de dilución.

5.4.1 .- Solución Madre do Fosfatos . Disuelva 34 gr.- de fosfato mo

nobásico de potasio (YH2PO4) en 500 ml . de agua destilada, ajustando el pH

a 7 .2 con NaOH 0.1 B 'y diluya a 1 it. den agua destilada.

5.4.2.- Solución de Sulfato de Magnesio. Disuelva 50 gr . de Sul*

fato de Magnesio, MgSO4 . 7 H20 en 1 it. de agua destilada.

5.4.3 . Agua de Dilución . A 1 It. de agua destilada agregue 1 .25ml. de solución Madre de fosfatos y 5.0 ml. de magnesio. Vacíe on frascos

o tubos de tsl manera que permita tener cantidades de 99 + 2 .0 ml. 6 . . ..9 ± 0 .2 ml . después de esterilizar en autoclave durante 15 minutos.

6.- Preparación y Conservación de la Muestras

6,1 .- La muestra debe tomarse en frascos de vidrio resistentes,

de tapón esmerilado de boca ancha, perfectamente lavados, enjuagados con

agua destilada y esterilizados a 121 0C por 30 minutos.

A el fraaoo se le agrega, ya de rutina, tioaulfato de sodio

previo a la esterilización a razón de 100 mg/lt . de muestra, como agente

deolorinante.

6.2.- Debe tenerse buen cuidado en quo el muestreo sea represen-

tativo en frecuencia y lugar. Ml frasco debe e ;dterilizarse tapado y mente

84

verlo eai, en el momento del muestreo el frasco se sumerge cerrado con la

boca hacia abajo y se destapa dentro delvgua, se gira de modo que el cue

110 quede ligeramente mis elevado que la base, y dirigido contra la co-

rriente. Se deja llenar 2/3 partes, se tapa y se saca.

6.3.- Para maestrear llaves y tomas de agua es necesario purgar

primero el sistema, dejando correr el agua s toda au oapaoidad durante 2

6 3 minutos, cerrando entonces la llave hasta donde sea necesario para to

mar la muestra sin que se derrame . Todas las muestras deben ir acompaña-

das de un informe de campo donde se anoten sus datos exactos de identifi-

cación y descripción.

6.4.- El análisis debe hacerse inmediátamente después del mees--

treo, de no ser posible refrigérese a 4°C . por un máximo de 6 hrs.

7.- Interferencias.

7.1 .- Aguas con alto contenido en metales pesados como cobre ó

fierro, causan efectos de toxicidad . Se debe agregar un agente quelante -

que reduzca la toxicidad al ' frasco de muestreo antes de la esterilizaoi6n.

Por ejemplo E D T A a razón de 327 mg/lt de la muestra.

7.2.- Loa problemas más frecuentes son loe causados por mala ese

terilizaoión, material suoio, inadecuado control en la temperatura 6 con-

taminaoi6n por alguna fuente externa.

7.3.- Algunas otras bacterias oomo loe pseudomas dan resultados

iguales a los ooliformes fecales.

8.- Procedimientos

Se utilizan series de tubos, haciendo la prueba siempre con 3 di-

ferentes diluciones, siendo datas mdltipbes de 10 (por ejemplo 10, 1, 0 .1

ml .) y por Dada dilución debe haber 3 6 5 tubos. La determinación consta

de tress pruebass

8.1 . Prueba Presuntiva

85

8.1 .1 . Las diluciones a tomar para la prueba dependen del tipo —

de muestra, y la cantidad y concentración del medio estará de acuerdo al

voidmen de muestra tomado, de tal manera que la adición de la muestra al

medio en el tubo de fermentación no reduzca la concentración de loe ingre

dientes del medio de cultivo.

8.1 .2.— Se inocula la muestra en la serie de tubos de fermentación

con caldo laotosado 6 caldo lauril triptosa como medio. Mezolar cuidadosa

mente .

8.1 .3.— Se meten los tubos a incubación a 35 ± 0 .5°C.

8.1 .4.— La primera lectura se hace a las 24 ± 2 hrs., se agitan

suavemente loa tubos y se examinan. Loa tubos que presentan formación de

gas se consideran positivos . Loa tubos que no presentan formación de gas

se vuelven a incubar otras 24 ± hrs.

8.1 .5.— Transcurridas 48 ± 3 hrs. de incubación, se hace la se-

gunda lectura . Los tubos que no presentan formación de gas, se consideran

negativos, ausencia de conformes, y se dará por concluido el análisis.

Si por el contrario presenta formación de gas, se consideran positivos y

hay presencia de ooliformee.

8.2.— Prueba confirmativa:

8.2.1 .— Todos los tubos que resultaron positivos, se resiembran,

con asa, en tubos de fermentación con bilis verde brillante (LBvB) como

odio de cultivo.

8.2.2.— Se meten s incubación a 35 ± 0.5 °C.

8.2.3 .— Se hace la primera lectura a las 24 ± 2 hrs. La presencia

de gas, tubos positivos . Los tubos con ausencia de gas se incuban otras 24

2 hrs .

8.2.4.— Transcurridas 48 ± 3 hrs. de Incubación total se hace la

segunda lectura . La formación de gas indica la presencia del grupo colifog

me, prueba positiva . La ausencia de gas, nos indica ausencia del grupo có

86

liforme, prueba negativa.

8.3.- Prueba complementaria t

8 .3 .1 .- Se preparan cajas patri con medio E A M 6 medio Agar E N-

D O .

8.3.2.- Se resiembra por estrías en estas cajas con un asa, de los

tubos de LBvB que en la prueba confirmativa hayan resultado positivos. Sep.

brando 1 6 más cajas por cada tubo positivo.

8.3 .3.- Se colocan las cajas en incubación a 35 ± 0.5°C por 24 +

2 hrs .

8.3.4.- La presencia de colonias típicas (nucleadas con ó sin bri

llo metálico) se considera como prueba positiva.

8.3.5 .- Bn este punto, la prueba puede continuarse de 2 formas di

ferenteas Sembrando en tubos con caldo laotosado, 6 bien sembrando en tu--

boa de Agar Nutritivo Inclinado y de aquí haciendo tinoiones de Gram.

8.3.6.- Siembra en tubos de Caldo Laotosado.

8.3.6.1 .- De las colonias típicas positivas de las cajas petri, se

toma una muestra con asa, y se resiembra en tubos de fermentaoión con cal-

do laotosado.

8.3.6.2.- Se coloca en incubaci6n a 35 + 0.5°C.

8 .3.6.3.- Se observan los tubos s las 24 ± 2 hrs., 6 bien a las

48 ± 3 hra. La producción de gas se considera como prueba complementaria -

positiva y presencia de coliformee . Tubos sin formación de gas, grupo ooli

forme ausente.

8.3.7 .- Siembra en tubos de Agar Nutritivo Inclinado con Tinoiones

de Gram.

8.3.7 .1 .- De las colonias típicas positives de las cajas petri, se

toma una muestra con un asa y se resiembra en tubos de fermentaoi6n con A-

gar Nutritivo Inolinado.

8.3.7.2.- Se colocan a inoubeoión a 35 • 0.5°C durante 24 + 2

87

hrs. si no se presenta formación de gas a las 24 hra. se continúa a 483 hrs.

8 .3.7.3.- Prepare la tinoión de Gram . de la siguiente formas

De los tubos sembrados de Agar Inclinado tome una muy pequeña por

ción y agregue a una gota de agua destilada oolooada sobre un portaobjetos

perfectamente limpio, a formar una ligera emulsión.

8,3.7.4.- Espere a que seque y fije pasando el portaobjetos a tra

vés de la flama en forma rápida unas tree veces comprobando que no se ha

dado demasiado calentamiento por medio de tocar con el dorso de la mano al

revs% del portaobjetos.

8.3.7.5.- Baga una tinoión cubriendo con la solución de cristal

violeta durante un minuto.

8.3.7.6.- Enjuague con macho cuidado con agua corriente.

8.3.7.7 .- Baga una segunda tinoión con solución de lugol durante

un minuto .

8.3.7 .8.- Enjuague nuevamente en la misma forme.

8.3.7.9.- Decolore con la solución de alcohol - acetona agregando

gota a gota y dejando fluir en el portaobjetos hasta que ya no arrastre .e

jada color .

8.3.7.10.- Tiña nuevamente cubriendo con la solución de safranina

durante 15 segundos.

8 .3.7 .11 .- Enjuague nuevamente en la misma forma.

8 .3.7.12.- Seque el exceso de agua con un papel absorbente.

8.3.7.13.- Examine en un microscopio. Las celulas que aceptan la

tinoión de safranii& son rosas, y se definen con gram-negativo, Grupo ooli

forme presente. Las celulas que no decoloran pero retienen la tinoión de

cristal de violeta son de azul profundo y se definen cono gran-positivas,

88

Grupo Coliforme ausente.

9.- Cáloulos.

9.1 .— La forma de expresión de resultados para los análisis bac+t

teriol6gioos, dependiendo de loa tubos positivos obtenidos, es en forma de

quebrado, sal por ejemplos Si se sembraron 3 diluciones (10., 1 y 0.1 ml,)

con 5 tubos en nada dilución y se obtuvieron los siguientes resultados:

10m1 .

1 ml .

0.1 ml.

5/5

4/5

3/5significa que de 5 tubos sembrados con 10 ml. de muestra 5 resultaron po-

sitivos, de 5 tubos sembrados con 1 ml . 4 resultaron positivo3, de 5 tubos

sembrados con 0.1 ml . 3 resultaron positivos.

Bi :dmade=,se observa que el número que aparece a la deseaba de la

diagonal indica el número de tubos que fueron sembrados, en total por cada

dilución, y el que aparece a la isquierda indica el número de tubos que -

reaultaron positivos y que deberán resembrarse.

Si al tármino de la incubación de loa tubos resembrados resultan

positivos 4,2,1, ea decir 4/5, 2/4, 1/3 las lecturas definitivas oarán ..

4/5, 2/5, y 1/5 y con la oombinacidn 4-8-1 se leerá el resultado en la tá

bla correspondiente a siembra 5 tubos.

9.2.- Si la combinación de diluciones difiere de 10, 1 y 0.1 ml.,

por ejemplo 100, 10 y 1 ml ., el resultado final de la table deberá multi-

plicarse por 0 .1 . 0 bien si se emplean diluciones menores por ejemplo 1,

0.1 y 0.01 ml. el resultado de la tabla deberá multiplicaras por 10, así

como por 100 en caso de emplear 0.1, 0.01 y 0.001 ml.

9.3.- Cuando se hacen mas de tree diluciones, se alcansanun rango

mas amplio de resultados, y se debe escoger entre las 3 diluciones que sean

mda significativas de la cantidad de coliformea existentes en la muestra.

Bsf por ejemplos

1 ml.

0.1 ml .

0.01 ml .

0.001 mi .

Combinación

de tubos po

sitivos

correcta.

5/5

5/5

2/5

0/5

5 - 2 - 0

89

5/5

4/5

2/5 ..

0/5

5 — 4 — 2

0/5

1/5

0/5

0/5

0 — 1 — 0

9.4 .— Cuando el H.M.P. para determinada combinación de ndmeros —

no aparezca en las tablas, puede estimares mediante la fórmula simple de

Thomas :

No. de tubos Positivos x 100

(ñl. de muestra en) z (ml. de muestra en)

(tubos negativos )

(todos loe tubos )

10.— Observaciones.

10.4.— El análisis de coliformes totales es generalmente aplicada

an sus pruebas presuntivas y confirmativas dnioamente, para todo tipo de

aguan con buenos resultados.

10.2.— La prueba presuntiva sin llegar a la confirmativa, no ea

recomendable, y no debe usaras rutinariamente, sin embargo pueden emplear

se en el análisis deL.aguaa negras y afluentes de plantas de tratamiento,

sólo como cierta referencia.

10.3 .— La prueba completa se aplioa en el análisis de .aguas pots

files para el control de calidad de los abastecimientos de agua.

N.M.P. / 100 ml .

90

A L C A L I N I D A D


Al igual que en la determinación para la acides, la determinación

de alcalinidad puede hacerse por indicadores, o bien potenciométricamente

con las mismas condiciones de color y turbiedad . Se recomienda para un rango

entre 10 y 100 mg/lt . de alcalinidad como CaCO3 ampliándose por uso de di

ferentea normalidades 6 volúmenes de muestra.


La alcalinidad existente en la muestra es medida por medio de una

titulación con un ácido neutralizándola asf hasta los puntos de pH desig-

nados para alcalinidad a la fenolftaleina (8 .3) y alcalinidad al anaranjá

do de metilo (4 .5) . Loa cuales pueden detectaras por medio de los indica-

dores o potenoiómétrioamente.


Los requerimientos de muestreo y almacenamiento son exactamente

los mismos que para acidez.


Vedas Interferencias de Acides.

V.- Aparatos .

A) Potenci6metro Beckman Spandiomatic 6 equivalente.

B) Agitador Magnético.

VI.- Reaotivos.

A) Agua exenta de CO2.- Prepárese en la misma forma que para

"Acides". (VI.A.).

B) Standard Primario de Carbonato de Sodio Na 2 CO3 secado a 250°C

91

por 4 hrs. y enfriado en un desecador.

C) Solución Indicadora de Anaranjado de Metilo.

D) Solución Indicadora de Fenolftaleína.

B) Solución de ácido sulfúrico H 2SO4 0.1 N. Diluya 3 ml. de H2SO4

concentrado a 1 lt. con agua exenta de CO2.

F) Solución estándar de ácido sulfúrico H2SO4 0.02 N. Diluya 200 ml.

de solución de H2SO4 0.1 N a 1 it. con agua exenta de CO2.

Estandarice como signes

1) Haga un mínimo de cuatro pesadas de 0 .088 10.001 gr. de Na2CO3

estándar primario.

2) Pasa a matraces erlenmeyer de 250 ml . si la titulación se va a ha-

cer con el indicador de anaranjado de metilo . '

3) Diluya a 50 ml. con agua exenta de CO2, disolviendo bien.

4) Agregue unas gotas del indicador de anaranjado de metilo, 6 bien

si la titulación se va a realizar potenciométrioamentes coloque la

soluoi6n de Na 2CO3 en el vaso de precipitados, diluyendo a un voló

men adecuado y disolución complete sobre un agitador magnético e -

introduzca los electrodos.

