Instructivo de Salmonella Tecra 3m

DISTRIBUCIONES BIOTECNOLOGICAS S.A. DE C.V. TELS. (55) 55-60-25-58 53-63-82-41 53-73-60-96 1

TECRA

INSTRUCCIONES

SALMONELLA INMUNOENSAYO VISUAL

PARA LA DETECCION DE SALMONELLA SPP.

EN ALIMENTOS Y MUESTRAS RELACIONADAS

USESE SOLAMENTE PARA EL DIAGNOSTICO IN VITRO

Estas instrucciones deben seguirse cuidadosamente; la falta de ellas puede conducir a resultados inexactos.

Nueva version – mayo de 2005 Instrucciones revisadas

Seccion 3: materiales requeridos Seccion 5: metodos de enriquecimiento Seccion 8: desarrollo del inmunoensayo Seccion 10: problemas- guia de solucion


TABLA DE CONTENIDOS

1. INTRODUCCION…………………………………..3

2. PRINCIPIO DE LA PRUEBA…………………….4

3. MATERIALES REQUERIDOS…………………..5

4. INSTRUCCIONES GENERALES……………….6

5. METODOS DE ENRIQUECIMIENTO……….7

6. PREPARACION DE MEDIOS PARA

ENRIQUECIMIENTO……………………………..17

7. PREPARACION DE REACTIVOS PARA

INMUNOENSAYO…………………………………21

8. DESARROLLO DEL INMUNOENSAYO…….22

9. BIBLIOGRAFIA……………………………………….27

10. GUIA DE SOLUCION DE PROBLEMAS…….28


1. INTRODUCCIÓN

TECRA INMUNOENSAYO SALMONELLA VISUAL (VIA™) ® ES UNA PRUEBA DE INVESTIGACIÓN RÁPIDA Y ESPECÍFICA

PARA LA DETECCIÓN IN VITRO DE SALMONELLA SPP. EN ALIMENTO, MUESTRAS DE ALIMENTO-RELACIONADAS

CON EL AMBIENTE.

DESPUÉS DEL ENRIQUECIMIENTO, POR LO MENOS 1 CFU DE SALMONELLA PUEDE SER DETECTADA EN 25

GRAMOS DE LA MUESTRA.

LOS PRESUNTOS POSITIVOS SE DEBEN CONFIRMAR POR MÉTODOS ESTÁNDARES (VÉASE LA SECCIÓN 8, EL PASO

11 DE ESTAS INSTRUCCIONES). ESTO ES ESPECIALMENTE IMPORTANTE EN SITUACIONES TALES COMO LAS

BITACORAS DEL PRODUCTO.

LA IMPORTANCIA DE LA SALMONELLA

LA SALMONELLA CONTINÚA SIENDO UNO DE LOS MICROORGANISMOS MÁS EXTENSAMENTE REPORTADOS EN

ALIMENTOS EN EL MUNDO. LAS SALMONELLAS SE DISTRIBUYEN EXTENSAMENTE EN LA NATURALEZA Y PUEDEN

SER AISLADAS DE UNA AMPLIA GAMA DE ALIMENTOS, ALIMENTOS PARA GANADO Y EN MUESTRAS

AMBIENTALES.

EL TECRA SALMONELLA VÍA, UTILIZA LOS ANTICUERPOS QUE RECONOCEN TODOS LOS TIPOS DE LAS

SALMONELLAS PROBADAS HASTA AHORA. EN UN ESTUDIO, SOBRE 300 MUESTRAS DE UNA VARIEDAD AMPLIA DE

FUENTES (QUE REPRESENTAN 152 SEROTYPES) FUERON PROBADAS Y DETECTADAS.

OTROS ESTUDIOS HAN DEMOSTRADO QUE LA TECNICA DE TECRA SALMONELLA VÍA:

• ES POR LO MENOS TAN SENSIBLE COMO LAS TÉCNICAS ESTÁNDARES DE CULTIVO

•NO TIENE VIRTUALMENTE NINGUNA REACTIVIDAD CON OTROS TIPOS DE ENTEROBACTERIAS

AOAC METODOS OFICIALES

LOS METODOS OFICIALES AOAC HAN DETERMINADO Y APROBADO LOS MÉTODOS SIGUIENTES INCLUIDO TECRA

SALMONELLA VIA

SITUACIÓN METODO

APROBADO

AOAC METODO OFICIAL 989.14 SALMONELLA EN ALIMENTOS INMUNOENSAYO COLORIMETRICO POLICLONAL METODO DE INVESTIGACION CON CALDO DE CISTINA SELENITA Y CALDO DE TETRATIONATO (TECRA SALMONELLA VIA)

SITUACIÓN METODO

APROBADO

AOAC METODO OFICIAL 998.09 SALMONELLA EN ALIMENTOS ENZIMA COLORIMETRICO POLICLONAL INMUNOENSAYO INVESTIGACION METODO CON RAPPAPORT-VASSILIADIS [R 10] CALDO Y CALDO DE TETRATIONATO (TECRA SALMONELLA VIA)


2. El PRINCIPIO DE LA PRUEBA

LA PRUEBA DE TECRA SALMONELLA VÍA ES UN ANÁLISIS DE ENLACE ENZIMATICO DE IMMUNOENSAYO (ELISA)

REALIZADO EN UNA CONFIGURACIÓN DE “SANDWICH”

(VÉASE EL CUADRO 1).

CUADRO 1: PRUEBA ELISA PARA DETECTAR SALMONELLA

1.- ALTA ACEPTACION EN LA CAPTURA DE ANTICUERPOS ESPECIFICOS PARA SALMONELLA SON ABSORBIDAS EN

LA SUPERFICIE DEL POZO

2. SI LOS ANTÍGENOS DE LA SALMONELLA ESTÁN PRESENTES EN LA MUESTRA, ESTOS SON CAPTURADOS POR LOS

ANTICUERPOS. EL RESTO DE LOS MATERIALES EN LA MUESTRA SE LAVAN.

3. EL “SANDWICH” ES COMPLEMENTADO POR LA ADICIÓN DE UNA ENZIMA-MARCADA CON ANTICUERPOS

(CONJUGADO) ESPECIFICO PARA SALMONELLA

4. LA PRESENCIA DE SALMONELLA SE INDICA CUANDO EL CONJUGADO CONVIERTE EL SUBSTRATO A UN COLOR

VERDE.

ALTERNATIVAMENTE, NO HAY SALMONELLA, NO HAY COLOR VERDE


3.- MATERIALES REQUERIDOS

3.1 MATERIALES SUMINISTRADOS POR TECRA

REACTIVOS

NUMERO MATERIALES

1. LAVADO DEL CONCENTRADO

2. CONTROL POSITIVO

3. DILUYENTE DEL CONTROL (CONTROL NEGATIVO)

4. CONJUGADO

5. DILUYENTE DEL CONJUGADO

6. SUBSTRATO

7. DILUYENTE DEL SUBSTRATO

8. SOLUCION DE PARO

9. POZOS REVESTIDOS POR ANTICUERPOS EN BOLSA RESELLABLE

SOPORTE DE SEGURIDAD PARA POZOS

MANUAL DE INSTRUCCIONES

HOJA DE IDENTIFICACION DE LA MUESTRA POR NUMERO O LETRA

TARJETA DE COLOR 1

3.2 MATERIALES REQUERIDOS PARA EL ENRIQUECIMIENTO DE LA MUESTRA

MEDIOS (SECCION 6)

HOMOGENIZADOR O MEZCLADOR

BOLSAS PARA HOMOGENIZAR

INCUBADORA: 35-37°C Y/O 41-43°C

PIPETAS SEROLOGICAS (1 ml)

3.3 MATERIALES REQUERIDOS PARA EL INMUNOENSAYO

INCUBADORA 35- 37°C

PIPETAS SEROLOGICAS (1ml)

BOTELLA PLASTICA DE 500 ml (PICETA)

PIPETAS PARA DISPENSAR DE 20µl A 200µl

PUNTAS PARA PIPETOR

CINTA PARAFILM

BAÑO MARIA O EQUIVALENTE (100°C)

