Isolamento e caratterizzazione di ceppi di Clostridium ... · I clostridi sono l’unica famiglia di batteri sporigeni anaerobi associati con gli esseri umani sia come non patogeni,

Lavoro di diploma Data: 1 giugno 2011

Scuola Medico Tecnica – Tecnico in analisi biomediche 2010/2011

Isolamento e caratterizzazione di ceppi di Clostridium difficile di origine clinica e in alimenti pronti al consumo

Autore: Giada Guerrini

Laboratorio: Istituto Cantonale di Microbiologia (ICM), Bellinzona

Responsabili: Antonella Demarta, Federica Mauri

Isolamento e caratterizzazione di ceppi di C. difficile di origine clinica e in alimenti pronti al consumo

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Indice 1. Riassunto ............................................................................................................................... 4 2. Abbreviazioni ......................................................................................................................... 5 3. Introduzione ........................................................................................................................... 6

3.1 Il Clostridium difficile ........................................................................................................ 6 3.2 Patogenicità, fattori di virulenza e CDAD (Clostridium difficile associated disease) ........ 6 3.3 Trasmissione e prevenzione ............................................................................................ 7 3.4 Resistenza e trattamento ................................................................................................. 7 3.5 Il C. difficile negli alimenti ................................................................................................. 7

4. Scopo del lavoro .................................................................................................................... 8 5. Materiali e metodi .................................................................................................................. 8

5.1 Alimenti ............................................................................................................................ 8 5.1.1 Preparazione dei terreni ............................................................................................ 8 5.1.2 Preparazione della soluzione di spore ...................................................................... 9 5.1.3 Preparazione dei campioni da analizzare ............................................................... 10 5.1.4 Estrazione diretta di DNA da brodo in caso di crescita negativa ............................. 11 5.1.5 Colorazione di Gram e catalasi ............................................................................... 12

5.2 Ceppi clinici .................................................................................................................... 12 5.3 Estrazione DNA ............................................................................................................. 13 5.4 Reazioni PCR per gluD e tossine .................................................................................. 14 5.5 Messa in evidenza del prodotto PCR ............................................................................. 16 5.6 Ribotipo PCR ................................................................................................................. 17 5.7 Messa in evidenza del prodotto PCR ............................................................................. 18 5.8 PCR per la tossina binaria ............................................................................................. 19 5.9 Messa in evidenza del prodotto PCR ............................................................................. 20

6. Risultati e discussione ......................................................................................................... 21 6.1 Studio preliminare, confronto e scelta dei metodi di coltura........................................... 21 6.2 Studio di campioni di alimenti ........................................................................................ 23 6.3 Analisi di campioni di origine clinica ............................................................................... 24

7. Conclusioni .......................................................................................................................... 26 8. Ringraziamenti ..................................................................................................................... 27 9. Bibliografia ........................................................................................................................... 28 10. Allegati ............................................................................................................................... 30

10.1 Allegato 1 ..................................................................................................................... 30 10.2 Allegato 2 ..................................................................................................................... 31 10.3 Allegato 3 ..................................................................................................................... 33 10.4 Allegato 4 ..................................................................................................................... 33 10.5 Allegato 5 ..................................................................................................................... 36 10.6 Allegato 6 ..................................................................................................................... 36 10.7 Allegato 7 ..................................................................................................................... 36 10.8 Allegato 8 ..................................................................................................................... 36 10.9 Allegato 9 ..................................................................................................................... 36 10.10 Allegato 10 ................................................................................................................. 36 10.11 Allegato 11 ................................................................................................................. 37 10.12 Allegato 12 ................................................................................................................. 37 10.13 Allegato 13 ................................................................................................................. 37 10.14 Allegato 14 ................................................................................................................. 37


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10.15 Allegato 15 ................................................................................................................. 37 10.16 Allegato 16 ................................................................................................................. 37 10.17 Allegato 17 ................................................................................................................. 37 10.18 Allegato 18 ................................................................................................................. 38 10.19 Allegato 19 ................................................................................................................. 38 10.20 Allegato 20 ................................................................................................................. 38


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1. Riassunto Il C. difficile è un batterio bacillo gram positivo, anaerobio e sporigeno, con crescita ottimale a 37°C. E’ isolato nel 80% delle feci di bambini e neonati e nel 3% di adulti sani. E’ anche presente nelle feci di molti animali. Causa infezioni del tratto gastro-intestinale e colpisce pazienti che fanno uso prolungato di antibiotici. Causa la CDAD (Clostridium difficile associated disease) con sintomi che variano dalla diarrea, alla colite pseudomembranosa fino al megacolon tossico. I fattori di virulenza principale del C. difficile sono la tossina A (TcdA), la tossina B (TcdB) e la tossina binaria (CDT). La CDAD è una delle infezioni nosocomiali più comuni ma negli ultimi tempi però si sono riscontrate molte infezioni anche a livello comunitario. L’origine delle infezioni comunitarie è sconosciuta e per questo motivo si è voluto indagare se il cibo potesse essere una possibile fonte di contaminazione. L’obiettivo del lavoro è stato di determinare se vi fosse la presenza di C. difficile in alimenti pronti al consumo come insalata e carne, determinandone eventualmente il tossinotipo in modo da poter eventualmente stabilire una correlazione con i ceppi isolati. Nello studio sono stati analizzati insaccati crudi e insalate provenienti da tutto il Ticino. Per quanto concerne i ceppi clinici sono stati analizzati quelli isolati presso ICM. Gli alimenti vengono inserti nel brodo di coltura. Dopo incubazione nel caso in cui è stata rilevata la presenza di C. difficile si è provveduto a eseguire: una PCR Multiplex per la determinazione dei geni delle tossine e della glutammato deidrogenasi ed una PCR per il ribotipo. Sono stati analizzati 27 campioni di carne e 7 di insalate, tutti sono risultati negativi per la presenza di C. difficile. Con questi risultati si può concludere che gli alimenti pronti al consumo come carne e insalata non dovrebbero essere una fonte di contaminazione in Ticino.

1. Abstract C. difficile is a Gram positive spore-formig bacteria bacillus with optimal growth at 37 °C. It is isolated in 80% of the faeces of babies and children and 3% of healthy adults. It is found in animal and human intestines. It causes infections of the gastrointestinal tract and affects patients who are long-term users of antibiotics. It causes the CDAD (Clostridium difficile associated disease), with symptoms which vary from diarrhea, pseudomembranous colitis to toxic megacolon. The virulence factors are: the toxin A (TcdA), the toxin B (TcdB) and the binary toxin (CDT). The CDAD is one of the most common nosocomial infections, however in recent times, many infections are found also at community level. The source of community infection is unknown and that is why we wanted to investigate if food could be a possible source of contamination. The objective of this study was to determine if there was the presence of C. difficult in food ready for consumption such as meat and salad, and determine the toxinotype in order to possibly establish a correlation with the strains isolated. In the study, raw meats and salads from all over the Ticino were analyzed. With regard to the clinical strains those isolated at ICM were analyzed. The foods were placed in the grow broth for spores isolation. Clinical strains were grown on agar blood. After detection C. difficile in culture, determination of toxin and glutamate dehydrogenase genes was performed by Multiplex PCR. The ribotype was also performed by PCR. 27 samples of meat and 7 of salads were analyzed, all were negative for the presence of C. difficile. With these results we conclude that ready-to-eat foods such as meat and salad should not be a source of contamination in Ticino.


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2. Abbreviazioni AS Agar Sangue ANA Anaerobiosi BHI Brain heart infusion C. difficile Clostridium difficile CDAD Clostridium difficile associated disease CDT Clostridium difficile Toxin CLO Clostridium difficile agar CMM Cooked meat medium gluD Glutammato deidrogenasi ICM Istituto Cantonale di Microbiologia Bellinzona PCR Polymerase Chain Reaction TBE Tris borato EDTA TcdA Toxin Clostridium difficile A TcdB Toxin Clostridium difficile B


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3. Introduzione

3.1 Il Clostridium difficile I clostridi sono l’unica famiglia di batteri sporigeni anaerobi associati con gli esseri umani sia come non patogeni, infatti fanno parte della normale flora intestinale di uomini ed animali, sia come agente patogeno [3]. Il C. difficile è un batterio a bastoncino Gram positivo, anaerobico e sporigeno con una crescita ottimale a 37°C. E’ stato scoperto come agente patogeno nel 1978 [1] [2] [3].

Vive nell’intestino umano e fa parte della flora batterica intestinale normale. Viene isolato dalle feci del 3% di adulti sani e dell’80% di bambini e neonati sani. E’ anche presente nelle feci di animali come cani, gatti, cavalli, maiali, roditori e nell’ambiente, ad esempio nel suolo, nell’acqua, nei sedimenti [3].

Su agar sangue le colonie non sono emolitiche (gamma emolisi), si presentano di colore grigio-giallognolo e superficie lucente, rotonde con bordi frastagliati. L’odore è inconfondibile: simile a “sudore di cavallo” [3].

3.2 Patogenicità, fattori di virulenza e CDAD (Clostridium difficile associated disease) Il C. difficile è la causa principale, in ambito ospedaliero, di CDAD (Clostridium difficile associated disease) anche se normalmente non è un batterio invasivo. Questa patologia è associata all’assunzione di antimicrobici di tutte le classi (in particolare ampicillina, cefalosporine e clidamicina), chemioterapici ed antitumorali. I pazienti più comunemente colpiti sono anziani, immunocompromessi, pazienti che hanno subito operazioni chirurgiche al tratto gastrointestinale e pazienti ospedalizzati o degenti in case di cura [2] [3].