5) Continúese la titulación hasta el vire de amarillo de canela 6 has

ta que el potenciómetro registre un pH de 4 .5.

6) Calcule la normalidad con la fórmula s

N

gr. de Ma2CO~ pesadosSolución de $2504

0.053 x ml . de ácido gastado.

7) Hágase un promedio de las diferentes normalidades obtenidas.


1) Si se va a realizar la titulación por indicadores se tomará la unes

tra en matraces erlenmeyer de 250 ml . en caso de usar potenciómetro

se asarán vasos de precipitado de 100 ml . y agitador magnético de

velocidad constante .

92

A) Alcalinidad a la fenolftaleina para muestras con pH mayor de

8.3.

1) Se toman 50 ml . de Muestra.

2) Se agregan unan gotas de fenolftaleinna 6 se coloca en el agi

tador magnético introduciendo los electrodos.

3 Se titula con la solución estándar de H2SO40.02 N hasta el-

vire rosa-incoloro 6 hasta un pH de 8 .3.

4) Se calcula por medio de la siguiente f6rmulas

Vol. gastado de H2SO4x N de H2SO4x5000

ml. de muestraFenolftaleína

entcaco3

aAlcalinidad a la

Alcalinidad al anaranjado de Metilo.

1) Se toman 50 ml. de muestra (6 se puede continuar con la misma

muestra empleada para la aloalinidad a la fenolftaleina)

2) Se agregan unas gotas de anaranjado de Metilo 6 as coloca en.

el agitador con el potenciómetro.

3) Se titula con la solución de H2SO4 0 .02 N hasta el vire de a-

marillo a canela 6 hasta pH a 4.5.

4) Se calcule con la Fórmulas

Alcalinidad al

Vol. gastado de H2804x N de H2SO4x5000en ---

Anaranjado de Metilo

CaCO3ml . de muestra.

Aloalinidad Totals

1) La alcalinidad total ea la suma de la aloalinidad al anaranja-

do de metilo y la alcalinidad a la fenolftaleína.

2) En muestras con pH menores de 8 .3, la aloalinidad a la fenolf-

93

taleina es igual a 0 y por ende la alcalinidad al anaranjado de

metilo ea igual a la alcalinidad total.

3) En casos que no se requiera el dato de alcalinidad a la fenolfta-

leína, la alcalinidad total se determina titulando directamente -

al anaranjado de metilo 6 pH 4.5, y reemplasando en la fórmula el

valor de los mililitros totales.

Alcalinidad Total en mg/1 como Ca CO3

BONDS i

F Vol . gastado de ácido sulfúrico para la alcalinidad a la fenolf

taleína.

Y - Vol . gastado de H2SO4 para la alcalinidad al anaranjado de

metilo .

(F + Y) x HH2SO4 x 5000

ml. de muestra.

94

ACID']3Z


R1 método volumétrico puede ser realizado de dos formas diferen--

teas

Por medio de indioadores cuando la muestra está libre de color y-

turbiedad 6 potenoiométricamente, cuando se trata de muestras coloridas--

6 turbias, cubre un rango de 10 mg/lt a aproximadamente 1000 mg/lt de aci

dez como CaCO3 usando 50 ml. de muestra.

Rangos mayores 6 menores pueden cubrirse variando los volómenes -

de muestra 6 la normalidad de la solución titulante.

II._ Fundamento del Método.

atendiéndose como acidez la medida de la capacidad de una agua -

para neutralizar una base, ea adicionada a la muestra una solución alkali

de normalidad oonooida, hasta su punto final de titulación designada a un

pH de 4.5 para acidez al anaranjado de metilo y un pH de 8 .3 para acidez-

a la fenolftaleína . Registrándose estos con los vires del indicador 6 --

bien en la lectura del potencí6metro.

III.- Muestreo y Almacenamiento*

Los recipientes de muestreo pueden ser de vidrio o plástico per -

fectamente limpios, enjuagando previamente con la misma agua a muestrear.

Taponando herméticamente el reoipiente y manteniéndose en refrigeración -

hasta el momento del análisis, siempre dentro del mínimo del día de su recolección.


A) Las interferencias de color y turbiedad son eliminadas empleas

do el método potenoiómétrioo.

B) Grasas, aceites 6 materia suspendida pueden interferir con la-

respuesta del electrodo, se recomienda no remover estas impu -

95

rezas de la muestra ya que también contribuyen a la acidez en

ella, es conveniente emplear un electrodo especifico para és-

tas condiciones 6 bien esperar cierto tiempo a que el electro

do alcance el equilibrio

C) Oases disueltos que contribuyen a la acidez pueden perderse,

por lo que el análisis debe hacerse lo más pronto posible, e—

vitando una prolongada exposición a la atm6sfera ó agitamien-

toa bruscos.

D) Cloro libre residual en la muestra, puede blanquear el color

del indicador.

V.— Aparatos .

A) Potenoi6metro Beckman Spandiomatic 6 equivalente.

B) Agitador Magnético.

VI.— Esactivos.

A) Agua exenta de CO2. Prepare por ebullición de agua destilada

o deionizada fresca durante 15 minutos y enfríe a temperatura

ambiente en recipiente cerrado . Prepare todos los reactivos —

con eats agua.

B.) Solución de Na0H . IN. Disuelva 40 gr. de NaOH en agua exenta

de CO2 afore a un litro . Se protege esta solución del CO2 at-

mosférico con un tubo de cal sodada 6 ascarita.

C) Soluoi6n de Biftalato de Potasio BHC8H4O4 0.01 N.

Emplee reactivo estándar primario y seque a 120 0C por 2 horas.

Enfríe en un desecador. Pese exactamente 2 .0423 gr. disuelva

en agua exenta de CO2 y afore exactamente a 1 it.

D) Solución Indicadora de Anaranjado de Metilo.

B) Solución Indicadora de Fenolftaleina.

F) Solución Titulante de Hidróxido de Sodio 0.02 N.

Diluya 20 ml . de solución de NaOH 1N. a 1 lt. con agua exenta de CO 2. Es-

tandarice como sigue:

1) Pipetee 20 ml. de solución de biftalato de potasio KHC 8H4O4

0.01 N en un matraz erlenmeyer 250 mi.

2) Diluya oon agua destilada a aproximadamente 50 ml.

3) Agregue unas gotas de indicador de fenolftaleina.

96

4) Titule con la solución de NaOH 0 .02, hasta el vire de incoloro

a Rosa pálido.

5) Si se desea se puede hacer la titulación en un potenciómetro -

empleando un vaso de precipitados y omitiendo la fenolfateleína,

el punto final de la titulación será cuando se alcance un pH de

8.3 ambos puntos deberán ser equivalentes.

6) Haga varias titulaciones y obtenga un promedio.

7) Calcule la normalidad como sigue:

N 0.01 x 20NSOH m

Vol. de NaOH Gastada Promedio.


A) Acidez al anaranjado de Metilo.

1) Se pipetean 50 ml. de muestra en un matraz erlenmeyer.

2) Se agregan unas gotas de anaranjado de metilo.

3) Titule con la solución de NaOH 0 .02 N hasta el vire de Canela a

amarillo. (Voldmen H)

4) Si se emplea la titulación potenoiométrica, se usa un vaso de •

precipitados y se omite el anaranjado de metilo, haciendo uso

de un agitador magnético para mantener homogenea la muestra mientras se titula con la solución de NaOH 0 .02 N B1 punto final dela titulación será cuando haya alcanzado un pH de 4.5.

B) Acidez a la Fenolftaleina.

Si la muestra tiene un pH mayor de 4 .5 o bien si se analiza direc-

tamente a la fenolftalelna sin excluirle el volumen de solución de NaOH --

gastado para la acidez al anaranjado de metilo, se consideras

Acidez a la fenolftaleina Acides Total.

1.- Se toman 50 ml . de muestra en un matraz erlenmeyer.

2.- Se agregan unas gotas de fenolftaleina.

3.- Se titula con solución NaOH 0 .02 N. hasta el vire de incoloro

a rosa. (Volumen F)

97

4) Si se emplea la titulamión potenciométrioa se precede en la -

miama forma que para la acides al anaranjado de metilo conti-

nuándose hasta un pH de 8.3.

C) Cálculos.

1.- Acidez al anaranjado de metilo

A~

S z N z 50000

ml. de muestra.

2.- Acides a la fenolftalina.

AF

F z N x 5000

ml. de muestra

3.- Acidez total

AT s

(F + x)x N x 50000

ml. de muestra.

DONDSs

F m ml. de solución de HeOH gastados para acidez a la

fenolftaleina.

N

ml. de solución de NaOH gastados para acidez it

anaranjado de metilo.

I • Normalidad de la solución de NaOH (0 .02)

98

F E N 0 L E S

CMETODO DE LA 4 - AMINO - ANTIPIRINA

Y EXTRACCION CON CLOROFORMO)


La aplicación del método se hace a todas las aguas en general . -

Por su sensitividad, alcanza a detectar hasta 1 pg/lt . Se recomienda para

muestras cuya concentración de fenol se encuentra de 0 .001 a 1 mg/lt.


Bata determinación ae basa en la reacción que tiene lugar entre

loa fenoles con la 4 - amino - antipirinm'a un pH de 10 .0 + 0.2 en presea

oia de ferrioianuro de potasio para formar un complejo colorido rojo.


Se recomienda hacer el andlisis dentro de las 4 his, siguientes

a su recolección . En caso de no ser posible, se puede preservar con 1 gr.

de Cu SO4 . 5 H20, por litro de muestra o bien acidificado con H 3PO4 a un

pH de 4 o menos, y refrigerando a 5 - 100C.


A) Agentes oxidantes o reductores interfieren en la formación del

Dolor, degradando los fenoles.

B) `Interferencias por compuestos de sulfuro intervienen también

en la reacción.

C) La acción bacteriana que se sirve de los fenoles como alimento

se preserva por adición de solución de sulfato de cobre (Cu304).

V.- Aparatos.

A) "Speotronic 20" marca Bauch & Lomb para asares a 460 nm. pro-

99

visto de un paso de luz de 1 cm.

B) Equipo de destilación.

YI.- Reactivos.

A) Estándares.

P.- Solución Stock de Fenol .- Disuelva 1 .00 gr. de Fenol en 500 ml.

de agua fresca, hervida y enfriada y afore a 1000 ml . General-

mente esta pesada es suficientemente exacta, sin embargo cuan-'

do se busca una extrema exactitud se estandariza como sigues

a.- Beactivos para la valoración de la Solución Stock.

1) Solución de Bromato Bromuro 0.1 N.- Disuelva 2.784 gr. de KBr0 3

anhidro en agua destilada, agregue 10 gr . de cristales de KBr

disuelva y afore a 1000 ml.

2) Acido olorhidrico concentrado.

3) KI, cristales de Ioduro de Potasio.

4) Solución de Tiosulfato de Sodio 0 .025 N. Se prepara y valora co

mo en la determinación de Oxígeno disuelto.

Solución de Almidón. Se prepara como en la determinación de oxi

geno disuelto.

b.- Procedimiento.

1) Se pipetean 100 ml. de agua destilada en un matraz de 500 ml.

con tapón esmerilado.

2) Se agregan 50 ml . de solución stock de fenol.

3) Se agregan 10 .0 ml. de solución de bromato bromuro.

4) Inmediatamente se agregan 5 ml . de HC1 concentrado.

5) Si el color café del bromato no persiste, agregue porciones de

10.0 ml. hasta que permanezca (generalmente se requieren 4 por-

ciones).

6) Mantenga el matraz tapado, y déjelo reposar por 10 minutos.

7) Agregue aproximadamente 1 gr . de KI.

8) El precipitado blanco que se forma no alters los resultados.

9) Titule con solución de tiosulfato de Sodio 0.025 Ii, usando al-

5)

100

midón como indicador, el vire es como el del oxigeno disuelto.

10) Corra un blanco con agua destilada a través de todo el prose --

dimiento.

11) Calcule la concentración de la solución stook de fenoles coma--

siguet

mg/lt de fenol = 7 .842 ( A x B — C)

A = ml. de solución de tiosulfato de sodio 0.025 N. usados pa--

ra el blanoo.

B = ml. totales de solución de Bromato — Bromuro usados para --

la muestra divididos entre 10.

C = ml . de tiosulfato usados para la solución.

12) Solución intermedia de fenol .— Diluya 10 ml . 6 la cantidad co--

rrespondiente de solución stock de fenol a 1000 ml . en agua dee

tilada fresca 1 .0 ml. = 10.0 pg de fenol. Prepárese el dia que—

se use.

13) Solución Stándar de fenol .— Diluya 50 ml. de la solución inter—

media de fenol a 500 ml . con agua fresca, hervida y enfriada .-

1 .0 ml. = 1 .0 jig de fenol. Prepárese 2 hrs . antes de usarse,

A) Solución de ácido fosfórico 1 1 9 .— Diluya 10 ml. de H3PO4 al —

85% a 100 ml . con agua destilada.

B) Hidróxido de Amonio concentrado NH4OH.

'0) Solución de Sulfato de Cobre.- Diluya 100 gr . de CuSO4 . 5H2O —

en agua destilada .y diluya a 1 it.

D) Solución de Cloruro de Amonio .— Disuelva 50 gr. de NH4 Cl en a—

gua destilada y diluya a 1000 ml.

B) Solución de Aminoantipirina .— Disuelva 2.0 gr. de 4 — aminoan —

tipirina en agua destilada y diluya a 100 ml . Prepárese diaria—

mente.

F) Solución de Ferrioianuro de Potasio.— Disuelva 8.0 gr. de . . ..

K3 Fe (CN)6 en agua destilada y diluya a 100 ml . Filtre si es —

necesario. Prepárese cada semana.

G) Cloroformo CH C1 3.

H) Sulfato de Sodio anhidro Na2SO4, granular.



101

1.— Prepare una serie de estándares de fenol, pipeteando 5, 10,

20, 30, 40 y 50 ml . de solución estándar de fenol, en matraoes

aforados de 500 ml. y diluyendo hasta la marca con agua desti

lada, prepare un blanco con agua destilada.

2.— Se pasan a vasos de precipitado de 1 litro y se agregan 10 ml.

de solución de cloruro de amonia.

