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Coral Muricea appressa
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I N S T I T U T O P O L I T E C N I C O N A C I O N A L
NT CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE CIENCIAS MARINAS
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DE COMPUESTOS
BIOACTIVOS DEL CORAL Muricea appressa Verril 1864
T E S I S
Que para obtener el
Título de
Maestro en Ciencias
P r e s e n t a
EFRAIN PEÑALOZA AYALA
La Paz, Baja California Sur, México Marzo de 2004
Coral Muricea appressa
2
Lugar de realización:
Este trabajo de tesis se llevó a cabo en el Laboratorio de
Farmacognosia de la UABCS. Forma parte del Programa de Investigación
Farmacognóstica de los Recursos Naturales de B.C.S. y fué dirigido por la
Dra. Rosalba Encarnación Dimayuga.
Apoyo técnico de la UABCS y CONACyT convenio F 500-N9306.
Coral Muricea appressa
3
A G R A D E C I M E N T O S
A la Dra. Clara Nogueira de la hermana República de Cuba por sus
valiosos consejos y guías hacia el aislamiento y purificación de los
compuestos.
A la Dra. Rosalba Encarnación por su valiosa dirección y
orientación hacia el aislamiento y purificación de las sustancias,
también por haberme dado la oportunidad de realizar este trabajo de tesis
en el laboratorio de Farmacognosia que acertadamente dirige.
A las autoridades competentes de la Universidad Autónoma de Baja
California Sur por haberme facilitado los recursos materiales y equipo
necesarios para lograr el objetivo de este trabajo de tesis durante 1992-
1994.
A Pedro Garza y Federico Sinsel del Departamento de Biología Marina
de la U.A.B.C.S., México y al Dr. Frederick Bayer del Museo Nacional de
Historia Natural del Instituto Smithsoniano en Washington, D.C. U.S.A.,
por haber contribuído a la identificación del coral Muricea appressa.
A la Dra. Kasuko Aoki del Departamento de Sistemas Biológicos de la
UAM-XOCHIMILCO en la Ciudad de México, D. F. por ayudarme realizar las
pruebas de contractilidad sobre el músculo liso de yeyuno de conejo.
Al Dr. Carsten Christophersen del Departamento de Química, División
de Química Marina de la Univesidad de Copenhague, Dinamarca, por ayudarme
a realizar las pruebas de RMN de +H y de 13C de los compuestos aislados.
Coral Muricea appressa
4
LEOBARDO PEÑALOZA BALTAZAR (Q.E.P.D.)
A MIS QUERIDOS PADRES:
MARIA MERCEDES AYALA MAYA
A MIS HERMANOS:
CIRO EDUARDO,
GUADALUPE,
OSCAR,
RUBEN,
RAQUEL VICTORIA,
SITA JOSEFINA
REYNALDO, DAN, J. JESUS, IMELDA, ESTHELA, MARIO, BRIGIDA.POR HABERME TENIDO LA PACIENCIA PARA LA REALIZACIÓN DE ESTA TESIS SIN DEDICARLES UN POCO MAS DE TIEMPO PARA ESTAR CON ELLOS.
Coral Muricea appressa
5
ÍNDICE GENERAL
Página
RELACIÓN DE FIGURAS Y TABLAS III
RESUMEN V
ABSTRACT VI
GLOSARIO VII
1.- INTRODUCCIÓN 1
2.- MORFOLOGÍA Y DISTRIBUCIÓN DE GORGONÁCEOS 3
3.- ANTECEDENTES 5
4.- JUSTIFICACIÓN 10
5.- OBJETIVOS 11
6.- METODOLOGÍA 12 6.1 Recolecta 12 6.2 Identificación 12 6.3 Obtención de extractos crudos 15 6.4 Determinación de la actividad antimicrobiana. Método de difusión en agar. 16 6.5 Determinación de la actividad contráctil 18 6.6 Aislamiento y purificación de los compuestos 19 6.7 Cromatografía en capa fina 20
6.8a Cromatografía en columna del extracto de éter
de petróleo (E) 21
6.8b Cromatografía en columna del extracto clorofórmico 24 6.8c Purificación de los compuestos 25 6.9 Caracterización química 26
Coral Muricea appressa
6
7.- RESULTADOS 27
7.1 Extracto de éter de petróleo (E) 30 7.2 Extracto clorofórmico (C) 33
7.3 Actividad antimicrobiana y contráctil sobre el músculo liso deyeyuno de conejo de fracciones semipuras de Muricea appressa 36
7.4 Caracterización química de los compuestos aislados 37 8.- DISCUSIÓN 44 9.- CONCLUSIONES 50 10. RECOMENDACIONES 51 11. ANEXO 52 12. LITERATURA CITADA 53
RELACIÓN DE FIGURAS Y TABLAS
Página
Fig. 1: Área de recolección de Muricea appressa ...........14
Fig. 2: Fraccionamiento del extracto crudo de éter de
petróleo de Muricea appressa por cromatografía encolumna.....23
Fig. 3: Fraccionamiento del extracto crudo clorofórmico de
Muricea appressa por cromatografía encolumna................25
Coral Muricea appressa
7
Fig. 4: Fracciones obtenidas del extracto de éter de
petróleo (E) de Muricea appressa.............................35
Fig. 5: Fracciones obtenidas del extracto clorofórmico (C)
de Muricea appressa .........................................36
Fig. 6: Espectro de Resonancia Magnética Nuclear (RMN)+H
(del protón) correspondiente a la mezcla de terpenos (EII-6)..39
Fig. 7: Espectro de RMN +H correspondiente al ácido
esteárico(CI-3)...............................................40
Fig. 8: Espectro de RMN de 13C correspondiente al ácido
esteárico(CI-3)..............................................41
Fig. 9: Espectro de RMN +H correspondiente al derivado del
ácido esteárico(CI-1)............................................42
Fig. 10: Espectro de RMN 13C correspondiente al derivado del
ácido esteárico (CI-1)...........................................43
Tabla I: Resultado de actividades del extracto de éter de
petróleo, clorofórmico y etanólico del coral Muricea
appressa.........................................................28
Tabla II: Resultado de la Actividad Antimicrobiana del Extracto
clorofórmico del coral Muricea appressa….........................29
Fotografía del coral Muricea appressa............................13
Coral Muricea appressa
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R E S U M E
N
Ejemplares de gorgonias Muricea appressa fueron recolectadas en el complejo insular Espiritu
Santo-La Partida, al sur del Golfo de California. Fueron realizadas pruebas de actividad
antimicrobiana de los extractos de éter de petróleo, clorofórmico y etanólico obtenidos, contra
microorganismos Gram positivos:(Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, y Streptococcus faecalis), un
Gram negativo (Escherichia coli) y un hongo levaduriforme (Candida albicans). Las fracciones
obtenidas del fraccionamiento de los extractos de éter de petróleo y chlorofórmico fueron purificadas
por cromatografía en capa fina y por cromatografía en columna, aislándose de la fracción clorofórmica
dos substancias puras (Ácido esteárico y un derivado de ácido esteárico). De la fracción de éter de
petróleo se aisló una mezcla de terpenos. La estructura química de cada una de las substancias fué
determinada por Resonancia Magnética Nuclear, tanto de +H como de 13
C. La actividad
antimicrobiana y la actividad contráctil de los extractos crudos y de algunas de las fracciones obtenidas
a lo largo de éste estudio es reportada, analizada y discutida.
A B S T R A C T
Samples of coral Muricea appressa were collected from the Gulf of California island complex
Espiritu Santo-La Partida, Baja California Sur, México. Three kinds of crude extracts (petroleum
Coral Muricea appressa
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ether, chloroform, and ethanol) were tested for antibiotic properties against Gram positives (Bacillus
subtilis, Stapylococcus aureus and Streptococcus faecalis), a Gram negative microorganism (Escherichia
coli), and one yeast (Candida albicans). Isolated fractions obtained from the crude extracts of
petroleum ether and choloform were purified using thin layer and column chromatography. Two pure
substances were isolated from the chloroform extract; Stearic acid and a stearic acid derivative. A
terpene mixture was also isolated from the petroleum ether extract. The chemical structures of the
isolated substances were determined by spectrometric techniques; proton and carbon NMR. The
antimicrobial activity and pharmacological properties (antibiotic and muscle contractility on the
smooth muscle of rabbit jejune) of the crude extract and from some partially-pure fractions obtained
in this project are reported, analyzed, and discussed.
G L O S A R I O
ÁCIDO GRASO: Ácido carboxílico compuesto de carbono, hidrógeno y oxígeno. El grupo funcional
terminal es COOH. La cadena de átomos puede ir de C4 a C
22.
AMEBICIDA: Sustancia capaz de inhibir el desarrollo y reproducción de las amibas debido a las
alteraciones celulares permanentes que produce.
ANTIMICROBIANO: Molécula natural (obtenida de hongos y de algunos organismos marinos) o
sintética que evita la reproducción y desarrollo de microorganismos.
ANTIFÚNGICO: Agente químico que evita el desarrollo y reproducción de hongos.