TUBOS TECRA O TUBOS EQUIVALENTES PARA CALOR


3.4 ALGUNOS MATERIALES DISPONIBLES DE TECRA

CATALOGO DESCRIPCION CANTIDAD

DEL PRODUCTO

ENVSWB25 TECRA ENVIROSWAB 25 HISOPOS

BPWMED500 AGUA PEPTONADA BUFERADA 500 gr

BPWMED2000 AGUA PEPTONADA BUFERADA 2 kg

IMBSUP50 IMBENTIN SUPPLEMENTO 50ml IMBSUP1000 IMBENTIN SUPPLEMENTO 1Lt IMBSUP2000 IMBENTIN SUPPLEMENTO 2Lt TLBMED500 CALDO LACTOSADO 500g TMBMED500 CALDO M 500g RVRMED500 CALDO RAPPAPORT-VASSILIADIS [R10] 500g TTB (B) MED500 CALDO BASE TETRATIONATO 500g IISSUP250 SOLUCION YODO/YODURADO 250ml TSBMED500 CALDO SOYA TRIPTONA 500g

4. INSTRUCCIONES GENERALES • TODOS LOS REACTIVOS SE DEBEN PREPARAR CUIDADOSAMENTE. LA FECHA DE LA RECONSTITUCIÓN SE DEBE ESCRIBIR EN LA ETIQUETA EXTERIOR DE LA CAJA. EL KIT SE DEBE UTILIZAR EN EL PLAZO DE 2 MESES DE LA RECONSTITUCIÓN • TODOS LOS COMPONENTES SE DEBEN REFRIGERAR (2-8°C) CUANDO NO SEAN UTILIZADOS. NO CONGELE. • LOS COMPONENTES DE TECRA SALMONELLA VÍA ESTAN DISEÑADOS PARA SU USO COMO UNIDAD INTEGRAL. LOS POZOS DEL CONTROL POSITIVO [2], DEL CONJUGADOL [4] Y CELDAS REVESTIDAS CON ANTICUERPOS [9] QUE LLEVAN EL MISMO NÚMERO DE LOTE. • EL CONTROL POSITIVO [2] (UN ESTÁNDAR INTERNO CALIBRADO) Y EL CONTROL NEGATIVO DEBEN SER APLICADOS CADA VEZ QUE SE REALIZA EL ANÁLISIS. • HAY DOS SISTEMAS DE CONJUGADO *4+ Y DILUYENTE CONJUGADO *5+ RECONSTITUYA UN CONJUGADO

INICIALMENTE Y EL OTRO EN LA CANTIDAD QUE SEA NECESARIO [4] SE DEBE UTILIZAR EN EL PLAZO DE UN MES

DESPUÉS DE SER RECONSTITUIDO.

• LOS POZOS NO UTILIZADOS SE DEBEN ALMACENAR SIEMPRE EN LA BOLSA PROPORCIONADA Y RESELLAR.


5. MÉTODOS DE ENRIQUECIMIENTO:

“ES POSIBLE QUE LOS ORGANISMOS VIABLES, PATÓGENOS ESTÉN PRESENTES AL UTILIZAR LAS MUESTRAS

CONTAMINADAS. POR LO TANTO, LAS PRÁCTICAS ESTÁNDARES DE SEGURIDAD DEL LABORATORIO PARA EL

MANEJO DE TALES ORGANISMOS DEBEN SER SEGUIDAS.”

ES IMPORTANTE ASEGURARSE DE QUE TODOS LOS CALDOS DE ENRIQUECIMIENTO SEAN PRE-CALENTADOS A LA

TEMPERATURA DE INCUBACIÓN, ESPECIFICADA EN EL PROTOCOLO, PARTICULARMENTE CUANDO LAS MUESTRAS

SON ANALIZADAS.

PARA ASEGURAR LA CORRECTA MEZCLA DE LA MUESTRA EN LOS MEDIOS, HOMOGENICE O MEZCLE EN LA

FORMA APROPIADA.

ANTES DE UTILIZAR TECRA®SALMONELLA VIATM DEBE REALIZARSE UN PRE-ENRIQUECIMIENTO DEL

ENRIQUECIMIENTO FINAL PARA ASEGURARSE DE QUE CUALQUIER SALMONELLA SPP. EN LA MUESTRA SE

MULTIPLICARÁ A LOS NIVELES PERCEPTIBLES. EL PROTOCOLO QUE SE UTILIZARÁ DEPENDE DE UN NÚMERO DE

FACTORES.

5.1 ELIGIENDO UN MÉTODO DE PRE-ENRIQUECIMIENTO LOS CALDOS DE PRE-ENRIQUECIMIENTO USADOS EN ESTUDIOS DE VALIDACIÓN DE AOAC SON RECOMENDADOS POR LA FDA Y EL MANUAL ANALÍTICO BACTERIOLÓGICO. PARA LA MAYORÍA DE LOS TIPOS DE ALIMENTOS, EL CALDO LACTOSADO ES EL MEDIO RECOMENDADO PARA EL PRE-ENRIQUECIMIENTO. PARA OTROS, NO-AOAC, APROBÓ OTRO TIPO DE PROCEDIMIENTOS, EL AGUA DE PEPTONA BUFERADA SE PUEDE UTILIZAR PARA EL PREENRIQUECIMIENTO. TODOS LOS PROTOCOLOS DE ENRIQUECIMIENTO RECOMENDADOS (VÉASE LA SECCIÓN 5.2) REQUIEREN UN PASO DE PRE-ENRIQUECIMIENTO PARA RE-VIVIR A LAS SALMONELLAS SPP DAÑADAS. E INCREMENTAR EL NUMERO DE CÉLULAS. LA OPCIÓN DEL MÉTODO DEL PRE-ENRIQUECIMIENTO ES MUY IMPORTANTE, Y DEPENDE DE LAS MUESTRAS QUE SE PROBARÁN. PARA ALGUNOS ALIMENTOS EN ESPECÍFICO LOS MEDIOS DE PRE-ENRIQUECIMIENTO SON ALTAMENTE RECOMENDADOS Y SE DEBEN UTILIZAR PREFERENTEMENTE A OTROS MEDIOS QUE SE NOMINEN EN EL PROTOCOLO DEL MÉTODO.

CARNE, ALIMENTOS CON CARNE, Y SUB PRODUCTOS DE LA CARNE. AGREGUE HASTA 2.25ml DE IMBENTIN AUTOCLAVEADO O DE TRITÓN X-100 COMO MEDIO DE PRE-ENRIQUECIMIENTO A 25g. DE MUESTRA

LECHE EN POLVO UTILICE 225 ml DE MEDIO AGUA VERDE BRILLANTE (BGW) EN 25g. DE MUESTRA

HUEVOS, HUEVO LIQUIDO, HUEVOS DUROS UTILICE 225 ml DE CALDO DE TRIPTONA DE SOYA (TSB) EN 25g DE MUESTRA

COCO UTILICE 225 ml. DE CALDO DE LACTOSA (LB) CON 2.25ml. DE IMBENTIN O TRITON X-100 EN 25g DE MUESTRA


PRODUCTOS SECOS UTILICE 225 ml TSB EN 25g DE MUESTRA. (NOTA: PARA ACTIVAR LOS PRODUCTOS SECOS UTILICE CALDO DE LAURIL TRIPTOSA (LTB) PUEDE SER SUBSTITUIDO POR CISTINA SELENITO (CS) EN EL PROTOCOLO DE ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO)

DULCES (INCLUIDOS CHOCOLATE Y COCOA) UTILICE 225 ml DE LECHE DESCREMADA CON 0.45ml DE SOLUCION VERDE BRILLANTE (BGDS) EN 25g DE MUESTRA

CONGELADOS Y MEZCLAS

UTILICE 225ml CALDO NUTRIENTE (NB) EN 25g DE MUESTRA

TODAS LAS ESPECIES, CANELA, OREGANO

1:100 DE MUESTRA EN TSB

CLAVO (ESPECIA)

1:1000 DE MUESTRA EN TSB

ESPECIES

UTILICE 225 ml TSB EN 25g DE MUESTRA

CEBOLLA Y AJO ADICIONAR SULFITO DE POTASIO EN TSB Y PROPORCIONAR UNA CONCENTRACION FINAL DE 0.5%. UTILICE 225ml MBPW EN 25g DE MUESTRA.

CULTIVOS INICIADORES PARA FERMENTAR ALIMENTOS UTILICE 225ml MBPW EN 25g DE MUESTRA

5.2. PARA ELEGIR UN PROTOCOLO SELECTIVO DE ENRIQUECIMIENTO REFIERA A LA

TABLA 1 PARA DETERMINAR EL PROTOCOLO MÁS CONVENIENTE PARA SU

LABORATORIO.