3.— Se ajusta el pH en un potenci6metro a 10 .0 ± 0.2 con NH4OH y

H3PO4 1 s 9.

4.— Se paean a embudos de separación de 1000 ml.

5.— Se agregan 3.0 ml . de solución de aminoantipirina y se mezcla

bien.

6.— Se agregan 3.0 ml. de solución de ferrioianuro de potasio, y

se memela bien nuevamente.

7.— Se deja reposar para el desarrollo de color por 3 minutos.

8.- Sztraiga al color inmediátamente con 25 ml . de cloroformo (ea

recomendable tener una probeta para cada estándar) . Agite aá

paradamente cada matraz un mánimo de 10 veces . Deja reposar.

9.— Agite nuevamente 10 veces y deje reposar.

10.— Prepare un embudo para cada estándar y blanco, conteniendo un

papel filtro casi lleno de sulfato de sodio anhidro.

11.— Filtre a través de estos embudos la capa de cloroformo sedi-

mentada en el embudo de separación, recibiendo el filtrado —

directamente en las celdas . Batas deben estar perfectamente

seuas,y el extracto de color de cloroformo que se recibe, no

debe contener agua ni humedad alguna, que forme burbujas las

cuales falaeazian la lectura.

12.— Se leen las absorbancias de los estándares a 460 nm calibran

do a "0" de absorbancia con el blanco de agua destilada.

13.- Se congruyre la curva deoalibración graficando concentración

contra absorbancia, el rango de la curva será de 0 .01 a 0.1

mg/lt de fenol correspondiendo de la siguiente formar

102

mi. de solución

Stándar de fenol rg fenol

mg/lt fenol para

500 ml. do muestra.

5.0 5.0 0.01

10.0 10.0 0.02

20.0 20.0 0.04

30.0 30.0 0.06

40.0 40.0 0.08

50.0 50.0 o.y


Cuando se trata de analizar muestras turbias, coloridas ó con inter-

ferenoias, siempre se trata la muestra con un paso preliminar de destilas

oidn como sigues

I) Se toman 500 ml. de muestra en un vaso de precipitado de I lt.

2) Se ajupdii el pH 4.0 1. 0.2 eon H3PO4 1t 9 y/o NH40H concentrado.

3) Se agregan 5.0 ml. de solución do CuSO4.

4) Se paean al aparato de destilación.

5) Se destila, recibiendo en un vaso de precipitado de 1 It., hasta 4506) Se suspende la destilación y se deja enfriar.

7) Se agregan 50 ml . de agua destilada al aparato de destilaoión.

8) Se oontinda con la destilaoión hasta completar 500 ml . de destilado.

9) Se lee agrega 10 ml . de solución de NH4C1 y a partir de este paso se

procede ezaotamente igual que en la curva de calibración . (punto VII

3).

10) Se determina la concentración de las muestras llevando las lecturas de

las absorbancias a la curva de calibración para leer las concentració

nos correspondientes . Si la muestra se sale del rango de la curva se

toma una alfouota adecuada y ss completa a 500 ml . con agua destilada.

Cáloulost

Fenoles mg/it = / de fenoles en la gráfica .

ml. de muestra.

ml.

A

103

FOSFATOS TOTALES Y ORTO

(lÑ PoDO DEL CLORURO ESTAYOSO)


El método se aplica a aguas potables, de desecho o salinas, depen-

diendo del método de digestión, se puede aplicar también a lodos, algas o-

sedimentos . Cubre un rango de 0.01 - 0.2 mg/lt, pudiendo ampliarse por me-

dio de diluoiones.

El método es recomendable hasta 500 pg/lt. Se presenta en forma di

renta y para casos en que se presenten interferencias o se desee aumentar-

la sensitividad, el método que se usa es por extracción.

II.- Principio de Método.

El método está basado en la reacción que tiene lugar entre los or-

tofoafatos y el molibdato de amonio para formar el ácido molibdofosfórioo---

que es reducido por el oloruro estanoso a un complejo intensamente colori-

do de azul de molibdeno.

La determinación de fosfatos totales, se hace sometiendo las muss-

tras a una digestión preliminar con una mezola de persulfato - doido sulf4

rico, que destruye la materia orgánioa y libera los compuestos orgánicos

de fósforo oomo fosfatos, al tiempo que los hidroliza a ortofosfatos.


Se recomienda no emplear botellas de pl gstioo para recolectar o al

macenar las muestras, sobre todo cuando se trata de concentraciones muy bá

jas ya que se podría causar absorción por las paredes del recipiente . El -

material de vidrio que se emplee tanto para muestrear como para analizar,--

debe lavarse con HC1 diluido caliente, y después enjuagarse varias veces -

con agua destilada, nunca empleando detergentes o jab& para su lavado.

Preferentemente analice la muestra tan pronto como sea posible, en

caso contrario consérvese en refrigeración.

P

104

Iy.- Interferenoias.

A) La presencia de mercurio a niveles arriba de 1 mg/lt de Hg, ooa-

aions un precipitado de cloruro merouroso en el paso de la diges

ti6n.

B) El arsénico, por presentar reacciones muy similares al f6sforo,-

puede oausar interferencias positivas . Ba recomendable efectuar-

una oorreoci6n por adicidn de arsénico a un .testigo, en la misma

proporoidn que contenga la muestra.

C) Altas concentraciones de fierro pueden causar precipitación.

V.- Aparatos.

A) Autoclave, para operar a 121°C y 21 lb/pulgadas 2 de presión.

B)"Speotronio 20" Bauch & Lomb para usarse a 690 nm . 6 equivalente.

C) `Podo el material de vidrio debe ser lavado con HCl diluido (111)

caliente y enjuagado varias vedes con agua destilada.

Ningdn material debe tener contaoto con detergentes, jabón o -

cualquier otro material que contenga fosfatos.

4I.- Reactivos.

A) Resctivos para la Digestión.

1)-Indioador de fenolftalefna .- Se disuelven 5 gr. de fenolftalef -

na en 500 ml . de alcohol etílico 6 isopropíliop al 95%, agregán-

dose 500 ml. de agua destilada . Se agrega NaOH 0.02 N a gotas, -

hasta la aparicidn de una ligera ooloraoi&n .roaa.

2) Hidróxido de sodio NaOH 0 .02 N.- Se pesan y se disuelven 800 mg.

de NaOH en agua destilada y se aforo a 1 lt.

3) Solución de ácido sulfdrioo .- A 600 ml. de agua destilada agré -

gueles con muoho cuidado 300 ml . de H2SO4 deje enfriar a tempo -

ratura ambiente y diluya a 1 lt . con agua destilada.

4) Persulfato de Amomio .- Cristales.

5) Hidr6zido de Sodio NaOH 12 N .- Pese y disuelva 480 gr. de NaOH -

en agua destilada y diluya a 1 lt.

105

B) Reaotivoa para la Reacción y Sxtracoión.

1.- Indicador de fenolftaloina .- Prepárese como en VI .A.I.

2.- Solución ácida fuerte .- A 600 ml. de agua destilada agregue len

tamente 300 ml. de H2SO4 concentrado, enfrie, agregue 4 .0 ml.de

HBO3 concentrado y diluya a 1 lt.

3.- Reactivo de molibdato de amonio I .- Disuelva 25 gr. de

(NE4)6 Mo7024 . 4 820 en 175 ml . de agua destilada . Agregue con

mucho cuidado 280 ml . de H2SO4 concentrado a 400 ml . de agua -

destilada. Bnfrie y agregue a la solución de molibdato. Afore a

1 it.

4.- Reactivo de molibdato de amonio II.- Disuelva 40.1 gr. do . . ..

(NH4)6 Mo7024 . 4 H20 en aproximadamente 500 ml . de agua deati

lada. Lentamente agregue 396 ml . de reactivo do molibdato I. -

Knfrie y diluya a 1 lt.

5.- Hidróxido de Sodio NaOH 1 B .- Se pesan y disuelven 40 gr . te

NaOR en agua destilada y se afore a 1 lt.

6.- Solución de Cloruro Batanbso I,- Disuelva 2 .5 gr. de SiC12.2H20

en 100 ml. de glicerina . Caliente en baño maría y agite con una

varilla de vidrio para acelerar la disolución. Rate reactivo es

muy eatable y no requiere ni preservación ni almacenamiento es-

pecial.

7.- Solución de Cloruro Batanoso II .- Mezcle 8 ml. de solución de

cloruro estanoso I con 50 ml. de glicerina . Bate reactivo es ea

table por lo menos 6 meses.

8.- Solvente de Benceno - Isobutanol .- Mezcle volúmenes iguales de

benceno y alcohol isobutilioo . Bate reactivo ea altamente infla

sable.

9.- Roluoi6n de alcohol - ácido sulfúrico .- Agregue con mucho cui-

dado 20 ml . de H2SO4 concentrado a 980 ml . de alcohol =still.**

con agitación oontinua.

C) Solución Stook de fosfato .- Disuelva en agua destilada 219 .5 mg.

de fosfato da potaéio dihidrogenado, aáhidro y diluya a 1000 ml.

106

1 .00 ml .

50.0 /sag PO4 — P

VII,— Procedimientos

A) Fosfatos Totales.

1 .— Digestión Preliminar.

a) &i un matraz erlenmeyer de 250 ml . pipetee 50 ml, de muestra hó

mogánea. Corra un blanco con agua destilada.

b) Agregue unas gotas de indicador de fenolftaleina.

o) Si se desarrolla coloración , agregue solución de ácido sulfdri

co a gotas, hasta la desaparición del color.

d) Agregue 1 ml . de exceso de solución de H2SO4

e) Agregue 0.4 de peraulfato de amonio sólido.

f) Coloque en la autoclave y lleve a cabo la digestión, sometiendo

las muestras a 121°C y 20 lb/ pulgada 2 de presión . por 30 minu-

toe.

g) Retire las muestras y deje enfriar.

h) Agregue unas gotas de indicador de fenolftaleina.

i) Agregue solución de NaOH 12 N, a gotas, hasta la aparición de

un ligero color rosa y adicione gotas de solución de ácido fuer

te para desaparecerlo.

j) Afore a 100 ml . (o voldmen original) con agua destilada.

k) En caso de formación de precipitado, no filtre, homogenice bien

y asi tome la muestra.

2.— Método Directo.

a) Tome estos 100 ml. o allouota aforada a 100 ml . con agua destilé

da. Para el blando use 160 100 ml. de agua destilada sometida a

digestión.

b) Se agrega 4.0 ml. de reactivo de molibdato I.

o) Agregue 0 .5 ml . (10 gotas) de solución de cloruro eatanoso I.

d) Espere 10 minutos a el desarrollo del color, y lea inmediátamen

te sus absorbanoias en el Speotronio a 690 mm.

3.— Método por extracción.

a) De los 100 ml. de muestra digerida, tome 40 ml . o alicuota diluí

107

da a 40 al . con agua destilada . Tome 40 ml. del blanco de digastión, para el blanco del método. Póngalo en un embudo de separa

oi6n de 250 ml.

b) Agregue 50 ml . del solvente de benceno - isobutanol.

c) Agregue 15 ml . de reactivo de molibdato II.

d) Tapone el embudo y agite por exactamente 15 segundos.

e) Quite el tapón, y deje reposar para la separación de las capas

orgánicazy acuosa.

f) Pipetee 25 ml . de la capa orgánica y páselos a matraces voldme-

tricoa de 50 ml.

g) Agregue de 15 - 20 ml . de la solución de alcohol - ácido sulfú-

rico, agite.

h) Agregue 10 gotas (0 .5 ml. ) de solución de cloruro estanoso II,

agite.

i) Afore hasta la marca con solución de alcohol - ácido sulfúrico.

Mezcle vigorosamente.

j) Despuáa de 10 minutos, pero antes de 30 lea en el Speotronic a

625 nm. Calibrando el "0" de absorbancia del aparato, oon el -

blanco de agua destilada.

B) Ortofoafatos.

1 .- Método Directo.

a) Se toman 100 ml . de muestra o alicuota diluida a 100 ml . con a-

gua destilada . Corriendo también un blanco.

b) Se neutralisa la muestra con solución ácida fuerte y con NaOS 1N.

o) Seguir exactamente el mismo procedimiento que para fosfatos tota

lea método directo. (VII .A.2 .b.).

2.- Método por Extracción.

a) Tome 40 ml . de muestra o aliouota diluida a 40 ml . con agua des

tilada neutralizada con solución ácida fuerte o con NaOH 1 N en

un embudo de separación de 250 ml . Corriendo también un blanco.

b) Seguir exactamente el mismo procedimiento que para fosfatos to-

tales método por extracción (VII .A.3.b.).

C) Cálculos y Curva de Calibración.

108

Prepare una serie de estándares por diluciones de diferentes void-

menes de la solución Stook de fosfato a 100 ml . para el método di-

recto y a 40 ml, para el método por extracción oomo sigues

1 .- Método Directo.

Prepare una solución estándar de fosfatos por dilución de 8 .0 ml.

de solución Stook a 1000 ml. con agua destilada I ml. - 0.4 pg. Tome vo-

lúmenes y afore a 40 ml. con agua destilada, cubriendo un rango de

0.01 - 0.2 mg/lt correspondiendo come sigue*

41. de Solución

Concentraciones en

Lstándar

/ug de P

mg/lt para 40 ml . de

1 ml. - 0.4 pg PO4-P

muestra.

0 0. 0

1 0.4 0.01

3 1 .2 0.03

'5 2.0 0.05

7 2.8 0.07

10 4.0 0.1

13 5.2 0.13

t5 6.0 0. 1518 7.2 0.18

20 8.0 0.20

Trdteloa ezáotamente en la miams forma que para las muestras de

fosfatos totales a partir del punto VII .A.2.b.

Construya la curva degalibraoión, gréfioando las lecturas de aboor

bancia contra concentraciones y lea las concentraciones correspondientes

a las absorbanoias de las muestras obtenidas en el análisis . Calcule me-'

diante las fórmulas*

Para fosfatos Totales*

de P gráficaml. de muestra x Factor de dilución.

109

Para Ortofosfatoa:

Mg yg de P gráfica1tp

ml. de muestra

2.— Método por extracción.

