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ISABELLE WEPPE
ÉVALUATION DE LA STRATÉGIE ANTISENS POUR L'ÉTUDE DU RÉCEPTEUR 13, DE LA DOPAMINE CHEZ LE PRIMATE.
Mémoire presenté
à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval
pour l'obtention du grade de maître ès sciences (M-Sc.)
Neurobiologie FACULTÉ DE MÉDECINE
Université Laval
O Isabelle Weppe, 2000
National Library Bibliothèque nationale du Canada
Acquisitions and Acquisitions et Bibliograp hic Services se~-ces bibliographiques 395 Wellington Street 395. rue Wellington OtîawaON KiAûN4 Ottawa ON K I A ON4 canada Canada
The author has granted a non- exclusive licence allowing the National Library of Canada to reproduce, loan, distribute or sell copies of this thesis Hi microform, paper or electronic formats.
The author retains omership of the copyright in this thesis. Neither the thesis nor substantial extracts ikom it may be printed or otherwise reproduced without the author's permission.
L'auteur a accordé une licence non exclusive permettant à la Bibliothèque nationale du Canada de reproduire, prêter, distribuer ou vendre des copies de cette thèse sous la forme de microfiche/nlm, de reproduction sur papier ou sur format électronique.
L'auteur conserve la propriété du droit d'auteur qui protège cette thèse. Ni la thèse ni des extraits substantiels de celle-ci ne doivent ê e imprimés ou autrement reproduits sans son autorisation,
La stratégie antisens devient un outil d'investigation de plus en plus utilisé en
Neurosciences, Elle a permis la caractérisation des propriétés pharmacologiques et des
fonctions biologiques de certains récepteurs. Ceci est dû à la découverte rapide de la
structure moléculaire de nouveaux sous-types de récepteurs dont les fonctions sont mal
connues. Les ODNs antisens permettent de réduire I'expression, et ce, de façon sélective
d'un sous-type particulier de récepteur, alors qu'encore beaucoup d'agents
pharmacologiques traditionnels ne permettent pas d'obtenir un tel résultat,
Dans un premier temps, et pour me familiariser avec la technique antisens,.nous
avons tenté de bloquer, via des ODNs antisens, la synthèse des récepteurs 5HT-, chez
le rat 11 m'a paru néanmoins important de présenter ici les résultats de cette étude. Nous
avons donc bloqué la synthèse des récepteurs 5HT-, et d'observer ses effets sur
l'expression de différents facteurs de transcriptions et neuropeptides. Cependant, notre
ODN antisens reste sans effet observable sur les sites de liaison SKI'-,. En revanche,
I'ODN mismatch semble avoir des effets non-spécifiques alors que théoriquement il ne
devrait pas s'hybrider avec I'ARNrn du récepteur 5HT-,.
Dans un deuxième temps, nous nous sommes attachés à bloquer la synthèse du
récepteur Dopaminergique D2 chez un singe normal, et ce, unilatéralement au niveau
des noyaux gris centraux dans le but créer une asymétrie du système dopaminergique et
de mieux comprendre le rôle de ce récepteur dans l'activité motrice. Ces résultats nous
permettrons de mieux appréhender, à plus long terme, le rôle des RD, dans la maladie
de parkinson et dans les troubles moteurs liés à cette maiadie. Les résultats suggèrent
que le blocage des RD2, au niveau du putamen et du noyau caudé par des ODNs
antisens, entraîne une diminution de l'utilisation de la main contralatérale alors que les
résultats suite à I'injection d'ODN antisens dans le putamen et le noyau accumbens
montrent une augmentation de l'utilisation de la main.
Ces résultats sont préliminaires certes, cependant ils permettront d'affiner la
mise au point de la stratégie antisens chez le primate.
Danid L~%ESOUE lsabelIe WEPPE
AVANT-PROPOS
Je voudrais tout d'abord remercier mon directeur de maîtrise le Dr. Daniel Lévesque et
mon codirecteur le Dr. Paul J. Bédard pour m'avoir accueilli dans leurs laboratoires. Leurs
valeurs scientifiques, leur patience, leur confiance ainsi que leurs encouragements m'ont été
d'une aide précieuse. Je remercie également le Dr. Paul J. Bédard pour son soutien financier
au cours de ma maîtrise.
Je remercie le Dr. Claude Rouillard pour ses conseils précieux et le Dr Guy Drolet pour
m'avoir fait 1 'honneur d'évaluer mon mémoire.
Je tiens aussi à remercier toute l'équipe du laboratoire de Daniel Lévesque pour
I'ambiance de travail et de sympathie dans le labo tout au long de ma maîtrise. Et tout
particulièrement Geneviève Beaudry et Laurent Grégoire pour leur patience sans limites, leur
aide de tous les instants.
Je voudrais aussi remercier tous les étudiants, assistants de recherche, secrétaires et
chercheurs de l'unité de Neurosciences qui, par leur chaleur et leur disponibilité, ont crée une
grande famille autour de moi.
Enfin, je tiens à remercier très particulièrement mes parents pour leurs soutiens, leur
confiance et leurs encouragements dont ils ont toujours fait preuve au cours de mes études.
AC
AMR + AMPc - ADN
ARNrn
Cx Cing
Cx PréF
DA
EPS
i.c.
i c v .
EG
IP + L-DOPA
LCA
N. Acc.
ODN(s)
PS-O
m l 7 29 3 9 Ji 5
RD2
mm-, SN
SNC
SNc
SNr
StDL
StVL
Tub. O.
Sm
Adenylyi cyclase
Stimule l'adénosine mono phosphate cyclique
inhibe l'adénosine mono phosphate cyclique
Acide désoxyn'bonucléique
Acide ribonucléique messager
Cortex cingulaire
Cortex préfrontal
Dopamine
Symptômes extrapyramidaux
Intra-cérébrale
Intra-cérébro-ventriculaire
Gène à réponse précoce
Stimule phosphatidyl inositoI
L-3,4dihydroxyphenylalanine
Liquide céphalorachidien artificiel
Noyau accumbens
OligodéoxynucIéotide(s)
Oligonucléotide phosphorothioate
récepteur D,, Da, D3, D4, D5 de la dopamine
Récepteur doparninergique D,
Récepteur sérotoninergique 5HT-,
Substance noire
Système nerveux centrai
Substance noire pars compacta
Substance noire pars reticulata
Striatum dorsolatéral
Striatum ventrolatéral
Tubercule olfactif
Sérotonine
LISTE DES FIGURES ET TABLEAUX :
FIGURE 1 :
FIGURE 2 :
TABLEAU 1 :
FIGURE 3 :
FIGURE 4 :
CHAPITRE PREMIER : INTRODUCTION
Les différents mécanismes d'actions de I'ODN antisens avec I'ARNm.
Ossature d'un PS-O, changement d'un Oxygène par un Soufre,
Synopsis de la classification des récepteurs dopaminergiques.
Coupe transversale, d'un cerveau de primate, au niveau des ganglions
de la base,
Physiopathologie de la maladie de Parkinson,
CHAPITRE TROISIÈME : MATÉRIELS ET MÉTHODES
FIGURE 5 :
TABLEAU 2 :
FIGURE 6 :
FIGURE 7 :
FIGURE 8 :
FIGURE 9 :
Représentation schématique des régions échantiIlonnées pour
l'analyse des niveaux d'ARNm des facteurs de transcriptions et des
neuropeptides.
Séquences des différentes amorces utilisées pour obtenir une partie de
la séquence du gène R D2 de macaca fmcicularis.
Position des amorces sur l'ADN du récepteur dopaminergique D1.
Schéma de la transcription inverse.
Effets de I'ODN antisens 5HT-, et de I'ODN misrnatch sur les niveaux des
sites de liaison des récepteurs 5HT-, au niveau du Cortex préfrontal
(Cx PréF).
Effets de 1'ODN antisens SHT-, et de L'ODN mismatch sur Ies niveaux des
sites de liaison des récepteurs 5HT-,. A :du corps du noyau accumbens
(NAC), B : de la coquille du noyau accumbens (NAS).
FIGURE 10 :
FIGURE 11 :
FIGURE 12 :
FIGURE 13 :
FIGURE 14 :
GEL 1 :
FIGURE 15:
FIGURE 16 :
FIGURE 17 :
FIGURE 18 :
Effets de I'ODN antisens et de i'ODN mismatch Sm-, sur les niveaux des
sites de liaison des récepteurs 5HT-,, A : du striatum dorsoiatéral (St DL),
B :du striatum ventrolatérai (St VL).
Effets de I'ODN antisens et de I'ODN rnismatch 5HT-, sur Ies niveaux des
ARNm de c-fox
Effets de I'ODN antisens et de I'ODN mismatch 5HT-, sur les niveaux des
ARNm de NGFI-B.
Effets de I'ODN antisens et de I'ODN mismatch 5HT-, sur les niveaux des
ARNm de Neurotensine.
Effets de I'ODN antisens et de I'ODN mismatch 5HT-, sur les niveaux des
ARNm de Dynorphine.
Résultats des PCR sur gels d'agarose L %-
Séquence obtenue du gène RD, de macaca fascicularis.
Effet d'une double injection intracérébrale ponctuelle (Cd, Put,) d'ODN
antisens Dz sur la préférence d'utilisation des mains chez le macaque
(SOpg/site/injection).
Effet d'une double injection intracérébrale ponctuelle (Cd, Put.) d'ODN
antisens D-, sur la préférence d'utilisation des mains chez le macaque
( LOOpb/site/injection).
Effet d'une double infusion intracérébrale continue (Put., Acc) d'ODN
antisens D-, sur la préférence d'utilisation des mains chez le macaque
( LOpgIpl- L pl/h),
TABLEAU 3 : Effet des injections sous cutanées de quinpirole sur Le comportement moteur
du singe traité par des ODNs antisens RD,.
TABLEAU 4 : Effet d'injections i.c. sur le comportement moteur du singe sans traitement
ODN antisens RD,.
Résumé ............................................................................................... i . . Avant.propos ........................................................................................ II . . . * . * Abreviations ........................................................................................ 111
Liste des figures et tableaux. ..................................................................... iv .. Table des rnatieres .................................................................................. vi
CHAPITRE PREMIER INTRODUCTION ..................................................... 1
1-Introduction à la technique antisens ................ .. ............................................... 2
1 -Mode d'action .............................................................................. 2
2-Applications aux Neurosciences ........................................................ -5 II-Introduction aux récepteurs de la sérotonine ................................................... -7
.............................. 1-Le récepteur de la sérotonine Sm, et la schizophrénie 8
UT-Introduction aux récepteurs de la dopamine ................................................... 10
L-Le récepteur dopaminergique D2 ....... .... ..... ......................................... 11
2-Anatomie et physiopathologie des noyaux gris centraux .......................... -12
3-La maladie de Parkinson ................................................................. 15
CHAPITRE DEUXIÈME PROBLÉMATIQUE .............................................. 18
1-Application de ta stratégie antisens au récepteur de la sérotonine SHT., chez le rat ...... 19
1-Pertinence de la recherche.. ............................................................. 19
2-Hypothèses et objectifs ................................................................... 20
II-Application de la stratégie antisens au récepteur de la dopamine D2 chez le macaque .. -22
I -Pertinence de la recherche .......... .,. ... ,.., ........................................ 22
2-Hypothèses et objectifs ............................................... ,. ................ -24
....... CHAPITRE TROISDÈME MATÉRIELS ET MÉTHODES ................. .. -27
[-Animaux et administration des ODNs SHT., .................................................. -28
II-Test de liaisons (binding) des récepteurs 5HT-, m3] Kétansérine ........................... 29
III-Hybridation in situ sur les coupes du protocole antisens Sm, ............................ 31
1-Synthèse des ri bosondes ................................................................. 31
2-Réactions d'hybridations in situ ........................................................ 32
N-Clonage du récepteur dopaminergique D2 de macaca fascicularis .......................... 34
1-Transcription inverse ..................................................................... 36
V-Les ODNs RD2. ..................................................................................... -38
VI-Les administrations des ODNs au singe macaca fascicularis. .............................. -39
1-L'anesthésie du singe ..................................................................... 39
2-Expériences de micro-injections d'ODN antisens.. ................................. -39
3-Expérience d'infusion continue d'ODN antisens .................................... -40
4Les tests d'utilisation de la main.. ..................................................... -41
5-Les injections de quinpirole... .......................................................... -41
CHAPITRE QUATRIÈME RÉSULTATS ..................................................... 42
1-Résuitats de la stratégie antisens appIiquée au RSHT- ,.. ...................................... 43
............. 1-Effet de I'ODN antisens et de I'ODN mismatch sur les EHT- , ..... 43
2-Effet de I'ODN antisens et de 1'ODN mismatch sur les niveaux d'ARNm des
facteurs de transcription et des neuropeptides ......................................... -47
II-Résultats de la stratégie antisens appliquée au RD, de rnacaca fascicularis ............. - 3 2
1-Résultats du clonage du gène RD, de macaca fmcicularis ......................... 52 a- Résultats des PCR .................................................................... 3 2
b- Résultats du séquençage du gène RD , ............................................. 53
2-Résultats des micro-injections ponctuelles ....... ... .. ...................... .. ....... .54 a- 5 pgipl. ............................................................................... -54
b- 10 &pl ................................................................................ 55
3-Résultats de l'infusion continue ...................................................... - 3 3
4Résultats des injections de quinpirole .................................................. 60
CHAPITRE CINQUJÈME DISCUSSION .................................................. -63
1-Évaluation de la stratégie antisens appliquée au récepteur 5HT, chez le rat ............... 64
II-Évaluation de la stratégie antisens appliquée au récepteur D, chez le singe macaca
fascicularis ............................................................................................ -66
1-Le séquençage du gène RD, de macaca fascicularis ................................ 66 2-La stratégie antisens appliquée au RD2 de primate et la préférence d'utilisation
de la main ..................................................................................... 67
CONCLUS ION ........................................................................................ -72
B IBLIOGRAPHIE ..................................................................................... 73
CHAPITRE PREMIER
Introduction
1-in traduction à la tee hniaue an tisens.
1- Mode d'action.
Les Oligodéoxynucléotides (ODNs) antisens sont de petits fragments synthétiques
d'acide désoxyribonucléique (ADN) ou d'acide ribonucléique (ARN), habituellement appelés
ODNs antisens et ayant une action au niveau génique. Ils sont généralement désignés pour
être complémentaire d'une petite séquence d'un ARNm cible. Les ODNs antisens inhibent
ainsi la traduction de l'acide ribonucléique messager (ARNm) cible en se liant à une séquence
unique et ce, de façon, séquence spécifique. Cette liaison, par hybridation spécifique de
ltODN avec I'ARNm de la protéine ciblée, permet d'inhiber spécifiquement la synthèse de la
protéine codée.
Les ODNs sont concus pour réguler l'information qui est transférée du gène à la
protéine. La meilleure cible gour les ODNs est donc I'ARNm. Les ODNs vont agir à
différents stades du métabolisme intermédiaire de I'ARNm et ainsi altérer la synthèse
protéique (figure 1) (Croo ke, 2000).
Tanscription - Transcriptional Arrest
Effects on OegfadaUon
m e 1 : Les différents mécanismes d'actions de I'ODN antisens avec 1'ARNm
(Croo ke, 2000).
Cette liaison peut inhiber la transcription. C'est le cas lorsque llODN se fixe sur la
double hélice d'ADN formant ainsi un triplex. Dans le cas de la liaison de lfODN avec
lfARNm, cela entraîne une inhibition de l'interaction de I'ARNm avec les protéines, d'autres
acides nucléiques et les facteurs essentiels aux étapes du mécanisme intermédiaire de
1' ARNrn.
Ces mécanismes dépendent de la chimie de I'ODN et de son site de liaison avec
1'ARNrn. Au court de cette recherche nous avons utilisé des ODNs antisens désignés pour
inhiber la traduction. Parmi les mécanismes d'actions visés par la stratégie antisens, l'arrêt de
la traduction représente le plus couramment ciblé, La plupart des ODNs qui ont été
synthétisés pour arrêter la traduction de la protéine cible, reconnaissaient spécifiquement la
séquence contenant le codon d'initiation (Crooke, 1999; Crooke, 2000). Cette hybridation va
donc empêcher la fixation des ribosomes au site d'initiation, inhiber le phénomène
d'élongation et ainsi empêcher la traduction de 1'ARNm (Baker et Monia, 1999; Cooper et
coll., 1999).
Avant d'émettre une conclusion à partir d'observations expérimentales, l'utilisation des
ODNs antisens nécessite la prise en compte de différents paramètres essentiels. Ces
paramètres sont : la stabilité, la pénétration cellulaire, la sélectivité et l'affinité, l'activité et le
mécanisme d'action, la tolérance, la bio disponibilité et la fabrication (Phillips et Zhang,
2000). Pour induire son effet biologique, un ODN antisens doit se lier spécifiquement et avec
un degré d'affinité élevé à sa cible ARNm. La dégradation des antisens représentait une autre
difficulté à surmonter lorsque ces derniers commencèrent à être utilisés comme agents
thérapeutiques (Agrawal, 1999).
