Embed Size (px)
Citation preview
ปญหาพิเศษ
การแยกสารสกัดจากเปลือกมังคุดเพ่ือใชในการยับย้ังเชื้อ
Propionibacterium acnes ISOLATION OF MANGOSTEEN FRUIT HULL FOR ANTIBACTERIAL
Propionibacterium acnes
โดย
นางสาวสมนึก อูอรุณ
เสนอ
สายวิชาวิทยาศาสตร คณะศิลปศาสตรและวิทยาศาสตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร
เพ่ือความสมบูรณแหงปรญิญาวิทยาศาสตรบัณฑิต (วิทยาศาสตรทั่วไป) พ.ศ. 2550
ใบรับรองปญหาพิเศษ สายวิชาวิทยาศาสตร คณะศิลปศาสตรและวิทยาศาสตร
มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร
วิทยาศาสตรบัณฑิต ปริญญา
วิทยาศาสตรท่ัวไป วิทยาศาสตร สาขา สายวิชา
เร่ือง การแยกสารสกัดจากเปลือกมังคุดเพื่อใชในการยับยั้งเช้ือ Propionibacterium acnes Isolation of Mangosteen Fruit Hull for Antibacterial Propionibacterium acnes
นามผูวิจัย นางสาวสมนึก อูอรุณ ไดพิจารณาเห็นชอบโดย ประธานกรรมการ
( อาจารยวันเพ็ญ เหลาศรีไพบูลย ) กรรมการ
( อาจารยนวลจันทร มัจฉริยกุล )
สายวิชาวิทยาศาสตร คณะศิลปศาสตรและวิทยาศาสตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตรรับรองแลว
( อาจารยพุทธพร สองศรี ) หัวหนาสายวิชาวิทยาศาสตร
วันท่ี 1 เดือน พฤษภาคม พ.ศ. 2550
ปญหาพิเศษ
เร่ือง
การแยกสารสกัดจากเปลือกมังคุดเพื่อใชในการยับยั้งเช้ือ Propionibacterium acnes Isolation of Mangosteen Fruit Hull for Antibacterial Propionibacterium acnes
โดย
นางสาวสมนกึ อูอรุณ
เสนอ
สายวิชาวิทยาศาสตร คณะศิลปศาสตรและวิทยาศาสตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร
เพื่อความสมบูรณแหงปริญญาวิทยาศาสตรบัณฑิต (วิทยาศาสตรท่ัวไป) พ.ศ. 2550
สมนึก อูอรุณ 2549: การแยกสารสกัดจากเปลือกมังคุดเพื่อใชในการยบัยั้งเช้ือ Propionibacterium acnes
ปริญญาวิทยาศาสตรบัณฑิต (วิทยาศาสตรท่ัวไป) สายวิชาวิทยาศาสตร ประธานกรรมการท่ีปรึกษา: อาจารยวนัเพญ็ เหลาศรีไพบูลย, Ph.D. 41 หนา มังคุด (Garcinia mangostana L.) เปนพืชสมุนไพรท่ีนํามาใชรักษาโรคติดเช้ือทางผิวหนัง บาดแผลและทองรวงมานานแลว งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงคเพื่อศึกษาการแยกสารสกัดจากเปลือก มังคุดในการนํามาใชยับยั้งเช้ือ Propionibacterium acnes ซ่ึงเปนเชื้อแบคทีเรียท่ีเจริญอยูตามผิวหนังและรูขุมขน ทําใหเกิดสิวอักเสบ จากการสกัดสาร พบวา เปอรเซ็นตสารสกัดหยาบของเปลือกมังคุดจากจันทบุรีและภาคใต ท่ีสกัดแบบแหง ดวย 95% เอทานอล มีคาเทากับ 3.67% และ 4.33% ตามลําดับ สวน เปอรเซ็นตสารสกัดหยาบของเปลือกมังคุดจากจันทบุรีและภาคใต ท่ีสกัดแบบสด ดวย 95% เอทานอล มีคาเทากับ 20.81% และ 5.17% ตามลําดับ การวิเคราะหสารสกัดหยาบโดยวิธี TLC พบวา คลอโรฟอรม : เบนซีน (7:3) เปนตัวทําละลายท่ีมีความเหมาะสมในการแยกสารสกัดหยาบจากเปลือกมังคุดจากจันทบุรีและภาคใต ท่ีสกัดแบบสด สวนไดคลอโรมีเทน : เมทานอล (98:2) เปนตัวทําละลายท่ีมีความเหมาะสมในการแยกสารสกัดหยาบจากเปลือกมังคุดจากจันทบุรีและภาคใต ท่ีสกัดแบบแหง การแยกกลุมสารของสารสกัดหยาบแบบสดจากเปลือกมังคุดจากภาคใต โดยวิธีคอลัมนโครมาโทกราฟ โดยใชตัวทําละลายคลอโรฟอรม : เบนซีน (7:3) เปนตัวชะ ไดสารสกัดทั้งหมด 9 fractions ซึ่งเมื่อนําสารสกัดไปทดสอบการยับยั้งการเจริญเติบโตของเช้ือแบคทีเรีย โดยวิธี agar diffusion พบวาสารสกัดดังกลาวสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเช้ือแบคทีเรีย Propionibacterium acnes ได นอกจากนี้ผลการวิเคราะหสารสกัด fraction ท่ี 2 และ 7 เปรียบเทียบกับสารมาตรฐาน 9-xanthone โดยวิธี HPLC พบวา สารสกัดดังกลาวไมใชสาร 9-xanthone แตอาจเปนสารท่ีเปน อนุพันธุของแซนโทนชนิดอ่ืน ๆ / / ลายมือช่ือนิสิต ลายมือช่ือประธานกรรมการ
Somnuek U-arun 2006: Isolation of Mangosteen Fruit Hull for Antibacterial Propionibacterium acnes.
Bachelor of Science. (General Science) Department of Science. Special Problems Advisor: Ms. Wanpen laosripaiboon, Ph.D. 41 p. Mangosteen (Garcinia mangostana L.) is a medicinal plant that has been used for many years as traditional medicine for the treatment of skin infection, wound and diarrhea. The aim in this study is the isolation of mangosteen fruit hull for antibacterial Propionibacterium acnes which is anaerobic bacteria. These bacteria are found around skins and hair follicles to induce inflammatory acne. % crude extract of dried mangosteen fruit hull from Chantaburi province and southern part of Thailand with 95% ethanol were 3.67% and 4.33%, respectively. While % crude extract of fresh mangosteen fruit hull from Chantaburi province and southern part of Thailand were 20.81% and 5.17%, respectively. Analysis by TLC shown that chloroform : benzene (7:3) was a suitable solvent for separation of fresh crude extract. On the other hand dichloromethane : methanol (98:2) was a proper solvent for separation of dried crude extract. Isolation of fresh crude extract from southern part of Thailand by column chromatography using chloroform : benzene (7:3) as eluting solvent shown 9 combined fractions which further antibacterial Propionibacterium acnes testing by agar diffusion method. It was found that these fractions inhibited the growth of Propionibacterium acnes. In addition, fraction 2 and 7 were monitored by HPLC comparison with 9-xanthone. From HPLC chromatogram indicated that they were not 9-xanthone but they may be xanthones derivative. / / Student’s signature Advisor’s signature
