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INTERAOPLANTA-INSETOPESQUISA

Adaptao dos insetos aos inibidores de proteinases produzidos pelas plantas

Figura 1. Pragas de importncia econmica. A) Lagarta da ma do algodoeiro(Heliothis virescens). B) Broca da cana-de-acar (Diatraea saccharalis). C)Lagarta da soja (Anticarsia gemmatalis). D) Lagarta do algodoeiro (Alabamaargillacea). Fotografias cedidas por Heraldo Negri de Oliveira (Depto deEntomologia ESALQ/USP)

A

B

D

C

co-evoluo de inibido-res de proteinases (IPs) deplantas e proteinases deinsetos fornece um inte-ressante e novo paradig-

ma para pesquisas ecolgicas, fisiolgi-cas e bioqumicas. As plantas parecemter desenvolvido IPs com extraordin-rias propriedades contra proteinasesde insetos. Eles so extremamente re-sistentes protelise e permanecemativos sob diversos pHs intestinais(Christeller et al., 1994), alm de seridentificados como inibidores contraquase todas as classes de proteinases.Os IPs tendem a ser sensivelmenteamplos em seus campos de ao, e hindicaes que eles tm propriedadesparecidas com a dos anticorpos paraprecipitar proteinases intestinais, reti-rando-as da soluo. Por outro lado, aspragas conhecidas apresentam diver-sas formas de evitar os efeitos negati-vos dessas protenas de defesa presen-tes nas plantas hospedeiras. Estas in-cluem o uso de proteinases para asquais as plantas hospedeiras no te-nham inibidores, a degradao proteo-ltica de inibidores, e mutaes adqui-ridas que resultam em proteinasesmenos sensveis aos IPs sem a perda daatividade proteoltica. Alm disso, omonitoramento de mecanismos de ati-vidade proteoltica, aparentemente levapara uma rpida resposta aos altosnveis de IPs na dieta. A expresso deproteinases insensveis aos IPs pareceser flexivelmente regulada para com-pensar as proteinases inibidas.

Controle de InsetosEstima-se que as perdas provoca-

das por pragas e doenas na agriculturamundial atinjam 37% da produo, dosquais cerca de 13% devido a insetos(Fig. 1). Atualmente os mtodos decontrole concentram-se basicamente

Marcio Castro Silva-FilhoProf. Dr. da Escola Superior de Agricultura Luiz de

Queiroz (ESALQ/USP)Departamento de Gentica

Laboratrio de Biologia Molecular de Plantasmdcsilva@carpa.ciagri.usp.br

Maria Cristina FalcoPs-Doc. do Departamento de Gentica

da ESALQ/USPmcfalco@carpa.ciagri.usp.br

Fotos cedidas pelos autores

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Tabela 1. Propriedades cinticas e peso molecular de diferentes atividadestrpticas presentes em lagartas alimentadas com dieta artificial e base de folhas

Dieta base de folhas a Dieta artificialEnzima

T1T2T3T4

Km (mM)0,270,352,415

Peso Molecular (kDa)70672917

Km (mM)--

2,9*

Peso Molecular (kDa)--

2917

a Folhas de fumo transgnico e no transgnico apresentaram os mesmos resultados* Atividade no detectada

Figura 2-Esquema representativo da ligaode uma serino-proteinase (tripsina)ao inibidor correspondente(Adaptado de Bode & Huber, 1992)

na utilizao de agroqumicos dentrode um manejo integrado de pragas.Entretanto, h uma grande demandapor parte da sociedade pelo desenvol-vimento de uma agricultura limpa, quediminua o uso de energia e produtosqumicos, que no deixe resduos inde-sejveis no meio ambiente e nos ali-mentos, alm de reduzir as contamina-es aos agricultores. Entre as alternati-vas para contornar estes problemas es-to o controle biolgico e o uso devariedades resistentes.