BIOENSAYOS: Procedimientos técnicos experimentales llevados a cabo con el fin de probar el efecto
causado por una sustancia en un sistema biológico.
CELENTERADOS: Son metazoos diploblásticos con simetría radiada. Su cuerpo es en forma de saco
con una sola abertura rodeada de tentáculos, que hace la función de boca y ano. Presenta células
urticantes llamadas cnidioblastos en los tentáculos.
CEMBRANO: Diterpeno con anillo de 14 carbonos.
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CITOTÓXICAS: Sustancias que producen alteraciones celulares definitivas o
temporales y que impiden a la células funcionar y reproducirse.
COMPUESTO BIOACTIVO: Es una sustancia de origen natural o sintético que
ocasiona cambios a nivel molecular en la célula y cuya actividad puede
medirse por comparación con sustancias conocidas.
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA: Procedimiento analítico de separación de moléculas que consiste
de una fase estacionaria, adherida a una placa de vidrio o de papel aluminio y de una fase móvil,
constituida por mezcla de diferentes solventes orgánicos con diferentes grados de polaridad.
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA: La fase estacionaria es colocada en una columna cilíndrica
vertical y la mezla a analizar se introduce en la parte superior de dicha columna, es adsorbida en la
fase estacionaria y luego se deja pasar la fase móvil; las sustancias separadas según sus diversas
afinidades, son recolectadas en fracciones sucesivas en el fondo de la columna.
DITERPENO: Sustancia animal o vegetal compuesta por cuatro unidades isoprénicas como las
Giberelinas (C20
).
ELUCIDACIÓN ESTRUCTURAL: Aclaración o explicación de la estructura química de un compuesto.
ESTERIFICADO: Sustancia química que tiene o está formando un enlace tipo éster en un compuesto.
ESTEROLES: Compuestos químicos cristalinos de C26-C30
. Contienen funciones R-OH y una cadena
alifática en C-17. Son ampliamente distribuídos y ocurren libres o como ésteres y glucósidos.
EXTRACTO CLOROFÓRMICO: Es el concentrado obtenido del organismo en estudio después de la
maceración con cloroformo y posterior evaporación del solvente.
EXTRACTO ÉTER DE PETRÓLEO: Concentrado obtenido del organismo en estudio después de la
maceración con éter de petróleo y evaporación del solvente.
FEROMONAS: Sustancias químicas que utilizan algunos organismos como los insectos para
comunicarse sexualmente.
FISIÓGRAFO: Instrumento utilizado para medir o describir mediante el registro de estímulos
eléctricos alguna actividad o función de un organismo vivo.
FLUORESCENCIA: Es el efecto causado en las moléculas que poseen dobles enlaces conjugados, de
absorber la luz ultravioleta invisible del espectro de luz y emitir la energía luminosa de 254 nm y de
366 nm.
FRACCIÓN ETÉREA: Fracción obtenida por cromatografía en columna a partir del extracto de éter de
petróleo.
Coral Muricea appressa
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GLUCÓSIDO: Compuesto químico abundante en plantas que contiene C, H y O, pueden convertirse
por hidrólisis en azúcares y otras sustancias orgánicas conocidas como agliconas.
HORMONA: Sustancia química que sirve como mensajero celular, se produce en un lugar distante
(glándula) y actúa en un sitio blanco de la célula causándole ciertos efectos fisiológicos.
ISOPRENOIDE: Que tiene estructura parecida a la del isopreno (2- metil-1,3 butadieno).
LACTONA: Éster interno de un ácido carboxílico formado por reacción intramolecular de ácidos
carboxílicos halogenados o hidroxilados con eliminación de agua.
METABOLITO: Molécula que interviene en las reacciones químicas de la célula, puede ser para
producir polímeros orgánicos (síntesis) o para obtener moléculas pequeñas (degradación).
METAZOARIO: Cualquier animal invertebrado que incluye todos los organismos de más de una célula,
constituyendo tejidos y hasta órganos.
MÚSCULO LISO: Organo activo del movimiento, dotado de actividad contráctil, exclusivo de la vida
vegetativa de organismos especializados. Forman en particular la pared de los órganos huecos que se
contraen sin la participación de la voluntad.
OCTOCORALES: Grupo taxonómico con categoría de subclase. La cavidad gastrovascular de los
organismos está rodeada por ocho septos radiales que se unen al disco oral y a la faringe. Los pólipos
poseen ocho tentáculos pinnados o plumosos.
PREGNANO: (Pregnadiol) Esteroide, producto metabólico de la progesterona.
PROSTAGLANDINA: Grupo de compuestos fisiológicamente activos, derivados del ácido
araquidónico, ácido graso C20
. Su nombre proviene de la glándula prostática, de donde fue encontrada
originalmente. Se designan como PG, seguidas con letras del alfabeto.
PROSTANOIDE: Sustancia con estructura química semejante a la de prostaglandina.
RMN: Método espectrométrico de Resonancia Magnética Nuclear. Existen de protón (+H) y de
13C,
empleados para identificación de la estructura química molecular.
SAPONINA: Agente lítico potente, que abate la tensión superficial. Es un glucósido, constituido por
una genina y aglucón capaz de formar abundante espuma.
SENSIDISCOS: Discos de papel filtro de 6.5 mm usados para medir la sensibilidad o resistencia de un
microorganismo frente al extracto o alguna fracción que se desee probar.
SIMBIÓTICO: Asociación entre dos organismos, no afectándose ninguno de
los dos pero sí obteniendo cierto beneficio.
Coral Muricea appressa
12
TERPENO: Sustancia formada por condensación de dos o más unidades
isoprénicas; se subdividen en monoterpenos(C10), sesquiterpenos(C
15),
diterpenos (C20) y otros.
13C: Isótopo no radioactivo estable del carbono usado en la investigación
analítica especial.
YEYUNO: Parte del intestino delgado mesentérico, que constituye los dos
quintos superiores que siguen al duodeno y preceden al íleon.
ZOOXANTELA: Microalga que se encuentra en simbiosis en la mayoría de los
corales tanto hermatípicos como los ahermatípicos.
Coral Muricea appressa
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AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DE COMPUESTOS
BIOACTIVOS DEL CORAL: Muricea appressa Verrill 1864
I.- INTRODUCCIÓN
La información sobre el uso de los productos naturales
con fines medicinales data por lo menos de 4000 años, aunque
se considera que su aplicación es tan antigua como el hombre
mismo (Christophersen et al., 1991).
Desde el punto de vista farmacognóstico, el estudio de
los organismos marinos es más costoso y difícil, comparado
con el de los organismos terrestres (Christophersen et al.,
1991). Sin embargo, dada la inmensa variedad de taxa marinos,
aproximadamente 500,000 especies en 30 phyla (Scheuer, 1986;
Grant y Mackie, 1977), y las características biológicas que
presentan algunos grupos como esponjas, cnidarios,
holotúridos, entre otros, de liberar y producir metabolitos
secundarios activos en su estado natural (Ciereszko y Karns,
1973) han podido ser considerados como un recurso potencial
importante en la búsqueda de nuevos compuestos bioactivos.
Este potencial es más importante por el hecho de que los
organismos marinos han evolucionado en un medio físico y
químico, distinto al que prevalece en el medio terrestre
(presión más elevada, presencia de sales, etc.) y es muy
probable que un elevado porcentaje de ellos puedan presentar
substancias químicas desconocidas, con nuevas estructuras,
Coral Muricea appressa
14
actividades biológicas y farmacológicas y por lo tanto mayor
actividad (Baker, 1984).
Las biotoxinas, por ejemplo, representan solamente una
parte de las numerosas y variadas moléculas aisladas durante
las últimas décadas a partir de organismos marinos. Estas
moléculas, aunque están relacionadas con familias de
compuestos ya conocidos, son originales y algunas carecen de
equivalentes en organismos terrestres (Coll et al., 1978).
Ciertos organismos marinos se consideran venenosos o
ponzoñosos debido a que la toxicidad es indicadora de una
actividad fisiológica potente. Es probable que algunas de las
toxinas de organismos marinos puedan originar nuevos
compuestos que tengan actividad fisiológica importante
(Ruggieri, 1976; Barnes, 1977).
Un mayor entendimiento de las relaciones entre los
organismos marinos y su ambiente, nos podría proporcionar
también orientación para la búsqueda de sustancias de interés
biomédico presentes en ellos (Grant y Mackie, 1977). Estas
sustancias pueden ser usadas para diferentes propósitos tales
como defensa, escape, orientación, reproducción y búsqueda
de alimento (Ciereszko y Karns, 1973).
La diversidad de formas y competencia fisiológica de
invertebrados marinos, contribuyen a su utilidad en la
investigación biomédica. Los más intensamente estudiados por
la presencia de sustancias biológicamente activas, han sido
aquellos que son más accesibles como las esponjas, cnidarios,
Coral Muricea appressa
15
poliquetos, moluscos y equinodermos, pues pueden ser
recolectados con relativa fácilidad y en cantidades
suficientes para la extracción química y la aplicación de
pruebas biológicas (Braekman y Daloze, 1983).
