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Virologia ambientale Corso ISS 017C del 29-10-2007 1

. CORSO 017C: Acque destinate al consumo umano:

l'applicazione del Decreto Legislativo 31/2001.

Roma Istituto Superiore sanità, Lunedì 29 ottobre 2007, 14.30-15.30

Michele Muscillo, Marcello Iaconelli, Mannocher Pousharban, Giuseppina La Rosa.

Isolamento e identificazione di enterovirus, adenovirus e norovirus nell’acqua ed altre matrici ambientali

Per eventuali comunicazioni contattare: ([email protected])Tel 0649902718Fax 0649902718

mailto:[email protected]


SommarioLe principali metodologie in questo campo si basano essenzialmente su:- concentrazione dell’acqua da 100-10 L a 200 µlin due step,-Identificazione dei virus con sistemi biologici o molecolari (PCR e sequenziamento genico).

Nuove prospettive-Uso della PCR quantitativa o Real Time-PCR-(Identificazione mediante microchip-microarray)


I punti essenziali della problematica

CONCENTRAZIONE DI GROSSI VOLUMI D’ACQUA- Ultrafiltrazione a flusso tangenziale- Cartucce a filtri elettropositivi o elettronegativi- Lana di vetro

IDENTIFICAZIONE DEI VIRUS– Biologica: inoculo su cellule, poi saggi LBM ed IFA– Molecolare: PCR, RealTime PCR, analisi sequenze– Integrata: inoculo su cellule, RealTime PCR (T0-T3)

VALUTAZIONE DELL’ESPOSIZIONE- molto empirica in quanto l’ applicazione di modelli matematici

è poco attendibile


Cosa sono i virus enterici• I virus enterici sono parassiti ultramicroscopici

endocellulari, dotati di affinità elettiva verso un determinato ospite. La barriera interspecifica può, talvolta, essere superata.

• Sono privi dell’organizzazione necessaria per la replicazione e quindi hanno la necessità di impadronirsi dell’apparato citoplasmatico o nucleare della cellula eucariotica specializzato nella sintesi di proteine o acidi nucleici

• Si replicano prevalentemente nell’intestino ma sono spesso neurotropici e cardiotropici. Hanno talvolta anche tropismo respiratorio.


PECULIARITA’ DEI VIRUS COME AGENTI DI RISCHIO BIOLOGICO AMBIENTALE

1.hanno una bassa carica infettante2.possono causare infezioni asintomatiche3.possono sviluppare nell’ospite un’immunità breve4.hanno un’elevata variabilità genetica5.sono eliminati in gran numero6.hanno molteplici vie di trasmissione7.hanno una elevata resistenza ambientale ed ai

trattamenti di disinfezione


La contaminazione virale dell’ambiente idrico da parte di virus patogeni per l’uomo rappresenta una problematica emergente nellavalutazione del rischio biologico.

COME CONTAMINANTIDELL’ACQUA

NorovirusssRNA

RotavirusdsRNA

AdenovirusdsDNA

HAVssRNA

HEVssRNA

EnterovirusssRNA

VIRUS ENTERICI TRASMESSI


Famiglia Picornaviridae:• Genere Enterovirus (64 sierotipi)

1. (PV) Poliovirus :3 tipi (1-3)2. (HEV-A) Human Enterovirus A: 11 coxsackievirus A (CA) ed

enterovirus 71,3. (HEV-B) Human Enterovirus B: 36 Coxsackievirus B, tutti gli

echovirus, enterovirus 69 e Coxsackievirus A94. (HEV-C) Human Enterovirus C: 11 Coxsackievirus A 5. (HEV-D) Human Enterovirus D: Enterovirus 68 e 70.

– Enterovirus sp non umani: 34 tipi

Fields, B. N., Knipe, D. M., Howley, P. M, Chanock, R. M., Melnick, J., Monath, T. P., Roizman, B., and Straus, S. E. Virology. Fields, B. N. 3[1], 1-1473. 1995. Philadephia, Lippincott-Raven.

Oprisan, G., M. Combiescu, S. Guillot, V. Caro, A. Combiescu, F. Delpeyroux, and R. Crainic. 2002. Natural genetic recombination between co-circulating heterotypic enteroviruses. Journal of General Virology 83:2193-2200.

Genere Hepatovirus:Genere Rinovirus:Genere Cardiovirus (encefalomiocardite)Genere Aftovirus (Virus malattia piedi e mani)


I VIRUS ENTERICI



ENVIRONMENTAL SAMPLES

CONCENTRATION a) 10 L water: Tangential ultrafiltrationb) 50 ml sewage: 10.000xg +200.000xg

+ PEG precultracent.

.

