Ladislav VyklickýLadislav Vyklický

IontovIontovéé kankanáály ly aktivovanaktivovanéé neuropneuropřřenaenaššeeččii

http://www.biomed.cas.cz/d331/index.html

Mozek dospělého člověka je tvořen ~50,000,000,000 neurony, které mezi sebou vytvářejí 1014 až 5 × 1014

(100-500 trillion) synaptických kontaktů

Označení „synapse“pochází od CharleseScotta Sherringtona (1857 – 1952; Anglie) v roce 1932 mu byla udělena Nobelova cena za fyziologii a medicinu.

Johannes Evangelista Purkinje1787-1869

1921 Otto Loewi (1873-1961)Ramon y Cajal (1852-1934), synaptická štěrbina

1. Sdrce 2. Sdrce

Stimulace vagu

Extracelulárnítekutina

Snížení tepovéfrekvence

Snížení tepovéfrekvence

Acetylcholin

ChemickChemickáá synapsesynapse

3

Aby látka mohla být považována za neuropřenašečmusí splňovat následující kriteria (Paton 1958) :

1. Presynaptický neuron musí obsahovat předpokládanou látkua být schopen ji uvolnit

2. Látka musí být uvolněna po stimulaci presynaptického axomu

3. Aplikace látky na postsynaptický neuron vyvolává stejný účinek jako má přirozený neuropřenašeč

4. Působení látky na postsynaptický neuron musí být farmakologicky ovlivněno stejně jako působení neuropřenašeče

5. V blízkosti synapse musí být přítomen „enzym“,ktetý neurotransmiter odstraní nebo rozloží

Definice Definice neuropneuropřřenaenaššeeččee

4

Akční potenciál přichází do presynaptického zakončení.

Otvírají se napěťově řízenéCa2+ kanály a Ca2+ vstupuje dovnitř.

Vzestup koncentrace Ca2+

spouští splynutí váčků s presynaptickou membránou.

Receptory s navázaným neuropřenašečem aktivujípostsynaptickou buňku.

Neuropřenašeč difunduje přes synaptickou štěrbinu a váže se na receptory na postsynaptické buňce.

Myelinovápochva

Extracelulárníprostor

Na+ kanál

K+ kanál

Ca2+ kanál

Neuropřenašeč se rozkládá, je transportován do presynaptického zakončení, jinou buňkou nebo difunduje pryč ze synapse.

Axon

i (elektrický proud)

Synaptická štěrbina

Molekuly neuropřenašeče

Presynaptické zakončenínervové buňky

Postsynaptickábuňka

Molekuly meuropřenašečejsou po syntéze transportovány do váčků.

1

2

3

4

5

6

7

ChemickChemickáá synapsesynapse

5

AcetylcholinAminy

DopaminNoradrenalinSerotoninHistamin

AminokyselinyGlutamátGABAGlycin

PeptidyPurinyPlyny

NOCO

Lipidy6

NeuropNeuropřřenaenaššeeččee

ChemickChemickáá signalizacesignalizace

• Receptor iontové kanály• Receptory spojené s trimerními G proteiny• Receptory mající enzymatickou aktivitu• Intracelulární receptory

7

Ionotropní receptory Metabotropní receptory

RReceptoryeceptory pro pro neuropneuropřřenaenaššeeččee

8

AcetylcholinAminy

DopaminNoradrenalinSerotoninHistamin

AminokyselinyGlutamátGABAGlycin

PeptidyPurinyPlyny

NOCO

Lipidy9

Ionotropní receptory

Metabotropní receptoryNeuropNeuropřřenaenaššeeččee

Postsynaptickádensita

Synaptickéváčky

Synaptickáštěrbina

Postsynaptickýneuron

10

DendritickDendritickéé trnytrny

11

Ionotropní receptor

Axon

Metabotropní receptor

Axon

Akčnípotenciál

Akčnípotenciál

Acetylcholin Acetylcholin

Kosterní sval

Srdeční sval

Aktivace nikotinického ACh

receptoru

Membránovádepolarizace

Akční potenciál a excitace

Kontrakce svalu

Aktivace muskarinickéhoACh receptoru

Uvolnění a-GTP + bg z heteromerických G

proteinů

bg aktivace K+ kanálů

Membránováhyperpolarizace

Snížení tepové frekvence

12

3-D rekonstrukce molekuly ACh receptoru

Iontové kanály jsou proteinové struktury tvořící póry,které umožňují tok iontů přes plazmatickou membránu

Selektivnífiltr

Senzor

Branka

Struktura iontovStruktura iontovéého kanho kanáálulu

Membrána

13

14

Neuropřenašeči aktivované iontovékanály jsou obvykle oligomerníkomplexy, které se skládají z několika podjenotek.

