Instituto Politécnico Nacional · 2019. 10. 3. · betoh di oro, amos por una lite, nomas una y ya), Gilberto (El chapa, pero chapa de oro no cualquiera), Lupita (por enseñarme

Instituto Politécnico Nacional Centro de Biotecnología Genómica

“Análisis de un gen que participa en la remodelación de la cromatina y su probable participación en el dimorfismo de

Yarrowia lipolytica”

Tesis que para obtener el grado de Maestro en Ciencias en

Biotecnología Genómica

Presenta: Ulises Mercado Salgado

Director de tesis:

Dr. Juan Manuel González Prieto Reynosa, Tamaulipas mayo, 2008.

i

Dedicatoria.

A mis padres por su amor, su ejemplo y su sabio consejo, que me guían a cada momento de mi vida.

A mis hermanos inigualables, Leopoldo Fabio, René e Israel que son parte de todos mis logros y su

hombro un rincón donde desahogar los sinsabores.

A mis amigos: Saúl (lo puse con acento y que !!, me estoy yendo por la banquetaaaa), Humberto (Shi mi

betoh di oro, amos por una lite, nomas una y ya), Gilberto (El chapa, pero chapa de oro no cualquiera),

Lupita (por enseñarme a cocinar sin quemar la carne, su sabio consejo y su apoyo incondicional siempre

“no te pongas short para ir a la escuelaaa”), Krystal (Ayy indiooo, tú me tienes mala leche), Maryela

(Descifrando el enigma del chile), Homar (Hueriga zapuka mukira, vamos a pescar !!), El Wilson (Puro

Michoacán).

A mis profesores: Dr. Juan Manuel González (Por la paciencia casi franciscana con la que me guió

siempre, sus conocimientos y determinación para alcanzar los objetivos), Dr. Nezahualcoyotl Mayek (Por

su valiosa aportación para darle forma a este trabajo, sus historias que nos hicieron reir y el carácter que

imprime a todo lo que hace), M.C. Sanjuana Hernández (El amor con el que hace las cosas y por ser

como una mamá cariñosa y alegre).

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, por la beca otorgada que permitió mi manutención y la

realización de este trabajo.

Al Programa institucional de Formación de Investigadores, por el apoyo económico que semestre a

semestre nos fue entregado.

Al Instituto Politécnico Nacional por la beca institucional que permitió la culminación de la tesis.

Al fondo de becas de movilidad Santander por el apoyo económico en el último semestre.

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iii

iv

Índice Abreviaturas ........................................................................................................................................... vi Índice de Figuras.................................................................................................................................... vii Índice de cuadros .................................................................................................................................. viii Página .................................................................................................................................................... viii Resumen .................................................................................................................................................. ix Summary ................................................................................................................................................. xi 1. Introducción ......................................................................................................................................... 1 2. Antecedentes......................................................................................................................................... 3

2.1 Generalidades ................................................................................................................................. 3 2.2 Procesos de diferenciación celular en hongos ................................................................................ 4 2.3 Mecanismos generales de la regulación de la expresión génica en la diferenciación celular. ...... 4 2.3.1 El nucleosoma .............................................................................................................................. 5 2.3.2 La cromatina ............................................................................................................................... 5 2.3.3 Inicio de la transcripción y elementos participantes. ................................................................. 7 2.4 Remodelación de la estructura de la cromatina ............................................................................ 8 2.4.1 Complejos remodeladores de cromatina .................................................................................... 8 2.5 Modificaciones de las Histonas. ..................................................................................................... 9 2.5.1 La desacetilación de las histonas ............................................................................................... 10 2.5.1.1 El gen RPD3 ............................................................................................................................ 11 2.6 El fenómeno del dimorfismo ........................................................................................................ 12 2.7 El hongo Yarrowia lipolytica como modelo de estudio ................................................................. 12 2.8 Dimorfismo en Y. lipolytica .......................................................................................................... 13

3. Justificación ........................................................................................................................................ 15 4. Objetivo General ................................................................................................................................ 16 5. Objetivos Específicos ......................................................................................................................... 16 6. Hipótesis ............................................................................................................................................. 16 7. Materiales y Métodos ......................................................................................................................... 17

7.1 Material biológico......................................................................................................................... 17 7.2 Plásmidos usados .......................................................................................................................... 17 7.3 Análisis Bioinformático ................................................................................................................ 17 7.6 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ............................................................................... 19 7.6.1 Condiciones de amplificación por PCR para el gen YlURA3 ................................................... 20 Cuadro 4. Condiciones de reacción de la amplificación del gen YlURA3. ....................................... 21 7.6.2 Condiciones de amplificación para determinar la mutación del gen RPD3 ............................ 21 7.7 Purificación de fragmentos de DNA rescatados de geles de agarosa ......................................... 24 7.8 Clonación de productos de PCR .................................................................................................. 24 7.9 Reacciones de modificación de DNA ........................................................................................... 24 7.9.1 Digestión enzimática .................................................................................................................. 24 7.9.2 Desfosforilación ......................................................................................................................... 25 7.9.3 Ligación de fragmentos ............................................................................................................. 25 7.10 Separación de fragmentos de DNA por electroforesis .............................................................. 25 7.11 Transformación genética de E. coli ........................................................................................... 26 7.12 Extracción de DNA plasmídico de bacterias ............................................................................. 26

v

7.13 Transformación genética de Y. lipolytica ................................................................................... 27 7.14 Determinación de la morfología colonial ................................................................................... 27 7.15 Determinación de crecimiento celular ....................................................................................... 28 7.16 Análisis de la mutante por Southern blot .................................................................................. 28 7.17 Inducción de la transición dimórfica ......................................................................................... 29 7.18 Observaciones al microscopio .................................................................................................... 29

8. Resultados .......................................................................................................................................... 30 8.1 Análisis bioinformático de la secuencia YlRPD3 ......................................................................... 30 8.4 Análisis de la mutante ΔRPD3 ..................................................................................................... 37 8.4.1 Análisis fenotípico de la mutante .............................................................................................. 37 8.3.2 Análisis del dimorfismo de la cepa meztli ................................................................................. 41

9. Discusión............................................................................................................................................. 47 10. Conclusiones ..................................................................................................................................... 51 11. Recomendaciones ............................................................................................................................. 52 12. Referencias Bibliográficas ............................................................................................................... 53 Apéndice ................................................................................................................................................. 62

vi

Abreviaturas oC Grado centígrado.

g Microgramo.

L Microlitro.

A260 Absorbancia a una longitud de onda de 260 nm.

A280 Absorbancia a una longitud de onda de 280 nm.

A Adenina

DNA Ácido desoxirribonucleico.

pb Pares de bases.

C Citosina.

Fig. Figura.

G Guanina.

kb Kilobases.

mg Miligramos.

ml Mililitros.

mM Milimolar.

kDa Kilo daltones

nm Nanómetros.

PCR Siglas en inglés de la Reacción en Cadena de la Polimerasa.

pH Potencial hidrógeno.

rpm Revoluciones por minuto.

T Timina.

Tm Temperatura de fusión.

U Unidades, utilizado en la concentración de enzimas.

UV Ultravioleta.

Vt Volumen total.

Ø Diámetro.

vii

Índice de Figuras Página Figura 1. Representación esquemática del código de histonas. 10 Figura 2. Esquema de la elaboración del vector de interrupción para el gen YlRPD3. 18 Figura 3. Secuencia de la región promotor del gen YlRPD3, se destacan los motivos de unión a factores transcripcionales identificados, así como la posible caja TATA de inicio de la transcripción.

30

Figura 4. Representación de la secuencia del terminador del gen YlRPD3 donde se identificaron de secuencias características de terminación de la transcripción en levaduras. 31

Figura 5. Representación esquemática de la secuencia aminoacídica de YlRPD3 comparada con las secuencias de Rpd3p de S. cerevisiae y C. albicans 31

Figura 6. Alineamiento del dominio histona desacetilasa de varios organismos. 33 Figura 7. Dendograma del alineamiento de secuencias de distintos organismos 34 Figura 8. A. Representación esquemática del análisis de restricción de la copia silvestre y mutante y el fragmento usado como sonda en el análisis tipo Southern. B. Análisis de las cepas de Y. lipolytica mediante Southern blot para comprobar la mutanción del gen YlRPD3.

35

Figura 9. Análisis teórico y experimental de la mutación. 36 Figura 10. A. Representación esquemática de la región donde se diseñaron los oligos para la prueba de PCR anidado. B. Fotografía de un gel de agarosa al 1% donde se observa la amplificación del tamaño esperado sobre DNAg de la cepa mutante como parte de la comprobación de la mutación del gen YlRPD3.

36

Figura 11. Morfología colonial de cepas de Y. lipolytica en medio completo YPG y diferentes concentraciones celulares. 37

Figura 12. Morfología celular de cepas de Y. lipolytica en medio completo YPG. A. P01a. B. Meztli. Observaciones realizadas a 100X 38

Figura 13. Morfología celular de cepas de Y. lipolytica en medio mínimo YNB. A. P01a. B. Meztli. Observaciones realizadas a 100X 38

Figura 14. Curvas de crecimiento de cepas de Y. lipolytica en medio completo YPG. 39 Figura 15. Curvas de crecimiento de cepas de Y. lipolytica en medio mínimo YNB. 39 Figura 16. Asimilación de diferentes fuentes de carbono de la cepa P01a en medio mínimo YNB. 40

Figura 17. Asimilación de diferentes fuentes de carbono de la cepa Meztli en medio mínimo YNB. 41

Figura 18. Morfología celular de cepas de Y. lipolytica en medio mínimo YNB a pH 7.0 a las 12 horas de incubación con diferentes fuentes de carbono. 42




viii

Índice de cuadros

Página

Cuadro 1. Características de eucromatina y heterocromatina. 6

Cuadro 2. Oligonucleótidos utilizados en las amplificaciones por PCR. 20

Cuadro 3. Condiciones de reacción de la amplificación del gen YlURA3. 21

Cuadro 4. Condiciones de reacción de la amplificación del gen YlURA3. 21

Cuadro 5. Componentes de la reacción de amplificación por PCR del sitio de la

sustitución del gen YlRPD3 por la copia no funcional que contiene el gen YlURA3

usado como marcador de selección. 22

Cuadro 6. Condiciones de la amplificación del fragmento generado en el sitio de la

sustitución. 22

Cuadro 7. Componentes de la reacción amplificación por PCR para la determinación de la correcta sustitución del gen YlRPD3 por el marcador de selección YlURA3.

23

Cuadro 8. Condiciones de la PCR para la amplificación del fragmento en la región 3’ de la sustitución del marco de lectura de YlRPD3 por el marcador YlURA3 .

23

Cuadro 9. Porcentaje de identidad de la secuencia YlRPD3 con otras enzimas histona

desacetilasas. 32

ix

Resumen

La regulación de la transcripción en organismos eucariotes es un sistema complejo de interacciones

entre diversos factores protéicos que remodelan la estructura de la cromatina. El equilibrio dinámico que

existe entre la activación y el silenciamiento génico se mantiene a través de modificaciones en la estructura

de la cromatina a nivel de las histonas del nucleosoma, dentro de las cuales destacan la acetilación y la

desacetilación. Las enzimas histona desacetilasas actúan en los residuos de lisina de las colas de las

histonas eliminando los grupos acetilo y reprimiendo la expresión génica. En los hongos la desacetilación

de histonas participa en procesos de diferenciación celular como la esporulación y la patogénesis. El

dimorfismo es un proceso de diferenciación celular que consiste en un cambio morfológico de levadura a

micelio como respuesta adaptativa a las condiciones ambientales, este a su vez se asocia con la patogénesis

de diversos hongos. El objetivo de este trabajo fue estudiar la posible función de la desacetilación de las

histonas en el dimorfismo de Yarrowia lipolytica, un hongo ascomiceto dimórfico considerado no

patogénico y estudiado ampliamente por su potencial biotecnológico. En este trabajo se caracterizó la

secuencia de un gen que codifica para una histona desacetilasa YlRPD3 que posee un marco de lectura

abierto de 1377 bases que codifican para una proteína de 458 aminoácidos. La proteína codificada por este

gen mostró una identidad mayor del 80% respecto al gen Rpd3 en Saccharomyces cerevisiae. La secuencia

aminoacídica presenta todos los motivos y dominios que caracterizan a esta familia de enzimas. Se

construyó un vector con una copia no funcional del gen YlRPD3 sustituyéndolo por el gen URA3 de Y.

lipolytica, mismo que fue usado como marcador de selección. Con este plásmido, mediante retrogenética,

se transformó una cepa ura- del hongo mediante la técnica de acetato de litio y se recuperaron las

transformantes por su capacidad para crecer en medio sintético sin uracilo. El análisis fenotípico de la cepa

mutante reveló una morfología colonial lisa, cremosa y de borde circular con respecto a las colonias

rugosas e irregulares de la parental; en la mutante la morfología microscópica muestra células con mayor

tamaño, de forma anormal y, en algunos casos, células deformes respecto a las células más pequeñas y

ligeramente más alargadas que se observan en la cepa parental. En la mutante se observó una reducción

importante de aproximadamente siete veces en el crecimiento en medio mínimo con respecto a la cepa

parental. La característica principal de la cepa mutante fue la incapacidad para llevar a cabo la transición

dimórfica, ya que mostró una morfología levaduriforme en condiciones de inducción, independientemente

de la fuente de carbono y pH ensayados. Estos hallazgos constituyen el primer reporte de la participación

x

de la desacetilación de histonas en el dimorfismo de los hongos como modelo de diferenciación celular en

organismos eucariotes.