Les ODNs composés de liens phosphodiesters ne sont pas de bons candidats pour la
stratégie antisens. En effet, ils sont très rapidement dégradés par les nucléases avant même
d'avoir atteint leur cible (Agrawal, 1999). Plusieurs structures modifiées des ODNs
phosphodiesters ont donc été synthétisées et testées. L'objectif de ces travaux est d'augmenter
la demi-vie des ODNs tout en conservant leur capacité à traverser la membrane cellulaire et à
se lier avec un degré d'affinité et de sélectivité élevée à leur cible ARN (De Mesmaeker et
coli., 1995; Zhou et Agrawai, 1998; Cooper et coII., 1999; Giles et coll., 2000; Nielsen, 2000).
Même si chacun des trois composants dVODN (base, sucre et liaison phosphodiester) peut être
modifié, les changements les plus importants ont été apportés à la liaison.
Les oligodéoxynucléotides phosphorothioates (PS-O) sont les plus utilisés de la première
génération d'ODNs modifiés. Un des atomes d'oxygène de la liaison phosphodiester est
remplacé par un atome de soufre (figure 2).
PO Iinkage
Figure 2 :Ossature d'un PS-O, changement d'un Oxygène par un Soufre
(Agrawal et Iyer, 1997).
Cette modification, au niveau de la liaison de PS-O, a permis de considérablement
augmenter la résistance de cet ODN antisens aux nucléases. Les PS-O sont devenus les
"antisens standard" étant donné leur facilité de synthèse et leur bonne résistance aux
nucléases. Ils sont également de bons substrats pour l'activation de la endoribonucléase H
(RNAse H) (Agrawal, 1999; Monteith et Levin, 1999). La RNAse H est une enzyme
omniprésente chez les procaryotes comme chez les eucaryotes. La RNAse H est présente dans
le noyau mais aussi dans le cytoplasme et son activité est variable suivant le type cellulaire.
Elle dégrade spécifiquement le brin d'ARN du duplex Am-ADN. L'hybridation de lYODN
antiwns avec I'ARNm va donc eniraîner une déagadation de ITARNm cible et empêcher son
utilisation pas la cellule (Crooke, 1998; Baker et Monia, 1999).
La taille de I'ODN antisens est essentielIe e t a fait l'objet de nombreuses études.
Actuellement, il est bien démontré que la taille de I'ODN doit se situer entre 15-20 bases pour
être spécifique de la séquence pour laquelle il est désignd et s'hybrider avec sa cible ARNm
avec un bon degré d'affinité (Stein, 1998; Agrawal, 1999). Si ltODN possède moins de 15
bases le risque d'être non-spécifique augmente et s'il est plus long que 25 bases un autre
problème se pose ; celui de la pénétration cellulaire. Ainsi avant de choisir la séquence de
I'ODN antisens il est important de connaître les structures secondaires de I'ARNm car
l'hybridation à ces endroits aura alors peu de chance de survenir (Gewirtz et coll., 1998;
Phillips et Zhang, 2000).
Pour choisir la séquence d'un ODN antisens, il est donc important de faire dans un
premier temps une recherche dans GenBank pour obtenir la séquence ARNm de la protéine
que I'on veut cibler. Ensuite de bien choisir la séquence que I'on veut cibler ; les trois régions
Ies plus utilisées sont : la région 5'-cap, le codon d'initiation et la région 3'non traduite de
I'ARNm. 11 est impératif d'éviter les séquences palindromiques. Enfin il convient de choisir
une séquence avec un bon ratio ATKG et d'éviter le quartet G ainsi que les séquences CpG
(Gewirtz et coll., 1998; Steiii, 1998; Stein, 1999; Myers et Dean, 2000).
2- A ~ ~ l i c a ü o n s Dour les Neurosciences.
La technique antisens se développe de plus en plus dans le domaine des
Neurosciences- Spécialement dans les études sur les récepteurs métabotropiques- La stratégie
antisens a été très performante dans Ia caractérisation des propriétés pharmacologiques et des
fonctions biologiques de certains récepteurs (Weiss et coll., 1997a; Davidkova et Weiss,
1998). Ceci est dû à la découverte rapide des structures moléculaires de nouveaux sous-types
de récepteurs métabotropiques dont les fonctions sont encore mal définies (pharmacologiques,
biologiques et comportementaIes). Les ODNs antisens permettent de réduire l'expression d'un
sous-type particulier de récepteur, et ce de façon spécifique, alors qu'encore beaucoup
d'antagonistes traditionnels ne permettent pas d'obtenir un tel résultat.
Le tissu nerveux est un milieu propice à I1utiIisation de la stratégie antisens. En effet,
l'entrée des ODNs antisens dans les cellules nerveuses et gliales se fait facilement et ne
nécessite pas l'ajout de molécules "porteuses" comme, par exemple des lipides cationiques
nécessaire dans d'autres systèmes (Whitesell et coll,, 1993; Sommer et coll., 2000).
L'administration des ODNs antisens doit se faire soit directement dans le site ou dans le(s)
ventricule(s). Cette administration intra-cérébrale (i-c.) ou intra-cérébro-ventriculaire (i.c.v.)
peut se faire de façon ponctuelle ou par infusion continue (pompe) (Whitesell et coll., 1993;
Ogawa et coll., 1995). La diffusion de I'ODN dans le tissu est dépendante de différents
facteurs à savoir: le type d'injection, du volume injecté, de la concentration de la solution
injectée, de la durée de l'injection et enfin du site de l'injection (Whitesell et coll., 1993;
Rajakumar et coll., 1997; Crooke, 2000). Malheureusement, les administrations d7ODN en
intra-veineuse ou intra-péritonéale n'ont pas montré la présence dlODN dans le cerveau. Cela
pose donc un important problème quant à Ifutilisation des ODNs antisens comme agents
thérapeutiques (Broaddus et coll-, 1998; Sommer et coll., 2000).
Un autre point important est la faible dégradation et la relative stabilité des ODNs dans le
système nerveux comparativement au niveau périphérique. En effet, deux facteurs contribuent
à la stabilité des ODNs antisens dans le système nerveux : le liquide céphalorachidien possède
peu d'exo-et endonucléases et le tissu nerveux est non-prolifératif (Peng Ho et coll., 1998;
Phillips et Zhang, 2000).
Notons également deux avantages qui ont participé au développement de la technique antisens
en Neurosciences. D'abord, la forte augmentation de l'effet physiologique comparé à la faible
magnitude des changements observés de la protéine ciblée notamment dans les études des
récepteurs D, (RD& des récepteurs de l'ocytocine ou encore de la progestérone (Weiss et
coll., 1993; Zhang et Creese, 1993; Ogawa et PfafT, 1996; Zhang et coll., 1996a; Weiss et
coll., 1997a). Cependant, il est important de mentionner ici que cette observation ne peut pas
servir de règle absolue et être généralisée. Enfin, le fait que l'expression génique soit très
régionalisée, il est possible de cibler spécifiquement un récepteur dans une région très définie
du cerveau alors qu'il est plus délicat de bloquer, par exemple, des gènes viraux dans la
circulation sanguine (Weiss et coll., 1997a).
La stimulation des cellules nerveuses du système nerveux central (SNC) peut avoir des
effets permanents ou semi-permanents sur Ie fonctionnement du cerveau. Dans de nombreux
cas, ces changements sont le résultat de l'activation de facteurs de transcriptions dont certains
font partie des gènes à réponse précoce (IEG) (comme c-fos, jun-B, erg-1 ...). Le rôle des IEG
a donc aussi été étudié, dans différentes parties du cerveau, grâce à la technique antisens
(Chiasson et coll., 1997; Chiasson et coll., 1998).
Les cas de récepteurs ayant fait l'objet d'étude sont nombreux. Les récepteurs de la
dopamine (DA) ont été très étudiés. En effet, l'implication de la DA dans de nombreuses
maladies telles que ; la maladie de Parkinson ou la schizophrénie a suscité l'intérêt des
chercheurs et il est devenu essentiel de comprend Ie rôle précis de chacun des récepteurs
dopaminergiques pour mieux soigner ces maladies (Weiss et coll., 1993; Zhang et Creese,
1993 ; Weiss et coll., 1997c; Tremblay et coll., 1998).
Les récepteurs sérotoninergiques, Muscariniques, opioides, NMDA-.. ont également fait
l'objet d'études (Weiss et coll-, 1997c; Scalzitti et Hensler, 2000).
II- Introduction aux récepteurs de la sérotonine.
La sérotonine (5HT) est un neurotransmetteur présent dans le SNC, le tractus gastro-
intestinal et le sang. Au niveau cérébral, la 5HT est impliquée dans te contrôle de différentes
fonctions telles que : le cycle veille/sommeil, la nociception, la thermorégulation, les
comportements sexuels, etc ... (Hamon et Gozlan, 1993 ; Peroutka, 1995). Actuellement, il
existe de plus en plus d'évidences visant à démontrer l'implication de la 5HT dans des
affections neuropsychiques comme la dépression, I'anxiété ou la schizophrénie (Byne et coll.,
1999; Krystal et coll., 1999 ).
L'action de la 5HT au niveau du SNC se fait via plusieurs sous-types de récepteurs
sérotoninergiques. L'essor de la biologie moléculaire a permis d'isoler 15 sous-types de
récepteurs de la 5HT (Peroutka, 1995). La nouvelle classification, proposée par Humphrey et
collaborateurs en 1993, est fondée sur les caractéristiques moléculaires des sous-types ainsi
que sur les systèmes de transduction de ces derniers. Il existe donc 7 classes de récepteurs
sérotoninergiques, d'où dérivent les 15 sous-types : 5HT-,, Sm-,, 5HT-,, 5HT-,, Sm-,, 5HT-
,, 5HT-, (Humphrey et coll., 1993).
1- Le récepteur de la sérotonine 5Hï-, et la schizophrénie.
La schizophrénie est une psychose touchant 1 95 de la population mondiale (Breier,
1999 ; Dalery et D'Amato, 1999). Jusqu'à récemment, les neuroleptiques étaient
principalement des antagonistes des récepteurs doparninergiques (D, essentiellement) (Byne et
coll., 1999). Cependant, ces antipsychotiques dits typiqcres comme I'halopéridol (Haldol)
diminuent les symptômes positifs de la maladie (hallucinations, idées délirantes, excitation,
suspicion, hostilité) mais entraînent beaucoup d'effets secondaires (Crow, 1985; De Clercq et
Peuskens, 2000). En effet, une exposition chronique aux neuroleptiques entraîne des troubles
neuroendocriniens comme l'hyperprolactérnie et des symptômes extrapyramidaux (EPS)
(Barnes et Edwards, 1993). Les nouveaux neuroleptiques dits astpiques, comme la clozapine,
traitent les symptômes positifs mais également les symptômes négatifs de la maladie
(diminution ou disparition d'une fonction psychique normale comme un affect émoussé, retrait
émotionnel, pauvreté des contacts sociaux, manque de spontanéité du discours, pensée
stéréotypée) (Crow, 1985; De Clercq et Peuskens, 2000). De plus, les neuroleptiques atypiques
entraînent moins d'effets secondaires (EPS) et sont efficaces dans le traitement des symptômes
positifs et négatifs de la maladie mais aussi pour le traitement des patients résistants aux
neuroleptiques typiques (Crow, 1985; De Clercq et Peuskens, 2000). Ces agents
pharmacologiques ont une caractéristique essentielle ; à savoir qu'ils possèdent une
composante doparninergique et sérotoninergique.
Il est donc devenu crucial de distinguer précisément les effets biochimiques et
pharmacologiques des deux types de neuroleptiques. Actuellement, il existe de plus en plus
d'évidences visant à montrer que la 5HT et ses récepteurs sont impliqués dans la
paîhophysiologie et la phamacothérapie de la schizophrénie (Roth et al, 1998; Byne et coll.,
1999 ). L'intérêt des chercheurs s'est porté, plus précisément, sur les récepteurs 5HT-=
(FSHT-& (Bumet et coll., 1996a; Seeman et coll., 1996). En effet, les nouveaux
neuroleptiques atypiques, comme la clozapine, rispéridone ou olanzapine sont d'importants
antagonistes 5HT-,, Ces observations suggèrent fortement que les RSHT-, jouent un rôle
prédominant dans la pathophysiologie de la schizophrénie (Burnet et coll., 1996a; Roth et al,
1998 ; Byne et coll., 1999 ).
Des résultats d'études de liaison ont permis de localiser les MHT, au niveau
cérébral. Il semblerait que les plus hauts niveaux de R5HT-, se trouvent dans le cortex
frontal, et dans d'autres aires du néocortex, comme le cortex cingulaire (Pams et COU., 1984).
iis sont égaiement présents dans le noyau accumbens (N. Acc.) et le striatum (Pompeiano et
coli., 1994). Ces régions cérébrales (le cortex cérébral et le N. Acc.) sont reconnues pour être
associées à l'activité antipsychotique des neuroleptiques atypiques (Lucas et Hen, 1995). Dans
la mesure où des traitements chroniques de rats à la clozapine montraient une diminution de
l'expression dYARNm et des sites de liaisons des RSHT-, dans les cortex cingulaires et
frontaux, Burnet et collaborateurs en 1996, ont suggéré que l'action de la clozapine sur le
système sérotoninergique et plus spécifiquement sur les RSHT-, pourrait contribuer à son
profil atypique (Burnet et coll., 1996a).
Les facteurs de an script ions sont des protéines qui se lient à des séquences ADN
spécifiques, présentes dans les promoteurs des gènes. Cette iiaison va influencer ainsi le taux
de transcription de ces gènes. L'expression de ces facteurs de transcriptions permet
d'examiner, au niveau cellulaire, les réponses du cerveau suite à différents stimuli. Étant
donné, qu'ils sont exprimés de façon transitoire dans des populations neuronales spécifiques, il
devient ainsi possible de cartographier les « réponses » du cerveau in vivo. Dans de nombreux
cas, ces changements sont le résultat de l'activation de facteurs de transcriptions. Certains de
ces facteurs de transcriptions font partie des gènes à réponse précoce (IEG), exprimés de façon
transitoire (Robertson, 1992 ; Morgan et Curran, 1995). Des données expérimentales ont
montré que l'expression de ces marqueurs biochimiques était liée à l'administration de
neuroleptiques. De plus, leur expression dans différentes régions cérébrales a été associée au
profil clinique des neuroleptiques (typique et atypique) (Merchant et coll., 1992; Merchant et
Dorsa, 1993)
L'administration de neuroleptiques induit différents effets dans le cerveau notamment,
des effets sur I'expression des iEG et des neuropeptides (c-fos et Neurotensine) (Robertson et
Fibiger, 1992; Robertson et coII., 1995). C-fos est devenu un marqueur d'activité neuronale
très utilisé. Le un récepteur nucléaire orphelin nerve growth factor-inducible B (NGFI-B), est
également un marqueur biochimique intéressant étant donné qu'il possède un niveau
d'expression basal au niveau du striatum. De plus, il a aussi été montré que des agonistes
doparninergiques et sérotoninergiques avaient un effet sur I'expression basde de 171EG NGR-
B au niveau du striatum (Gervais et coll., 1999). Dernièrement il a été montré que
l'administration aiguë et chronique de neuroleptiques modifie l'expression de NGF'I-B chez le
rat (Eleaudry et coll., 2000).
III- Introduction aux réce~teurs de la do~amine.
La DA est un neurotransmetteur qui fait partie de la famille des catécholamines. La DA
se retrouve au niveau cérébral et au niveau pét-iphérique- Elle contrôle un grand nombre de
fonctions cérébrales comme : l'activité motrice, la cognition, l'émotion.. .
Le système dopaminergique a été intensément étudié depuis une trentaine d'annees en raison
de son impiication dans des maladies comme la maladie de Parkinson, la schizophrénie, le
syndrome de Tourette. .. (Missale et coll., 1998).
La classification des récepteurs de la DA repose sur trois paramètres : la
pharmacologie, Ia structure génétique et la signalisation cellulaire. Avant les années 90, on ne
connaissait que deux sous-types de récepteurs dopaminergiques : les récepteurs D, et les
récepteurs DZ7 car certains agonistes DA stimulaient I'adenylyl cyclase (AC) alors que d'autres
l'inhibaient ou étaient sans effet. L'essor de la biologie moléculaire a permis d'identifier
d'autres sous-types de récepteurs dopaminergiques, qui ont été dénommés chronologiquement
à leurs découvertes. Us ont été ensuite divisés selon l'ancienne classification comprenant
seulement les deux sous-types, D, et D,. IL existe donc actuellement cinq sous-types de
récepteurs dopaminergiques qui sont présentés dans Ie tableau 1 (Jackson et Westlind-
Danielsson, 1994 ; Jaber et coll., 1996)
Récenteurs tp- D,
Dl D5
Intron
Séquence codante
Chromosome
Localisation cérébrale
Tableau 1 : Synopsis de la classification des récepteurs dopaminergiques
(Inspiré de Schwartz, 1993).