CADA PROTOCOLO DE ENRIQUECIMIENTO TIENE PROCEDIMIENTOS SEPARADOS PARA EL ANÁLISIS DE LAS

MUESTRAS DEPENDIENTES EN LA CARGA MICROBIANA. LOS ALIMENTOS DE CARGA MICROBIANA BAJA TALES

COMO POLVOS DE LECHE, CACAO, HARINA DE SOJA, CHOCOLATE, HARINA, HUEVO EN POLVO Y ALMIDONES

REQUIEREN UN PASO SELECTIVO MÁS CORTO QUE EL ENRIQUECIMIENTO EN LOS ALIMENTOS CON ALTAS

CARGAS MICROBIANAS TALES COMO CARNES, PESCADOS, AVES DE CORRAL, COMIDA CON CARNE Y

SUBPRODUCTOS CRUDOS DE LA CARNE.


TABLA 1 SELECION DEL PROTOCOLO DE ENRIQUECIMIENTO

PROTOCOLO

NOMBRE

PROTOCOLOS DESTACADOS

APROBACIONES

ENRIQUECIMIENTO

PERMITE LA PREPARACIÓN DE MEDIOS POR ADELANTADO

INCUBACION TEMPERATURAS REQUERIDAS

METODO APLICABLE PARA HISOPOS

AOAC

+ ESTÁNDAR AUSTRALIANO

ISO 6579*

SELECTIVO SIMPLE

SELECTIVO TOXICO-BAJO

35-37°C

41-43°C

1 RV(R10)/TT

2 RV(R10)

3 TT

TT/SC

5 RV/MSCORSC

6 RV/MSC

7 ENVIROSWAB METODO

+ AOAC aprobacion para todos los alimentos. # El método deque usa los caldos selectivos recomendados en el estándar australiano AS1766.2.5 continuando con

enriquecimientos en el caldo M

* validado contra ISO 6579.


PROTOCOLO 1 – RV [R10] / TT-AOAC APROBACION METODO (998.09) OPCION 1 PRODUCTOS DE CARGA MICROBIANA BAJA

PRE-ENRIQUECIMIENTO

ADICIONAR 25g DE MUESTRA 225ml. LB INCUBAR A 35-37°C DE 18 A 22 HRS.

REALIZAR DOS ENRIQUECIMIENTOS SELECTIVOS TRANSFERIR 1 ml.PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO TRANSFERIR 0.1ml PARA PRE- ENRIQUECIMIENTO

EN 9 ml. DE CALDO TT PRE-CALENTADO EN 9.9 ml. DE CALDO RV PRE CALENTADO

INCUBAR A 41-43°C POR 6-8 HORAS.

REALIZAR DOS POST-ENRIQUECIMIENTOS TRANSFERIR 1ml. DE TT EN 10ml.DE TRANSFERIR 1ml. DE RV [R10] EN 10ml

CALDO M PRE- CALENTADO DE CALDO M PRE-CALENTADO

INCUBAR A 35-37°C DE 16-20 HRS

REALIZAR ELISA

PRODUCTOS DE CARGA MICROBIANA ALTA ALIMENTOS CRUDOS PRE-ENRIQUECIMIENTO

ADICIONAR 25g. DE MUESTRA A 225ml. LB

INCUBAR A 35-37°C DE 18-22 HORAS

REALIZAR DOS ENRIQUECIMIENTOS SELECTIVOS TRANSFERIR 1 ml.PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO TRANSFERIR 0.1 ml PARA PRE- ENRIQUECIMIENTO

EN 9 ml. DE CALDO TT PRE-CALENTADO EN 9.9 ml. DE CALDO RV[R10] PRE CALENTADO


REALIZAR DOS POST-ENRIQUECIMIENTOS TRANSFERIR 1ml. DE TT EN 10ml.DE TRANSFERIR 1ml. DE RV [R10] EN 10ml.

CALDO M PRE- CALENTADO DE CALDO M PRE-CALENTADO


REALIZAR ELISA


PROTOCOLO 2 – RV [R10] / TT-AOAC APROBACION METODO (998.09) OPCION 2 PRODUCTOS DE CARGA MICROBIANA BAJA

PRE-ENRIQUECIMIENTO


REALIZAR UN ENRIQUECIMIENTO SELECTIVOS TRANSFERIR 0.1 ml PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO EN 9.9 ml. DE CALDO RV [R10] PRE-CALENTADO


REALIZAR UN POST-ENRIQUECIMIENTO TRANSFERIR 1ml. DE RV [R10] EN 10ml.

DE CALDO M PRE-CALENTADO


REALIZAR ELISA




REALIZAR UN ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO TRANSFERIR 0.1ml PARA PRE- ENRIQUECIMIENTO

EN 9.9 ml. DE CALDO RV[R10] PRE CALENTADO


REALIZAR UN POST-ENRIQUECIMIENTO TRANSFERIR 1ml. DE RV [R10] EN 10ml.

DE CALDO M PRE-CALENTADO


REALIZAR ELISA


PROTOCOLO 3– TT-AOAC APROBACION METODO (998.09) OPCION 3 PRODUCTOS DE CARGA MICROBIANA BAJA

PRE-ENRIQUECIMIENTO


REALIZAR UN ENRIQUECIMIENTO SELECTIVOS TRANSFERIR 1ml PARA PRE- ENRIQUECIMIENTO

EN 9 ml. DE CALDO TT PRE CALENTADO


REALIZAR UN POST-ENRIQUECIMIENTO TRANSFERIR 1ml. DE TT EN 10ml. DE CALDO M PRE-CALENTADO


REALIZAR ELISA




REALIZAR UN ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO

TRANSFERIR 1ml PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO EN 9 ml. DE CALDO TT PRE CALENTADO


REALIZAR UN POST-ENRIQUECIMIENTO

TRANSFERIR 1ml. DE TT EN 10ml. DE CALDO M PRE-CALENTADO


REALIZAR ELISA


PROTOCOLO 4 –TT/SC-AOAC APROBACION METODO (998.14) PRODUCTOS DE CARGA MICROBIANA BAJA

PRE-ENRIQUECIMIENTO ADICIONAR 25g DE MUESTRA 225ml. LB

INCUBAR A 35-37°C DE 18 A 22 HRS.

REALIZAR DOS ENRIQUECIMIENTOS SELECTIVOS TRANSFERIR 1 ml.PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO TRANSFERIR 1ml PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO

EN 9 ml. DE CALDO TT PRE-CALENTADO EN 9ml. DE CALDO SC PRE-CALENTADO


REALIZAR DOS POST-ENRIQUECIMIENTOS TRANSFERIR 1ml. DE TT EN 10ml.DE TRANSFERIR 1ml. DE SC EN 10ml.

CALDO M PRE-CALENTADO DE CALDO M PRE-CALENTADO


REALIZAR ELISA




REALIZAR DOS ENRIQUECIMIENTOS SELECTIVOS TRANSFERIR 1 ml.PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO TRANSFERIR 1ml PARA PRE- ENRIQUECIMIENTO

EN 9 ml. DE CALDO TT PRE-CALENTADO EN 9ml. DE CALDO SC PRE-CALENTADO


REALIZAR DOS POST-ENRIQUECIMIENTOS TRANSFERIR 1ml. DE TT EN 10mlDE TRANSFERIR 1ml. DE SC EN 10ml.



REALIZAR ELISA


PROTOCOLO 5 – RV/MSC O SC- VALIDADO ATRAVES DE NF ISO 6579 PRODUCTOS DE CARGA MICROBIANA BAJA

PRE-ENRIQUECIMIENTO MUESTRA SECA OTROS PRODUCTOS

ADICIONAR 25g DE MUESTRA A 50 ml BPW. ADICIONAR 25g DE MUESTRA A 225 ml INCUBAR A 20-25°C POR 2 HORAS. BPW. INCUBAR A 35-37°C POR 18-22 HRS.

ADICIONAR 175 ml BPW. INCUBAR A 35-37°C POR 16-20 HRS

DOS ENRIQUECIMIENTOS SELECTIVOS TRANSFERIR 0.1ml PARA PRE ENRIQUECIMIENTO TRANSFERIR 1ml PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO

EN 10ml DE RV PRE-CALENTADO EN 10ml DE MSC PRE-CALENTADO O

INCUBAR A 41-43°C DE 6-8 HORAS TRANSFERIR 10ml PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO EN 100ml DE MSC PRE-CALENTADO

INCUBAR A 35-37°C DE 6-8 HRS.