Negli ultimi anni il C. difficile è diventato protagonista di molte infezioni comunitarie. In questi casi i fattori di rischio non sono sempre collegabili all’uso di antibiotici o ad un ospedalizzazione precedente come dimostrato nel lavoro di Kujiper e van Dissel [5] nel quale in 33 pazienti che avevano contratto l’infezione, 8 (24%) non avevano assunto nessuna cura antibiotica nei 3 mesi precedenti l’inizio dei sintomi. E’ quindi necessario individuare i fattori di rischio e le vie di trasmissione per la malattia comunitaria. Alcuni studi si sono occupati degli animali (anche quelli domestici), che sono un serbatoio molto importante e che spesso albergano ceppi molto simili a quelli isolati nell’uomo [5].

I due principali fattori di virulenza del C. difficile sono la tossina A (tcdA) e la tossina B (tcdB) che modulano diversi eventi fisiologici nella cellula e causano la malattia. Le tossine entrano nella cellula mediante endocitosi causando la disorganizzazione del citoscheletro e morte cellulare.

La tossina A è un’enterotossina che causa necrosi delle cellule epiteliali intestinali, aumento della permeabilità, secrezione di liquidi e reclutamento di neutrofili che portando alla formazione di pseudomembrane. La tossina B è una citotossina che innesca l’apoptosi.


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Il C. difficile produce anche una terza tossina chiamata tossina binaria (CDT) che aumenta la virulenza del ceppo. Il meccanismo di azione di questa tossina non è tuttora chiaro ma si sa che non è relazionata con le tossine A e B [1].

Il C. difficile è stato isolato per la prima volta nel 1935 ma fino agli anni ’70 non è stato considerato patogeno [3]. In seguito, è stato identificato come causa di diarrea associata a terapia antibiotica e colite pseudomembranosa. Oggi il 25% delle diarree associate all’uso di antibiotici è causato dal C. difficile. Solitamente la diarrea è di carattere benigno senza crampi addominali e potrebbe cessare terminando la cura antibiotica in corso; in alcuni casi invece evolve a colite, colite pseudomembranosa, megacolon tossico fino alla perforazione dell’intestino. Neonati e bambini portano il C. difficile nelle feci ma non hanno nessun tipo di sintomo. La condizione predisponente principale che permette lo sviluppo del C. difficile è la distruzione della flora normale del colon causata normalmente dall’uso di antibiotici, immunosoppressori o chemioterapici. La contaminazione avviene per via oro-fecale; le spore ingerite sopravvivono alla barriera acida dello stomaco e germinano nel colon [6]. Uno studio ha dimostrato che l’uso di medicamenti gastrici per la soppressione di acido sono un fattore di rischio per contrarre la CDAD a causa dell’indebolimento della barriera acida [7].

3.3 Trasmissione e prevenzione Il clostridio produce delle spore che persistono per anni nell’ambiente divenendo una delle contaminazioni più comuni in ambito sanitario [5]. Le spore sono molto resistenti al calore e all’alcool; in ambito ospedaliero il veicolo principale conosciuto dell’infezione da C. difficile sono le mani. E’ importante lavarle in modo accurato con il sapone ogni volta che si entra in contatto con un paziente, poiché la sola disinfezione con alcool non è sufficiente per eliminare le spore. Se è possibile il paziente affetto da CDAD deve essere isolato ed il personale medico ed infermieristico deve indossare camice e guanti quando vengono svolte le cure. La trasmissione tra paziente e paziente è comune e spesso si riescono ad isolare le spore del batterio anche sulle mani, sui vestiti e stetoscopi usati dal personale sanitario [2][6]. Oltre alla disinfezione della mani è importante stare attenti ad endoscopi o altri strumenti che possono trasportare spore. La decontaminazione deve essere eseguita con disinfettanti sporicidi o in autoclave [8].

3.4 Resistenza e trattamento Il C. difficile può essere resistente ad antibiotici come cloramfenicolo, tetraciclina e eritromicina [3].

In caso di CDAD bisogna sospendere la cura antibiotica in corso ed, in alcuni casi, questo provvedimento è sufficiente per far cessare la diarrea. Se la malattia non dovesse cessare si somministra un antibiotico attivo su C. difficile come vancomicina o metronidazolo [2].

3.5 Il C. difficile negli alimenti L’infezione comunitaria da C. difficile sta diventando un problema serio; di conseguenza si stanno cercando le possibili fonti di contaminazione. Si sa che il C. difficile è un batterio ambientale che si trova nel terreno e nell’intestino di molti animali. Per questo motivo si analizzano alimenti di origine animale e vegetale. Sono stati effettuati diversi studi su alimenti come carne di origine varia ed insalate pronte al consumo, con risultati discordanti. La discordanza dei risultati è in parte dovuta al metodo: oggi non esiste un metodo standard che permetta la ricerca di C. difficile negli alimenti. Infatti in ogni


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studio effettuato sono state usate metodiche differenti. Ad esempio in Svizzera è stato effettuato uno studio su 46 carni (manzo e maiale): tutti e 46 i campioni sono risultati negativi [9]. Negli USA invece è stato effettuato uno studio su 88 carni di origine varia e ben il 42% (37) dei campioni è risultato positivo per la presenza di C. difficile [10]. Su un totale di 1140 alimenti analizzati in diversi studi, in media l’8% (96) dei campioni sono risultati positivi alla presenza di C. difficile [9][10][11][12][13][14][15].

4. Scopo del lavoro

Il C. difficile è considerato il principale agente patogeno di diarree in ambito nosocomiale. In molti paesi però si sono constatate infezioni comunitarie non associate all’assunzione di antibiotici. In Ticino non si conoscono dati relativi alla malattia comunitaria. Una possibile fonte di contaminazione da C. difficile nella popolazione non ospedalizzata potrebbe essere il cibo.

Nello studio si è voluto stabilire se alcuni alimenti pronti al consumo, in particolare insaccati crudi e insalata, potessero rappresentare una fonte di contaminazione per l’essere umano.

Nell’eventualità di poter confrontare i ceppi rilevati negli alimenti con i ceppi risultati positivi al C. difficile isolati nel 2010 e 2011 nel reparto di batteriologia presso ICM di Bellinzona, questi ultimi sono stati tipizzati. Si potrebbe speculare che il cibo possa essere una fonte di contaminazione se ci fosse una correlazione molecolare tra i ceppi clinici e da alimenti.

5. Materiali e metodi

5.1 Alimenti lo studio ha previsto la ricerca di C. difficile in insaccati da consumare prevalentemente crudi e insalata. Tutti i prelievi sono stati eseguiti dagli ispettori del Laboratorio Cantonale su tutto il territorio ticinese. Gli insaccati crudi comprendono: salame, salametto, mortadella, luganiga e luganighetta. Il prelievo degli ispettori è stato eseguito tra febbraio e luglio 2011 con la raccolta di 40 campioni in supermercati e macellerie. Le insalate analizzate sono lavate, pretagliate, imballate e pronte al consumo. I 10 campioni sono stati raccolti tra febbraio e maggio 2011, e provenivano da supermercati del territorio.

5.1.1 Preparazione dei terreni Materiale:

Cooked meat medium (Biolife, Italia) (allegato 1)

Brain heart infusion (Oxoid, UK) (allegato 2)

Sodim Taurocholate Hydrate (Sigma, Svizzera) (allegato 3)

Clostridium difficile selective supplement (Oxoid, UK) (allegato 4)

Acqua Milli-Q, Millipore, (Noionaqua Sagl, Svizzera)

Contenitori bottiglie di vetro da 1 litro per Brain heart infusion

Contenitori bottiglie di vetro da 50 ml per Cooked meat medium

Agitatore

Autoclave


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Protocollo Coocked meat medium (CMM):

Pesare 2 g di CMM e versare in 20 ml di acqua Milli-Q

Il terreno deve essere messo in autoclave per essere sterilizzato prima dell’utilizzo

Conservare a 4°C

Protocollo Brain heart infusion (BHI): 1. Aggiungere 47 g di BHI e 1 litro di acqua Milli-Q 2. Sciogliere con l’agitatore 3. Aggiungere 1 g di sodium taurocholate hydrate 4. Sciogliere sull’agitatore 5. Autoclavare 6. Una volta che il brodo è raffreddato dobbiamo aggiungere l’antibiotico (1 antibiotico per

500 ml di BHI): a. Antibiotico liofilizzato (Clostridium difficile selective supplement) b. Ricostituire con 2 ml di H2O sterile c. Versare l’antibiotico nel brodo

7. Conservare a 4°C

5.1.2 Preparazione della soluzione di spore Per stabilire la sensibilità del metodo abbiamo contaminato gli alimenti direttamente con le spore provenienti dal ribotipo di referenza 029 (A+B+CDT-).

Materiale: Ceppo di riferimento 029 (ICM) Thioglicolato (BBL, USA )(allegato 5) NaCl (allegato 6) Agar Sangue COL-S Columbia 5% SB 067689 (Becton Dickinson, Svizzera)

Protocollo preparazione soluzione di spore: 1. Scongelare in brodo thiglicolato il ceppo 029 2. Incubare in anaerobiosi a 37°C per 7-10 giorni 3. Dopo incubazione eseguire alcool shock:

a. Prelevare del brodo (da 3 a 6 ml) e inserirlo in un tubo Falcon da 50 ml con etanolo 70% in rapporto 1:1

b. Lasciare a temperatura ambiente per 50-60 minuti su agitatore c. Centrifugare a 3’800 rpm per 10 minuti d. Risospendere il sedimento con NaCl in proporzione 1:1

4. Eseguire diluizioni seriali: 10-1, 10-2, 10-3,10-4 5. Inseminare 100 µl di ogni diluizione su Agar Sangue e incubare per 24-48 ore in

anaerobiosi a 37°C per 24-48 ore. 6. Contare CFU (devono essere minimo di 30 e massimo di 300)

Dopo aver contato le CFU bisogna eseguire una serie di calcoli per conoscere il numero di spore in sospensione (ml) e quindi stabilire il volume necessario per contaminare (allegato 7).