กิตติกรรมประกาศ ขาพเจาขอขอบพระคุณอาจารยวันเพ็ญ เหลาศรีไพบูลย ประธานกรรมการท่ีปรึกษาปญหาพิเศษ และอาจารยนวลจันทร มัจฉริยกุล กรรมการท่ีปรึกษาปญหาพิเศษ ท่ีไดกรุณาใหคําปรึกษาแนะนําการทํางานวิจัย และตรวจแกไขรายงานปญหาพิเศษฉบับนี้ใหสําเร็จลุลวงไปดวยดี ขอขอบพระค ุณอาจารย ม าล ี ศร ีสดส ุข ที ่ให ความอน ุเ คราะห เ ชื ้อแบคท ีเ ร ีย Propionibacterium acnes และอาหารเล้ียงเช้ือ รวมท้ังการใหคําปรึกษาแนะนําการทํางานวิจัยในคร้ังนี้ ขอขอบคุณเจาหนาท่ีสาขาวิชาเคมีและจุลชีววิทยาทุกทาน ท่ีกรุณาใหความรูและชวยเหลือในการใชเคร่ืองมือและอุปกรณตาง ๆ ทายสุด ขอขอบพระคุณบิดา มารดา และพ่ี ท่ีใหกําลังใจและการสนับสนุนเปนอยางดี จนกระท่ังสําเร็จการศึกษา สมนึก อูอรุณ
พฤษภาคม 2550
(1)
สารบัญ
หนา
สารบัญ (1) สารบัญภาพ (2) คํานํา 1 การตรวจเอกสาร 3 อุปกรณและวธีิการ 12 อุปกรณ 12 วิธีการ 15 สถานท่ีและระยะเวลาในการทดลอง 19 ผลและวิจารณ 20
การสกัดสารจากเปลือกมังคุด 20 การวิเคราะหสารสกัดโดยวิธีโครมาโทกราฟแบบแผนเคลือบ (ThinLayer Chromatography, TLC) 21 การแยกกลุมสารสกัดโดยวิธีคอลัมนโครมาโทกราฟ (Column Chromatography) 26 การแยกกลุมสารสกัดโดยวิธีพรี-คอลัมนโครมาโทกราฟ (Pre-Column Chromatography) 28 การทดสอบการยับยั้งการเจริญเติบโตของเช้ือ Propionibacterium acnes 31 การวิเคราะหสารสกัดท่ีแยกไดโดยวิธีโครมาโทกราฟของเหลวแบบสมรรถนะสูง (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) 33 สรุป 36 ขอเสนอแนะ 37 เอกสารและส่ิงอางอิง 38
(2)
สารบัญภาพ
ภาพท่ี หนา 1 Propionibacterium acnes 1 2 มังคุด 3 3 การเจริญของผลมังคุดจากการแตกหนอของดอกเพศเมีย 4 4 โครงสรางของแซนโทน 5 5 อนุพันธุของแซนโทน 6 6 อนุพันธุของแซนโทน 7 7 TLC โครมาโทแกรมของสารสกัดหยาบแบบแหงจากเปลือกมังคุดจากจันทบุรี 22 8 TLC โครมาโทแกรมของสารสกัดหยาบแบบแหงจากเปลือกมังคุดจากภาคใต 24 9 TLC โครมาโทแกรมของสารสกัดหยาบแบบสดจากเปลือกมังคุดจากจนัทบุรี 25 10 TLC โครมาโทแกรมของสารสกัดหยาบแบบสดจากเปลือกมังคุดจากภาคใต 25
11 TLC โครมาโทแกรมของสารสกัดแบบแหงจากเปลือกมังคุดจากภาคใต ท่ีแยกไดจากคอลัมนโครมาโทกราฟ 27
12 TLC โครมาโทแกรมของสารสกัดแบบสดจากเปลือกมังคุดจากภาคใต
ท่ีแยกไดจากคอลัมนโครมาโทกราฟ 27
(3)
สารบัญภาพ (ตอ)
ภาพท่ี หนา 13 TLC โครมาโทแกรมของสารสกัดหยาบแบบแหงจากเปลือกมังคุดจากภาคใต
ท่ีแยกไดจากพรี-คอลัมนโครมาโทกราฟ คร้ังท่ี 1 28 14 TLC โครมาโทแกรมของสารสกัดหยาบแบบแหงจากเปลือกมังคุดจากภาคใต