Prepare una eoluoión estándar de fosfatos por dilución de 10 mi . de

solución Stook a 1000 ml. con agua destilada 1 .0 ml 0 0.5 rg. Tome voldml

nee y afore a 100 ml . con agua destilada, cubriendo un range de 0.01 — 0.2

mg/lt .

Correspondiendo Domo signet

ml. de Solución

Eatándas pg de P

Conoentraoionea en

mg/lt para 100 ml . de wo

muestra.

0 0 0

2 1 0.01

6 3 0.03

10 5 0.05

14 7 0.07

20 10 0.1

26 13 0.13

30 15 0.15

36 18 0.18

40 20 0.20

Trátelos exactamente en la misma forma que para foafatoa totales

a partir del punto 9II .A.3.b.

Grafique y calcule como en el método directo.

110

OXIGENODIS[TaIlPO O.D.

(METODO DE WINKLER)

.1.- Alcance y Aplicación.

El método es aplioable principalmente en aguas de desecho, afluen-

tes, muestras de arroyos o ríos y aquellas muestras que presentan interfe-

rencia por nitratos o en cantidades menores de 5 .0 mg/it. de fierro ferro-

so.

II.- Principio de Método.

Esta prueba se basa en la adición de una solución de manganeso di-

valente, seguida de un álcali fuerte a la muestra en una botella Winkler,-

el oxígeno disuelto presente oxida rápidamente una cantidad equivalente -

del hidróxido manganoso divalente dispersado que precipita oomo hidróxidos

con más altos estados de valencia.

En presencia de iones ioduroa y en condiciones ácidas, el mangane-

so oxidado regresa a su estado divalente, con la liberación del ioduro e -

quivalente a el oxigeno disuelto inicial contenido en la muestra . Al iodo--

es entonces ouantifioado con una solución de tiosulfato de sodio.


La determinación de oxígeno disuelto es una prueba que debe hacer-

se en el lugar de reooleooión de la muestra, tomándola directamente en las

botellas winkler sin que se formen burbujas en el frasco con la muestra ni

al momento de tomarla . El frasco Winkler para oxígeno disuelto es de tapón

esmerilado, para evitar que la muestra tenga contacto con el aire.

Cualquier agitación podría alterar el contenido gaseoso, por lo que la ,-

muestra se debe transportar después de fijar el oxígeno disuelto y de ser-

posible hacer la determinación en el lugar de reooleooión.


111

A) Grandee cantidades de materia orgánica, que debido a su número

no completen la oxidación, así como materia inorgánica que sea

resistente a la oxidación,

B) Altas concentraciones de fierro férrico o ferroso, para las que

se recomienda otra modificación del método,

C) Cloruros en cantidades mayores de 1 gr/lt, pueden ocasionar re-

sultados más altos,

V,- Reactivos.

A) Solución de Sulfato Manganoso .- Pese y disuelva cualquiera de -

loa siguientess

480 gr. de Mn SO4 . 4 H20 ó

400 gr. de Mn SO4

. 2 H20 6

364 gr. de Mn 804

H20

con agua destilada y llene a 1 lt . No debe dar ningdn color con

el almidón cuando se añade solución de Ioduro de Potasio en me-

dio ácido.

B) Solución de Álcali - Ioduro - Nitruro .- Disuelva 500 gr. de . ..

NaOH y 135 gr. de NaI 6 150 gr. de KI en agua destilada y afore

a lit. Agregue 10 gr. de azida de Sodio, NaN3 , disuelta en 40

ml. de agua destilada.

C) Acido Sulfúrico Concentrado, H2SO4 .

D) Almidón,- Prepárese una solución acuosa añadiendo 5 gr . de alma

dón soluble a aproximadamente 800 ml, de agua destilada hirvien

do y con agitación, caliente unos minutos más y dójese reposar

toda la noche1deese el sobrenadante clarificado . Presérvese por

adición de unas gotas de tolueno 6 1 .25 gr. de ácido salicilico

por litro de solución.

E) Solución Stock de tiosulfato de Sodio 0 .10 N.- Disuelva 24.82 gr.

de Na2S203 . 5 H20 en agua destilada hervida y enfriada y dilkya

a 1 lt. Presérvese por adición de 5 ml . de cloroformo 6 1 gr . de

NaOH por litro.

F) Solución Mstándar de fiiosulfato de Sodio 0 .025 N.

112

Prepárese por dilución de 250 ml . de la solución Stock a 1000 ml.

(6 6.205 gr. de Na28203 . 5 H20 a 1000 ml .) oon agua destilada,

hervida y enfriada . Se preserva por adición de 5 ml . de olorofor

mo 1 .00 ml. = 200 pg de O.D. Estandarización de la solución de

Tiosulfato 0 .025 N. ;

1 .- Reactivos.

a.- Solución Estándar de dicromato de Potasio 0.025 N. Ponga a secar

K2Cr207 por 2 hra. a 1030 C, enfríe a temperatura ambiente en de-

secador, pese 1 .226 gr. y diluya a 1000 ml . con agua destilada.

b.- Ioduro de Potasio Kl cristales, libre de iodato.

co .- Acido Sulfúrico H2SO4

1 a 9.- Prepárese por dilución de 10 ml . de

H2SO4 concentrado a 100 ml . con agua destilada.

2.- Procedimiento.

a.- Diluya 2 gr. aproximadamente de KI con 100 - 150 ml . de agua del

tilada en un matras erlenmeyer de 500 ml.

b.- Agregue 10 ml. de K2SO4 1 $ 9.

o.- Agregue exactamente 20 .0 ml . de solución de dicromato de Potasio.

d.- Coloque en la obscuridad por 5 minutos.

e.- Diluya a aproximadamente 400 ml.

f.- Titule oon la solución Estándar de Tiosulfato de Sodio.

g.- Calcule la normalidad de tiosulfato por medio de la fórmulas

N1 x V1

V2

Dondea

N1 - Normalidad de la solución de K 2Cr207 (0.025N)

V1 --ml . de la solución de K2Cr207 (20 ml.)

V2 ml . de solución de Ns25203 gastados en la titulación.

N =

113

VI.- Procedimiento.

A) 7ijaoi6n del ozfgeno Disuelto.

1.- Se toma la muestra directamente en la botella winkler con las

precauciones ya indicadas.

2.- Se le agregan 2 ml. de la solución de Sulfato manganoso intro-

duciendo la punta de la pipeta en la muestra.

3.- Se le agregan 2 ml. de la solución de álcali - ioduro - nitruro,

de igual forma que la anterior.

4.- Se taps cuidadosamente y se mezcla invirtiendo la botella un -

minimo de15 veces.

5.- Se deja reposar 2 minutos pare la formación del precipitado.

Quite loa tapones cuidadosamente y agregue 2 ml . de H2SO4

cancel ,

trado introduciendo la punta de la pipeta en la muestra.

7.- Tapone nuevamente y mezcle de igual forma hasta la desaparición

completa del precipitado café.

B) Titulación.

1.- De la solución resultante de la botella, pipetee 100 .0 ml. en

un matraz erlenmeyer de 250 mi.

2.- Titule con la solución de tiosulfato de sodio hasta color ama-

rillo paja.

3.- Agregue 1 - 2 ml . de la solución de almidón.

4.- Continde la titulación de la muestra hasta la desaparición del

color soul.

5.- Determine la cantidad de oxigeno disuelto en mg/lt por medio

de la fórmtlas

ml. detiosulfatoz B z B q z 1000

Vol. de M.

ml. Bá2

8203 z 0.025 z 8 z 1000

98.7

6.-

mg/It OD .

DB DOHDBi

mg/It OD =

114

C A P I T U L O I I I

IS9ESTIOACIOBBS

D~

LABORATORIO

115

ESTUDIO DE LA COBRELACIOñ ENTER INDICADORES DE CONTANINACION

BACTERIOLOOICA (COLIFORMES TOTALES, COLIFORMES

FECALES, ESTREPTOCOCOS FECALES) Y OROARICA

(ESTERoLES FECALES)

116

Para evaluar la calidad sanitaria del agua, se utilizan indicado-

res de contaminaoiónt fisioos, químicoa y bacteriológicos.

Los indicadores bacteriológicos de contaminación sons Coliformea-

Totales, Coliformes Fecales y Estreptococos feoales.

Para la identificación de bacterias indicadoras de contaminación,

la técnioa más empleada es la de tubos de fermentación múltiple, la cual-

proporoicna un limite de confianza de 95%.

La realización de esta técnica requiere de un total de 96 horas -

para Coliformes Totales y i'satreptoc000a Fecales y de 72 horas para Golf -

formes Fecales.

Para obtener buenos resultados, las muestras deben analizarse den

tro di las siguientes 6 horas, siempre y cuando las muestras se encuentren

en refrigeraoión.

Como indicadores quimioos se oonsideran entre los más importantes,

el colesterol y el coprostanol.

Colesterolt Nos sugiere el indioe de contaminación en aguas super

fioialea ya, que no solo se encuentra en las heces de animales de sangre-

caliente, sino también en los huevos, leche, manteca, lana, grasa, eto .,-

por lo que no se considera como un indicador de contaminación especifico.

Coprostanolt Ha sido considerado como un buen indicador de conta-

minación fecal. Este esterol es un compuesto orgánico fecal oaracteristi-

oo, que se anouentra en las heces de animales4e sangre caliente . Bajo -

oondioiones normales, el ooprostanol es el principal esteroide fecal.

117

I. OBJETIVO3

Establecer una evaluación comparativa entre conformes totales/al

prostanol, ooliformea fecales/ooprostanol y estreptococos fecales

/ooprostanol, con el fin de obtener una correlación entre estos

dos tipos de análisis.

Obtener constantes que permitan sustituir cualquiera de loa dos

análisis.

Evaluar tiempos y costes de laa determinaciones.

Comprobar nuevas tácnicas de extracción para cromatografía de ga-

ses en compuestos orgánicos.

118

II. Material de Muestreo

II.1. Para Análisis Baoteriológicos:

La muestra debe obtenerse directamente en un frasco de vidrio re-

sistente, de boca ancha con tapón esmerilado y preferentemente de color -

ámbar con una capacidad no menor de 125 ml.

El frasco de vidrio debe contener antes de ser esterilizado, una

concentración de 0.1 ml. de una solución al 10 % de tiosulfato de sodio

para impedir la aooi6n bactericida del cloro, si date se encontrara pre-

sente .

II.2. Para Análisis Cromatográfioos:

Para el análisis de colesterol y ooprostanol en agua debe muss--

trearse en un fraseo de vidrio color ámbar de bona snobs, con tapón recu-

bierto de teflón, con capacidad de 1 lt.

Previamente debe ser lavado con detergente y mezcla ordmica, enjua

gando posteriormente perfectamente con agua destilada y después con aceto

na y hexano para evitar que permanezcan en el frasco, trazas de compuestos

orgánicos, que producirían interferencias en el análisis.

II.3. Téonicas de Muestreo

11.3.1 . Análisis Baoteriol6gioost

Se introduce rápidamente el frasco debajo de la superficie del a-

gua a una profundidad de 20 a 30 cm ., se quita el tapón dentro del agua y

se dirige la boda del mismo en sentido contrario al de la corriente para

evitar el contacto del agua con las manos ; antes de que se lleáe completa

mente, tapar el frasco dentro del agua.

II.3.2. Análisis Cromatográfioos:

119

Se introduce el frasco sin tapa en posición horizontal a una pro-

fundidad de 30 cm. aproximadamente colocándola a contracorriente, permi -

tiendo que se llene completamente, en cuanto se saca el frasco del agua —

se requiere preservar la muestra ya que tanto el colesterol como el coproa

tanol son rápidamente removidos en un sistema de agua debido a la activi-

dad miorobiol6gica.

Existen dos métodos efectivos de preaervaci6n s (a) 1 ml . de clo-

ruro mercúrico (Hg C12) al 1 % en agua destilada por litro de muestra, (b)

1 ml, de ácido sulfúrico concentrado (H2 SO4) por litro de muestra . El cos

servador debe agregarse inmediatamente después del muestreo, guardando la

muestra a una temperatura de 4°C . hasta la realisaoi6n de sus análisis.

120

III . PROChMIMIENTO D.ANÁLISIS

III .1 . Equipo,Material y Reaotivos.

111 .1 .1 . Análisis - Bacteriológicos s

Equipo y material para conforms totales r

a) Incubadora equipada con dispositivo mecánico pars la circula-ción del aire ; termómetro exacto con termostato de funoionamiento perfecto.

b) Batista de esterilización de aire caliente capas de indicar conprecisión, temperaturas entre 160 y 180°C.

o) Autoclave en perfeoto funcionamiento con termómetro y manómetroexactos.

d) Potencáómetro.

e) Balanza de sensibilidad menor de 2 gramos.

f) Recipiente de cristal Pyrex o de acero inoxidable para la pre-paración de medios.

g) Pipeta con error de calibración menor de 2.5 %.

h) Pipetero de aluminio o acero inoxidable de medidas necesariaspara conservar las pipetas estériles.

i) Frasco.ow tubo de dilución de cristal Pyrex, con tapón de cris—tal, caucho o cápsula de roaca_de materiales que no produzcansubstancias tóxicas durante el proceso de esterilización.

j) Caja Petri de 100 mm . de diámetro, de cristal P,yrrex.

121

K) Tubo de ensaye con capacidad necesaria (25 x 200 mm ., 25 x 150

mm., 20 x 150 mm .) de cristal Pyrex, de preferencia con tapdn-

de rosca.

L) Tubo Durham o de hermdlisia.

M) Gradilla Metálica.

N) Mechero.

I) Asa de Siembra.

Reactivos para Coliformes Totales;

Medios; Caldo laotosado o caldo lauril triptosa; caldo lactosa bi

lis verde brillante (LBvB) ; agar eosins, agar nutritivo, azul de metileno

(RAM) a agar ENDO; agua destilada desmineralizada y desprovista de sustan

oias baotericidas o inhibidoras; agua de dilución.

Equipo y Material para Coliformes Fecales;

a) Baño de agua con control de temperatura (Ver lista de equipo

material para ooliformes totales).

Reaotivos para ooliformea Fecales;

Medios; Caldo lactosado o caldo lauril triptosa; medio E C.

Equipo y Material para Estreptoc000s Feoalest

A) Incubadora equipada con dispositivo meodnioo para la circula -

ción del aire, termómetro exacto con termostato de funciona —

miento.