IDENTIFICATION

SEQUENCING

QUANTIFICATION

DATA ANALYSES ELETTROPHORESIS

REAL TIME RT-PCR QUALITATIVE RT-PCR

HUMAN FECES 1 ml of PBS suspension: 140µl, RNA extraction


Concentrazione di 10 L mediante cartucce verticali. L’uso del controllo positivo richiede, in ottemperanza alle norme di

sicurezza, una cappa Biohazard. Il controllo positivo è un virus ed è necessario per la valutazione dell’accuratezza e sensibilità del metodo.


Concentrazione a flusso tangenziale di 10L di acqua:(sono disponibili cartucce di lunghezza variabile)

wasteThe concentrate

pumpprefilter cartridge


Cartucce di ultrafiltrazione per piccoli volumi, max 40 ml


Concentrazione mediante ultrafiltrazione di 38 ml di

sospensione


Scarto dell’ultrafiltrato


Unità contenente l’ultrafiltrato


Recupero del concentrato


Recupero del concentrato mediante centrifugazione


Volume finale = 100-200 ul


Colonna di lana di vetro


Filtrazione su lana di vetro


Eluizione, flocculazione a pH acido, centrifugazione 7.000xg, formazione pellet proteine-virus


Filtrazione su membrana elettronegativa: preparazione della membrana elettronegativa


Assemblaggio di membrana e prefiltro nell’apparato filtrante



Le membrane vengono strette tra la base ed il coperchio dell’apparato filtrante


L’apparato per la filtrazione viene fissato con appositi bulloni


Il Il pelletpellet creato come visto prima, viene utilizzato per : creato come visto prima, viene utilizzato per : a) estrazione acidi nucleici per analisi a) estrazione acidi nucleici per analisi filogeneticafilogenetica

•• Amplificazione Amplificazione PCR del DNA PCR del DNA

•• Sequenziamento deiSequenziamento deiframmenti amplificatiframmenti amplificati

•• analisi analisi filogeneticafilogenetica

•• Trascrizione Trascrizione inversa RNA inversa RNA

RNA

cDNA

RNA®220 bp20115413475

170 bp

Mar

ker

DS

5’NC


b) Colture cellulari: inoculo del b) Colture cellulari: inoculo del pelletpellet, risospeso in , risospeso in PBS, su PBS, su monostratimonostrati cellulari e analisi delle placchecellulari e analisi delle placche


Placche di adenovirus su monostrati cellulari dopo 3 gg di incubazione a 37°C, fissaggio delle cellule

e colorazione per evidenziare le aree di lisi


Una collezione di 78 enterovirus umani, quando analizzata con sieri di Melnick, presentava un gran numero di casi non identificati(N.D.). Soltanto con l’analisi filogenetica è possibile identificare la

maggior parte dei non-poliovirus.•

SET A B C

N. of samples

27polio 34 non-polio

17N.D

Manzara, S., M. Muscillo, G. La Rosa, C. Marianelli, P. Cattani, and G. Fadda. Molecular identification and typing of enteroviruses isolated from clinical specimens. J.Clin.Microbiol. 40:4554-4560. 2002


Un particolare di un albero filogenetico che evidenzia altissime correlazioni genetiche tra enterovirus umani

ed alcuni ceppi di enterovirus porcini

Af363453Pev9xxAf3634549421-v4Pen295169Af363455Af085363Pol15utrdPol5utrk

Ev25m1262Ev25th222Ev3vp2gen

Porcine enterovirus 9, ITA92-915BE915Ita93/DV/941 (2003)Porcine enterovirus 10,

Coxsackievirus B2 strain Ohio-1

Human echovirus 3

Poliovirus type 3 2141/Switz/80

Porc ine enterovirus 9

Porcine enterovirus 9Porcine enterovirus type 9

Human echovirus 25


Dalla nostra esperienza sulle acque di mare:

• Molti virus sono difficili da identificare, soprattutto non-poliovirus ed in particolare gli echovirus ed i coxsackievirus A

• Molti enterovirus sono ricombinanti• Frequente è il rilevamento di reovirus,

spesso ricombinanti per i quali non è possibile risalire all’ospite

• Possibilità di isolare enterovirus porcini, spesso parzialmente simili agli umani


Analisi quantitativa dei virus: Real Time PCR e RT-PCR


Principio della reazione PCR Real Time: nella RealTime vi è, in aggiunta ai primer, un probe con un florocromo, generalmente il FAM, in 5’ ( R, reporter) ed una molecola all’estremità 3' che blocca la fluorescenza ( Q, quencher). La fluorescenza non viene emessa quando entrambe le molecole sono presenti sul probe.


Ad ogni ciclo di PCR, la polimerasi estende il probe utilizzando come stampo il filamento di DNA su cui è ibridato.