Second Messager
1 - Le réce~teur dopaminer
Non Non
Waa 477aa
5q3 1 -q34 4q 16.3
Striaturn Hypothaianus
Le récepteur dopaminergique D, fut le premier à être cloné en 1988 (Bunzow et coll.,
1988). Le clonage du récepteur D2 a révélé la présence de isoformes. Les deux isoformes, la
forme D, court (D,S) et la forme D, long (D,L), different seulement de 29 acides aminés, au
niveau de la troisième boucle intra-cytoplasmique. (Da1 Toso et coll., 1989; Giros et coll.,
1989; Monsma et coll., 1989). Malgré le fait que cette dissemblance se situe dans la troisième
boucle intra-cytoplasmique, site de couplage du récepteur avec la protéine G, il ne semble pas
avoir de différence fonctionnelle entre les deux isoformes. La seule différence qu'il semble
exister se situerait au niveau de leur mode de régulation (Missale et coll., 1998).
Le RD, semble couplé négativement à I'AC, dans la majorité des lignées cellulaires
(Onali et coll., 1985; Neve et coll., 1991). Ce récepteur possède également la capacité
d'augmenter les niveaux de calcium intracellulaire via ta stimulation de l'hydrolyse du
phosphatidyl inositol (XP). D'autre part, le RD, peut réduire les concentrations intracellulaires
Oui (6) Oui (5) Oui (3)
DZL 443aa W a a 387à515aa
D, 414aa
llq22-q23 3q13.3 1 Le Striamm Tub. O. Cx PréF
H i ~ ~ o c a ~ e
APMc + APMc + N Acc, N Acc.
APMc- APMc-? APMc -
IP + K+, Ca2+ -
de calcium via l'inhibition des canaux calciques. Cette inactivation des canaux calciques
pourrait être directement liée à l'activation d'une protéine G- Enfin, le RD, est également
capable de moduler l'ouverture des canaux potassiques, la libération de l'acide arachidonique
et l'activité des pompes Na= (Jaber et coll., 1996; Missale et coll., 1998).
La localisation cérébrale du RD, chez le primate est assez bien documentée (HuntIey et
coll., 1992). Les RD, sont exprimés dans le cortex moteur comme, les récepteurs
dopaminergiques DL et D, (RD, et RD,). II existe une prédominance des RD, et RD, dans le
striatum (putamen et noyau caudé). Des expériences d'hybridation in situ ont permis de mettre
en évidence, au niveau du striatum, une ségrégation des RD, et les RD2 (Hundey et coll.,
1992). En effet, les RD, sont exprimés dans la voie striatonigrale/Substance P, alors que les
RD, sont exprimés dans la voie striatopallidale/Enképhaline (Cambier et coll., 2000). Le RD,
est le seul sous-type de récepteur dopaminergique retrouvé au niveau pré et post-synaptique.
Les RD2 se retrouvent principalement dans le striatum, le tubercule olfactif (Tub. O.) et
le N. Acc. Dans l e corps du N. Acc,, ils sont exprimés par les neurones acide y-
aminobutyrique (GABA) coexprimant l'enképhaline. Alors que dans le pôle septal de la
coquille du N. Acc., ils sont exprimés par des neurones coexprimant la neurotensine. On les
retrouve également dans la substance noire pars compacta (SNc), l'aire tegmentale ventrale et
l'hypothalamus, ils sont exprimés par des neurones dopaminergiques- Les RD, sont également
présents dans la glande pituitaire où ils régulent la production et la sécrétion de la prolactine
(Jaber et coll,, 1996; Missale et coll., 1998).
2- Anatomie et ~h~s iopa tho lo~ ie des noyaux -gis centraux.
Les noyaux gris centraux (NGC), ou ganglions de la base, forment un ensemble de cinq
structures sous corticales faisant partie du système moteur extrapyramidal. Les composantes
de cet ensemble sont le noyau caudé, le putamen, le globus pallidus qui se divise en segment
interne et externe, le noyau sous thalamique et enfin la substance noire pars reticulata et pars
compacra (SNr et SNc). Le noyau caudé e t le putarnen proviennent de la même structure
télencéphalique et l'ensemble de ces noyaux forme le striatum (figure 1) (Kandel et coll.,
1991).
Le striatum est le principal composant des ganglions de la base et semble
principalement impliqué dans le contrôle des fonctions motrices. Le striatum du primate
(noyau caudé-putamen) peut être divisé en trois composantes majeures en fonction de Leurs
afférences corticales (Parent et coll,, L995):
- La région striatale sensorimotrice regoit des afférences du cortex sensorirnoteur. Elle
comprend la partie dorsolatéraIe du putamen et le bord dorsolatéral du noyau caudé.
- La région siriatale associarive regoit des projections du cortex préfrontal, temporal, pariétal
et cingulaire. Elle correspond à la majeure partie du noyau caudé et au pôle rostral du
putamen.
- La région srriatale limbique reçoit des afférences des cortex limbiques et paralimbiques
(gyrus hippocampique, gyrus parahippocampique et cortex cingdaire). Etle correspond au N-
Acc- et au Tub- O. (Parent et coll-, 1995; Morissette et colI., 1998).
GPe
STh
Fimre 3 : Coupe transversale d'un cerveau de primate, au niveau des
ganglions de la base (Kandel et coll., 1991).
Les noyaux gris centraux sont donc des structures complexes recevant des informations
en provenance du cortex et du système limbique. L'intégration de ces fonctions, laisse
supposer qu'ils possèdent un rôle fonct io~el au niveau des fonctions cognitives. Cependant,
ils ont d'abord un rôle bien connu dans le contrôle des fonctions motrices, en raison de leur
implication directe observée dans certaines pathologies, comme la maladie de Parkinson
(Graybiel et coll-, 1994; Parent et coll., 1995). Les ganglions de la base interviennent dans les
processus de proboramniation et d'exécution des mouvements par le traitement et le filtrage de
diverses informations sensorielles-
Comme nous L'avons vu précédemment lors du paragraphe sur la localisation des
récepteurs RD2, les connections, reliant les W C , sont formées de plusieurs types de neurones
synthétisant une variété de neurotransmetteur. Le mode de transmission qui est utilisé repose
sur le principe inhibitioddésinhibition des efférences du striatum. L'information reçue par le
cortex puis envoyée au striatum donne lieu à deux voies distinctes de sorties (Kandel et coll-,
1991; Parent et coll., 1995; Cambier et coll., 2000)-
La voie striatonigrale également appelée la « voie directe » exprime les RD,, alors que la voie
striatopallidale ou « voie indirecte », exprime les RD2. La stimulation de la voie striatonigrale
mène à I'inhibition des neurones projetant vers le globus pallidus interne et la substance noire.
À l'inverse, la stimulation de la voie indirecte provoque une inhibition des neurones du
thaIarnus.
3- La maladie de Parkinson.
Les symptômes de la maladie de Parkinson ont été décrits pour la première fois en
1817 par James Parkinson dans son rapport intitulé « Essai sur la paralysie agitante ». La
prévalence de la maladie de Parkinson est évaluée à 150 sur 100 000 et augmente avec l'âge.
Après 65 ans, la maladie touche 3 9% de la population, 5 à 10 % des cas débutent avant 40 ans
et aucune prévalence connue reliée au sexe ou à la race n'a été observée (Cambier et coll.,
2000). Les débuts sont généralement insidieux. Des douleurs mal systématisées, une fatigue
générale, une réduction de l'activité peuvent orienter, à tort, vers une affection rhumatismale
ou un état dépressif- Néanmoins dans 80 % des cas, le tremblement a retenu l'attention du
malade- Signalons que l'unilatéralité ou la prédominance unilatérale est habituelle au stade
précoce de la maladie. Les symptômes de la maladie sont : le tremblement de repos, l'akinésie,
la rigidité musculaire, les troubles de posture e t la bradykinésie (ralentissement des
mouvements). À ces symptômes moteurs, viennent s'ajouter après quelques années des
troubles psychiatriques tels que : la confusion mentale, des troubles copitifs et une tendance
dépressive (Cambier et coll,, 2000).
Du point de vue physiologique, la maladie de Parkinson est caractérisée par une
dégénérescence progressive des neurones dopaminergiques de la partie pars compacta de Ia
substance noire (figure 4).
_ _ - - Tronc cérébral M o e l l e épiniëre
Fimire 4 : Physiopathologie de la maladie de Parkinson (Carnbier et coll., 2000)-
Vlo : noyau thalamique veniro-latéral-oraI, VA : noyau thalamique ventral antérieur,
CM : cortex frontal moteur, PM : cortex prémoteur, AMS : aire motrice supplémentaire.
Au cours de la maladie de Parkinson, la défaillance des neurones dopaminergiques de la
SNc a une double conséquence sur les neurones effecteurs du putarnen (Zigmond et coll-,
1989; Zigrnond et Stricker, 1989 ; Cambier et coll., 2000).
1- Les RD2 ne sont plus régulés négativement par la SNc. L'inhibition GABA qu'ils
exercent sur les neurones du Globus pallidus externe est auamentée. De ce fait, l'inhibition
GABA du noyau sous-thalamique (NST) par les neurones du Globus pallidus externe est
diminuée. L'excitation glutarnatergique exercée, par le noyau sous-thalamique sur le Globus
pallidus interne et sur la SNr, est augmentée. Les neurones du Globus pallidus interne et de la
SNr exercent une puissante inhibition GABA sur les noyaux thalamiques qui adressent
normalement une excitation tonique au cortex frontal moteur, pré-moteur et à l'aire motrice
supplémentaire.
2- Les RD1 ne sont plus régulés positivement par la SNc. L'inhibition GABA qu'ils
exercent, sur le Globus pallidus interne et sur la SNr, est réduite. Ceci contribue à renforcer
l'action inhibitrice de ces dernières structures sur les noyaux thalamiques.
Bien qu'il existe aussi d'autres types de traitements antiparkinsoniens, l'administration
du précurseur de la dopamine, la L-3,4dihydroxyphenyIalanine (L-DOPA), reste cependant le
médicament de référence. Le traitement par la L-DOPA a pour but de compr le déficit en DA
constaté au niveau de la SN et du striatum. La plupart des patients parkinsoniens répondent
bien à la L-DOPA. Elle améliore à peu près tous les symptômes moteurs observés surtout
l'akinésie et la rigidité. 11 n'en demeure pas moins qu'après quelques années de traitement, des
effets secondaires sont observés. Un de ces effets est la diminution de l'efficacité des
médicaments (effet de tolérance) caractérisé par une baisse de L'efficacité de la réponse et par
une augmentation de la dose pour obtenir un effet maximal (Cambier et coll., 2000). Notons
également qu'après quatre ou cinq ans de traitement, on observe souvent l'apparition de
mouvements violents et saccadés, que l'on nomme dyskinésies. La survenue des dyskinésies
est plus précoce lorsque la maladie a débuté chez un sujet jeune. Les dyskinésies revêtent
souvent l'aspect de mouvements choréoathétosiques, d'intensité très variable. La plupart des
agonistes de la DA testés jusqu'à maintenant et qui démontrent un bon effet antiparkinsonien
induisent eux aussi des dyskinésies, exceptée la bromocriptine qui est un agoniste sélectif D2
présentant également des propriétés antagonistes D 1 (Nutt, 1990; Carnbier et coll., 2000).
CHAPIWRE SECOND
Problématique
1- Application de la stratéeie antisens au réce~teur de la sérotonine 5WT-,, chez le rat.
1-Pertinence de la recherche,
Les récepteurs dopaminergiques de type D, sont des cibles pharmacologiques pour les
antipsychotiques. Pendant longtemps, les effets cliniques des neuroleptiques utilisés dans le
traitement des symptômes de la schizophrénie furent associés presque exclusivement aux RD,
(Byne et coll,, 1999). En effet, l'utilisation d'antagonistes aux RD2, comme I'halopéridol
(antipsychotique typique), permet de traiter les symptômes positifs de la schizophrénie, mais
entraîne de nombreux effets secondaires d'ordre extrapyramidaux comme les dyskinésies ou
d'ordre endocriniens comme la galactorrhée, la gynécomastie ou l'aménorrhée (Barnes et
Edwards, 1993). L'apparition sur le marché de nouveaux antipsychotiques (atypiques), comme
la clozapine, traitant les symptômes positifs et négatifs de la maladie et entraînant moins
d'effets secondaires surtout ceux d'ordre extrapyramidaux, a poussé les chercheurs à essayer
de mieux comprendre les différences biochimiques et pharmacoIogiques qu'il existe entre les
deux types de neuroleptiques (typiques versus atypiques).
Les récepteurs sérotoninergiques, essentiellement tes sous-types SHT-,,, ,,, , et ,,
sont apparus comme étant de nouvelles cibles potentielles pour l'action des agents
antipsychotiques atypiques (Burnet et coll,, 1996a; Bumet et COLI-, 1996b; Seeman et coll.,
1996: Kapur et coll., 1999). En effet, certains neuroleptiques, comme la clozapine ou la
rispéridone, montrent une plus grande affinité pour les récepteurs SHT, que pour les
récepteurs de la famille 4 (Leysen et coll., 1993; Seeman et Van Tol, 1994). De plus, les
RSHT-, sont exprimés dans des aires cérébrales, comme le cortex cérébral et Ie N. Acc,
connues pour être associées avec des symptômes psychotiques ou avec une activité
antipsychotique.(Lucas et Hen, 1995). Ainsi, il a été suggéré que le blocage des R5HT-,
pourrait participer au profil atypique démontré par des neuroleptiques comme la clozapine
(Leysen et coll., 1993; Meltzer, 1995). IL a été démontré que la schizophrénie est associée avec
une altération de l'expression des R5J3T-lA (baisse) et des RSHT-, (augmentation) (Burnet et
coll.. 1996b). Également, un traitement chronique avec de la clozapine entraîne une
diminution de l'expression de I'ARNm des WHT-, ainsi qu'une diminution du nombre des
sites de liaison au niveau des cortex cingulaires et frontaux (Burnet et coll., 1996a).
L'étude des récepteurs de la 5HT dans le SNC est devenue très ardue. L'essor de la
biologie molécutaire a permis d'isoler 15 sous-types de récepteurs de la 5HT. Les outils
pharmacotogiques actuels ne permettent pas d'envisager l'étude de ces sous-types de façon
isolée, puisque aucun agent pharmacologique actuellement disponible n'est spécifique d'un
seul sous-type de récepteur de la SHT. La stratégie antisens permet d'étudier spécifiquement
un sous-type de récepteur couplé aux protéines G dans le SNC.
2-Hv~othèses et objectifs,
Les récepteurs sérotoninergiques sont impliqués dans la schizophrénie et sont devenus
des cibles potentielles pour l'action des neuroleptiques atypiques (Burnet et coll., 1996a; Roth
et al, 1998 ; Byne et coll., 1999 ). Plus particulièrement le récepteur 5HT-, fait t'objet,
actuellement, de nombreuses recherches (Seeman et coll., 1996)-
Le rôle des EHT-,, au niveau du système nerveux centrai, n'est pas encore très bien
connu. Chez le rat, on retrouve de fortes concentrations de récepteurs Sm-, dans le Cx PréF
et dans d'autres aires du néocortex, comme le cortex cingdaire (Pazos et coll., 1984). Ils sont
également présents dans le N. Acc. et dans le striatum (Pompeiano et coll., 1994). Les
récepteurs Sm-, sont exprimés dans des régions cérébrales reconnues pour être associées à
l'activité antipsychotique des neuroleptiques (Lucas et Hen, 1995). La plupart des
neuroleptiques atypiques comme la clozapine possèdent une forte affinité pour ce sous-type de
récepteurs. Ces caractéristiques suggèrent que le récepteur 5HT-, pourrait participer à
l'activité antipsychotique des neuroleptiques, II pourrait également jouer un rôle clé dans la
diminution des effets secondaires extrapyramidaux des neuroleptiques atypiques.
L'administration des neuroleptiques entraîne différents effets au niveau cérébral, un
des plus important est la modification de l'expression de certains gènes (Robertson, 1992).
En effet, deux familles de gènes sont bien documentées, les gènes à réponse précoce
(IEG) et les neuropeptides (c-fos et neurotensine .spectivement).
L'expression transitoire de c-fos peut être considérée comme un marqueur d'activité
neuronale. Un rôle pour la neurotensine dans la schizophrénie a été proposé (Merchant et
Dorsa. 1993). De façon intéressante, des schémas cérébraux d'expression de ces marqueurs
biochimiques ont été associés aux profils atypiques et typiques des antipsychotiques.