Com o desenvolvi-mento das tcnicas debiologia molecular quepermitem a manipula-o de genes de inte-resse, aliadas s meto-dologias de transfor-mao gentica deplantas, uma nova einteressante aborda-gem no controle deinsetos vem atraindo aateno de pesquisa-dores em todo o mun-do. Genes que codifi-cam para protenascom atividade insetici-da tornaram-se umaarma bastante pode-rosa e com um amplopotencial de utilizao.Por outro lado, estu-dos envolvendo a in-terao entre as plan-tas hospedeiras com seus insetos, nota-damente as pragas, no se desenvolve-ram com a mesma intensidade. Um dossistemas mais fascinantes envolvendoesse tipo de interao baseado nosestudos com inibidores de proteinasesproduzidos pelas plantas e insetos her-bvoros.

Inibidores de Proteinases dePlantas Contra Insetos Herbvoros

Sabe-se h mais de 60 anos que asplantas contm peptdeos que atuam

como inibidores de proteinases (IPs).Este grupo de protenas est amplamen-te distribudo no reino vegetal e fazparte de um mecanismo de defesa dasplantas contra o ataque de pragas epatgenos (Richardson, 1991). As pro-tenas de defesa podem ser produzidasconstitutivamente em tecidos que soparticularmente vulnerveis ao ataquede insetos, como as sementes, ou po-dem ser induzidos por danos mecni-cos, como ocorre quando um inseto sealimenta de uma folha (Jouanin et al.,

1998). Entretanto, muitas delas so txi-cas tambm a mamferos, o que indicaque devam ser cautelosamente estuda-das para uso como mecanismo de pro-

teo de plantas a insetos.De acordo com sua especificidade,

as proteinases podem ser divididas emquatro classes: as serino-, cisteno-, me-talo- e aspartil-proteinases. Os IPs maisabundantes e estudados so aquelescapazes de inibir as serino-proteinases,grupo das tripsinas e quimotripsinas,enzimas encontradas majoritariamenteem insetos da ordem Lepidoptera (Ter-ra & Ferreira, 1994). Os inibidores deserino- e cisteno-proteinases so am-plamente distribudos em sementes etecidos de reserva de plantas. Portanto,alm de protegerem as plantas contra oataque de insetos, os IPs so utilizadoscomo protenas de reserva em algumassementes.

O mecanismo de ao de um IPbaseia-se na inibio competitiva deuma proteinase, via bloqueio de suaatividade proteoltica (Fig. 2). A inges-to de IPs pelos insetos herbvorosinterfere no processo de degradao deprotenas no intestino mdio. Assimsendo, os inibidores so considerados

agentes anti metablicos, poislevam a uma deficincia pro-tica dos insetos. A atividadeantibitica dos IPs atribuda sua interferncia na diges-to protica que diminui adisponibilidade de aminoci-dos, prejudicando a sntesede protenas necessrias aocrescimento, desenvolvimen-to e reproduo. Uma outrahiptese que os inibidoresafetem o desenvolvimento deforma indireta, via um meca-nismo de feedback, quelevaria a um aumento da pro-duo de proteinases digesti-vas para compensar os bai-xos nveis de aminocidosdisponveis. Os aminocidosseriam deslocados para a sn-tese de proteinases em detri-mento de outras protenasessenciais. Entretanto, inves-

tigaes mais recentes mostraram que adeficincia de aminocidos essenciaisresultantes da hiperproduo de protei-nases em lagartas de Spodoptera exiguae Heliothis zea deveu-se reduo daatividade proteoltica intestinal (Broa-dway, 1995).

Uma vez estabelecido que os IPs soproduzidos pelas plantas em respostaao ataque de pragas, suas propriedadesantimetablicas foram testadas contradiversos insetos. Resultados in vitro ba-

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Figura 3.Separao das tripsinas (n)e qui-motripsinas () presentes em extra-to intestinal de Spodoptera frugiper-da alimentadas com dieta artificial(A) e com dieta artificial suplemen-tada com 0,5 % (p/v) de IPs extra-dos de sementes de soja (B)

seados na combinao de extra-tos intestinais com diferentes ini-bidores, mostraram que os IPsforam efetivos na inibio dasproteinases digestivas. Alm dis-so, a incorporao de IPs emdietas artificiais mostrou-se efi-ciente em vrios estudos. Destaforma, foram obtidas plantastransgnicas resistentes a pragasvia expresso de genes de IPs(Hilder et al., 1987; Duan et al.,1996; Gatehouse et al., 1997).