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5.1.3 Preparazione dei campioni da analizzare Materiale

Coltello

Tagliere

Cucchiaio

Pinzetta

Sacchetto sterile: Seward stomacher lab system standard bags classic 400 (Seward, UK)

Incubatore 80°C

Incubatore 60°C

Camera anaerobiosi

Fiamma

Sigma Laboratory Centrifughe (Sigma, Svizzera)

Tubi Falcon 50 ml CELLSTAR®Tubes (Greiner bio-one, Germania)

CLO 90 mm 43 431 (Biomérieux, Svizzera)

Agar Sangue COL-S Columbia 5% SB 067689 (Becton Dickinson, Svizzera)

Salame: Tagliare il salame in pezzi molto piccoli con il coltello (sterilizzato alla fiamma), usare come piano di lavoro un tagliere ricoperto con un sacchetto di plastica sterile.

Insalata pronto al consumo: se necessario tagliare a pezzi piccoli con un coltello (sterilizzato alla fiamma).

Protocollo del metodo che utilizza BHI: 1. Aggiungere 10 g di alimento in 30 ml di brodo 2. Incubare in anaerobiosi da 10 a 15 giorni 3. Dopo incubazione eseguire l’alcool shock:

a. Prelevare del brodo (da 3 a 6 ml) e inserirlo in un tubo Falcon da 50 ml con etanolo 70% in rapporto 1:1

b. Lasciare a temperatura ambiente per 50-60 minuti su agitatore c. Centrifugare a 3’800 rpm per 10 minuti d. Eliminare il surnatante

4. Inseminare il sedimento su piastra CLO selettiva per C. difficile 5. Incubare in anaerobiosi a 37°C per 48 -72 ore

Protocollo del metodo che utilizza CMM: 1. Aggiungere 10 grammi di alimento in 20 ml di CMM

a. Incubazione a 80°C per 10 minuti b. Incubare in anaerobiosi a 37°C per 7 giorni

2. Dopo eseguire l’alcool shock: vedi punto 3 del protocollo precedente 3. Inseminare il sedimento su piastra CLO selettiva per C. difficile 4. Incubare a 37°C in anaerobiosi per 48-72h

Grazie all’incubazione a 80°C si selezionando solo le spore del C. difficile presente nel campione. Con l’alcool shock si selezionano le spore, eliminando le cellule in fase vegetativa.

Dopo incubazione le colonie sospette vengono isolate su Agar Sangue ed incubate sia in anaerobiosi che in aerobiosi per 24-48 ore. Il C. difficile deve crescere solo in anaerobiosi.


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5.1.4 Estrazione diretta di DNA da brodo in caso di crescita negativa In caso di crescita negativa su piastra si esegue un’estrazione direttamente dal brodo di coltura per accertarsi che realmente non ci sia la presenza di C. difficile.

Materiale: QIAamp® DNA Stool Mini Kit (50) (Qiagen, Svizzera) Centrifuge 54172 R (Eppendorf, Svizzera) Tubi 2 ml sterili, (Eppendorf, Svizzera) Tubi 1.5 ml sterile, (Eppendorf, Svizzera) Ghiaccio Vortex Incubatore 70°C

Protocollo estrazione diretta da brodo: 1. Depositare 200 µl di brodo in un tubo da 2 ml 2. Immergere la provetta nel ghiaccio 3. Aggiungere 1.4 ml di Buffer ASL 4. Vortex per 1 minuto 5. Incubare il campione per 5 minuti a 70°C 6. Vortex per 1 minuto 7. Centrifugare a 14'000 rpm per 1 minuto 8. Depositare 1.2 ml di surnatante in un nuovo tubo da 2 ml ed eliminare il sedimento 9. Aggiungere 1 pastiglia InhibitEX 10. Vortex per 1 minuto fino a quando la pastiglia non si sia sciolta completamente 11. Incubare 1 minuto a temperatura ambiente 12. Centrifugare a 14'000 rpm per 3 minuti 13. Depositare il surnatante in un nuovo tubo da 1.5 ml 14. Centrifugare a 14'000 rpm per 3 minuti 15. Depositare 15 µl di proteinasi K in un nuovo tubo da 1.5 ml 16. Prelevare 200 µl dalla centrifugazione precedente e inserire nel nuovo tubo con la

poteinasi K 17. Aggiungere 200 µl di Buffer AL 18. Vortex per 15 secondi 19. Incubare 10 minuti a 70°C 20. Aggiungere 200 µl di etanolo (96-100%) 21. Vortex 22. Aggiungere tutto il contenuto nella QIAamp spin column 23. Centrifugare a 14'000 rpm per 1 minuto e gettare il tubo contentente il filtrato 24. Spostare la colonna in un tubo pulito e aggiungere 500 µl di Buffer AW1 25. Centrifugare a 14'000 rpm per 1 minuto e gettare il tubo contenete il filtrato 26. Spostare la colonna in un tubo pulito e aggiungere 500 µl di Buffer AW2 27. Centrifugare a 14'000 rpm per 3 minuti e gettare il tubo contenente il filtrato 28. Spostare la colonna in un tubo pulito 29. Centrifugare a 14'000 rpm per 1 minuto 30. Trasferire la colonna in un tubo Eppendorf da 1.5 ml e aggiungere 200 µl di Buffer AE 31. Incubare per 1 minuto a temperatura ambiente 32. Centrifugare a 14'000 rpm per 1 minuto 33. Conservare a -20°C.


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5.1.5 Colorazione di Gram e catalasi Sulle colonie sospette vengono eseguiti la catalasi e la colorazione di Gram. Il C. difficile è un batterio Gram positivo con catalasi negativa.

Materiale:

Vetrini

Ansa

Acqua ossigenata H2O2 (allegato 8)

NaCl (allegati 6)

Violetto di Genziana (Fluka, Svizzera) (allegato 9)

Lugol (Fluka, Svizzera) (allegato 10)

Acetone-Alcool (Centazone, Svizzera) (allegato 11)

Fucsina (Fluka, Svizzera) (allegato 12)

Fiamma

Protocollo per il test della catalasi: 1. Prelevare una colonia e porla su un vetrino 2. Aggiungere sopra la colonia una goccia di acqua ossigenata

La catalasi risulta positiva quando la colonia forma delle bolle, se è negativa invece non si presenterà nessuna reazione.

Protocollo della colorazione di Gram: 1. Su un vetrino depositare una goccia di NaCl 2. Prelevare e distribuire nella goccia con un ansa la colonia desiderata 3. Lasciar asciugare 4. Fissare alla fiamma per qualche secondo 5. Aggiungere violetto di genziana per 1 minuti 6. Sciacquare con acqua 7. Aggiungere il Lugol per 2 minuti 8. Sciacquare con acqua 9. Aggiungere Acetone e Alcol e lasciare agire per qualche secondo 10. Sciacquare con acqua 11. Aggiungere la Fucsina per 30 secondi 12. Sciacquare con acqua 13. Asciugare

Il C. difficile è un bacillo, solitamente corto, Gram positivo. A volte si possono notare le spore che non vengono colorate.

5.2 Ceppi clinici Presso ICM il C. difficile viene isolato tramite una piastra selettiva di nome Brazier’s C. difficile selective medium. In caso di crescita sulla piastra selettiva, per la conferma di C. difficile vengono inseminate altre 2 piastre Agar Sangue, una viene incubata in aerobiosi ed una in anaerobiosi entrambe a 37°C. Se la piastra in aerobiosi presenta una crescita non si tratta di C. difficile. Se invece la coltura è positiva solo sulla piastra incubata in anaerobiosi si esegue un test di agglutinazione con il C. difficile Test Kit (Oxoid, UK) che riconosce la proteina glutammato deidrogenasi, specifico per il C. difficile [17].


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Sia le colture di C. difficile che il materiale fecale in analisi vengono testate per la presenza di tossine. Il test permette di stabilire se il ceppo di C. difficile produce tossine, ma non permette di stabilire quali siano presenti. Il kit usato si chiama Premier Toxins A&B della ditta Meridian Bioscience Inc. (USA). Tutti i ceppi positivi da coltura per C. difficile, anche con tossine negative, vengono congelati in Skim Milk (allegato 13) a -20°C nel reparto di igiene ospedaliera. Le feci che risultano negative in coltura vengono tenute per un breve periodo in congelatore prima di essere eliminate.

Per questo studio sono stati scongelati i ceppi patogeni isolati da materiale fecale identificati dal laboratorio nel 2010 e nel 2011. I ceppi vengono inseminati su Agar Sangue e messi ad incubare in anaerobiosi per 48-72 ore.

Sia i ceppi clinici che quelli di origine alimentare sono stati analizzati tramite PCR per la messa in evidenza del tossinotipo e della PCR ribotipo mediante le manipolazioni dettagliate di seguito.

5.3 Estrazione DNA L’estrazione avviene da colonie di C. difficile isolate su AS con il kit InstaGene™Matrix di Biorad secondo la metodologia fornita. Le cellule vengono lisate, si aggiunge una matrice che assorbe i resti della cellula (membrana batterica, polisaccaridi e proteine) e che mediante centrifugazione, li trascina sul fondo, lasciando li DNA purificato nel surnatante.

Materiale:

InstaGene™Matrix (Bio-Rad, Svizzera)

Tubi 1.5 ml sterili (Eppendorf, Svizzera)

Ansa

Incubatore 56°C

Incubatore 100°C

Centrifuge 54172 R (Eppendorf, Svizzera) Vortex

Protocollo: 1. Aggiungere 1 ml di acqua sterile autoclavata in un tubo da1.5 ml 2. Prelevare una colonia e stemperarla nell’acqua 3. Centrifugare 12'000 rpm per 1 minuto 4. Eliminare surnatante 5. Aggiungere 200 ml µl di IstaGene™ Matrix 6. Incubare a 56°C per 30 minuti 7. Vortex per 10 secondi 8. Incubare a 100°C per 8 minuti 9. Vortex per 10 secondi 10. Centrifugare a 10'000 rpm per 3 minuti 11. Conservare l’estratto di DNA a -20°C.