Trimer TetramerHexamerPentamer

Cis – loop receptory GABAGlycin AcetylcholinSerotonin

Glutamátové receptory

ATP – řízené receptory

ZZáákladnkladníí principy aktivace principy aktivace iontových kaniontových kanáállůů neuropneuropřřenaenaššeeččemem

15

Iontový kanál se nacházíve dvou konformačníchstavech:

a) zavřeném(s nebo bez agonisty) a

b) otevřeném(pouze s agonistou).

Aktivace iontovAktivace iontovéého kanho kanáálu lu agonistouagonistou

16

Agonista

Agonista

EC50 je koncentrace agonisty, která vyvolává právě 50 % maximální efekt

KKřřivka zivka záávislosti velikosti odpovvislosti velikosti odpověědi na koncentraci di na koncentraci agonistyagonisty

100%

50%

00.1 1 10 100 1000

17

Jsou zapotřebí dvě molekuly agonisty,,aby došlo k aktivaci IK

HillHillůůvv koeficientkoeficient

18

Desensitizace je stav kdy je receptor refrakterní k další aplikaci agonisty

DesensitizaceDesensitizace a pravda pravděěpodobnost otevpodobnost otevřřeneníí

19

Po je vždy <1

Při vysoké koncentraci agonisty

Agonista•přirozený•syntetický

Typy inhibice chemicky aktivovaných iontových kanTypy inhibice chemicky aktivovaných iontových kanáállůů

Agonista

Antagonista

Kompetitivní

Nekompetitivní

Blokátor

Antagonista

20

Opakovaná vazba Vlastnosti receptorů

Co urCo urččuje dobu trvuje dobu trváánníí postsynaptoickýchpostsynaptoických potencipotenciáállůů??

21

22

DNA RNA Protein Kompletace

Recyklace

Transport

10%

90%

Během 18 hodin je přibližněpolovina nově syntetizovaných ionotropních receptorůdegradována

Degradace

23

GABAminergníGlycinergní Purinergní (ATP)

CholinergníSerotonergní

Glutamátergní

ZastoupenZastoupeníí jednotlivých druhjednotlivých druhůů synapssynapsíí v CNSv CNS

24

5-hydroxytryptaminem aktivované IK (5-HT3)

ATP aktivované IK (P2x)

Glutamátem aktivované IK (GluR)

Acetylcholinem aktivované IK (ACh)

γ- aminomáselnou kyselinou aktivované IK (GABA)

Glycinem aktivované (IK)

Excitační Inhibiční

IontovIontovéé kankanáály aktivovanly aktivovanéé neuropneuropřřenaenaššeeččii;;dděělenleníí na excitana excitaččnníí a inhibia inhibiččnníí

25

MetodyMetody

26

ModelyModely

HipokampHipokampáálnlníí neuronyneurony

DRG neuronyDRG neurony

HEK293 a COSHEK293 a COS KortikKortikáálnlníí řříízkyzky

Rekombinantníreceptory Nativní receptory Synaptický přenos

27

Aplikace lAplikace láátektek

28

Aplikace lAplikace láátektek

29

Aplikace lAplikace láátektek

30

Agonista (glutamát)

Testovaná látka (neurosteroid)

TV kamera + monitor

Snímací komůrka s řízkem

Patch clampzesilovač

Miktoskop

Mikromanipulátor

Stimulator

Pipeta

Osciloskop

ElektrofyziologickElektrofyziologickáá laboratolaboratořř

31

Izolace tkIzolace tkáánněě

Izolace mozkuZchlazení na 4°C

VibratomVibratom –– zazařříízenzeníí na pna přříípravu pravu řříízkzkůů

Detail komDetail komůůrkyrky

Komůrka

Nervová tkáň

Led

Žiletka

Směr vibrací žiletky

Směr posumu tkáně

ŘŘíízek z prodlouzek z prodloužženenéé mmííchychy

Fotografie řízku připraveného z prodloužené mích potkana.DS – dorzální strana, VS – ventrální strana, T – vlákno přidržující řízek k podložce, Sp5 – kaudální část jádra trigeminu

Mikrofotografie živého neuronupořízená za použitíDIC-IR mikroskopie.E – patch clampová elektroda