xi

Summary The regulation of transcription in eucaryotic organisms is a complex system of interactions among various

protein factors that reshape chromatin structure. The dynamic balance between activation and gene

silencing is maintained through changes in chromatin structure at level of histones in nucleosome, where

acetylation and deacetylation has been the subject of further study. Among them histone deacetylases act

on lysine residues in the histone tails, removing acetyl groups and suppressing gene expression. In fungi

has been reported deacetylation activity involving in cell differentiation processes such as sporulation and

pathogenesis. The dimorphism is a process of cell differentiation characterized by a change in morphology

of yeast to mycelium as adaptive response to environmental conditions; this in turn has been associated

with the pathogenesis of some fungi. The objective of this work was to study the possible role of the

deacetylation of histones in the dimorphism of Yarrowia lipolytica, which is an ascomycete dimorphic

fungus considered non pathogenic and studied extensively for its biotechnological potential. We

characterized the sequence of one gene that encodes for a histone deacetylase and has an open reading

frame of 1377 bases that encode for one protein of 458 amino acids. The protein encoded by this gene

showed an identity greater than 80% over the Rpd3 gene of Saccharomyces cerevisiae. The aminoacidic

sequence presents every motif and domains that characterize this family of enzymes. One vector was built

with a non functional copy of the YlRPD3 gene replaced by the gene YlURA3 which was used as a

selection marker. Through retrogenetics with this plasmid, it was transformed an ura- strain of the fungus

using the technique of lithium acetate; transformants were recovered because of their ability to grow in

synthetic medium without uracile. The phenotypic analysis of the mutant strain colonial morphology

revealed a smooth, cream and rounded edge colony, clearly distinct to parental colonies rough and

irregular; at microscope morphology of mutant cells showed a larger sample size, abnormal and sometimes

deformed cells, which one is clearly different to parental strain where smaller and slightly cells are more

elongated. The mutant showed a significant reduction at minimum average growth of around seven times

with respect to the parental strain. The main feature of the mutant strain was the inability to carry out the

dimorphic transition because it showed yeast morphology under induction condition, regardless the source

of carbon and pH tested. These findings constitute the first report of the involvement of histone

deacetylation on fungal dimorphism as a model of cell differentiation in eucaryotic organisms.

1

1. Introducción

Los hongos son organismos eucariotes que se encuentran distribuidos ampliamente en la naturaleza.

Establecen diversas relaciones con el ambiente, se les encuentra en forma saprófita, parásita ó simbiótica;

siendo estos los que más eficientemente llevan a cabo los procesos de degradación de la materia orgánica

ya que poseen la capacidad de colonizar diversos sustratos, además de servir como un atractivo modelo en

la industria biotecnológica, agrícola y clínica, entre otras.

La diferenciación celular es el fenómeno por el cual las células se especializan morfológica y/o

funcionalmente adaptándose a las condiciones del medio sin alterar sus características genéticas. Se han

descrito diferentes procesos de diferenciación celular en hongos, los cuales se asocian con su capacidad de

colonización, supervivencia y patogénesis. Las etapas de la diferenciación celular son: recepción del

estímulo, decodificación y transducción de la señal, cambio en el programa y cambio morfológico y/o

funcional en el organismo (Ruiz-Herrera, 1993).

Un proceso de diferenciación que ha sido sujeto de algunos estudios es el dimorfismo, el cual se

define como “la capacidad mostrada por algunos hongos de crecer como levadura o como micelio

dependiendo del medio en el que se encuentren o en respuesta a señales ambientales” (Ruiz-Herrera,

1984). Los efectores que generan como respuesta el cambio dimórfico en hongos son el pH, temperatura,

fuente de nitrógeno, concentración de gases en la atmósfera O2/CO2 y fuente de carbono, principalmente.

Existen diferentes reportes en los que se ha descrito a un gran número de hongos que son patógenos

de plantas y animales, lo cual sugiere una fuerte asociación entre el dimorfismo mostrado por ciertos

hongos y su patogenicidad. Como parte del estudio de la patogénesis de los hongos se han descrito algunos

aspectos moleculares tales como las rutas de señalización involucradas en la transición dimórfica. Las

principales rutas de señalización implicadas en el dimorfismo son la ruta de las MAP cinasas y la vía de

PKA-AMPc (Durrenberger et al., 1998; Bolker, 2001; Lee, 2003).

Los fenómenos de diferenciación celular en general implican un alto grado de regulación de la

expresión génica. El punto de regulación más importante se da en la transcripción a nivel de la estructura

de la cromatina, ya que cumple con la función de organizar y empaquetar el DNA a través de las histonas y

otras proteínas asociadas. Las histonas forman un octámero en el cual se enrolla el DNA dando lugar a la

unidad fundamental de la cromatina llamada nucleosoma (Kornberg, 1974; Kornberg, 1999). Las

extensiones amino terminales de las histonas son susceptibles de ser modificadas de diversas formas,

principalmente por acetilación y desacetilación, fosforilación, metilación y ubiquitinación (Bird, 1999).

2

Estas modificaciones ocultan o exponen regiones de las proteínas encargadas de regular la expresión

génica.

La desacetilación de las histonas es un proceso de modificación enzimática de la estructura de la

cromatina que esta asociado con el silenciamiento génico. Las enzimas que llevan a cabo este proceso son

las histona desacetilasas. Existen diversos estudios donde se ha observado la participación de este proceso

en fenómenos de diferenciación celular tales como la esporulación (Kouzarides, 1999), cambio del tipo de

apareamiento (Soll, 1992), patogénesis (Klar, 2001) y germinación de esporas (Christodoulidou, 1996).

El estudio a nivel molecular de los fenómenos de diferenciación celular en hongos, particularmente

el dimorfismo, abre la posibilidad de trazar estrategias tales como el diseño de nuevas drogas para el

control de las micosis que afectan a los humanos. Al tener un mayor entendimiento de los procesos

biológicos que se llevan a cabo en estos organismos y sus genes participantes, es posible extrapolar esos

resultados a la búsqueda de respuestas en sistemas eucarióticos más complejos.

Con el fin de observar la probable participación de la desacetilación de las histonas en el

dimorfismo de Y. lipolytica, en este trabajo se presenta la estrategia de obtención de una cepa del hongo

afectada en el gen RPD3 (Reduced Potassium Dependency Factor) que codifica para una histona

desacetilasa y el análisis de la mutante obtenida.

3

2. Antecedentes 2.1 Generalidades

Los hongos son organismos eucariotes que se han agrupado en el reino mycota o fungi (Whittaker,

1969). Son organismos unicelulares o pluricelulares, heterótrofos, poseen una pared celular formada

principalmente de quitina y tienen la característica única del crecimiento apical (Bartnicky-García, 1968;

Ruiz-Herrera, 1984). Las relaciones de los hongos con el ambiente son de gran importancia ya que tienen

la capacidad de colonizar los más variados sustratos; se encuentran en la naturaleza en forma saprófita,

degradando la materia orgánica inerte; además, subsisten formando asociaciones simbióticas con otros

organismos y se les puede encontrar también en forma parásita aprovechando los nutrientes de otros

organismos, alimentándose de ellos o viviendo en su interior; causando enfermedades en plantas y

animales e incluso el hombre. La facilidad de cultivar estos organismos en laboratorio así como el hecho de

ser organismos eucariotes, hacen de los hongos un modelo atractivo en la industria biotecnológica, agrícola

y médica, entre otras. La diferenciación celular ha sido definida como la “serie de eventos bioquímicos, que

cuidadosamente ordenados en el tiempo y en el espacio dan lugar a la especialización de la célula sin

alterar sus características genéticas” (Ruiz-Herrera, 1984). Los procesos de diferenciación celular en los

hongos pueden comprenderse en sus diferentes etapas que parten del reconocimiento del estímulo del

medio y se recibe en la superficie celular a través de receptores en la membrana. Al respecto solo se

conocen unas cuantas proteínas que sirven como receptores en la membrana celular de los hongos. Los

estímulos pueden ser de diferente naturaleza: biológica, física y/o química; biológica, en el caso de que el

hongo reconozca un hospedero o parte de él; química, si en el medio existen feromonas o pH; física, en el

caso de cambios en presión, concentración de gases atmosféricos o de temperatura.

El siguiente paso es la decodificación y transducción de la señal. En esta etapa las proteínas

receptoras transmiten la señal mediante cambios químicos y conformacionales, posteriormente la señal

viaja a través de diferentes proteínas que participan en diversas vías, las cuales están íntimamente

relacionadas con el tipo de receptor que reconoce el estímulo. Algunos ejemplos de estas vías son las rutas

PKA “Protein Kinase A”, PKC “Protein Kinase C” y MAPK “Mitogen Activated Protein Kinases”.

Cuando la señal llega al núcleo celular se desencadenan cambios en el programa que implican una serie de

modificaciones en la expresión génica. Los principales puntos de control de la expresión génica se dan a

4

nivel transcripcional, traduccional y postraduccional, dichos cambios le permiten al organismo generar

variaciones en su morfología y/o función celular que se pueden reflejar en el fenotipo como respuesta a las

señales (Ruiz-Herrera, 1993).

2.2 Procesos de diferenciación celular en hongos

Los hongos presentan diversas morfologías y procesos de diferenciación como parte de su ciclo de

vida entre los que se encuentra la formación de pseudomicelio, en este proceso se presenta un cambio

morfológico en ciertos hongos de un estado levaduriforme a células alargadas, septadas, multinucleadas y

la característica que le da el nombre es que en los septos se observa un ligero estrangulamiento de las hifas.

Durante la germinación de esporas se observa un cambio en el tipo de crecimiento de isodiamétrico a

polarizado, lo que permite a los hongos desarrollarse y colonizar el medio donde se encuentran, esto como

respuesta a condiciones físicas y nutricionales favorables. La esporulación permite perpetuar la especie

dando lugar al desarrollo de esporas, las cuales constituyen la forma resistente de estos organismos. Una

vez que los hongos se establecen y adaptan exitosamente al medio, algunos presentan formación de

estructuras reproductivas que se utilizan para la producción de esporas que les permite completar su ciclo

de vida, este proceso diferenciativo se utilizó como criterio para clasificar a los hongos en basidiomicetos,

ascomicetos, zigomicetos y deuteromicetos (Alexopoulos, 1996). De nuestro particular interés es el

dimorfismo que presentan algunos hongos y que se ha definido como la capacidad mostrada para crecer

como levadura o como micelio dependiendo del medio donde se encuentren o en respuesta a señales en el

ambiente (Ruiz-Herrera, 1985). El cambio dimórfico es reversible y se ha propuesto como un mecanismo

de adaptación y colonización al medio ambiente donde se desarrollan. El dimorfismo ha sido asociado con

la patogénesis, ya que la mayoría de los hongos dimórficos son patógenos de humanos, animales y plantas

(Ruiz-Herrera, 1998).

2.3 Mecanismos generales de la regulación de la expresión génica en la diferenciación celular.

El fenotipo de los organismos está dado por la expresión del genotipo en respuesta al ambiente. La

expresión de los genomas está regulada de forma tal que solo se expresa cierto porcentaje del total de genes

contenidos en las células (Kornberg 1999). Generalmente, el flujo de la información genética comienza en

los genes y finaliza en la formación de proteínas, que dan como resultado el fenotipo en los organismos. En

la diferenciación celular como en la mayoría de los procesos celulares el principal punto de regulación de

5

la expresión de los genes se da a nivel de la transcripción. En este punto la regulación está presente en los

diferentes niveles de la organización del DNA, en la cromatina y el nucleosoma.

2.3.1 El nucleosoma

El nucleosoma es la unidad fundamental de la estructura de la cromatina en la cual se organiza y

empaqueta el DNA. Consiste de un octámero de histonas (H2A, H2B, H3 y H4) que se da por la formación

de un tetrámero entre las histonas H3-H4 y dos heterodímeros, H2A-H2B. En el nucleosoma se enrollan

147pb equivalentes a 1.75 giros (Kornberg, 1974). Existe además la histona H1 que se encuentra en

contacto con las regiones de DNA y el octámero mismo, confieriendo estabilidad al complejo. Además,

protege de 15 a 20pb de DNA de la digestión enzimática. Otro dato interesante característico de la H1 es su

proporción estequiométrica, similar a las cantidades de octámero (Luger, 2001). Existen tres mecanismos

principales mediante los cuales los nucleosomas pueden reprimir la transcripción. El primero y más simple

es el ocultamiento de regiones de unión de proteínas a DNA interfiriendo con los mecanismos de

activación-represión y con la maquinaria transcripcional. El segundo son las interacciones entre los

nucleosomas que llegan a reprimir la transcripción en dominios enteros en los cromosomas. El tercer

mecanismo es la interacción de nucleosomas con proteínas características de zonas heterocromáticas que

reprimen la expresión de forma hereditaria (Kornberg, 1999). Existe evidencia bioquímica y genética que

demuestra ampliamente que el nucleosoma es un factor normalmente represivo para la transcripción.