ท่ีแยกไดจากพรี-คอลัมนโครมาโทกราฟ คร้ังท่ี 2 30 15 TLC โครมาโทแกรมของสารสกัดหยาบแบบแหงจากเปลือกมังคุดจากภาคใต
ท่ีแยกไดจากพรี-คอลัมนโครมาโทกราฟ คร้ังท่ี 3 30 16 ผลการทดสอบการยับยั้งการเจริญเติบโตของเช้ือ Propionibacterium acnes 32 17 HPLC โครมาโทแกรมของสารมาตรฐาน 9-xanthone 34
18 HPLC โครมาโทแกรมของสารสกัด fraction ท่ี 2 34
19 HPLC โครมาโทแกรมของสารสกัด fraction ท่ี 7 35 20 TLC โครมาโทแกรมของสารสกัดท้ัง 9 fractions เปรียบเทียบกบัสารมาตรฐาน 9-xanthone 35
1
การแยกสารสกัดจากเปลือกมังคุดเพ่ือใชในการยับย้ังเชื้อ Propionibacterium acnes
Isolation of Mangosteen Fruit Hull for Antibacterial Propionibacterium acnes
คํานํา
Propionibacterium acnes เปนแบคทีเรียติดสีแกรมบวก มีรูปรางเปนทอนหรือเปนกิ่ง เซลลอยูเดี่ยวๆ เปนคู หรือ เปนกลุม ดังภาพท่ี 1 ไมสรางสปอร เจริญเติบโตในสภาวะท่ีไมมีอากาศ พบมากตามผิวหนังและรูขุมขน ซ่ึงเปนสาเหตุสําคัญท่ีทําใหเกิดสิวอักเสบ การรักษาสวนใหญจะใชยาปฏิชีวนะ แตยาเหลานี้ก็มีโทษ เพราะอาจทําใหเกิดอาการแทรกซอน ซ่ึงเปนปญหาท่ีพบมากในปจจุบัน จึงมีผูสนใจศึกษาสารสกัดจากพืชสมุนไพรมากข้ึน เพื่อนํามาใชทดแทน จากรายงานการศึกษา มีพืชสมุนไพรหลายชนิดท่ีใหผลในการยับยั้งเช้ือแบคทีเรียนี้ เชน มังคุด ขลู กวาวเครือและแพทชูลี เปนตน
ภาพท่ี 1 Propionibacterium acnes ท่ีมา: Daniel et al. (2006) มังคุด (mangosteen) มีช่ือวิทยาศาสตรวา Garcinia mangostana L. อยูในวงศ Clusiaceae เปนพืชสมุนไพรชนิดหนึ่งท่ีนิยมนํามาศึกษาหาสารออกฤทธ์ิทางชีวภาพ จากการศึกษาท่ีผานมาพบวา เปลือกมังคุดมีสารแทนนิน (tannin) และแซนโทน (xanthone) สารแทนนินมีฤทธ์ิสมานแผล สวนสารแซนโทน มีฤทธ์ิลดอาการอักเสบ ตานเชื้อแบคทีเรียและเช้ือราที่เปนสาเหตุของโรคผิวหนังหลายชนิด นอกจากน้ันยังพบวา สารสกัดจากมังคุดสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเช้ือ Propionibacterium acnes ไดดี (Chomnawang et al., 2005)
2
ดังนั้นงานวิจัยนี้จึงสนใจในการศึกษาการแยกสารสกัดจากเปลือกมังคุด เพื่อหากลุมสารท่ีออกฤทธ์ิในการยับยั้งเช้ือแบคทีเรีย Propionibacterium acnes
วัตถุประสงค
1. เพื่อศึกษาการแยกสารสกดัจากเปลือกมังคุดเพื่อใชในการยับยั้งเช้ือ Propionibacterium acnes 2. เพื่อศึกษาผลของกลุมสารท่ีแยกไดตอการยับยั้งเช้ือ Propionibacterium acnes 3. เพื่อศึกษาองคประกอบของกลุมสารท่ีแยกไดท่ีมีผลตอการยับยั้งเช้ือ Propionibacterium acnes
3