E

36

Gene knockout Gene knockout

DNA … gen … DNA

Genetickémanipulace

DNA … neg … DNA

Gene knockout

Bahaviorální, farmakologické a jiné testy

Germinální buňky

Germinální buňky-bez genu

AcetylcholinAminy (katecholaminy)Aminokyseliny

GlutamátGABAGlycin

PeptidyPurinyPlynyLipidy

37

Lišaj smrtihlav

Extracelulární prostor

METABOTROPNÍ GLUTAMÁTOVÉRECEPTORY

IONOTROPNÍ GLUTAMÁTOVÉRECEPTORY

CGlutamátvázajícídomena

Kanál-tvarujícídomena

RODOKMEN METABOTROPNÍCHGLUTAMÁTOVÝCH RECEPTORŮ

RODOKMEN IONOTROPNÍCHGLUTAMÁTOVÝCH RECEPTORŮ

38

Receptor Podjednotka Gen ChromozomAMPA GluR1 GRIA1 5q33

GluR2 GRIA2 4q32-33GluR3 GRIA3 Xq25-26GluR4 GRIA4 11q22-23

Kainate GluR5 GRIK1 21q21.1-22.1

GluR6 GRIK2 6q16.3-q21GluR7 GRIK3 1p34-p33KA-1 GRIK4 11q22.3KA-2 GRIK5 19q13.2

NMDA NR1 GRIN1 9q34.3NR2A GRIN2A 16p13.2NR2B GRIN2B 12p12

NR2C GRIN2C 17q24-q25

NR2D GRIN2D 19q13.1qterNR3A GRIN3A 9q31.1NR3B GRIN3B 19p13.3

Kys. glutamová

AMPA (α-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate)

NMDAN-methyl-D-aspartát

Kainát

IonotropnIonotropníí glutamglutamáátovtovéé receptoryreceptory

39

AMPA receptor GluR2AMPA receptor GluR2–– /GluA2//GluA2/

NSIQIGGLFPRGADQEYSAFRVGMVQFSTSEFRLTPHIDNLEVANSFAVTNAFCSQFSRGVYAIFGFYDKKSVNTITSFCGTLHVSFITPSFPTDGTHPFVIQMRPDLKGALLSLIEYYQWDKFAYLYDSDRGLSTLQAVLDSAAEKKWQVTAINVGNINNDKKDETYRSLFQDLELKKERRVILDCERDKVNDIVDQVITIGKHVKGYHYIIANLGFTDGDLLKIQFGGANVSGFQIVDYDDSLVSKFIERWSTLEEKEYPGAHTATIKYTSALTYDAVQVMTEAFRNLRKQRIEISRRGNAGDCLANPAVPWGQGVEIERALKQVQVEGLSGNIKFDQNGKRINYTINIMELKTNGPRKIGYWSEVDKMVVTLTELPSGNDTSGLENKTVVVTTILESPYVMMKKNHEMLEGNERYEGYCVDLAAEIAKHCGFKYKLTIVGDGKYGARDADTKIWNGMVGELVYGKADIAIAPLTITLVREEVIDFSKPFMSLGISIMIKKPQKSKPGVFSFLDPLAYEIWMCIVFAYIGVSVVLFLVSRFSPYEWHTEEFEDGRETQSSESTNEFGIFNSLWFSLGAFMQQGCDISPRSLSGRIVGGVWWFFTLIIISSYTANLAAFLTVERMVSPIESAEDLSKQTEIAYGTLDSGSTKEFFRRSKIAVFDKMWTYMRSAEPSVFVRTTAEGVARVRKSKGKYAYLLESTMNEYIEQRKPCDTMKVGGNLDSKGYGIATPKGSSLRNAVNLAVLKLNEQGLLDKLKNKWWYDKGECGSGGGDSKEKTSALSLSNVAGVFYILVGGLGLAMLVALIEFCYKSRAEAKRMKVAKNPQNINPSSSQNSQNFATYKEGYNVYGIESVKI

C - terminální část

N - terminální část

C N

C CN

N

40

LBDLigand Binding Doména

Membránová Doména

NTDN Terminální Doména

GluR2GluR2

C

N

41

GluR2GluR2

42

NR1-1aNR1-1b NR1-2a NR1-2b NR1-3a NR1-3b NR1-4a NR1-4b

NR2ANR2BNR2CNR2D

pre-mRNA

Alternativnísestřih mRNA

Sestřih

Překlad

Insert (a,b)

Kazeta

---1.2.

3.