L'administration de neuroleptiques typiques, comme halopéridol, entraîne une augmentation
de l'expression de c-fos au niveau du striatum dorsolatéral (StDL) (structure motrice) et
également au niveau de la coquille du N. Acc. (structure Iimbique). Cependant,
l'administration de neuroleptiques atypiques, comme la clozapine, entraîne une au,gmentation
de l'expression de c-fos dans la coquille du N. Acc. mais pas dans le StDL. Cela montre que le
la coquille du N. Acc. est une cible commune aux deux classes de neuroleptiques et il pourrait
être un site de l'activité antipsychotique des neuroleptiques. Le Cx PréF quant à lui pourrait
être un site par lequel les neuroleptiques atypiques induiraient leur action sur les symptômes
négatifs de la maladie et aussi leur action sur les patients non répondant aux neuroleptiques
typiques. En ce qui concerne le StDL, les résultats semblent converger vers un rôle dans les
EPS des neuroleptiques typiques. Il a d'ailleurs été proposé que la différence d'expression de
c-fos entre le N. Acc. et le StDL serve d'index pour les neuroleptiques atypiques (Merchant et
Dorsa, 1993; Robertson et coll., 1994; Robertson et coll., 1995; Deutch et Duman, 1996).
Les résultats obtenus avec la neurotensine sont moins nombreux, cependant, ils
indiquent que la neurotensine pourrait servir également de marqueur pour distinguer les
antipsychotiques typiques des atypiques et les schémas d'expressions sont identiques à ceux
de c-fos (Merchant et coll,, 1992; Merchant et Dorsa, 1993).
Les effets des ODNs antisens sur la synthèse du récepteur 5HT-, et sur l'expression
des différents marqueurs biochimiques, comme c-fos et neurotensine, sont difficilement
prévisibles. Cependant, on peut s'attendre à observer des effets localisés au niveau des aires
cérébrales reliées aux actions antipsychotiques comme le N. Acc. et le Cx PréF. Il est possible
que l'expression de c-fos soit bloquée dans ces structures comme d'ailleurs celle de la
Neurotensine. Il nous est apparu important de connaître également les effets de l'antisens
5HT-= sur l'expression du facteur de transcription NGIFI-B et le neuropeptide Dynorphine. En
effet, N F I - B possède un niveau basai d'expression dans ie striatum et son expression est
influena% par les antagonistes doparninergiques et sérotoninergiques (Gervais et coll., 1999).
La dynorphine, CO-exprimée avec les RD1 dans la voie s t r ia t~ni~pde , pourrait également nous
donner des informations quant à la moddation des récepteurs Sm-,, sur la transmission
dopaminergique.
Ce travail me permettra de me familiariser avec la technique antisens pour après
l'appliquer au récepteur D2 chez Le singe. Ce travail de recherche constituera donc à
développer cette stratégie pour l'étude du récepteur SHT-,- Pour cela, des ODNs antisens
seront fabriqués et administrés de façon intra-ventriculaire chez des rats normaux. Cette
technique a déjà été utilisée avec succès pour différents récepteurs comme le récepteur D3,
D2- -. (Weiss et coll., 1997a; TrembIay et coll., 1998). Dans le but de vérifier l'efficacité de
notre antisens, nous administrerons un contrôle ODN mismatch à d'autres rat et enfin un
dernier groupe de rat recevra Iui une injection intra-ventriculaire de salin (contrôle VEH).
Cette étude nous permettra de mettre au point la stratégie antisens appliquée au RSHT-, et
d'observer les effets de 1'ODN antisens Sm-, sur les Mm-,, sur l'expression des facteurs
de transcription c-fos et NGFI-B ainsi que sur les neuropetides, Neurotensine et Dynorphine.
Et à plus long terme de mieux comprendre Ie rôle du récepteur SHT-, dans la schizophrénie.
II- A~plication de la straté e antisens au réce~teur de la do amine D2 chez le macaque.
La dopamine est un neurotransmetteur du SNC, impliqué dans la régulation de
nombreuses fonctions cérébrales (activité motrice, cognition émotion prise alimentaire...).
L'étude du système dopaminergique est au cœur de nombreuses recherches étant donnée que
son altération est impliquée dans de nombreuses dysfonctions cérébrales. La dégénérescence
progressive des neurones dopaminergiques de la substance noire entraîne Ia maladie de
Parkinson. Les principaux traitements de cette maladie sont l'administration d'agonistes
dopaminergiques ou du précurseur de la DA, la L-DOPA. Ces traitements ont pour but de
contrebalancer le déficit en DA au niveau des ganglions de la base. Cependant ces traitements
ne sont pas sans effets secondaires, essentiellement liés à leur action sur le système
dopaminergique. En effet, I'administration chronique de L-DOPA entraîne souvent
l'apparition de mouvements involontaires et de réactions psychotiques (Kandel et coll., 1991;
Cambier et coll., 2000).
La DA exerce son action via piusieurs récepteurs, classés suivant leur action sur l'AC.
Ii semblerait que le RD, joue un rôle essentiel dans l'activité rnotrke, cependant son rôle exact
dans l'activité motrice en général et dans la maladie de Parkinson en particulier est encore mal
connu. La localisation cérébraIe du RD, chez le primate est assez bien documentée (Huntley et
coll., 1992). Les RD, sont exprimés largement exprimés dans le striatum, le Tub. O. et le N.
Acc. Ils sont également présents dans la SNc, dans l'aire tegrnentaie ventrale et dans les cortex
préfrontaux, cingulaires, temporaux et entorhinaux (Jaber et coll., 1996; Missale et coll.,
1998).
Pour mieux traiter les patients atteints de troubles moteurs, il devient donc impératif de
bien distinguer le rôle de chaque sous-type de récepteur. Cependant, les outils
pharmacologiques actuels ne nous permettent pas d'étudier un sous-type de récepteur de façon
isolée. En effet, les antagonistes actuellement disponibles ne sont pas assez spécifiques. La
stratégie antisens a été intensivement appliquée au récepteur D, chez les rongeurs. Elle a
permis de mieux comprendre les fonctions motrices véhiculées par le RD, (Zhang et Creese,
1993 ; Wahlestedt, 1994; Weiss et coll., 1997a).
En 1993, Zhang et Creese ont infusé, en i.c.v. pendant 2-3 jours, des ODNs antisens
RD2 chez des rats. Après traitement, le nombre de sites de liaisons D, étaient diminués de 50
% dans le striatum et de 70 % dans le noyau accumbens. Les effets, de ces diminutions des
RDz sur le comportement des rats étaient des catalepsies, une baisse de l'activité motrice
spontanée ainsi qu'une diminution de la locomotion stimulée par I'agoniste, sélectif D2,
quinpirole (Zhang et Creese, 1993).
En 1993, Weiss et collaborateurs rapportaient les résultats de I'administration i . c x
disconhnue, d'ODN antisens RD, chez des souris 6-hydroxydopamine (6-OHDA) lésées
unilatéralement. Après 6 jours de traitement, le nombre de sites de liaisons 4 était diminué
seulement de 15 %. Malgré cette faible diminution, les auteurs observaient une inhibition
complète de la réponse motrice sous agoniste, sélectif D,, quinpirole. Alors qu'aucun
changement moteur n'était observé sous agoniste sélectif D,. Pour expliquer l'importance de
la réponse comportementale comparativement à la faible baisse du nombre de RD,, les auteurs
ont émis l'hypothèse suivante : les réponses motrices véhiculées par les RDz passeraient via un
petit groupe fonctionnel de RD, nouvellement synthétisé et que les ODNs antisens réduiraient
préférentiellement ce groupe de RD2 (Weiss et coll., 1993; Zhang et coll., 1996b).
Zhang en 1996, Weiss en 1997 e t Davidkova 1998 ont rapporté des injections,
continues ou discontinues, intra-striades et unilatérales chez le rat, dYODN antisens RD,
incorporé dans un vecteur. Ces traitements entrainaient une diminution locale des RDZ. De
plus, l'injection d'agonistes D2 après Ie traitement entraînait une rotation de l'animal du côté
contraiatérai à t'injection (Zhang et coIl., 1996b ; Weiss et coll., 1997b; Davidkova et coll.,
1998).
Toutes ces expériences nous montrent que la stratégie antisens est concluante chez les
rongeurs et a permis d'établir plus précisément le rôle des RD, dans l'activité motrice.
L'asymétrie striatale en RD, entraîne une rotation de l'animal, sous agoniste D2, du côté
contralatéral à L'injection d'ODN antisens. Le RI& est effectivement impliqué dans l'activité
motrice et son inhibition entraîne une diminution de cette dernière.
2-Hvpothèses et obiectifs.
La maladie de Parkinson est caractérisée par une dégénération de la vo
doparninergique nigrostriée et se traduit au niveau moteur par un tremblement de repos, une
akinésie, une rigidité musculaire, des troubles de la posture et une bradykinésie
(ralentissement des mouvements). Le rôle exact de chaque récepteur dopaminergique, dans les
différents effets de la maladie, reste encore méconnu. La littérature fait état de plusieurs études
semblant confirmer l'implication du RD, dans l'activité motrice (Weiss et COIL, 1993; Zhang
et Creese, 1993; Kelly et coll., 1998; Morissette et coll., 1998). II est donc important, de
distinguer le rôle exact de ce récepteur dopaminergique, au niveau moteur, dans la maladie de
Parkinson.
Le rôle de la DA, dans les fonctions motrices, est traditionnellement associé au
système moteur extrapyramidal, dont le striatum est le principal composant (putamen et noyau
caudé). Cette association est basée sur le nombre important de fibres dopaminergique qui
innervent le striatum. Le striatum de primate (putamenhoyau caudé) exprime de fortes
concentrations de RD, et RD, comparativement aux récepteurs dopaminergiques D, (RD,)
beaucoup moins nombreux et aux récepteurs dopaminergiques D, et D, (RD, et RD3 quasiment inexistants. Fonctionnellement, la prédominance des RD, et RD, dans le striamm
suggère que ces récepteurs doivent avoir ; des rôles plus sélectifs dans la modulation
dopaminergique impliquée dans le fonctionnement du striatum en général et dans le contrôle
extrapyramidal en particulier (Huntley et coll., 1992). Comme déjà mentionné dans le chapitre
premier, le striaturn peut être divisé en trois composants majeurs en fonction de l'origine de
leurs inputs corticaux (Parent et coll., 1995).
-Le putamen est associé à la région striatale sensorirnotrice et associative et il semble qu'il so i t
impliqué dans l'exécution du mouvement, de I'activité motrice en général (Flaherty et
Graybiel, 1993; De la Fuente-fernandez et coil., 2000).
-Le noyau caudé quant à lui a une composante plus associative que sensorirnotrice et semble
plus impliqué dans l'initiation du mouvement, la programmation du mouvement (Graybie 1 et
coll., 1994; Menon et coll., 1998; De la Fuente-fernandez et coll., 2000).
-Le N-Acc- est une structure limbique, mais qui semble impliquée également d a n s la
locomotion du moins chez les rongeurs (Deutch et Cameron, 1992; Canales et Iversen, 2000).
Chez les primates, il semble plus impliqué dans l'apprentissage moteur (Stem et Passingham,
1994; Stern et Passingham, 1995).
Ainsi au vue des observations exposées dans le pa rqpphe précédent, si nous inhibons,
via des ODNs antisens, les RD, du putamen et du noyau caudé, nous pensons pouvoir inhi ber
l'activité motrice contralatérale. En effet, le singe que nous utiliserons au cours de ce travaL1, à
une très forte préférence, dans tous ses gestes quotidiens, pour l'utilisation de sa main gauche.
En inhibant les RD2 dans le putarnen et le noyau caudé de l'hémisphère droit, nous espérans
contrebalancer cette dominance gauchère et observer une augmentation de l'utilisation d e la
main droite.
Si nous inhibons en plus du putamen, le noyau accumbens (composante
d'apprentissage moteur), nous espérons observer une diminution de l'utilisation de la main
contralatérale.
Le travail de recherche consistera, donc en premier lieu, à cloner le gène du récepteur
dopaminergique D,du macaque macaca fascicularis et à développer la stratégie antisens pour
l'étude de ce récepteur 4. Une fois les ODNs antisens synthétisés, nous les injecterons à
différents endroits des noyaux gris centraux d'un singe normal, cela, dans le but, de créer une
asymétrie du système doparninergique et d'en observer les effets. Dans un premier temps,
nous effectuerons des injections, i.c discontinues, à la fois dans le putamen et le noyau caudé
ensuite nous effectuerons des infusions i.c, simultanément dans le putamen et le N-Acc.
Dans cette étude pionnière, nous tenterons de mettre au point la stratégie antisens chez
Ie primate. En effet, il n'existe actuellement aucune donnée dans la littérature sur l'utilisation
des ODNs dans le SNC des primates. Ce travail nous aidera donc à mieux connaître les modes
d'administrations, les concentrations à injecter et les tests comportementaux à effectuer.
Les études, via des ODNs antisens, du rôle du RD, chez les rongeurs, mentionnent
souvent l'utilisation de l'agoniste sélectif D2, quinpirole (Weiss et coll., 1993; Zhang et
Creese, 1993; Weiss et coll., 1997b). Puisque, les RD, semblent impliqués dans l'activité
motrice, les injections de quinpirole, dans ces études, ont pour but d'induire un mouvement
rotatoire de l'animal. En effet, si on diminue le nombre de RD,, via des ODNs antisens RD,,
dans un hémisphère donné, l'injection d'agoniste D,, quinpirole, induira un mouvement
rotatoire, de l'animal, contralatéra1 à l'hémisphère traité par les ODNs antisens.
Lors des différentes expériences dYODNs antisens RD, que nous allons effectuer sur le
primate, nous effectuerons régulièrement des injections de quinpirole en sous-cutanée. Ainsi,
nous pourrons observer les réactions motrices de l'animal, sous agoniste D,, et essayer
d'évaluer l'efficacité de notre ODN antisens ainsi que le rôle des RD, dans les différentes
structures étudiées.
Cette étude nous permettra ainsi de mieux comprendre la physiologie des ganglions de
la base chez le macaque et plus particulièrenient Ie rôle du RD, dans l'activité motrice chez le
primate non humain. Et à plus long terme de mieux comprendre le rôle du récepteur D, dans la
maladie de Parkinson et l'apparition des mouvements anormaux comme la dyskinésie.
Matériels et Méthodes
&Animaux et administration des ODNs 5HT-,
Pour cette expérience, treize rats mâles Sprague-Dawley de 200 à 250g (Charles River,
Canada) ont été utilisés, La veille de l'expérimentation et dans le but de prévenir toute
infection, du Kétoprofen 50 mg, un analgésique, a été ajouté à l'eau des abreuvoirs, et ce,
jusqu'au sacrifice des animaux. Les ODNs ont été administrés via des canules implantées dans
le ventricule latéral gauche des rats. Avant l'implantation des canules en forme de « L » aux
coordonnés stéréotaxiques suivantes : Antéro-postérieur (AP) : 0.8mm postérieur au Brepa,
Latéral (L) : 1,4mm, Vertical (V) : 4.0mm, les rats ont été anesthésiés avec de la
kétarnine:xylarnine (200:3 mg/rnl) et placés dans les appareils stéréotaxiques afin de procéder
à la chirurgie.
Les ODNs ont été synthétisés par le service « analyse d'image et synthèse d'ADN du
Centre Hospitalier de l'université Laval » et n'ont pas été purifiés. Afin d'obtenir la
concentration souhaitée pour les infusions, 10 pg/pl, les ODNs ont été dissous dans une
solution stérile de Ringer. Le mélange Ringer-ODNs a été administré dans le ventricule latéral
gauche des animaux à l'aide de mini-pompes osmotiques ALZET Mode1 2001
commercialisées par la compagnie ALZA Corp. (Pa10 Alto, CA). Ces mini-pompes
osmotiques, placées sous la peau du coup et attachées au kit Brain lnfusion (ALZA Corp), ont
permis d'infuser les ODNs à raison d' lplheure pendant 6 jours.
L'ODN antisens dirigé contre 1'ARNm du RSHT, était composé de 18-mers
modifiées en phosphorothioates à toutes les positions (S-CAT-TAT-GGT-AGA-GCC-TCG-
3'). L'ODN antisens 5HT, que nous avons choisi, correspondait à la région codante de +7 à
+24 de l'ADN complémentaire du récepteur SHT, de rat (Accession no XI3971 R-norvegicus
mRNA for serotonin receptor SHT-2.-GenBank) (Pritchett et coll., 1988)- Cinq des treize rats
ont reçu des ODNs antisens Sm,.
