Intérêts de limmunofluoresence et des méthodes moléculaires pour le diagnostic de pneumocystose

Intérêts de l’immunofluoresence Intérêts de l’immunofluoresence et des méthodes moléculaires et des méthodes moléculaires

pour le diagnostic de pour le diagnostic de pneumocystosepneumocystose

- MGG- calcofluor- Gomori-Grocott- bleu de toluidine

En particulier avec les prélèvements « pauvres » : expectorations ou patients non sidéens

Méthodes par Méthodes par colorationcoloration

ImmunofluorescenImmunofluorescencece

Lim, Lim, Applied microbiologyApplied microbiology , 1974 , 1974

- 108 ech patients immunodéprimés clinique/radio suggérant PCP- crachats induits ou aspirations tracheales- IFD : Ac obtenus chez le lapin

Clinique et/ou radioNbre patients avec IFD

+ - total

Très en faveur de PCP

25 10 35

Suggestifs de PCP 8 25 3

Négatifs (contrôles) 3 47 50



Histologie(methenamine-silver sur

biopsie)

Nbre patients avec IFD

+ - total

+ 9 0 9

- 2 4 6

total 11 4 15



bonne spécificité de la technique : pas de confusion possible gain de sensibilité p/t à la méthode de référence de l’époque ? (anapath.)


Milder, Milder, J. Clin. Microbiol.J. Clin. Microbiol. , 1980 , 1980

- rats immunodéprimés par injections sc de cortisone 2/semaines.- sacrifice de 4 rats toutes les semaines

* biopsie de poumon : Gomori-Grocott* LBA : Giemsa et IFI (Ac obtenus chez le lapin)



0

1

2

3

4

1 2 3 4 5 6 7

Semaines

No

mb

re r

ats

po

sit

ifs

IFI

Giemsa

histologie



au moins aussi sensible que l’histologie pour le diagnostic très précoce de l’infection. sensibilité très supérieure au Giemsa sur LBA pas de problème de spécificité.


Procop, Procop, J. Clin. Microbiol J. Clin. Microbiol 20042004

- 313 échantillons examinés (LBA ++). Diff-Quick, Gomori-Grocott, Calcofluor, Merifluor White® (IFD)- echantillon considéré + si positif avec 2 techniques au moins.

techniquetechnique SensibilitéSensibilité SpécificitéSpécificité VPPVPP VPNVPN

Diff-Quick 48.4 99.6 96.9 88.0

Calcofluor 73.8 99.6 98.0 93.4

Gomori 76.9 99.2 96.2 94.2

IFD 90.8 94.7 81.9 97.5


NgJ. Clin Microbiol, 1990

182 ech(VIH ou « à risque »)

IFI : 90 %DQ : 73 %Gomori : 72%Bleu toluidine : 71 %



IFD : 97 %DQ : 90 %

Halford, Cytopathology, 1994

384 echIFD : 86 %Gomori-Grocott : 66 %

Wolfson, J. Clin Microbiol, 1990

148 ech double aveugle

IFD : 100%Giemsa : 65%

Aslanzadeh, Infection, 1996

168 echIFD : 100%CW : 57%


Elvin, BMJ, 1988 (abstract)

25 LBA VIH+

43 IS VIH+

IFI : 19 +Gomori-Grocott : 17+

IF > Gomori

Rigole, Pathol. Biol. 1997 (abstract)

100 LBA IDIFD : 72 +Gomori-Grocott : 68 +

Tuncer, Scand J Infect Dis. 1998 (abstract)

30 IS ID IF : 8 +Giemsa et Gomori : 4 +


Lautenschlager, J Clin Microbiol, 1996

553 LBA IDIF : 86%Gomori-grocott : 81%

Aslanzadeh, Infection, 1996 : - 168 prélèvements respiratoires dont 58% VIH- IFD : 19+ dont 12 crachats, 1 crachat induit et 6 LBA

(100%) CFW : 11+ dont 6 crachats et 5 LBA (57%)

Gain de sensibilité avec l’IF notamment pour les expectorations.


Cruciani Eur Respir J. 2002- méta analyse : comparaison de l’analyse d’un crachat

induit par rapport au LBA (« gold standard ») chez les VIH+.

- colorations : 43 % colorations : 43 % IF : 67 % (p<0.001)IF : 67 % (p<0.001)

L’IF est nettement plus sensible pour les crachats induits (VIH+).