AlternativnAlternativníí sestsestřřihih

NR1-1a

NR1-1aNR2A

NR2BNR2A NR2B

NR2A43

RNA RNA editingeditingQ/R mQ/R míísto AMPA receptorsto AMPA receptorůů tvotvořřených GluR2ených GluR2

NSIQIGGLFPRGADQEYSAFRVGMVQFSTSEFRLTPHIDNLEVANSFAVTNAFCSQFSRGVYAIFGFYDKKSVNTITSFCGTLHVSFITPSFPTDGTHPFVIQMRPDLKGALLSLIEYYQWDKFAYLYDSDRGLSTLQAVLDSAAEKKWQVTAINVGNINNDKKDETYRSLFQDLELKKERRVILDCERDKVNDIVDQVITIGKHVKGYHYIIANLGFTDGDLLKIQFGGANVSGFQIVDYDDSLVSKFIERWSTLEEKEYPGAHTATIKYTSALTYDAVQVMTEAFRNLRKQRIEISRRGNAGDCLANPAVPWGQGVEIERALKQVQVEGLSGNIKFDQNGKRINYTINIMELKTNGPRKIGYWSEVDKMVVTLTELPSGNDTSGLENKTVVVTTILESPYVMMKKNHEMLEGNERYEGYCVDLAAEIAKHCGFKYKLTIVGDGKYGARDADTKIWNGMVGELVYGKADIAIAPLTITLVREEVIDFSKPFMSLGISIMIKKPQKSKPGVFSFLDPLAYEIWMCIVFAYIGVSVV

LFLVSRFSPYEWHTEEFEDGRETQSSESTNEFGIFNSLWFSLGAFMQQGCDISPRSLSGRIVGGVWWFFTLIIISSYTANLAAFLTVERMVSPIESAEDLSKQTEIAYGTLDSGSTKEFFRRSKIAVFDKMWTYMRSAEPSVFVRTTAEGVARVRKSKGKYAYLLESTMNEYIEQRKPCDTMKVGGNLDSKGYGIATPKGSSLRNAVNLAVLKLNEQGLLDKLKNKWWYDKGECGSGGGDSKEKTSALSLSNVAGVFYILVGGLGLAMLVALIEFCYKSRAEAKRMKVAKNPQNINPSSSQNSQNFATYKEGYNVYGIESVKI

C - terminální část

N - terminální část

V DNA …CAG… tento triplet kóduje glutamin (Q)V RNA je překvapivě …CGG… tento triplet kóduje arginin (R)

DNA RNA protein

II. Membránová oblast

arginin (R)glutamin (Q)

RNA editing

44

RNA RNA editingediting GluR2GluR2

TM4TM3

TM2 TM1

arginin (R)glutamin (Q)

RNA editing

Na+Ca2+

45

EHLFYWQFRHCFMGVCSGKPGMVFSISRGIYSCIHGVAIEERQSVMNSPTATMNNTHSNILRLLRTAKNMANLSGVNGSPQSALDFIRRESSVYDISEHRRSFTHSDCKSYNNPPCEENLFSDYISEVERTFGNLQLKDSNVYQDHYHHHHRPHSIGSTSSIDGLYDCDNPPFTTQPRSISKKPLDIGLPSSKHSQLSDLYGKFSFKSDRYSGHDDLIRSDVSDISTHTVTYGNIEGNAAKRRKQQYKDSLKKRPASAKSRREFDEIELAYRRRPPRSPDHKRYFRDKEGLRDFYLDQFRTKENSPHWEVDLTDIYKERSDDFKRDSVSGGGPCTNRSHLKHGTGEKHGVVGGVPAPWEKNLTNVDWEDRSGGNFCRSCPSKLHNYSSTVAGQNSGRQACIRCEACKKAGNLYDISEDNSLQELDQPAAPVAVTSNASSTKYPQSPTNSKAQKKNRNKLRRQHSYDTFVDLQKEEAALAPRSVSLKDKGRFMDGSPYAHMFEMPAGESSFANKSSVPTAGHHHNNPGSGYMLSKSLYPDRVTQNPFIPTFGDDQCLLHGSKSYFFRQPTVAGASKTRPDFRALVTNKPVVSALHGAVPGRFQKDICIGNQSNPCVPNNKNPRAFNGSSNGHVYEKLSSIESDV

Serin

Threonin

PKA PKA ffosforylaosforylaččnníí mmííststaa NR2B NR2B podjednotkypodjednotky NMDA receptoruNMDA receptoru

46

1 MGRLGYWTLLVLPALLVWRDPAQNAAAEKGPPALNIAVLLGHSHDVTERELRNLWGPEQA61 TGLPLDVNVVALLMNRTDPKSLITHVCDLMSGARIHGLVFGDDTDQEAVAQMLDFISSQT