Les huit rats restant ont été séparés en deux groupes contrôles. Quatre d'entre eux ont
reçu un ODN 5HT, << mismatch » de même séquence que I'ODN antisens SHT, mais avec 4
changements de bases (5'-CAT-MT-CGT-ACA-GCWG-3 '). Ces ODNs SHT,
<< mismatch » ont également été modifiés en phosphorothioates à toutes les positions. Les
quatre rats restant ont composé le groupe contrôle véhicule (groupe VEH) et ont reçu des
infusions de solution saline.
Nous avions bien vérifié au préalable, connues selon les bases de données de GenBank, que
les séquences ODNs utilisées n'avaient pas d'homologies significatives avec d'autres
séquences,
Une fois les traitements terminés, les rats ont été sacrifiés par décapitation sous anesthésie au
CO,. Leurs cerveaux ont été retirés de la boîte crânienne et immédiatement congelés quelques
secondes dans de I'isopentane à -40°C, puis conservés à -80°C jusqu'à analyse ultérieure,
II- Test de liaison lu bindiag 4 des réceateurs 5FIT-, avec la Kétansérine lH31 .
Dans ce cas précis, les études de liaisons ont consisté à utiliser des ligands 5HT-,
radioactifs pour détecter la présence des RSHT-,, et, par la suite, de caractériser les sites
récepteurs présents sur les coupes de cerveaux,
Pour mesurer l'impact de L'administration des ODNs, nous avons utilisé le ligand
radioactif w3] Kétansérine 2nM (activité spécifique :73 Cilrnmol) comme ligand spécifique
aux R 5 K ï , et le Méthysergide lyM comme ligand non-spécifique. Nous savions que la
Kétansérine lie, de façon non spécifique, les récepteurs aiphal-adrénergiques c'est pourquoi
nous avons rajouté aux solutions de liaisons, du Prazosin à 50pM. En effet, le Prazosin est un
ligand spécifique des récepteurs alpha,-adrenergiques (Leysen et coll., 1982).
Les cerveaux des treize rats ont été préalablement découpés sur cryostat. Et des coupes
de 12pm ont été montées sur lames SuperfrostTM (Fisher Scientific, Totronto, Canada). Avant
de procéder à l'expérience de liaison, les coupes de cerveaux ont été pré-incubées pendant 1
heure avec du tampon d'incubation (50 nM Hépes /10 nM éthylène diamine tétracétate
(EDTA) I 0.1 % sérum-albumine bovine (MA), pH 7.4). Ensuite, les différentes solutions de
liaisons (spécifique et non-spécifique) ont été déposées sur les lames correspondantes.
La solution spécifique était composée de 50 p M de Prazosin et de 2 nM de
[II3] Kétansérine dans du tampon d'incubation. La solution non-spécifique quant à elle était
composée de 50pM de Prazosin de 2nM de CH3] Kétansérine et de 1 y M de Méthysergide dans
du tampon d'incubation. Après 2 heures d'incubation et une fois lavées avec du tampon de
lavage composé de 50 nM d'H6pps et de 100 nM de NaCI, le tout à pH 7.4 et à +OC, puis avec
de l'eau distillée à 4°C' les coupes été déposées à sécher, toute la nuit, sous la hôte. Le
lendemain, les lames ont été exposées sur un film ~ ~ p e r f i l r n ~ ~ (Amersham) pendant 5
semaines. Le développement des films s'est fait en les immergeant 5 minutes dans le
développeur de la compagnie Kodak, le D-19 et en les rinçant 30 secondes dans l'eau. Les
films ont ensuite été fixés 10 minutes avec du Rapid Fix de Kodak.
La révélation s'est donc faite par autoradiographie sur film, cette technique présente
l'avantage de localiser anatomiquement la densité des sites étudiés. Le comptage des films a
été effectué grâce au logiciei NIH image (Wayne Rashanb, NIMH). Pour cela, après
soustraction du bruit de fond, les densités optiques de ont été transformées en nCi/mg de
tissu à I'aide des courbes standards générées par les micros échelles CH3] (Amersham).
La figure 5 présente la localisation schématique des différentes régions analysées dans cette
étude : le cortex préfrontai, le sûiatum dorsolatérai, le seiaturn ventrolatéral, la coquille du
noyau accumbens. e t le corps du noyau accumbens.
Fisyre 5 : Représentations schématiques des régions échantillonnées pour l'analyse des
niveaux d'ARNm, des facteurs de transcriptions et des neuropeptides.
III- Hvbridation in sihr sur les coupes du ~rotocole antisens 5HT-,
L'Hybridation in situ est une technique de biologie moléculaire basée sur la
complémentarité des bases des acides nucléiques. Cette technique, utilisant une partie de la
séquence en acides nucléiques du brin complémentaire radioactif, permet de localiser par
appariement des bases, la présence d'ARNm endogènes sur des coupes de cerveaux.
Nous avons utilisé cette technique pour évaluer les effets des infusions des ODNs et de
salin sur l'expression des ARNm des facteurs de transcriptions, NGFI-B et c-fos. et sur
l'expression des neuropeptides, Neurotensine et Dynorphine.
1- La synthèse des ribosondes :
Pour chaque ARNrn, une sonde ARN spécifique e t complémentaire, radiomarquée à
I7UTP [s3'] a été utilisée. Les sondes ARN ont été synthétisées et radiomarquées avec de
I'UTP[S~~] (Dupont NENTM, Boston, MA) à l'aide du Kit Riboprobe systemTM commercialisé
par la compagnie Promega.
Pour la synthèse des différentes sondes, les plasmides linéarisés correspondants ont été
utilisés : - La sonde c-fus a été obtenue à partir d'un fragment EcoRI 1.8 Kb d'ADNc de c-fus de rat
sous-cloné dans pBlueScript, linéarisé avec SmaI et synthétisé avec la T7 RNA polymérase. - La sonde NGFI-B a été obtenue à partir d'un fragment EcoRI 2.4 Kb d'ADNc de NGFI-E3
de rat sous-cloné dans pBluescript, linéarisé avec BamHI e t synthétisé avec la T3 RNA
pol ymérase.
+Pour la Neurotensine, un fragment correspondant aux nucléotides 424 à 760 a été introduit
dans le plasmide pGEM4Z, linéarisé avec BamHI et synthétisé avec la T7 RNA polymérase.
-+Pour la Dynorphine, un fragment correspondant aux nucléotides à 770 à 1430 a été introduit
dans le plasmide pGEM-42, linéarisé avec EcoM et synthétisé avec l a T"7 RNA polymérase.
Avant de procéder à la synthèse des ribosondes, il est important de laisser incuber 25 pl de
mélange de synthèse, 1-2 heures à 37'C. Le mélange de synthèse est composé de tampon de
transcription SX, de lOOrnM de dithiothréitol (DTT), de lOmLM de rATP, rCTP et rGTP, de
0.2-lpg de plasmide linéarisé, de 39 unitédpl de ribonucléase (RNAse) inhibiteur et enfin de
15-20 unités de I'ARN Polymérase (T7 ou T3) correspondant à Ia ribosonde que l'on souhaite
synthétiser.
Une fois I'incubation terminée rajouter lpl de désoxyribonucléase @Nase) (10 unités)
et laisser incuber le mélange 10 minutes à 37°C. Arrêter La réaction avec 5 pl d'EDTA 0.5M,
pH 8 et rajouter ensuite 19 pl de tampon de ribosonde composé de Tris pH 7.4 0. lM, de NaCl
O. 15M, de EDTA 12-5 mM et de dodécylsulfate de sodium (SDS) 0.2%. 11 est important de
purifier la sonde sur colonne MiniQuick spin RNA Column (Roche) et de la conserver à
-80°C jusqu'à son utilisation.
2-Réactions d'hybridations in sitzi :
L'expérience d'hybridation in situ sur coupes de cerveaux se fait en trois étapes :
Le pré-traitement, l'hybridation et le post-traitement.
Le pré-traitement consiste à fixer les coupes de cerveaux dans du paraformaldéhyde
4 %/solution tampon phosphate (PBS) lx, pendant 20 minutes à 4°C.
Une fois les coupes fixées, les lames doivent être incubée, pendant 10 minutes à 37"C,
dans un tampon Protéinase K 1X composé d e l 0 mM de Tris pH 8,SOrnM EDTA et I pglrnl
de Protéinase K puis rincées brièvement avec de l'eau traitée au diéthyl pyrocarbonate
(DEPC). Cette étape va permettre de perméabiliser la membre et ainsi permettre aux sondes de
pénétrer. Les lames doivent ensuite être placées, 10 minutes avec agitations, dans une réaction
d'acéthylation composée de O. LM triéthanolamine pH 81 anhydre acétique, cela va permettre
de bloquer les charges positives et négatives des ARNm. Une fois cette étape terminer, les
lames doivent être rincées deux fois avec une solution de sodium citrate standard (SSC) 2X
pendant 5 minutes. Enfin les coupes de cerveaux sont déshydratées avec&fférents gradients
d'alcool éthylique (EtOH) : EtOH 30 %, 15 secondes ; EtOH 60 95, 15 secondes ; EtOH 95 %,
15 secondes ; EtOH 100 %, 1 minute et laissées à sécher à L'air libre-
La réaction d'hybridation, consiste à déposer 50 pl de solution d'hybridation sur les
lames. La solution d'hybridation est constituée de 2*106 CPM de sonde/lame, de lOOmM de
DTT et enfiln du mélange d'hybridation 50% formamide. La sonde doit être préchauffée à
65°C pendant 5 minutes avant d'être ajoutée à la solution d'hybridation, cela va permettre de
briser les structures secondaires.
Le mélange d'hybridation se compose ainsi pour 50 ml de solution :
25 ml de formamide ultra pure désionisée
10 ml de SSC 20 X
1,250 ml de Tris pH8 2M
1,100 ml NaPPi 4'5%
100 PI EDTA 0,5M pH8
1 ml dextran Sulfate 50X
2'5 g de dextran sulfate R-,
Une fois la solution d'hybridation déposée sur chaque lame et afin d'éviter le
dessèchement des coupes de cerveaux, il faut déposer délicatement une lamelle sur chaque
lame. L'hybridation peut commencer, il faut alors placer les lames, toute la nuit, dans une
chambre humide saturée à 50 % formamidef4X SSC et dans un four à hybridation réglé à 55°C
pour c-fos, neurotensine et dynorphine cependant, pour NGFI-B, il est préférable d'utiliser un
four à 58°C.
Le lendemain, une fois la réaction d'hybridation terminée, il faut procéder au post-
iraitement. En premier lieu, il faut décoller les lamelles en plaçant les lames dans une solution
de 2X SSC avec agitations. Une fois les IamelIes enlevées, les lames doivent alors être traitées
avec de la RNase A (20 mg/ml RNase A dans le tampon de RNase A) pendant 1 heure à 37°C'
la RNAse A digère les ARN simple brin (les ribosondes non hybridées). Une fois le traitement
terminé, il faut rincer brièvement les lames avec de l'eau distillée et procéder aux différents
lavages suivant : 15 minutes avec du 2X SSC ;30 minutes avec du 0.5X SSC à 55°C ;30
minutes avec du 0.1X SSC à 55°C ; 5 minutes avec du 0-IX SSC. Les lavages à 55°C
s'effectuent, pour NBGI-B, à 58°C.
Avant de placer les lames sur film, il convient de les déshydrater avec différents
gradients d'alcool acéthylique contenant de 17ammonium d'acétate qui permet de garder les
hybrides ARN/ARN stables : EtOH 30 %/ 300m.M ammonium acétate 15 secondes, EtOH 60
%/ 300mM ammonium acétate 15 secondes, EtOH 90 %/ 300mM ammonium acétate 15
secondes, EtOH 100 % 1 minute- Les lames sèchent à l'air libre et sont ensuite exposées sur
des films radio-sensibles B iomaxMR (Kodak, New Haven, CT).
Selon les ribosondes utilisées, les temps d'expositions different. Ainsi pour NGFI-B,
les lames sont exposées 4 jours, 20 jours c-fos, 6 jours pour la Neurotensine et 4 jours pour la
Dynorphine-
La quantification des films s'est effectuée par analyse d'image via ordinateur avec le
Iogiciel NM image (Wayne Rasbanh, NIMH). Pour ceIa, après soustraction du bruit de fond,
les densités optiques de gris ont été transformées en nCi/mg de tissu à l'aide des courbes
standards générées par les micros échelles @13] (Amersham). Les mesures ont été effectuées
sur des coupes présentant les régions suivantes : le cortex cingulaire (Cx Cing), le cortex
préfrontal (Cx PréF), le striatum dorsolatérd (StDL), le striatum ventrolatéral (StVL) ainsi que
la coquille (« shell ») du N- Acc. (NAS) et te corps (« core ») du N. Acc, (NAC), La
localisation exacte de ces différents territoires est représentée sur la figure 5.
IV- Clona~e du réce~teur do~aminereiaue D, de macaca fascicularis :
Nous avions besoin d'au moins une partie de la séquence du gène RD2 pour pouvoir
concevoir notre ODN antisens RD,. Pour obtenir la séquence codante, allant du codon de
départ jusqu'à la troisième boucle intra-cytoplasmique, nous avons choisi un oligo dégénéré
(amorce N095) en amont de 1'ATG de départ et dont la séquence était commune aux gènes
RD, de rat et de souris. Nous avons également conçu deux autres amorces (NO36 et 37) situées
dans la troisième boucle intra-cytoplasmique. Le tableau 2 présente les différentes séquences
des amorces utilisées lors de cette expérience.
Pour obtenir la séquence de l'amorce N095, nous avons effectué un alignement avec le
logiciel GeneWorks de différentes séquences connues de GenBank, de RD, d'humain, de rat et
de souris (Accession nOC : Uû43301 rat Sprague-D D, prom ; Xl7458.l r rattus 4 ; XS3278.1 R norvegicus 4 ; X55674.1 M musculus 4 ; MM3683 1.1 Rat D, compl cDNA ; h D2
M29066 compl cDNA). Nous avons ensuite choisi une séquence, de 18-mers, identiques à
toutes les séquences alignées, en amont de L'ATG de départ et ayant un nombre important de
CG. Les amorces 36 et 37, quant à elles, ont pu être désignées grâce à une partie de séquence
du gène RD2 de macaca fascicularis de la troisième boucle intra-cytoplasmique qui avait été
obtenu par un autre groupe de recherche. Pour chacune des amorces, une séquence de 18-mers
avec un nombre important de CG a été choisie. Les positions des différentes amorces sur le
gène RD, sont représentées sur la figure 6
Diff6rent.s oligos utilisés pour obtenir la séquence ADN du récepteur D,
L
NO36 : Amorce située dans la troisième boucle intra-cytoplasmique.
NO37 : Amorce située dans la troisième boucle intra-cytoplasmique.
NO95 : Amorce située en amont de I'ATG de départ et dont la séquence est commune au
Tableau 2 : wuence des différentes amorces utilisées pour obtenir une partie de la séquence
du gène du RD, de macaca fascicularis.
ATG
3i'mC boucle intra-cytoplasmique
Fimire 6 : Position des amorces sur l'ADN du récepteur dopaminergique Dz
de mucaca fasciczrlaris.
1 -Transcription inverse:
Pour obtenir un premier brin d'ADN complémentaire (ADNc) du RD, de mucaca
fascicularis, une préparation d'ARN totaux d'un kagrnent de putamen de singe macuca
fascicularis a été inverse transcrit.
Pour cela, une solution contenant : 1 pg/ul d'ARN totaux de singe macaca
fascicularis, 20 unités d'AMV reverse transcriptase (RT) (Roche), tampon 5X d'ADNc de
synthèse, 12.5 mM de déoxynucléotide triphosphate (dNTP), 39 unités de RNase Inhibiteur
(Roche) 20 m g h l BSA et 12.5 p M d'amorce NO36 a été incubée à 55°C pendant 1 heure. Le
mécanisme de la transcription inverse est explicité dans la figure 7.
Transcription
PREMER BRIN D'ADNc
Fimre 7 : Schéma de la transcription inverse.
Nous avons effectué deux amplifications de 1'ADNc par PCR. Une première PCR avec
les amorces 95/36 et une deuxième avec Ies amorces 95/37. Pour 50 pl de réaction 2 pl
d9ADNc (inverse transcrit) a été amplifié avec 1.25 unités d9AmpliTaq Gold (Perkin Elmer),
5pl de tampon PCR AmpliTaq Gold, 10 rnM dNTP, et 12.5 y M de chaque amorce (95136 ou
95/37).
Les amplifications ont été effectuées avec le programme suivant :
Dénaturation à 94°C pendant 9 minutes
12 cycles : 94OC, 1 minute
60°C, 1 minute 30 secondes
72"C, I minute 30 secondes
12 cycles : 94T, 1 minute
55"C, 1 minute 30 secondes
72"C, 1 minute 30 secondes
12 cycles : 94T, 1 minute 30 secondes
50°C, 1 minute 30 secondes
72°C 15 minutes
La ligation des fragments PCR a été effectuée avec le i< TA Cloning Kit (pCR 2.1) »
commercialisé par Invitroben,
Les plasmides pCR 2.1 résistant à I'ampicilline et contenant l'ADN double brin de notre
séquence RD, ont été transférés dans des bactéries compétentes JM-109. La sélection de
bactéries JM- 109 ainsi transfectées s'est effectuée sur gélose LB contenant O. 1 mglm1
d'ampicilline.