B) Estufa de esterilización de aire oaliente capaz de indicar —

con precisión, temperaturas entre 160° y 180°C .

y

122

o) Autoclave, con termómetro y manómetro exactos.

d) Potenciómetro.

e) Balanea analítica de sensibilidad menor de 2 gramos.

f) Recipiente do cristal Pyrex, o de acero inoxidable para la pro

paraoión de medios.

g) Pipeta con error de calibración menor de 2,5 %.

h) Pipetero de aluminio o acero inoxidable de medidas necesarias

para conservar las pipetas estériles.

i) Prasoo o tubo de dilución de cristal Pyrex, con tapón de aria-

tal, caucho o cápsala de rosca de material que no produzca subs

tanoias tóxicas durante el proceso de esterilización.

k) Gradilla Metálica.

1) Mechero.

u) Asa de Siembra.

Reactivos para estreptococos fecales s

Medios= Caldo asida dextrosa ; caldo asida violeta de etilo.

I11,1 .2. Análisis Cromatogáficoa s

Equipo y material para ooprostanol y colesterol s

a) Rmbudo de separación de 2 litros.

b) Tubo ds centrifuga graduado con tapón esmerilado de 15 ml.

123

a) Matras volumdtrioo de varios tamaños 10 ml ., 25 ml. y 100 ml.

d) Rotoyapor con baño maría,

e) Matras para el rotavapor con entrada 24/40 de 500 ml.

f) Pipeta Pasteur o doetficadora.

g) Miorojeringa Hamilton de 10*.

h) Lana de vidrio silanizada.

i) Columns oromatográfioa con diámetro interior de 10 mm.

j) Cromatógrafo de gases Hewlett Packard 7620 A con detector de

ionización de flama ; con columna de vidrio de 6 ft z1/4in ,

empacada con 3 % de 0 V - 10 V en Chromosorb de 80 - 100 ma-

lles.

BOTA : Todo el material debe ser lavado con jabón, mezcla orómi-

ca y enjuagado con bastante agua de la llave, agua destilé

da, acetona y finalmente hexano grado plaguicida.

Reactivos para coprostanol y colesterol e

Todos los solventes deben ser de grado plaguicida y oheoados en el

oromat6grafo de gasea, para comprobar en pureza y evitar aei posibles ine

terferenoias.

Si no se encuentra la pureza deseada, debe obtenerse por medio de

destilación fraeoionada en un aparato totalmonhe de vidrio ..

a) Acetona - grado análitioo.

b) Acetonitrils - grado plaguicida.

124

o) Etanol al 70 % (v/v) etanol grado plaguicida en agua destilada.

d) Eaxano — grado plaguicida.

e) Eter de petróleo — grado plaguicida.

f) Acido olorhídrioo — grado plaguicida.

g) Cloruro de sodio al 20 % (P/V) — grado reactivo . En agua deatilá

da.

h) Alúmina neutra (óxido de aluminio).

i) Sulfato de sodio anhidro, grado reactivo, se calienta durante 12

12 hrs. a 6500C, y se almaoena en un frasco cerrado, contenido en

un desecador.

j) Patrones de coprostanhl y colesterol.

125

I1I .2. Metodología Analítica.

111.2.1 . Análisis Baoteriológiooa 1

Técnica de Tubos Múltiples de Fermentación s

El procedimiento de tubos múltiples en la determinación de la densi-

dad de conformes totales y coliformes fecales considera 3 etapas $ la prue

ba presuntiva, prueba confirmativa y prueba complementaria . Mn la prueba

presuntiva, la actividad metabólica de las bacterias es estimulada vigoró-

samente y ocurre una selección densa de los organismos, que utilizan la $—

lactosa. Después de la incubación a 35 0C, un cultivo de cada tubo gas —

positivo en la prueba presuntiva se transfiere a un tubo de medio para la

prueba conffirmativa . Bata prueba reduce la posibilidad de resultados fal-

sos y gaspositivos que pueden ocurrir por la actividad metabólica de los

organismos formadores de esporas o por la producción sinargétioa de gas,

debido a que algunas capas bacterianas no pueden, individualmente produ-

cirla a partir de la fermentación de la lactosa . Es ocasionalmente necesa

rio aislar estas bacterias productoras de gas e identificarlas como con.

formes, por la prueba complementaria para verificar que eeta prueba con--

firmativa ha eliminado selectivamente todos los tubos con resultados pos,

tivoe falsos.

Procedimiento para Coliformes Totales.

En la técnica del IMP se deben utilizar series de tubos, los cuales

constan de tree diluciones por lo menos ( 10 .0, 1 .0, 0.1 ml .) y por. cadaaerie de dilución debe haber 5 tubos.

Prueba Presuntiva s

Inocular una aerie de tubos de fermentación que tengan caldo lactosa

do 6 caldo lauril triptosa con cantidades apropiadas de la muestra que se

va a analizar (múltiplos o submúltiplos de 1 ml .)

Incubar loa tubos de fermentación inoculados a 35 ± 0.5 00.

126

Examinar oads tubo a las 24 ± 2 horas.

Los tubos quo presenten formación de gas se consideran positivos.

Los tubos que no presenten formación de gas se vuelven a incubar

otras 24 ± 2 horas.

La ausencia de gas dentro de 48 + 3 horas, indicará una prueba no-

_ gativa, es decir ausencia de coliformes y por lo tanto el análisis quedará

concluido.

Prueba Confirmativa s

Los tubos positivos de la prueba presuntiva se resiembran con una

ass de siembra en caldo lactosa bilis verde brillante (LBvB) y se incuban a

35 0.5°C.

Examinar cada tubo a las 2412 horse.

La formación de gas dentro de 48 + 3 horas, constituye una prueba

confirmativa de la presencia de coliformes.

La ausencia de gas al final de 48 ± 3 horas, indicará que no se en

cuentra presente el grupo coliforme.

Prueba complementaria $

De los tubos positivos de LBvB se resiembra con una asa por catrina

en cajas con medio &AM incubando a 35 ± 0.5°C y se bacon observaciones a las

24 horas.

Cuando existe la presencia de colonias típicas es una prueba posi-tiva, se toma una muestra utilizando el ass y se resiembran $

a) En tubos de fermentación Don caldo lactosado a 35 ± 0.5°C. Se -

observa de las 24 a las 48 horae. La producción de gas ea una -

prueba positiva .

127

b) En tubos con agar inclinado a 35 ± 0.5°0, se observa a las 18 -

24 horas y se hacen preparaciones gram.

o) Tinoión Gram. La presencia de bacilos gram negativos no esporu-

lados, son una prueba complementaria positiva.

Procedimiento para Coliformes Fecales i

Prueba Presuntiva s

Trasferir 1 ml. de las diluciones decimales apropiadas a loa tubos

de fermentación con caldo lactosado o caldo lauril triptosa e incubar a 35

± 0.5°C por 24 - 48 horas.

Prueba Confirmativat

De loa tubos positivos (loa que presentan producción de gas), inocu

lar con un ass a tubos de fermentación con medio BO.

Incubar a 44.5 ± 0.2°C en baño maría por 24 ± 2 horas.

Una prueba positiva será la producción de gas. Leer el resultado

en las Tablas del BAP que se presentan al final de setae técnicas.

Procedimiento para estreptococos fecales s

Técnica de dilución en tubos Mdltiples.

Prueba Presuntiva;

Inocular 1 ml . de las diluciones decimales apropiadas a tubos de

ensaye que contengan caldo asida dextrosa e incubar a 35 + 0 .5°C por 24-48

horas .

Se examina la presencia de turbiedad o de precipitado después de 24

horas. Loa tubos sin turbiedad son reincubados nuevamente por otras 24 ± 2

horas .

128

Si después de 48 horas se observa turbiedad, se efeotda la prueba

confirmativa ; en calo contrario, se considera el resultado como negativo.

Prueba confirmativa s

Todos los tubos que presentan turbiedad pasadas las 24 6 48 horas

de incubación, son confirmadas en caldo asida - etil - violeta.

Con un ass de inoculación se transfieren tres siembras de cada tu-

bo positivo presuntivo a un tubo de ensaye conteniendo mediá de cultivo pa

ra la prueba confirmativa.

Se incuba a 35 + 0.5 0C durante 24 - 48 horas.

Loa tubos positivos para estreptococos fecales presentan un botón

pdrpura en el fondo, aeal9yo

n .ts' tl@r una turbiedad densa.

Se oalcula el NMP.

III.2.2.- Análisis Cromatográfioos s

Táonioae de Sxtracoión.

- A oada litro de muestra preservada se le agregan 2 ml'. de ácido -

clorhídrico concentrado y 5 ml. de una solución de cloruro de sodio al 20 %

en agua destilada.

Se agregan 100 ml . de hexano y se agita durante 45 min. en un agitl

dor magnético.

Se transfiere la muestra y el extracto a un embudo de separación -

de 2 litros, regresando la fase acuosa a la botella.

Lavar los extractos de hexano combinado en el embudo de separación,

dos veces, con porciones de 50 mi . de etanol al 70 %, descartando la por-

ción de etanol.

Lavar los extractos de hexano combinado, dos veces, con porciones

129

de 50 ml. de aoetonitrilo . Descartar loe lavados de aoetonitrilo.

Se seca el extracto pasando el extracto de hexano a través de

una columna empacada con 20 gr. de sulfato de sodio prelavado con 40-

ml . de hexano. Enjuagar la columna con 30 ml . de hexano, para asegu —

rar la completa recuperación de la columna y colectar el extracto y—

el lavado de hexano en un matraz redondo de 500 ml.

Evaporar el hexano en un rotavapor a 35 0C, para que quede un—

concentrado de 3 ml.

Transferir cuantitativamente el extracto de hexano a un tubo de—

centrifuga y lavar el matraz dos veces con porciones de 2 ml . de hexa

no. Agregar este lavado al tubo de centrifuga.

Evaporar los extraotos de hexano con una corriente de gas ni-

trógeno hasta un voldmen de 1 ml.

Clean Up (Limpieza) .

130

Se preparan las micro columnas como sigue!

Se tapona una pipeta volumétrioa con un poco de lana silanizada.

Después se le colocan 5 cm. de alumina, golpeando la columna continuamen

te para asegurar un empacado uniforme . Se agrega después 1 cm. de sulfa-

to de sodio anhidro.

Se transfiere cuantitativamente el concentrado del extracto de -

hexano en la columna . Lavar el tubo de centrifuga dos veces con porcio -

mes de 2 ml. de Etter de petróleo y agregarlo a la columna.

Se eluye la micro columna con 10 ml . de eter de petróleo y se -

descarta esta fracción.

Eluir la columna con 6 ml. de etanol y conectar en un tubo de --

oentrifuga.

Se evapora a sequedad con una corriente de gas nitrógeno y se lle

va a un voldmen de 1 ml . con hexano. Registrándose el voldmen exacto.

De aquí se toma una alícuota con la microjeringa (de 2 a 6¡al)-

y se inyeota en el oromatógrafo de gases, donde se realiza la completa -

separación de la muestra a través de la columna, posteriormente es detec

tado el compuesto (ooprostanol y colesterol) en el detector de ioniza -

cien de flama y por último graficada la respuesta del aparato en forma -

de picas que forman los cromatogramas.

Previamente se tienen preparados los patrones de coprostanol y -

colesterol, loa cuales están diluidos en benoeno a diferentes concentra-

ciones, ya que se requiere inyectar diferentes alicuotas de los patrones,

para llevar a cabo la identificación, la cual se hace midiendo los tiem-

pos de retención y la ouantificaoión que se realiza con las alturas de -

los picos formados en el cromatograma.

131

IV.— CALCULOS Y RESULTADOS

IV.1 .— Análisis Baoteriológimos.

Coliformes Totales y Peonies s

La fórmula que se utiliza para obtener los resultados tanto de oo-

liformes totales como fecales ea la siguientes

NMP/100 ml . f Valor de NIP en Tabla z 10

Voldmen de Muestra.

El valor de el NIP se lee directamente en una Tabla, que se enoueñ

tra al finalizar el inciso.

Loa resultados se encuentran a continuación s

NUMERO DE

MUESTRA

VALOR DE NIP

TN TABLA

VOLUMEN DE

MUESTRA

MP/ 100 ml.

* 350 ta-2 350 z 1o2

2 350 1Ó 2 350 z 102

3 350 1Ó-2

350 z 1o2

4 350 10-2 350 z 102

5 350 102 350 x 1o26 350 1Á-2 350 z 102

7 920 1ó-2 920 z 102

8 920 10^2 920 x 102

9 540 102 540 z 10210 540 10"2 540 x 10211 350 1Ó 2 350 z 102

12 350 1Ó2 350 z 102

13 350 1Ó 2 350 z 102

14 350 10~2 350 z 102

15 350 10—2 350 x 102

16 540 10-2 540 x 102

17 350 10+2 350 x 10 2

132

NUMERO DE

MUESTRA

VALOR DE NMP

EN TABLA

VOLUMEN DE

MUESTRA

NMlP/ 100 ml.

18 350 102 350 x 102

19 350 1Ó—2 350 x 102

20 920 10 2 920 z 102

21 540 10-2 540 z 102

22 540 102 540 z 102

23 350 10 2 350 x 102

24 350 1Ó2 350 z 102

25 350 ió2 350 x 1o2

26 920107

2 920 z 102

27 540 1Ó-2 540 z 102

28 540 10 2 540 z 102

29 35010-.

2 350 x 102

30 92010—

2 920 z 102

Estreptococos Fecales s

La fórmula que se utiliza para los oáloulos de los resultados de estrep-

t000cos fecales es la misma que para ooliformes totales y fecales, de igual

manera el valor de NM7 se lee en la Tabla.

Loa resultados son los Siguientes s

NUII O DE

MUESTRA

VALOR DE NMP

EN TABLA

VOLUMEN DE

MUESTRA

NMP/100 ml.

~ 240 1072240 x 102

2 24010—2

240 x 102

3 240 1Ó-2 240 x 102

4 240 1072240 x 10 2

5 240 1C2 240 x 102

6 240 1Ó—2 240 x 102

7 540 1Ó-2 540 z 10 2

350 102 350 x 102

133

NUMERO DE

VALOR DR NMP

MUESTRA

EN TABLA

VOLUMEN DE

MUESTRA

NMP/l 00 a.