(Paranjape y Kamakaka, 1994)

2.3.2 La cromatina

La cromatina es el complejo formado por el DNA, las histonas y otras proteínas no-histonas

asociadas con la organización del DNA como la proteína heterocromática HP1 por sus siglas en inglés

(heterocromatic protein 1) y el grupo de alta movilidad HMG por sus siglas en inglés (high mobility

group). La cromatina constituye el segundo orden en la organización del DNA pues una vez que este se

enrolla en los nucleosomas se pliega sobre sí mismo para formar la estructura característica de la

cromatina, una fibra de 30 nm conformada por los nucleosomas y la histona H1 (Eissenberg y Elgin, 2000).

La principal consecuencia funcional del empaquetamiento de la cromatina es la restricción en el acceso al

DNA hacia una gran variedad de proteínas que regulan la actividad génica. La organización estructural de

la cromatina en cromosomas eucarióticos es variable en ciertas regiones del cromosoma.

6

Se han descrito dos tipos de cromatina con base en características bien definidas; eucromatina y

heterocromatina. La eucromatina formada por regiones cromosómicas extensas en un estado disperso y

relajado, en estas regiones se encuentran la mayoría de los genes que presentan actividad transcripcional.

La heterocromatina formada por regiones de DNA que permanecen altamente compactadas y se encuentran

constituyendo los telómeros y centrómeros, principalmente. Ciertas regiones de DNA son heterocromáticas

para todas las especies en todas las etapas de diferenciación, a estas regiones se les conoce como

heterocromatina constitutiva. Otras regiones de DNA se comportan como heterocromáticas en algunas

células y eucromáticas en otras debido a la diferenciación que sufren las células de organismos de acuerdo

a su nivel de complejidad y se le denomina heterocromatina facultativa (Andrulis et. al., 1998). Existen

diferencias notables entre los dos tipos de cromatina que se detallan en el cuadro 1.

Cuadro 1. Principales características de la eucromatina y la heterocromatina.

Característica Eucromatina Heterocromatina

Apariencia en interfase Relajada (tinción baja) Condensada (tinción alta)

Localización cromosómica Brazos distales Pericentromérica y telomérica

Tiempo de replicación Fuera de la fase S Fase S tardía

Secuencias que lo componen

DNA único, interrumpido por

secuencias medianamente

repetitivas

DNA altamente repetitivo

(secuencias satélite)

Densidad génica Alta Baja

Localización en el núcleo General Agrupado a menudo (periferia

nuclear, cerca del nucleolo)

Recombinación meiótica Normal Ausente

Actividad génica Alta Ausente

Silenciamiento de genes Genes individuales Grandes Dominios

Metilación del DNA Islas CpG hipometiladas Altamente Metiladas

Acetilacion de las Histonas Alta Baja

Espaciamiento en nucleosomas Irregular Regular

Accesibilidad de nucleasas Variable Baja

(Modificado de Eissenberg y Elgin, 2000)

7

2.3.3 Inicio de la transcripción y elementos participantes.

El inicio de la transcripción como mecanismo de regulación de la expresión génica se presenta en

dos etapas: 1) el relajamiento de la estructura de la cromatina, seguida de la interacción del complejo RNA

polimerasa y 2) los factores generales de la transcripción. Las proteínas reguladoras de la transcripción

desencadenan la primera etapa participando junto con complejos remodeladores de la cromatina (Bjorklund

y Kim, 1996).

En los primeros estudios sobre la activación de genes fueron identificadas tres RNA polimerasas en

eucariotes, designadas numéricamente I, II y III. La RNA polimerasa II es la responsable de la síntesis de

mRNA, mientras que las polimerasas I y III sintetizan RNA ribosomal y RNA de transferencia,

respectivamente (Roeder y Rutter, 1969). La RNA polimerasa II es un complejo multiprotéico formado por

12 subunidades y que para llevar a cabo su función se vale de las proteínas llamados factores generales de

la transcripción o GTF’s: TFIIA, -B, -D, -E, -F y –H (Feaver et. al., 1996; Conaway y Conaway, 1997). El

inicio de la transcripción de genes codificantes en los eucariontes requiere la formación de un complejo de

pre-iniciación (PIC) que consiste de la RNA polimerasa II y los GTF’s (Warren, 2002). Un ejemplo de la

acción de un cofactor negativo es la represión estérica por medio de la proteína NC2p que, al agregarse en

forma de ‘pinza’ al complejo formado por la proteína de unión a la caja TATA (por sus siglas en inglés

TBP), impide la unión de los GTF’s (Kamada et. al., 2001).

Los trabajos sobre control en la transcripción en eucariotes se han centrado principalmente en dos

clases de elementos regulatorios. Unos son los que actúan en “cis” como los potenciadores, silenciadores y

aisladores y los que actúan en “trans”, constituido por factores transcripcionales activadores y represores

que se unen al DNA, regulando la expresión génica.

Un grupo de elementos “cis” lo conforman los potenciadotes que son regiones no traducibles que se

encuentran a lo largo de los genomas y son reconocidas por factores proteicos que inducen la expresión de

los genes, son específicos y se encuentran desde 100pb hasta varios miles de pares de bases de distancia de

los genes sobre los cuales actúan (Maniatis et. al., 1998).

Existen también los silenciadores que son regiones no traducibles que distan desde unos cientos

hasta varios miles de pares de bases de los promotores, son secuencias que actúan como sitio de unión de

factores represores de la transcripción. Estos factores pueden funcionar dependiendo de la orientación, en

cuyo caso actúan en un sentido, o bien existen silenciadores bidireccionales que actúan en ambos sentidos

(Brooker, 1999).

8

Otro ejemplo de elementos “cis” son las secuencias de DNA y proteínas asociadas que pueden

cumplir la función de generar sus propias fronteras llamadas ‘Insulator’ o aisladores (West y Gaszner,

2002). Dichas secuencias de DNA protegen a los genes de señales inapropiadas. Los aisladores protegen la

expresión génica en su entorno de dos formas: la primera es por un bloqueo de la acción de un potenciador

distante el cual solo sucede si el aislador se sitúa entre el potenciador y el promotor y en cualquier otra

posición no actúa (Geyer y Corces, 1992; Kellum y Schedl, 1992); la segunda forma en la que un aislador

protege el silenciamiento no deseado de un gen es al actuar como una barrera contra regiones condensadas

(heterocromáticas) cercanas a genes y que pudieran ejercer un silenciamiento.

Por su parte los elementos que actúan en “trans” son proteínas que pueden reconocer secuencias

específicas de DNA, este es un fenómeno que involucra una afinidad estructural y electrostática entre las

dos partes. Los tipos de unión que se presentan son enlaces por puente de hidrógeno, enlaces iónicos e

interacciones hidrofóbicas, los motivos de unión más representativos que están presentes en los factores

transcripcionales son el motivo Hélice-Vuelta-Hélice, las proteínas de unión a DNA por “dedos de zinc”, el

motivo hoja-β y el motivo tipo “cierre de leucina”. En general, la función de los factores transcripcionales

es modular la expresión génica, activándola o reprimiéndola mediante su unión a las regiones regulatorias

de los genes.

2.4 Remodelación de la estructura de la cromatina

Las primeras observaciones hechas en el núcleo celular mostraron heterogeneidad en la

organización estructural del DNA, éste hecho cobró importancia una vez que se definieron los dos estadios

en los que se encuentra la cromatina en el núcleo: heterocromatina y eucromatina (Heitz, 1928). Las

evidencias mostraban que los cambios en la estructura del cromosoma estaban estrechamente vinculados

con los niveles de expresión de los genes por lo que el descubrimiento del nucleosoma (Hewish y

Burgoyne, 1973; Kornberg y Thomas, 1974) aclaró aún más la participación de la estructura de la

cromatina en la regulación de la expresión génica.

2.4.1 Complejos remodeladores de cromatina

Se han propuesto dos grupos de complejos multiproteicos que remodelan la estructura de la

cromatina, los dependientes de ATP y los enzimáticos. Estos complejos alteran los contactos entre el DNA

y el nucleosoma y modifican la carga de las colas de histonas (Felsenfeld et al., 1996). Los complejos

9

remodeladores de la cromatina dependientes de ATP representan un importante grupo de factores que

participan activamente en la regulación génica. Se han descrito distintos complejos remodeladores de la

cromatina tales como SWI/SNF (Switching / Sucrose non fermenting), RSC (remodels the structure of

chromatin), NuRF (Nucleosome Remodelling Factor), CHRAC (The chromatin accessibility complex) y

ACF (ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor). De manera general estos complejos

actúan sobre los nucleosomas remodelando los contactos entre el DNA y las histonas, propician la

movilidad del nucleosoma y permiten la reorganización de arreglos nucleosomales (Kingston, 1999).

El segundo tipo de modificación de la cromatina son las enzimáticas, y estas se llevan a cabo en el

extremo amino terminal de las histonas, son modificaciones postraduccionales y reversibles; los efectos

sobre la cromatina que provocan las modificaciones enzimáticas de las histonas son la neutralización de las

cargas de los residuos aminoacídicos de las histonas, la desestabilización de los contactos entre los

nucleosomas y el mayor acceso a proteínas reguladoras de la transcripción.

2.5 Modificaciones de las Histonas.

Las modificaciones de las histonas son cambios que tienen gran implicación en la regulación de la

expresión génica. Las modificaciones de las histonas son cambios covalentes, reversibles y

postraduccionales, se llevan a cabo en los extremos amino-terminal o “colas de las histonas” y provocan

cambios en la carga neta (positiva) de éstas, que normalmente presentan afinidad al DNA (Kuo y Allis,

1998). Entre los hechos más importantes que dieron luz en el conocimiento de los procesos de regulación

destacan la identificación de coactivadores asociados con las regiones promotoras con actividad histona

acetiltransferasa e histona desacetilasa, éstas activan y reprimen la transcripción, respectivamente (Berger,

2002). Las principales modificaciones enzimáticas son la acetilación y desacetilación, la fosforilación,

ADP-ribosilación, metilación y ubiquitinación (Wolffe, 2001). Los diferentes tipos de modificaciones de

las histonas se han englobado como el código de histonas (Fig. 1), éste código es una extensión en el

potencial de información del código genético y constituye un mecanismo epigenético que regula la

mayoría de los procesos que afectan la estructura de la cromatina, impactando de manera esencial en la

expresión génica y, por consiguiente en el fenotipo de los organismos. Se ha observado que los

aminoácidos que sufren estas modificaciones son arginina y lisina, aunque también se han observado en

residuos de serina.

10

Figura 1. Representación esquemática del código de histonas (Zhang y Reinberg, 2006).

Uno de los principales procesos de modificación enzimática es la acetilación y desacetilación de las

histonas. La acetilación de las histonas se lleva a cabo por las proteínas Histona-Acetil-Transferasas (HAT)

y consiste en la adición de un grupo acetilo donado por la Acetil-CoA al residuo de lisina, provocando la

neutralización de la carga positiva e incrementando la hidrofobicidad del núcleo de histonas, con ello se

produce una importante reducción de la afinidad DNA-Histona (Kuo y Allis, 1998). Existen dos formas en

las que se puede presentar la acetilación, la primera es como parte de la edición y maduración de las

histonas en el citoplasma (cotraduccional), antes de entrar a cumplir su función en el núcleo; la segunda

ocurre en los extremos amino terminal cuando forman parte de la cromatina enrollando al DNA.

2.5.1 La desacetilación de las histonas

La desacetilación de las histonas es el proceso contrario a la acetilación, es uno de los mecanismos

por los cuales la célula reprime la expresión de genes al compactar la estructura de la cromatina, así se

evita la accesibilidad del DNA a los factores y la maquinaria transcripcional. Las enzimas que llevan a

cabo la desacetilación son las histona desacetilasas (HDAC) las cuales forman complejos multiprotéicos

provocando un efecto contrario al fenómeno de la acetilación, restaurando la carga de los aminoácidos y la

compactación de la estructura de la cromatina (Tauton y Hassing, 1996). Las HDAC se han clasificado en

tres principales clases: 1, dentro de las cuales se agrupan las clásicas HDAC conteniendo las subclases

RPD3, HDA1 y HOS3; la clase 2 contiene a las desacetilasas sirtuinas dependientes de la molécula

energética nicotin adenin dinucleótido (NAD+) con las subclases SIR2 y HST1-4; y la clase 3, que agrupa a

Acetilación Metilación Fosforilación

11

las enzimas relacionadas con HD2, específicas de plantas (Trojer et. al., 2003). Se ha documentado que la

actividad histona desacetilasa a menudo se presenta en grandes complejos. En hongos existen dos grupos

definidos, uno es el complejo HDA con un peso de 350 kDa y que posee a la enzima Hda1p como

subunidad catalítica. Otro complejo es el HDB que contiene a la enzima Rpd3p con un peso de 600 kDa

como subunidad catalítica (Rundlett et al., 1996).