Les clones positifs, obtenus après les cultures bactériennes, ont été mis en culture
liquide dans 2.5 ml de LB contenant 70 ml11 Final d'ampicilline.
L'ADN du RD, doit être extrait du plasmide pour le séquençage. Pour cela 1,s ml de
culture liquide va en premier lieu être centrifugé et le culot resuspendu dans 200 pl de tampon
de lyse composé de Glucose 50 rnM, de Tris-HCl pH-8 25 mM, de EDTA 10 mM et 4 m g h l
de lysozyme. Après 5 minutes à température pièce, Ia réaction de lyse est stoppée en ajoutant
400 pl de solution 0.2 M NaOH, SDS 1 % et en laissant le méIange, 5 minutes sur glace. Après
l'arrêt de la réaction de lyse, 300 p1 d'acétate ammonium 7.5 M, pH 7.8 doivent être ajouté et
I'eppendorf doit être rapidement vortexé puis centrifugé 10 minutes. Avant de laisser le
mélange incuber 30 minutes à -20°C, il faut rajouter au surnageant, préalablement prélevé,
0.6 volume d'isopropanol. Après avoir centrifuger 20 minutes I'eppendorf et éliminé le
surnageant, le culot doit être lavé à I'éùianol 70 % puis lyophilisé 1 minute. Une fois sec, le
culot doit être resuspendu dans 50-100 pl de TE, RNase 0.2 % et conservé à 4OC.
Pour le séquençage, nous avons utilisé le service de séquençage de l'université Laval.
Le séquençage s'est fait avec le séquenceur d'ADN AB1 373 Strech avec option XL. L'ADN
était en solution dans de I'eau ou dans du Tris-HC1 pH 8'0 10 mM (0.5 yg par
réaction;100ng/pl). Les amorces Reverse et T7 (1 -5 FM) ont été utilisées pour le séquençage.
V- Les ODNs RD,
Grâce à la séquence clonée, nous avons pu identifier une région spécifique au récepteur
D, de cette espèce et développer notre ODN antisens RD2. Les ODNs ont été synthétisés par le
service K analyse d'image et synthèse d'ADN du Centre Hospitaiier de l'Université Laval »
puis purifiés sur cartouches OPC (Perkin Elmer (AB[), Foster city, CA, USA). 11s ont été
ensuite dissous dans une solution stérile de Liquide céphalorachidien artificiel ( K A ) pour
obtenir une concentration de 5-6 y&d. La composition du LCA utilisé lors de cette
expérience est la suivante (Theo, 1994):
8.7 1 g/I de NaCl
0.2 g/l CaCI,
0.296 g/1 MgS04.7H20
1.8 g/1 Glucose
0.068pll KH2P0,
0.342gI K,HP0,.3H20
0.1 mgml gentamicine.
L'ODN antisens RD, choisi était un 18-mers modifiés en phosphorothioates aux
positions 1 et 17 dirigé contre I'ARNrn du récepteur D2. L'ODN antisens RD, correspondait à
la région codante de +1 à +18 de la séquence du gène RD, obtenue et contenant I'ATG de
départ (5'-ATG-GAT-CCA-CïG-AAT-CïG-3 ' ).
Un ODN contrôle « Missense » de 18-mers modifiés en phosphorothioates aux positions 1 et
17 a été synthétisé (5 ' -TAT-ACFAGC-GTC-TAC-GAG-3 ' ).
Les séquences utiIisées n'avaient pas d'homologies significatives avec d'autres séquences
connues selon les bases de données de GenBank.
VI-Les administrations des ODNs au siwe macaca farcicularis :
Toutes les expériences ont été effectuées sur le même singe, une femelle Macaca
fascicularis, non-ovariectomisée de 2.46 Kg. Pour chaque injection, le singe était placé dans
une chaise spécial. Les coordonnées stéréotaxiques utilisées, lors de ces expériences, ont été
déterminées ,@ce à l'atlas de Szabo (Szabo et Cowan, 1984).
1-L'anesthésie du sinee :
Lors des chirurgies intracérébrales, l'induction de l'anesthésie s'effectue par injection
intramusculaire d'un mélange de kétaminelatropine (10 mg/kg, ; 0.05 mglkg). Par la suite,
l'anesthésie est maintenue par infusion continue (10 ml/kg/heure) dans la veine saphène d'un
mélange de kétamine/propofol/fentanyl(1 mglmi ; 0.8 mgld ; 0- 1 pghl).
Après les chirurgies, le singe reçoit un analgésique (kétoprofen) à raison de 2.0 mg/kg
le jour de l'intervention puis 1.0 mgkg les deux jours suivants.
2-Ex~ériences de micro-iniections d70DN antisens :
Pour les deux expériences d'injections ponctuelles, des canules guides, 23G(David
Kopft Instruments), ont été placées de façon stéréotaxique dans le Noyau Caudé et dans le
putamen de l'hémisphère droit aux coordonnées suivantes :
Noyau Caudé : Antéro-postérieur : + 22.0, Latéral : +4.0, Vertical : +7.0
Putamen : Antéro-postérieur : t16.0, Latéral : + 11.0, Vertical : +5.0
Première expérience :
Les injections ont eu lieu à l'aide d'une pompe pour micro-injections (CMA/100, BAS) deux
fois par jour pendant 4 jours (matinée et après-midi). Dans chaque site, 10 pl ODN antisens
(50 pb/site/injection) été injectés, à raison de 0 .5~1 par minute.
Lors des injections seul Ie coordonné verticai été modifié :
Noyau Caudé : Verticale: +6S.
Putamen : Verticale: + 4.5
Deuxième expérience : '
Les injections ont eu lieu à l'aide d'une pompe pour micro-injections (CMA/100, BAS) deux
fois par jour pendant 3 jours (matinée et après-midi). Dans chaque site, 10 y1 ODN antisens
(100 pg/site/injection) été injectés, à raison de OS@ par minute.
Lors des injections seul le coordonné vertical été modifié :
Noyau Caudé : Verticale: 4-0.
Putamen : Verticale: + 4-0.
3-Ex~érience d'infusion continue d'ODN antisens :
Pour l'expérience d'infusion intracérébrale continue d'ODN antisens, 2 canules en
<< L D, 23G(David Kopft Instnirnents), ont été placées de façon stéréotaxique dans le noyau
accumbens et dans le putamen de l'hémisphère droit Ces 2 canuIes en L D ont été rattachées
à des mini-pompes osmotiques ALZET Mode1 2001 (ALZA Corp., Pa10 Alto, CA) permettant
d'infuser notre ODN antisens RD2 (10 pgfpl) à raison de lpllheure pendant 7 jours.
Les canules ont été placées aux coordonnées suivantes :
Noyau accumbens : Antéro-postérieur : + 20.5, Latéral : 2.2, Vertical : +3.0.
Putamen : Antéro-postérieur : +18.0, Latéral : 10.0, Vertical : 4.0.
4-Les tests d'utilisation de la main :
Chaque test comportait dix essais. Chaque essai consistait à présenter, au singe, une
barre métallique avec cinq morceaux de fruit. Chaque essai était effectué à des endroits
différents à l'intérieur de la cage, mais le même schéma était suivi pour chaque test. Le singe
prenait alors les morceaux de fruit avec ses mains. Lors de chaque test, le nombre de fruit pris
avec la main droite et le nombre de fruit pris avec la main gauche été comptabilisé et nous
permettait d'obtenir une moyenne sur 10 essais soit 50 morceaux de fruit et une préférence
d'utilisation de chaque main.
5-Les injections de quinpirole.
Nous avons également effectué des injections sous-cutanées (s.c.) d'agoniste D,
quinpirole,
Tout au long des différentes expériences i< antisens >> effectuées sur le singe, différents
dosages de quinpirole ont été testés en sous-cutanée : 0.05 rng/kg 0.1 mgkg et 0.2 mgkg. Les
injections avaient toujours lieu vers 14 heures et la durée d'observation de l'animal était
d'environ 1 heure et demie. Pendant cette heure et demie, nous observions les réactions
motrices de l'animal et comptabiiisions le nombre de tour complet sur lui-même, effectués par
le singe,
Nous avons égaiement effectué une injection de quinpirole (25 pg/Spl LCA) en i-c.
dans le putamen et observé les effets d'une telle injection.
Enfin nous avons voulu tenter de combiner les effets d'un antagoniste D2 en i-c. et
ceux d'un agoniste D2 en sous-cutanée. Ainsi nous avons injecté du radopride (25pg/15pl
LCA) en i-c. dans le putarnen et le noyau caudé combiné à une injection de quinpirole 0.2
mgkg en s-c.
CHAPITRE QUATRIÈME
Résultats
1-Résuitats de la stratépie antisens apaliauée au RSHT-,
1-Effet de I'ODN antisens et de I'ODN mismatch sur les R5HT-,
Les ODNs antisens Sm-,, ont été administrés en i.c.v. via des mini-pompes
osmotiques à raison d' 1 pl/heure pendant 6 jours (10çcg/pl). Les groupes contrôles ont reçu
soit des ODNs mismatch Sm-,, (10pD/yl) soit des infusions de sohtion saline (groupe VEH).
Des tests de radioliaison ont été réalisés, avec la Kétansérine tritiée, sur les coupes de
cerveaux présentant les différentes régions à analyser à savoir : le cortex préfrontal (Cx PréF),
la coquille et le corps du noyau accumbens (NAS et NAC) ainsi que le striatum dorsolatéral et
ventrolatéral (StDL et StVL).
Au niveau du Cx PréF, on n'observe pas d'effet I'ODN antisens Sm-,, ni de I'ODN
mismatch SHI'-,, sur les sites de liaison des récepteurs 5HT-,, comparativement au groupe
contrôle VEH (figure 8)-
Au niveau du NAC, nous n'observons pas d'effet de I'ODN antisens 5HT-, sur les
RSHT-,, en revanche I'ODN mismatch 5HT-, entraîne une augmentation significative du
nombre de R5HTW comparativement au groupe contrôle VEH (figure 9A).
Et au niveau du NAS, nous n'observons aucun n'effet significatif de l'antisens ni du
mismatch (figure 9B).
Au niveau du StDL comme du StVL, I'ODN antisens 5HT-, reste sans effet sur
l'expression du R5HT-,- En revanche, I'ODN contrôle mismatch 5HT-, entraîne une
augmentation significative de l'expression de ce récepteur comparativement au groupe VEH
(figure 10 A et B).
Cela sembIe suggérer que I'ODN antisens Sm-=, utilisé dans cette expérience, n'a pas
d'effet observable sur le site de liaison du RSHT-, tel que mesuré avec la kétansérine tritiée.
En revanche, les effets significatifs de I'ODN mismatch 5W-, laissent supposer que celui-ci
a des effets non-séquence spécifique, puisque théoriquement, il ne devrait pas s'hybrider au
récepteur Sm-,.
Figure 8 : Effets de 1'ODN antisens 5HT-, et de 1'ODN mismatch sur les niveaux des sites de
liaison des récepteurs 5HT-, au niveau du Cx PréF.
Binding SET-2A NAC
Binding 5HT-2A NAS
Fiare 9 : Effets de 1'ODN antisens 5HT-, et de 1'ODN mismatch sur les niveaux des sites de
Liaison des récepteurs 5J3T.-,,
A :du corps du noyau accumbens (NAC), B : de Ia coquille du noyau accumbens (NAS).
* : t-test si,&~catif P< 0.0 1,
Buiding 3m-ZA StDL
Fimire 10 : Effets de L'ODN antisens 5HT-, et de I'ODN cc mismatch fi sur les niveaux des
sites de liaison des récepteurs 5HT-,.
A :au niveau du Striaturn dorsolatéral (StDL), B : au niveau du Striatum ventrolatéral
(StVL).* : t-test sibdcatif P< 0-0 1.
2-Effet de I'ODN antisens et d e I'ODN mismatch sur les niveaux d'ARNm des
facteurs de transcri~tion et des neurooeptides
Aux vues des résultats des tests de radioliaison, I'ODN antisens 5HT-, est sans effet
observable dans toutes les structures analysées (Cx PréF, NAC, NAS, StDL et StVL). En
revanche I'ODN misrnatch a des effets significatifs dans le NAC, StDL et StVL. Cela, semble
dû à des effets non-séquence spécifiques de I'ODN mismatch 5HT-,.
Ainsi même si nous observons des résultats significatifs, suite au traitement antisens au
niveau de l'expression de I'ARNrn de c-fos et de NGFI-B (figure 11 et 12), ils ne peuvent en
aucun cas être attribués à des effets antisens.
Les traitements ODNs antisens et misrnatch restent sans effet significatif sur
l'expression de I'ARNrn des neuropeptides Neurotensine et Dynorphine (figure 13 et 14).
VEH MM AS VEH MM AS VEH MM AS VEH MM AS VEH MM AS ;
C x Cine - NAC NAS StDL m%
Fieure 11 : Effets de W D N antisens et de L'ODN mismatch 5HT-, sur les niveaux des
ARNm de c-fos.
* : t-test significatif PC 0.0 1.
VEH MM AS
Cx Cing
VEH MM
NAC -
_Ba_ VEH MM
NAS - VEH
Fimire 12 : Effets de I'ODN antisens et de I'ODN mismatch 5HT-, sur les niveaux des
d' ARNm de NGFI-B.
* : t-test significatif Px 0.0 1 ; ** : t-test significatif P< 0.05.
Neurotensine / 5HT-2A
. -- .... ---A- A---
VEEf MM AS VEH MM AS VEH MM AS VEH MM AS VEH MM -4s
Cs Cing &+!= - NAS sl!x a
Figure 13 : Effets de 170DN antisens et de I'ODN mismatch 5m-, sur les niveaux des
d7ARNm de Neurotensine.
VEH MM
NAC - MM
NAS
VEH MM
s t n -
F i m w 14 : Effets de L'ODN antisens et de L'ODN mismatch SH'ï, sur les niveaux des
d' ARNm de Dy norp hine.
II-Résultats de la stratégie antisens a~pIiauée au RD de macaca -fasciculmr's.
l -Résultats du clonage du gène RD2 de macaca -fascicularis
a- Résultats des PCR.
Les taiUes attendues des deux fragments sont respectivement de 1013 pb avec les amorces 95-
36 et de 989 pb avec les amorces 95-37.
Les résultats des deux PCR sont présentés sur le gel 1. Les tailles correspondent aux attentes et
il est important de souligner que chaque fixament est dédoublé, cela pourrait laisser supposer
la présence d'isoformes du RD, chez le singe macaca fascicularis comme c'est le cas chez le
rat et l 'home-
a b c
GEL 1 :Résultats des PCR sur gels d'agarose 1%.
fragment du gène RD2 obtenu avec les amorces NO95 et 36
fragment du gène RD2 obtenu avec les amorces No 95 et 37
contrôle PCR
b- Résultats du s é ~ u e n ç a ~ e du cène RD2.
La séquence obtenue est présentée dans la figure 15. Elle présente une partie de
séquence non codante, de 1 à 100 pb, et une partie codante qui débute à I'ATG de départ et se
termine dans la troisième boucle intra-cytoplasmique. Dans la séquence obtenue, on retrouve
1'ODN antisens RD, que nous avons choisi et qui comprend I'ATG de départ
situé dans la 3"me boucle hm-cytoplasmique.
Nous avons obtenu 931 pb de la séquence du gène RDI de singe macaca fascicularis, les 100
premières bases, de la séquence obtenue, sont non codante.