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5.4 Reazioni PCR per gluD e tossine Vengono eseguite 2 PCR multiplex, in una vengono messi i primer per rilevare il gene per la tossina B (tcdBs e tcdBas) e per la glutammato deidrogenasi (GluDs e GluDas). Nella seconda PCR, invece, con una coppia di primer (CLDs e CLDas) rivela la presenza del gene A, amplificando una regione del gene piuttosto conservata mentre la seconda coppia di primers (CLDToxAs e CLDToxAas) è complementare ad una regione più variabile che contiene delle sequenze oligopeptidiche ripetute. Questi primers permettono di identificare la più comune delezione del gene A che avviene proprio all’interno di queste zona. Dal punto di vista fenotipico i ceppi che presentano questa delezione non producono la tossina A.

Figura 1: L'immagine mostra una regione del gene della tossina A, che contiene le sequenze ripetute, lunga 2'535 bp: il primer CLDToxA amplifica per la mutazione più comune. La mutazione consiste in una delezione di 1'821 bp (nel disegno sono indicate in bianco) che porta alla formazione di una sequenza lunga 714 bp [16].

Materiale:

QIAGEN Multiplex 2x PCR Kit (1000), (Qiagen, Svizzera) (allegato 14)

Primer mix 1 o tcd BS 10 µM (Microsynth, Svizzera) o tcd BAS 10 µM (Microsynth, Svizzera) o GluDS 10 µM (Microsynth, Svizzera) o gluDAS 10 µM (Microsynth, Svizzera)

Primer mix 2 o CLDToxAS 10 µM (Microsynth, Svizzera) o CLDToxAas 10 µM (Microsynth, Svizzera) o CLDs 10 µM (Microsynth, Svizzera) o CLDAS 10 µM (Microsynth, Svizzera)

H2O RNAase free

Applied Biosystem VERITI 96 Well Thermal Cycler (Applied Biosystems, USA)

Primer CLDToxA

CLDToxA

Primer CLDToxA


15

Tabella 1: Primer utilizzati nella reazione

Nome Sequenza Referenza

tcdBs forward 5’-GTGTAGCAATGAAAGTCCAAGTTTACGC-3’ [16]

tcdBas reverse 5’-CACTTAGCTCTTTGATTGCTGCACCT-3’

gluDs forward 5’-GTCTTGGATGGTTGATGAGTAC-3’ [17]

gluDas reverse 5’-TTCCTAATTTAGCAGCAGCTTC-3’

CLDtoxAs forward 5’-TTTTGATCCTATAGAATCTAACTTAGTAAC-3’ [16]

CLDtoxAas reverse 5’-CCACCAGCTGCAGCCATA-3’

CLDs forward 5’-TGTTGGAATAGGTGCTGAAG-3’ Tox A in house

(LUMC)* CLDAs reverse 5’-AGATGGAGATGAGAAAAAGTGA-3’

* I primers per amplificare il gene della tossina A sono stati disegnati al centro di referenza per il Clostridium difficile in Olanda al Leiden University Medical Centre.

Protocollo:

Tabella 2: Volume per il mix di reazione per la multiplex PCR GluD e tossina B e per PCR tossina A

Per un campione: GluD e TcdB TcdA

Master Mix 2x 12.5 µl 12.5 µl

Primer Mix 1 2.5 µl

Primer Mix 2 2.5 µl

H2O RNAse free 7.5 µl 7.5 µl

DNA campione 2.5 µl 2.5 µl

Totale 25 µl 25 µl

Il programma del termociclatore è composto da 15 minuti a 95°C seguito da 11 cicli dove la temperatura di annealing parte da 65°C e finisce a 55°C diminuendo 1°C ogni ciclo. Gli 11 cicli sono composti da: denaturazione per 30 secondi a 95°C, annealing per 30 secondi a 65-55°C e elongazione per 30 secondi a 72°C. Successivamente il programma è composto da altri 29 cicli: denaturazione per 30 secondi a 95°C, annealing per 30 secondi a 55°C, elongazione per 30 secondi a 72°C ed un estensione finale per 7 minuti a 72°C. [18]


16

5.5 Messa in evidenza del prodotto PCR Materiale:

Resophor agarose hight resolution (Eurobio, Fancia)

TBE 1x (allegato 15)

DNA Molecular Weight Marker XIV 100 base pair ladder, (Roche, Svizzera) (allegato 16)

Loading buffer 6x (allegato 17)

GelRed™ Nucleic Acid Gel Stain (Biotium, USA) (allegato 18)

Microonde

Beuta

Protocollo: 1. Pesare 1.5 g di agarosio 2. Sciogliere nel microonde l’agarosio in una beuta con 100 ml di TBE 1x (portare a

ebollizione) 3. Raffreddare 4. Aggiungere 10 µl di GelRed (10 µl per 100 ml di soluzione) 5. Versare il gel nello stampo

Nella migrazione viene caricato un marcatore di massa molecolare, un controllo negativo ed uno positivo (ribotipo 027) ed i campioni.

Tabella 3: Volume da caricare su gel per elettroforesi

Campione controlli Peso molecolare

Campione/controlli 10 µl

Loading buffer 6x (allegato) 2 µl

Marcatore di massa molecolare 10 µl

Volume da caricare 12 µl 10 µl

Il gel viene fatto migrare a 150 V per circa 40 minuti. Se il campione è positivo per la gluD si ottiene una banda a 158 bp, per la tossina B invece a 200 bp. La presenza della tossina A è indicata da una banda a 369 bp, mentre la presenza della delezione della tossina A da una banda a 714 bp.


17

1 2 3 4 8 9 10 115 6 7 12 13 14 15

1 2 3 4 8 9 10 115 6 7 12 13 14 15

Ladder

Ladder

Tossina A

Tossina B e GluD

1 2 3 4 8 9 10 115 6 7 12 13 14 15

1 2 3 4 8 9 10 115 6 7 12 13 14 15

Ladder

Ladder

Tossina A

Tossina B e GluD

Figura: 2 Risultato PCR multiplex per il gene della gluD e i geni delle tossine: nel pozzetto numero 1 fino al numero 13 sono stati inseriti i campioni provenienti da pazienti. Al centro troviamo il marcatore di massa molecolare con scala da 100 bp. Il campione 14 è il controllo positivo, mentre il 15 è il controllo negativo. Il campione 3 e 8 sono C. difficile ma non producono nessuna tossina. Il campione 4 presenta la mutazione della tossina A. Il campione 7 invece non è un C. difficile.

5.6 Ribotipo PCR Il ribotipo si basa sulla presenza nel cromosoma batterico, di numerosi alleli dell’operone rRNA che è costituito da: una subunità 16S, una regione intergenica una subunità 23S; ogni allele differisce dall’altro per la diversa lunghezza della regione intergenica situata tra le due subunità. Mediante PCR viene amplificata questa regione e si ottengono tanti frammenti di DNA di diverse lunghezze. [19]

Figura 3: rappresentazione dell’operone rRNA; mediante i due primer 16S e 23S si amplifica lo spazio intergenico.

Materiale:

Taq PCR Master Mix 2x Kit 1000 units (Qiagen, Svizzera) (allegato 19)

Closd 16s 10 µM (Microsynth, Svizzera)

Closd 23s 10 µM (Microsynth, Svizzera)

H2O RNAase free

Applied Biosystem VERITI 96 Well Thermal Cycler (Applied Biosystem, USA)

Delezione gene A (714 bp)

gluD (158 bp) TcdB (200 bp)

TcdA (369 bp)

16S 23S Spazio intergenico 16S Spazio intergenico 23S 16S Spazio intergenico

Primer 16S Primer 23S


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Tabella 4: Primer utilizzati nella reazione

Nome Sequenza Referenza

Closd 16S 5’-GTGCGGCTGGATCACCTCCT-3’ [20]

Closd 23S 5’-CCCTGCACCCTTAATAACTTGACC-3’

Tabella 5: Volume per il mix di reazione per PCR ribotyping

Per un campione

Master Mix 2x 12.5 µl

Primer 16s 0.75 µl

Primer 23s 0.75 µl

H2O RNAse free 8.5 µl

DNA campione 2.5 µl

Totale 25 µl

Il programma è composto da 6 minuti a 95°C seguito da 35 cicli composti da: denaturazione per 1 minuti a 94°C, annealing 1 minuto a 57°C, elongazione per 1 minuto a 72°C ed un estensione finale a 72°C per 7 minuti. [19]

5.7 Messa in evidenza del prodotto PCR Vedi protocollo 5.5: pesare 3,75 g di agarosio e sciogliere in 250 ml di TBE 1x.

Il gel viene fatto migrare a 150 V per circa 5 ore. Tutti i risultati vengono analizzati con il programma informatico BioNumerics versione 6.01 (Applied Maths, Belgio). Il programma permette di standardizzare i gel e confrontare le bande con una banca dati esistente per stabilire il ribotipo.


19

Figura 4: Risultato PCR ribotipo di alcuni ceppi clinici: nel primo e nell’ultimo pozzetto vengono inseriti marcatori di massa molecolare con scala da 100 bp. Il campione numero 1 è compatibile con il riboprofilo 106, i profili dei campioni 2, 3, 7, 9, 10, 11 non sono presenti nella banca dell’Istituto. I campioni 4 e 6 corrispondono al ripotipo 001, il campione 5 al ribotipo 050, il campione 8 al ribotipo 126. In penultima posizione invece abbiamo inserito un controllo negativo (CN).