9 350 102 350 x 102

10 240 10-2 240 z 102

11 240

. 10-2 240 x 102

12 240 102 240 x 102

13 240 102 240 x 102

14 240 10-2 240 z 102

15 240 102 240 x 102

16 350 10-2 350 z 10

17 240 10-2 240 x 102

18 240 10-2 240 x 102

19 350 10-2 350 z 102

20 240 tÓ-2240 x 102

21 350 . 10-2 350 x 102

22 240 10-2240 x 102

23 240 10-2240 x 102

24 240 10-2 240 z 102

25 240 10-2 240 x 102

26 540 10-2 540 x 10227 350 10_-2 350 z 10228 350 1Ó-2

350 ' z 10229 240 -210 x 102'24030 540 1Ó-2

540 z 102

134

IV.2.- Análisis Cromatogrdfioos.

Para realizar los cálculos para las concentraciones de coprostanol,

se efeotúan las oorrespondientes sustituciones en la siguiente f6rmulat

ppb =

= AID X. Vie X Ce X

x Atm X. 103microgramos

litro coprostanol

Ac

Vim

Vm

Atc

Donde'

Am = altura del pico de la muestra, cm.

Ao = altura del pico del patrón, cm.

Vie- voldmen inyectado del patr6n.

Vim- voldmen inyectado de la muestra.

Ce = ooncentraoi6n del patr6n, en ml.

I = voldmen de diluoi6n de la muestra extraída, ml.

Vm = voldmen inicial de la muestra.

Atm= atenuación del amplificador en la muestra.

Ate= atenuación del amplificador en el patr6n.

103= constante para transformar mg/ml. a mg/l.

Cuando se trabaja a una misma atenuación, no es necesario poner ep .,

tos factores en la fórmula.

Loa resultados calculados son loe siguientes'

NW R0 DE

MUESTRA

Am Ae Vie Vim COPEOSTANOL

/1.

1 0.8 0.6 4.5 5.0 0.0608

2 0.5 0.6 4.0 3.0 0.0563

3 0.8 0.6 5.0 5.0 0.0675

4 0.6 0.5: 4.0 4.0 0 .0608

5 0.6 0.6 4.0 3.0 0 .06756 0.7 0.8 5.0 5.0 0.0443

7 0.8 0 .7 5.0 3 .0 0 .0965

8 0.6 0.5 5 .0 3 .0 0.01013

135

NUMERO DB

1flü88TRA

Am Vie Vim COPROSTANOL

/1

9 0 .6 0 .5 4.0 3.0 0.0811

10 0.9 0.6 5.0 4.0 0.0760

11 0 .6 0 .5 4.0 4 .0 0 .0608

12 0.7 0 .5 4.5 5.0 0 .0638

13 0 .7 0.6 4 .5 4.0 0.0665

14 0.6 0.5 4 .5 4.0 0 .0684

15 0.6 0 .7 4.0 3 .0 0 .0579

16 0 .7 0 .6 5.0 4.0 0.0739

17 0.5 0.4 5.0 5 .0 0.0633

18 0.5 0.4 5.0 5.0 0.0633

19 0.9 0.7 4.0 4.0 0.0651

20 0.9 0 .6 4.0 3.0 0.1013

21 0 .8 0 .6 5 .0 4.0 0 .0844

22 0 .7 0 .6 4.0 3 .0 0 .0788

23 0 .8 0.7 4 .0 4.0 0 .0579

24 0 .7 0 .6 5.0 5.0 0 .0591

25 0 .7 0 .5 4.5 5.0 0.0638

26 0 .7 0 .5 4.0 3 .0 0.0946

27 0.7 0.8 5 .0 3.0 0.0739

28 0.7 0.6 5 .0 4.0 0.0739

29 0 .7 0.9 5 .5 4.0 0 .054230 0.8 0.6 5 .0 3 .0 0 .1126

8e tiene ques

Ce = 0.1015

X = 0 .5Vm = 1000

Por lo que al realisar las operaciones se obtiene una constante que es:

Ce z % I 103 = 0.1015 z 103 = 0.0507o.nTe

136

R E S U L T A D O S

NUMERO BE

MU!'sSTRA ,_

FECHA DE

LOCALIZACION

MUESTREO

COPROSTANOL

8/l

COLIFORMES

TOTALES

NMp/ 100 ml

COLIFORMES

FECALES

ESTREPTOCOCOS

FECALES

l 30-I%-79

Embarcadero de 12 0.0608 350 : 102 350 x 102 240 x 102

2 30-14-79

ohimiloo 0.0563 350 x 102 350 x 102 240 x 102

3 30-11-79

r 0.0675 350 z 102 350 x to2 240 x to2

4 30-11-79

" 0 .0608 350 x to2 350 z 10 2 240 x to2

5 30-11-79

" 0 .0675 350 z 102 350 x 102 240 z 102

6 5-%1I-79

" " 0.0443 350 z to~ 350 z 1o2 240 x to2

? 5-111-79

" It 0.0965 920 x 102 920 x to2 540 z 102

8 5-111-79 0.1013 920 z io2 920 x 102 350 x 102

9 5-4I1-79 " 0 .0811 540 x 102 540 x 102 350 x 10210 5-4II-79

" " 0 .0760 540 x 102 540 z 102 240 x tot

11 10-%II-79 0.0608 350 x 102 350 z 102 240 x to2 .12 10-111-79 0.0638 350 z 102 . 350 s 102 240 x 10213 10-111-79

" " 0 .0665 350 z 102 350 x 102 240 x 10214 10-1II-79 0 .0684 350 x 102 350 s 10 2 240 x 10215 10-x11-79

" " 0.0579 350 x 102 350 x 102 240 x 10216 13-111-79

" 11 0 .0739 540 x 102 .540 z 102 350 x to217 13-XII-79

" "

" 0 .0633 350 x 102 350 x 10:

240 x 10218 13-]CII-79 0 .0633 350 z 102 350 z 102 240 x 10219 13-111-79

" " o .oó5t 35o z 102 35o z to2 350 x 10220 13-XII-79

" "

" 0 .1013 540 z 102 540 x 102 240 z 102

137

NUMERO DE

FECHA DE

LOCALIZACION

MUESTRA

MUBSTBEO

COPROSPANOL

s/1COLIFORMES

TOTALES

mF/100m1

COLIFORI[ES

FECALES

ESTREPTOCOCOS

FECALES

21

16-xII-79Embaroadero de xo 0 .0844 540 x 10 2 540 x 102 350 x 10 222

16-JCII-79

oLimiloo 0 .0788 540x 10 2 540 x 102 240 x 102

23

16-I1I-79

" 0.0579 350 x 102 350x 102 240 x 102

24

16-JCII-79 0.0591 350 z 102 350x 102 240 x 102

25

16-%II-79

"

"

" 0 .0638 350 x 10 2 350 z 102 240 x 10 2

26

19-x12-79

"

" 0.094 6 920 x 102 920 x 102 540 z 10227

19-111-79 0.0739 540x 10 2 540 z 102 350 z 10228

19-xII-79 0.0739 540 x 102 540 z 102 350 z 102

29

19-111-79

"

"

" 0.0542 350 x 10 2 350 z 102 240 x 102

30

19-1II-79

"

"

" 0.1126 920 x 102 920 x 102 540 x 10 2

138

V. ANÁLISIS ESTADISTICO Y DISCUSION DE RESULTADOS

Habiéndose demostrado que existe y es bastante bueno el coefi-

ciente de correlación, se procedió a encontrar las constantes en la acuse

oión de regreoión logarítmica para oada caso, de la manera siguiente:

Eouaoi6n de Regresión Logarítmica

Y m a+b (1n x)

Donde :

Yi — b in x)

Yiin xi —~ in Xi Yi

(In %i)2 — ñ (

ln

xi

)2

a

sb

(1ñ

139

COBEELéCION t C0PROSTANOL — COLI101i& 8 TOTALES

Y . a + b (In X)

1Yi In Xi — ñ in Xi Ti

b =

Donde :

Y = Coprostanol ()Mil)

X = Conformes Totales (NJ P/100 ml .)

23.203924 - 236038696--

3451 .56

- 3447 .766403

0 .165228

3 .7936

b

0 .04

( Yi - b in Xi)

= ~a

( 2.1496 - 0.04 x 321 . 6á)

a = -0 .35716

Sustituyendo en la ecuación de regresión logarítmica se obtienen las --

constantes :

Y = — 0.357 + 0.04 (1n X)

Resultando un coeficiente de correlación des

Y = 0.93795

b =

b

1ña =

140

CARRR7+bCICmT s COPBOSPADTOL - COLIF08EBS FRC :►LRS

Y = a+b (In X)

Yi in xi -

in xi Yib e

~~-(In xi) 2(

In xi )2

Dondei

Y = Coproatanol ( Ng/l)

X = Coliformes feoales (REP/100 ml .)

b = 23 .150235 - 23 .038696

3439 .8112 - 3436 .4122

0.1115393 .399

b= 0 .0328

a = i ( Yi -b 1n Xi )

a = 30 ( 2.1496 - 0 .0328 X 321 .53)

a - 0.2798

Substituyendo en la eouacidn de regresión logaritmioa se obtienen

las constanteas

Y = 0.2798 + 0 .0328 (in x)

Resultando un ooefioiente de correlación des

Y = 0.90

b =

141

b

b

CORBELACION * COPROSTANOL- ESTREPTOCOCOS FECALES

Y - a+b (1n 1)

1b Yi ln Xi - m ln Xi Yi_

(In Xi) 2 -

ñ (

In Xi) 2

Donde*

Y - Coprostanol ( )ig/1)

X - Estreptococos fecales (IMP/100 ml .)

22.1243 - 22.032683

9 3253.7855 - 3151 .67~

0.091617

2 .1155

b = 0 .0433074

a =1- ( Ti - b

In Xi)n

a - 3O 1 (2.1496 - 0.0433074 x 307.49)

a - -0 .372

Substituyendo en la eouación de regresión logarítmica se obtienen las cona

tantea *

Y - 0.372 + 0.0433 (1n X)

Resultando un coeficiente de correlación de *

Y = 0 .73

142

Este estudio se cumple para un rango de ooprostanol de

0.0443 a 0.1126 oon una media % = 0.07165 y una desviación estándar

S = 0.01605 , de donde obtenemos el coeficiente de correlación y la ecua

oión de regresión logarítmica para t

Coprostanol / Coliformes Totales,

Coprostanol / Coliformes Fecales y

Coprostanol / Estreptococos Fecales.

143

VI.— CONCLIISIONES

Para un rango de 0.0443 a 0.1126 de coprostanol se obtuvo

un coeficiente de correlación de t

Coprostanol / Coliformes totales — 0 .93795 ,Coprostanol / Coliformes fecales — 0 .90

y

Coprostanol / Estreptococos fecales — 0 .73

Considerando, por los valores obtenidos, una correlación positi

va, se cuenta con resultados aoeptables y confiables.

Los resultados de este estudio se aplicarán dependiendo de la —

exaotitud, tiempo y costo en el que se requieran los análisis, ya que la

determinación de coprostanol por oromatograffa de gases proporciona datos

exactos y confiables ; sin embargo, el análisis es muy costoso y requiere

de un tiempo de extracción de la muestra muy largo.

En el caso del análisis bacteriológico de la muestra, proporcio

na el NMP/100 ml. por lo que se considera inexacta y poco confiable, sin

embargo, se puede trabajar con gran número de muestras y el costo es muy

bajo en comparación con las determinaciones aromatográficas.

Deberá tenerse en cuenta que este estudio se realizó en un sólo

tipo de agua con caracteristicaa especificas de aguas residuales domésti-

cas, por lo que las constantes de la ecuación de regresión logaritmica, no

podrán aplicarse a cuerpos de agua con otras características.

144

VII.— RRCO1NDACIONNS

Se sugiere la aplicación de un estudio similar a éste, para o-

tro tipo de cuerpos de agua, en donde quizá intervengan factores que di-

ficulten la correlación de las dos determinaciones, pero que proporcionen

las bases de investigaciones futuras.

Se recomienda ampliar este estudio para diferentes puntos de

muestreo dentro del mismo cuerpo receptor, con el fin de obtener un ran—

go para la evaluación del coprostanol.

145

Indice del NMP y límite confiable de 95% para varias oom-

binaciones de resultados positivos y negativos cuando se-

usanl 5 tubos con porciones de 10 Ml . en cada uno, 5 con—

porciones de 1 M1 . y 5 con porciones de 0.17M1.

No. de tubos con

reaooionee positivas

Indice

del

NMP

por

Limite Confiable Número de tubos con

reacciones positivas

Indice

del

NMP

por

100111

Limite Confiable

de 95% de 95%.