GC-CTCGAGCAGC
GGCGCCCTAT-GGCTTGAAGA-GCCTGGCCAC-CCAGTGGCTC-CGCCGCCCCG-IOO
ATGGATCCAC-TGAATCTGTC-CTGGTACGAT-GATGGTCTGG-AGAGGCAGAA-150
CTGGAGCCGG-CCCTTCAATG-GGTCGGACGG-GAAGGCGGAC-AGACCCCACT-OO
ACAACTACTA-TGCCACGCTG-CTCACCCTGC-TCATCGCGGT-CATCGTCTTC-50
GGCAACGTGC-TGGTGTGCAT-GGCCGTGTCC-CGCGAGGG-CGCTGCGAC-300
CACCACCAAC-TACCTGATCG-TCAGCCTCGC-GGTGGCCGAC-CTCCTCGTGG-50
CCACACTGGT-CATGCCCTGG-GTTGTCTACC-TGGAGGTGGT-AGGTGAGTGG-OO
AAATTCAGCA-GGATTCACTG-TGACATCTTC-GTCACTCTGG-ACGTCATGAT-50
GTGCACGGCA-AGCATTCTGA-ACTTGTGTGC-CATCAGCATC-GACAGGTACA-SOO
CAGCTGTGGC-CATGCCCATG-CTGTACAATA-CGCGCTACAG-CTCCAAGCGC-550
CGGGTCACCG-TCATGATCGC-CATCGTCTGG-GTCCTGTCCT-TCACCATCTC-6OO
CTGTCCACTC-CTCTTCGGAC-TCAACAACGC-AGACCAGCGAGTGCATCA-650
TTGCCAACCC-GGCCTTCGTG-GTCTACTCCT-CCATCGTCTC-CTTCTACGTG-7OO
CCCTTCATCG-TCACCCTGCT-GGTCTACATC-AAGATCTACA-TTGTCCTCCG-75O
CAGACGCCGC-AAGCGAGTCA-ACACGAAGCG-CAGCAGCCGA-GCCTTCAGGT-800
CCCACCTGAG-GGCTCCACTA-AAGGAGGCTG-CCCGGCGAGC-CCAGGAGCTG-85O
GAGATGGAGA-TGCTCTCTAG-CACCAGCCCA-CCCGAGAGGA-CCCGGTACAG-900
CCCCATCCCG-CCCAGC ____----------------- 931
Figure 15: La séquence obtenue du gène RD, de macaca farcicularis où sont représentés,
, I'ODN antisens RD, qui comprend I'ATG de départ, et
2-Résultats des micro-in iections uonctuel Ies
Toutes les expériences ont été effectuées sur le même singe, une femelle macaca
fascicularis, non-ovarectornisée de 2.46 Kg. Ce singe démontrait une nette préférence pour
l'utilisation de sa main gauche.
Les ODNs antisens RD2 (SOpg/site/injection) ont été injectés unilatéralement en ix., de façon
ponctuelle, à l'aide d'une pompe pour micro-injections. Les injections avaient lieu deux fois
par jour (10 @/injection à une vitesse de O.Spl/rninute) pendant 4 jours. Ces injections ont eu
lieu dans le putamen et dans le noyau caudé de l'hémisphère droit. Les résultats de ces
injections sont présentés dans la figure 16.
Les résultats contrôies. effectués avant toute manipulation chirurgicale de l'animal,
montrant que le singe a une nette préférence pour l'utilisation de sa main gauche. En effet, il
utilise à 80 % sa main gauche et à 20 % sa main droite.
Tout au long des injections d'ODN antisens RD, (a, b, c, d), nous observons une
augmentation de l'utilisation de la main droite pour finalement atteindre 54 % d'utilisation de
la main droite pour 46 % d'utilisation de la main gauche le jour suivant l'arrêt des injections
(19 février). Après le 19 février, nous observons un retour progressif (en 4 jours) aux résultats
contrôles.
Les ODNs antisens RD,, injectés au niveau du putamen et du noyau caudé, semblent
donc agir sur la préférence d'utilisation de la main et le singe utilise de plus en plus sa main
droite. Les effets sont particulièrement important le 5''" jour après le début du traitement
Les ODNs antisens RD, (lûOpgfsite/injection) ont été injectés unilatéralement en i.c., de façon
ponctuelle, à l'aide d'une pompe pour micro-injections- Les injections avaient Lieu deux fois
par jour (10 plfinjection à une vitesse de O.Spl/minute) pendant 3 jours. Ces injections ont eu
lieu dans le putamen et dans le noyau caudé de l'hémisphère droit. Les résultats de ces
injections sont présentés sur la figure 17.
Les résultats contrôles ont été vérifiés avant la deuxième expérience d'injection, Le
singe utilise toujours préférentiellement sa main gauche pour attraper les objets et les
morceaux de nourriture (84 % de main gauche et 16 % de main droite).
Nous observons une au-mentation de l'utilisation de la main droite tout au long des
injections d'ODN antisens RD, (a, b, c) pour finalement atteindre un plateau les deux jours
suivant la fin des injections (4'*= et le Sième jour) avec 34 % d'utilisation de la main droite pour
66 % d'utilisation de la main gauche Nous observons, ensuite, un retour progressif aux
résultats contrôles.
Les ODNs antisens RD,, injectés au niveau du putamen et du noyau caudé, semblent donc agir
sur la préférence d'utilisation de la main et le singe utilise de plus en plus sa main droite-
Cependant les effets sont moins importants que lors du premier traitement. En effet, nous
n'observons pas de tendance au renversement de la préférence d'utilisation de main comme
lors de la première expérience et ce, malgré, L'augmentation de la concentration d'ODN
antisens RD, injecté quotidiennement. Notons enfin, que la durée d'injection était de trois
jours pour cette expérience alors que pour la picmière expérience, les ODNs antisens étaient
injectés pendant quatre jours.
Effet d'une double injection intracérébrale pontuelle (Cd,Put.) d'ODN antisens D2 sur la préférence d'utilisation des mains chez le macaque
(50 pg/site/injection)
1 main droite
4% -- main gauche
a : Injections 1,2 d'antisens (AM,PM)
b : Injections 3,4 d'antisens (AM,PM)
c : Injections 5,6 d'antisens (AM,PM)
d : Injections 7,8 d'antisens (AM,PM)
Effet d'une double injection intracérébrale ponctuelle (Cd,Put.) d'ODN antisens D2 sur la préférence d'utilisation des mains chez le macaque
I main droite
1 :3 main gauche
a : Injections 1,2 d'antisens (AM,PM)
b : Injections 3,4 d'antisens (AM,PM)
c : lnjections 5,6 d'antisens (AM,PM)
3-Résultats de l'infusion continue
Le même singe a été utilisé pour cette expérience d'infusion d'ODN antisens RD, qui
fait suite aux deux premières d'injections ponctuelles CODN antisens RD,-
Les ODNs antisens RD, ont été infusés, pendant 7 jours, unilatéralement en ix, à l'aide
de mini-pompes osmotiques (10 pg/pI ;lyllheure). Ces infusions ont eu lieu dans le putamen
et dans le noyau accumbens de l'hémisphère droit et non plus dans le putarnen et le noyau
caudé comme précédemment Les résultats de ces injections sont présentés dans la figure 18.
Les résultats contrôles ont été vérifiés avant la troisième expérience d'injection d'ODN
antisens RD,. Le singe utilise toujours préférentiellement sa main gauche pour attraper les
objets et les morceaux de nourriture (80 % sa main gauche et à 20 % sa main droite).
Contrairement aux deux premières expériences, nous observons une diminution de
l'utilisation de la main droite tout au long des 7 jours d'infusion des ODNs antisens RD, (du 5
mai au 12 mai), pour atteindre le Brne jour d'infusion quasiment 100 % d'utilisation de la main
gauche. Nous observons un retour progressif aux résultats contrôles après la fin du traitement.
Les ODNs antisens infusés au niveau du putamen et du N. Acc. semblent donc agir sur
la préférence d'utilisation de la main. Cependant les effets ne correspondent pas aux
hypothèses de dépah En effet, les infusions CODN antisens R D , dans le putamen et dans le
N-Acc, du singe devaient entrainer une diminution de l'utilisation de la main gauche au profit
de la main droite. Notons néanmoins que les effets observés sont maximums le 6i'me jour après
le début du traitement et qu'ils sont opposés à ceux observés après injections ponctuelles
d'ODN antisens RD,au niveau du putamen et noyau caudé.
Effet d'une double infusion intracérébrale continue (Put, Acc) dfODN antisens D2 sur la préférence d'utilisation des mains chez le macaque
(1 O pg/ pl- 1 pVhr)
100
90 = 80 ig-S
70 C
g 60 a V) .-
'L main droite - .- 50 c. 3
40 main gauche s
10
O
Implantation et début infusion 5 mai (10pg/pl- 1 pl/hr)
4-Résultats des iniections de auinpirole :
Différents dosages de quinpirole ont été injectés en sous-cutanées au singe aux cours
des trois expériences d'injections d90DN antisens RD,. Les résultats obtenus sont présentés
dans le tableau 3.
Ne tourne pas
~Mvts rap. en avant main droite
Regarde sous jambe gauche
Boit beaucoup
Active
Injections (m@g)
Expérience
11 16- 17 18 19 27 fév fév fév fév fév fév
0.05 0.05 0.1 0.1 0.1 0.1
Contrôle 1 1 1 1 2
29 8 10 12. 16 fév mai mai mai mai
Tableau 3 : Effet des injections sous cutanées de quinpirole sur le comportement moteur du
singe traité par des ODNs antisens RD2.
Exp. 1 : Injection ponctuelle ODN antisens SOpg/site/injection (4 jours) (putamen, N. caudé)
Exp. 2 : Injection ponctuette ODN antisens lOOpg/site/injection (3 jours) (putamen, N. caudé)
Exp. 3: Infusion ODN antisens (10yg/pI, lm) pendant 7 jours.
Mvts rap. : Mouvements rapides
Nous avons voulu tester différentes doses de quinpirole en sous-cutanée pour mieux
connaître leurs effets sur le comportement du singe. Une dose comprise entre 0.1 et 0-2 m d k g
entraîne une phase d'éveil assez importante chez le singe. Cette activité se maintient durant à
peu près 1 heure à 1 heure e t demie. II est important de souligner ici, que l'injection de
quinpirole entraîne une phase de somnolence, post-injection, d'environ 10 minutes puis
l'animal devient très actif. Les comportements moteurs rapportés dans le tableau 3 sont le fruit
d'observations du singe sous quinpirole. Étant donné le caractère pionnier de ces expériences,
nous ne savions pas quels comportements nous allions observer, ainsi nous avons rapporté ici
ceux qui nous semblaient différer de la << normale ».
L'injection contrôle de quinpirole (0.05 mg/kg) nous montre que le singe utilisé ne
tourne pas, spontanément, sur lui-même.
Lors de la première expérience d'injections ponctuelles dYODN antisens RD, les
injections de quinpirole (0-05 e t 0.1 mg/kg) ont eu lieu le 16, 17 et 18 février, jours
d'injections d'ODN antisens RD,.,, ainsi que le 19 février, jour où nous avons observé te
renversement de préférence d'utilisation de la main.
Le premier constat, aux vues des résultats du tableau 3, est que le singe ne tourne pas sur lui-
même. En revanche, un comportement singulier du singe a attiré notre attention. En effet, les
16 et 17 février, il a commencé à regarder régulièrement sous sa jambe gauche. Puis ces
mouvements se sont transformés en une pirouette complexe qui consistait à regarder sous sa
jambe gauche puis à effectuer une rotation complète autour de l'axe formé par sa jambe
gauche. Un autre point important ici, mis à part le fait que l'animal s'abreuve souvent au cours
de l'expérience, est le fait que l'animal fait souvent des mouvements rapides vers l'avant avec
sa main droite.
Les injections des 27 et 29 février (0.1 rngfkg) ont eu lieu lors de la deuxième
expérience mais après la fin des injections d'ODN antisens RD,. Le 27 février correspond au
plateau post-injection durant lequel l'utilisation de la main droite a été la plus importante
(34%). Le 29 février correspond au palier de retour à la normale.
Le singe ne tourne toujours pas sur lui-même mais effectue toujours sa pirouette et boit
beaucoup.
Les injections de quinpirole effectuées pendant l'expérience d'infusion d'ODN
antisens RD, different des injections précédentes par leur concentration : 0.2 m g k g au lieu de
0.1 m g k g
Les injections des 8, 10 et 12 mai ont été faites pendant l'infusion d'ODN antisens RDZ et
celle du 16 mai a été faite le dernier jour de l'expérience correspondant au jour du retour à la
« normale ».
Le singe ne tourne pas sur lui-même, mais effectue toujours régulièrement sa pirouette. Le
singe n'a plus tendance à boire beaucoup ni a avoir des mouvements rapides des mains.
Nous avons égaiement d'injecté en i.c. du quinpirole (25 pg/5pl) dans le putamen le 22
mars, date ne correspondant à aucun traitement antisens. Le singe montre effectivement une
phase de somnolence mais aucune phase d'excitation réelle et surtout il ne tourne pas sur lui-
même,
Le 24 mars nous avons voulu connaître les effets d'une injection en i.c. d'antagoniste
D,, raciopride (25 pg/15yl), dans le putarnen et le noyau caudé, combinée à une injection
sous-cutanée d'agoniste D, quinpirole (0.2 mglkg). Les résultats sont présentés dans le
tableau 4 et montrent que le singe ne toume pas sur lui-même mais effectue beaucoup de
pirouettes.
Type d'injection
In-iection i.c. putamen
25pg / 51.11 LCA
Injection i.c putamen et N Caudé
25pg raclopride / 15p.l LCA
In-iection S.C.
quinpirole 0.2 mgfkg
Date
22 mars
24 mars
Durée d'observation
1 heure post-injection
1 heure post-injection
OBSERVATIONS 1 -Somnolence -Aucune phase d'excitation -Ne toume pas
-Phase de somnolence de 10 minutes -Phase d'excitation -Fait beaucoup de pirouettes -Ne toume pas
Tableau 4 : Effet d'injections i-c. sur le comportement moteur du singe sans traitement ODN
antisens RD2.
Discussion
1-Évaluation de la straté-e antisens à l'étude du réce~teur 5HT-, dans le cerveau de
rat. -
La stratégie antisens à été appliquée, avec succès, à l'étude de différents récepteurs
métabotropiques chez le rat (RD,, RD,...). Les résultats montraient un effet significatif de
I'antisens sur le récepteur pour lequel il était désigné, alors que les ODNs contrôles (missens
ou mismatch) n'entraînaient pas d'effet significatif.
Nous sommes confrontés ici à plusieurs problèmes. L'ODN antisens 5HT-, reste sans
effet observable sur les récepteurs, tels que mesurés avec la kétansérine tritiée. Et cela même
si I'infusion des ODNs à durée 5 jours et que le turn-over du récepteur Sm-, est de 2.5 à 3
jours (Gozfan et coll., 1994, Pinto et Battaglia, 1994). En revanche, I'ODN contrôle mismatch
5HT-, entraîne une augmentation significative de l'expression des RSHT-, au niveau d u
NAC, StDL et StVL. Théoriquement, I'ODN contrôle misrnatch 5HT-, ne devrait pas
s'hybrider avec I'ARNm du récepteur 5HT-,. Ces effets pourraient donc être associés a des
effets non-séquence spécifiques.
Scalzitti et collaborateurs ont observé une augmentation des R5HT-, dans le cortex et le
striatum de rat suite à l'infusion i.c.v. d'ODNs antisens 5HT-, pendant 8 jours. Cependant ils
soulignent également le fait que des structures secondaires de I'ARNm ont été trouvées dans la
séquence pour laquelle leur antisens était désigné (Scalzitti et coll., 1998; Scalzitti et Hensler,
2000). L'ODN antisens Sm-,, que nous avons utilisé pourrait donc être complémentaire
d'une séquence comportant également une structure secondaire. Une structure secondaire a pu
gêner l'hybridation de I'ODN antisens avec I'ARNm et ainsi empêcher la liaison. Cela
expliquerait donc le manque de résultats significatifs observés avec notre antisens. Il est
important de souligner ici que les niveaux de MHT-, sont faibles dans Ies structures
analysées de plus nos groupes ne comporte pas beaucoup de sujets (n faible) et les erreurs
calculées sont grandes.
Nous observons une augmentation significative des WHT-, dans le NAC, StDL et
StVL après le traitement par I'ODN contrôle mismatch. Ceci est sûrement le fruit d'une
liaison non-séquence spécifique de L'ODN avec l7ARNm. Il aurait peut-être été judicieux de
choisir un mismatch avec 5 ou 6 bases différentes de I'antisens, cela aurait sûrement
diminuerait les chances de liaisons non-spécifiques de ce dernier. Peut-être même aurait-il
fallu choisir un missens plutôt qu'un mismatch comme l'a suggéré Chiasson en 1994
(Chiasson et coll,, 1994).
Ainsi même si nous observons des résultats significatifs, suite au traitement antisens,
sur les niveau d'expression des ARNm de c-fos et de NGFI-B (figure 11 et 12)' ils ne peuvent
en aucun cas être attribués à des effets antisens. Il est probable que le stress, les différences de
la manipulation ou encore la chirurgie aient pu avoir des effets sur les niveaux d'expression de
I'ARNm de ces facteurs de transcription.
En revanche, les traitements ODNs restent sans effets sur l'expression des ARNm des
neuropeptides, Neurotensine et Dynorphine.
Il serait intéressant de refaire cette expérience pour vérifier l'augmentation des
récepteurs SW-, dans le cortex et le striatum observée par Scaizitti et coll. en 2000 (Scalzitti
et Hensler, 2000). En effet, 17aumgnentation de l'expression des récepteurs 5HT-,, observés
par les auteurs, est en contradiction avec Les effets attendus de la technique antisens.