121 FIPILGIHGGASMIMADKDPTSTFFQFGASIQQQATVMLKIMQDYDWHVFSLVTTIFPGY181 RDFISFIKTTVDNSFVGWDMQNVITLDTSFEDAKTQVQLKKIHSSVILLYCSKDEAVLIL241 SEARSLGLTGYDFFWIVPSLVSGNTELIPKEFPSGLISVSYDDWDYSLEARVRDGLGILT301 TAASSMLEKFSYIPEAKASCYGQAEKPETPLHTLHQFMVNVTWDGKDLSFTEEGYQVHPR361 LVVIVLNKDREWEKVGKWENQTLSLRHAVWPRYKSFSDCEPDDNHLSIVTLEEAPFVIVE421 DIDPLTETCVRNTVPCRKFVKINNSTNEGMNVKKCCKGFCIDILKKLSRTVKFTYDLYLV481 TNGKHGKKVNNVWNGMIGEVVYQRAVMAVGSLTINEERSEVVDFSVPFVETGISVMVSRS541 NGTVSPSAFLEPFSASVWVMMFVMLLIVSAIAVFVFEYFSPVGYNRNLAKGKAPHGPSFT601 IGKAIWLLWGLVFNNSVPVQNPKGTTSKIMVSVWAFFAVIFLASYTANLAAFMIQEEFVD661 QVTGLSDKKFQRPHDYSPPFRFGTVPNGSTERNIRNNYPYMHQYMTRFNQRGVEDALVSL721 KTGKLDAFIYDAAVLNYKAGRDEGCKLVTIGSGYIFATTGYGIALQKGSPWKRQIDLALL781 QFVGDGEMEELETLWLTGICHNEKNEVMSSQLDIDNMAGVFYMLAAAMALSLITFIWEHL841 FYWKLRFCFTGVCSDRPGLLFSISRGIYSCIHGVHIEEKKKSPDFNLTGSQSNMLKLLRS901 AKNISNMSNMNSSRMDSPKRATDFIQRGSLIVDMVSDKGNLIYSDNRSFQGKDSIFGDNM961 NELQTFVANRHKDNLSNYVFQGQHPLTLNESNPNTVEVAVSTESKGNSRPRQLWKKSMES1021 LRQDSLNQNPVSQRDEKTAENRTHSLKSPRYLPEEVAHSDISETSSRATCHREPDNNKNH1081 KTKDNFKRSMASKYPKDCSDVDRTYMKTKASSPRDKIYTIDGEKEPSFHLDPPQFVENIT1141 LPENVGFPDTYQDHNENFRKGDSTLPMNRNPLHNEDGLPNNDQYKLYAKHFTLKDKGSPH1201 SEGSDRYRQNSTHCRSCLSNLPTYSGHFTMRSPFKCDACLRMGNLYDIDEDQMLQETGNP1261 ATREEVYQQDWSQNNALQFQKNKLRINRQHSYDNILDKPREIDLSRPSRSISLKDRERLL1321 EGNLYGSLFSVPSSKLLGNKSSLFPQGLEDSKRSKSLLPDHASDNPFLHTYGDDQRLVIG1381 RCPSDPYKHSLPSQAVNDSYLRSSLRSTASYCSRDSRGHSDVYISEHVMPYAANKNTMYS1441 TPRVLNSCSNRRVYKKMPSIESDV

Non-synonymous SNP(leucin za jinou AK)

Synonymous SNP(fenylalanin za fenylalanin)

SNP SNP –– SingleSingle--nucleotide polymorphism nucleotide polymorphism NMDA r NMDA r -- NR2A NR2A podjednotkapodjednotka

SNP molekuly DNA se liší v jednom páru bazí

47

Protein proteinovProtein proteinovéé interakce NMDA receptoruinterakce NMDA receptoru

48

↑[Ca2+]i

Depolarizace

5 ms2 pA

GLY

GLU

GLYGLU

Aktivace NMDA receptoruAktivace NMDA receptoru

49

Farmakologie NMDA receptoruFarmakologie NMDA receptoru

Mg2

+

Zn2+

MK-801

Polyaminy

Kompetitivníantagonista

PCP

Neurosteroidy

Ketamin

Memantin

Nekompetitivníantagonista

Nekompetitivníantagonista -blokátor iontového kanálu

Napěťově závislý inhibitor

Use-dependentinhibitor

Agonista

Glutamát

NMDA

Koagonista

Glycin

APV 7ClKH+Ifenprodil

Ketamin

50

MgMg2+2+ je je blokblokáátortor NMDA receptor IKNMDA receptor IK

51

ExcitaExcitaččnníí synapsesynapse

10 mM Glu

1 M Glu

Glutamatový transporter

52

UvolUvolňňovováánníí glutamglutamáátutu z z presynaptickpresynaptickéé termintermináályly

53

8 nm

6.5 nm

Avogadrovo číslo = 6 . 1023

Koncentrace glutamátu = 1 mM

V = 1000 nm3

Kolik molekul Kolik molekul glutamglutamáátutu je v blje v blíízkosti NMDA zkosti NMDA receptoru breceptoru běěhem hem synapticksynaptickééhoho ppřřenosu?enosu?