2.5.1.1 El gen RPD3

En S. cerevisiae el gen Rpd 3 codifica para una proteína con actividad histona desacetilasa

implicada en la regulación transcripcional de ciertos genes; además, se han encontrado proteínas

homólogas a esta en otros eucariotes (Suka et al., 1998). La eliminación del gen Rpd3 incrementa la

acetilación de las histonas in vivo (Rundlett et al., 1996). En células diploides de S. cerevisiae las mutantes

en Rpd3 presentan defectos en la recombinación mitótica y en la esporulación (Dora et al., 1999). Rpd3p

es parte de un complejo formado por proteínas como Ume6p, Sin3p y Sap30p, asociadas a su vez con el

silenciamiento transcripcional. También, se ha observado que Rpd3p reprime la transcripción en loci

definidos a través de la interacción con proteínas que se unen al DNA y pueden desacetilar todos los sitios

de acetilación de la histona H4 (in vitro) y, junto con Sin3p reprime la transcripción de Ume6p (Vidal y

Gaber, 1991). Rpd3p y Sin3p forman un complejo capaz de desacetilar las histonas H3 y H4, además de

ser un regulador negativo del gen HO (Stillman, 1994). Otro descubrimiento importante fue la

participación de las desacetilasas en regiones del genoma con islas de CpG metiladas complementando el

silenciamiento que provoca el proceso de metilación con lo que queda manifiesta su actividad represora

(Nan et al., 1998). Recientemente, se ha descrito la implicación directa de Rpd3p en la regulación de la

transcripción de RNA ribosomal. En otros hongos se han caracterizado histona desacetilasas, entre ellas

HdaAp homóloga a Rpd3p y presente en Aspergillus nidulans, y se ha comprobado que mutantes en esta

proteína se ven afectadas en el crecimiento y esporulación bajo condiciones de estrés oxidativo (Tribus et

al., 2005). Se ha reportado que el gen Phd1, que codifica para una histona desacetilasa en

Schizosaccharomyces pombe, es indispensable en la meiosis y en el mecanismo de resistencia a tricostatina

A. Un estudio sobre los genes HDA1 y RPD3 de histona desacetilasas encontrados en el patógeno

oportunista C. albicans mostró que participan en la regulación del cambio fenotípico de alta frecuencia

observado en este hongo (Srikantha et al., 2001).

12

2.6 El fenómeno del dimorfismo

La importancia del dimorfismo se centra en dos aspectos principales, uno es el hecho de que

diversos hongos patógenos de plantas y animales presentan una morfología distinta entre su estado

saprófito y parásito; el otro aspecto es la posibilidad de estudiar el dimorfismo en los hongos como modelo

adecuado y eficiente para la comprensión de los procesos de diferenciación celular en organismos

eucariotes.

Existe gran diversidad de condiciones naturales en las que se pueden encontrar los hongos;

coexisten dentro de los seres vivos, a los que pueden invadir causando enfermedades. En el caso de los

mamíferos, la temperatura corporal y la composición de los tejidos son generalmente condiciones

inadecuadas para el crecimiento de la mayoría de los hongos; sin embargo se han observado cepas fúngicas

que al ser incapaces de crecer a 37ºC no penetran en el hospedero sino que causan lesiones superficiales;

mientras que otro grupo de hongos, regularmente dimórficos, son capaces de adaptarse a la temperatura

corporal causando infecciones profundas y diseminadas.

2.7 El hongo Yarrowia lipolytica como modelo de estudio

Yarrowia lipolytica es un ascomiceto aerobio y dimórfico que se puede encontrar en forma de

levadura, pseudomicelio y micelio verdadero, o una mezcla de estos (Barth y Gaillardin, 1996). Este hongo

en su forma de levadura se puede aislar fácilmente de productos como queso, yogurt y una gran variedad

de productos lácteos. Debido a su incapacidad de crecer en temperaturas superiores a 34ºC se le considera

no patógeno en humanos. Su tipo de reproducción es sexual, con dos tipos sexuales identificados como A y

B; se encuentra de manera estable tanto en estado haploide como diploide y se aparea por conjugación

heterotálica. En la etapa de esporulación se producen cuatro ascosporas haploides. La morfología colonial

de Y. lipolytica es diversa dado que se han observado desde colonias lisas y brillantes hasta opacas y

rugosas. Factores como la aireación, fuente de nitrógeno, fuente de carbono y pH, entre otros, son los que

determinan el tipo de morfología colonial. Y. lipolytica presenta una serie de características que le hacen un

interesante objeto de estudio. Por ejemplo su dimorfismo lo convierte en un buen modelo de diferenciación

y su capacidad de crecer en substratos inusuales como alcanos o ácidos grasos y la de secretar proteínas y

ácidos orgánicos hacen de este organismo un modelo atractivo en la industria de la biotecnología

(Beckerich y Gaillardin, 1998); además de ser susceptible de análisis bajo las técnicas más comúnmente

utilizadas en genética y biología molecular, se le puede manipular fácilmente en condiciones de

13

laboratorio, existen métodos eficientes para llevar a cabo su transformación genética, los sistemas de

transición levadura-micelio in vitro son reproducibles en el laboratorio y su genoma esta actualmente

secuenciado (Base de datos www.genolevures.org).

2.8 Dimorfismo en Y. lipolytica

Existen estudios donde se han descrito los efectores del dimorfismo de Y. lipolytica, entre los cuales

están el pH, fuente de carbono, fuente de nitrógeno, citrato y concentración de gases O2/CO2 (Domínguez

et al., 2000; Ruiz-Herrera y Sentandreu, 2002). Actualmente está bien establecido el método para la

inducción de la transición dimórfica en Y. lipolytica con base en el uso de medio mínimo con N-Acetil

glucosamina (GlcNAc) como fuente de carbono. Se ha visto también que tal inducción es favorecida con

un choque térmico a las células previo a la inoculación de éstas al medio inductor (Guevara-Olvera et. al.,

1993). Durante la transición levadura–micelio las células en estado micelial contienen mayor cantidad de

aminoazúcares y muestran una disminución en el contenido de proteínas respecto a la fase levaduriforme

(Vega y Domínguez, 1986). Se sabe que las poliaminas son indispensables para el crecimiento y

diferenciación en mamíferos y hongos, estas son sintetizadas por una ruta metabólica en donde participa la

ornitina descarboxilasa (ODC), que transforma la ornitina en putrescina. Las mutantes en el gen YlODC

indican un absoluto requerimiento de poliaminas para desarrollar una morfología micelial (Jiménez-

Bremont et. al., 2001). La actividad de la ODC se incrementa significativamente así como los depósitos de

poliaminas en las hifas cultivadas en medio con GlcNAc (Guevara-Olvera et. al., 1993). En Y. lipolytica el

pH ácido induce una morfología levaduriforme, mientras que la morfología micelial se observa a un pH

neutro (Ruiz-Herrera, 2002). En un estudio donde se caracterizó y analizó el gen RIM9 de Y. lipolytica de

la vía Rim/Pal de respuesta a pH en este hongo, se observó que las mutantes en dicho gen no fue afectada

la dependencia del pH en el dimorfismo de Y. lipolytica por lo que se cree que puede existir al menos una

vía alterna (González-López, 2002). HOY1 es un factor trancripcional que contiene un homeodominio que

se ha identificado en genes responsables del apareamiento en distintos organismos. Las mutantes de este

gen son incapaces de formar micelio en condiciones de inducción de la transición dimórfica (Torres-

Guzman y Domínguez, 1997). El gen YWPl codifica una proteína de pared celular específica de la forma

micelial en Y. lipolytica, las mutantes en este gen no muestran defectos morfológicos probablemente

debido a la existencia de otras proteínas con función homóloga (Ramón et al., 1996). Las mutantes de los

genes CDC25 y RAS2 son incapaces de realizar la transición levadura-micelio, estos resultados sugieren

14

que RAS2 y CDC25 son componentes de la ruta del AMP cíclico, que es indispensable para la formación

de micelio. Las mutantes en ambos genes tienen defectos en la morfogénesis, probablemente debido a

perturbaciones en el procesamiento de las proteínas extracelulares (Richard, 2001). El gen YlBEM1 es

necesario para la transición dimórfica. Las mutantes en este gen presentan serios defectos en la

morfogénesis y en la regulación del crecimiento polarizado. Dicho gen esta íntimamente ligado a la

organización del citoesqueleto y a procesos como la formación de septos, a través de posibles interacciones

con los filamentos de actina y con el direccionamiento de la quitina, ya que se localiza abundantemente en

regiones de biosíntesis de la pared celular y los septos (Hurtado y Rachubisnki, 2002). El gen TUP1 de C.

albicans es un represor de la miceliación; el análisis de cepas mutadas en dicho gen mostraron una

morfología micelial constitutiva (Braun y Johnson, 1997). En Y. lipolytica se observa el mismo efecto de

TUP1, por ello se sugiere como un participante importante en el proceso del dimorfismo (comunicación

personal A. Domínguez, 1999). El gen STE11, que forma parte de la ruta de las MAP cinasas de Y.

lipolytica es necesario en el proceso de dimorfismo del hongo, no así en la integridad de la pared celular ni

en su tasa de crecimiento. La mutación del gen mostró defectos en el proceso de apareamiento. Por su

parte, el AMPc inhibe la formación de micelio bajo condiciones de inducción (Cervantes-Chávez, 2007).

15

3. Justificación

La importancia de este trabajo radica en dos aspectos fundamentales, la generación de conocimiento

para un mejor entendimiento del proceso de dimorfismo y los genes que participan en el mismo,

complementando los diversos estudios que se han enfocado principalmente hacia la identificación de genes

de señalización (Ruiz-Herrera, 1993) y vías de transducción de señales implicadas en dicho proceso

(Cervantes, 2007). La comprensión de los diferentes niveles del proceso del dimorfismo, es la base para

poder diseñar estrategias que permitan el control de este fenómeno. El segundo aspecto es el interés

antropocéntrico en áreas como la clínica, puesto que se sabe que la mayoría de los hongos dimórficos son

patógenos oportunistas y se ha correlacionado la capacidad de llevar a cabo la transición dimórfica con la

patogenicidad, ya que las micosis se han convertido en un serio problema para la salud en pacientes

inmunocomprometidos (Nemecek et al., 2006).

De esta manera, la comprensión del fenómeno del dimorfismo es parte fundamental de los

esfuerzos encaminados hacia el control de enfermedades producidas por hongos en seres humanos,

animales y plantas, lo que permitirá el desarrollo de nuevos antifúngicos. El conocimiento de los genes con

implicaciones en el dimorfismo, así como el descubrimiento de los mecanismos y su asociación con los

procesos biológicos de los hongos para su crecimiento, son estudios estrechamente vinculados cuya

repercusión en la industria y en la medicina serán de suma importancia, puesto que dicho conocimiento

conlleva al control del crecimiento de los hongos tanto dimórficos como filamentosos o que presenten un

cambio de morfología en alguna etapa de su desarrollo. Así mismo, el proceso del dimorfismo es un

ejemplo de la diferenciación celular que se presta como un sistema extrapolable a organismos eucariotes

superiores en los esfuerzos encaminados a la comprensión de dicho fenómeno en los diferentes niveles de

complejidad.

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4. Objetivo General

Determinar la posible participación del gen RPD3 que remodela la estructura de la cromatina en el

dimorfismo de Yarrowia lipolytica.

5. Objetivos Específicos

Análisis bioinformático del gen YlRPD3 que codifica para una histona desacetilasa.

Obtener y analizar fenotípicamente una cepa mutante de Y. lipolytica afectada en el gen YlRPD3.

Analizar la facultad de la cepa mutante ΔYlRPD3 de llevar a cabo la transición dimórfica.

6. Hipótesis

El gen RPD3 participa en la transición dimórfica de Y. lipolytica

17

7. Materiales y Métodos

7.1 Material biológico

Las cepas utilizadas de Y. lipolytica fueron la P01a (MAT A: ura3-302, leu2-270) y la cepa meztli

(MAT A: leu2-270, Δrpd3). Por su parte, las cepas utilizadas en el desarrollo de la estrategia de

interrupción del gen fueron: la E. coli JM-109 genotipo: e14–(McrA–) recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17

(rK– mK+) supE44 relA1. (lac-proAB) [F´ traD36 proAB lacIqZ.M15] y la E. coli DH5α genotipo: F-,

φ80dlacZΔM15, Δ(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17(rk-, mk+), phoA, supE44, λ-, thi-1,

gyrA96, relA1

7.2 Plásmidos usados Los plásmidos que se utilizaron para los ensayos de clonación y transformación fueron: pJMGP1,

el cual deriva del plásmido pBluescript, contiene un fragmento Pst I de 4kb donde se encuentra el gen

YlRPD3 con su promotor y su terminador; el plásmido pKSURA3 que se derivó del pBluescript-KS® y

contiene el gen URA3 de Y. lipolytica, su tamaño total fue 4.67kb, el gen URA3 fue amplificado por PCR

utilizando el oligonucleótido en sentido con un sitio Nco I y aprovechando que en el extremo 3’ posee otro

sitio Nco I de manera natural, lo anterior permitió interrumpir el marco de lectura del gen YlRPD3 que

posee sitios Nco I flanqueando la mayor parte de dicho marco. Por último se utilizó el plásmido

pJMGP1A7 que se derivó del pJMGP1. Con esa construcción se obtuvo el vector de interrupción del gen

de interés en este estudio, el plásmido pJMGP1A7 contiene el gen YlURA3 sustituyendo el marco de

lectura de YlRPD3, y se utilizó para la transformación genética de Y. lipolytica.