REALIZAR DOS POST-ENRIQUECIMIENTOS TRANSFERIR 1ml. DE RV EN 9ml.DE CALDO M TRANSFERIR 1ml. DE MSC O SC EN 9ml.

PRE-CALENTADO DE CALDO M PRE-CALENTADO INCUBAR A 35-37°C DE 16-20 HRS

REALIZAR ELISA


ADICIONAR 25g. DE MUESTRA A 225ml. BPW


REALIZAR DOS ENRIQUECIMIENTOS SELECTIVOS TRANSFERIR 0.1mlPARA PRE-ENRIQUECIMIENTO TRANSFERIR 1ml PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO

EN 10ml DE RV PRE-CALENTADO EN 10ml DE MSC PRE-CALENTADO O

INCUBAR A 41-43°C DE 16-20 HORAS TRANSFERIR 10ml PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO EN 100ml DE SC PRE-CALENTADO

INCUBAR A 35-37°C DE 16-20 HRS.

REALIZAR DOS POST-ENRIQUECIMIENTOS TRANSFERIR 1ml. DE RV EN 9ml.DE CALDO M TRANSFERIR 1ml. DE MSC O SC EN 9ml.

PRE-CALENTADO DE CALDO M PRE-CALENTADO


REALIZAR ELISA


PROTOCOLO 6 – METODO RV/MSC PRODUCTOS DE CARGA MICROBIANA BAJA

PRE-ENRIQUECIMIENTO ALIMENTOS DESHIDRATADOS TODOS LOS DEMAS ALIMENTOS

ADICIONAR 25g DE MUESTRA A 50 ml BPW. ADICIONAR 25g DE MUESTRA A 225 ml BPW INCUBAR A 20-25°C POR 2 HORAS. INCUBAR A 35-37°C POR 18-22 HRS.

ADICIONAR 175 ml BPW. INCUBAR A 35-37°C POR 16-20 HRS

DOS ENRIQUECIMIENTOS SELECTIVOS TRANSFERIR 0.1ml PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO TRANSFERIR 1ml PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO

EN 9.9ml DE RV PRE-CALENTADO EN 9ml DE MSC PRE-CALENTADO

INCUBAR A 41-43°C DE 6-8 HORAS INCUBAR A 35-37°C DE 6-8 HRS

REALIZAR DOS POST-ENRIQUECIMIENTOS TRANSFERIR 1ml. DE RV EN 9ml.DE CALDO M TRANSFERIR 1ml. DE MSC EN 9ml.

PRE-CALENTADO DE CALDO M PRE-CALENTADO


REALIZAR ELISA

PRODUCTOS DE CARGA MICROBIANA ALTA - ALIMENTOS CRUDOS PRE-ENRIQUECIMIENTO

ADICIONAR 25g. DE MUESTRA A 225ml. BPW


REALIZAR DOS ENRIQUECIMIENTOS SELECTIVOS TRANSFERIR 0.1ml PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO TRANSFERIR 1ml PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO



REALIZAR DOS POST-ENRIQUECIMIENTOS TRANSFERIR 1ml. DE RV EN 9ml. TRANSFERIR 1ml DE MSC EN 9ml.

DE CALDO M PRE-CALENTADO DE CALDO M PRE-CALENTADO


REALIZAR ELISA


PROTOCOLO 7 – HISOPOS PARA MEDIO AMBIENTE

PRE-ENRIQUECIMIENTO

HISOPADO REQUERIDO TECRA ENVIROSWAB

ADICIONAR 20ml BPW AL TUBO DEL HISOPO INCUBAR A 35-37°C DE 18-22 HRS

REALIZAR DOS ENRIQUECIMIENTOS SELECTIVOS TRANSFERIR 0.1ml PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO TRANSFERIR 1ml PARA PRE-ENRIQUECIMIENTO



REALIZAR DOS POST-ENRIQUECIMIENTOS TRANSFERIR 1ml. DE RV EN 9ml.DE TRANSFERIR 1ml. DE MSC EN 9ml



REALIZAR ELISA

NOTA: LOS LABORATORIOS UTILIZAN HISOPOS DISTINTOS A LOS DE TECRA ENVIROSWAB PARA VALIDAR EL USO

DE MEDIOS ADECUADOS PARA CADA TIPO DE MUESTRA


6. PREPARACION DE MEDIOS PARA ENRIQUECIMIENTO SE SUGIERE UTILIZAR MEDIOS DE LA MARCA TECRA DE 3M (VER SECCION 3.4)

PRECAUCION: CUANDO SE SIGAN LOS PROCEDIMIENTOS DE AOAC, TENGA PARTICULAR CUIDADO, EN LA PREPARACION, DE DOS DE LOS MEDIOS SELECTIVOS:

1. CALDO SELENITO CISTINA.- DEBE SER PREPARADO Y UTILIZADO INMEDIATAMENTE CON PRIORIDAD EN SU USO.

2. AGENTES SELECTIVOS YODO-YODURADO Y VERDE BRILLANTE, DEBERA SER ADICIONADO A LA PREPARACION DEL CALDO DE TETATRIONATO BASE Y DAR UN USO PRIORITARIO.

EL AJUSTE CORRECTO DEL pH DE LOS MEDIOS PREPARADOS Y LA VERIFICACION DEL pH PARA LA ESTERILIZACION ES MUY IMPORTANTE, SI SE NECESITA AJUSTARLO, UTILICE ACIDO CLORHIDRICO (HCL 1M) O HIDROXIDO DE SODIO: (NaOH 1M). 6.1 AGUA PEPTONADA BUFERADA (BPW) TECRA CATALOGO: BPWMED500 o BPWMED2000

AGAR DE PEPTONA 10.0g. CLORURO DE SODIO 5.0g.

FOSFATO DISODICO (SODIO FOSFATO DIBASICO) [Na2HPO4 ] 3.5g. FOSFATO POTASICO (FOSFATO DIÁCIDO DE POTASIO) [KH2PO4] 1.5g. DISOLVER LOS INGREDIENTES EN 1 LT. DE AGUA PURIFICADA. MEZCLAR TOTALMENTE. DISPENSAR Y ESTERILIZAR POR AUTOCLAVE A 121°C POR 15 min. pH FINAL 7.0- 7.4 A 25°C.

6.2 VERDE BRILLANTE SOLUCION AL 1% (BGDS)

VERDE BRILLANTE (ACUOSO) 0.1g AGUA PURIFICADA 10.0ml DISOLVER INGREDIENTES Y MEZCLAR TOTALMENTE.

6.3 VERDE BRILLANTE AGUA (BGW)

ADICIONAR 2ml DE BGDS A I L DE AGUA PURIFICADA Y MEZCLAR. DISPENSAR Y ESTERILIZAR POR AUTOCLAVE A 121°C POR 15 min. pH FINAL 6.8-7.2 A 25°C.

6.4 IMBENTIN TECRA CATALOGO: IMBSUP 50, IMBSUP1000 o IMBSUP2000

COLOCAR EN VAPOR 100 ml DE IMBENTIN SUPLEMENTO EN UNA BOTELLA VERTICAL, CON TAPA AFLOJADA LIGERAMENTE EN BAÑO MARIA o AUTOCLAVE A 121 °C DURANTE 15 min. REMOVER LA BOTELLA DEL BAÑO MARIA O DE LA AUTOCLAVE Y PERMITIR ENFRIAR A TEMPERATURA AMBIENTE (20-25 °C)


NOTA: EL IMBENTIN SE UTILIZARA EN DOS ETAPAS DESPUÉS DE APLICAR VAPOR. UNA VEZ QUE HA LLEGADO A TEMPERATURA AMBIENTE, CERRAR LA TAPA FUERTEMENTE Y SUAVEMENTE INVERTIR LA BOTELLA VARIAS VECES PARA MEZCLAR EL CONTENIDO. ETIQUETAR LA BOTELLA CON LA FECHA QUE FUE TRATADO EL IMBENTIN. USAR DENTRO DE LOS SIGUIENTES SEIS MESES DE TRATAMIENTO. ALMACÉNAR POR ENCIMA DE 10 ° C.

