ISOLASI DAN IDENTIFIKASI PEPTIDA PENGHAMBAT ENZIM PENGUBAH ANTIGIOTENSIN DARI PROTEIN HIDROSAT PUTIH TELUR

A. PendahuluanEnzim pengubah Angiotensin (ACE=Angiotensin-converting enzyme) adalah golongan peptida yang memilika peran fisiologis penting dalam mengatur tekanan darah dalam sistem renin-angiotensin. Penghambat ACE telah terbukti berpotensi sebagai obat antihipertensi. Pembuatan penghambat ACE seperti captopril, Enalapril Lisinopril dan lain-lain digunakan dalam dunia medis. Namun obat-obat tersebut memiliki efek samping seperti batuk, mati rasa, gangguan ginjal dan Edemia Angioneurotik. Peptida yang berasal dari protein makanan dianggap lebih ringan, aman dan mudah diserap dibandingkan dengan ibat-obat sintesis. Oleh karena itu banyak penelitian yang difokuskan pada penelitianan tentang peptida ACE yang berasal dari protein makanan yang bersumber dari kacang kedelai, keju, susu, kentang, protein ganggang, anggur, biji-bijian amaran, protein tiram, makanan canola, kolagen babi atau putih telur. Selain itu, putih telur dengan kandungan proten yang ttinggi memiliki banyak peptida. Beberapa peptida pengambat ACE dari putih telur juga telah ditemukan.

Penelitian ini membahas peptida penghambat ACE baru dari putih telur. Tujuan penelitian ini yang pertama adalah menyiapkan protein hidrosat putih telur dengan teknik proteolisis enzimatik mengukur aktivitas penghambat ACE. Tujuan yang kedua yakni menggambarkan peptida dengan metode pemisahan yang dikombinasikan spektrometer masa penukar ion dengan tiga quadpole linier

B. Bahan dan MetodeReagen

Angiotensin-Converting Enzyme (ACE) dari paru-paru kelinci, hippuryl-L-histidyl-L-leucine, caporal, asam hipurat dan HPLC asetonitril, asam triflouroasetat (TFA) yang dibeli dari sygma. Enzim Alcalase dibeli dari Novozymes. Semua reagen merupakan analitic grade.

Instrumen

4000 Q-Spekrometes massa dengan antarmuka Turbolonspray. Cairan kromatorgrafi sistem 2010, A Shimadzu 2010 sistem HPLC dilengkapi dengan detektor PDA dan C18 kolom fase terbalik. 1200 sistem kuarter series. Rotary Evaporator, spray dryer dan cwntrifuge digunakan untuk reparasi sampel.

Reparasi protein hidrosat dari putih telur.

Protein purih telu yang terlarut dalam air suling untuk mendapatkan bubur proten 5% dihidrolisi dalam reaktor 250 mL dibawah suhu dan pH yang terkontrol. Campuran dipanaskan sampai 90 C selama 10 menit untuk denaturasi protein dan kemudian didinginkan sampai suhu 50 C. Nilai pH diatur 10,0 menggunakan 1 M hidrogen klorida dan kemudian ditambahkan proteinase alcalase apda proten 4%. Sampel diambil pada saat reaksi menit ke

30, 60, 120, 180 dan disimpan dalam penangas air yang mendidih selama 10 menit untuk menonaktifkan enzim dan disentrifugasi. Terakhir, supernatan disemprot kering.

Uji aktifitas ACE

Pengujian dilakukan dalam Buffer borat yang mengandung mM NaCl. Buffer yang sama digunakan untuk persiapan larutan kaptopril, substrat, asam hipurat, peptida dan enzim yang dicairkan. Total volume reaksi 60 mL mengandung 10 mM buffer borat, 4mM hippuryl-L-histidyl-L-leucine, 300 mM NaCl dan 10 milli unit ACE. Semua larutan diinkubasi pasa suhu 37 C selama 30 menit dalam penangas air termostatik sebelum pencampuran, dan 30 menit pada saat setelah pencampuran dengan suhu yang sama. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 60 mL HCL sebelum menyuntikkan sampel ke HPLC untuk mengukur asam hipurat yang dihasilkan oleh hidrolisis substrat hippuryl-L-histidyl-L-leucine. Fase gerak isokratik terdiri dari larutan 25% asetonitril dengan 0,5 % TFA. Lalu disaring melalui filter selulosa 0,45 pM dan digegass oleh USG selama 30 menit. Aliquot dari 10 pM campuran dianalisis pada Shimadzu C18. hippuryl-L-histidyl-L-leucine dan asam hipurat terdeteksi pada 228 nm ketika fase gerak yang terkontro 0,5 mL/menit.