Paralelamente aos resultadospositivos com as plantas trans-gnicas, um nmero crescentede trabalhos mostrou que osinsetos eram capazes de adap-tar-se presena dos inibidoresproduzidos pelas plantas (parauma reviso, veja Jongsma &Bolter, 1997).Mecanismos de Adaptaodos Insetos aos Inibidores

de ProteinaseEm um trabalho pioneiro,

Jongsma e colaboradores (1995a)observaram que lagartas de Spodopte-ra exigua adaptaram-se presena deIPs expressos em plantas transgnicasvia induo de proteinases insensveisao inibidor. A partir de ento, estasobservaes foram extendidas umaampla gama de insetos-praga. No en-tanto, um outro mecanismo adaptativobaseado na sntese de proteinases ca-pazes de inativar, via degradao pro-teoltica, os IPs produzidos pelas plan-tas foi descrito por outros grupos (Giriet al., 1998; Girard et al., 1998).

O Laboratrio de Biologia Molecu-lar de Plantas do Departamento deGentica da ESALQ/USP iniciou, re-centemente, estudos envolvendo o usode IPs visando a obteno de resistn-cia a pragas de importncia econmi-ca. Os trabalhos tambm tiveram comoobjetivo o estudo a nvel molecular dainterao entre plantas de interesseeconmico e insetos herbvoros. Oprimeiro trabalho avaliou os efeitos dapresena do inibidor de proteinase dotipo 2 de batata (PIN-2) em plantastransgnicas de tabaco, sobre o desen-volvimento, metabolismo e proteina-ses intestinais da lagarta da ma doalgodoeiro, Heliothis virescens (Brito etal., submetido). Os ensaios biolgicos,realizados com apoio do Departamen-to de Entomologia da ESALQ/USP mos-traram no haver diferenas significati-vas quando comparados com o trata-

mento base de plantas no transfor-madas. Estas observaes levaram hiptese de uma adaptao deste inse-to ao inibidor. A fim de estudar opossvel mecanismo adaptativo daslagartas, foram caracterizadas as pro-teinases digestivas dos insetos, comapoio do Laboratrio de Bioqumicade Insetos do Departamento de Bio-qumica do IQ/USP. Assim, as lagartasforam submetidas a trs dietas distin-tas: 1) base de folhas de plantastransgnicas de fumo, 2) folhas deplantas de fumo no transformado e,3) dieta artificial sem a presena de IPs.A combinao de tcnicas de separa-o de protenas e estudos cinticos,revelaram a presena de duas tripsinase uma quimotripsina no tratamentos base de dieta sem inibidor. No entan-to, em lagartas alimentadas base defolhas transgnicas ou no, foram de-tectadas quatro atividades trpticas,sendo que duas eram totalmente no-

vas (Tab. 1). Uma nica atividadede quimotripsina foi observada.Uma observao interessante foique as novas tripsinas apresenta-vam pesos moleculares bem su-periores aos demais e maior afini-dade pelo substrato. A filtraoem gel na presena ou ausnciade SDS, revelou que as tripsinasde alto peso molecular seriamoriginadas a partir das tripsinas demenor peso recm sintetizadas,via um processo de oligomeriza-o. Portanto, trata-se de mais umnovo mecanismo de adaptaodos insetos aos IPs produzidospelas plantas.

Novas evidncias de adapta-o dos insetos presena deinibidores de proteinases foramverificadas em um estudo envol-vendo um outro inseto polfago(mltiplos hospedeiros), a lagartado cartucho do milho, Spodopterafrugiperda, e inibidores de serino-proteinases extrados de soja.

Os inibidores de proteinase desoja Bowman-Birk e Kunitz foramincorporados em dietas artificiais queforam utilizadas na alimentao daslagartas desde as primeiras fases dodesenvolvimento. Embora os ensaiosde inibio in vitro tenham mostradouma alta eficincia contra as proteina-ses da lagarta, os ensaios biolgicosmostraram que no houve alteraessignificativas no desenvolvimento emetabolismo de lagartas alimentadascom dieta artificial contendo inibido-res extrados da soja. Esse fato levou investigao do mecanismo respons-vel pela adaptao dos insetos pre-sena dos inibidores. Para isso, foramanalisados extratos intestinais das la-gartas alimentadas com dietas conten-do os inibidores. O mecanismo adap-tativo desenvolvido pelas lagartas de S.frugiperda estava relacionado altera-o na expresso das serino-proteina-ses. Os resultados mostraram o apare-cimento de uma nova atividade trpticae um aumento significativo na ativida-de quimotrptica do inseto (Fig. 3). Apolifagia do inseto pode ter facilitadoo desenvolvimento de proteinases quetenham reduzida afinidade aos IPs dasoja. Como a eficincia de um inibidorespecfico dependente da compatibi-lidade estrutural do seu stio reativocom o stio ativo da proteinase, provvel que as enzimas digestivastenham sofrido alteraes nos amino-