L'hybridation de I'ODN antisens avec sa séquence complémentaire de I'ARNm, du récepteur
cible, entraîne théoriquement une diminution de l'expression des récepteurs étudiés. Les
auteurs expliquent ces augmentations par la perturbation du mécanisme visant à stabiliser les
structures secondaires de 1'ARN. Ils supposent que la perturbation de ce mécanisme, par la
Liaison des ODNs antisens avec 17ARNm, pourrait inhiber la répression de la traduction et
ainsi augmenter l'expression des récepteurs 5HT-,.
Pour refaire l'expérience, il faudrait donc choisir un autre ODN antisens 5HT-,, s'assurer
qu'il n'est pas complémentaire d'une structure secondaire, et désigner correctement un ODN
mismatch ou missens. Les ODNs devront être infuser en i.c.v. pendant 8 jours, puisque c'est
au bout de 8 jours seulement que Ies auteurs ont observé cette augmentation.
Seulement après avoir pris ces précautions, il sera alors peut être possible de connaître
les effets des RSHT-, sur les niveaux d'ARNm des facteurs de transcription comme c-fos ou
NGFI-B et sur les neuropeptides comme Neurotensine ou Dynorphine.
II-Évaluation de la stratégie antisens appliquée au RD, chez le singe macaca fascicularis.
1- Le séauencaoe du gène RD2 de mucaca füscicularis
Le résultat de la PCR, effectuée avec les amorces 95 et 37, montre deux fragments (gel
1)- L'amorce 37 se trouve dans la troisième boucle intra-cytoplasmique. Les différences
existantes entre les deux isoformes connus des RD, humain et rat (D,L et D,S) se situent dans
la troisième boucle intra-cytoplasmique (Giros et coll., 1989; Monsma et coll., 1989)- Ces
observations suggèrent fortement la présence de deux isofomes du RD, chez le singe macaca
facicularis, De plus, nous avons également obtenu deux fragments avec la PCR, effectuée
avec les amorces 95 et 36. Cela soutien donc l'hypothèse de la présence de deux isoformes
chez le RD, du singe macaca fascicularis.
Nous nous attendions à obtenir 989 paires de bases (pb) du gène RD, de macaca
fascicularis. Nous avons obtenu une séquence de 93 1 pb. II est possible que nous ayons cloné
l'isoforme court du RD2 de rnacaca fascicularis. Il est donc essentiel de continuer le
séquençage du RD, du singe macaca fu.scicularis pour tout d'abord obtenir la séquence
complète du RD2 de rnacaca fascicwiwis et ensuite tenter de vérifier l'hypothèse selon laquelle
il existe deux isoformes de a chez macaca fascicrrlaris. Si on se réfêre aux tailles des
séquences connues de RD, humain (no accession M29066) et RD, rat (noaccession X56065),
la séquence codante du RD, du singe macaca facieularis devrait avoir une séquence codante
d'environ 1330 pb.
Pour obtenir la séquence complète du RD, de macaca fascicularis, il faudrait concevoir un
oIigo dégénéré (comme nous l'avons fait avec l'amorce N095) c'est-à-dire effectuer un
alignement avec le logiciel GeneWorks des différentes séquences connues de GenBank, de
RD, d'humain, de rat et de souris. Une fois l'alignement effectué, choisir une séquence se
situant à la f in des séquences alignées. Cette séquence del8-mers devra être la plus identique
possible à toutes les séquences alignées, avoir une bon ration ATKG et ne pas présenter
d'homologies significatives avec d'autres séquences connues selon les bases de données de
GenBank.
2- La straté-ie antisens appliquée au RD de primate et la préférence d'utilisation de la main
Comme il a été mentionné dans le chapitre second, la stratégie antisens pour le RD, a
été largement appliquée aux rongeurs. Ces études semblent soutenir l'hypothèse selon
laquelle, les RD,, situés dans te striatum, seraient impliqués dans la locomotion. En effet, la
diminution de l'expression des RD, dans le striatum entraîne une diminution de la Iocornotion.
Ainsi, les RD, aurait un rôle excitateur sur l'activité motrice (Weiss et coll., 1993; Zhang et
Creese, 1993; Weiss e t coll., 1997b)-
Nous avons tenté d'appliquer cette stratégie au primate pour tenter d e mieux
comprendre le rôle du RD, dans le striatum de primate (putamen, noyau caudé, N. Acc.). Les
rôles exacts de chaque noyau gris centraux sont encore mal connus. Cependant, leur déplétion
en dopamine, lors de la maladie de Parkinson, entraîne des troubles moteurs importants. Nous
avons donc essayé d'évaluer, grâce à Ia technique antisens, le rôle des RD, dans l'activité
motrice du striatum de primate.
Nous savons que le putamen semble plus impliqué dans l'exécution du mouvement et
que Ie noyau caudé serait lui plutôt impliqué dans l'initiation du mouvement (De la Fuente-
fernandez et coll., 2000). Nous avons donc tenté de bloquer la synthèse des Q dans ces deux
structures en y injectant directement les ODNs antisens RD, de mieux comprendre le rôle
du RD, dans ces deux structures motrices. Nous avions pris soin d'implanter les canules
d'injection dans la partie, du putamen et du caudé, allouée aux membres supirieurs. En effet il
semblerait qu'il existe une topographie corporelle au sein de ces structures (Flaherty et
Graybiel, 1993; Graybiel et coll., 1994; Parent et coll., 1995).
Le singe que nous avons utilisé, tout au long des expériences antisens, avait une très
forte préférence pour l'utilisation de sa main gauche dans tous ses gestes quotidiens. En
inhibant les RD,, dans le putamen et le noyau caudé de l'hémisphère droit, nous espérions
contrebalancer cette dominance gauchère e t observer une augmentation de l'utilisation de la
main droite.
Lors d e la première expérience d'injection ponctuelle d'ODN antisens RD,
(SOpg/site/injection, 2 injections/jour pendant 4 jours), nous avons effectivement observé,
chez notre singe, un changement dans Ia préférence d'utilisation de la main. Comparativement
aux contrôles (80% d'utilisation de la main gauche), les effets étaient spectaculaires le 5ième
jour après le début du traitement, En effet, le singe est devenu à 54 % droitier,
Lors de la deuxième expérience d'injection ponctuelle d'ODN antisens RD,
(~ûOpglsite/injection, 2 injections/jour pendant 3 jours), nous avons essayé d'augmenter la
concentration de notre antisens- Ainsi au Iieu d'injecter 50yg/site/injection nous avons injecté
100yg/site/injection en prenant soin de descendre un peu nos canules d'injection pour éviter
d'injecter dans un site peut être nécrosé, tout en restant dans la zone supposée allouée aux
membres supérieurs. Les résultats obtenus après trois jours de ce traitement ne sont pas aussi
concluants que ceux de la première expérience. En effet, le renversement de préférence
d'utilisation de la main n'a pas Iieu même au 5ièmc jours après le début du traitement comme
pour la première expérience. Nous n'observons qu'un plateau les deux jours suivants la fin des
injections (4ième et 5ième jours) avec 34% d'utilisation de la main droite.
Plusieurs paramètres sont à mettre en exergue ici :
-Visiblement la concentration de I'antisens injecté est essentielle puisque nous
observons le renversement de la préférence de Ia main lorsque la concentration injectée
ponctuellement est de 50yglsitelinjection. Alors qu'avec une concentration de
iOOpg/sitelinjection, on n'observe pas ce renversement
-La durée du traitement est également primordiale. Effectivement, les effets sont plus
probants lorsque le traitement dure 4 jours au lieu de 3 jours. 11 serait intéressant d'injecter de
façon ponctuelle des ODNs antisens RD, à une concentration de 50yg/site/injection pendant 7
jours dans le putamen et le noyau caudé. afin d'observer les effets sur la préférence
d'utilisation de la main. En effet, c'est le s " ~ ~ jours après le début des traitements que les
effets sont les plus importants et les infusions d'ODN antisens ont eu lieu pendant 7 jours.
Ainsi en injectant ponctuellement des ODNs antisens dans les putamen et le caudé pendant 7
jours, nous aurons un << contrôle temps » sur les deux types d'expériences d'administrations
d'ODN antisens.
-Un autre point important ici, est la notion de l'apprentissage par l'animal. Bien que les
fi-uits étaient disposés dans des endroits différents de la cap , il est indéniable que le singe ait
pu apprendre les schémas de présentations des fruits au fil des jours. Ainsi si les résultats de la
deuxième expérience sont moins importants dans quelle mesure ne sont-ils pas influencés par
cet apprentissage ?
Cependant nous avons observé un contre-balancement de la préférence de 1'utiIisation de la
main chez notre singe gaucher. Ainsi les RD, localisés dans le putarnen et le noyau caudé,
semblent jouer un rôle important dans l'activité motrice.
Les résultats obtenus avec I'expérience d'infusion dans le putamen et le N-Acc. ne sont
pas en accord avec notre hypothèse de départ. En effet, si le putamen est impliqué dans
l'exécution du mouvement, le N-Acc., structure limbique, est égaiement impliquée dans la
locomotion du moins chez les rongeurs (Deutch et Carneron, 1992; Canales et Iversen, 2000)-
Chez les primates, le N.Acc. semble plus impliqué dans l'apprentissage moteur (Stern et
Passingharn, 1994; Stern e t Passingharn, 1995)- Le blocage de l'expression des RD, par
I'ODN antisens devrait diminuer ['activité motrice et par le fait même contrebalancer la
préférence d'utilisation de la main. Cependant les effets observés sont opposés à ceux attendus
et le singe devient pratiquement à 100% gaucher le 6i'me jour d'infusion.
Si l'expression des RD, est inhibée dans le N.Acc. et le putamen, cela suggère que
t'apprentissage moteur et l'exécution du mouvement soient inhibés, du moins pendant le
traitement. Ainsi l'inhibition de l'expression des RD, dans ces structures devrait avoir Ies
mêmes effets sur la préférence d'utilisation de la main que ceux observés lors des deux
premières expériences. Cependant ce n'est pas le cas, le singe devient de plus en plus gaucher.
L'inhibition de l'expression des RD,, au niveau du putamen et du N.Acc. avec ces
concentrations, n'est pas suffisante pour obtenir un effet sur la préférence de l'utilisation de la
main. Faut-il une inhibition des RD, à la fois au niveau du putamen et du noyau caudé pour
observer un effet moteur ?
Il est intéressant de mentionner ici, que les effets maximums observés lors des expériences
d'injections ponctuelles d'ODN antisens ont eu lieu le jour alors que les effets maximums
lors de l'infusion d'ODN antisens ont eu lieu le @"'jour. De plus, ces effets sont opposés. Les
deux combinaisons, putamenhoyau caudé versus putamen/N.Acc., ne sont pas équivalentes et
semblent même avoir des effets moteurs opposés sur l'utilisation de la main droite
Enfin le dernier point important de cette étude, a été les injections d'agoniste D, chez
le singe sous traitement antisens. Nous nous attendions à ce que notre singe tourne sur lui-
même sous quinpirole. Cependant, quelles que soient les concentrations, le type et la durée des
administrations ainsi que les structures ciblées, le singe ne tourne pas, pourtant il est
indéniablement actif sous quinpirole. Néanmoins, deux modifications du comportement
moteur ont attiré notre attention.
La première modification du comportement moteur a été des mouvements rapides en
avant de la main droite lors de la premiére expérience. Comme il a été précisé plus haut, il
semble exister une topographie corporelle au sein de ces structures et nous avions pris soin
d'implanter les canules d'injection dans la partie, du putamen et du caudé, allouée aux
membres supérieurs. 11 est possible que le quinpirole ait accentué, dans ces régions,
l'asymétrie due au traitement antisens dans l'hémisphère droit. Cependant nous n'observons
pas ces mouvements de la main droite lors des expériences suivantes.
Enfin, il est intéressant de souligner l'apparition de pirouettes » plutôt atypiques.
Cette <i pirouette N complexe consistait à se pencher en avant pour regarder sous sa jambe
gauche puis à effectuer une rotation complète autour de l'axe forme par sa jambe gauche. Lors
de la première expérience d'injection ponctuelle, le singe a d'abord commencé à regarder
régulièrement sous sa jambe gauche (16 et 17 février) et ce mouvement s'est transformé en
« pirouette » le 18 f6vrier. Et à partir de cette date, ce mouvement singulier a persiste à chaque
injection de quinpirole. Ce mouvement est difficilement interprétable. Est-ce le reflet de
l'action de ODNs antisens dans les régions étudiées ou celui de lésions dues aux injections
successives ?
Ndanmoins le quinpirole reste sans effet sur le comportement rotatoire du singe. Cette
absence de rotation de l'animal pourrait être dû à une trop faible diffusion des ODNs antisens
dans les structures. En effet, nous n'avons aucune donnée sur la diffusion du liquide
(LCAIODN antisens) dans le tissus.
L'inhibition de la synthèse des RD, n'est peut-être pas assez importante pour entraîner une
asymétrie du système dopaminergique suffisante et nécessaire à un mouvement de rotation
sous quinpirole.
Enfin, les canules ont été implantées dans les regions douées aux membres supérieurs, peut-
être aurait4 mieux fallu injecter les ODNs antisens dans la région des membres inférieurs
pour observer un mouvement rotatoire sous quinpirole-
11 est important de mentionner ici que nous ne savons pas si les effets observés sont dus
à des effets de I'ODN antisens ou aux lésions entraînées par les injections de liquide
directement dans les structures.
II serait donc très utile pour la poursuite de cette étude d'élucider plusieurs points essentiels à
l'application de la technique antisens.
-II faudrait connaître la diffusion, dans les tissus, de notre liquide (LCA/ ODN
antisens) ainsi que la pénétration cellulaire de notre ODN antisens. Pour cela il faudrait
marquer les ODNs antisens avec de la biotine et ensuite une fois le cerveau prélever suivre le
trajet de notre liquide (Yee et coll., 1994). Ainsi nous pourrons cornaître la diffusion tissulaire
du liquide, la pénétration cellulaire et peut-être avoir une idée de la concentration de I'ODN à
utiliser ou de la vitesse à laquelle t'administrer.
-Une fois ces données recueillies, il serait sans doute intéressant d'administrer les
ODNs antisens à un singe Iésé unilatéralement avec de la 6-hydroxydopamine. En effet, le
singe 16sé devrait tourner spontanément sous quinpirole. Dans ce cas de figure, peut-être qu'il
serait possible d'observer des effets plus important en contrebalançant le déficit moteur,
comme cela a été fait lors des études du RD, chez le rat avec la technique antisens.
-Enfin, il est essentiel de mettre au point un test d'utilisation de la main dans lequel, le
facteur apprentissage est réduit au maximum. Peut-être faudrait-il tester la vitesse d'exécution
du geste plutôt que la main choisi pour effectuer le geste.. .
CONCLUSION :
Il est, à l'heure actuelle, bien établi que la stratégie antisens est un outil d'investigation
efficace et permettant d'étudier un sous-type particulier de récepteur au niveau cérébral. Cette
technique n'entraîne pas d'up régulation des récepteurs cibles, ainsi, contrairement aux
traitements courants (antagonistes et agonistes) les récepteurs ne sont pas super sensibles après
l'arrêt du traitement, Cette technique est b i e n au point chez les rongeurs, néanmoins, cette
stratégie n'avait pas encore été appliquée aux primates non-humains au niveau cérébral Les
résultats présentés ici, sont préliminaires et done à considérer avec précaution.
D'autant qu'aucune donnée n'est encoFe disponible sur le turn-over-du RD2 au niveau
cérébral chez le primate. Mais ces résultats nous permettrons à l'avenir de perfectionner les
différents points essentiels au bon fonctionnement de la technique antisens. En effet, cela nous
permettra d'affiner : les concentrations d'ODN antisens à injecter, la diffusion du liquide dans
les tissus, la position exacte des injections a u sein des structures, la pén6tration cellulaire de
notre ODN antisens, te mode d'administration Ci.c. ou i.c.v,) .
Néanmoins ces résultat montrent u n certain effets au niveau de la préférence
d'utiIisation de la main. En effet, 11 semble indéniable que le RD, joue un rôle prédominant
dans l'activité motrice. Néanmoins, le rôle jouer par les différentes structures étudiées ici
(putamen, noyau caudé et N.Acc.) semble p lus complexe que prévu. Ainsi une fois que les
effets observés pourront être attribués avec certitude aux effets de l'antisens et les mises au
point effectuées, nous pourrons tenter de mieux comprendre le rôle du RD, dans l'activité
motrice du primate et également d'affiner nos connaissances sur le rôle des différentes
structures motrices étudiées.
Non seulement les ODNs antisens son* de bons outils expérimentaux, mais ils
possèdent également un important potentiel en tant qu'agents thérapeutiques pour des
maladies neurodégénératives ou neuropsychiques-
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