La polimerasi estende il primer e scorrendo lungo il DNA incontra il probe e lo degrada per effetto della sua attività 5’ esonucleasica.


Il fluorocromo emette fluorescenza in quanto non è più bloccato dalla vicinanza del quencher.


Piastra a 96 pozzetti per la preparazione delle miscele di reazione


Sistemazione della piastra nella camera dell’incubatore a programmazione ciclica.


Emissione di fluorescenza liberata dal fluorocromo


La fluorescenza aumenta di intensità con il procedere degli step di amplificazione


La fluorescenza viene misurata dall’apparato ottico dello strumento utilizzato per

l’esecuzione della Real Time


La curva di emissione della fluorescenza

viene registrata in un file


Condizione indispensabile per l’esecuzione della RealTime è la disponibilità di uno standard.

Per i virus ad RNA (enterovirus, norovirus) occorre una soluzione di RNA sintetico la cui concentrazione deve essere

spettrofotometricamente determinata. Per i virus a DNA (adenovirus) lo standard è più facile da preparare in quanto si ricava da un

plasmide ove il target è stato precedentemente clonato. La preparazione dello standard di RNA sintetico di un virus ad RNA è complesso e richiede altissima specializzazione: la regione target

del virus viene trascritta, poi amplificata e quindi clonata in un plasmide particolare. Successivamente l’RNA sintetico viene

prodotto da questo plasmide mediante trascrizione in vitro ottenuta tramite SP6 o T7 RNA polimerasi. La soluzione di RNA viene privata

del DNA contaminante, purificata e determinata spettrofotometricamente a 260 nm. Tramite il numero di Avogadro, viene calcolato il numero esatto di molecole contenute nella nostra

soluzione. Opportune diluizioni di questa soluzione vengono analizzate in doppio o in triplo parallelamente al campione.


Preparazione della scheda Realtime


Tipico elettroferogramma dello standard di poliovirus sintetico


Tipica curva di calibrazione con uno standard di RNA sintetico di poliovirus


Infectious unit/10 ul


Campioni ambientali : come si differenziano i campioni positividai negativi.


Curva di calibrazione effettuata usando RNA sintetico derivante da Norovirus GII


REFERENZE BIBLIOGRAFICHE• Muscillo, M., A. Carducci, G. La Rosa, L. Cantiani, and C. Marianelli.. Enteric virus

detection in adriatic seawater by cell culture, polymerase chain reaction and polyacrylamide gel electrophoresis. Wat.Res. 31:1980-1984. (1997)

• Manzara, S., M. Muscillo, G., La Rosa, C. Marianelli, P. Cattani, and G. Fadda. Molecular identification and typing of enteroviruses isolated from clinical specimens. J.Clin.Microbiol. 40:4554-4560 (2002).

• La Rosa,G., Muscillo,M., Di Grazia,A., Fontana,S., Iaconelli,M., and Tollis,M. Validation of RT-PCR Assays for Molecular Characterization of Porcine Teschoviruses and Enteroviruses. J.Vet.Med.Series B 53 (6), 257-265. (2006)

• La Rosa,G., Muscillo,M., Iaconelli,M., Di Grazia,A., Fontana,S., Sali,M., De Carolis,E.,Cattani,P., Manzara,S., and Fadda,G. Molecular characterization of human adenovirusesisolated in Italy. New Microbiol. 29 177-184. (2006)

• La Rosa,G., Fontana,S., Di Grazia,A., Iaconelli,M., Pourshaban,M., and Muscillo,M. Molecular Identification and Genetic Analysis of Norovirus Genogroups I and II in Water Environments: Comparative Analysis of Different Reverse Transcription-PCR Assays. Applied and Environmental Microbiology 73 (13), 4152-4161. (2007).

• La Rosa,G., Fontana,S., Di Grazia,A., Iaconelli,M., Pourshaban,M., and Muscillo,M. Quantification of genogroups I and II noroviruses in clinical and environmental samples via TaqMan Real-Time RT-PCR. In preparazione, (2008)


CONCLUSIONI

LA STANDARDIZZAZIONE DEI METODI DI CONCENTRAZIONE E IDENTIFICAZIONE DEI VIRUS SONO ESSENZIALI

• Ci si auspica una revisione delle normative per le acque potabili a livello comunitario come si sta facendo per le acque di balneazione nell’ambito del progetto europeo VIROBATHE, “Sixth Framework Programme- Specific Targeted Research Project. Methods For The Concentration And Detection Of Adenoviruses And Noroviruses In European Bathing Waters With Reference To The Revision Of The Bathing Water Directive 76/160/EEC” ove partecipano 16 gruppi Europei per un totale di 9 stati.

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