Interações Ag-Ac: reações sorológicas e testes

sorológicos secundários

Viviane Mariguela- pós-doutoranda

Relembrando...

Anticorpo

Moléculas secretadas pelas células B em

resposta a um imunógeno (RIH)

Antígeno/Epítopo

Antígenos- moléculas reconhecidas pelo sistema imune.

Epítopos ou determinantes antigênicos- são sítios nos antígenos aos quais os receptores de antígenosreconhecem/ligam.

Interação Ag-Ac: Conceito Inicial

É uma associação bimolecular semelhante à interação de enzimas com seus substratos ou de hormônios com seus receptores, com uma distinção bem evidente o Ac não provoca nenhuma alteração química irreversível na molécula de Ag, podendo, portanto, o produto formado (Ag-Ac) se dissociar nos seus 2 componentes; isto é, Ag e Ac livres na solução.

Ag + Ac AgAc (Imunecomplexos)

Natureza das reações Ag/Ac

• Ligações não-covalentes

– Pontes de Hidrogênio – Ligações Eletrostáticas – Forças de Van der Waals – Ligações Hidrofóbicas

• Reversível

• Ligações Múltiplas

Source: Li, Y., Li, H., Smith-Gill, S. J.,

Mariuzza, R. A., Biochemistry 39, 6296, 2000

http://www.med.sc.edu:85/chime2/lyso-abfr.htm

• Conceito de chave e fechadura

Especificidade

É a habilidade do anticorpo em distinguir seu

imunógeno de outros antígenos.

Fatores que Afetam as Reações Ag/Ac

• Afinidade

• Avidez

• Relação [Ag]:[Ac]

• Forma física do Ag

(solúvel ou particulado)

Excesso de Ac Excesso de Ag

Equivalência – formação de rede

IMUNODIAGNÓSTICO

Diagnóstico laboratorial realizado por meio de técnicas imunológicas.

Busca: Anticorpo ou Antígeno no organismo vertebrado suspeito de estar infectado usando ensaios / reações sorológicas.

ENSAIOS SOROLÓGICOS

Primários detectam a interação direta entre antígeno e

anticorpo: Ex. Radioimnoensaio, Imunofluorescência,

ELISA.

Secundários detectam conseqüências da interação entre

antígeno e anticorpo mudanças no estado físico do

antígeno: Imunodifusão, Aglutinação, Precipitação, Fixação

de Complemento.

Van Oss, 2000; Janeway, 2001

Ac + Ag Ac-Ag K1

K2

K1 = 1010 M-1 alta afinidade

Testes Baseados nas Reações Ag/Ac

• Todos os testes baseados nas reações Ag/Ac

dependerão da formação de rede ou eles

terão de utilizar outras vias para detectar

pequenos complexos imunes

• Todos testes baseados nas reações Ag/Ac

podem ser usados para detectar o Ag ou Ac

LIMIAR DE DETECÇÃO OU

SENSIBILIDADE ANALÍTICA

DE ALGUMAS REAÇÕES

SOROLÓGICAS

LIMIAR DE DETECÇÃO OU

SENSIBILIDADE ANALÍTICA

DE ALGUMAS REAÇÕES

SOROLÓGICAS

TESTES DE LIGAÇÃO

PRIMÁRIA

• RIE 0,00005 g/ml

• ELISA 0,0005 g/ml

TESTES DE LIGAÇÃO

SECUNDÁRIA

• HEMAGLUT. PASSIVA 0,01 g /ml

• RFC 0,05 g/ml

• AGLUT. BACTÉRIAS 10,05 g /ml

• PRECIPITAÇÃO GEL 30,00 g/ml

Testes de Aglutinação

Formação de rede

Testes de Aglutinação: – simples, baratos, um pouco mais sensíveis!

Teste qualitativo ou quantitativo

Existem Vários Tipos:

a) Hemaglutinação de Eritrócitos

b) Aglutinação Bacteriana

c) Aglutinação Passiva

d) Inibição da Aglutinação (Inib. Hemaglutinação – HI)

2) Reagente (anticorpo anti A, B):

AGLUTINAÇÃO DIRETA

1) Amostra de sangue na placa teste:

Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO)

Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação

26

4) Controle negativo:

3) Mistura-se:

5) Leitura do resultado:

Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação visível (aglomeração dos eritrócitos na placa teste), como ilustrado acima.

negativo positivo

Porque o SI gera resposta se não entramos previamente em contato com outro tipo

sanguíneo?