Los estudios de la química de productos naturales de los
corales gorgonaceos fueron iniciados a finales de los años
sesenta con las especies caribeñas más comunes. Estos
estudios ilustraron que éste grupo de invertebrados marinos
contiene altos niveles de metabolitos secundarios, como
acetogeninas, sesquiterpenos, terpenos y en algunos casos
esteroles altamente funcionales (Fenical, 1982). Uno de los
descubrimientos más interesantes en este grupo de corales
blandos, fue el aislamiento de glucósidos esteroidales y
glucósidos triterpenoides a partir de varias especies de
Pseudopterogorgia (Fenical, 1987).
El gran número de metabolitos secundarios aislados de
organismos marinos han conducido al descubrimiento de nuevas
rutas biosintéticas que ocurren solamente en algunos taxa y
a la revisión de algunas ya conocidas. También dio lugar a la
utilización de los datos químicos como una base útil para
estudios taxonómicos (Amico, 1995).
2.- MORFOLOGÍA Y DISTRIBUCIÓN DE GORGONÁCEAS
El Orden Gorgonácea comprende alrededor de 1,200
especies distribuidas por todos los océanos. Harden (1979),
mencionó un total de 173 especies para el Pacífico oriental,
Coral Muricea appressa
16
registrando 125 especies de 21 géneros desde Perú hasta
Alaska. Brusca (1980) en su publicación acerca de la fauna de
invertebrados marinos del Golfo de California, menciona seis
especies de gorgonaceos.
Las gorgonias o corales blandos pertenecen al Phylum
Cnidaria, Orden Gorgonácea, Suborden Holaxonia, Clase
Anthozoa, Subclase Octocorallia. Muricea appressa Verrill,
1864 pertenece a este Phylum, es de color café obscuro, crece
en forma de abanico, con pequeñas verrugas comprimidas. Su
superficie es rugosa cubierta con pequeñas espículas
cortas. El coral se divide de la base en dos o tres
principales ramas, que crecen hacia fuera y eventualmente
curvadas para quedar paralelas a la rama de origen, cada una
de las cuales se subdivide a un diámetro de 0.64 cm de manera
dicotoma, de tal forma que las muestras de 8.35 cm de altura
tienen más de 20 ramas, casi todas son delgadas y tienen el
mismo diámetro; el cenénquima es delgado, muy poco expuesto
excepto en las ramas principales y en la base. En vida, el
color del tallo es rojo débil y pólipos café amarillentos.
Las muestras más grandes son de 45.7 cm de altura. Son
prominentes miembros de la fauna sésil de aguas someras de
una variedad de localidades; habita en el norte y sur de
California donde representa uno de los pocos miembros de este
Orden en esas aguas frías del norte. Ha sido reportado al sur
del continente americano hasta Panamá y Zorritos, Perú
(Verrill, 1868; Brusca, 1980); tienen pocos depredadores y se
Coral Muricea appressa
17
mantienen en competencia por espacio sobre sustrato sólido
(Levinton, 1982).
Se piensa que el crecimiento de gorgonias y la escasa o
nula depredación por organismos competidores se debe en
parte a la producción y secreción de sustancias o compuestos
diterpénicos, y a sustancias relacionadas con el cembrano
(Ciereszko, 1977b).
Las formas de desarrollo o ramificaciones son
importantes en la clasificación de los corales y pueden ser
de varios tipos como: arbórea, con brazos en forma de
candelabro (Género Muricea); arbustiva, a los cuales los
pescadores mexicanos les llaman “arbolitos de mar” (Género
Lophogorgia); o con manifestaciones en un plano,
anastomosadas formando amplios abanicos (Género Pacifigorgia)
(Matamoros, 1984).
3.- ANTECEDENTES
Han sido identificadas más de 6,000 nuevas estructuras
químicas entre los años 1973 y 1994 a partir de organismos
marinos, de los cuales el 61% (3,681) corresponden a
moléculas isoprenoides; el 17.2% (1,030) de los compuestos
han sido aislados de celenterados, ocupando el tercer lugar
en relación a los organismos marinos estudiados (Amico, 1995;
Ireland et al, 1993).
Ciereszko (1977a), publicó que las gorgonias de la
especie Eunicea mammosa en Bermuda y Bimini, han logrado un
Coral Muricea appressa
18
desarrollo abundante debido a la producción de sustancias
terpénicas que producen en el fondo marino y que impiden su
depredación. Su extracción química condujo a la
cristalización de la “eunicina”, el primer terpeno
descubierto en octocorales.
Existen otros antecedentes que apoyan que corales
gorgonianos presentan compuestos bioactivos con diversas
aplicaciones, tales como antimicrobianos, hormonas y
prostaglandinas, entre otros. Estas últimas son de gran
interés biomédico ya que ejercen efectos tranquilizantes en
el sistema nervioso central, estimulan el músculo liso y
disminuyen la presión sanguínea. Las prostaglandinas,
derivadas de los ácidos grasos de cadena C20 han sido los
compuestos más activos que han sido investigados en las
ciencias médicas desde hace 30 años (Scheuer, 1989). Tienen
diversas actividades biológicas y están presentes a baja
concentración en los tejidos de los mamíferos (Goodman y
Gilman, 1982) También se conocen derivados de prostaglandinas
a partir de extractos de la gorgonia del Caribe Plexaura
homomalla (Ciereszko y Karns, 1973). Esta especie contiene
compuestos esterificados de prostaglandinas, idénticos a los
derivados presentes en mamíferos, y además contiene esteroles
C30 de los cuales el principal es el gorgosterol. Es de
destacar que las prostaglandinas constituyeron hasta el 1.3%
de peso seco del organismo, hecho que llamó la atención de la
comunidad de investigación biomédica, sobre el potencial
inexplorado de este organismo como fuente de substancias
Coral Muricea appressa
19
bioactivas. Además, las prostaglandinas son de interés por su
papel en la producción de hormonas esteroidales como la
codisona, que regula la movilidad en crustáceos (Scheuer,
1989). Es conocido que las microalgas juegan un papel de
hospedero simbiótico intracelular con un gran número de
gorgonias (Levinton, 1982; Rovirosa et al., 1983), lo que
hace pensar que los esteroles aislados de éste tipo de
celenterados, pueden haber sido producidos por estas
microalgas o por la asociación de ambos (Rovirosa et al.,
1983).
Los corales gorgonianos exhiben pocas evidencias de
depredación (Ciereszko, 1977b) y ha sido demostrado que sus
extractos crudos son tóxicos para peces, gasterópodos y
larvas de anuros. Se desconoce si las toxinas aisladas son
los únicos agentes responsables de esa toxicidad. Estos
compuestos se clasifican estructuralmente como lactonas del
cembrano (Colver y Jacobs, 1981).
Bandurraga et al., (1982), publicaron el aislamiento de
tres cembranólidos dicetónicos en una gorgonia del Pacífico
(Lophogorgia alba) que carece de zooxantelas, destacando que
éstas microalgas no son esenciales para la producción de
metabolitos secundarios en algunos corales gorgonianos.
Por otro lado, revisiones de los organismos marinos de
las aguas del Golfo de California, indicaron la presencia de
antimicrobianos y antifúngicos en gorgonias del género
Muricea (Keer, 1988; Encarnación y Keer, 1992).
Coral Muricea appressa
20
Las gorgonias del género Eunicea son muy comunes en las
aguas someras de la región del Caribe y ha sido demostrado
que producen una cantidad de sesquiterpenos y una variedad de
diterpenos, los cuales en su mayoría, son lactonas derivadas
del esqueleto del cembrano (Rodríguez et al., 1994).
Block (1974), aisló, de la fracción de extracto
hexánico a partir de Muricea appressa var. appressa,
esteroles con diferente grado de saturación y sustituyentes
en el anillo B e insaturación en la cadena lateral.
Así mismo, Block (1974) aisló de otras dos especies de
la familia Gorgoniidae (Plexaura sp de las Bahamas y Eugorgia
ampla del Golfo de California, México) esteroles que
presentaron el anillo del ciclopropano en la cadena lateral o
con cadenas laterales anormalmente cortas o largas.
Ortega et al., (2002), en su estudio sobre gorgonias, a
partir del extracto acetónico de Muricea sp de la Bahía de
Mazatlán, México, aislaron dos metabolitos nuevos: muricenona
A(1) y muricenona B(2), que son pregnanos degradados,
caracterizados por el rompimiento y pérdida de un átomo de
carbono del anillo A del núcleo esteroidal y con propiedades
citostáticas y citotóxicas en células de carcinoma humano.
Izac et al., (1982a y b), publicaron el aislamiento y
estructura de un terpenoide con actividad ictiotóxica, el
pacifigorgiol, a partir del abanico marino Pacifigorgia cf.
Coral Muricea appressa
21
adamsii, recolectado en la Bahía de Los Frailes B.C.S.,
México.