7.3 Análisis Bioinformático

Para el análisis de las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos se utilizó el programa

computacional DNASTAR (Lasergene®, USA). En internet se utilizaron las herramientas de la base de

datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) como el

BLASTn y BLASTp, el sitio Genolevures (http://cbi.labri.fr/Genolevures/), la base de datos

Saccharomyces Genome Database (SGD) (http://www.yeastgenome.org/) y la herramienta Matinspector de

la base de datos TRANSFAC (http://genomatix.gsf.de/matinspector).

18

7.4 Estrategia de interrupción del gen YlRPD3

A partir del vector pJMGP1, que contiene el gen YlRPD3 con su promotor y terminador, se diseñó

una estrategia para interrumpir el marco de lectura del gen. El marco de lectura abierto del gen se eliminó y

se sustituyó por el gen YlURA3 usado como marcador de selección. El análisis de restricción del gen

YlRPD3 mostró que posee sitios NcoI flanqueando la totalidad de la secuencia traducible. A partir del

plásmido pKSURA3 se diseñaron oligonucleótidos con la secuencia de restricción para NcoI en la región

del promotor y terminador del gen URA3 (YlURA S y YlURA R), de manera que los sitios NcoI permitieran

la sustitución del marcador de selección por el gen en estudio (Fig. 7). Mediante retrogenética se

transformó la cepa P01a de Y. lipolytica que tiene auxotrofía para uracilo y leucina.

Figura 2. Esquema de la elaboración del vector de interrupción para el gen YlRPD3. A. Análisis de

restricción del gen YlRPD3. B. Digestión con Nco I. C. Obtención del marcador YlURA3 con sitios Nco I

flanqueantes. D. ligación del marcador de selección en el plásmido con zonas flanqueantes de YlRPD3

A B

C

D

19

7.5 Extracción de DNA genómico de Y. lipolytica

La extracción del DNA de Y. lipolytica se realizó mediante el método de Hoffman y Wriston

(1987). La cepa P01a se cultivó en 20 mL de medio rico (YPG) por 18 h a 30 ºC con agitación a 200 rpm.

Pasado el tiempo de incubación se centrifugó el cultivo en tubos eppendorf descartando el sobrenadante. El

sedimento celular obtenido (pastilla) se lavó con agua destilada y se centrifugó nuevamente. Sin el

sobrenadante la pastilla lavada se resuspendió en 200 µL de solución de lisis (Tritón X-100 2%; SDS 1%;

NaCl 0.1M; Tris-HCl pH 8 10 mM y EDTA 1 mM). Posteriormente se añadieron aproximandamente 300

mg de perlas de vidrio (ballotini) de 0.45mm de diámetro y 200 µL de fenol:cloroformo (1:1). Los tubos se

agitaron en un agitador tipo vortex durante ciclos simultáneos de 1min al vortex más 1min en hielo, con

tres repeticiones. Concluida la agitación se agregaron 200 µL de TE 10:1 (Tris 10mM y EDTA 1mM) y se

centrifugó por 10 min a 12,000 rpm. El sobrenadante se rescató en tubos nuevos y se agregó 30 µg de

RNAsa A. posteriormente se incubaron durante 5 min a 37ºC y se añadieron 10 µL de acetato de amonio

4M y 1ml de Etanol al 100%, los tubos se mezclaron por inversión y se dejaron reposar durante 20min a -

20ºC. El contenido de los tubos se centrifugó durante 5min a 12,000 rpm descartando el sobrenadante;

luego se lavó el precipitado con 100 µL de etanol 70%, el sobrenadante se eliminó a través de una

centrifugación, posteriormente se secó el sedimento de DNA durante 1-2 min a 55ºC. Finalmente el DNA

genómico se resuspendió en 30 µL de TE 10:1 y se almacenó a -20ºC.

7.6 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Las amplificaciones por PCR se realizaron en un termociclador BIORAD® modelo i-cycler y se

usando aproximadamente 100 ng de DNA genómico (DNAg) y 10 ng de DNA plasmídico (DNAp) como

templado, oligonucleótidos a una concentración de 500 ng µL-1. Los deoxinucleótidos (dNTP’s) se usaron

a concentración de 10 mM, 1.5 µL Cloruro de Magnesio a 50 mM, 5 µL de buffer 10X y 2.5 U de enzima

Taq DNA polimerasa (Invitrogen®) en un volumen final de 50 µL. Las condiciones en que se llevaron a

cabo las amplificaciones variaron de acuerdo con el tamaño del fragmento y la temperatura de

alineamiento de los oligonucleótidos, la temperatura de desnaturalización del DNA fue 94 ºC al igual que

la temperatura de extensión de la Taq polimerasa (72 ºC). El cuadro 2 indica la secuencia de los

oligonucleótidos utilizados y su respectiva temperatura de fusión, (Tm). Alternativamente, se utilizó el

estuche PCR SuperMix (Invitrogen®) con el que se realizaron ensayos de PCR para obtener productos de

alta fidelidad; ello con el fin de asegurar que la amplificación de la copia no funcional del gen de interés

20

que contiene una copia del gen YlURA3 sea susceptible de ser expresada y así utilizarse como marcador de

selección en ensayos de transformación genética.

Cuadro 2. Oligonucleótidos utilizados en los ensayos de amplificación por PCR.

Nombre Secuencia Tm (ºC)

JMGP1 (Sentido URA3 NsiI) GTCGATGCATATCTGTCTGACTCGT 63

JMGP2 (Reverso URA3 NsiI) ACAAATGCATGTTTCTCGGTGTACA 59.7

JMGP3 (Oligo Interno Sent) CTGGACTACCACTACACC 56

JMGP4 (Oligo interno Rev) TCCAACGAAGAATGTATC 49.1

JMGP5 (Sentido RPD3) GCACCACACACCGCCATC 60.5

JMGP6 (Reverso RPD3) CGTTTGATAGCTAGTCAC 51.4

YlURAS (Sentido URA3 NcoI) GTCGCCATGGATCTGTCTGACTCGTC 74.6

YlURAR (Reverso URA3) TCCATAACAAGTTCTTCTGCCTCC 66.2

7.6.1 Condiciones de amplificación por PCR para el gen YlURA3

Mediante un ensayo de PCR se obtuvo el gen YlURA3 que se usó como marcador de selección de

las cepas mutantes en YlRPD3. Las condiciones de amplificación se establecieron tomando en cuenta la

longitud del fragmento y la temperatura de fusión de los oligonulceótidos, la reacción se realizó utilizando

100ng de DNA plasmídico y oligonucleótidos a una concentración de 0.5 g µL-1, el resto de los

componentes de la reacción forman parte del buffer del PCR supermix (Invitrogen®); las condiciones se

muestran en el cuadro 3 y 4.

21

Cuadro 3. Componentes de la reacción en la amplificación del gen YlURA3

Cuadro 4. Condiciones de reacción de la amplificación del gen YlURA3. 7.6.2 Condiciones de amplificación para determinar la mutación del gen RPD3

Una prueba de PCR sobre la región RPD3 permitió determinar si la cepa mutante integró de manera

exitosa la copia mutada con la que se transformó genéticamente. La prueba se realizó a partir de DNA

genómico de la cepa mutante y la cepa parental utilizando oligonucleótidos diseñados en las zonas

adyacentes al sitio de sustitución (Cuadro 5 y 6).

Componente Cantidad

DNA(pKSURA3) 1 µL

Oligo JMGP1 1 µL

Oligo JMGP2 1 µL

PCR supermix

HIFI (Contiene

dNTP’s, Mg++,

Buffer y Enzima)

47 µL

Condiciones Tiempo T (ºC) Ciclos TºC desnaturalización 5 min 94 1

To C desnaturalización 45 s 94

30 To C alineamiento 45 s 55

To C extensión 2 min 72

T° C adición de poly A 5 min 72 1

T° C mantenimiento (tiempo indefinido) - 4 -

22

Cuadro 5. Componentes de la reacción de amplificación por PCR del sitio de la sustitución del gen

YlRPD3 por la copia no funcional que contiene el gen YlURA3 usado como marcador de selección.

Cuadro 6. Condiciones de la amplificación del fragmento generado en el sitio de la sustitución.

Con una prueba de PCR sobre la región YlRPD3 fue posible la determinación de la recombinación

de la copia mutada del gen, de manera que permitió conocer si ésta se integró específicamente en el sitio

del gen de interés, para ello se utilizó un oligonucleótido interno sentido diseñado sobre el marcador de

Componente Cantidad DNAg 1 µL

Oligo JMGP5 1 µL Oligo JMGP6 1 µL

Mg++ 1.5 µL

Buffer 5 µL

Nucleótidos 1 µL

Agua 39 µL

Enzima Taq 0.5 µL




To C extensión 1 min 45 s 72



23

selección YlURA3 y un oligonucleótido reverso diseñado sobre la región genómica adyacente al marco de

lectura (ORF) sustituido del gen YlRPD3 (Cuadro 7 y 8)

Cuadro 7. Componentes de la reacción amplificación por PCR para la determinación de la correcta

sustitución del gen YlRPD3 por el marcador de selección YlURA3.

Cuadro 8. Condiciones de la PCR para la amplificación del fragmento en la región 3’ de la sustitución del marco de lectura de YlRPD3 por el marcador YlURA3 .




To C extensión 30 s 72



Componente Cantidad DNAg 1 µL

Oligo JMGP3 1 µL Oligo JMGP6 1 µL

Mg++ 1.5 µL

Buffer 5 µL

dNTP’s 1 µL

Agua 39.5 µL

Enzima Taq 0.5 µL

24

7.7 Purificación de fragmentos de DNA rescatados de geles de agarosa

En los ensayos de electroforesis realizados se rescataron fragmentos de DNA producto de

reacciones de digestión enzimática o PCR, con la finalidad de obtener fragmentos puros, se utilizó agarosa

ultra pura de la compañía Promega® para la preparación de geles 1%, una vez corrida la electroforesis, se

llevó el gel al transiluminador de luz UV para visualizar la banda de interés, procurando una exposición

mínima a la luz UV, se cuantificó la banda a través del cálculo respecto a la concentración del marcador de

peso molecular, se cortó la banda de interés con una navaja de bisturí, los fragmentos cortados del gel con

el DNA se sometieron al protocolo indicado en el estuche comercial de Promega® Wizard SV PCR and

agarose gel clean-up system No. Cat. A9280. Una vez purificado el fragmento se sometió a una

electroforesis para su cuantificación, encontrándose que el producto recuperado representó normalmente el

80-90% de la cantidad inicial.

7.8 Clonación de productos de PCR

La clonación de productos de PCR se llevó a cabo para la conservación de fragmentos de interés o

construcciones que permitieron la mutación del gen YlRPD3, se utilizó el estuche comercial de Promega®

pGEM T-easy vector system de acuerdo a las especificaciones del fabricante. La primera etapa de la

clonación consistió en la ligación del fragmento de interés en el vector pGEM T – Easy vector que contiene

el estuche y que está linearizado para aceptar el inserto. La preparación de la mezcla de ligación consistió

en colocar 5 µL de buffer 2X de la enzima, 1 µL de vector pGEM T – Easy (50 ng), producto de PCR

(siguiendo la relación inserto : vector - 3:1) y por último 1 µL de enzima T4 DNA ligasa en un tubo

eppendorf de 1.5 µL, la reacción se incubó 1 h a temperatura ambiente, o bien, si el máximo número de

transformantes es requerido se puede dejar toda una noche ligando a 4 °C.

7.9 Reacciones de modificación de DNA 7.9.1 Digestión enzimática

Los distintos ensayos de digestión enzimática se llevaron a cabo para la obtención del marcador de

selección YlURA3 con los extremos Nco I compatibles con el vector pJMGP1 que contenía la copia del gen

de interés YlRPD3 y que fue digerido con la misma enzima de restricción. Los ensayos se realizaron de

25

acuerdo al protocolo descrito por Invitrogen® en un volumen final de 20 µL, añadiendo de 100 hasta 500

ng de DNAp o productos de PCR, o bien de 0.2 a 0.5 µg de DNAg, de 1 a 5 U de enzima de restricción y 2

µL del buffer (10X) correspondiente para cada enzima. Posteriormente, se incubaron durante 1 ó 2 h a la

temperatura que la casa comercial específica para cada enzima de restricción utilizada.

7.9.2 Desfosforilación

Se llevaron a cabo ensayos de desfosforilación de los extremos cohesivos de un vector digerido de

acuerdo con las especificaciones de la fosfatasa alcalina (CIAP) de Invitrogen®. El método simplificado de

desfosforilación consiste en añadir 1 U de enzima directamente en el tubo donde se llevó a cabo la

digestión, utilizando así el propio buffer de la enzima de restricción sin necesidad de purificar el

fragmento. La mezcla se incubó durante 30 min a 37 ºC y se eliminó la enzima con una columna del

estuche comercial de Promega® Wizard No. Cat. A9280. El método alternativo para llevar a cabo la

desfosforilación consistió en purificar el DNAp previamente digerido para eliminar la enzima y,

posteriormente, se desfosforiló usando el buffer específico de la fosfatasa, la concentración utilizada de

DNAp fue de 200 a 500 ng, se añadieron 4 µL de buffer 10X, agua destilada hasta 39 µL y 0.01 U de la

enzima fosfatasa, se incubó la reacción a 37 °C durante 30 min.