6.5 CALDO DE LACTOSA (LB) TECRA CATALOGO: TLBMED500 AGAR DE PEPTONA 5.0g. EXTRACTO DE RES EN POLVO 2.5g. PEPTONA DE CARNE 0.5g. LACTOSA 5.0g. DISOLVER LOS INGREDIENTES EN 1Lt DE AGUA PURIFICADA. MEZCLAR TOTALMENTE DISPENSE LOS VOLUMENES REQUERIDOS Y ESTERILICE POR AUTOCLAVE A 121°C POR 15 min. pH FINAL 6.7-7.1 25°C 6.6 CALDO LAURIL TRIPTOSA (LTB) TRIPTOSA 20.0g LACTOSA 5.0g CLORURO DE SODIO 5.0g

FOSFATO DIPOTASICO (FOSFATO MONOACIDO DE POTASIO) [K2HPO4] 2.75g FOSFATO POTASICO (FOSFATO DIÁCIDO DE POTASIO) [KH2PO4] 2.75g LAURIL SULFATO DE SODIO 0.1g

DISOLVER LOS INGREDIENTES EN 1Lt DE AGUA PURIFICADA. MEZCLAR TOTALMENTE DISPENSE LOS VOLUMENES REQUERIDOS Y ESTERILICE POR AUTOCLAVE A 121°C POR 15 min. pH FINAL 6.6-7.0 25°C 6.7 L-CISTINA SOLUCION L-CISTINA 0.1g HIDROXIDO DE SODIO 15.0ml DISOLVER L-CISTINA EN EL HIDROXIDO DE SODIO Y DILUIR EN 100ml CON AGUA PURIFICADA NO UTILIZAR AUTOCLAVE. 6.8 CALDO MANITOL CISTINA SELENITO (MSC) TRYPTONA 5.0g MANITOL 4.0g SELENITO DE SODIO (NaHSeO3) 4.0g FOSFATO DISODICO (Na2HPO4) 10.0g SOLUCION DE L-CISTINA 10.0ml. DISOLVER LOS INGREDIENTES, EXCEPTO LA CISTINA, EN 1 Lt. DE AGUA PURIFICADA. MEZCLAR VIGOROSAMENTE. DOSIFICAR LOS VOLUMENES REQUERIDOS DENTRO DE CONTENEDORES ESTERILES Y CALENTAR EN BAÑO MARIA, O VAPOR POR 10 min. NO UTILIZAR AUTOCLAVE, ENFRIAR Y ADICIONAR LA SOLUCION DE L-CISTINA EN CANTIDAD DE 0.1 ml. EN 10ml. “UTILICE EL MISMO DIA DE PREPARACION”


6.9 CALDO M

PEPTONA CASEINA 12.5g EXTRACTO DE LEVADURA 5.0g D-MANNOSE 2.0g CITRATO DE SODIO 5.0g CLORURO DE SODIO 5.0g FOSFATO DIPOTASICO (K2HPO4) 5.0g CLORURO DE MANGANESO 0.14g SULFATO DE MAGNESIO 0.8g SULFATO FERROSO 0.04g POLISORBATO 80 (TWEEN 80) 0.75g

DISOLVER LOS INGREDIENTES EN 1 Lt DE AGUA PURIFICADA. HOMOGENEIZAR Y CALIENTAR PARA DISOLVER COMPLETAMENTE. DISPENSAR EN ALÍCUOTAS DE 10 ml. EN TUBOS DE ENSAYO Y ESTERILIZAR POR AUTOCLAVE A 121 ° C DURANTE 15 min. PH FINAL, 6.8-7.2 A 25 ° C. 6.10 LECHE BAJA EN GRASA (LECHE DESCREMADA EN POLVO RECONSTITUIDA) LA LECHE DESCREMADA UHT, SE SABE QUE ES LIBRE DE SALMONELLA Y CONSERVADORES, ES ACEPTABLE PARA SU USO. AGREGAR 100g DE LECHE EN POLVO DESCREMADA EN 1 Lt DE AGUA PURIFICADA. HOMOGENIZAR PARA DISOLVER COMPLETAMENTE. DISPENSAR Y ESTERILIZAR POR AUTOCLAVE A 121 ° C DURANTE 15 min. PH FINAL, 6.8-7.2 A 25 ° C. 6.11 CALDO NUTRIENTE (NB) EXTRACTO DE CARNE 3.0g PEPTONA 5.0g DISOLVER LOS INGREDIENTES EN 1LT DE AGUA PURIFICADA. MEZCLAR VIGOROSAMENTE, DISPENSE LOS VOLUMENES REQUERIDOS Y ESTERILICE POR AUTOCLAVE A 121°C POR 15 min. pH FINAL 6.6 - 7.0 A 25°C 6.12 CALDO RAPPAPORT-VASSILIADIS (RV) PEPTONA DE SOYA 5.0g CLORURO DE SODIO 8.0g FOSFATO POTASICO (FOSFATO DIÁCIDO DE POTASIO) [KH2PO4] 1.6g CLORURO DE MAGNESIO (MgCl2.6H2O) 40.0g MALAQUITA VERDE 0.04g DISOLVER LOS INGREDIENTES EN 1 Lt DE AGUA PURIFICADA. MEZCLAR VIGOROSAMENTE. DISPENSE LOS VOLUMENES REQUERIDOS Y ESTERILICE POR AUTOCLAVE A 115°C POR 15 min. pH FINAL 5.0 – 5.4 A 25°C


6.13 CALDO RAPPAPORT- VASSILIADIS R10 (RV[R10]) CODIGO TECRA: RVRMED500 PEPTONA CASEINA 4.54g CLORURO DE MAGNESIO (ANHIDRO) 13.4g CLORURO DE SODIO 7.2g FOSFATO POTASICO 1.45g OXALATO DE MALAQUITA VERDE 0.36g DISOLVER LOS INGREDIENTES EN 1 Lt DE AGUA PUIFICADA. CALIENTE PARA DISOLVER. DISPENSE EN CONTENEDORES APROPIADOS Y USAR AUTOCLAVE POR 15 min. A 115°C. pH FINAL 4.9-5.3 A 25°C 6.14 CALDO SELENITO CISTINA (SC) TRIPTONA 5.0g LACTOSA 4.0g FOSFATO DISODICO (Na2HPO4) 10.0g SELENITO DE SODIO (NAHSeO3) 4.0g L-CISTINA 0.01g DISOLVER LOS INGREDIENTES EN 1 Lt DE AGUA PURIFICADA. MEZCLAR VIGOROSAMENTE. DISPENSE LOS VOLUMENES REQUERIDOS EN TUBOS ESTERILES CALENTAR POR 10 min. EN VAPOR CONTINUO. NO UTILICE AUTOCLAVE. pH FINAL 6.5-6.9 A 25°C. “UTILICE EL MISMO DIA DE PREPARACION”. 6.15 CALDO TETRATIONATO (TT) EL CALDO DE TERATIONATO ESTA PREPARADO COMO UN MEDIO BASE AL CUAL SE LE ADICIONA UNA SOLUCION YODO – YODURADO Y UTILICE INMEDIATAMENTE. CALDO BASE PRODUCTO TECRA TTB (B) MED 500

PEPTONA DE CARNE 5.0g SALES BILIARES 1.0g CARBONATO DE CALCIO 10.0g TIOSULFATO DE SODIO 30.0g DISOLVER LOS INGREDIENTES EN 1 Lt DE AGUA PURIFICADA. MEZCLAR VIGOROSAMENTE. CALENTAR CON FRECUENTE AGITACION Y HERVIR POR 1 min. HASTA DISOLVER COMPLETAMENTE EL POLVO. ENFRIAR POR DEBAJO DE LOS 40°C. SOLUCION YODO-YODURO YODO 6.0g YODURO DE POTASIO 5.0g AGUA PURIFICADA 20.0 ml


COMPLEMENTO DEL MEDIO A UN Lt. DE CALDO BASE ADICIONAR 20 ml. DE SOLUCION DE YODO-YODURADO. MEZCLAR Y DISPENSAR EN CANTIDADES DE 10 ml. EN TUBOS ESTÉRILES. NO CALENTAR DEPUES DE ADICIONAR LA SOLUCION DE YODO. EL COMPLEMENTO DEL MEDIO PUEDE SER UTILIZADO EN EL DIA DE PREPARACION. SI EL VERDE BRILLANTE (SUMINISTRADO POR SEPARADO) SE VA A ADICIONAR, AÑADIR 10 ml. DE 0,1 % BGDS A 1 Lt DEL MEDIO. pH FINAL, 7,8-8.2 A 25°C. 6.16 CALDO DE SOYA TRIPTONA (TSB) PRODUCTO TECRA TSBMED500