Faulkner (1994), en una revisión sobre productos
naturales marinos publicó que las gorgonias Calicogorgia sp.
del Japón y Litophyton sp. de Okinawa, Japón, presentan tres
terpenoides con actividades tóxicas que repelen al
gasterópodo Drupella fragum. Asimismo reportó que han
aislado 25 diterpenoides de la gorgonia Solenopodium stechei
de los arrecifes de la Gran Barrera de Australia.
Además, Faulkner (1995), reporta lactonas
sesquiterpénicas aisladas de un octocoral del Mediterráneo
Maasella edwarsi. También registra un nuevo cembranofurano de
Sinularia dissecta de las costas Mandapam, India, que posee
actividad sobre la acetil colinesterasa, y señala que de la
gorgonia de Nueva Caledonia Villogorgia rubra, fueron
aislados dos alcaloides indólicos, (villagorginas A y B)
junto con cafeína y otras aminas sencillas.
Ha sido publicado el alto contenido en compuestos
volátiles (principalmente de sesquiterpenos) en corales
blandos y en algunas especies, representando más de 10% del
peso seco del animal (Salva et al., 1994).
Existen otras evidencias sobre las diversas propiedades
biológicas de algunos compuestos obtenidos de corales
gorgonianos como antitumorales (Rodríguez et al., 1994);
Coral Muricea appressa
22
antimicrobianos y citotóxicos (Su et al., 1993; 1995; Shin y
Seo, 1995; Duh y Rei-Sheu, 1996; Slattery et al., 1997).
Tambien ha sido reportado que el coral blando Xenia elongata
presentó compuestos clasificados como xenicanos con
propiedades ictiotóxicas (Higuchi et al., 1995).
4.-JUSTIFICACIÓN
Considerando la gran variedad de organismos vivos que se
encuentran en el océano todavía sin estudiar, la probabilidad
de ser portadores de nuevos compuestos activos es alta.
Debido a que en México, la investigación en el campo de la
química de productos naturales dirigida hacia la biología
marina es muy escasa, es importante realizar este tipo de
estudios.
En virtud de que las enfermedades infecciosas ocupan
los primeros lugares como causa de morbilidad en México
(Osuna y Lozoya, 1989), y debido al uso inadecuado de los
antibióticos, lo cuál produce resistencia en los
microorganismos, se ha sentido la necesidad urgente de
desarrollar y descubrir drogas antibacterianas.
Considerando que en las últimas décadas han sido
aisladas y caracterizadas substancias con propiedades
biológicas y farmacológicas a partir de celenterados marinos,
Coral Muricea appressa
23
y considerando los estudios reportados sobre la actividad
antimicrobiana y sobre el músculo liso de conejo en el
extracto etanólico de M. appressa, (Encarnación y Keer,
1992), se plantea la búsqueda de estas substancias bioactivas
en el coral Muricea appressa, Verril 1864 para conocer mejor
el potencial de esta especie como portadora de compuestos con
actividad biológica. Por lo que este trabajo de tesis está
relacionado con el aislamiento de substancias con actividad
biológica presentes en la gorgonia Muricea appressa, Verril
1864.
5.- OBJETIVO GENERAL
Aislar, purificar y caracterizar químicamente,
compuestos bioactivos presentes en la gorgonia Muricea
appressa Verrill 1864.
5a. OBJETIVOS PARTICULARES
1. Determinar la actividad antimicrobiana de las
fracciones y compuestos aislados de M. appressa Verril 1864
sobre cinco cepas de microorganismos, y su actividad
contráctil en el músculo liso de yeyuno de conejo.
Coral Muricea appressa
24
2. Determinar y elucidar la estructura química de los
compuestos aislados de M. appressa Verril 1864 por Resonancia
Magnética Nuclear de +H y
13C.
6.- M E T O D O L O G Í A
6.1-Recolecta
La recolecta del coral Muricea appressa fué realizada
por buceo autónomo a una profundidad de 15 a 20 metros en el
Complejo Insular Espíritu Santo-La Partida, área localizada
entre los 24° 24’ latitud norte y los 110° 17’ longitud
oeste, en el Golfo de California (Fig. 1). Las muestras
fueron limpiadas de todo material extraño y colocadas en
bolsas de polietileno por separado, luego se conservaron en
recipientes con hielo para su transporte y posteriormente
conservadas en congelación hasta su uso.
6.2- Identificación
La identificación del material recolectado fue efectuada
por comparación con material de referencia, en el
Departamento de Biología Marina de la U.A.B.C.S., México, y
en el Museo Nacional de Historia Natural del Instituto
Smithsoniano de Washington D.C., E.U.A., y usando caracteres
de campo como la forma de crecimiento, estructura y forma de
la colonia, clase, distribución y estructura de pólipos y
distribución, forma y tamaño de las escleritas. Las gorgonias
de interés fueron identificadas como Muricea appressa Verril,
1864 (Bayer, 1961; Williams, 1993; Hardee y Wickstern, 1996).
Coral Muricea appressa
25
Fotografía del coral Muricea appressa Verrill 1864
2H C= CH 2
C H 3-
F ig. 6: Espectro de RM N 1H correspondiente a la m ezcla de terpenos (E II-6)
C H 2
54
Coral Muricea appressa
27
6.3 - Obtención de extractos crudos
Los ejemplares de Muricea appressa Verrill 1864
recolectados en agosto de 1990, fueron cortados en pequeñas
piezas, pesadas (726 g) y el material fue extraído por
maceración con éter de petróleo, cloroformo y metanol
durante siete días con cada uno de los solventes. Los
extractos crudos obtenidos fueron concentrados en el
rotavapor al vacío hasta sequedad, a una temperatura no mayor
de 40° C , obteniéndose para el extracto de éter de petróleo
5 g, para el extracto clorofórmico 3 g y para el etanólico
0.5 g.
6.4- Determinación de la actividad antimicrobiana. Método de
difusión en agar.
La determinación de la actividad antimicrobiana por el
método de difusión en agar fué llevado a cabo de acuerdo a
Encarnación et al., 1992.
6.4a Preparación de los sensidiscos.
Los sensidiscos se hicieron de papel filtro Whatman # 1,
de 6.5 mm de diámetro. En el solvente correspondiente
(acetato de etilo para el extracto etéreo, cloroformo para el
clorofórmico), fueron disueltos 20 mg/mL de cada uno de los
extractos crudos obtenidos anteriormente. Los sensidiscos
Coral Muricea appressa
28
fueron impregnados con 140 µL de cada solución y evaporado el
solvente a temperatura ambiente.
6.4b Controles
Los sensidiscos empleados fueron impregnados sólo con el
solvente puro como controles negativos; sensidiscos
comerciales con ácido nalidíxico (30 µg), cloranfenicol (30
µg), y ampicilina (40 µg) fueron empleados como controles
positivos para las bacterias; y sensidiscos con ketoconazol
para el hongo levaduriforme Candida albicans.
6.4c Cepas
Los microorganismos de prueba fueron:
Bacillus subtilis,
Staphylococcus aureus,
Streptococcus faecalis,
Candida albicans,
Escherichia coli.
Las cepas en forma pura fueron obtenidas del Instituto
Oceanográfico de Scripps, Universidad de California, La
Jolla, E.U.A., a excepción de la cepa de S. Aureus, que fue
obtenida del Laboratorio de Diagnóstico y Análisis
Especiales de La Paz, B.C.S., México.
6.4d Preparación de la suspensión de microorganismos.
Por tinción de Gram fue comprobado que las cepas eran
puras. Cada cepa fue sembrada por separado en caldo nutritivo
Coral Muricea appressa
29
a pH 7 y 37°C durante 18 a 24 horas para obtener una
suspensión que fue ajustada a una concentración de 1X105
UFC/mL de acuerdo a la escala de Mc Farland (En Murray et
al., 1999). El medio de Agar dextrosa Sabouraud líquido (ver
anexo) fue empleado para el desarrollo del hongo
levaduriforme C. albicans.
6.4e Actividad antimicrobiana
La determinación de la actividad antimicrobiana, fue
realizada por duplicado en cajas Petri conteniendo medio de
cultivo agar Müeller Hinton, las cuales fueron inoculadas con
un hisopo con la suspensión del microorganismo de prueba para
tener una capa superficial homogénea de las bacterias, y en
las cajas de Petri que contenía agar dextrosa Sabouraud fue
inoculado el hongo levaduriforme. Sobre éstas fueron
distribuidos los sensidiscos impregnados con 140 µL de los
soluciones de los extractos de éter de petróleo y
clorofórmico previamente preparados a una concentración de 10
mg/mL, e incubadas a 37° C durante 18 a 24 horas. Al terminar
la incubación fue medida la zona de inhibición (en mm)
producida por los extractos (en caso de haber)
considerándose positivos los que presentaron un diámetro
mayor a 6.5 mm y negativos los que no presentaron halo.