Inferior Superior

5 tubos

con

10 Ml.

5 tubos

con

1 M1 .

5 tubos

con

0.1 Ml

5 tubos

con

10 Ml

5 tubos

con

1 Ml .

5 tubos

con

0.1 Ml .

Inferior Superior

100 Ml

0 0 0

o 0 1 2 40.5 7 4 2 1 26 9 78

o 1 0 2 Z0.5 7 4 3 0 27 9 ao

o 2 0 4 Z0.5 11 4 3 1 33 11 93

4 4 0 34 12 93

1 0 0 2 40.5 7

1 0 1 4 4 0.5 11 5 0 0 23 7 701 1 0 4 40.5 11 5 0 1 31 11 89

1 1 1 6 <0.5 15 5 0 2 43 15 110

1 2 0 6 <0.5 15 5 1 0 33 11 93

5 1 1 46 16 120

2 0 0 5 <0.5 13 5 1 2 63 21 1502 0 1 7 1 172 1 0 7 1 17 5 2 0 49 17 130

2 1 1 9 2 21 5 2 1 70 23 170

2 2 0 9 2 21 5 2 2 94 28 220

146

CONTINUACION DE LA TABLA

No. de tubos con

reaocianes positivas

Indios

del

NMp

por

100 M1 .

Limite Confiable Ndmero de Tubos con

reaooiones positivas

Indice

del

NMP

Ltmite Confia-

de 95% ble de 95%

Inferior Superio$Inferior Superior5 tubos

con

10 M1 .

5 tubos

con

1 M1 .

5 tubos

con

0.1 Ml

5 tubos

con

10 M1 .

5 tubos

con

1 Ml .

5 tubos

con

por

0.1 Ml .

100 M1.

2 3 o 12 3 28 ~$ 3 0 79 25 1905 3 1 110 31 250

3 o o 8 1 19 5 3 2 140 37 3403 o 1 11 2 253 1 0 11 2 25 5 3 3 180 44 5003 1 1 14 4 34 5 4 o 130 35 3003 2 0 14 4 34 5 4 1 170 43 4903 2 1 . 17 5 46 5 4 2 220 57 7003 3 o 17 5 46 5 4 3 280 90 850

5 4 4 35o 120 1,000

4 o o 13 3 31 5 5 o 240 68 75o4 o 1 17 5 46 5 5 1 350 120 1,000

4 1 o 17 5 46 5 5 2 540 180 1,400

4 1 1 21 7 63 5 5 3 920 300 3,200

4\ .. 1 2 26 9 78 5 5 4 1600 640 5,800

4 2 o 22 7 67 5 5 5 7/ 2400

147

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149

INFORME SOBRE LA ItIVESTIOACION

DB LA

TSCNICA DB CROMATOGRAFIA EN CAPA .FINA

150

IN D I C E

1.- A N T E C E D E N T E S

2.- I N T B O D U C C I O N

3.- F U N D A M E N T O S T P O B I C O S

4.•• OBJETIVOS

~.~•1I3TODOLOGIA

6.- C O N C L U S I O N E S

7.- R B F S B B N C I A S B I B L I O G B A F I C A S

//1/1/////////i'//

151

1 .— ANTECEDENTES

Los plaguicidas son usados para exterminar plagas, pero al mimo

tiempo pueden tener efectos tóxicos sobre un rango grande de organismos

no venenosos.

En realidad, ciertos plaguicidas son omnipresentes . La acción com-

binada del aire y el agua, ha llevado residuos de plaguicidas muy persie-

tentes a machos sitios del globo terráqueo,

Por ejemplo, residuos de plaguicidas organoclorados han sido enooá

tractos en animales árticos y antárticos, en el aire sobre el Ooáano Atlán

tico y en los lugares más recónditos de nuestro planeta.

Algunos plaguicidas son agotados rápidamente por la luz del sol y

por organismos existentes en el suelo y el agua, sin embargo otros persiá

tan por mucho tiempo . Algunos productos de descomposición son tan ó más —

tóxicos que el plaguicida original.

Loa plaguicidas en la atmósfera viajan grandes distancias, ayudando

a la formación de ozono, el cual es fototóxioo y puede dañar a las cose—

chas y a la salud humana.

Los plaguicidas olorados existentes en el agua son siempre absorbi

dos por los organismos acuáticos en un proceso llamado "Bioamplificaoi6n",

la cual puede formar substancias tóxicas arriba de los niveles que son da

ñinoe para loe organismos superiores en la cadena alimenticia . Este sín-

drome no está limitado sólo a los organismos acuáticos.

Los plaguicidas en el suelo, pueden ser encontrados en las partial

las 6 acarreados a gran distancia por el agua 6 por el polvo . Los organis

mos del suelo siempre logran la degradación de los plaguicidas rápidamen-

te.

Los efectos de loe plaguicidas sobre la fauna puedeaser inmediato

(agudo) y a

largo plazo ( orónioo)

152

&visten numerosos reportes en loa cuales se habla de envenenamien -

to de miles de peces y organismos acuáticos, así como las aves, por pla--

guioidas en el agua 6 sobre terreno tratado . Muchos plaguicidas interfie-

ren 6 interrumpen las funciones fisiológicas vitales en plantas y animales.

bn muchos caaos, esas funciones son similares en una gran variedad de or-

ganismos.

Por ejemplo, algunos plaguicidas que son más peligrosos para la sé

lud humana, son insecticidas que atacan a los sistemas de enzimas, que son

una parte básica en la transmisión nerviosa en los insectos así como en -

los humanos. Ciertos herbicidas pueden actuar como veneno para el sistema

nervioso. Otros plaguicidas se combinan químicamente con enzimas esencia-

les para las plantas y metabolismo animal 6 con la función respiratoria -

causando en esos sistemas una función anormal.

2.- INTRODUCCION.

R1 incremento de plaguicidas organoolorados persistentes, por su

excesiva aplicación y mal uso, ha originado su presencia en nuestro medio

generalmente en aguas superficiales causando la muerte de peces y aves, -

deteriorando su alimentación y contaminando inclusive la alimentación del

hombre. Su peligrosidad aumenta al ser resistente a la degradación quími-

ca y bioquímica, por lo gmelgrandes volúmenes de plaguicidas son arrastró

dos al mar con fatales consecuencias para su flora y fauna.

Por tal motivo y conciente de la situación la Secretaria de Agri-

cultura y Recursos Hidráulicos, por medio de la Dirección General de Pro-

tección y Ordenación Eoológioa, ha realizado estudios diversos tendientes

a prever y controlar dicha contaminación, enfocando la Subdirecci6n de In

veatigación y Entrenamiento, la parte concerniente a los análisis oromato

gráficos para la detección de residuos de plaguioidas en agua lo que es u

na razón suficiente para llevar a cabo la investigación "La técnica croma

tográfica de Capa fina, sus usos, ventajas y desventajas con otras DEetodó

logias."

3.- FUNDAMENTOS TEORICOS.

15 3

La Cromatografia abarca una gran variedad de técnicas de separación

sumamente efectivas . La oaróoterístioa común de todas ellas es que los --

componentes de la muestra se distribuyen entre doe fasesp una de las cuales

es estacionaria mientras que la otra se filtra a través de loa intersticios

ó sobre la superficie de la fase fija . El desplazamiento de la fase móvil

se manifiesta en una migración diferencial de los componentes de la muestra.

Lou diversos mecanismos que causan la migración diferencial constí

tuyen los diferentes tipos de cromatografía.

No hay restricciones sobre la naturaleza de las dos fases. La fase

móvil puede ser, liquida ó gaseosa, resultando las siguientes oombinacio-

ness

CASE MOVIL FASE ESTACIONARIA ABREVIACION

Liquida Sólida CLS

Gas Sólida CGS

Liquida Liquida CLL

Gas Liquida COL

La CLS generalmente ea la absorción sobre la superficie del sólido

ó una reacción reversible que resulta del intercambio de iones a la forma

oión de complejos.

La CGS normalmente es adsorción, pero puede ser capturada dentro —

de la estructura microscópica del sólido ó una reacción quimica reversible

con el sólido.

La CLL ea participación del soluto, definida por an solubilidad ré

lativa en los dos líquidos.

La COL es participación del soluto definida por la presión de vapor

potencial del soluto y la solución.

Hay varias formas de llevar a cabo el proceso cromatogrófico, depen

diendo de como se introduce la muestra y como se desplaza a través de la

154

fase estacionaria. Loa métodos comunes son t eluoión, desplazamiento y a-

nélisis frontal.

Elución.- La muestra se oolooa en capa delgada en la parte superior

a la columna (Fig . 1) . La fase móvil inerte (gas ó liquido), fluye a tra

vés de la columna arrastrando loa componentes de la muestra, pero no obs-

tante, sus moléculas se distribuyen entre las dos fases y permanecen una

cierta porción del tiempo en cada fase de aouerdo con el coeficiente de -

distribución correspondiente . Mientras permanecen en la fase estacionaria,

las moléculas no se desplazan en la columna . Así pues, la velocidad del -

desplazamiento promedio de todas las moléculas de una misma especie es fun

oión del coeficiente de distribución de la velocidad de la fase móvil . Eá

te método de alusión ea la técnica cromatogrdfica más ampliamente utilizó

da.

Desplazamiento .- La muestra se oolooa en una capa delgada en la parte

superior de la columna ( Fig . 2 ) . En lugar de la fase móvil inerte emplea

da en el método de eluoión, se utiliza squi una fase móvil activa para des

plazar la muestra prácticamente en au totalidad de la fase estacionaria.

Los componentes de la muestra que más retienen, tienden igualmente a

desplazar a los que se retienen menos . Se desarrollan asf zonas en órden

decreciente de sus coeficientes de distribución y una zona desplaza a la

inmediata anterior hasta que todos han salido de la columna.

Las principales ventajas del método de desplazamiento sont que la -

muestra no se diluye en grandes cantidades de efluentes y que la columna

se usa en toda su capacidad. Por otra parte hay tendencia de las zonas a

sobreponerse parcialmente y al final de la operación, la columna queda car

gads con el agente de desplazamiento qué a veces es dificil de eliminar.

Esta es la razón por lo que no se emplea mucho esta técnica.

Análiais Frontal.- La muestra se agrega constantemente mezclada con

la fase móvil (Fig. 3) . Dado que los componentes tienen coeficientes de -

distribución diferentes, la columna presenta capacidad diferente para cada

uno.

155

Desafortunadamente la oapaoidad para un componente determinado no

ea ajeno a la presencia de otras substancias . El que se retiene menos es

el primero en salir, pero no lo hace sino hasta que la columna se ha asta

rado con 41. Después de su aparición, el primer componente sigue saliendo

a una concentración constante hasta que la columna se natura también con

el segundo componente, entonces sebos componentes salen sin haberse sepa-

rado; este análisis se emplea principalmente para obtener datos termodind

micos.

4,- OBJETIVOS.

La finalidad del estudio como ya se indicó al principio, es el in

vestigar una de las técnicas cromatográficas existentes, la que se sabe es

muy versátil, rápida y da bajo costo, por consecuencia de gran interés pá

ra ser aplicada como prueba confirmativa de la CGL en la determinación de

residuos de plaguicidas en aguas.

Piaba tionica ea llamada "Cromatogrdffa .en Capa Nina".

' Seta investigación fué dividida en tres etapas fundamentales.

A) Entrenamiento del Personal.

B) Desarrollo de la Metodología.

C) Evaluación de resultados y conolusiones.

La primera etapa fué cubierta en un lapso de una somas, aeiatieñ

do el personal a un entrenamiento por parte de Sanidad Vegetal (dependen-

cia de la Secretaría de Agricultura y Recursos Hidráulicos), sobre la me-

todología usada y su aplicación.

Una ves conolufda la primera parte, se llevó a cabo la aplicación

de la técnica del Manual Analftico de Pesticides Vol . 1t experimentando -

con loe siguientes estándares de plaguicidas.

Aldrfn

Meto=icloro

Endrin

pp, DDS

Heptaoloro

0 'pDDD

5.- METODOLOGIA .

156

5 .1 . PRINCIPIO. Los extractos de muestra y estándares de referen- -

cia, son los oolooados en forma de manchas sobre placas de Al 203 y desarro--

liadas con heptano 6 aoetona al 2 .% en heptano.

Las planas reveladas son rociadas con AgNO 3 y expuestas a la luz --

UV.

El método es usado para obtener información adicional sobre la idea

tifioaoión de plaguicidas obrados determinados por C .G.L. y puede ser usa—

do oomo un método de análisis para residuos de plaguicidas donde la aromató

grafía de gases no está disponible . Los resultados son semicuantitativos.

5.2.— APARATOS.

Aplioador

Puente de Luz UV

Tanque Cromatogrfifioo

Pipetas marcadas

Desecador

Placas de vidrio 8" X 8"

Soporte de Placas

Rociador

Tablero

Plantilla

5.3.— REACTIVOS.

Acetona

MCLA DE REACTIVOS.

Acetona en Reptano

2 % ( V/V )

Peróxido de Hidrógeno

Alcohol, etanol

2— Fenoxietanol

Oxido de Aluminio

Nitrato de Plata

n— Reptano

Estándares

157

Solución acuosa de Acetona

50 % (Y/Y)

Reactivo Cromogénico.- Disolver 0,100 gr . de Ag2H03 en 1 ml. de

H2O. Agregar 20 ml . de 2 - Fenoxietanol, diluir a 200 ml. con acetona, a-

gregar'unas gotas de H 202 al 30 %y mezclar.

Guardar en la obscuridad toda la noche y decantar en un aspersor.

Desechar después de 4 días.

5.4.- PROCSDIMINñTT0.

A) Preparación de la capa adsorbente.

Preparación de la Placa .- Lavar las placas con agua destilada. Des

puéa enjuague las placas limpias con acetona y etanol y déjelas secar. Ca

losar las placas'sobre el tablero y asegurarse que no presenten huellas de

loa dedos 6 algún otro material adherente.

Adsorbente .- Para cubrir 5 placas, pesar 30 gr. de Al203 en un ma

tras erlenmeyer de 250 ml. Agregar 50 ml. de agua destilada, agitar mode

radamente por 45 . segundos, ya que la agitación violenta produce burbujas

que ocasionan marcas en las placas.

HOTAs Las suspensiones que contienen adsorbentes con aglomerantes

secan rápidamente; la operación completa desde la preparación hasta la co

locación de la suspensión en la placa, no debe exceder de 2 minutos.

Recubrimiento .- Después de agitar, inmediatamente vaciar la suspen

sión dentro del aplioador. Girar el cuerpo del aplioador con la mano 180 0'

dé5pués de pocos segundos la suspensión empezará a fluir por la salida.

Tomar el aplioador con ambaá manos y empujar con movimiento cons-

tante a través de la aerie de placas . Aproximadamente 5 seg. son requeri-

dos para el proceso de recubrimiento. Inmediatamente después de la aplica

ción, dar pequeños golpea en la orilla de la plantilla o agitarla suavemea

te para quitar las imperfecciones, mientras no se seque la suspensión.

Dejar secar las placas en esa posición durante 15 minutos ; entonces secar

las planas en una estufa por 30 minutos a 180°C ; después de éate tiempo

158

sanar las planas y dejar enfriar.

Examinar a la luz las planas cuidadosamente para observar algunas

imperfecciones o irregularidades (Fig . 4 a) . Desoartar las placas que muss

tren grandes fluctuaciones o manchas en la capa (Fig. 4 b).

Preparar 5 placas más después que la primera aerie es secada.

Limpiar el aplioador vigorosamente y secarlo antes de usarlo nuevamente.