7.9.3 Ligación de fragmentos

Las ligaciones se llevaron a cabo siguiendo la técnica descrita por Invitrogen® para la T4 DNA

ligasa. Para la estimación del DNA a ligar se utilizó una proporción inserto – vector de 3:1 en la ligación, 4

µL del buffer 5X, 1 U de enzima T4DNA ligasa y agua destilada estéril hasta un volumen total de 20 µL,

posteriormente se incubó durante 4 h a temperatura ambiente o bien toda la noche a 4 ºC.

7.10 Separación de fragmentos de DNA por electroforesis

La resolución de fragmentos de DNA resultado de los distintos ensayos se realizó a través

de electroforesis utilizando una cámara de electroforesis horizontal BioRad® en la cual se colocó un gel de

agarosa 1% y se cubrió con solución TAE 1X (40mM Tris-Acetato y 1mM EDTA pH 8.0), las muestras de

DNA y el marcador λ/HindIII (50 ng µL-1) se cargaron en el gel, para lo cual se utilizó Orange 6X y SYBR

gold® en el buffer de carga. Por último, se aplicó un voltaje de 80v durante 1 h para la visualización

correcta de cada fragmento.

26

7.11 Transformación genética de E. coli

Los ensayos de transformación de E. coli se realizaron siguiendo el protocolo descrito por el

estuche comercial de Promega® pGEM T – easy vector. Una vez que se obtuvo la ligación, se colocaron 2

µL de dicha reacción en un nuevo tubo eppendorf y posteriormente se añadieron las células calcio -

competentes JM-109 mantenidas en hielo todo el tiempo, por cada ensayo de clonación se usaron 50 µL de

células competentes. Una vez mezcladas las células con la reacción de ligación, se mantuvieron en hielo

por 20 min. Posteriormente se les aplicó un choque térmico a 42 °C por 50 seg. Inmediatamente después se

volvió a transferir el tubo con la mezcla a hielo durante 2 min para posteriormente añadir 950 µL de medio

de cultivo LB sin antibiótico y se colocó en un equipo Thermomixer® a 37 °C durante 1.5 h.

Posteriormente se prepararon placas con medio LB + ampicilina, a las que se añadió el componente X-Gal

(20 µL a una concentración de 50 µg mL-1) y el componente IPTG inductor de la alfa-complementación

(100 µL a 100 mM), por último, una vez transcurrida la incubación, las células se sembraron en las placas

y se incubaron a 37 °C durante toda una noche.

7.12 Extracción de DNA plasmídico de bacterias

La obtención de DNAp se llevó a cabo con el protocolo de Bimboim y Doly (1979). Las colonias se

resembraron en 3 mL de medio LB líquido con ampicilina a 37 ºC y agitación durante toda una noche,

posteriormente se transfirió el cultivo a tubos eppendorf de 2ml y se centrifugó a 12000 rpm durante 30 s.

El sobrenadante se descartó y el sedimento celular se resuspendió en 300 µL de la solución P1 (Tris-HCl

pH8 50mM; EDTA 10mM; RNAsa A 0.1 mg mL-1). Posteriormente, se añadieron 350 µL de la solución

P2 (NaOH 200 mM; SDS 1%), se mezcló por inversión y se añadieron 350 µL de la solución P3 (acetato

de potasio 3M, pH5.5), el tubo se invirtió varias veces y se centrifugó a 12000 rpm durante 5min. El

sobrenadante Se rescató y se añadió 1 vol de cloroformo-isoamílico (24:1), el tubo se agitó vigorosamente

y se centrifugó durante 5 min a 12000 rpm. Posteriormente, se rescató la fase acuosa y se colocó en un tubo

nuevo al cual se añadió 0.6 vol de isopropanol, el tubo se invirtió 3 veces y se guardó a -20 ºC durante 15

min. Posteriormente los tubos se centrifugaron a 12000 rpm durante 5 min. El sobrenadante se desechó y la

pastilla de DNA se lavó con etanol 70%. Finalmente el contenido se centrifugó durante 5min y el

sobrenadante se desechó. El DNA se secó a 55 ºC durante 1 a 2 min. Una vez libres de restos de etanol, los

DNA’s se resuspendieron en 50 µL de TE 10:1 y se almacenaron a -20ºC hasta su uso posterior.

27

7.13 Transformación genética de Y. lipolytica

El ensayo de transformación genética de Y. lipolytica se realizó con células intactas tratadas con

acetato de litio (Xuan et al., 1988). La cepa P01a se inoculó en 5ml de medio completo YPG, pH 4.0 a 28

ºC, en agitación durante 18h. Posteriormente se tomó el volumen necesario del preinóculo para obtener

12.5 mL del medio completo YPG pH 4.0 con una concentración de 1x105cel mL-1, se incubó en un matraz

de 250 mL a una temperatura de 28 ºC con agitación hasta alcanzar una concentración de 1x108cel mL-1. El

cultivo se utilizó para obtener células competentes del hongo. El cultivo se centrifugó a 5000 rpm durante 5

min y se sometió a dos lavados con TE (Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM, pH 8.0). El siguiente paso fue la

resuspensión de las células en regulador de citrato con acetato de litio 0.1M, pH 6.0 hasta obtener una

concentración de 5x107cel mL-1 y se incubaron durante 1 h a 28 ºC con agitación suave de 70 a100 rpm.

Posteriormente las células se centrifugaron y se resuspendieron en regulador de citrato con acetato de litio

0.1M, pH 6.0 hasta obtener una concentración de 5x108cel mL-1.

Las células competentes (100 µL) se colocaron en un tubo falcon de 15 mL, posteriormente se

añadieron 5 µL de DNA sonicado de esperma de salmón (5 mg mL-1) y 500 ng de DNA del vector de

interrupción linearizado; se mezcló suavemente y se incubó por 15 min a 28 ºC sin agitación. Una vez

transcurrido el tiempo se agregaron 700 µL de una solución de polietilenglicol PEG 4000 al 40 % en

regulador de citrato con acetato de litio 0.1M, la mezcla se incubó por 1 h a 28 ºC con agitación suave (75

rpm). Por último, las células se sometieron a un choque térmico a 39 ºC durante 10 min para después

añadir 1 mL de TE pH 8.0 y sembrar 200 ó 400 µL de la suspensión en placas con medio selectivo sin

uracilo, mismas que se incubaron a 28ºC hasta la aparición de colonias.

7.14 Determinación de la morfología colonial

Para la observación de la morfología colonial se sembró por goteo sobre la placa, colocando 5 µL

de una suspensión celular de 1x107, 1x106, 1x105 y 1x104 cel mL-1 respectivamente en la misma placa con

medio completo YPG o medio mínimo YNB, las placas se incubaron a 28 °C en oscuridad durante 36 h o

hasta la visualización de la morfología colonial, el experimento se realizó con dos repeticiones.

28

7.15 Determinación de crecimiento celular

El análisis del crecimiento se realizó midiendo la absorbancia a 600 nm de los cultivos a diferentes

tiempos, para ello se utilizó el espectrofotómetro Beckman Coulter® DU – 650 y se llevó a cabo

paralelamente un conteo celular con la cámara Neubauer® bajo microscopía de campo claro con un

objetivo 40X, el diseño del experimento consistió en hacer tres repeticiones de cada muestra.

7.16 Análisis de la mutante por Southern blot

La hibridación DNA-DNA se realizó siguiendo el protocolo de Southern (1975). En dicho ensayo

se utilizaron 2 µg de DNAg previamente digerido con Pst I. Los fragmentos se separaron por electroforesis

en gel de agarosa 1% y se tiñeron con bromuro de etidio. Posteriormente, se colocó el sistema de

transferencia del DNA a una membrana de nylon, usando una solución de transferencia (NaOH 0.4M)

durante toda una noche. Posteriormente la posición del gel se marcó en la membrana y el DNA transferido

se fijó en un equipo “Stratalinker” que emite radiación UV que permite la fijación del DNA en la

membrana, se aplicaron dos ciclos predeterminados por el aparato. La membrana se pre-hibridó con una

solución SSC 4X que contiene SDS al 1%, reactivo de Denhardt 1X (polivinilpirrolidona, 0.02 %; Ficoll,

0.02 %; Seroalbúmina bovina, 0.02 %) y DNA de esperma de salmón (100 µg mL-1) como agente

bloqueador. La membrana se incubó con la solución a 65 ºC durante 4 h. Posteriormente se hibridó la

membrana a 65 ºC durante toda una noche utilizando la solución SSC 4X con dextran sulfato de sodio 10%

y DNA de esperma de salmón (100µg mL-1), utilizando como sonda el fragmento Sal I de 0.6 kb del

promotor del gen en estudio marcado por radioactividad, el marcaje de la sonda se realizó por el método de

iniciador al azar (random priming) de acuerdo con las especificaciones del estuche comercial Rediprime de

la compañía Amersham®, el nucleótido marcado fue la citosina con fosforo radioactivo P32, el nucleótido

se denominó gamma-dCTP. La membrana se lavó utilizando la solución ‘a’ (2XSSC y SDS 0.1%) a

temperatura ambiente para remover el excedente de la solución de hibridación. Los siguientes lavados se

realizaron con la solución ‘b’ (1XSSC y SDS 0.1%) y ‘c’ (0.1XSSC y SDS 0.1%) en intervalos de 10 a 15

min cada uno hasta que la membrana alcanzó un valor de 400 a 600 cpm. La exposición de las membranas

se hizo en “cassettes” con película fotográfica X-OMAT (Kodak), incubándola a -70 ºC durante 24 h.

29

7.17 Inducción de la transición dimórfica

Los ensayos de inducción del dimorfismo se realizaron de acuerdo con Guevara-Olvera (1993) y

Ruiz-Herrera (2002). Las cepas se cultivaron en medio completo YPG en 10 mL a 200 rpm para obtener

así el preinóculo. Posteriormente, se inocularon 3x106 células mL-1 en un volumen total de 2 mL de medio

mínimo YNB (leucina 150 mM y uracilo 100 mM) dependiendo de los requerimientos de cada cepa; se

utilizó buffer de citratos 100 mM; se utilizaron tres diferentes fuentes de carbono tales como glucosa, N-

acetil glucosamina, 1.0% y suero, 2 %. Como única fuente de nitrógeno se utilizó sulfato de amonio

(NH4)2SO4 0.5%. La preparación de las células previo a la inoculación en el medio consistió en un lavado

de las células con agua destilada, posteriormente se resuspendieron en un volumen de agua destilada hasta

cinco veces menor que el original y se mantuvieron en agitación suave (75 rpm) durante 4 h o hasta

observar todas las células con morfología levaduriforme. Una vez sincronizados los cultivos se aplicó un

choque térmico de 37 ºC por 15 min. Posteriormente los cultivos se incubaron a 28 ºC con agitación a 250

rpm, el experimento se realizó por triplicado, por último se registró la morfología al microscopio cada 12 h

para lo cual se fotografiaron distintos campos microscópicos de alícuotas de cada muestra.

7.18 Observaciones al microscopio

El análisis de la morfología celular de las cepas de Y. lipolytica mutante y parental se realizó

mediante microscopía de campo claro. Las observaciones se realizaron a diferentes tiempos y se hicieron

diluciones cuando fue necesario, colocando 10 µL del cultivo en un portaobjetos. El análisis morfológico

se realizó a 100 aumentos en el microscopio Olympus® BX51. Se capturaron imágenes de las

observaciones utilizando una cámara Hitachi® KP-D50 color digital, integrada al microscopio.

30

8. Resultados 8.1 Análisis bioinformático de la secuencia YlRPD3

La secuencia del gen YlRPD3 posee un marco de lectura abierto de 1377 pb. Con el programa

computacional TRANSFAC se realizó el análisis de la región promotora, que mostró sitios de

reconocimiento de factores transcripcionales que pueden sugerir los diferentes tipos de regulación de dicho

gen (Fig. 2). Dentro de dicho análisis se identificaron motivos de unión al factor transcripcional MluI que

se ha descrito como un regulador dependiente del ciclo celular en organismos eucariotes. Además esta

presente el sitio MSN2/MSN4 al cual se une reguladores de respuesta a estrés; el motivo Gal4 es un sitio

de activación de la transcripción bajo inducción por galactosa que es característico de levaduras. El sitio

HMG box es reconocido por proteínas de activación transcripcional del tipo denominado “grupo de alta

movilidad” y es un sitio de interacción para la proteína Ste11p. También se encuentra el sitio de unión

GCN4 que es un factor de activación transcripcional característico de levaduras. Adicionalmente, se

identificó la posible caja TATA de inicio de la transcripción de este gen.

Figura 3. Secuencia de la región promotor del gen YlRPD3, se destacan los motivos de unión a

factores transcripcionales identificados, así como la posible caja TATA de inicio de la transcripción.

31

El análisis de la región del terminador del gen YlRPD3 mostró las secuencias conservadas que

sirven de señal para el término de la transcripción en levaduras, los motivos observados son TTT, TAG,

TAGT, y regiones ricas en Timina (Russo, 1993) (Fig. 4).