การตรวจเอกสาร มังคุดมีช่ือวิทยาศาสตรวา Garcinia mangostana เปนตนไมเขตรอน เขียวชุมตลอดป เช่ือกันวามีแหลงกําเนิดมาจาก Sunda Islands และ Moluccas มีความสูงต้ังแต 7-25 เมตร ใชเวลากวา 100 วัน ผลจะเจริญเต็มท่ี มีลักษณะดังภาพท่ี 2 เปลือกผลมีสีมวงแดงหรือมวงน้ําตาล ผิวผลเรียบ เสนผานศูนยกลางประมาณ 4-6 เซนติเมตร ในหนึ่งผลมี 5-8 กลีบ จํานวนกลีบของเน้ือจะเทากับจํานวนกลีบดอกท่ีอยูดานลางของเปลือก มีรกสีขาวหุม สีขาวน้ีคือสวนเนื้อ เนื้อมีกล่ินหอม รสหวาน ในเอเชียมังคุดเปนผลไมท่ีไดรับการขนานนามวา “ราชินีแหงผลไม” พบมากในประเทศไทย อินเดีย ศรีลังกาและพมา มังคุดจัดอยูในวงศ Clusiaceae อนุกรมวิธานของมังคุด มีดังนี้ Kingdom: Plantae Division: Magnoliophyta Class: Magnoliopsida Order: Malpighiales Family: Clusiaceae
Genus: Garcinia Species: G. mangostana
ภาพท่ี 2 มังคดุ ท่ีมา: Anonymous (2006a)
4
มังคุดท่ีปลูกในประเทศไทยมีพันธุเดียว เพราะเมล็ดเกิดจากเนื้อเยื่อของดอกเพศเมีย ไมไดเกิดจากการผสมเกสร ดังภาพท่ี 3 A คือ ดอกเพศเมียแตกหนอจากกิ่งของตน B คือ ดอกเพศเมียเปดออก C คือ ผลออน ดังนั้นจึงเช่ือกันวามังคุดมีพันธุเดียวและเรียกกันวา พันธุพื้นเมือง แหลงท่ีพบมากในประเทศไทยไดแก นนทบุรี จันทบุรีและภาคใต พบวามังคุดจากนนทบุรีและจากจนัทบุรีมีผลเล็กและเปลือกบาง มังคุดจากภาคใตมีผลใหญและเปลือกหนากวา แตยังไมมีการศึกษาเปรียบเทียบใหเห็นชัดเจนพอท่ีจะสามารถแยกเปนพันธุได (วันดี, 2537)
A
C B
A
B C
ภาพท่ี 3 การเจริญของผลมังคุดจากการแตกหนอของดอกเพศเมีย ท่ีมา: Anonymous (2006b) แซนโทน เปนสารประกอบอินทรีย พบในพืชวงศ Clusiaceae (Guttiferae), Gentianaceae, Moraceae และ Polygalaceae มีลักษณะเปนผลึกของแข็งสีเหลือง มีโครงสรางเปนวง (phenolic) ดังภาพท่ี 4 เร่ิมแรกในป ค.ศ. 1939 นํามาใชเปนยาฆาแมลง ปจจุบันใชเปนยาฆาไขและตัวออนของแมลง ขอมูลท่ัวไป มีดังนี้
5
ช่ือ IUPAC : xanthen-9-one ช่ืออ่ืน : 9-xanthone, xanthone, Genicide สูตรโมเลกุล : C13H8O2 นําหนกัโมเลกลุ : 196.201 g/mol
O
O
1 ภาพท่ี 4 โครงสรางของแซนโทน ท่ีมา: Answers Corporation (1999) อนุพันธุของแซนโทน ท่ีพบในพืชวงศ Clusiaceae มีหลายชนิด เชน mangostin (2) ซ่ึงพบในเปลือกมังคุด (pericarp) เปลือกหุมเมล็ดมังคุด (aril) เปลือกตนมังคุด (stem bark) เปนตน มีลักษณะเปนผลึกของแข็งสีเหลือง มีคุณสมบัติตานแบคทีเรีย การอักเสบและการเกิดมะเร็ง (Answers Corporation, 1999) นอกจาก mangostin (2) แลว ยังพบอนุพันธุของแซนโทนชนิดอ่ืน อีกหลายชนิด ดังภาพท่ี 5 และ 6
6
1-isomangostin : R = 1-isomangostin hydrate : R =
3-isomangostin : R = 3-isomangostin hydrate : R =
O
OH
R1
CH3
CH3
R2
R3
CH3CH3
O
O
R
CH3CH3
O
OH
CH3
CH3
O
O OH
O
OCH3
OH
CH3 CH3
R O
O
O
CH3
OH
R
O
OH
CH3
CH3
O
O
OHO
OCH3
CH3
OH
CH3CH3
OCH3
CH3
O
OH
OH
O
O
CH3
CH3
OCH3
CH3
CH3 CH3 mangostenone A tovophyllin B
ภาพท่ี 5 อนุพันธุของแซนโทน ท่ีมา: Mahabusarakam et al. (1987) และ Suksamrarn et al. (2003)