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Figura 4.A metodologia do Phage Display(Adaptado de Webster, 1996)

cidos que circundam o stio de ligao,resultando em uma fraca interao comos inibidores (Paulillo et al., no prelo).

Perspectivas na Utilizao deInibidores de Proteinases no

Controle de InsetosAo se considerar a possibilidade de

produzir plantas transgnicas expres-sando IPs, algumas consideraes sefazem necessrias a fim de aumentar aschances de sucesso. Entre estas, inclu-em-se os nveis de expresso do IP, suaconstante de inibio, a estabilidade doIP no intestino do inseto e a habilidadede adaptao do inseto aos inibidoresvia alterao da expresso gnica. Fato-res ambientais secundrios tambm po-dem interferir na severidade dos sinto-mas. Como os IPs agem causando umadeficincia na disponibilidade de ami-nocidos, a digestibilidade do alimento,a concentrao e a qualidade pro-tica da dieta sero determinantespara maximizar os efeitos dos IPssobre os insetos. Alm disso, in-meros compostos fitoqumicospresentes ou induzidos pelas plan-tas tambm apresentam potencialde alterar a toxicidade dos IPssobre os insetos hospedeiros (Bro-adway & Duffey, 1988).

A presso de seleo sobre osinsetos para desenvolver protei-nases que so insensveis aos IPsde plantas hospedeiras so consi-derveis e a evoluo de insetosem muitas geraes por ano ofere-ce uma vantagem significativa so-bre as plantas. Mas, alm das altasconcentraes de inibidores, asplantas podem encontrar alterna-tivas de melhorar a eficcia deseus inibidores envolvendo multi-domnios ou variantes multimri-cos. Isso antes regra que exceoentre os IPs vegetais, e uma amplagama de combinaes observa-da. Alm de serem encontradosinibidores com stios ativos repeti-dos, comum encontrar inibido-res de serino-proteinases em com-binaes com inibidores de ciste-no-, aspartil-proteinases e amila-ses (Richardson, 1991). Isto, porum lado, parece uma eleganteforma de economizar protenas,mas o significado desses mltiplosstios pode ser muito mais comple-xo. Ferreira et al. (1994) tm demonstra-do que as enzimas digestivas de insetosocorrem muitas vezes em formas multi-mricas. Jongsma & Bolter (1997) pro-

pem que os efeitos da combinao deinibidores multimricos com enzimasmultimricas em quantidades equimo-lares devem ser muito similar aos anti-corpos policlonais e antgenos com ml-tiplos epitopos.

Os insetos polfagos so um casointeressante. Ao longo da evoluo,estes insetos desenvolveram a capaci-dade de atacar uma grande variedadede espcies vegetais, incluindo mono edicotiledneas. Consequentemente, elesforam capazes de responder a umagama de diferentes inibidores vegetais.Isso vai de encontro aos resultadosobtidos pelo nosso grupo e descritosacima. Recentes experimentos com plan-tas transgnicas utilizando genes de IPsde monocotiledneas expressos em di-cotiledneas e vice-versa, sugeriram queaqueles insetos que normalmente se

alimentam de mono ou dicotiledneasso capazes de se adaptar a IPs dediversos tipos de plantas (Lepl et al.,1995). Para contornar estes problemasde adaptao, seria interessante utilizarIPs de espcies vegetais bastante sepa-radas evolutivamente daquelas cujosinsetos so predadores. Duan et al.,(1996) demonstraram que isso poss-vel a partir da obteno de plantastransgnicas de arroz expressando oinibidor de proteinase do tipo 2 debatata. Os autores mostraram que asplantas transgnicas foram protegidascontra o ataque da praga Sesamia infe-rens.