Figura 4. Representación de la secuencia del terminador del gen YlRPD3 donde se identificaron de

secuencias características de terminación de la transcripción en levaduras.

El marco de lectura de YlRPD3 codifica para una proteína de 458 a.a. que muestra una identidad

mayor al 80% con respecto a su homóloga en S. cerevisiae (Cuadro 9). YlRpd3p presenta el dominio

característico de esta familia de enzimas (Fig 5).

Figura 5A. Comparación de secuencias de Rpd3p en levaduras, se muestra una representación

esquemática de la secuencia aminoacídica de YlRpd3p comparada con las secuencias de Rpd3p de S.

cerevisiae y C. albicans (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).

S. cerevisiae

C. albicans

Y. lipolytica

32

Cuadro 9. Identidad de YlRpd3p con otras enzimas histona desacetilasas.

Secuencias RPD3 en otros organismos Identidad (%)

Saccharomyces cerevisiae 82

Xenopus laevis 58

Mus musculus 65

Drosophila melanogaster 60

Homo sapiens 65

Con la herramienta bioinformática Megalign de Lasergene® se alinearon distintas histona

desacetilasas y se observó el grado de conservación que existe entre secuencias. Las regiones destacadas

muestran los aminoácidos conservados en estas enzimas (Fig 5B.)

Posteriormente, se construyó un dendrograma con base en las secuencias de proteínas histona

desacetilasas obtenidas de distintos organismos (Fig. 6).

33

34

35

8.2 Transformación genética de Y. lipolytica y obtención de la mutante ΔRPD3

El ensayo de transformación genética de Y. lipolytica dio como resultado cincuenta transformantes

que se recuperaron y analizaron por su capacidad para crecer en un medio selectivo. Las colonias

transformantes se aislaron y resembraron en medio sólido y líquido de YNB con leucina. Se recuperaron

cincuenta colonias para su análisis posterior.

8.3 Comprobación de la mutación

Las cincuenta colonias que se recuperaron fueron analizadas por Southern blot para observar el

número de copias y el tipo de integración del vector de interrupción en el genoma del hongo, para ello se

utilizó como sonda el fragmento SalI del promotor del gen (Fig. 8.A), utilizando DNAg digerido con PstI.

El tamaño de la señal observada que corresponde a la copia silvestre del gen es de 3.97 kb, mientras que en

las transformantes es de 2.74 kb debido al sitio interno PstI presente en el marcador de selección (Figs. 8

A y B). El análisis mostró que 49 de las 50 colonias analizadas integraron de manera homóloga y con copia

única el vector de interrupción en la región del gen YlRPD3. Adicionalmente se llevaron a cabo pruebas de

PCR para corroborar la integración de la copia no funcional del gen YlRPD3 (Figs. 9 y 10).

A. B.

Figura 8. Comprobación de la mutación del gen YlRPD3 A. Representación esquemática del análisis de

restricción de la copia silvestre y mutante y el fragmento utilizado como sonda en el análisis tipo Southern.

B. Análisis de las cepas de Y. lipolytica mediante Southern blot para comprobar la mutanción del gen

YlRPD3.

36

A. B.

Figura 9. A. Representación esquemática del sitio donde se diseñaron los oligonucleótidos para el ensayo

de PCR para la comprobación de la mutación, el tamaño esperado para el fragmento obtenido con DNAg

de la cepa parental es de 1.45kpb, mientras que el tamaño esperado para el fragmento de DNAg de la

mutante es mayor con un tamaño de 1.6kpb. B. Resultados de la amplificación por PCR utilizando los

oligonucleótidos JMGP5 y JMGP6 en cepas de Y. lipolytica.

A. B.

Figura 10. A. Representación esquemática del diseño de oligonucleótidos para la comprobación de la

mutación, el oligo sentido se ubicó en la región 3’ del marcador de selección, mientras que el oligo reverso

se diseñó en la región terminador del gen YlRPD3, el tamaño esperado es de 100pb. B. Resultados de la

amplificación por PCR utilizando los oligonucleótidos JMGP4 y JMGP6 en cepas de Y. lipolytica.

λ/HindIII P01a Mutante

1.45 1.6

4

kb

kb

2

Testigo +

0.1

λ/Hind III Mutante

100pb

37

8.4 Análisis de la mutante ΔRPD3 El análisis de la cepa mutante consistió en la observación y comparación de su morfología colonial

y celular respecto de la cepa parental cultivada y documentada bajo las mismas condiciones, lo que

permitió la caracterización fenotípica de la cepa obtenida en este estudio.

8.4.1 Análisis fenotípico de la mutante

El análisis de la morfología colonial se realizó cultivando la cepa P01a y una de las cepas mutantes

en placas con medio completo durante 36 h y se realizó un registro fotográfico. Las diferencias en el borde

de colonia fueron notables, las cepas parentales P01a presentaron crecimiento de borde irregular y

apariencia rugosa mientras que las cepas mutantes mostraron bordes circulares y apariencia cremosa y lisa.

Debido al fenotipo colonial, la cepa mutante se denominó ‘meztli’ (que significa ‘luna llena’ en lengua

náhuatl) (Fig. 11).

Figura 11. Morfología colonial de cepas de Y. lipolytica en medio completo YPG a diferentes

concentraciones celulares.

P01a Meztli

1x107 cel. 1x106 cel. 1x105 cel.

P01a Meztli

38

El análisis de la morfología celular se determinó cultivando la cepa meztli y la parental P01a en

medio completo YPG y medio mínimo YNB con microscopía de campo claro. Las células de la cepa

mutante se caracterizan por una morfología ovalada (Fig. 12) y mayor tamaño que la parental en medio

mínimo (Fig. 13).

A. B.

Figura 12. Morfología celular de cepas de Y. lipolytica en medio completo YPG. A. P01a. B. Meztli.

Observaciones realizadas a 100X.

A. B.

Figura 13. Morfología celular de cepas de Y. lipolytica en medio mínimo YNB. A. P01a. B. Meztli.

Observaciones realizadas a 100X

La tasa de crecimiento en medio completo (Fig. 14) no mostró diferencias entre la cepa meztli y

parental. En medio mínimo se observó una drástica reducción en la tasa de crecimiento de la cepa mutante

respecto a la cepa parental de aproximadamente siete veces (Fig. 15).

39

0 4 8 12 16 20 240.0

0.5

1.0

1.5

2.0PO1aMeztli

Tiempo (h)

Abs

orba

ncia

(600

nm

)

Figura 14. Crecimiento de cepas de Y. lipolytica en medio completo YPG. Los valores son el promedio de

tres repeticiones y se calculó el error estándar a través del programa Prisma® para obtener las barras de

error.

Figura 15. Crecimiento de cepas de Y. lipolytica en medio mínimo YNB. Los valores son el

promedio de tres repeticiones las barras mostraron el error estándar a través del programa Prisma®.

40

La capacidad de asimilación de las cepas de Y. lipolytica en medio mínimo YNB se evaluó en

diferentes fuentes de carbono (Fig. 16 y 17). La glucosa y sacarosa son las fuentes de carbono más

eficientemente asimiladas por P01a, el resto de las fuentes de carbono fueron pobremente asimiladas (Fig.

16). Meztli mostró una diferencia clara respecto a la parental en la asimilación de las fuentes de carbono

ensayadas (Fig. 17).

Figura 16. Asimilación de diferentes fuentes de carbono de la cepa P01a en medio mínimo YNB,

los valores son el promedio de tres repeticiones y se calculó el error estándar con el programa Prisma®.

41

Figura 17. Asimilación de diferentes fuentes de carbono de la cepa meztli en medio mínimo YNB.

Los valores mostrados son el promedio de tres repeticiones, las barras de error se calcularon por medio del

error estándar con el programa Prisma®.

8.3.2 Análisis del dimorfismo de la cepa meztli

La morfología celular en el tiempo cero es levaduriforme para ambas cepas, debido a la

sincronización a la que se sometió previo a la inoculación en el medio inductor (resultados no mostrados).

A las 12 horas de incubación a pH7 con glucosa se observan células de la cepa parental respondiendo al

estímulo presentando la formación de micelio; la cepa meztli presentó una tasa de crecimiento menor

respecto a la parental y su morfología celular fue levaduriforme. Con N-acetil glucosamina en P01a se

observaron células alargadas; mientras que en meztli se detectaron células levaduriformes ligeramente

alargadas. En suero, P01a mostró mayor respuesta a la transición dimórfica con un mayor número de

células con morfología micelial; mientras que meztli con suero, exhibió tasa de crecimiento menor y

morfología levaduriforme con células ligeramente alargadas por la gemación en los polos, similares a las

observadas en los cultivos con N-acetil glucosamina (Fig. 18).

42

Figura 18. Morfología celular de cepas de Y. lipolytica en medio mínimo YNB a pH 7.0 a las 12

horas de incubación con diferentes fuentes de carbono.

A las 24 horas de incubación se registró nuevamente la morfología celular de los cultivos de P01a y

meztli. A pH 7.0 con glucosa se observó que P01a presentó una morfología micelial con hifas muy largas

en tanto que meztli mantuvo morfología celular totalmente levaduriforme. Los cultivos con N-acetil

P01a Meztli

Glucosa

N-Acetil glucosamina

Suero

43

glucosamina muestran que la cepa parental desarrolló casi por completo un crecimiento micelial; mientras

que meztli presentó morfología levaduriforme. Las observaciones de los cultivos con suero mostraron a la

cepa P01a con morfología 100% micelial; mientras que los cultivos de meztli exhibieron una morfología

levaduriforme con células ligeramente alargadas (Fig. 19).



P01a Meztli

Glucosa


Suero

44

A las 12 horas de incubación se realizaron observaciones microscópicas de los cultivos a pH 3.0.

Los cultivos de P01a en glucosa mostraron morfología micelial y en los cultivos de la cepa meztli se

encontraron solo levaduras. Los cultivos con N-acetil glucosamina de P01a mostraron una tasa de

crecimiento menor que la observada a pH 7.0 y morfología micelial; la cepa meztli en cambio mostró

morfología celular levaduriforme. P01a en suero exhibió morfología celular micelial y bajo número de

células observadas por campo óptico; por su parte los cultivos de meztli mostraron levaduras ligeramente

alargadas (Fig. 20).



P01a Meztli

Glucosa


Suero

45

A las 24 horas de incubación a pH 3.0, la cepa parental en medio con glucosa, N-Acetil

glucosamina y suero mostró una morfología celular micelial; en tanto que meztli mostró solamente células

levaduriformes (Fig. 21).



P01a Meztli

Glucosa


Suero

46

Finalmente, se registró la morfología de los cultivos a las 48 h con el fin de observar posibles

cambios en la morfología registrada durante las primeras 24 h en ambas cepas. La morfología celular de la

cepa meztli se mantuvo levaduriforme en todas las condiciones ensayadas; en tanto que P01a exhibió

morfología micelial a las 48 h. Cabe mencionar que el suero como inductor de la miceliación, tuvo un

efecto ligero en meztli cuando se cultivó a pH 7, ya que se observaron células levaduriformes en gemación

más alargadas de lo normal (datos no mostrados).

47

9. Discusión. El análisis de la secuencia obtenida de la base de datos www.genolevures.org del gen YlRPD3

mostró un tamaño de 1377 pb que corresponde al promedio observado en la secuencia homóloga reportada

del gen Rpd3 de S. cerevisiae (Vidal et al., 1990). La secuencia carece de intrones al igual que las ya

reportadas (Srikantha et. al., 2001). Un análisis de la región del promotor del gen YlRPD3 reveló la

presencia de sitios de reconocimiento de proteínas y factores reguladores transcripcionales similares a los

reportados para Rpd3 en S. cerevisiae. La presencia del sitio de unión a MluI sugiere que YlRPD3 puede

estar regulado en alguna etapa del ciclo celular, probablemente al final de la fase M del ciclo puesto que se

observan células de la cepa mutante que no alcanzan a separarse una vez que han gemado. Una región

MSN2/MSN4 se identificó, esta podría participar en respuesta a situaciones de estrés en el organismo

(Schmitt y McEntee, 1996), en este caso, el estrés nutricional que sufre el hongo en condiciones de medio

mínimo. La secuencia de unión al factor transcripcional Gal4 (Melcher y Johnston, 1995) presente en el

promotor indica que probablemente la galactosa pudiera influenciar la actividad de YlRPD3, sin embargo

la galactosa fue una de las fuentes de carbono utilizadas en el análisis fenotípico de la mutante y fue

pobremente asimilada no solo por la cepa mutante sino también por la parental. La secuencia HMG box

sirve como sitio de interacción a la proteína Ste11p perteneciente a la vía de señalización de las MAP

cinasas en hongos, tal es el caso de S. cerevisiae y S. pombe (Kjærulff et al., 1997) por lo que es posible

que dicha ruta cuya activación se da en respuesta a nutrientes afecte la expresión del gen en estudio.

Además se observó la secuencia que reconoce el factor GCN4 cuya implicación en los procesos de

biosíntesis de aminoácidos en respuesta a carencia de los mismos es conocida (Hope y Struhl, 1986), esto

indica la posibilidad de que YlRPD3 participe en la regulación de genes responsables de la respuesta a

condiciones de limitación o ausencia de aminoácidos, situación que se presenta en condiciones de medio

mínimo y cuya repercusión en la cepa mutante se traduce en una disminución en su tasa de crecimiento.