Pre-lavado de la capa Adsorbente .- Raspar 0.5" de suspensión del

final de la orilla de la plana con una navaja (Fig. 4 o) . Verter 15 ml. de

acetona acuosa al 50% en una cámara. Cortar un pedazo de papel filtro . ..

Whatman No. 1, de 3/4" x 8", mojado con la solución acuosa de acetona y có

losado sobre la parte raspada a una distancia de 0.25", reoubriendo la oa

pa de adsorbente. (Fig. 5).

Colocar en una cámara, sellar con masking tape y desarrollar a 1 .5"

de la punta de la placa (75 - 90)minutos).

gáitsr la plana del tanque, quitar el papel filtro, invertir la -

placa y secar en la campana por 5 minutos. Henar la placa a 80°C por 45 -minutos. Sanar la plana del horno, enfriar y guardar en un desecador hasta

que se necesite. Use las placas preparadas dentro de la semana después que

fueron preparadas. El prelavado de la capa de adsorbente remueve interfe-

rencias de cloruros.

Colooaci6n de las muestras y estándares .- No los coloque cerca de

la orilla de las planas . Extrema distorsión de manchas ocurren durante el

desarrollo cuando son colocados ceros de la orilla.

Muestra.- Racer con el lápiz una marca de 1 .5" de fondo de la plaoa a ambos lados . La linea imaginaria entre dos puntos indica la mancha -

de la muestra 6 "líneas de origen".

Dibuje una linea completa a través de la placa de 5 .5" medidos des

de la orilla (Fig . 6 ); esta línea representa el solvente despdda del de-

159

sarrollo, el frente del recorrido ea de 4" (10cm.) . Sobre la arista más –

baja del adsorbents será el punto de partida a 0.75" do la orilla del lado

izquierdo da la placa y usando una plantilla como gota, hacer 18 marcas e

con lápis a intervalos de 6/16" . (Fig. 6) . (Henos marcas a intervalos ma

yores pueden ser usados) . Las marcas sirven como guías horisontales para

la aplicación de las muestras.

Para una determinación óptima semicuantitativa, ajustar la aliouó

ta de la muestra para que los residuos caigan dentro del rango de 0.005 –

0.1 ttg .

Colocar el extracto de la muestra con una jeringa de 1 – 3 ~tl y –probar con un volámen total menor de 10 pg. Usar la misma jeringa para las

muestras y los estándares y procurar que el tamaño de las muestras sea lo

más pequeño posible . (enjuagar la jeringa entre muestra y estándar).

8stâadar.– Colocar los estándares de plaguicidas y las mesolas sebre la misma placa junto con las muestras. Las manchas dé les estándares

deben tenor las siguientes oonoentracionest 0.002, 0.005, 0.001, 0.02, .6.

0.05, 0.1 y 0.2 pg. Las manchas menores de o.2 pg. son difíciles de cuan-

tificar y las manchar mayores de 0.55 pg. son difíciles de distinguir.

La determinación semicuantitativa es mejor alcanzada por coloca

ción intermendia de las muestras entre loe estándares en un rango de con-

centración variable.

Desarrollo.– Presaturar la cámara oolooande 75 ml . de solvente de

desarrollo antes de colocar las placas (30 minutos 6 más).

La presaturaoidn disminuye el tiempo de desarrollo y dâ uniformi-

dad a loe valores del factor de retardación 6 rotación R p.

Cuándo el frente del solvente alcanza justamente 10 cm . de la "lt

nea"dibujada, quitar la placa y secar por 5 minutos en la estufa . sol–

vente usado viaja rápidamente a través de la capa de Al 203 y la placa debe

ser sacada del lanque justamente cuando el frente del solvente alcanza la

160

.

lines de 10 cm. Loa compuestos con valores altos de Rp se traslaparán al

frente del solvente, si la placa está a la izquierda de la cámara.

5.5 .— vISUALIZACIOH.

Rociado.- Sostener la placa en un soporte y rociar equitativa y

lentamente usando movimientos del rociador perpendiculares a la dirección

del flujo del solvente . Rociar hasta que la plat's aparezca traslüoida o

incorporada con reactivo . La falta de Spray dará como resultado una sen-

aitividad pobre . Después del rooiado;.seoar la plana por 15 minutos en la

estufa.

Revelado.- Exponer las planas a una fuente de luz ultravioleta haá

ta que las manchas de los estándares de menor concentración aparezcan . Cin

0t' nanogramos (ng.) de plaguicidas olorados deberán ser visibles despuésde 15 - 20 minutos, de exposición . Tiempos de exposición mayores de 30 mi

putos no dañan las placas. Para mejores resultados colocar las placas 3"

debajo de la lámpara. Una regla general a seguir es exponer tanto como sea

necesario para completar la delineación de las manabas de concentraciones

menores.

Rvaluaoión .- La evaluación de los resultados de loa residuos de --

plaguicidas se lace de aouerdo a loa valores obtenidos de BP, que está dado

por la siguiente expresiónt

Er Distanciadeldesplazamientodel soluto

Distancia del desplazamiento del solvente.

y por la comparación visual de la localización, tamaño e intensi-

dad de las manchas de los estándares con las muestras (Rig. 7).

Limites de Detección.- Loa siguientes limites de detección han sido

reportados de la bibliografías 0 .001 ttg de Lindane, 0 .002 pg de Heptaoloro,

pes TDE, Dieldrin, P.P. - DDB. Aldrfn,isómeros de DDTt 0 .03 pg de Metoxioló

ro; 0.005 pg de BBC, 0.02 fag de Clordano y 0.05 pg de Toxafeno.

Para trabajos de rutina 0 .005 pg pueden ser claramente visibles, -

con excepción del olordano, BBC y Toxafeno . Debido a la aensitividad del

161

método, no es necesario generalmente trabajar con gran cantidad de ex

traoto de muestra.

6 .- CONCLUSIONES.

Como ya se indio6 en el punto anterior, la metodología solamen

te fuá probada con estándares de plaguioidas, por lo que no se pueden-

reportar resultados y se recomienda continuar con la investigaoi6n, u-

tilizando dicha técnica con muestras conteniendo residuos de plaguici-

das. No obstante, se presentan las siguientes oonalusionea$

A) La oromatograffa en placa fina debe usarse siempre y en cualquier -

tipo de análisis como prueba confirmative de la cromátograffa C .G.L.

B) Es una técnica muy rápida, versátil y de bajo costo.

C) Sirve como oromatograffa preparatoria para otro tipo de análisis.

D) Ea una prueba aemiouantitativa pero oonfiable.

162

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1.- Cromatografia de Gases.

M.Y. Dabrio.

2.- Métodos Modernos de Análisis Químiooa.

Roberto L. Peosok.

3.- Métodos Instrumentales de Análisis

Willard.

4.- Identificación Sistemática de Compuestos Orgánicos.

Shriner.

5.- Water Pollution Control Federation, Faust S .P. y Osman. Journal.

Vol. 45 (1973).

Report on Environmental of Pesticide Programs.

Vol. 1.

7.- Pesticidas Agrícolas.

Claudio Barberá (2a . Ed.)

8.- Methods for Organic Pesticides in Water and Waswater, Environmental

Protection Agency. National Environmental Research Center.

163

164

165

166

167,

168

Placa de 8120Limite dal solvente

después de desarrollar

0.75"

Muestra

Muestra

Muestra

Múestra

Estandar

Estandar

Estandar

Fig, 6

169

Fig.?

E V A L II A C I O N

Frente del disolvente

,

b

0

~ 0

i

1

a ~

1

~

~

r • •a

a o distancia desde el punto de aplioaoión al

centro de la manaba

b = distancia desde el punto de aplioaoión al

frente del disolvente.

Rf = a

HfG 1

170

b

PAOINA DICE DEBE ECIR

FE

D E

E R R A T A S

Portada

1

2

2

2

5.1

7.11

7.II

7.II1

7.III

8.VI.0

8 .VII.2 .0

9.VII.6

9.VII.B.2

10 .V.Á.

11 .VI.d.

13.1

Pemanentes

Pemanentes

1 .1

I1.1

111.1

disulva

Prinoipio de Método

solución de Plomo

alaacenar

mantengáse

HCL

SnCL2

agregue 3 gr de sulfato de pino granular y

ooneote

paso 2 .(VI.A.2)

Fiederiob

en agua destilada

2 µgelt .. 0.002 mg./l

Permanentes

Permanentes

3

50

115

disuelva

Principio del Método

soluoi6n de acetato de plomo

almacenar

manténgase

HCl

Sn012

agregar 3 g de sino granular al generador y oo-

neote

paso 2. (VII.Á.2)

Diedrich

en agua destilada y afore a 100 ml.

20 pg/l = 0 .020 mg/l

PAGINA

DICL DEBE DECIR

33.IV.B

ortotoludina

34.IV.P

AL(OH)3

35.VII.A

baño de agua hasta

38.a.1 .1

llevando con un volumen

38.a.1 .2

Normalidad del XmnO4 -

42.I

Sulfonato linear

46.IV A)

La urea, doido glutdmico

48

B gramos de Na2CO2

48.1

(VI.A.1)

51 .1I

iones cloro

53. VII C)

pH de la muestra 7 y 10

61, 60

Las

páginas

62.V. B

Vari Heat

63

GRASAS Y ACEITES mg/lt -

agregue 10 ml . de eolnoidn de cloruro merodrioo y 40

ml . de eoluoión

Duress Total (VI.A)

se orea. Esta

(Bete pardmetro ya fu4 descrito en lao page.

6)

ortotolidina

'Al(OH)3

baño de agua fria hasta

llevando a un volumen

Normalidad del KanO4 •

sulfonato lineal

La urea, glicerina, doido glufdmioo

B - gramos de Na2CO3

105. (VI.A.I)

iones de cloro

pH de la muestra 7 a 10

eaten

intercambiadas

Vary Heat

CRASAS Y ACEITES mg/1 -

16 .5

Agregue 20 ml . de soluoidn de oloruro merodrl

co y 10 ml . de soluoión

22 .VI.A

Duresa Total (IV.A)

24 .II .

se orea, . Esta

27 - 29

CROMO HEXAVALENTE• : la4a

~~

.

P2 - P 1 X 1000

ml . de la muestra

PAGINA

DICE

64.V. B .

Agitador Magnético con capacidad de 0 .2 a 0.3 ml.

C .

Reloj con segundero 6 cronómetro

72.VI.4

refrigérese

74.3.1

facultativas anaeróbicas gram-negativas,

80.2

feces

88 .8 .3.7 .13 se definen com

90.10.1

aplicada

DEBE DECIH

B) Agitador magnético con regulador de velocidad

C) Cucharita de medioión con capacidad de 0 .2 a-

0.3 ml.

D) Cronómetro 6 reloj con segundero

refrigérese

facultativas, anaerdbioas, gran-negativas

heces

se define como

aplicado

Acidez, (III)Aoidez. ( IV )Expandiomatio

Vol. gastado de H2SO4 X N de H2SO4 R

ml . de muestra

( F+ M) R NH2804 X 50,000

ml . de muestraAT m

gastado de H2804 R N de

ml . de

H2í 304 xmuestra

Vol.a

91 .III

acidez91 . IV .

acidez91 .V

Spandiomatic

93.4

Vol . gastado de H2SO4 X N de H2304 X 5000

ml. de muestra

Vol. gastado de H2SO4 X N de H2SO4 X 5000

ml. de muestra

94

Al,

e

( P+ M ) R NH2804 R 5000

95.II

para neutralizar una base, es adicionada a la-

muestra una solución alkali de

96.V

Spandiomatio

97.VII.4 NaOH 0.02 N El punto

98.VII.C .2

!~P = ,rR N X 5000ml. de muestra

50, 0p¡0

50,0Ó0

ii

para neutralizar una base. Se adioiona a la IpOsstra

una solución alcalina de

Expandiomatio

NaOH 0.02 N. El punto

AN- ,PRN,_I_54moml. de muestra

O

93.4

ml. de muestra

PAOIBA

DICB DEBE DECIR

99rIII

y refrigerando a 5 - 10° 0

100 VI

P.- Soluoidn Stook

102 . VII. A.2

oloruro de amonia

107 .VII.e

Agregue 0.4 de perenifato

. , /As de P Rrgfioa , x. . ..1tp

mi . de muestra

112.V. A)

oon agua destilada y llene a 1 lt ..

125. i)

durante 12 12 bra.

126

eubmdltiplos de 1 ml .)

128

Trasferir

129

media de cultivo

139. V

regreoión

135

Ao altura del pica

141

logaritmioa

y refrigerando a 4° C

1 .- Soluoi6n stock

cloruro de amonio

Agregue 0 .4 g. de persulfato

ma de p . ra de P de la srifioa , x . . ..1

con agua destilada y afore a 1 1.

durante 2 hrs.

submdltiploe de 10 ml.)

Transferir

medio de cultivo

regresión

As - altura del pioo

logarítmica

109 y 110ml. de muestra

142

146

155 se coloca en capa delgada en la parte

superior a la columna

se coloca en una capa delgada en

columna

b 22.1243 — 220 .32683

3253 .7855 — 3151 .67

b 22.1243 - 22 .032683

3153 .7855 - 3151 .67

ml

ra .¡`

~t r.~ g

la parte su1erior de

158 Ag2NO 3 AgNO 3

CO I MGGO,S.C ._

uumu, llama

PADIHA DICE DEBE DECIR

162 .para pb fue para Pb fué

174 . . . levistes retioulatus . . . Lebistea reticulatue . ..

175 Su oonoentraoi6n de mercurio . . . Su concentración mdaima de Mer-

curio . ..

176 . . . aereie virens . . . . Moreis virene .

195 . . . de 1 ml/g . . . . de 1 ml de RC1 X 1g.de .Cd.

200 El agua de la llave . . . El agua olorada de la llave . ..

200 . . . para los penes) . . . para loe peoes, 0 .2 ppm es -

tózico).

213 Lepomie , maoro ohirue, Lepomia maoroohirus,

241 . . . priemra . . . . . . primera ...

258 . . . comp rt mientos . . . . . . oomportamientos . ..

284 Tilapia, mosembioa, Tilapia mossambioa

1

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Instituto Nacional de Ecología Libros INErepositorio.inecc.gob.mx/ae/ae_003009.pdf · ii. iii. 83comendaciones para el anali sis de los pabametros pisico-quimicos mas importantes