mangostin หรือ α-mangostin : R1 = R2 = OH, R3 = OCH3 2 β-mangostin : R1 = R3 = OCH3, R2 = OH 3 γ-mangostin : R1 = R2 = R3 = OH 4 2,8-bis-(γ,γ-dimethylallyl)- 1,3,7-trihydroxyxanthone : R1 = R3 = OH, R2 = H 5
calabaxanthone : R = OCH3 6 demethylcalabaxanthone : R = OH 7
CH3CH3
CH3C3OH
H
CH3CH3
CH3CH3
OH
9
8
10
11
13 12
7
O
OHO
OH
OH
O
OHO
O
OH
CH3
CH3
CH3
mangostinone 2-(γ,γ-dimethylallyl)-1,7-dihydroxy-3-methoxyxanthone
หรือ 1,7-dihydroxy-2-(methylbut-2-enyl)-3-methoxyxanthone
O
OH
OH
O
O
CH3
CH3CH3
CH3
OH
CH3
O
OH
OHOH
O
CH3CH3
CH3
CH3
CH2
OHO
mangostanin mangostenol
O
OH
OH
CH3
CH3OH
OH
CH3 CH3
O
O
OHO
OCH3
CH3
OH
CH3 CH3 gartanin trapezifolixanthone
O
OH
OH
CH3
CH3
OH
O
O
CH3
CH3
O
OH
OH
CH3
CH3
OH
O
CH3
CH3
O
CH3
OH
garcinone B garcinone D
ภาพท่ี 6 อนุพันธุของแซนโทน ท่ีมา: Mahabusarakam et al. (1987) และ Suksamrarn et al. (2003)
14
15
16 17
18 19
20 21
8
Mahabusarakam et al. (1987) ไดศึกษาองคประกอบของเปลือกในของมังคุด (pericarp) และเปลือกหุมเมล็ดมังคุด (aril) โดยสกัดดวยเบนซีน (benzene) จากการศึกษาพบอนุพันธุของแซนโทน 8 ชนิด ท่ีไดจากการสกัดเปลือกในของมังคุด ไดแก mangostin (2), β-mangostin (3), γ-mangostin (4) และ gartanin (18) ซ่ึงเปนสารท่ีเคยพบมากอน โดย P. Yates และ H.G. Stout เม่ือป ค.ศ. 1958, P. Yates และ H.B. Bhat เม่ือป ค.ศ. 1958, A. Jefferson และคณะ เม่ือป ค.ศ. 1970 และ T.R. Govindacbari และคณะ เม่ือป ค.ศ. 1958 ตามลําดับ และจากการศึกษาตอมาพบสารอ่ืน ๆ อีก ไดแก 1-isomangostin (8), 1-isomangostin hydrate (9), 3-isomangostin (10) และ 3-isomangostin hydrate (11) และพบอนุพันธุของแซนโทน 5 ชนิด ท่ีไดจากการสกัดเปลือกหุมเมล็ดมังคุด คือ mangostin (2), calabaxanthone (6), demethylcalabaxanthone (7), 2,8-bis-(γ,γ-dimethylallyl)-1,3,7-trihydroxyxanthone (5) และ 2-(γ,γ-dimethylallyl)-1,7-dihydroxy-3-methoxyxanthone (15) นอกจากนี้ Suksamrarn et al. (2003) ไดศึกษาการแยกสารสกัดจากเปลือกมังคุด (green fruit
hull) เปลือกหุมเมล็ดและเมล็ดมังคุดสด (fresh aril and seed) โดยสกัดดวยเมทานอล (methanol) จากการศึกษาพบวาสารท่ีแยกไดจากการสกัดเปลือกมังคุดไดแก γ-mangostin (4), garcinone D (21), mangostanin (16) และ 1,7-dihydroxy-2-(methylbut-2-enyl)-3-methoxyxanthone (15) นอกจากนี้ยังพบสาร α-mangostin (2), β-mangostin (3), mangostenol (17), mangostinone (14), mangostenone A (12), garcinone B (20), tovophyllin B (13) และ trapezifolixanthone (19) ซ่ึงเปนสารท่ีเคยพบมากอน โดย Sunit Suksamrarn และคณะ เม่ือป ค.