PEPTONA DE CASEINA 17.0g PEPTONA DE SOYA 3.0g CLORURO DE SODIO 5.0g FOSFATO DIPOTASICO (K2HPO4) 2.5g GLUCOSA 2.5g DISOLVE LOS INGREDIENTES EN 1 Lt DE AGUA PURIFICADA. MEZCLAR VIGOROSAMENTE. DISPENSE LOS VOLUMENES REQUERIDOS Y ESTERILICE POR AUTOCLAVE A 121°C POR 15 min. pH FINAL 7.1-7.5 A 25°C

7. PREPARACIÓN DE REACTIVO PARA INMUNOENSAYO ANTES DE UTILIZAR EL TECRA SALMONELLA VIA, LA PREPARACION DE LOS REACTIVOS ES NECESARIA. ATENCION: EVITAR LA CONTAMINACIÓN CRUZADA DE REACTIVOS. ASEGÚRESE DE QUE LOS TAPONES DE LAS BOTELLAS DE LOS REACTIVOS NO SEAN INADVERTIDAMENTE CAMBIADAS. SOLUCION DE LAVADO DILUIR EL CONCENTRADO DE LAVADO [1] A 2Lt CON AGUA DESTILADA O DEIONIZADA. PARA EL LAVADO DE POZOS, SE RECOMIENDA UNA BOTELLA DE PLÁSTICO CON BOQUILLA AMPLIA. ALMACENAR LA SOLUCIÓN DE LAVADO A 4 °C CUANDO NO ESTÁ EN USO. ASEGÚRESE DE QUE LOS RECIPIENTES UTILIZADOS PARA ALMACENAR LA SOLUCIÓN DE LAVADO SE LIMPIEN MINUCIOSAMENTE CADA VEZ QUE SE UTILICEN. DONDE LA CONTAMINACIÓN MICROBIANA POR AGUA ES UN PROBLEMA, EL USO DE AGUA ESTERIL ES RECOMENDADA CONTROL POSITIVO EN UN SOLO PASO, TRANSFERIR 3 ml. DEL DILUENTE DE CONTROL [3] AL VIAL DE CONTROL POSITIVO [2]. REEMPLAZAR EL TAPÓN ROJO, ATORNILLAR FIRMEMENTE Y A CONTINUACIÓN HOMOGENIZAR. CONTROL NEGATIVO EL DILUYENTE DE CONTROL [3] RESTANTE, TRAS LA RECONSTITUCIÓN DEL CONTROL POSITIVO [2] SE UTILIZA COMO CONTROL NEGATIVO.


CONJUGADO DOS CONJUGADOS: CONJUGADO [4] Y CONJUGADO DILUYENTE [5] SON PROPORCIONADOS. RECONSTITUIR

INICIALMENTE SÓLO UN CONJGADO. AÑADIR TODOS LOS CONTENIDOS DEL VIAL DE DILUYENTE CONJUGADO [5]

AL VIAL CONJUGADO [4]. REEMPLACE EL TAPÓN ROJO Y TAPON ROSCA. PERMITIR AL CONJUGADO [4]

DISOLVERSE COMPLETAMENTE A TEMPERATURA AMBIENTE.

NO AGITAR EL CONTENIDO DEL VIAL CONJUGADO ENÉRGICAMENTE.

REGISTRAR LA FECHA DE RECONSTITUCIÓN EN LA ETIQUETA DE LA BOTELLA.

DESCARTAR EL CONJUGADO RECONSTITUIDO DESPUES DE 1 MES.

SUSTRATO AGREGAR EL DILUYENTE DE SUSTRATO [7] EN EL SUSTRATO [6]. ASEGÚRESE DE QUE EL CONTENIDO SE HA DISUELTO COMPLETAMENTE. EL SUSTRATO RECONSTITUIDO APARECERÁ INCOLORO A COLOR VERDE PÁLIDO. SOLUCIÓN PARO LA SOLUCIÓN DE PARO [8] ESTÁ LISTA PARA USAR.

8. REALIZAR EL INMUNOENSAYO GARANTIZAR QUE TODOS LOS KITS DE LOS COMPONENTES ESTEN A TEMPERATURA AMBIENTE (20-25 ° C) ANTES DE UTILIZAR.

PASO 1: MUESTRA TRATAMIENTO TÉRMICO ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO SIMPLE TRANSFERIR 1 ml. DE LA MUESTRA DE CALDO M EN UN TUBO ETIQUETADO. REALIZAR TRATAMIENTO TÉRMICO COMO SE INDICA A CONTINUACIÓN. OTRO ENRIQUECIMIENTO TRANSFERIR 0,5 ml. DE CADA UNO DE LOS DOS TUBOS DE CALDO M PARA MUESTRA EN UN TUBO ETIQUETADO. REALIZAR UN TRATAMIENTO TÉRMICO COMO EL QUE SE DESCRIBE A CONTINUACIÓN. TRATAMIENTO TÉRMICO CALENTAR EL CALDO DE M DURANTE 15 min. EN UN BAÑO DE AGUA HIRVIENDO. ALTERNADAMENTE, COLOCAR TUBOS EN VAPOR EN UN AUTOCLAVE (100 ° C) DURANTE 15 min. (NO COLOCAR LOS TUBOS BAJO PRESIÓN.) ENFRIAR LOS TUBOS CON CALDO M A TEMPERATURA AMBIENTE.


PRECAUCION: ENFRIE LOS TUBOS RESTANTES DE CALDO M A TEMPERATURA AMBIENTE, ASÍ COMO LOS TUBOS DE ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO. ESTOS TUBOS PUEDEN UTILIZARSE PARA CONFIRMACIÓN DE MUESTRAS POSITIVAS DE ELISA MEDIANTE MÉTODOS DE PLACAS ESTÁNDAR.

PASO 2: PREPARAR LOS POZOS DE MUESTRA ABRIR LA BOLSA Y TOMAR EL NÚMERO REQUERIDO DE POZOS DE LA BOLSA SELLADA, TOMAR UN POZO PARA CADA MUESTRA, UNO PARA EL CONTROL POSITIVO Y OTRO PARA EL CONTROL NEGATIVO. PRESIONE LOS POZOS FIRMEMENTE EN SU SITIO EN EL SOPORTE PROPORCIONADO. REEMPLAZAR POZOS NO UTILIZADOS EN LA BOLSA DE PAPEL DE ALUMINIO Y CIERRE.

PASO 3: ADICIÓN DE MUESTRAS UTILIZAR UNA PIPETA NUEVA PARA CADA MUESTRA, TRANSFERIR 200µL DE ALICUOTAS, CONTROLES Y MUESTRAS DENTRO DE LOS POZOS INDIVIDUALES, RECORDANDO LA POSICIÓN DE CADA UNA DE LAS MUESTRAS EN LA HOJA DE REGISTRO PROPORCIONADA. CUBRIR LOS POZOS CON PELÍCULA DE PLÁSTICO PARAFILM E INCUBAR DURANTE 30 min. A 35-37 ° C.

PASO 4: PRIMER LAVADO UN LAVADO MINUCIOSO DE LOS POZOS ES UN PASO CRÍTICO Y ESENCIAL PARA UNA CLARA INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS. VACIADO DE LOS POZOS PARA GARANTIZAR QUE LOS POZOS NO SE DESPRENDIERON DURANTE EL LAVADO, EMPUJELOS FIRMEMENTE EN EL CONTENEDOR (SOPORTE DE POZOS). INVERTIR RÁPIDAMENTE EL CONTENEDOR (SOPORTE DE POZOS), VACIAR SU CONTENIDO EN UN RECIPIENTE DE RESIDUOS. ELIMINAR EL LÍQUIDO RESIDUAL GOLPEANDO EL CONTENEDOR (SOPORTE DE POZOS) FIRMEMENTE VARIAS VECES CARA ABAJO EN UNA PILA GRUESA DE TOALLAS DE PAPEL ABSORBENTE. ESTO ES IMPORTANTE PARA LA ELIMINACIÓN EFECTIVA DE RESIDUOS DE LA MUESTRA. RELLENAR LOS POZOS CON SOLUCION DE LAVADO UTILIZAR UNA BOTELLA CON BOQUILLA (PICETA) APLICAR UN FUERTE FLUJO DE SOLUCIÓN DE LAVADO, RELLENAR COMPLETAMENTE CADA POZO, TENIENDO CUIDADO DE NO ATRAPAR BURBUJAS DE AIRE EN LA PARTE INFERIOR DE LOS POZOS.


NOTA: LAVAR Y VACIAR COMPLETAMENTE LOS POZOS UN TOTAL DE TRES (3) VECES DESCRITAS ANTERIORMENTE.