5.8 PCR per la tossina binaria La PCR permette di determinare la presenza della tossina binaria mediante due primer che amplificano la subunità A (CDTA F e CDTA R) e la subunità B (CDTB F CDTB R). [20]

Figura 5: Gene della tossina binaria, la coppia di primer per la subunità A aplificheranno la regione cdtA, mentre la coppia di primer per la subunità B amplificheranno la regione cdtB [21]

Materiale: Taq PCR Master Mix 2x Kit 1000 units, (Qiagen, Svizzera) (allegato 19)

CDTA F 10 µM (Microsynth, Svizzera)

CDTA R 10 µM (Microsynth, Svizzera)

CDTB F 10 µM (Microsynth, Svizzera)

CDTB R 10 µM (Microsynth, Svizzera)

H2O RNAase free

Applied Bioyistem VERITI 96 Well Thermal Cycler ( Applied Byosistem, USA)

Primer CDTA Primer CDTB


20

Tabella 6: Primer utilizzati nella reazione:

Primer Seguenza Referenza

CDTA F forward 5’-3TGAACCTGGAAAAGGTGATG-3’ [22]

CDTA R reverse 5’-AGGATTATTTACTGGACCATTTG-3’

CDTB F forward 5’-CTTAATGCAAGTAAATACTGAG-3’ [22]

CDTB R reverse 5’-AACGGATCTCTTGCTTCAGTC-3’

Tabella 7: Volume per il mix di reazione per PCR tossina binaria

Per un campione: Sub unità A Sub unità B

Master Mix 2x 25 µl 25 µl

CDTA F 1.5 µl

CDTA R 1.5 µl

CDTB F 1.5 µl

CDTB R 1.5 µl

H2O RNAse free 17 µl 17 µl

DNA campione 5 µl 5 µl

Totale 50 µl 50 µl

Il programma è composto da 5 minuti a 95°C seguito da 30 cicli composti da: denaturazione per 45 secondi a 94°C, annealing 1 minuto a 52°C, elongazione per 1 minuto a 72°C ed un estensione finale a 72°C per 7 minuti.[21]

5.9 Messa in evidenza del prodotto PCR

Vedi protocollo 5.5

Il gel viene fatto migrare a 150 Volt per circa 40 minuti. La positività della tossina binaria è data dalla presenza della subunità A, a 327 bp, e dalla subunità B a 451bp.


21

Figura 6: Risultato della PCR per la tossina binaria: il campione 1 e 2 risultano negativi, il campione 3 invece è positivo per la tossina binaria come pure il campione 6. Il campione 4 corrisponde al controllo negativo, mentre il 5 al controllo positivo. Al centro troviamo il marcatore di massa molecolare con scala da 100bp.

6. Risultati e discussione

6.1 Studio preliminare, confronto e scelta dei metodi di coltura In primo luogo abbiamo eseguito uno studio preliminare, utilizzando dei campioni non ufficiali (campioni che non fanno parte della campagna di prelevamento), che ha permesso di testare quale dei due metodi utilizzati (metodo con cooked meat medium e metodo con brain heart infusion) fosse più sensibile nella rivelazione di spore di C. difficile. Gli alimenti sono stati contaminati direttamente, con quantitativi diversi, con spore provenienti da un ceppo con ribotipo 029 (A+B+CDT-).

I cibi, dopo essere stati inseriti nel brodo, vengono contaminati con le spore. Dopo incubazione, viene eseguito l’alcool shock per eliminare tutte le cellule in fase vegetativa contenute nel campione: il sedimento viene poi inseminato su piastra CLO selettiva per C. difficile. Se dopo 48 ore di incubazione a 37°C in anaerobiosi la crescita risulta positiva si prosegue con le analisi molecolari sopra descritte per confermare la presenza del ceppo con ribotipo 029 usato per contaminare gli alimenti.

Subunità A (327bp)

Subunità B (451 bp)


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Tabella 8: Tabella riassuntiva dello studio preliminare sulla carne eseguito per determinare la sensibilità del metodo:

Campione Metodo ContaminazioneCrescita

ANA gluD TcdA TcdB Ribotipo

Carne 1 BHI

10’000 per g Positivo Positivo Positivo Positivo

029 CMM Positivo Positivo Positivo Positivo

Carne 2 BHI

5’000 per g Positivo Positivo Positivo Positivo

029 CMM Positivo Positivo Positivo Positivo

Carne 3 BHI

1’000 per g Positivo Positivo Positivo Positivo 029

CMM Negativo Negativo Negativo Negativo -

Carne 4 BHI

500 per g Positivo Positivo Positivo Positivo 029

CMM Ø Ø Ø Ø Ø

Carne 5 BHI

50 per g Positivo Positivo Positivo Positivo 029

CMM Negativo Negativo Negativo Negativo -

BHI = Brain heart infusion CMM = Cooked meat medium ANA = anaerobiosi - = non eseguito

Entrambi i metodi hanno evidenziato una buona sensibilità di detezione del C. difficile fino alla contaminazione con 5'000 spore per grammo. Il metodo che utilizza Brain heart infusion, riesce a rilevare la presenza del patogeno fino a una contaminazione di 50 spore per grammo.

Tabella 9: Tabella riassuntiva dello studio preliminare sull’insalata eseguito per determinare la sensibilità del metodo

Campioni Metodo ContaminazioneCrescita

ANA gluD TcdA TcdB Ribotipo

Insalata 1

BHI 10’000 per g

Positivo Positivo Positivo Positivo 029

CMM Positivo Positivo Positivo Positivo

Insalata 2

BHI 5’000 per g

Positivo Positivo Positivo Positivo 029

CMM Positivo Positivo Positivo Positivo

Insalata 3

BHI 1’000 per g

Negativo Negativo Negativo Negativo -

CMM Negativo Negativo Negativo Negativo

BHI = Brain heart infusion CMM = Cooked meat medium ANA = anaerobiosi - = non eseguito


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La sensibilità di detezione del patogeno riscontrata nelle insalate risulta essere di 5'000 spore per grammo con entrambi i metodi. Con una contaminazione di 1'000 spore per grammo si ottengono risultati negativi con entrambi i metodi.

Entrambi i metodi sono riusciti a rilevare la presenza di C. difficile con una contaminazione di 5'000 spore per grammo, sia nella carne che nell’ insalata. E’ stato quindi deciso di contaminare tutti gli alimenti con 5'000 spore per grammo, visto che al di sotto di questa soglia il ritrovamento di C. difficile non è certo.

A causa del basso numero di campioni preliminari e dei risultati discordanti degli studi pubblicati non abbiamo voluto scegliere un metodo unico ed abbiamo quindi continuato il lavoro utilizzando entrambi i metodi in parallelo.

6.2 Studio di campioni di alimenti Tutti i campioni ufficiali sono stati raccolti dagli Ispettori del Laboratorio Cantonale e messi in coltura con entrambi i metodi sopra citati. Ogni campione è stato suddiviso in due parti in modo da utilizzarne una come controllo positivo, contaminandola con 5'000 spore per grammo. Le tabelle completi dei risultati di carne e insalata sono in allegato (allegato 20).

Tabella 10: tabella riassuntiva degli alimenti ufficiali

Metodo Alimento Crescita su terreno

selettivo

Risultato PCR dopo estrazione DNA da

brodo

BHI 27 insaccati Negativo Negativo

BHI 7 insalate Negativo Negativo

CMM 27 insaccati Negativo Negativo

CMM 7 insalate Negativo Negativo

BHI = Brain heart infusion CMM = Cooked meat medium

Tabella 11: tabella riassuntiva degli alimenti ufficiali usati come controllo positivo

Metodo Alimento Crescita positiva su

terreno selettivo

Risultato PCR dopo estrazione DNA da

brodo

BHI 27 insaccati 22 positivi 0 positivi

BHI 7 insalate 5 positivi -

CMM 27 insaccati 16 positivi 5 positivi

CMM 7 insalate 6 positivi 1 positivo

BHI = Brain heart infusion CMM = Cooked meat medium - = analisi non effettuata


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I 27 insaccati crudi sono risultati tutti negativi. Da nessuno di esso è stato possibile isolare il C. difficile. I controlli positivi mostrano risultati discordanti. Dei 27 campioni analizzati con il metodo Brain heat infusion contaminati con 5'000 spore per grammo, 5 non hanno mostrato nessuna crescita in coltura. Anche per 5 di questi l’analisi tramite PCR è risultata negativa nei 5 campioni per i quali è stata effettuata. Per quanto concerne i campioni contaminati analizzati con il metodo Cooked meat medium, risulta che per 11 campioni non è stato possibile ottenere una coltura positiva. Anche per questi campioni è stata effettuata l’estrazione di DNA direttamente dal brodo di crescita per verificare tramite PCR la presenza di C. difficile. Il metodo molecolare ha permesso di confermare la presenza di C. difficile solo in 5 degli 11 campioni.

I 7 campioni ufficiali di insalata sono risultati negativi per C. difficile .Il metodo basato sul Brain heat infusion ha rilevato la presenza di C. difficile in 5 dei 7 campioni di insalata contaminati con 5'000 spore per grammo. Al momento della stesura dei risultati, l’analisi tramite PCR non era stata eseguita. Il metodo che utilizza Cooked meat medium ha rilevato la contaminazione in 6 campioni su 7; il campione negativo per la crescita in coltura è però risultato positivo tramite PCR dopo estrazione di DNA diretta da brodo.

Malgrado l’esiguo numero di campioni analizzati, i risultati sembrano indicare che il metodo che utilizza Brain heat insufion sia più sensibile per i campioni di carne poiché è stato possibile valutare correttamente il 79% dei campioni contaminati. I campioni contaminati negativi in coltura però sono risultati tali anche dopo estrazione di DNA diretta dal brodo.

Il metodo Cooked meat medium invece, ha rilevato il C. difficile in 6 su 7 campioni di insalata contaminati. Nell’unico campione contaminato risultato negativo in coltura è però stato possibile mettere in evidenza C. difficile tramite PCR.