ศ. 2002 และสารท่ีไดจากการสกัดเปลือกหุมเมล็ดและเมล็ดมังคุดสด ไดแก demethylcalabaxanthone (7) และ α-mangostin (2) และจากการนําสารท่ีสกัดและแยกไดท้ังหมดมาทดสอบการยับยั้งการเจริญเติบโตของเช้ือ Mycobacterium tuberculosis พบวา α-mangostin (2), β-mangostin (3) และ garcinone B (20) สามารถยับยั้งเช้ือไดดีท่ีสุด โดยมีคาความเขมขนตํ่าสุดท่ีสามารถยับยั้งได (minimum inhibitory concentrations, MIC) เทากัน คือ 6.25 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร และสารท่ีสามารถยับยั้งเ ช้ือไดนอยท่ีสุด คือ 1,7-dihydroxy-2-(methylbut-2-enyl)-3-methoxyxanthone (15) โดยมีคา MIC มากกวา 200 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร นอกจากอนุพันธุของแซนโทน สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเช้ือ Mycobacterium tuberculosis แลว ยังสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อแบคทีเรียชนิดอ่ืนๆ อีก จากการศึกษาของ Sakagami et al. (2005) พบวา α-mangostin (2) และ β-mangostin (3) ซ่ึงสกัดจากเปลือกตนมังคุด (stem bark) สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเช้ือแบคทีเรีย Enterococci ท่ีดื้อตอยาปฏิชีวนะ vancomycin (vancomycin resistant Enterococci, VRE) และเช้ือแบคทีเรีย Staphylococcus aureus ท่ี
9
ดื้อตอยาปฏิชีวนะ methicillin (methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA) ไดดี ซ่ึงเช้ือ Enterococci เปนสาเหตุสําคัญท่ีทําใหเกิดโรคติดเช้ือในระบบปสสาวะ โรคเยื่อบุหัวใจอักเสบ โรคเยื่อหุมสมองอักเสบ เปนตน สวนเช้ือ Staphylococcus aureus เปนสาเหตุสําคัญท่ีทําใหเกิดโรคติดเชื้อทางผิวหนัง เชน สิว ฝ เปนตน และจากการศึกษายังพบวา α-mangostin (2) สามารถยับยั้งการเจริญของเช้ือแบคทีเรีย VRE และ MRSA ไดดีกวา β-mangostin (3) ซ่ึงมีคา MIC เทากับ 6.25 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร และ 6.25 ถึง 12.5 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ตามลําดับ นอกจากนี้การใช α-mangostin (2) รวมกับยาปฏิชีวนะ gentamycin (GM) ในการยับยั้งเช้ือ VRE และเม่ือใชรวมกับยาปฏิชีวนะ vancomycin hydrochloride (VCM) ในการยับยั้งเช้ือ MRSA จะใหผลการยับยั้งท่ีดีมากข้ึน
Chomnawang et al. (2005) พบวาสารสกัดจากมังคุด สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย Propionibacterium acnes และ Staphylococcus epidermidis ไดดีท่ีสุด ในจํานวนสารสกัดจากพืชท้ังหมด 19 ชนิด ซ่ึงแบคทีเรียท้ัง 2 ชนิดนี้ เปนแบคทีเรียท่ีทําใหเกิดสิวอักเสบ โดยมีคา MIC เทากับ 0.039 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร และ มีคาความเขมขนต่ําสุดท่ีสามารถฆาแบคทีเรียได (minimum bactericidal concentrations, MBC) เทากับ 0.039 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร และ 0.156 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร ตามลําดับ นอกจากนี้ยังพบวาสารท่ีเปนตัวออกฤทธ์ิเปน mangostin (2) ซ่ึงเปนอนุพันธุของแซนโทน ชนิดหนึ่ง