Todos los ensayos fueron realizados por duplicado. También
fue efectuada la determinación de la actividad antimicrobiana
por el método de difusión en agar de 14 de las fracciones (6
Coral Muricea appressa
30
de éter de petróleo y 8 del clorofórmico) obtenidas en el
proceso de fraccionamiento de los extractos crudos por
cromatografía en columna.
6.5 Determinación de la contractilidad muscular en el
músculo liso de yeyuno de conejo.
Preparación de los segmentos de yeyuno.
Los extractos de éter de petróleo y clorofórmico de
Muricea appressa Verrill 1864 fueron sometidos a la prueba de
contractilidad sobre el músculo de yeyuno de acuerdo a
Encarnación et al., (1994). Fueron utilizados conejos machos
de la cepa Nueva Zelanda de 2.5 a 3 kg. Se mantuvieron en
ayuno durante una noche y se sacrificaron. Varios segmentos
del intestino delgado de 5 ó 6 cm, fueron colocados en una
solución de Tyrode a pH 7.4, con 95 % de oxígeno y 5 % de
dióxido de carbono a 37°C. Los segmentos fueron limpiados de
todo tejido que lo rodea, cortados en piezas de 1.5 cm de
longitud y colocados en una cámara de vidrio en posición
vertical con 18 ml de solución Tyrode, permitiendo el
equilibrio durante 30 minutos o hasta una hora. La
contractilidad espontánea del músculo liso fue registrada en
un fisiógrafo tetracanal (CPM, NARCO BIOSYSTEMS Inc., Model
85) equipado con una fuerza transductora F-50 y previamente
calibrado con un estándar de acetilcolina como patrón y un
sistema de referencia conocido (extracto etanólico de la
gorgonia Lophoborgia rigida) como control positivo. El yeyuno
Coral Muricea appressa
31
fue colocado en una tensión inicial de 0.5 g empleándose
concentraciones de 75 µg/ml de extracto (López et al., 1990).
El intervalo de porcentaje de estimulación/min usado
para considerar una escala de medición de actividad fue: de
24 a 40 % = (1+); de 40 a 80 % = (2+); de 80 a 120 %= (3+) y
de 120 a 160 %= (4+), que son los valores de referencia para
el reporte de positivas en los ensayos (Encarnación et al.,
1994).
6.6 Aislamiento y purificación de los compuestos
El aislamiento y purificación de los compuestos activos
fue llevada a cabo por medio de técnicas cromatográficas,
principalmente cromatografía en capa fina y en columna, y
empleando el bioensayo dirigido hacia la determinación de la
actividad antimicrobiana sobre las cinco cepas de los
microorganismos antes mencionados: S. aureus, S. faecalis, B.
subtilis, E. coli y C. albicans, que condujera finalmente al
aislamiento de los compuestos activos y a la detección de
fracciones con actividad antimicrobiana. Para proceder a
purificar el compuesto activo, el sistema de solventes fue
seleccionado por cromatografía en capa fina, eligiéndose
aquel sistema que permitiese la mejor separación de los
componentes presentes en el extracto o fracción, para
posteriormente extrapolarlo a la cromatografía en columna y
proceder a su fraccionamiento.
Coral Muricea appressa
32
6.7-Cromatografía en capa fina
Fueron utilizadas placas cromatográficas comerciales
marca Whatman de 2.5 cm de ancho por 5 cm de longitud,
conteniendo silica gel e indicadores de fluorescencia
integrados de dos tipos: el que contiene salisilato de zinc,
que revela las sustancias que absorben longitudes de onda de
254 nm y aparece como un fondo verde, y sales sódicas de
ácido sulfónico, que revelan las sustancias que absorben la
luz ultravioleta de onda larga (366 nm) con un contraste
amarillo (Touchtone, 1992).
Las cámaras cilíndricas empleadas fueron saturadas con
la ayuda de papel filtro humedecido con el eluyente, el cual
fue colocado sobre las paredes internas de la cámara para
favorecer la evaporación del solvente en forma uniforme al
interior de la cámara. La placa fue marcada en el extremo que
se sumerge en el sistema o fase móvil con la muestra aplicada
sobre la misma, a un centímetro de distancia del extremo de
la placa. A intervalos de l5 mm fueron colocadas las
muestras a eluir, dejando evaporar el solvente en los puntos
de aplicación antes de colocar la placa en la cámara. Este
extremo fue sumergido en la fase móvil del sistema quedando
en el fondo de la cámara, justo arriba del nivel del sistema,
el punto de aplicación de la muestra. Después de que el
frente de la fase móvil alcanzó la distancia deseada antes
del tope de la placa (aproximadamente a un centímetro de
Coral Muricea appressa
33
distancia), ésta fue sacada de la cámara. Se dejó evaporar el
exceso de eluyente para continuar con el proceso de
detección de los compuestos por observación directa de la
placa, bajo la lámpara de luz ultravioleta, para detectar si
había presencia de sustancias con moléculas insaturadas
dobles y triples enlaces carbono-carbono (Sthal, 1969).
Posteriormente fue visualizado el corrimiento de los
componentes por oxidación, empleando la aspersión con
reactivos oxidantes, tales como el H2SO
4 (ácido sulfúrico) al
10% o con la mezcla ácido sulfúrico/Vanillina al 0.5% y
calentamiento (Krebs et al. 1966). La presencia de compuestos
orgánicos que reaccionan con los reactivos oxidantes,
producen manchas visibles coloreadas en ocasiones y
separadas, indicando el número de sustancias presentes en la
muestra.
6.8a Cromatografía en columna del extracto de éter de
petróleo (E)
Una vez determinado el sistema de elución, por
cromatografía en capa fina para el extracto de éter de
petróleo, el sistema fue extrapolado a la cromatografía en
columna para proceder a su fraccionamiento, para lo cuál, 2 g
del extracto fueron montados en una columna cromatográfica de
46 cm de longitud x 3.5 cm de diámetro interno, con silica
gel (60-230 mallas) como soporte, en proporción de 1:60
(muestra: silica), empleando inicialmente como eluyentes
Coral Muricea appressa
34
tetracloruro de carbono (CCl4) al 100%, y posteriormente la
mezcla CCl4:EtOAc, en un gradiente de polaridad de 5 % al 50
% de acetato de etilo (EtOAc), obteniéndose 10 fracciones
semipuras. Una segunda evaluación de estas fracciones fue
realizada por cromatografía en capa fina para la selección de
un nuevo sistema que permitiera fraccionar una de estas
fracciones semipuras (150 mg de EII), la cual fue sometida a
una posterior purificación por cromatografía en columna,
empacada con silica gel (230-400 de malla), empleando como
eluyente inicial Benceno (Benc) 100 % y finalmente una mezcla
de Benc:EtOAc en proporción de 2:1 (fig. 2).
Coral Muricea appressa
35
EXTRACTO CRUDO DE ÉTER DE PETRÓLEO (E)Muestra: Extracto éter de petróleo2.0 gSistemas: CCl4 100 %CCl4:ETOAc 5-50 %60-230 mallas
PROPORCIÓN 1:60
10 FRACCIONES SEMIPURAS
FRACCIÓN EII SEMIPURA (150 mg)
Cromatografía en columnaSiO2 gel (230-400 mallas)Sistema: Benceno 100%Benc/EtOAc 2:1
7 FRACCIONES MÁS PURAS
Fig. 2: Fraccionamiento del extracto crudo de Éter de Petróleo de Muricea appressa Verril 1864.
FASE ESTACIONARIA:SO2 GEL
Coral Muricea appressa
36
6.8b Cromatografía en columna del extracto clorofórmico
(C)
Se procedió a fraccionar el extracto clorofórmico por
técnicas cromatográficas, para la purificación de sus
componentes, y para la elección del sistema, se siguió el
mismo criterio aplicado en el fraccionamiento del extracto de
éter de petróleo descrito en 6.7. Para esto, 2.5 g de éste
fueron montados en una columna cromatográfica de iguales
características que la del extracto etéreo, empacada con SiO2
gel (60 - 230 de malla) en una proporción de 1:40 respecto a
la muestra. La aplicación de la muestra se hizo preparando
una papilla conteniendo la muestra en silica gel en
proporción 1:2. El sistema usado inicialmente fue benceno al
100 %; después fue cambiado por benceno:acetato de etilo 10
%, y finalmente por Benc/EtOAc al 20%. (Fig.3).
Coral Muricea appressa
37
Adsorbente: Silica gel Muestra: 2.5 g
Sistemas eluyentes:60-230 malla Benceno 100 %....400 mlProporción: 1 g de muestra Benc:EtOAc 10%, 20 %por 40 g de SiO2 gel Recolecciión de fracciones de 5 ml/tubo
EXTRACTO CRUDO CLOROFÓRMICO (C)
14 FRACCIONES SEMIPURAS
Fig. 3: Fraccionamiento del extracto crudo Clorofórmico de Muricea appressa Verrill 1864
Cromatografía en columna
6.8c.Purificación de los compuestos
Después de haber efectuado el fraccionamiento del
extracto crudo de éter de petróleo, la fracción EII (Fig.2)
produjo un precipitado blanco, cuya estructura fue
determinada por RMN de +H y 13C. Por otro lado, la fracción CI
del extracto clorofórmico produjo el compuesto CI-1 cuya
estructura fue analizada por RMN de +H y de 13C y la fracción
CIII dió el precipitado C1-3, cuya estructura también fue
analizada por RMN de +H y 13C (Fig. 5).