54

8 nm

6.5 nm

Kolik molekul Kolik molekul glutamglutamáátutu je v blje v blíízkosti NMDA zkosti NMDA receptoru breceptoru běěhem hem synapticksynaptickééhoho ppřřenosu?enosu?

Odpověď:

1 molekula glutamátu (0.6)

55

8 nm

6.5 nm

Jakou drJakou drááhu urazhu urazíí molemolekula kula glutamglutamááttu bu běěhem hem 1 ms1 ms??

Difúze a Brownův pohyb

56

8 nm

6.5 nm

Jakou drJakou drááhu urazhu urazíí molemolekula kula glutamglutamááttu bu běěhem hem 1 ms1 ms??

Odpověď:

1 μm

1 μm

57

ExcitaExcitaččnníí postsynaptickpostsynaptickéé proudyproudy

58

AMPA receptor EPSC

NMDA receptor EPSC

Regulace uvolRegulace uvolňňovováánníí glutamglutamáátutu

59

Glutamát

Metabotropní GLUreceptor

Presynaptický neuron

„„UptakeUptake““ glutamglutamáátutu

Glutaminsyntáza

60

bicuculine, strychnine, CNQX, TTXNMDA mEPSC

Kolik NMDA receptorKolik NMDA receptorůů je aktivovje aktivovááno bno běěhem EPSC? hem EPSC?

61

bicuculine, strychnine, CNQX, TTXNMDA mEPSC

S = i/U (50 pS)i = 50.10-12 x 40.10-3

i = 2 pA

? otevřených iontových kanálů20 pA / 2 pA = 10

? NMDA receptorůPo = 10%100 NMDA receptorů

Kolik NMDA receptorKolik NMDA receptorůů je aktivovje aktivovááno bno běěhem EPSC? hem EPSC?

62

Kolik NMDA receptorKolik NMDA receptorůů je aktivovje aktivovááno bno běěhem EPSC? hem EPSC?

1 μm

100 nm

10 nm

63

Trvá asi 1s od doby co NMDA receptor vstoupil do synapse než z ní opět vystoupí

Receptory se v membrReceptory se v membráánněě pohybujpohybujíí

64

AMPA receptory lišící se podjednotkovým složením

DvDvěě rrůůznznéé glutamglutamáátergntergníí synapse na neuronu mohou msynapse na neuronu mohou míít t postsynaptickypostsynaptickyjak AMPA tak NMDA receptory s rjak AMPA tak NMDA receptory s růůzným zným podjednotkovýmpodjednotkovým slosložženeníímm

NMDA receptory lišící se podjednotkovým složením

65

NMDA receptor

AMPA receptor1 s

AMPA a NMDA receptory

NMDA receptory

RelativnRelativníí zastoupenzastoupeníí AMPA a NMDA receptory se mAMPA a NMDA receptory se můžůže me měěnit.nit.

66

DlouhodobDlouhodobéé zmzměěny ny úúččinnosti innosti synapticksynaptickééhoho ppřřenosu enosu

((Long Term Potentiation Long Term Potentiation –– LTPLTPLongLong Term Term DepressionDepression -- LTD) LTD)

67

Experientální uspořádání

Test

Kontrola

CA3 neurony

Schafferovykolaterály (z CA3

neuronůCA1

neuron

DrážděníSchafferových

kolaterál TEST

DrážděníSchafferových

kolaterál KONTROLA

Hipokampus

Potkaní mozek

Am

plitud

a EP

SC (

mV)

CA1

neur

ony

Am

plitud

a EP

SC (

mV)

CA1

neur

ony

CA1 neuron bez depolarizace

CA1 neuron s depolarizací

DlouhodobDlouhodobáá potenciacepotenciace synapticksynaptickééhoho ppřřenosu LTPenosu LTP

68

Vysokofrekvenční stimulaceNízkofrekvenční stimulace

Mírné zvýšení [Ca2+] Značné zvýšení [Ca2+]

Zvýšení [Ca2+]

