Prof. José Raimundo Correa

Western Blotting

Eletroforese de proteínas

Diferença de tamanho (PM)

Mobilidade da proteína

Detecção

Marcação com

anticorpo específico

Detecção da

proteína alvo

Gel de poliacrilamidaMembrana de

nitrocerlulose

Desafios da proteômica

”In a few years we will have finished sequencing the human genome. Then we will spend the next 500 years trying to understand the function of these genes. ”

1998

Professor Mathias Uhlén

Royal Institute of Technology (KTH), Stockholm

Member of the board, Amersham Biosciences

GENOMA – Conjunto de DNA (humano)

30.000 – 45.000 ?? genes

Transcriptoma – Conjunto de mRNAs

mRNA – 100.000 representantes??

PROTEOMA – Equivalente protéico do genoma

Proteínas – 1.000.000 – 40.000.000 ?? representantes??

Além do Genoma : Sistemas Biológicos

Marc Wilkins

Siena Itália setembro de 1994

“all proteins expressed by a genome, celll or tissue”

PROTEINOME PROTOME

PROTEOME

1º Conceito de Proteoma

Electrophoresis. 1995 Jul;16(7):1090-4.

Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium.

Wasinger VC, Cordwell SJ, Cerpa-Poljak A, Yan JX, Gooley AA, Wilkins MR, Duncan MW, Harris R,

Williams KL, Humphery-Smith I.

Department of Microbiology, University of Sydney, Australia.

A protein map of the smallest known self-replicating organism, Mycoplasma genitalium (Class: Mollicutes),

revealed a high proportion of acidic proteins. Amino acid composition was used to putatively identify, or provide

unique parameters, for 50 gene products separated by two-dimensional gel electrophoresis. A further 19 proteins

were subjected to peptide-mass fingerprinting using matrix-assisted laser desorption ionisation-time

of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry and 4 were subjected to N-terminal Edman degradation. The majority of

M. genitalium proteins remain uncharacterised. However, the combined approach of amino acid analysis and

peptide-mass fingerprinting allowed gene products to be linked to homologous genes in a variety of organisms.

This has allowed proteins to be identified prior to detection of their respective genes via the M. genitalium sequencing initiative.

The principle of 'hierarchical' analysis for the mass screening of proteins and the analysis of microbial genomes via their protein

complement or 'proteome' is detailed. Here, characterisation of gene products depends upon the quickest and most economical

technologies being employed initially, so as to determine if a large number of proteins are already present in both homologous

and heterologous species databases. Initial screening, which lends itself to automation and robotics, can then be followed by

more time and cost intensive procedures, when necessary.

Conceito

Proteôma: complemento protéico do genoma em um

dado organismo, em um dado momento, em uma dada

situação.

Proteômica: comparação qualitativa e quantitativa de

proteômas sob diferentes condições ou processos

biológicos.

Proteomática: bioinformática para proteômica.

Mudanças biológica

(Morfogenesis)

Proteoma 1 Proteoma 2Perfis de proteínas

Proteoma 1

Proteoma 2

Proteoma 3

Proteoma „n‟

1 único genoma!

2D – PAGE

ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA

- Separação de aprox. 10.000 proteínas em um

único gel

- Separa proteínas de acordo com massa

molecular (MM) e ponto isoelétrico (PI)

2D – PAGE

ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA

Esquema da análise proteômica

Mistura protéica Proteínas individuais

PeptideosMassa dos peptideos

Identificação da Proteína

Separação

2D-SDS-PAGE

Digestão com

Tripsina

Espectometria de massas

MALDI-TOF

Busca nos

bancos de dados

Seleção dos ‘Spots’

Componentes da Proteômica

Separação proteica

Bioinformatica

Espectometria de

massas

2D – PAGE

ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA(1ª. Dimensão)

2D – PAGE

ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA(1ª. Dimensão)

2D – PAGE

ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA(2ª. Dimensão)

Revelação dos géis

11 cm

pH 3 - 10

Detecção: Comassie, prata, fluorescência, imunodetecção.

DIGE : Differential Gel Electrophoresis

DIGE : Differential Gel Electrophoresis

DIGE : Differential Gel Electrophoresis

PROCESSAMENTO DOS SPOTS

Imagem do gel Seleção do spot

Retirada

descoloração

TripsinizaçãoEspectrometria

de massa

Prêmios Nobel da Espectrometria de massa

The Five Mass Spectrometry Nobel Prize Pioneers

Joseph John

Thomson

1906 Nobel Prize for

Physics

"in recognition of the

great merits of his

theoretical and

experimental

investigations on the

conduction of

electricity by gases"

Francis William Aston

1922 Nobel Prize for

Chemistry

"for his discovery, by

means of his mass

spectrograph, of

isotopes, in a large

number of non-

radioactive elements,

and for his

enunciation of the

whole-number rule"

Wolfgang Paul

1989 Nobel Prize for

Physics

"for the development

of the ion trap

technique"

John Bennet Fenn

2002 Nobel Prize for

Chemistry

"for the development

of soft desorption

ionisation methods

(ESI) for mass

spectrometric

analyses of biological

macromolecules"

Koichi Tanaka

2002 Nobel Prize for

Chemistry

"for the development

of soft desorption

ionisation methods

(MALDI) for mass

spectrometric

analyses of biological

macromolecules

Espectômetro de massas:

MALDI-TOF-TOF

Espectômetro de massas:

MALDI-TOF-TOF

Aplicações da Proteômica

Mapeamento de uma rede de relações: identificação de proteínas em uma rede funcional: vias biosintéticas, vias de transdução de sinal, complexos multiprotéicos.

Mapeamento de modificações proteicas: caracterização de modificações pós-traducionais: fosforilação, glicosilação, oxidação, etc.

Aplicações da Proteômica

Especificação de proteínas: catalogar todas as proteínas presentes em um tecido, célula, organela, etc.

Perfil de expressão diferencial: Identificação de proteínas em amostras com uma função particular; diferenciação, estágio de desenvolvimento, condição de doença, resposta a uma droga ou estímulo.

Marcadores de diagnóstico: Expressão diferencial

Proteínas comuns

Proteínas dos

pacientes infectados

Proteínas dos

pacientes saudáveis

Análise dos spots

Desvantagens

Proteínas não vivem sozinhas

- Interações com outras proteínas

- Interações com RNA/DNA

- Interações com outras identidades químicas (ligantes, co-fatores, metais iônicos, hormones)

Desvantagens

- O proteôma humano é muito variável

- Um proteôma por tecido (250 tecidos)

- Um proteôma por fração sub-celular

- Milhares de doenças

- O proteôma muda com influências externas (drogas, alimentação...)

- O proteôma muda com o tempo

Um genoma por indivíduo, mas quantos proteômas?

Desvantagens

Proteínas pouco abundantes – (50 – 70%)

Proteínas de membrana

Proteínas com extremos de PI e MM

Método trabalhoso

Reprodutibilidade

Vantagens

Sensibilidade

Analise em larga escala

Rapidez

Automação

Ainda não é possível fazer a descrição molecular

completa de uma célula viva ou de um ser vivo!!!

Novos paradigmas na Biologia

Ciência do descobrimento