Introducción a la terapia génica

Curso de Genética Molecular

Ciencias Biológicas

Universidad de Jaén

TERAPIA GÉNICA

Introducción de secuencias de ADN (naturales o artificiales) en células para alterar su expresión génica con fines terapéuticos.No se incluye el transplante de médula ósea o de hígado.

Dos tipos principales de terapia génica:

Somática: Introducción de ADN en células no reproductivas,puede ser in vivo o ex vivo. No permanece en la descendencia del organismo tratado.

Germinal: Introducción de ADN en células reproductivas. Modifica el patrimonio genético de la especie y puede ser transmitido a la descendencia. Presenta graves inconvenienteséticos aunque en animales (ratones) está muy desarrollada (knock-outs y transgénicos).

TERAPIA GÉNICA

Tipos de terapia génica

Reemplazar un gen defectuoso (cirugía genética),

enfermedades hereditarias monogénicas.

1. Manipulación para aumentar la expresión de genes

(citocinas, etc.)

2. Reducir la expresión de un gen potencialmente dañino

(oligonucleótidos antisentido)

3. Introducir un gen no-humano (resistencia a metales,

antibióticos, patógenos, etc.)

TERAPIA GÉNICA

Tipos de problemas tratables por terapia génica

1. Enfermedades heredables (fibrosis quística,

etc.)

2. Enfermedades adquiribles

Infecciosas (virus, bacterias, parásitos)

Cáncer

Arteriosclerosis

Etc.

TERAPIA GÉNICA

Métodos de introducción de ADN

Transfección:Físicos: Biolística (genegun), electroporaciónQuímicos: Lipidos catiónicos, fosfato cálcico, polímeros, etc.Biológicos: ADN unido a ligandos de receptores de membrana expresados en células diana

Transducción: dependientes de virusRetrovirusAdenovirusVirus Adeno-Asociados (AAV)Herpesvirus

TERAPIA GÉNICA

Tipos de reparto del ADN

EX VIVO:Paciente no está directamente expuesto al sistema de transferencia génica.Posibilidad de monitorizar la expresión del transgenTrabajo sobre poblaciones de células específicas

IN SITU:ADN dirigido directamente a un órgano o tumor

IN VIVO:ADN introducido directamente a través de la sangre

Crecimiento de la terapia génicaCrecimiento de la terapia génica1988 1988 -- 20002000

050

100150200250300350400450

Prot

ocol

os d

e te

rapi

a gé

nica

apr

oba d

os

Progresión de ensayos clínicos Progresión de ensayos clínicos sobre terapia génicasobre terapia génica

0

50

100

150

200

250

300

Phase I Phase I-II Phase II Phase III

Prot

ocol

os d

e te

rapi

a gé

nica

apr

oba d

os

Esquema estructura de los retrovirus

Esquema ciclo de vida de los retrovirus

Producción de retrovirus defectivos para terapia génica

Problemas de los retrovirus en terapia génica

Se ha observado la desconexión de los genes a las pocas

semanas de la introducción. Posiblemente por metilación. El

cambio de promotores puede aliviar este problema.

Posibilidad de integración aleatoria que desrregule o inactive

genes celulares imprescindibles.

Dificultad para infectar células quiescentes (cerebro, hígado).

Baja eficacia de transducción viral en tejidos vivos.

Limitación a 7-7,5 Kb

Citocinas necesarias para la Citocinas necesarias para la hematopoyesishematopoyesis

IL-2,4,6,7,10,13,14,15

IL-2,4,6,7,9,12,15

IL-2,12,15

CFUs

Plaquetas

Monocitos

Polimorfos

G.Rojos

(TPO)/IL-11

GM-CSF

G-CSF/GM-CSF

EPO

Células maduras

Natural Killer

Linfocitos T

Linfocitos B

Células maduras

célulamadre

CFU-GEMM

Stem CellFactor(SCF),

IL-3

Línea linfoide

IL-3

Línea mieloide

Varios receptores de factores de Varios receptores de factores de crecimiento contienen la cadena crecimiento contienen la cadena γγγγγγγγ comúncomún