Kovacs, Kovacs, N. Engl. J. Med. N. Engl. J. Med. 1988 (abstract)1988 (abstract)

- 49 crachats induits de patients présentant une PCP (confirmée a posteriori compte tenu des colorations, la clinique, l’évolution sous traitement)

IFI : 92 %Bleu de toluidine : 80 %Diff-Quick : 76 %





Evaluation des FP avec l’IFI : 15 patients + uniquement avec IFI

3 patients PCP certaine (réponse au tt anti-Pj) 6 patients indéterminés 6 ont autre cause et n’ont pas été traités pour Pj

Evaluation des FN avec toutes les méthodes : 77 patients – 57 Vrais négatifs 10 patients indéterminés 10 Faux négatifs (réponse au tt anti-Pj)





MéthodeMéthode SensibilitSensibilitéé

SpécificitSpécificité é VPPVPP VPNVPN

DQ 72 100 100 69

GMS 75 100 100 72

TBO 74 100 100 71

IFI 80 90 93 74




IFD : 97 %DQ : 90 %

MéthodeMéthode SensibilitSensibilitéé

SpécificitSpécificité é VPPVPP VPNVPN

DQ 70-100 100-100 100-100 65-100

IFD 72-100 100-96 100-92 69-100

(Crachats induits – LBA)


difficulté de conclure en l’absence de « gold standard »

IF : bonne sensibilité, a priori supérieure à celle des techniques de coloration classique. Permet de « rattraper » certains cas. Intéressant en particulier pour les expectorationns

deux techniques sont indispensables. FN de toutes les techniques FP de l’IF

décrite comme plus rapide d’execution (p/t Gomori) et surtout plus rapide et plus simple à lire.

pas de problème de spécificité : Spécificité des Ac monoclonaux, et reconnaissance « facile » des kystes ?


Une capacité de détection supérieure …Une capacité de détection supérieure …

Dilution des LBA : comparaison capacité de détection x 100 p/t Gomori (Ribes, J Clin Microbiol, 1997 )x 1000 p/t IFD (Leigh et all, J Clin Pathol, 1993)

PCRPCR

Brancart,J Microbiol Methods 2005 (abstract)

53 LBAGiemsa et IFD : 8+PCR : 24+

Arcenas, Diag Microbiol Infect Dis (abstract) 2006

Gain de sensibilité de 21% Spécificité.

RibesJ Clin Microbiol, 1997

129 ech

Gomori : 37+PCR : 60+

Caliendo, J Clin Microbiol, 1998

232 ech

Crachats induits : IF : 64 % PCR : 96 %

Leibovitz, J Clin Microbiol, 1995

284 ech

Crachats induits : Giemsa et GMS : 28 % PCR : 85 %

PCRPCR


Khan, J Infect, 2000 (abstract)

46 echIF : 2+PCR : 11+ nPCR : 21+

TamburriniJ Med Microbiol, 1993 (abstract)

52 LBAIFD : 81%PCR : 100%

PCRPCR


Caliendo, J Clin Microbiol, 1998

232 ech

LBA : IF et PCR : 100 %

Leibovitz, J Clin Microbiol, 1995

284 ech

LBA : Giemsa et GMS : 82 % PCR : 86 %

PCRPCR


… … pas toujours … pas toujours …

Un certain nombre de Faux Neg de la PCR sont post-traitement.

Leigh et all, J Clin Pathol, 1993

Mauvaise extraction de l’ADN

Toutes les methodes ne se valent pas …(Lu, J Clin Microbiol, 1995)sensibilité de 6 méthodes PCR : 100%, 100%, 57%, 60%, 33%, 23%

PCRPCR

Pourquoi PCR pas toujours à 100 % ?Pourquoi PCR pas toujours à 100 % ?

Olsson, Clin Microbiol Infect, 2001

91 ech

IF : sens 60% spé 97% VPP 88% VPN 86%PCR : sens 96% spe 59% VPP 52% VPN 100%

PCRPCR

Une trop grande sensibilité ??Une trop grande sensibilité ??

PCRPCR

Il existe un portage sain … Il existe un portage sain …

Chez l’immunodéprimé : 18% (Maskell, Thorax, 2003)

Chez l’immunocompétent : 12 à 20%(Maskell, Thorax, 2003 ; Medrano, Emerg Infect Dis, 2005 ;Sing, J Clin Microbiol, 2000)

Pas toujours retrouvé : 0%(Nevez, Clin Infect Dis, 2005 ; Weig, J Clin Microbiol, 1997)

PCRPCR

Comment distinguer le portage de l’infection par P. jiroveci ?Comment distinguer le portage de l’infection par P. jiroveci ?

Flori, J Med Microbiol, 2004

173 LBA de patients présentant des signes évoquant PCP« Gold standard » : clinique, épreuve thérapeutique …

sensibilité spécificité VPP VPN

Giemsa Gomori

60 100 100 92

PCR RT PCR

100 85 21 100

PCRPCR

Comment distinguer le portage de l’infection par P. jiroveci ?Comment distinguer le portage de l’infection par P. jiroveci ?

Flori, J Med Microbiol, 2004

Détermination de la concentration en ADN dans l’échantillon :

La PCR en temps réel, en permettant la quantification de l’ADN de l’échantillon pourrait permettre un diagnostic biologique fiable .

PCRPCR

Les méthodes moléculaires ne sont pas à l’heure actuelle de bonnes méthodes pour le diagnostic de la PCP : trop de faux positifs dus à une trop grande capacité de détection. autres utilisation possible : épidémio, screening des patients pouvant bénéficier d’une prophylaxie, suivi de l’efficacité du tt …

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