Coral Muricea appressa
38
6.9- Caracterización química
La caracterización química de los compuestos aislados
fue llevada a cabo por técnicas espectroscópicas,
principalmente por RMN: 13C y +H en colaboración con la
División de Química Orgánica Marina de la Universidad de
Copenhague en Dinamarca.
Los espectros de los compuestos puros aislados se
obtuvieron en un espectrómetro de RMN AM 500 con un campo
magnético de 100 MHz, marca Bruker y utilizando como sol-
vente el cloroformo deuterado (CDCl3 ).
La identificación de los compuestos fue efectuada por
comparación y cotejo de tablas con señales características
para cada grupo químico particular (Silverstein et al.,
1974).
La estructura química fue determinada midiendo el
corrimiento químico (de protón y de carbono) resultante de la
diferencia en la posición de absorción electromagnética de un
protón particular, con respecto a la posición de la absorción
de un protón de referencia, generalmente del tetrametil
silano (TMS). La escala delta es dada en unidades de partes
por millón (ppm). Los picos de absorción obtenidos en el
espectro de RMN +H, representan protones en los diferentes
ambientes químicos, y cada área de absorción es proporcional
al número de protones que representa (Silverstein et al.,
1974).
Coral Muricea appressa
39
7.- RESULTADOS
Debido a la actividad contráctil positiva detectada en
el extracto crudo de éter de petróleo (Tabla I), este fué
fraccionado para su purificación. Por cromatografía en capa
fina se obtuvo un cromatograma con buena separación de los
constituyentes de la mezcla y con el solvente adecuado (CCl4
100% y CCl4/EtOAc 5-50%), el cuál se aplicó a la
cromatografía en columna obteniéndose diez fracciones. El
mismo extracto crudo inicialmente no presentó actividad
antimicrobiana por el método de difusión en agar, pero la
fracción EVI parcialmente pura, resultó positiva contra S.
aureus. El extracto crudo clorofórmico también se probó para
ver si inhibía o no la contractilidad del músculo liso de
yeyuno de conejo, así como su actividad antimicrobiana.
Algunas de las fracciones (6) parcialmente puras obtenidas y
que se les realizaron actividad antimicrobiana, resultaron
positivas (tabla II).
Coral Muricea appressa
40
TABLA I: RESULTADO DE ACTIVIDADES DE LOS EXTRACTOS CRUDOS: ÉTER DE PETRÓLEO, CLOROFÓRMICO Y ETANÓLICO DEL CORAL Muricea
Appressa Verril 1864 __________________________________________________________ CONTRACTILIDAD ACTIVIDAD EXTRACTOS MUSCULAR * ANTIMICROBIANA** __________________________________________________________ ÉTER DE PETRÓLEO POSITIVA 4+ NEGATIVA __________________________________________________________ CLOROFÓR- MICO INACTIVA NEGATIVA __________________________________________________________ ETANÓLICO POSITIVA 3+ NEGATIVA __________________________________________________________ *PRUEBA DE CONTRACTILIDAD MUSCULAR SE EFECTUÓ SOBRE EL MÚSCULO LISO DE YEYUNO DE CONEJO. **ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA CONTRA LOS GÉRMENES: S.aureus; S.faecalis; B.subtilis; E. coli; C.albicans.
Coral Muricea appressa
41
TABLA II: RESULTADO DE ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LAS FRACCIONES DEL EXTRACTO CLOROFÓRMICO DEL CORAL Muricea appressa Verril 1864. _________________________________________________________ A C T I V I D A D A N T I M I C R O B I A N A __________________________________________________________ FRACCIÓN M I C R O O R G A N I S M O (1) (2) (3) (4) (5) __________________________________________________________ CII
(-) (-) (-) (-) (-) CIII (-) (-) (-) (-) (-)
CIV 10.5* 11 8 (-) (-)
CVI 9 9.5 8 (-) (-)
CVII
11 11 8 (-) (-) CVIII
8.5 7 7 (-) (-) CIX 8.5 9 7.5 (-) (-)
CC 9 12 9 (-) (-)
__________________________________________________________ MICROORGANISMOS:(1) S.aureus;(2)S.faecalis;(3)B.subtilis; (4)E. coli; (5)C.albicans. (-) = NEGATIVA * HALO DE INHIBICIÓN, en mm 7.1 Extracto de éter de petróleo (E).
El sistema de solventes (CCl4 100% y CCl4/EtOAc 5-50%)
encontrado por cromatografía en capa fina para la separación
de los componentes del extracto, fue aplicado en el
Coral Muricea appressa
42
fraccionamiento del mismo por cromatografía en columna
obteniéndose fracciones diferentes en su contenido, así como
en el comportamiento químico y actividad.
De la fracción EI (25.7 mg) fueron obtenidos cristales
insolubles en cloroformo (2-3 mg) que se guardaron como
referencia.
La fracción EII (158.7 mg) no presentó actividad en el
músculo liso de yeyuno de conejo. Sin embargo, por su aspecto
y cromatograma observados fue sometida a un fraccionamiento
en una columna cromatográfica pequeña, obteniéndose siete
subfracciones en cantidades menores a 10 mg; y una
subfracción denominada EII-6
(8 mg) que se caracterizó por
presentar un precipitado blanco, soluble en n-heptano, la
cual fué purificada por cristalización en EtOAc. La
estructura química de estos cristales (EII-6) fue determinada
por métodos espectrométricos de RMN +H y
13C y resultó ser una
mezcla de terpenos, dejándose un remanente de casi 2 mg como
referencia.
Desafortunadamente las cantidades de cuatro de éstas
subfracciones, (EII-1
, EII-2
, EII-4
y EII-5 ) fueron insuficientes
para detectar actividad antimicrobiana y sobre el músculo
liso de yeyuno de conejo, dejándose como referencia.
Coral Muricea appressa
43
La subfracción EII-3 (5 mg) fue empleada para determinar
actividad en músculo liso de yeyuno de conejo, resultando
inactiva.
La subfracción EII-7
obtenida, es un polvo obscuro que se
guarda como referencia (8 mg). Por su aspecto parece ser una
fracción muy impura. No se le determinó actividad.
Las fracciones EIII (117 mg); E
IV (130.6 mg) y E
V (109 mg)
son inactivas microbiológicamente.
La fracción EVI (119.7 mg) presentó actividades para
músculo liso de yeyuno de conejo, y antimicrobiana para B.
subtilis, con 10.8 mm de halo de inhibición.
La fracción EVII
(693 mg) no presentó actividad
antimicrobiana.
A las fracciones EVIII
(28.7 mg) y EIX (<10 mg) no se les
determinaron actividades debido a que la EVIII estaba muy
impura y no se obtuvo suficiente cantidad de EIX.
En resumen, de las diez fracciones obtenidas del
extracto de éter de petróleo, una fue positiva, cinco
negativas y a cuatro no se les probó actividad
antimicrobiana. Respecto a la prueba de actividad
contráctil de estas mismas fracciones, tres fueron inactivas,
una positiva y a seis no se les probó actividad.
De la fracción EII-6 fue aislada una mezcla de compuestos
terpénicos por cromatografía en columna, que mostró una sola
Coral Muricea appressa
44
banda por cromatografía en capa fina denominada EII-6
, cuya
estructura química fue determinada por RMN +H y
13C (Fig. 4).
7.2 Extracto clorofórmico ( C )
EXTRACTO DE ÉTER DE PETRÓLEO (E)
25.7 157.2 158.7 117.2 130.6 109 119.7 <10
NO R E A L I Z A D A S INACTIVA INACTIVA INACTIVA *A
NO R E A L I Z A D A S INACTIVA N O REALIZADA ACTIVA
FRACCIONES <10 mg
*A=Staphylococcus aureus 10.5 mm de halo
Fig. 4: Fracciones obtenidas del extracto de Éter de Petróleo de Muricea appressa Verril l 1864
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10SISTEMA:CCl4/EtOAcGradiente
EI EI' EII EIII EIV EV EVI EIX
Obtenciónde cristalesinsolubles enCHCl3
Por cristalización,precipitado blanco.Estructura química porRMN +H Y 13C
EII-1 EII-2 EII-5 EII-6 EII-7
FRACCIÓNCANTIDAD, mgACTIVIDADES ANTIMICROB.CONTRÁCTIL
Coral Muricea appressa
45
El extracto crudo clorofórmico, originó 14 fracciones al
emplear inicialmente el sistema Benceno 100% en cromatografía
en columna y dos sistemas binarios consistentes de las
mezclas Benc:EtOAc 10 % y Benc:EtOAc 20 %, lográndose así dos
fracciones casi puras durante el proceso de fraccionamiento
(Fig.5).