El análisis de la región terminador mostró los motivos característicos en levaduras que sirven de

señal para la terminación de la transcripción. La identidad entre la secuencia del gen Rpd3 de S. cerevisiae

y RPD3 de Y. lipolytica es mayor a 80%, lo cual sugiere que son genes homólogos, este hecho se ve

reforzado en la comparación de dominios cuyo resultado mostró que el mismo dominio histona

desacetilasa con 312 a.a. de extensión esta presente en los genes correspondientes de S. cerevisiae y C.

albicans; incluso en S. cerevisiae el dominio inicia en la misma posición de la secuencia aminoacídica (19

al 331). La longitud promedio del dominio histona desacetilasa fue 312 aminoácidos y se observaron

48

variaciones mínimas. Tales evidencias indican que el gen en estudio corresponde al homólogo de RPD3 en

S. cerevisiae.

Actualmente la clasificación de las enzimas histona desacetilasas esta basada en comparaciones

entre secuencias dentro de la cual se proponen tres principales clases de histona desacetilasas: la clase I

donde se agrupan las desacetilasas clásicas conteniendo las subclases RPD3, HDA1 y HOS3; la clase II

contiene a las histona desacetilasas Sirtuinas dependientes de NAD+ con las subclases SIR2 y HST1-4.

Finalmente la clase III agrupa a las enzimas HD2 específicas de plantas (Trojer et al., 2003). Con

diferentes secuencias proteicas de histona desacetilasas se realizó un dendrograma que mostró las

relaciones entre las especies analizadas y donde se situó a la secuencia YlRpd3p en el grupo de las histona-

desacetilasas clase I, en tanto que las demás incluidas se agruparon de manera congruente a la clasificación

descrita anteriormente, por lo que las relaciones filogenéticas a partir de distintas secuencias de

desacetilasas apoyan la clasificación propuesta por Trojer.

La técnica de doble recombinación homóloga fue seleccionada para la interrupción de YlRPD3. A

través de esta técnica se eliminó la mayor parte del marco de lectura incluyendo el dominio funcional

histona desacetilasa. El resultado obtenido en este trabajo mostró una integración sitio-específica de copia

única del gen mutado en 49 de las 50 colonias analizadas.

El análisis de la morfología colonial mostró a la cepa mutante meztli (ΔRPD3) con apariencia

cremosa, de borde definido y circular, mientras que la cepa parental P01a exhibió colonias rugosas de

borde irregular. El fenotipo de la cepa meztli (ΔRPD3) presentó similitud a nivel de morfoloía colonial y

celular con cepas afectadas en el gen YlBEM1 (Cleofe y Rachubinsky, 2002) así como en mutantes en

HOY1 (Torres-Guzmán y Domínguez, 1997) y ODC (Jiménez-Bremont et al., 2001)

En medio completo el crecimiento entre P01a y meztli no mostró diferencias significativas, sin

embargo en medio mínimo se observó una drástica reducción del crecimiento de la cepa mutante respecto

de la parental de siete veces aproximadamente; la morfología celular mostró diferencias claras entre P01a

y meztli, las células de P01a son ligeramente alargadas y se observa una mezcla de células levaduriformes

y algunas hifas cortas. En la cepa meztli se observan células más redondeadas, de mayor tamaño y en

muchos casos una morfología deformada, logrando gemar pero con defectos en la separación de las

células, sugiriendo que la mutación puede impactar en el desarrollo normal del ciclo celular en el hongo.

Las fuentes de carbono mejor asimiladas por la levadura fueron glucosa y sacarosa; la maltosa,

manosa, galactosa y lactosa son pobremente asimiladas de acuerdo a lo observado en las curvas de

crecimiento, comparativamente existe un estudio hecho para la determinación de los patrones de

49

asimilación de fuentes de carbono de diferentes levaduras donde observaron que en S. cerevisiae al igual

que en Histoplasma capsulata, Pichia pastori entre otros, asimilan de manera eficiente la glucosa, seguida

por la sacarosa y galactosa, mientras que la lactosa, maltosa y manosa son generalemnte poco asimilables

como única fuente de carbono en levaduras (Shifrine, 1954). En los ensayos se observó que meztli crece

en una proporción mucho menor respecto a P01a; sin embargo mantiene el perfil de asimilación de fuentes

de carbono tal como la cepa parental y por tanto, la eliminación del gen YlRPD3 probablemente no tiene

influencia en la asimilación de las fuentes de carbono analizadas.

El diseño experimental para observar la respuesta de meztli a la inducción del dimorfismo se realizó

como describen Ruiz-Herrera y Sentandreu (2002) cultivando simultáneamente la cepa meztli y la P01a

bajo las mismas condiciones y registrando cada 12 horas la morfología celular. A las 12 horas se observó

que P01a mostró células alargadas mientras que meztli exhibió una morfología completamente

levaduriforme independientemente de la fuente de carbono y pH ensayados, este fenotipo resulta similar al

reportado por Cleofe y Rachubinsky (2002), en cuyo estudio se obtuvieron mutantes afectadas en el gen

YlBEM1 el cual es homólogo al gen Scd2 de S. cerevisiae cuya participación en el crecimiento polarizado

de ese hongo es bien conocida, las observaciones al microscopio de dicha mutante indicaron la presencia

de células esféricas, de mayor tamaño y en muchos casos deformes respecto a la parental de referencia y de

igual forma que lo observado en meztli resultaron incapaces de llevar a cabo la transición dimórfica,

Aunado a lo anterior se ha observado que mutantes del gen YlRAC1 que codifica para una molécula de

señalización indispensable para la formación de micelio, presentan un fenotipo similar al observado en las

mutantes afectadas en RPD3 con morfología celular de forma redondeada e incapacidad para llevar a cabo

la transición dimórfica (Hurtado et al., 2000), estas evidencias sugieren que el fenotipo similar de dihcas

mutantes implica una posible interacción entre la señalización que lleva a cabo YlRAC1 y la actividad

como factor transcripcional de YlRPD3 y el complejo del que forma parte.

A las 24 horas P01a mostró una morfología micelial en las condiciones ensayadas; sin embargo en

pH 3 mostró una mezcla de levaduras y micelio, contrastando con lo observado por Ruiz-Herrera y

Santandreu (2002), quienes reportaron una morfología levaduriforme en pH 3, probablemente la respuesta

de la cepa P01a a la miceliación a pH3 se deba a que algunas células no se sincronizaron al inicio del

experimento. Por su parte la morfología observada en la cepa meztli es levaduriforme independientemente

de las fuentes de carbono y pH probados, El suero provocó una morfología levaduriforme aunque con

células más alargadas que las observadas en glucosa y N-Acetil glucosamina como fuente de carbono. A

las 48 horas se registró también la morfología de los cultivos de meztli y P01a, observando solamente

50

células levaduriformes en los cultivos de meztli y micelio en los cultivos de P01a. Estas observaciones

indican que independientemente del tiempo de cultivo ensayado para la inducción de la transición

dimórfica, la morfología celular muestra el mismo patrón. La razón de monitorear la morfología después

de las 48 h se debe a que algunas cepas de este hongo pueden miceliar cuando se cultivan por períodos

mayores a 36 h (Barth y Gaillardin, 1996).

Un estudio de cepas de Y. lipolytica defectivas en el gen HOY1 cuyo producto se ha identificado en

el núcleo, contiene un homeodominio que le permite interacción con DNA y es característico de distintos

factores transcripcionales. Dichas mutantes son incapaces de formar micelio y presentan una morfología

deforme y alterada respecto a la parental (Torres-Guzman y Domínguez, 1997).

Por las evidencias anteriores dada la similitud de fenotipos observada con otros genes estudiados

previamente, queda clara la participación del gen YlRPD3 en el dimorfismo de Y. lipolytica, aunque por la

naturaleza de la proteína que codifica, se sabe que actúa como regulador de la expresión de ciertos genes

(Rundlett et al., 1996), lo que sugiere que puede actuar al final de una de las vías de transducción de

señales del hongo debido a que se asocia con otras proteínas formando complejos que actúan a nivel de la

cromatina. Las observaciones realizadas sobre la cepa meztli de Y. lipolytica incapaz de realizar el cambio

dimórfico son consistentes con la teoría de que al ser RPD3 un cofactor que interviene en la represión o

silenciamiento génico está íntimamente ligado a procesos diferenciativos que se caracterizan por un alto

grado de regulación de la expresión génica (Vidal y Gaber, 1991). En S. cerevisiae se ha descrito a TUP1

como factor represor de la transcripción. En C. albicans la mutación del gen TUP1 provoca un crecimiento

micelial constitutivo (Braun et al., 1997). Adicionalmente se ha descrito la interacción entre TUP1 y

complejos de histona desacetilasas (Davie, 2003), en S. cerevisiae se ha descrito la participación de TUP1

en la formación de heterocromatina a través del reclutamiento de la histona desacetilasa HDA1 (Fagerstrom

2005), sin embargo la prueba de la interacción de TUP1 y RPD3 en S. cerevisiae, la dio a conocer Watson

et al., (2000) al observar que la eliminación de RPD3 provoca un cambio significativo en la actividad

represora de TUP1. Por la evidencia anterior, es probable que en Y. lipolytica el gen RPD3 actúe junto con

TUP1, lo que explicaría que la cepa meztli crezca constitutivamente como levadura, y por tanto, RPD3 esté

actuando como un regulador positivo de la miceliación.

51

10. Conclusiones

Se identificó la secuencia del gen RPD3 de Y. lipolytica, así como el dominio histona desacetilasa, a

su vez se analizó la región del promotor encontrando los posibles mecanismos de regulación del gen. La

identidad entre YlRPD3 y otras histona desacetilasas fue significativa, lo que permitió predecir que el gen

YlRPD3 es homólogo a RPD3 de S. cerevisiae.

La caracterización fenotípica de la mutante de Y. lipolytica afectada en el gen de la histona

desacetilasa RPD3 demostró una reducción significativa del crecimiento comparada con la cepa parental

cuando se cultivaron en medio mínimo con diferentes fuentes de carbono. La glucosa y la sacarosa se

asimilaron mejor en ambas cepas que el resto de las fuentes de carbono probadas. La mutante presentó

células de mayor tamaño y de aspecto redondo comparadas con las de la cepa parental que principalmente

exhibió células pequeñas y ligeramente alargadas. Las colonias que formó la mutante fueron de aspecto

liso, cremoso y de borde circular mientras que la cepa de referencia mostró colonias de aspecto rugoso y

borde irregular.

Las observaciones realizadas sobre la respuesta dimórfica de una cepa de Y. lipolytica afectada en la

histona desacetilasa RPD3 indicaron que la proteína participa en este proceso diferenciativo, ya que la cepa

mutante en el gen en estudio mostró una clara incapacidad para llevar a cabo la transición dimórfica. Estas

observaciones son el primer reporte que se ha realizado sobre la implicación de la desacetilación de las

histonas en el dimorfismo de Y. lipolytica.

52

11. Recomendaciones

Las observaciones realizadas muestran claramente el efecto de la mutación en la capacidad de

realizar el cambio dimórfico de Y. lipolytica. Es importante realizar estudios que proporcionen el mayor

entendimiento sobre las posibles interacciones de RPD3 con otros genes implicados en el dimorfismo de

este hongo. Actualmente se cuenta con técnicas avanzadas para la interrupción de genes que podrían

permitir el análisis de otros genes que participen en la remodelación enzimática de la cromatina para poder

ofrecer una visión más clara de la implicación de dicho proceso en el fenómeno de dimorfismo analizado

en este estudio. Existe además la opción de utilizar inhibidores de las histona desacetilasas en posteriores

estudios que permitan ampliar el conocimiento y valorar la importancia que estas desempeñan en los

procesos de diferenciación celular; particularmente en el dimorfismo cuya mejor comprensión permitirá el

diseño de mejores estrategias de control de las micosis que las que actualmente se utilizan.

53

12. Referencias Bibliográficas

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Apéndice

Medios de cultivo

Medio completo (YPG): Extracto de levadura, 1%; D- Glucosa, 1%; Bacto peptona Difco, 2 %

(Sambrock y Rusell, 2001).

Medio mínimo (YNB): Base nitrogenada de levadura sin aminoácidos (YNB w/o aa), 1.7g/l;

Sulfato de amonio como fuente de nitrógeno, 0.5%; fuentes de carbono, 1% cuando fue necesario glucosa,

maltosa, manosa, lactosa, galactosa, sacarosa. Cuando fue necesario uracilo 250mM y leucina 200mM.

Medio de inducción: base nitrogenada de levadura sin aminoácidos (YNB w/o aa), 0.67%, sulfato

de amonio, 0.5%, buffer de citratos, 0.1M, fuente de carbono, 1% cuando fue necesario glucosa o N-Acetil

glucosamina, suero, 2%, uracilo 250mM y leucina 200mM cuando fue necesario.

Medio LB: Extracto de levadura 0.5%, Bacto triptona 1% y NaCl 1%,

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Instituto Politécnico Nacional · 2019. 10. 3. · betoh di oro, amos por una lite, nomas una y ya), Gilberto (El chapa, pero chapa de oro no cualquiera), Lupita (por enseñarme