Ca2+/Calmodulin kináza a protein kináza CCa2+ závislá fosfatáza

Fosforylované synaptické proteiny

Defosforylované synaptické proteiny

LTP

LTD

AMPA receptorNMDA receptor

69

PresynaptickPresynaptickýý mechnismusmechnismus LPTLPT

Presynaptická část

Presynaptická část

Postsynaptická část

Postsynaptická část

Am

plitud

a EP

SC

Am

plitud

a EP

SC

LTP

Kontrola

[Ca2+]

NO, CO …Indukce LTP

70

[Ca2+]

1. 1. PoPosynapticksynaptickýý mechnismusmechnismus LPTLPT

Indukce LPT

Am

plitud

a EP

SC

Kontrola

Am

plitud

a EP

SC

bez Mg2+

LTP

Presynaptická část

Postsynaptická část

NMDA receptory AMPA receptory

AMPA receptor EPSC

NMDA receptor EPSC

71

[Ca2+]

Indukce LPT

Kontrola

Am

plitud

a EP

SC

LTP

Am

plitud

a EP

SC

Presynaptická část

Postsynaptická část

NMDA receptoryAMPA receptory

Fosforylace

2. 2. PoPosynapticksynaptickýý mechnismusmechnismus LLTTPP

72

ExcitotoxicitaExcitotoxicita

73

Fyziologie a patologie NMDA receptorFyziologie a patologie NMDA receptorůů

• LTP • Vývoj• Synaptický přenos

• LTP • Vývoj• Synaptický přenos

NMDA receptoryNMDA receptoryNMDA receptory

• Zvýšená excitabilita• Poruchy kognitivních funkcí• Neurodegenerace (excitotoxicita)

• Zvýšená excitabilita• Poruchy kognitivních funkcí• Neurodegenerace (excitotoxicita)

+

-74

Kontrola Glutamát 30 min

ExcitotoxicitaExcitotoxicita

A B

Synaptickéreceptory

Mimosynaptickéreceptory

Syndrom „čínské restaurace"

75

80 s100 μM glutamátu na 2s

Vliv Vliv glutamglutamáátutu na intracelulna intraceluláárnrníí koncentraci Cakoncentraci Ca2+2+

76

ExcitotoxicitaExcitotoxicita • Hromadění K+ extracelulárně• Nedostatečný uptake glutamátu• Zvýšená extracelulární koncentrace

glutamátu• K+ vyvolaná depolarizace neuronů• K+ vyvolané zvýšené uvolňování glutamátu• Dlouhodobá aktivace NMDA receptorů• Snížená míra blokády NMDA receptorů Mg2+

77

Mechanismus bunMechanismus buněčěčnnéé smrtismrti

78

• Alzheimerova choroba • Důsledky mozkové příhody• Tramatické poškození mozku • Parkinsonova choroba• Tardivní dyskinezie• Huntingtonova choroba• Amyotrofická laterální skleroza• Olivopontocerebellar degenerace• AIDS• Alergická encefalomyelitida

““GlutamGlutamáátergntergníí““ teorie vzniku:teorie vzniku:

• Epilepsie• Anxieta• Deprese• Schizofrenie• Chronická bolest• Léková závislost

Výrazná neurodegenerace Další

79

AcetylcholinAminy (katecholaminy)Aminokyseliny

GlutamátGABAGlycin

PeptidyPurinyPlynyLipidy

80

α (alfa) podjednotka (6) GABRA1, GABRA2, GABRA3, GABRA4, GABRA5, GABRA6 β (beta) podjednotka (3) GABRB1, GABRB2, GABRB3γ (gama) podjednotka (3) GABRG1, GABRG2, GABRG3 δ (delta) podjednotka (3) GABRDε (epsilon) podjednotka GABREπ (pi) podjednotka GABRPθ (theta) podjednotka GABRQ

ρ (rho) podjednotka GABRR1, GABRR2, GABRR3 (ty se však nespojují s GABRA –Q podjednotkami, ale homooligomerizují se navzájem a vytvářejí GABAA-ρ receptors (dříve GABAC receptory) – Vyskytují se v sítnici.