La primera fracción, denominada CI-1 (8 mg) por
cromatografía en capa fina de silica gel presentó una mancha,
y por cristalización en un sistema Benc:EtOAc 5:1 produjo un
compuesto puro, identificado por RMN de +H y13C como un
derivado de ácido esteárico.
La fracción CII es inactiva microbiológicamente.
La segunda fracción, conteniendo un compuesto puro,
llamada fracción CI-3, fue cristalizada en metanol,
originando un precipitado blanco denominado CI-3. Se determinó
su estructura química por métodos espectroscópicos de RMN +H
y 13C, identificándose como ácido esteárico. Los resultados de
las actividades antimicrobianas de las fracciones semipuras
obtenidas en este extracto son mostrados en la tabla II,
exceptuando la C1-3, ya que la cantidad de muestra obtenida
fue empleada para la determinación de su estructura química.
De la fracción CIV fueron obtenidos 16.4 mg y fue
comprobada su actividad contra bacterias Gram positivas,
Coral Muricea appressa
46
dando los siguientes halos de inhibición, en mm: B. subtilis
8; S. faecalis 11 y S. aureus 10.5.
A la fracción CV no se le detectó actividad debido a la
poca cantidad obtenida.
La fracción CVI (22 mg) fue activa para B.subtilis 8 mm;
S. faecalis 9.5 mm y contra S. aureus 9 mm.
Fueron obtenidos 130.5 mg de la fracción CVII y resultó
activa para B. subtilis 8 mm; S. faecalis 11 mm; y S. aureus
11 mm.
Las fracciones CVIII
, CIX y C
C; con 97.2, 80.3 y 228 mg
respectivamente, también mostraron actividad contra los tres
mismos gérmenes Gram positivos contra los que fue activa la
fracción CVII
. De las fracciones CX, C
A y C
B fueron obtenidos
243.5, 106.5, 73.5 mg respectivamente, pero no fue probada
la actividad, por una parte, por no estar muy puras y por
otro lado, porque era prioritario la obtención de los
espectros de RMN de los compuestos puros obtenidos.
De la fracción CXI fueron obtenidos 460.7 mg pero se
encontró inactiva microbiológicamente.
Coral Muricea appressa
47
t
*X=Bacillus subtilis de 7 a 9 mm
Y = Streptococcus faecalis de 9.5 a 12 mm
Z =Staphylococcus aureus de 9 a 14 mm
EXTRACTO CLOROFÓRMICO (C)
FRACCIÓN
CANTIDAD, mgACT. ANTIM.
NO REALIZADA 106.5INACTIVA
16.4 <10 73.5 228 80.3 460.7FRACCIONES ACTIVAS DE IV A IXPARA *X,* Y, *Z
Fig. 5: Fracciones obtenidas del extracto clorofórmico de Muricea appressa Verrill 1864
Por cristalización:precipitado blanco:CI-3Estructura química porRMN +H y 13C
CI CII CA CIII CIV CV CB CC CIX CXI
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14SISTEMA:Benc/EtOAc proporción:3:2
En sist. Benc:EtOAc 5:1una banda: CI-1. Sedetermina la estructuraquímica por RMN de +H yde 13C.
Coral Muricea appressa
48
7.3 Actividad antimicrobiana y contráctil sobre el músculo
liso de yeyuno de conejo de fracciones semipuras de M.
Appressa Verril 1864
De las 14 fracciones obtenidas del extracto clorofórmico
por cromatografía en columna, ocho fueron probadas para
actividad antimicrobiana contra los cinco microorganismos.
Resultaron seis positivas, las cuales produjeron zona de
inhibición mayor de 6.5 mm de diámetro, mientras que para la
actividad en músculo liso de yeyuno de conejo de éste mismo
extracto, solo fué probada una fracción (CIII
), la cuál
resultó inactiva. Del extracto de éter de petróleo, fueron
probadas seis fracciones del total de diez, resultando una
positiva para actividad antimicrobiana (EVI), y de las cuatro
probadas (EI’, E
III, E
IV y E
VI) para contractilidad muscular
sólo una resultó positiva (EVI).
Coral Muricea appressa
49
7.4 Caracterización química de los compuestos aislados
El análisis de los espectros de resonancia magnética
nuclear +H y 13C obtenidos, y los resultados de las fracciones
purificadas por cromatografía en columna (Figs. 6-10),
sugieren que:
En el extracto de éter de petróleo, la subfracción EII-6
corresponde a una mezcla de terpenos. En el espectro de RMN
de protón (Fig. 6) se observa una señal de mayor frecuencia
en 1.28 ppm que corresponde a uniones metileno, y la señal de
menor frecuencia corresponde a moléculas con enlace metilo
(0.9 ppm), moléculas con doble enlace (1.6 ppm) y moléculas
con radical carbonilo (2.0 ppm). Tomando en cuenta las
diferentes señales y tratando de encontrar los enlaces
correspondientes a las moléculas, se puede observar que son
moléculas con diferentes señales así como de estructuras
químicas y que corresponde a una mezcla de terpenos debido a
las señales.
En el extracto clorofórmico, la fracción purificada CI-3
corresponde a la molécula del ácido esteárico C18H36O2 . En el
espectro de RMN +H y
13C (Figs. 7 y 8) se pueden observar que
de las 19 señales, las más sobresalientes por su frecuencia y
grupos que contiene, están situadas a 1.19 (protones
metilenos); 1.5 (metilenos del grupo carbonilo), 0.88 (protón
metilo), mientras que en el espectro de 13C se observa una
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señal en 14.02 ppm para el grupo metilo; las de los
metilenos (22.6-29.59) y las de los protones de grupos ácido
a campo bajo principalmente, y se encuentra una correlación
directa con el peso molecular, obtenido de la suma de los
pesos de los átomos registrados en el espectro
correspondiente a los 284 daltones, que es el de la fórmula
del ácido esteárico.
En los espectros de las figuras 9 y 10 se observan
señales del grupo metilo en ambos espectros (0.88 y 14.03
respectivamente) y también hay 12 señales (22.6 a 34.34 ppm),
que corresponden a grupos metilenos en 13C y a protones de
metilenos (1.25 ppm) en RMN +H, también se observan señales
en el espectro de 13C en 64.29 y en 173.29 que corresponden a
protones en un ambiente de enlace tipo ester y al radical
carbonilo respectivamente. Debido a la cantidad de señales y
a los grupos funcionales que se presentan en los espectros,
se observa que corresponde a un compuesto puro (CI-1
) derivado
del ácido esteárico. Las señales coinciden con las del ácido
esteárico tanto en el espectro de protón como de 13C.
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HC = CH
-CH3
Fig. 6: Espectro de 1H de RMN correspondiente a la mezcla de terpenos (EII-6)
-CH2
MEZCLA DE TERPENOS
CDCl3
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CH2-
δ=1.2
CH3-
δ=0.8
Fig.7: Espectro de RMN 1H correspondiente al ácido esteárico (CI-3)
ÁCIDO ESTEÁRICO CH3 (CH2)16 COOH
CH3CH2 C=O
δ=1.6
δ=2.3
CH2-C=O‘
CDCl3
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56
Las publicaciones o investigaciones consultadas (Benito-
Pruna et al., 1982; Del Rio et al., 1989; Hardee y
Wickestern, 1996 y en la revisión de la base de datos
Marinelit (1999)) sobre el orden Gorgonacea, no reportan
bioactividad en extractos de Muricea appressa Verril 1864, lo
que dificulta su estudio comparativo respecto a estas
pruebas. Por esto, en términos generales puede considerarse
al presente estudio como un apoyo para el conocimiento de
metabolitos bioactivos presentes en estos organismos.
Los extractos crudos de Muricea appressa, Verrill 1864 a
los que se expusieron las bacterias, contenían
concentraciones extremadamente altas de metabolitos y otras
moléculas semipuras, que no se expresan naturalmente a esos
niveles, sin embargo, no resultaron activos para el ensayo de
actividad antimicrobiana por el método de difusión en agar.
Posiblemente esto ocurrió porque existen compuestos
modificados estructuralmente o porque se diluye el efecto
del compuesto activo, con la presencia de los otros
componentes.
Para la actividad en músculo liso de yeyuno de conejo
se observó que la concentración de moléculas bioactivas fue
la adecuada para producir reacción, especialmente los
extractos crudos de éter de petróleo y clorofórmico. Es
posible que existan otras fracciones de las no probadas
hasta el momento y que puedan presentar esta actividad.
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57
Considerando que las pruebas realizadas se hicieron
para detectar la actividad, las determinaciones posteriores
fueron las que guiaron a la detección de fracciones y
compuestos activos. El efecto de estas últimas pudo verse
afectado por factores como: concentración, humedad, luz,
oxidación, sobrecalentamiento, impurezas del solvente y
constituyentes del medio (Rios et al., 1988; Smith et al.,
2000).