UTILIZAR APLICADORAS DE LAVADO AUTOMATICO PARA ELISA. PUEDEN USARSE EN LUGAR DE LAVADO MANUAL. SIN EMBARGO, PARA RESULTADOS SATISFACTORIOS ES ESENCIAL QUE LOS LAVADOS ESTEN ADECUADOS PARA USARSE CON TECRA VIA.

PASO 5: ADICIONAR EL CONJUGADO Step 5: Adding the Conjugate

ASEGÚRESE DE QUE LOS POZOS ESTÁN VACÍOS ANTES DE CONTINUAR. AÑADIR 200µL DE CONJUGADO [4] A CADA POZO. CUBRIR EL CONTENEDOR (SOPORTE DE POZOS) CON PELÍCULA DE PLÁSTICO PARAFILM E INCUBAR DURANTE 30 min. A 35-37 ° C.

PASO 6: SEGUNDO LAVADO VACIAR LOS POZOS Y LAVAR VIGOROSAMENTE UN TOTAL DE CUATRO (4) VECES (NO TRES) MEDIANTE LA SECUENCIA DESCRITA ANTERIORMENTE EN EL PASO 4.

PASO 7: ADICION DEL SUSTRATO ASEGÚRESE DE QUE LOS POZOS ESTÁN VACÍOS ANTES DE CONTINUAR. AÑADIR 200µL DE SUSTRATO [6] A CADA POZO. INCUBAR A 20-25 ° C (TEMPERATURA AMBIENTE). NO INCUBAR

LOS POZOS JUNTO AL AIRE ACONDICIONADO O EN OTROS LUGARES DONDE LA TEMPERATURA PUEDE VARIAR EL

RANGO ACEPTABLE.

UN DESARROLLO DE COLOR TIENDE A CONCENTRARSE ALREDEDOR DE LOS LADOS DE LOS POZOS. AGITE

SUAVEMENTE EL CONTENEDOR PARA DISTRIBUIR EL COLOR UNIFORMEMENTE ANTES DE LEER EL RESULTADO.

INCUBAR DURANTE 10 MINUTOS Y A CONTINUACIÓN LEER LOS RESULTADOS.

PASO: 8 LECTURA DE RESULTADOS RESULTADOS PUEDEN LEERSE VISUALMENTE MEDIANTE LA CARTA DE COLORES PROPORCIONADA O CON UN LECTOR DE PLACA.

USO DE LA CARTA DE COLORES: NOTA: ANTES DE CONTINUAR, ASEGÚRESE DE QUE ESTÁ UTILIZANDO LA TARJETA DE COLOR 1. COLOQUE EL CONTENEDOR (SOPORTE DE POZOS) SOBRE UN FONDO BLANCO, A CONTINUACIÓN, COMPARAR

CADA UNO DE LOS POZOS CON LA TARJETA DE COLOR.


DESPUES DE 10 MINUTOS, SI EL COLOR DEL POZO CONTROL POSITIVO [2] ES EQUIVALENTE AL PANEL 4 EN LA

TARJETA DE COLOR, ENTONCES, CONTINUAR CON LOS PASOS 9 Y 10. CONTINUAR LA INCUBACIÓN DEL SUSTRATO

SÓLO SI EL CONTROL POSITIVO [2] HA ALCANZADO UNA ABSORBENCIA EQUIVALENTE AL PANEL 4 Y CONTINÚE

CON LOS PASOS 9 Y 10.

SI LA ABSORBENCIA NO HA LLEGADO A UN COLOR EQUIVALENTE AL PANEL 4 DESPUÉS DE 30 MINUTOS, EL

RESULTADO DE LA PRUEBA NO PUEDE SER UTILIZADA. CONSULTE LA GUÍA DE SOLUCIÓN DE PROBLEMAS ANTES

DE REPETIR LA PRUEBA.

UTILIZANDO UNA PLACA DE LECTURA

LA ABSORBENCIA DE LAS MUESTRAS SE PUEDE LEER EN 414 + 10NM UTILIZANDO UNA PLACA DE LECTURA.

LA LONGITUD DE ONDA DUAL DE LOS LECTORES DEBERÍAN SER BORRADOS CONTRA EL AIRE Y EL SEGUNDO,

LONGITUD DE ONDA "DE REFERENCIA" DEBERÍA ESTABLECERSE EN 490 + 10NM.

EL INSTRUMENTO DE LONGITUD DE ONDA SOLO DEBE CUBRIR UN POZO QUE CONTENGA 200µL DE SUSTRATO O

AGUA, O EN EL POZO DEL CONTROL NEGATIVO INMEDIATAMENTE DESPUÉS DE LA ADICIÓN DEL SUSTRATO AL

POZO.

DESPUÉS DE 10 MINUTOS, SI EL COLOR DEL POZO DEL CONTROL POSITIVO [2] TIENE UNA LECTURA DE POR LO

MENOS 1.0, PROCEDER CON LOS PASOS 9 Y 10.

CONTINUAR LA INCUBACIÓN DE SUSTRATO SÓLO HASTA EL CONTROL POSITIVO [2] SI HA ALCANZADO UN

ABSORBENCIA DE 1.0, CONTINÚE CON LOS PASOS 9 Y 10.

SI LA ABSORBENCIA NO HA LLEGADO A 1.0 DESPUÉS DE 30 MINUTOS, NO SE PUEDE UTILIZAR EL RESULTADO DE LA PRUEBA. CONSULTE LA GUÍA DE SOLUCIÓN DE PROBLEMAS ANTES DE REPETIR LA PRUEBA.

PASO 9: AGREGAR LA SOLUCIÓN DE PARO LA ADICIÓN DE LA SOLUCIÓN DE PARO [8] ES OPCIONAL, PERO DEBE AÑADIRSE SI NO SE PUEDE LEER UNA PLACA INMEDIATAMENTE. LA SOLUCIÓN DE PARO [8] ALENTARA LA VELOCIDAD DE REACCIÓN, SIN EMBARGO, LOS RESULTADOS SE DEBEN LEER DENTRO DE 30 MINUTOS DE SU ADICIÓN AÑADIR 20µL DE SOLUCIÓN DE PARO[8] A CADA POZO. TOQUE EN LOS LADOS DEL CONTENEDOR (SOPORTE DE POZOS) SUAVEMENTE PARA MEZCLAR EL CONTENIDO Y A CONTINUACIÓN, LEER EL RESULTADO EN UN PLAZO DE 30 MINUTOS.

PASO 10: INTERPRETACION DE RESULTADOS

UTILICE LA CARTA DE COLORES

PARA QUE LA PRUEBA SEA VÁLIDA:

• EL CONTROL POSITIVO DEBE SER AL MENOS TAN OSCURO COMO PANEL DE 4 EN LA TARJETA DE COLOR Y…

• EL CONTROL NEGATIVO DEBE ESTAR DENTRO DEL INTERVALO NEGATIVO EN LA TARJETA DE COLOR.


SI NO SE CUMPLEN ESTOS CRITERIOS NO PUEDEN UTILIZARSE LOS RESULTADOS. CONSULTE A LA GUÍA DE

SOLUCIÓN DE PROBLEMAS ANTES DE REPETIR LA PRUEBA.

UNA MUESTRA SE CONSIDERARÁ NEGATIVA CUANDO LA PRUEBA ES VÁLIDA Y EL POZO DE EJEMPLO TIENE UN

COLOR DENTRO DEL RANGO NEGATIVO EN LA TARJETA DE COLOR.

UNA MUESTRA SE CONSIDERARA POSITIVA CUANDO LA PRUEBA ES VÁLIDA Y EL COLOR EN EL POZO DE LA

MUESTRA ES MAYOR O IGUAL AL PANEL 3 EN LA TARJETA DE COLOR.

UTILIZANDO UN LECTOR DE PLACA PARA QUE LA PRUEBA SEA VÁLIDA:

• EL CONTROL POSITIVO DEBE HABER ALCANZADO UN ABSORBENCIA DE POR LO MENOS 1.0 Y … • EL CONTROL NEGATIVO DEBE TENER UN ABSORBENCIA DE MENOS DE 0,2. SI NO SE CUMPLEN ESTOS CRITERIOS NO PUEDEN UTILIZARSE LOS RESULTADOS. CONSULTE A LA GUÍA DE SOLUCIÓN DE PROBLEMAS ANTES DE REPETIR LA PRUEBA. UNA MUESTRA SE CONSIDERARÁ NEGATIVA CUANDO LA PRUEBA ES VÁLIDA Y EL POZO DE EJEMPLO TIENE UNA LECTURA MENOR DE 0,3. UNA MUESTRA SE CONSIDERA POSITIVA CUANDO LA PRUEBA ES VÁLIDA Y EL POZO DE EJEMPLO TIENE UNA LECTURA SUPERIOR O IGUAL A 0,3.