Nel tentativo di spiegare il risultato negativo dell’analisi tramite PCR degli alimenti contaminati, abbiamo aggiunto del DNA sia all’estratto di DNA dal brodo di coltura che direttamente nel brodo di coltura prima dell’estrazione. Nei due casi i risultati sono stati positivi escludendo quindi sia possibili problemi del metodo PCR che problemi dovuti alla presenza di inibitori.

D’altra parte, non è sempre stato possibile mettere in evidenza il C. difficile tramite PCR nei campioni di alimenti contaminati. E’ possibile che, forse a causa di un ambiente non favorevole, le spore introdotte non siano germinate impedendo sia la crescita su piastra sia un’estrazione ottimale di DNA. D’altra parte, non è possibile escludere una non omogenea distribuzione delle spore immesse nel campione.

6.3 Analisi di campioni di origine clinica Lo studio comprendeva anche un indagine sui C. difficile di origine clinica. I campioni sono stati isolati dal reparto di microbiologia dell’ICM di Bellinzona. Sono stati analizzati 83 ceppi del 2010 mentre 26 ceppi erano del 2011 (analisi effettuate fino ad aprile 2011).


25

Figura 7: il grafico mostra l’andamento dei ceppi clinici nel 2010 e nel 2011. Il ribotipo “?” sono dei ribotipi vari che non sono stati identificati (nessuna referenza nella banca dati).

Il grafico mostra molto bene la prevalenza del C. difficile ribotipo 014 (A+B+CDT-) in Ticino; la sua frequenza nel 2010 e all’inizio del 2011 è stata del 19%. Si noti anche che il ribotipo 018 (A+B+CDT-) nel 2010 ha avuto una frequenza del 5% (4 ceppi) mentre nei primi 4 mesi dell’anno è stato isolato nel 19% (5 ceppi) dei casi. Queste frequenze potrebbero indicare una piccola epidemia in corso. Nel periodo considerato, è stato possibile osservare che in Ticino sono presenti anche i ribotipi 066, 078 e 126 che possiedono la tossina binaria positiva che rende particolarmente patogeno il C. difficile.


26

7. Conclusioni Le fonti di contaminazione e i fattori predisponenti delle infezioni nosocomiali da C. difficile sono ben conosciuti mentre poco si sa sull’origine delle infezioni comunitarie, la cui prevalenza è in aumento. Tra i serbatoi conosciuti di questi batteri anaerobi sporigeni predominano l’ambiente e gli animali da reddito e di compagnia, ma recentemente, sono state indagate altre possibili fonti di contaminazione quali gli alimenti. La frequenza di isolamento di C. difficile negli alimenti varia da 0 al 45% circa a dipendenza del tipo di alimento e della Nazione in cui si è svolto lo studio. Nell’unico studio svizzero a nostra conoscenza [9] nessuno dei 46 campioni di carne analizzati è risultato positivo. Anche i nostri risultati sono stati negativi ma solo un numero esiguo di campioni è stato analizzato; per conclusioni statisticamente valide avremmo dovuto aumentare il numero di campioni. Malgrado le limitazioni menzionate, abbiamo potuto stabilire che il metodo che utilizza il Brain heart infusion risulta più sensibile rispetto a quello con Cooked meat medium per la rivelazione su piastra di C. difficile nei campioni di carne, mentre quest’ultimo sembra più adatto all’analisi delle insalate. Possiamo perciò confermare le difficoltà già riscontrate da altri autori per la ricerca di C. difficile negli alimenti.

Dai nostri dati preliminari, sembrerebbe che la ricerca tramite PCR di C. difficile nelle carni e nelle insalate sia possibile; bisognerebbe però ottimizzare il metodo per un’estrazione ottimale di DNA anche dalle spore e per una migliore omogeneizzazione dei campioni.

A causa del numero limitato di campioni analizzati, in questo studio non è stato possibile stabilire se alimenti pronti al consumo come insaccati crudi ed insalate possano rappresentare una causa di contaminazione da C. difficile in Ticino; sembra però che anche nell’impossibilità di escluderla, questa origine sia poco probabile. L’analisi dei ceppi di C. difficile isolati da pazienti nel periodo 2010-2011 mostra una netta prevalenza di ceppi appartenenti al ribotipo 014 (A+B+CDT-), uno dei ribotipi più frequenti in Europa. L’origine e/o il serbatoio di questo ribotipo resta ancora sconosciuto.


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8. Ringraziamenti Ringrazio il direttore dell’Istituto Cantonale di Microbiologia Dr. Orlando Petrini per avermi dato la possibilità di svolgere il mio lavoro di diploma presso l’istituto e il direttore del Laboratorio Cantonale Dr. Marco Jermini per la preziosa collaborazione. Ringrazio la Dr.ssa Antonella Demarta e Federica Mauri per avermi seguita durante il mio percorso, aiutandomi e dandomi consigli. Ringrazio la Dr.ssa Petra Giannini e tutto il team del Laboratorio Cantonale per la pazienza e l’aiuto fornito. Ringrazio anche la tecnica in analisi biomediche AnnaPaola Caminada per i numerosi consigli. Un grazie immenso anche a Nadia Ruggeri che ha saputo aiutarmi in un momento particolarmente delicato. Un grazie va a tutti i dipendenti dell’Istituto che anno animato ogni mia giornata lavorativa. Ringrazio il direttore della Scuola Superiore Medico Tecnica di Locarno Andrea Boffini ed i docenti Claudio Naiaretti e Giovanni Togni per tutti i consigli metodologici. Un ringraziamento anche Susan Gilbert. Ringrazio la mia famiglia e tutte le persone che mi hanno aiutato, sostenuto e sopportato durante tutto il percorso formativo.


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30

10. Allegati

10.1 Allegato 1 http://www.biolifeit.com/biolife/upload/file/Documenti/56aeb910303.pdf ultima visita: 04.04.2011

Biolife Italiana S.r.l. Scheda Tecnica N°401310 B I-2 9/2003 Pagina 1 di 1

Biolife Italiana S.r.l. Viale Monza 272, 20128 Milano. Tel. n° 02-25209.1, Fax n° 02-2576428, E-mail: [email protected] ; sito Web: www.biolifeit.com

COOKED MEAT MEDIUM Terreno d’uso generale per la crescita ed il mantenimento di microrganismi aerobi ed anaerobi FORMULA TIPICA (g/l) Cuore di vitello, infuso da 454 Peptone 10 Estratto di carne 10 Sodio cloruro 5 Glucosio 2 PREPARAZIONE

Sospendere 10 g di particelle in 100 ml di acqua distillata, oppure 1 g in 10 ml in provetta. Lasciare assorbire per circa 15 minuti, quindi sterilizzare a 121°C per 15 minuti. Raffreddare lentamente per evitare l’espulsione delle particelle dai contenitori. pH finale 7.2 ± 0.2 DESCRIZIONE

Cooked Meat Medium è un terreno indicato per la crescita di una larga varietà di microrganismi inclusi quelli a sviluppo difficile, partendo anche da inoculi molto bassi. Il terreno mantiene vitali le cellule batteriche per lungo tempo e per questo motivo è un eccellente substrato per il trasporto ed il mantenimento delle colture microbiche. Il terreno può essere addizionato di glucosio, emina e vitamina K per la crescita rapida dei batteri anaerobi. IMPIEGO

Per la coltivazione dei batteri anaerobi, bollire le provette che non sono state preparate in giornata, per eliminare l’ossigeno disciolto. Inoculare pesantemente nella zona delle particelle di carne ed incubare a 35°C fino a 7 giorni in condizioni di anaerobiosi. I clostridi saccarolitici coltivano con produzione di gas e di acidi, i proteolitici provocano una disgregazione delle particelle di carne e l’annerimento del terreno. CONTROLLO QUALITÀ DELL’UTILIZZATORE

Controllo positivo di proteolisi C.histolyticum ATCC 19401 Controllo positivo di saccarolisi C.perfringens ATCC 13124 CONSERVAZIONE

Conservare a 10-30°C, in luogo asciutto. In queste condizioni Cooked Meat Medium è valido fino alla data di scadenza indicata in etichetta. Non utilizzare oltre questa data. Eliminare se vi sono segni evidenti di deterioramento della polvere (modifiche del colore, indurimento della polvere ecc.). Conservare le provette preparate in laboratorio per un massimo di 7 giorni a 2-8°C. Bollire le provette che non sono state preparate in giornata, per eliminare l’ossigeno disciolto. PRECAUZIONI E SICUREZZA DEGLI OPERATORI

Il preparato qui descritto non è classificato come pericoloso ai sensi della legislazione vigente né contiene sostanze pericolose in concentrazioni _1%. Come per tutti i terreni in polvere anche la manipolazione del Cooked Meat Medium deve essere effettuata con una adeguata protezione delle vie respiratorie. Il prodotto qui descritto è solo per uso diagnostico in vitro e deve essere usato in laboratorio, da operatori adeguatamente addestrati, con metodi approvati di asepsi e di sicurezza nei confronti degli agenti patogeni. Sterilizzare le provette dopo il loro uso e prima dell’eliminazione come rifiuto. BIBLIOGRAFIA

• Robertson, M. (1916) J. Path. Bact. 20, 327-349 CONFEZIONE

4013102 Cooked Meat Medium, 500 g (50 l) IVD


31

10.2 Allegato 2 http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=CM1135&org=133&c=UK&lang=EN ultima visita: 04.04.2011

BRAIN HEART INFUSION BROTH

Code: CM1135

A highly nutritious infusion medium recommended for the cultivation of streptococci, Neisseria and other

fastidious organisms.