IonotropniIonotropni GABAGABAAA receptoryreceptory

BarbiturátyDiazepam (Valium)EthanolInhalační anestetika

(vliv anxiolytický, hypnotický)

GABAA receptory jsou tvořeny pěti podjednotkami – vždy obsahují α a βpodjednotky – nejčastější podjednotkovésložení je α2β2γ

IonotropniIonotropni GABAGABAAA receptoryreceptory

AcetylcholinAminy (katecholaminy)Aminokyseliny

GlutamátGABAGlycin

PeptidyPurinyPlynyLipidy

83

Glycinový receptor se skládá z pěti podjednotek

α-podjednotka (α1-4) GLRA1, GLRA2, GLRA3, GLRA4(váže glycin)

β-podjednotka (GLRB)

Iontový kanál je propustný pro Cl-

Tento typ receptoru je exprimován především v míše

Existují jak čisté glycinergní synapse tak smíšenéglycinergní a GABAminergní

IonotropniIonotropni glycinový receptorglycinový receptor

84

Strychnos nux-vomica LStrychnin

Farmakologie glycinovFarmakologie glycinovéého receptoruho receptoru

85

AcetylcholinAminy (katecholaminy)

DopaminNoradrenalinSerotoninHistamin

AminokyselinyPeptidyPurinyPlynyLipidy

86

Typ Iono/Metabotropní Mechanismus Účinek

5-HT1 Gi/Go Snižuje hladinu cAMP Inhibitory

5-HT2 Gq/G11 Zvyšuje IP3 and DAG. Excitační

5-HT3 Ligand-gated Na+ and K+ kanál. Depolarizace Excitační

5-HT4 Gs Zvyšuje hladinu cAMP Excitační

5-HT5 Gi/Go Snižuje hladinu cAMP Inhibiční

5-HT6 Gs Zvyšuje hladinu cAMP Excitační

5-HT7 Gs Zvyšuje hladinu cAMP Excitační

5-HT receptor

Serotoninové receptory modulujíuvolňování řady neuropřenašečuglutamátu, GABA, dopaninu, noradrenalinu, acetylcholinu….

SerotoninovSerotoninovéé receptoryreceptory

5-HT3 jsou ionotropní receptory –složené z pěti podjednotek HT3A – HT3E – jsou exitační.

CNS – úzkostPNS – nocicepce (C vlálkna)

87

AcetylcholinAminyAminokyselinyPeptidyPurinyPlynyLipidy

88

ACh RECEPTOR –PODJEDNOTKOVÉ SLOŽENÍ

α podjednotka ACh receptoru:

4 transmembránové oblasti (M1, M2, M3, M4)

2 mimomembránové oblasti (extracelulární pr., cytosol)

8 nm

2,5 nm

Extracelulárníprostor

Cytosol

Extracelulárníprostor

Cytosol

ACh RECEPTOR –POHLED SHORA

Cytoplazmatickédomény

Extracelulárnídomény

Membránovédomény

17 nACh podjednotek

Nervový typ Svalový typ

(α1)2β1δε

(α1)2β1δγ

(α3)2(β4)3 Automomní ganglia

(α4)2(β2)3 CNS

(α3)2(β4)3

(α7)5

NikotinickýNikotinický Ach receptorAch receptor

89

Na+ kanál ve svalu

Ca2+ kanál

AChR kanál

NeuronálníNa+ kanál

K+ kanál

Uvolnění ACh

Acetylcholinesterasa

Acetylcholin(ACh)

Bungarus fasciatus

Alfa-Bungarotoxin

Tubocurarin

Strychnos Toxifera

Sarin (Organofosfáty)

90

Botulotoxin (klobásový jed) je produkován bakteriíClostridium botulinum. Je to možná absolutněnejúčinnější jed - 100 g by stačilo k vyhubení celého lidstva. BT – brání presynaptickým vesikulům, aby splynuly s membránou a uvolnily ACh.

Acetylcholin

Nervová plasticita - paměťProbouzeníPozornost

Alzheimerova choroba(inhibitory cholinesterázy)

CholinergnCholinergníí ppřřenos v CNSenos v CNS

91

AcetylcholinAminy (katecholaminy)AminokyselinyPeptidyPurinyPlynyLipidy

92

93

PurinergnPurinergníí receptory receptory

Purinergní receptory

Ionotropní receptory –(P2X1 – P2X7)hetero nebo homotrimery; kanál je propustný pro Na+/Ca2+

CNS i PNSmoduluje srdeční činnost, tonus hladkých svalových vláken cév, nocicepce)

Metabotropní receptory –(P2Y1 -P2Y15; jen některé u člověka, ↑Ca2+ nebo ↑↓cAMPCNS? PNS pravděpodobně společně s noradrenalinem)

AcetylcholinAminyDopaminNoradrenalinSerotoninHistaminAminokyseliny

GlutamátGABAGlycin

PeptidyPurinyPlyny

NOCO

Lipidy94

Ionotropní receptory

Metabotropní receptoryZZáávvěěrr

… a jestli máte pocit, že byste rádi studovali iontové kanály - tak

vám pomůžeme. vyklicky@biomed.cas.cz

Děkuji za pozornost95