ILIL--2R2R ILIL--15R15R ILIL--7R7R ILIL--4R4R ILIL--9R9R

TTBB

NKNK

TTBB

NKNK

TTBB

TTBB

TT

ILIL--22 ILIL--1515ILIL--77 ILIL--44 ILIL--99

γγγγγγγγCC γγγγγγγγCC γγγγγγγγCC γγγγγγγγCC γγγγγγγγCC

Terapia génica para XTerapia génica para X--SCIDSCID

inserción en el paciente

co-cultivo

cadenaγγγγ común

vector retroviralY

médula ósea

gen expresado en las células precursoras

desarrollo correcto de linfocitos B y NK

reconstituciónde un sistema inmune funcional

cocultivo células madre

1. Aparece durante la infancia con infecciones recurrentes oportunísticas. Los niños suelen tener infecciones típicas del SIDA como Candida albicans, Pneumocystis carinii. Sin tratamiento es mortal en el 100% de los casos

2. SCID ligado al cromosoma X aparece por una mutación en la cadena γγγγ común del los receptores de citocinas, el gen está situado en el cromosomas X. Presenta una incidencia de 1/50,000. Los pacientes tienen unos niveles muy bajos de linfocitos T y elevadas cantidades de linfocitos B inmaduros no funcionales.

3. La única terapia curativa es el transplante de médula. Este sistema es eficaz en el 100% de los casos con HLA idéntico.

4. La cirugía genética es potencialmente curativa

Inmunodeficiencia combinadad severa ligada al cromosoma X

Detección del ARNm de la cadena Detección del ARNm de la cadena γγγγγγγγC mediante RTC mediante RT--PCRPCR

Resultados terapia génica para XResultados terapia génica para X--SCID : qué pasa con SCID : qué pasa con los niveles de expresión del transgén?los niveles de expresión del transgén?

M. Cavazzana-Calvo, et. al. Science (2000) 288:669-71

Paciente 1Paciente 1 Paciente 2Paciente 2

Niveles cuantificados por citometría de flujoNiveles cuantificados por citometría de flujo

Resultados terapia génica para XResultados terapia génica para X--SCID : qué pasa con los niveles SCID : qué pasa con los niveles de linfocitos?de linfocitos?

M. Cavazzana-Calvo, et. al. Science (2000) 288:669-71

Resultados terapia génica para XResultados terapia génica para X--SCID : beneficios clínicosSCID : beneficios clínicosM. Cavazzana-Calvo, et. al. Science (2000) 288:669-71

“As a likely consequence of development and sustained function of the immune system, clinical improvement was observed in both patients. In P2, protracted diarrhea as well as extensive graft-versus-host disease (GVHD)-like skin lesions disappeared. Both patients left protective isolation at days 90 and 95 and are now at home 11 and 10 months, respectively, after gene transfer without any treatment. Both enjoy normal growth and psychomotor development. No side effects have been noted. A similar result has since been achieved in a third patient 4 months after gene transfer. These results demonstrate that in these patients, a selective advantage was conferred to T and NK lymphocyte progenitors, enabling full-blown development of mature and functioning T and NK lymphocytes.”

ILIL--22 ILIL--1515 ILIL--77 ILIL--44 ILIL--99

γγγγγγγγCC γγγγγγγγCC γγγγγγγγCC γγγγγγγγCC γγγγγγγγCC

Virus de ADN utilizados en terapia génicaAdenovirus:

Potencialmente patogénicos

Común en terapia génica in situ

Insertos de ADN grandes (35Kb)

Amplio espectro de células diana

Puede transducir células quiescentes

En cultivo se pueden obtener grandes cantidades (1011/ml)

Problemas: Inmunogénicos y expresión transitoria (3 semanas)

AAV:

Virus humanos no patogénicos

Sitio de integración preferente (Cromos. 19)

Amplia variedad de tejidos diana pero no muy eficaz

Sólo permite insertos de 5 Kb

No tiene sistema de empaquetamiento eficiente e independiente

ProblemasProblemas1. A los 10 años de la aprobación del primer estudio de terapia génica más de 4000 pacientes han recibido este tratamiento en todo el mundo. Muy pocos han tenido beneficios clínicos definitivos. 2. Hace un par de años murió un paciente después de un tratamiento de terapia génica3. Algunos ensayos clínicos han sido suspendidos debido a obscurantismo por parte de los investigadores en los informes preceptivos de la FDA.4. Dos pacientes de X-SCID han desarrollado leucemia

PromesasPromesas1. Recientemente una enfermedad mortal (X-SCID) ha sido curada por terapia génica2. Avances en la biología molecular y los sistemas de transferencia génica acelerarán el uso de la terapia génica.

Terapia génica 2003Terapia génica 2003