Esta possibilidade est sendotestada no nosso laboratrio com abroca da cana-de-acar (Diatraea sac-charalis) e os inibidores de proteinasesde soja (Kunitz e Bowman-Birk). Os

resultados da caracterizao dasproteinases das lagartas, seguidoda realizao de ensaios biolgi-cos com a incorporao dos IPsde soja em dieta artificial, mos-traram-se muito promissores (Pa-trcia Pompermayer, comunica-o pessoal). Assim, os genesque codificam para os IPs da sojaforam clonados e utilizados natransformao gentica da cana-de-acar (Maria Cristina Falco,comunicao pessoal).

Uma outra alternativa seria agerao de novas molculas deinibidores de proteinases espe-cficos contra enzimas de pragasde importncia econmica. Estaestratgia pode ser testada utili-zando-se IPs engenheirados, comsuas afinidades otimizadas pormodelos computacionais, comodescrito por Urwin et al. (1995),ou por phage display, comoproposto por Jongsma et al.(1995b). Na metodologia dophage display, mltiplas sequ-ncias de genes inibidores, quediferem apenas no stio da prote-na que interage com a proteina-se do inseto so geradas, utili-zando-se a tcnica da Reao daPolimerase em Cadeia -PCR eoligonucleotdeos degenerados.A biblioteca clonada em umfagomdeo ou um vetor M13fusionado ao gene da capa pro-

tica - g3 - do fago, que expe asprotenas em sua superfcie. Esses fagosso selecionados contra uma protenade interesse (proteinase digestiva de D.

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saccharalis, por exemplo), imobilizadaem suporte slido (uma placa Elisa, p.ex.). Subseqentes lavagens eliminamos fagos sem ou com pouca afinidade.As partculas do fago com alta afinidadeso selecionadas para transformao deE. coli, fornecendo novos genes e codi-ficando inibidores de proteinase maisespecficos (Fig. 4). Essa metodologiafoi utilizada para a famlia de inibidoresdo tipo Kunitz, gerando inibidores po-tentes e especficos contra vrias protei-nases do tipo serina (Roberts et al.,1992; Dennis & Lazarus, 1994). Estaestratgia vem sendo explorada emnosso laboratrio com o IP Bowman-Birk de soja, dirigido contra as protei-nases digestivas da broca da cana-de-acar, D. saccharalis (Marcia O. deMello, comunicao pessoal).

Provavelmente algum meca-nismo adaptativo ocorrer, apesar dautilizao desta tecnologia. O que seprocura, na verdade, que esta adapta-o seja mais lenta, de forma a permitirum maior tempo de cultivo sem que apresena dos insetos cause danos eco-nmicos significativos cultura. A utili-zao de vrios mtodos de controledentro do manejo integrado de pragas,a diversificao do material cultivado,de forma a diminuir a presso de sele-o sobre a praga, rotao de culturas eprticas culturais, retardariam o apareci-mento de insetos resistentes.

A maioria das pesquisas atuais estofocadas na expresso de inibidores deproteinases nicos em plantas transg-nicas. O sucesso deve ser mais significa-tivo quando combinaes de IPs cobri-rem o espectro de proteinases intesti-nais. Isto tornar mais difcil para oinseto superar os efeitos dos IPs sim-plesmente aumentando a expresso degenes de proteinases insensveis aosIPs. Alguns desses genes podem serencontrados na natureza, mas a enge-nharia gentica tem permitido alter-losde forma a torn-los mais eficientes.

Na verdade, necessrio compre-ender melhor o modo de ao dos IPssobre os insetos e as formas pelas quaiseles se adaptam. Esta promete ser umalinha de pesquisa com muito espaopara crescer nos prximos anos.

AgradecimentosAgradecemos a colaborao dos pro-

fessores Walter R. Terra (Depto. deBioqumica, IQ/USP) e Jos Roberto P.Parra (Depto. de Entomologia, ESALQ/USP), FAPESP pelo suporte financeiro,ao Bilogo Heraldo Negri de Oliveira

(Depto. de Entomologia, ESALQ/USP),pelas fotografias.

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