Tingkat aktivitas penghambat dihitung sebgai berikut:

A merupakan area puncak pada reaksi kosong. Reaksi campuran kosong yang merupakan volume yang sama dari larutan penyangga yang bukan sampe. B adalah puncak reaksi di kedua ACE dan sampel peptida enzimatik dan niali IC 50 didefinisikan sebagai konsentrasi inhibitor menghambar 50% aktivitas ACE pada kondisi uji.

Pemurnian peptida penghambar ACE

Bubuk protein hidrolisat protein putih telur dimasukkan dan dikemas sengan seohadex G-25 gel yang telah diseimbangkan dengan air suling. Hidrolisat dielsi dengan air suling dengan kecepatan 60mL/jam. Puncak elusi dilihat pada 220 nm. Fraksi vakum yang beku dan kering dan fraksi aktif tertinggi dan disimpan pada suhu 20 C sampai digunakan.

Sintesis peptida

Peptida yang berasal dari ovotransferrin putih telur disintesis dengan prosedur peptida fase padat menggunakan FMOC dilindungi metode sintesis asam amino. Peptida disintesis dimurnikan dengan HPLC pada kolom ODS. Massa molekul peptida terisolasi ditentukan oleh spektrometri massa

C. PembahasanSampel hidrolisat diperoleh setelah enzim hidrolisis (pada 0, 30, 60, 120, 180 menit) diukur untuk kegiatan ACE-inhibitor. Nilai aktivitas Inhibitor ACEadalah 5%, 25%, 50%, 37%, 58% (Gambar. 1), masing-masing. Hidrolisat untuk 180 menit dimurnikan dengan Sephadex G 25 (Gambar. 2) dan fraksi yang ada. 8 memiliki aktivitas tinggi (IC50 0,18 mg / ml). Fraksi itu

dimurnikan lebih lanjut dengan SP Sephadex C 25 fraksi pertukaran ion, hanya satu puncak yang dihasilkan lyophilised dan nilai IC50 tidak meningkat secara signifikan. Fraksi dimurnikan dengan SP Sephadex C 25 pertukaran ion adalah lyophilised, dan kemudian diperiksa dengan analisis HPLC, dua puncak diperoleh. 8 bukanlah peptida tunggal, jika peptida tunggal diisolasi dan diidentifikasi; aktivitas tinggi enzim nilai peptida penghambat angiotensin-converting mungkin ditemukan. Telah dilaporkan bahwa kromatografi pertukaran kation dan RP-HPLC yang diterapkan untuk memurnikan peptida penghambat enzim angiotensin-converting, dan aktivitas Inhibitor ACEdari fraksi tidak ada. 8 di pekerjaan itu sebanding dengan oligopeptida dari telur yang dimasak, biji-bijian bayam atau susu domba. Fraksi tidak ada. 8 dimurnikan dengan Sephadex G 25 yang digunakan untuk studi lebih lanjut.