PASO 11: CONFIRMANDO MUESTRAS POSITIVAS CONFIRMACION DE MUESTRAS POSITIVAS POR EL METODO TECRA SALMONELLA VIA, ESTE DEBE SER CONFIRMADO MEDIANTE UNA ASADA EN CALDO M Y ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO (SI PROCEDE?) EN MEDIOS DE IDENTIFICACIÓN ESTÁNDAR Y MEDIANTE LA REALIZACIÓN DE LAS PRUEBAS SEROLÓGICAS Y BIOQUÍMICAS ESTÁNDAR. ESTO ES ESPECIALMENTE IMPORTANTE EN SITUACIONES TALES COMO PRODUCTOS DEVUELTOS.

PASO 12: ELIMINACIÓN CUANDO LA PRUEBA SE COMPLETE, AUTOCLAVEAR LOS POZOS A 121 ° C ° POR AL MENOS 30 MINUTOS O INCINERAR COMO RESIDUOS ESPECIALES. OTROS COMPONENTES DEL KIT Y LOS POZOS, PUEDEN SER ENVIADOS PARA EL RECICLAJE O ELIMINADOS DE CONFORMIDAD CON LOS REQUERIMIENTOS REGULATORIOS LOCALES


9. BIBLIOGRAFIA

1. Hughes, D., Dailianis, A. and Ash, M. (1996) Comparison of Modified TECRA Visual Immunoassay with AOAC Method 989.14 and Reference Culture Methods 967.25 - 967.28 for Detection of Salmonella in Foods and Related Samples. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 79(6): 1344-1359. 2. Hughes, D., Dailianis, A. and Hill, L. (1999) Salmonella in Foods - A New Enrichment Procedure for Use with the TECRA Salmonella Visual Immunoassay: Collaborative Study. J. Assoc. Off. Anal. Chem. Int. 82: 634-647. 3. Hughes, D., Sutherland, P.S., Kelly, G. and Davey, G.R. (1987) Comparison of the TECRA Salmonella Visual Immunoassay and standard culture methods for the detection of salmonellae in foods. Food Tech. in Aust. 39(9): 446-447, 450- 451 and 454. 4. Jay, L.S. and Comar, D. (1988) Comparative study of TECRA Salmonella Visual Immunoassay and Australian Standard cultural methods for analysis of salmonellae in foods. Food Tech.in Aust. 40(5): 186-191. 5. Lambini, M., Mavridou, A., Richardson, S.C. and Papadakis, J.A. (1990) Comparison of the TECRA Salmonella Immunoassay with the conventional culture method. Letters in Appl. Micro. 11: 182-184.25 6. Corbion, B., Fremy, S., Pires-Gomes, C., Piquet, C., Rexach,L., Pigeon, C. (1990) Detection des Salmonella dans les Aliments par six methods rapides. Management Et Technologies Alimentaires 4: 44-45. 7. Flowers, R.S., Klatt, M.J. and Keelan, S.L. (1988) Visual Immunoassay for Detection of Salmonella in Foods: Collaborative Study. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 71(5): 973-980. 8. Andrews, W.H., June, G.A., Sherrod, P.S., Hammack, T.S. and Amagnana, R.M. (1995), “Salmonella”, in FDA Bacteriological Analytical Manual (BAM), 8th Edition, Chapter 5, pp. 11-20, AOAC Int., Gaithersburg, MD 20877, USA. 9. Hughes, D., Dailianis, A. and Hill, L. “A new enrichment procedure for the TECRA Salmonella Visual Immunoassay using a single selective enrichment broth.” Poster presented at AOAC 112th Annual Meeting, Montreal, September 1998. TECRA Report #72.


10. GUIA DE SOLUCION DE PROBLEMAS

PROBLEMA CAUSA DEL PROBLEMA ACCION

CONTROL POSITIVO [2] EL POZO NO ALCANZA UN ABSORBENCIA DE 1.0 EN 30 MINUTOS

1. SUSTRATO RECONSTITUIDO [6] NO PERMITIR LLEGAR A TEMPERATURA AMBIENTE ANTES DE ADICIÓN. 2. SE HA EXCEDIDO LA FECHA DE USO 3. KIT ALMACENADOS A TEMPERATURA ELEVADA O POR DEBAJO DEL PUNTO DE CONGELACIÓN

1.- GARANTIZAR EL SUFICIENTE TIEMPO PERMITIDO PARA QUE LOS COMPONENTES DEL KIT ALCANCEN TEMPERATURA AMBIENTE. 2.- COMPRUEBE FECHA DE USO DEL KIT Y FECHA DE RECONSTITUCIÓNDEL CONJUGADO. 3.- EL KIT SE DEBE ALMACENAR ENTRE 2 ° - 8 ° C CUANDO NO ESTÁ EN USO.

CONTROL NEGATIVO [3] LOS POZOS DAN UN MAYOR ÍNDICE DE ABSORBENCIA 0,2 Y/O FALSOS POSITIVOS

1. INADECUADO LAVADO DE POZOS. 2. CONTAMINACIÓN CRUZADA CON CONTROL POSITIVO [2]. 3. EL AGUA UTILIZADA PARA LA PREPARACIÓN DE LAVADO TIENE UNA ALTA CARGA MICROBIANA. 4. LA PLACA ESTUVO DEMASIADO TIEMPO SIN LEER (PASO 7).

1.- CONSULTE LA SECCIÓN 8 (PASO 4). 2.- DEBE UTILIZARSE UNA PUNTA NUEVA PARA PIPETA PARA CADA MUESTRA. 3.- UTILICE AGUA ESTÉRIL PARA LAVADO. 4.- LEER DESPUÉS DE 10 MINUTOS. SÓLO EXTENDER LA INCUBACIÓN DEL SUSTRATO HASTA EL PC IGUAL A PANEL 4 O UN ABSORBENCIA DE 1.0.

SUSTRATO RECONSTITUIDO [6] ES VERDE OBSCURO

1. CONTAMINACION CON EL CONJUGADO [4]

1.- NO UTILICE LA MISMA PUNTA DE LA PIPETA O DISPENSADOR DE CONJUGADO Y EL SUSTRATO. PREPARAR NUEVO SUSTRATO PARA SU USO.

TODOS LOS POZOS APARECEN VERDES

1. CONTAMINACION POR PIPETA 2. INADECUADO LAVADO DE POZOS

1.- LIMPIAR LAS PIPETAS CON REGULARIDAD 2.- REFERIR A LA SECCION 8 (PASO 4) 3.- GARANTIZAR QUE LA SOLUCIÓN DE LAVADO SE RECONSTITUYÓ CORRECTAMENTE Y ALMACENE DE 2 ° - 8 ° C.

NO HAY DESARROLLO DE COLOR EN POZO DE CONTROL POSITIVO [2]

1. CONJUGADO DILUYENTE [5] UTILIZADO EN LUGAR DE CONJUGADO RECONSTITUIDO [4]. 2. EL CONTROL NEGATIVO [3] UTILIZADO EN LUGAR DE CONTROL POSITIVO [2].

GARANTIZAR LA NO UTILIZACION DEL VIAL CONJUGADO DILUENTE [5] YDEL CONJUGADO RECONSTITUIDO ESTÁN AISLADOS. 2.- COMPRUEBE QUE SE HAYA UTILIZADO EL REACTIVO CORRECTO.


RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO DE ELISA

PARA CONSULTAS:

DISTRIBUCIONES BIOTECNOLOGICAS S.A. DE C.V. DISTRIBUIDOR AUTORIZADO DE 3M MEXICO

TELS. (55) 55-60-25-58 -- 53-63-82-41 -- 53-73-60-96

[email protected]

www.distribucionesbiotecnologicas.com.mx

ADICIONAR MUESTRAS (30 min, 35-37°C)

LAVAR 3 VECES

ADICIONAR CONJUGADO (30 min, 35-37°C)

LAVAR 4 VECES

ADICIONAR SUSTRATO

(MINIMO 10 min, 20-25°C)

LEER RESULTADOS

mailto:[email protected]

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Instructivo de Salmonella Tecra 3m