Formula gm/litre

Brain infusion solids 12.5

Beef heart infusion solids 5.0

Proteose peptone 10.0

Glucose 2.0

Sodium chloride 5.0

Disodium phosphate 2.5

pH 7.4 ± 0.2 @ 25°C

Directions

Dissolve 37g in 1 litre of distilled water. Mix well and distribute into final containers. Sterilize by autoclaving at

121°C for 15 minutes.

Description

A versatile liquid infusion medium which is suitable for the cultivation of streptococci, Neisseria and other

fastidious organisms, this medium is recommended for blood culture work and, with the additions described

below, for the isolation and cultivation of pathogenic fungi.

Oxoid Brain Heart Infusion Broth is essentially a buffered infusion broth, giving similar results to the brain

dextrose broths originally employed for the cultivation of streptococci1, and for the cultivation of dental

pathogens2. The addition of 0.1% agar will serve to reduce convection currents and so create conditions of

varying oxygen tension which favour the growth and primary isolation of aerobes and anaerobes3, while even

easily cultivated organisms show improved growth4.

Oxoid Brain Heart Infusion Broth was used in a test for the pathogenicity of streptococci5,6 and the same

medium was enriched with ascitic fluid for the cultivation of gonococci7. It is especially useful as a growth and

suspension medium for staphylococci which are to be tested for coagulase production; Newman8 employed a

similar medium for this purpose in an investigation of food poisoning caused by dairy products.

A satisfactory medium for blood culture can be prepared by adding 1g of agar per litre of Brain Heart Infusion

Broth. Ensure that the agar is uniformly distributed in the sterile broth before dispensing into bottles. More

conveniently, add one Agar Tablet (CM0049) to each 100ml of Brain Heart Infusion and sterilize by


32

autoclaving for 15 minutes at 121°C. Cool to 60-70°C and mix gently to ensure uniform distribution of the

agar.

Tubes of Oxoid Brain Heart Infusion Broth which are not used the same day as sterilized should be placed in

a boiling water bath for several minutes to remove absorbed oxygen, and cooled rapidly without shaking, just

before use.

Further supplements to improve the recovery of organisms from blood can be added before sterilization or

aseptically post-sterilization. Co-enzyme1 (NAD), penicillinase and p-amino benzoic acid are examples. Brain

Heart Infusion Broth supplemented with yeast extract, haemin and menadione was consistently better in

producing heavy growth of five species of Bacteroides than three standard anaerobic broths. Furthermore,

microscopy of overnight cultures showed normal morphology in Brain Heart Infusion Broth but abnormal

morphology in the three anaerobic broths9.

Storage conditions and Shelf life

Store the dehydrated medium at 10-30°C and use before the expiry date on the label.

Store tubed or bottled medium in the dark and below 20°C.

Appearance

Dehydrated medium: Straw coloured, free-flowing powder.

Prepared medium: Straw coloured solution.

Quality control

Positive controls Expected results

Streptococcus pneumoniae ATCC® 6303* Turbid growth

Candida albicans ATCC® 10231* Turbid growth

Negative control

Uninoculated medium No change

*This organism is available as a Culti-Loop®

References

1. Rosenow E. C. (1919) J. Dental Research l. 205-249.

2. Haden R. L. (1923) Arch. Internal Med. 32. 828-849.

3. Hitchens A. P. (1921) J. Infectious Diseases 29. 390-407.

4. Falk C. R. et al. (1939) J. Bact. 37. 121-131.

5. Chapman G. H. et al. (1944) Am. J. Clin. Path. 9: Tech. Suppl. 3. 20-26.

6. Chapman G. H. (1946) Am. J. Digestive Diseases 13. 105-107.

7. Reitzel R. J. and Kohl C. (1938) J. Am. Med. Assoc. 110. 1095-1098.

8. Newman R. W. (1950) J. Milk and Food Tech. 13. 226-233.

9. Eley A., Greenwood D. and O’Grady F


33

10.3 Allegato 3 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?D7=0&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&N4=86339%7CSIGMA&N25=0&QS=ON&F=SPEC ultima visita: 04.04.2011, allegato in forma parziale

Description

Other Notes For the solubilization of unconjugated bilirubin1

Propriétés

EQP level http://www.sigmaaldrich.com/insite_enhanced_quality

Description Anionic

Assay ≥97.0% (TLC)

optical activity [α]20/D +23±1°, c = 3% in H2O (dry matter)

total impurities ≤1% taurine

≤2% cholic acid

Solubilità H2O: soluble50 mg/mL, clear

10.4 Allegato 4 http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=SR0096&org=52&c=UK&lang=EN ultima visita: 04.04.2011

CLOSTRIDIUM DIFFICILE SELECTIVE SUPPLEMENT

Code: SR0096

Vial contents (each vial is sufficient for 500mls of medium)

per vial per litre

D-cycloserine 125.0mg 250.0mg

Cefoxitin 4.0mg 8.0mg

Directions

Suspend 34.5g in 500ml of distilled water and bring gently to the boil to dissolve completely. Sterilise by

autoclaving at 121°C for 15 minutes. Allow to cool to 50°C and add aseptically the contents of 1 vial of Oxoid

Clostridium Difficile Supplement (SR0096) reconstituted as directed, together with 7% (v/v) Defibrinated


34

Horse Blood (SR0050). Sheep Blood (SR0051) may be used in place of Horse Blood but some strains of the

organism will show a slightly reduced growth recovery. Mix well and pour into sterile Petri dishes.

Description

Clostridium difficile was first isolated in 1935 by Hall and O’Toole1 who proposed the name `difficile’ because

it was very difficult to isolate. In 1940 Snyder2 isolated Clostridium difficile from infants aged 10 weeks to 1

year. No further isolations were reported until 1960, when the organism was cultured by McBee3 from the

intestinal contents of a seal, and in 1962 Smith and King4 reported its presence in human infections.

Toxicogenic isolates of Clostridium. difficile have been demonstrated to be a major cause of antibiotic-

associated ileo-caecitis in laboratory animals5 and pseudomembranous colitis in man6,7. Keighley8 found

Clostridium difficile was associated with colitis and diarrhoea without pseudomembranous changes after

antibiotic therapy following gastrointestinal operations.

Hafiz and Oakley9 devised a medium for the selective isolation of Clostridium difficile based on the

observation that the organism has a high tolerance to cresol, which it produces during its growth, and used

Reinforced Clostridial Medium (CM0151) plus 0.2% phenol or p-cresol.

George et al10 in a study of selective media for the routine isolation of Clostridium difficile from faecal

specimens found this medium was inhibitory compared with growth on blood agar. They recommended the

use of a fructose containing nutrient medium plus egg yolk, with D-cycloserine and cefoxitin as selective

agents for the isolation of Clostridium difficile.

The combination of Oxoid Clostridium difficile Agar Base plus the Culture Media Supplement (SR0096) is

based on the formulation proposed by George et al.10

The selective agents D-cycloserine (500µg/ml) and cefoxitin (16µg/ml) inhibit growth of the majority of

Enterobacteriaceae, as well as Streptococcus faecalis, staphylococci, Gram-negative non-sporing anaerobic

bacilli and Clostridia species. (except Clostridium difficile) which may be found in large numbers in faecal

samples.

Levett11, noting reports12,13 that some strains of Clostridium difficile had low minimum inhibitory concentrations

to both cycloserine and cefoxitin, reduced the antibiotic concentrations to 125µg per ml cycloserine and 4µg

per ml cefoxitin and combined this with alcohol shock14 to compensate for the reduction in selectivity.

Clostridium difficile was isolated from all of the 33 faecal specimens plated on to CCFA Medium containing

cycloserine and cefoxitin at 250µg per ml and 8µg per ml respectively, but from only 25/33 specimens plated

on to medium containing 500µg per ml cycloserine and 16µg per ml cefoxitin. The specimen should be

treated with alcohol before inoculation (see technique).

It can be expected that medium containing the lower concentration of antibiotics will yield a greater growth of

contaminating organisms if antibiotics are used alone, but Levett reported that there was no difference in the

growth of contaminating organisms on plates containing either concentration of antibiotics following alcohol

shock treatment of the specimen.

Phillips and Rogers15 have described a simple modification to the medium in which the ability of Clostridium

difficile to produce p-cresol from p-hydroxyphenyl acetic acid is used for the rapid presumptive identification

by gas chromatographic detection of the p-cresol. Addition of 7% horse blood to the agar base increases the

recovery of Clostridium difficile and produces larger colonies compared with Egg Yolk Emulsion used by

George et al.10

Technique

1. Lightly inoculate the medium with the faecal sample spreading part of the original inoculum in order

to obtain well separated colonies.


35

2. Incubate plates at 35°C for 18-24 hours in a conventional anaerobic gas jar. The use of the Oxoid

Anaerobic Jar (HP0011) with an Anaerobic Gas Generating Kit (BR0038) is strongly recommended.

Alternatively use Anaerogen (AN0025 or AN0035). Anaerogen does not require the addition of water

or a catalyst.

3. Colonies of Clostridium difficile after 48 hours incubation are 4-6mm diameter irregular, raised

opaque, grey-white.

Technique for Alcohol Shock Treatment (if required)

1. Mix equal parts of industrial methylated spirit or absolute alcohol and the faecal specimen.

2. Homogenise using a vortex mixer.

3. Leave at room temperature for 1 hour.

4. Inoculate on to Clostridium difficile Selective Agar and incubate anaerobically.

Storage conditions and Shelf life

Store the dehydrated medium at 10-30°C and use before the expiry date on the label.

Store the prepared medium at 2-8°C no longer than 5-7 days.

Appearance

Dehydrated medium: Straw coloured, free-flowing powder

Prepared medium: Straw coloured coloured gel

Quality control

Positive control: Expected results

Clostridium difficile NCTC 11204 Good growth; grey-white coloured

colonies

Negative controls:

Staphylococcus aureus ATCC® 25923*

No growth

Escherichia coli ATCC® 25922* No growth

* This organism is available as a Culti-Loop®

Precautions

Colonies of Clostridium difficile from faecal cultures are smaller when egg yolk is used in place of horse

blood.