Debido a que no hay un método estandarizado para
expresar los resultados de escrutinio en sensibililidad
bacteriana hacia antimicrobianos, algunos autores usan el
diámetro de los halos de inhibición y/o el peso mínimo de
extracto que inhibe el crecimiento de un microorganismo (Ríos
et al., 1988). En nuestro caso, empleamos el diámetro del
halo de inhibición, incluyéndose el diámetro del sensidisco
empleado para cada fracción probada, considerándose un
resultado positivo si se obtenía un diámetro mayor que 6.5
mm. Se usó éste debido a que ha dado resultados
satisfactorios con controles de antimicrobianos y para estas
cepas en estudio en el laboratorio (Encarnación et al.,
1994).
En relación al bajo porcentaje de fracciones con
actividad antimicrobiana positiva del extracto de éter de
petróleo obtenidas, Jensen et al., (1996) mencionaron que
puede deberse a que las bacterias asociadas comunmente con la
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58
superficie de gorgonias no son inhibidas por compuestos
secundarios producidos por este invertebrado, por lo que
parece que no es la función ecológica principal de los
compuestos secundarios de las gorgonias.
También es posible que no ocurra inhibición bacteriana
por los extractos debido a que las bacterias que colonizan la
superficie del coral son capaces de producir bio-películas y
son mucho menos susceptibles a antibioticos que las bacterias
que crecen libremente en medio de cultivo (Desnottes, 1996,
Costerton et al., 1999). En nuestro caso, el bajo porcentaje
de actividad antimicrobiana obtenido en este extracto, puede
deberse a que no se emplearon cepas bacterianas marinas y
esto pudo haber modificado el resultado o bién a que la
molécula no difunde en el agar.
Es de tomar en consideración que las fracciones
estudiadas para actividades, indiquen que las gorgonias
mantengan defensas químicas inducibles, o metabolitos
secundarios inhibidores de bacterias no probadas en éste
estudio, defensas químicas que no fueron obtenidas del tejido
del animal y defensas químicas que funcionan por mecanismos
diferentes que el de toxicidad como la que se detecta en el
ensayo de difusión en agar o en músculo liso de yeyuno de
conejo.
Desde el punto de vista del procedimiento para obtener
los dos compuestos puros y una mezcla de terpenos, se puede
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59
considerar como un método sencillo, rápido y seguro. Sin
embargo, con mucha perseverancia y paciencia, se pueden
obtener resultados iguales o todavía más alentadores que los
hasta el momento se han logrado, como por ejemplo, obtener un
compuesto nuevo.
Una interpretación conservadora de los resultados del
ensayo de actividad antimicrobiana por difusión en agar, que
está basado en lo concerniente a los bajos niveles de
actividad, puede deberse a artefactos producidos in situ
durante el procedimiento de extracción y el procedimiento de
la prueba. Por ejemplo, moléculas de las posibles zooxantelas
(debido al color de Muricea), derivadas del endosimbionte de
corales gorgonianos, como algunos ácidos grasos presentes en
los extractos, pueden degradar la clorofila y estos
productos pueden presentar actividad antibacteriana débil
(Jensen et al., 1996). También es posible que la interacción
física del extracto y bacteria cause pequeñas zonas de
inhibición.
En las fracciones obtenidas de las columnas
cromatográficas del extracto de éter de petróleo, se observó
actividad antimicrobiana para bacterias Gram positivas. Esto
indica que algunos tipos de moléculas presentes en el
extracto etéreo de Muricea appressa penetran al procariote o
de alguna forma se combinan con las moléculas de la pared, o
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con algunas proteínas celulares e impiden su proliferación en
el medio de cultivo (Lennette, 1985).
El extracto clorofórmico tiene fracciones que desde el
punto de vista cromatográfico, son muy interesantes de
continuar investigando para separar los componentes y definir
su estructura química, ya que posee sustancias a las que es
susceptible el Bacillus subtilis por ejemplo, y es posible
que puedan poseer otras actividades biológicas, diferentes a
las efectuadas en este trabajo de tesis.
Con el hallazgo de dos moléculas puras: ácido esteárico
y derivado de ácido esteárico en el extracto clorofórmico y
la mezcla de terpenos en el extracto de éter de petróleo,
aunque pertenecen a familias de compuestos ya conocidos y
encontradas en corales blandos (Coll et al., 1978; Bandurraga
et al., 1982 ; Fenical, 1987) llama la atención que tanto el
ácido esteárico como su derivado, se encuentren en el mismo
extracto clorofórmico. Esto ocurre posiblemente a que ambas
moléculas se encuentran en diferentes etapas de síntesis,
pero en la misma vía metabólica para la elaboración de
moléculas más complejas que podrían ser la ruta metabólica de
la elaboración de prostaglandinas, las cuales se sintetizan a
partir de ácidos grasos (Scheuer, 1995), las cuales son
necesarias para la subsistencia y conservación evolutiva
propia del coral en estudio.
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Es difícil saber cuantos compuestos tiene la mezcla de
terpenos aislada por cromatografía en columna y que
estructuras poseen. Químicamente son compuestos diferentes
(figs. 6 y 7), pero debido a la poca cantidad de material
obtenida de ésta fracción, no fué posible proceder a su
purificación.
Lo que podría explicar el hallazgo de los compuestos
terpénicos, el ácido esteárico y su derivado, es que en una
de las reacciones de la vía metabólica, a partir de estos
compuestos, los corales gorgonianos sintetizan
prostaglandinas, aunque en concentraciones pequeñas que son
difíciles de detectar en el género Muricea, pero no en otras
especies como Plexaura. (Scheuer, 1989; Di-Marzo, et al.,
1996).
No se detectó actividad antimicrobiana de amplio
espectro (para varias cepas de microorganismos) como se ha
observado en otros invertebrados marinos y macroalgas (Amico,
1995), pero la incidencia de actividad contra cepas Gram
positivas fué más alta comparada con cepas Gram negativas.
Esto sugiere que M. appressa presenta sustancias con
actividad contra tipos específicos de bacterias. Una
explicación alterna es que las bacterias Gram positivas
carecen de una membrana externa cuya función puede influir en
su protección a los antibióticos (Goodman y Gilman, 1982).
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62
Debido a que se detectó una mayor cantidad de fracciones
en el extracto clorofórmico positivas para actividad
antimicrobiana, que en el extracto de éter de petróleo, puede
suponerse que el primero presenta moléculas con mayor
cantidad de fracciones con propiedades antimicrobianas que el
extracto de éter de petróleo para las cepas probadas en este
estudio.
9.- CONCLUSIONES
Los extractos de éter de petróleo* y clorofórmico**,
crudos, de Muricea appressa Verrill 1864 son inactivos
microbiológicamente a la concentración probada por el método
de difusión en agar. Hubo actividad tanto antimicrobiana (CIV,
CVI, CVII, CVIII, CIX y CC) como contráctil (EVI) en el músculo
liso de yeyuno de conejo de algunas de las fracciones
semipuras obtenidas lo que indica la presencia de substancias
bioactivas.
*La mezcla de terpenos EII-6, se encuentra en el extracto
de éter de petróleo.
**El ácido esteárico (C1-1
) y su derivado (C1-3), ambos en
forma pura, se pudieron aislar del extracto clorofórmico
mediante las técnicas de cromatografía en capa fina y en
columna.
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10.- RECOMENDACIONES
Se sugiere la utilización del sistema de solventes por
gradiente en el procedimiento de cromatografía en columna, ya
que se obtuvo una mayor cantidad de fracciones con
actividades biológicas efectivas y además se aislaron de una
manera más fácil los compuestos puros.
En vista de no haber encontrado información reciente y
actualizada del coral Muricea appressa Verrill 1864, sería
conveniente continuar con la investigación, iniciando con
obtener mayor cantidad de extractos, de preferencia del
clorofórmico, que es donde puede haber más compuestos
biológicamente activos del coral objeto de estudio.
Determinar por métodos espectroscópicos si hay otras
moléculas que puedan ser las responsables de la actividad
antimicrobiana detectada en las fracciones que resultaron
positivas.
Obtener mayor cantidad de la fracción portadora de la
mezcla de terpenos (etérea); sería conveniente su posterior
purificación y la elucidación de la estructura de los
terpenos que la constituyen, ya que alguna de estas moléculas
podría tener una estructura química nueva; y determinar si
presentan o no actividad antimicrobiana, así como su efecto
sobre la contractilidad del músculo de yeyuno de conejo.
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11.- A N E X O
Medios de cultivo empleados Agar sal manitol Fórmula para 1000 ml de agua destilada Extracto de carne 1.000 g Peptona de carne 5.000 g Peptona de caseína 5.000 g Cloruro de sodio 75.000 g D- Manitol 10.000 g Agar 15.000 g Rojo fenol 0.025 g pH final 7.4 Medio de Agar sabouraud dextrosa Glucosa 40 g Peptona 10 g Agar 15 g Agua destilada 1 l. pH final 5.6 Medio de Müeller Hinton Para 1000 ml de agua destilada: Extracto de carne 2 .0 g Peptona de caseína H 17.5 g Almidón 1.5 g Agar 17.0 g pH final 7.4
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