IDA adalah prosedur yang menggabungkan dua atau lebih yang berbeda mode pemindaian secara berurutan yang sama LC / MS run.. Telur protein putih terutama terdiri dari ovalbumin (54%), ovotransferrin (12%), ovomucoid (11%), yang diidentifikasi, dan urutan asam amino yang ditemukan dari telur database putih pada ExPasy. Beberapa peneliti telah menemukan bahwa FRADHPFL, RADHPF, FGRCVSP, NIFYCP, FFGRCVSP, LW, FCF, ERKIKVYL menunjukkan aktivitas ACE-inhibitor. Dalam tulisan ini, fraksi dianalisis dengan HPLC-MS / MS. Fraksi menjadi sasaran Turbo spektrometri massa semprot. 19 ion memindai spektrum massa diperoleh dengan full scan Model EMS, dan ion bermuatan dikonfirmasi bahwa ion mereka adalah tunggal biaya model ER. MS / MS spektrum ion bermuatan dengan m / z di 700.3526, 702.4043, 732.3730, 844.3937, 674.4109, 707.3261, 775.3794, 561.2756, 557.3484, 651.4007, 560.6570, 583.2781, 561.3712, 591.3379, 490.2032, 657.4669, 504.3732, 577.4041 dan 571.6089 diperoleh. Berikut analisis urutan asam amino dan pencarian database (Expasy), lima ion ini dibebankan diidentifikasi menjadi RVPSLM peptida, TPSPR, DLQGK, AGLAPY, RVPSL, masing-masing. Yang cocok 328-333,356-360,127-131, 86-91 dan 328-332 residu dari ovotransferrin dalam telur (residu 1-386) (ditunjukkan pada Gambar. 3). MS / MS spektrum untuk RVPSLM, TPSPR, DLQGK, AGLAPY, RVPSL ditunjukkan pada Tabel 1, yang berisi serangkaian lengkap fragmen b dan y Model ion, karena CID terutama memproduksi b dan ion y Model. MS / MS spektrum untuk peptida, tidak mengandung seri lengkap dari fragmen b dan y ion, yang sering terjadi karena dengan meningkatnya energi tabrakan, peptida bisa pecah di lokasi di mana ada tidak hubungannya asam amino dan membuat peptida sequencing sangat sulit. Kegiatan Inhibitor ACEpeptida disintesis

Peptida sintetik RVPSLM, TPSPR, DLQGK, AGLAPY, dan RVPSL diidentifikasi oleh analisis RP-HPLC dan Dionex MSQ spektrometri massa. Hasil HPLC menunjukkan bahwa kemurnian peptida RVPSLM, TPSPR, DLQGK, AGLAPY, RVPSL adalah 98,73%, 98,77%, 96,68%, 98,92%, 98,60%. Spektrum massa dari mereka peptida menunjukkan MW benar peptida sintetik. Dalam rangka untuk lebih memastikan aktivitas Inhibitor ACEpeptida ini, peptida diukur dengan metode 2,4 disebutkan. Peptida RVPSL memiliki aktivitas tinggi dan nilai IC50 adalah 20 pM. Angiotensin-converting enzyme aktivitas penghambatan dari RVPSL adalah sebanding dengan atau lebih tinggi dari peptida kecil (Guan et al., 2009,

Muguruma et al., 2009, Rho et al., 2009 dan Saiga et al., 2003). Namun, menemukan bahwa RVPSLM tidak angiotensin-converting enzyme aktivitas penghambatan dibandingkan dengan RVPSL, telah menyarankan bahwa asam amino terminal memainkan peran penting dalam ekspresi enzim aktivitas penghambatan angiotensin-converting. Telah dilaporkan bahwa peptida menunjukkan aktivitas Inhibitor ACEyang sangat tinggi seperti LVL dari plasma babi dan IL dari protein whey. Hasil ini menunjukkan bahwa Leu terletak pada C terminal di peptida ini memainkan peran penting dalam aktivitas.

D. KesimpulanDalam studi ini menunjukkan bahwa fraksi bobot molekul rendah yang bersumber dari

protein hidrolisat putih telur oleh Gel filtrasi menunjukkan aktivitas penghambat enzim angiotensin-converting in vitro. Di antara fraksi, teridentifikasi peptida RVPSL dengan aktivitas inhibitor ACE dan nilai-nilai IC50 yang berada 20 pM. Protein hidrolisat putih telur dalam penelitian ini disiapkan dengan cara mudah dimasukkan ke dalam makanan sehari-hari. Ini merupakan hal penting untuk mencegah dan menyembuhkan hipertensi. Sampai saat ini, ada banyak laporan bahwa peptida dengan aktivitas Inhibitor ACEyang diperoleh dari protein hidrolisat makanan. Kebanyakan penelitian harus memperhatikan penelitian hubungan antara struktur dan aktivitas peptida inhibitor ACE.