Determinação de Grupos

Sanguíneos – Sistema ABO

AGLUTINAÇÃO PASSIVA

AGLUTINAÇÃO INDIRETA PASSIVA

Exemplo: Hemaglutinação Passiva para a Doença de Chagas:

• As hemácias são revestidas com Ag do T. cruzi (ligação

covalente) e então distribuídas nos poços da placa.

• O soro teste e os controles positivos e negativos, devidamente

diluídos, são adicionados aos poços da referida placa.

• Se houver Ac específico contra o Ag, as hemácias se

aglutinam e formam uma camada no fundo do poço. Quando

não existe Ac específico, as células formam um botão no fundo

do poço.

Aglutinação Positiva

Negativa

Ag solúveis associados a outras superfícies

(Partículas de látex ou superfície de hemácias)

32

Exemplo: presença de hCG na urina (gravidez)

INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO

+

Soro anti - hCG Urina

São incubados e

colocados numa

placa

Adicionam-se Partículas revestidas

com hCG

Resultado positivo:

(presença de hCG

na urina): não ocorre

aglutinação.

Ac se ligaram no hCG da urina,

(ficando bloqueados), na incubação inicial

Resultado negativo:

(ausência de hCG na

urina).

Ocorre aglutinação, pois

os anticorpos anti-hCG

não são bloqueados na

incubação inicial,

porque não havia o

hormônio na urina.

Livres, podem aglutinar

as partículas revestidas

de hCG.

• Teste de aglutinação quantitativa

– Título

– Efeito Prozona 1/2

1/4

1/8

1/1

6

1/3

2

1/6

4

1/1

28

1/2

56

1/5

12

1/1

02

4

Pos.

Neg

.

Título

64

8

512

<2

32

128

32

4

Paciente

1

2

3

4

5

6

7

8

-Aglutinação Bacteriana

-As infecções bacterianas frequentemente induzem a

produção de Acs séricos específicos para Ags de superfície

das Bactérias.

-A presença de tais Acs pode ser detectada pelas reações de

aglutinação bacteriana.

-Os títulos dos Acs séricos de um indivíduo suspeito é

definido como a recíproca da maior diluição do soro que

produz uma reação positiva de aglutinação.

-O título aglutinante de um soro pode ser usado para o

diagnóstico de infecções bacterianas.

Um exemplo de teste de soro-

aglutinação com partículas é o teste

de Látex de aglutinação ou de

aglutinação bacteriana.

Ag Bacteriano Acs Anti-bacterianos

(+) (-)

Teste de Coombs

Testes de Precipitação

- Formação de rede

- Tipo de Ags: Macromoléculas Solúveis

- Principais Acs envolvidos: IgG* e IgM

- Formação de Precipitado dos Imunocomplexos

- Maior formação de precipitado de

imunecomplexos na zona de equivalência entre as

concentrações de Ag e de Ac

Reações de Precipitação:

-Acs e Ags em soluções aquosas formam uma rede/malha =>Precipitação A formação da rede requer: 1) Acs polivalentes 2) Ags devem ser bivalentes / polivalentes

Testes de Precipitação: – simples, baratos, mas específicos!

e pouco sensíveis!!!

Não Precipitação Precipitação +

Curva de Precipitação

TÉCNICAS DE DIFUSÃO EM GEL

IMUNODIFUSÃO

• Coloca-se agarose sobre uma lâmina:

Imunodifusão Dupla:

• Faz-se em seguida, pequenos orifícios no gel e são adicionadas as soluções

testes de Ag e Ac, como por exemplo, é mostrado abaixo:

Ac

Ac

Ag Ag

Ac

Ag Ag

42

Ac

Ag Ag

Utilização: muito usada em

pesquisa e diagnóstico de

algumas doenças, como

cisticercose

• As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela formação de uma linha de precipitação:

• Pode ser visualizada pós lavagem do gel , para remoção das proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com corante

Técnica de Imunodifusão Dupla

em Gel deÁgar - IDGA

• Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica.

• As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com os seus PM e cargas elétricas.

• Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se difunde.

• Ag e Ac formam arcos de precipitação.

IMUNOELETROFORESE

50

+ -

Ag

Ag

1- Separação de antígenos 2- Anti-soro na coluna

canaleta

2- Anti-soro na canaleta

canaleta

3- Difusão e precipitação

Immunoelectrophoresis reveals the presence of several distinct

immunoglobulin isotypes in normal human serum.

Eletroforese contra corrente ou

contra-imuno-eletroforese • Método

– Ag e Ac migram em direção ao outro pela eletroforese

– Usado somente quando o Ag e o Ac têm cargas opostas

• Qualitativa –Rápida

Ag Ac

- +

Ensaio baseado no complemento

LIMIAR DE DETECÇÃO