The Oxoid formula does not contain the neutral red indicator proposed by George et al.10 because it is

designed for use with horse blood. On this medium the typical colour of the colony of Clostridium difficile will

not appear however there will be a fluorescent reaction.

Typical Gram stain morphology of Clostridium difficile may not be evident in colonies picked from this

medium because of the antibiotics present. Subculture to blood agar to obtain characteristic morphology10.


36

10.5 Allegato 5 Thioglicolato:

sciogliere 30 gThioglycolate Medium (BBL) in 1 litro di acqua demineralizzata Portare a ebollizione e bollire per 1 minuto Aggiungere 100 µl di vitamina K1 1% (Fluka, Svizzera) (sciogliere 1 g in 100 ml di

Etanolo 96% e conservare al buio) Distribuire 6 ml in provette Sterilizzare a 118°C per 15 minuti

10.6 Allegato 6 NaCl allo 0,9%:

18 g di cloruro di sodio (NaCl) (Fluka, Svizzera) 2 litri di acqua demineralizzata Sterilizzare a 121°C per 15 minuti

10.7 Allegato 7 Numero di spore per ml: CFU : 100 µl = x : 1000 µl

Numero di spore per diluizione: Diluizione = Numero di spore per ml : x

Calcolo di spore da aggiungere al campione: Numero spore desiderato (o volume da contaminare) = Numero spore per grammo (ml)

Numero spore per ml : 1000 ul = Numero spore per grammo( ml) : x

10.8 Allegato 8 Acqua ossigenata:

10 ml di acqua ossigenata 35% (Fluka, Svizzera) 90 ml di acqua demineralizzata

10.9 Allegato 9 Violetto di Genziana:

Soluzione madre: Sciogliere 100 g di violetto di genziana in 2 litri di alcool etilico (Centazone, Svizzera) Mescolare bene con il miscelatore Filtrare in bottiglia scura

Soluzione di lavaro: Mescolare 500 ml di soluzione madre con 2 litri di acqua demineralizzata Mettere in bottiglia scura

10.10 Allegato 10 Lugol:

Aggiungere 3 litri di acqua demineralizzara a 200 g di Potassium lodide (Fluka, Svizzera)

Mescolare bene con il miscelatore Aggiungere 100 g di Iodine (Fluka, Svizzera)


37

Mescolare a lungo (tutta la notte) Versare in bottiglia scura

10.11 Allegato 11 Alcool – Acetone (Centazone, Svizzera):

Mescolare 3 parti di Alcool 96% e 1 parte di Acetone

10.12 Allegato 12 Fucsina (Fluka, Svizzera):

Sotto cappa aggiungere 4 litri di acqua a 20 di fucsina Mescolare bene con l’agitatore Filtrare in bottiglia scura

10.13 Allegato 13 Skim milk:

Aggiungere 70 ml di acqua demineralizzata a 10 grammi di Skim milk (BBL) Mescolare bene Sterilizzare a 121°C per 15 minuti Lasciar raffreddare Aggiungere 10 ml di Calf serum (Sigma, Svizzera) e 20 ml di glicerolo (Fluka,

Svizzera) Mescolare bene

10.14 Allegato 14 QIAGEN Multiplex 2x PCR Kit (1000), Cat. No. 20614 (Qiagen,Svizzera):

HotStarTaq DNA polymerase Multiplex PCR buffer dNTP mix

10.15 Allegato 15 Tampone TBE 10x

108 g di Tris base 55 g di boric acid 40 ml di 0.5 M EDTA, pH 8

Tampone TBE 1x:

900 ml di acqua demineralizzata

100 ml di TBE 10x

10.16 Allegato 16 DNA molecular weigh marker XIV 100 base pair ladder (Roche, Svizzera) Concentrazione 250µg/ml

36 µl di marker 100 bp 54 µl di H2O RNAse free 18 µl di loading buffer 6x

10.17 Allegato 17 Loading buffer 6x:

0.25% di Blu di bromotimolo


38

0.25% di Xylene cyanol 30% di glicerolo in acqua

10.18 Allegato 18 http://www.biotium.com/product/product_info/flyer/GelRed%20&%20GelGreen%20Flyer.pdf ultima visita: 25.5.2011 allegato in forma ridotta

GelRedTM and GelGreen TM

The best nucleic acid gel stains by combining sensitivity, safety and stability

GelRed™ and GelGreen™ represent a new generation of fluorescent nucleic acid gel stains designed to replace the highly toxic ethidium bromide (EtBr) for staining dsDNA, ssDNA or RNA in agarose gels or polyacrylamide gels. GelRed and GelGreen are superior to EtBr and other EtBr alternatives by having a combination of low toxicity, superior sensitivity and exceptional stability.

Nucleic acid dyes are inherently hazardous because of their potential to cause DNA mutation. However, for genotoxicity to occur, it is necessary for the dyes to enter cells. With this insight, we engineered the chemical structures of GelRed™ and GelGreen™ so that the dyes are unable to cross cell membranes, thus denying the opportunity for them to interact with intracellular DNA. As a result of the novel designs, GelRed™ and GelGreen™ are shown to be nonmutagenic and noncytotoxic at concentrations relevant to nucleic acid gel staining. Moreover, GelRed™ and GelGreen™ have also been tested to be nontoxic to aquatic life, meeting the environmental regulatory requirement by the state of California for safe disposal in the drain.

GelRed™ is a direct replacement for EtBr due to its nearly identical spectra to those of EtBr. Key features of GelRed include the following::

10.19 Allegato 19 Taq PCR Master Mix 2x Kit 1000 units, Cat. No. 201445 (Qiagen, Svizzera):

Taq DNA Polymerase QIAGEN PCR Buffer dNTPs

10.20 Allegato 20

Tabella 12: Tabella dei 27 campioni di carne e dei controlli positivi

Campione Metodoa) Contaminazioneb) Crescita su terreno selettivoc)

Risultato PCR dopo estrazione DNA da brodod)

1

BHI - No Negativo

X Si -

CMM - No Negativo

X Si -


39

2

BHI - No Negativo

X Si -

CMM - No Negativo

X Si -

3

BHI - No Negativo

X Si -

CMM - No Negativo

X No Negativo

4

BHI - No Negativo

X Si -

CMM - No Negativo

X No Positivo

5

BHI - No Negativo

X Si -

CMM - No Negativo

X Si -

6

BHI - No Negativo

X Si -

CMM - No Negativo

X No Negativo

7

BHI - No Negativo

X Si -

CMM - No Negativo

X SI -

8

BHI - No Negativo

X Si -

CMM - No Negativo

X SI -

9

BHI - No Negativo

X Si -

CMM - No Negativo

X No Positivo

10 BHI - No Negativo


40

X Si -

CMM - No Negativo

X Si -

11

BHI - No Negativo

X Si -

CMM - No Negativo

X No Negativo

12

BHI - No Negativo

X Si -

CMM - No Negativo

X Si -

13

BHI - No Negativo

X Si -

CMM - No Negativo

X Si -

14

BHI - No Negativo

X No Negativo

CMM - No Negativo

X Si -

15

BHI - No Negativo

X Si -

CMM - No Negativo

X Si -

16

BHI - No Negativo

X No Negativo

CMM - No Negativo

X No Positivo

17

BHI - No Negativo

X Si -

CMM - No Negativo

X Si -

18 BHI - No Negativo

X Si -


41

CMM - No Negativo

X No Negativo

19

BHI - No Negativo

X No Negativo

CMM - No Negativo

X No Positivo

20

BHI - No Negativo

X Si -

CMM - No Negativo

X Si -

21

BHI - No Negativo

X Si -

CMM - No Negativo

X No Negativo

22

BHI - No Negativo

X No Negativo

CMM - No Negativo

X No Negativo

23

BHI - No Negativo

X Si -

CMM - No Negativo

X Si -

24

BHI - No Negativo

X No Negativo

CMM - No Negativo

X Si -

25

BHI - No Negativo

X Si -

CMM - No Negativo

Si Si -

26 BHI

- No Negativo

X Si -

CMM - No Negativo


42

X No Positivo

27

BHI - No Negativo

X Si -

CMM - No Negativo

X Si -

a) BHI = Brain heart infusion; CMM = Cooked meat medium

b) X= contaminazione con 5’000 spore/grammo; - = nessuna contaminazione

c) No= nessuna crescita su terreno selettivo; Si = crescita su terreno selettivo

d) Risultato analisi PCR positivo, negativo o non effettuato (-)

Tabella 13: Tabella dei 7 campioni di insalata e dei controlli positivi

Campione Metodoa) Contaminazioneb) Crescita su terreno selettivoc)

Risultato PCR dopo estrazione DNA da brodod)

1

BHI - No Negativo

X Si -

CMM - No Negativo

X Si -

2

BHI - No Negativo

X No -

CMM - No Negativo

X Si -

3

BHI - No Negativo

X No -

CMM - No Negativo

X No Positivo

4

BHI - No Negativo

X Si -

CMM - No Negativo

X Si -

5

BHI - No Negativo

X Si -

CMM - No Negativo

X Si -

6 BHI - No Negativo


43

X Si -

CMM - No Negativo

X Si -

7

BHI - No Negativo

X Si -

CMM - No Negativo

X Si -

a) BHI = Brain heart infusion; CMM = Cooked meat medium

b) X= contaminazione con 5’000 spore/grammo; - = nessuna contaminazione

c) No= nessuna crescita su terreno selettivo; Si = crescita su terreno selettivo

d) Risultato analisi PCR positivo, negativo o non effettuato (-)

Documents

Isolamento e caratterizzazione di ceppi di Clostridium ... · I clostridi sono l’unica famiglia di batteri sporigeni anaerobi associati con gli esseri umani sia come non patogeni,