สุวิมล และคณะ (2548) พบวา สารสกัดจากมังคุดสามารถออกฤทธ์ิตานการอักเสบของสิว ท่ีมีสาเหตุมาจากเชื้อ Propionibacterium acnes ไดดีท่ีสุด จากพืชสมุนไพรท้ัง 19 ชนิด โดยพิจารณาจากฤทธ์ิการตานอนุมูลอิสระและผลการลดระดับของไซโตคายน (cytokine) ซ่ึงเปนสารท่ีทําลายเซลลคุมกันของหนังกําพรา โดยมีคาความเขมขนท่ีสามารถยับยั้งได 50 % (Inhibitory concentration at 50%, IC50) เทากับ 6.17 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร สวนพลูคาว สาบเสือและชุมเห็ดเทศ ใหผลปานกลาง คือ มีคา IC50 เทากับ 32.52, 67.55 และ 112.46 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ตามลําดับ และจากการทดลองโดยวิธี nitro blue tetrazolium (NBT) reduction พบวา มังคุดสามารถลดระดับ reactive oxygen species (ROS) ไดถึง 77.80±1.28% แสดงวามังคุดสามารถกําจัดอนุมูลอิสระไดดี นอกจากนี้ยังสามารถยับยั้งการสราง tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) ไดถึง 94.59% แสดงวามังคุดสามารถลดปริมาณสารส่ืออักเสบไดดีเชนกัน Nakatani et al. (2001) พบวา γ-mangostin ซ่ึงเปนอนุพันธุของแซนโทนชนิดหนึ่ง สามารถลดปริมาณ prostaglandin E2 (PGE2) ซ่ึงเปนสารส่ืออักเสบไดดี กลไกในการยับยั้งการสราง PGE2 คือ
10
γ-mangostin จะไปยับยั้งการทํางานของเอนไซม cyclooxygenase (COX) ทําให arachidonic acid (AA) ซ่ึงเปนสารท่ีพบในเซลลเนื้องอกของหนู C6 (C6 rat glioma) ไมสามารถเปล่ียนเปน PGE2 ได นอกจากนี้การศึกษาในหลอดทดลอง พบวา γ-mangostin สามารถยับยั้งได ท้ัง constitutive cyclooxygenase (COX-1) และ inducible cyclooxygenase (COX-2) โดยมีคา IC50 เทากับ 0.8 และ 2 ไมโครโมล ตามลําดับ จากการศึกษาตอมา พบวา สารสกัดจากเปลือกมังคุด (fruit hull) ดวยเอทานอล (ethanol) 40% สามารถยับยั้งการหล่ังสารท่ีทําใหเกิดอาการแพ (histamine) และสารสกัดจากเปลือกมังคุด ดวยเอทานอล 100%, 70% และ 40% สามารถยับยั้งการสราง PGE2 ในเซลลเนื้องอกของหนู C6 ได แตสารสกัดดวยน้ําไมออกฤทธ์ิในการยับยั้ง นอกจากนี้สารสกัดท้ัง 4 ยังมีฤทธ์ิยับยั้งการแพทางผิวหนังของหนู (passive cutaneous anaphylaxis, PCA) (Nakatani et al., 2002) พิยดา (2548) ไดศึกษาพืชสมุนไพรท้ัง 68 ชนิด เพื่อใชในการยับยั้งเ ช้ือแบคทีเรีย Propionibacterium acnes โดยสกัดดวยน้ําและเอทานอล 95% แลวนํามาทดสอบกับเช้ือโดยวิธี paper disc agar diffusion บนอาหารเล้ียงเช้ือ brain heart infusion ในสภาวะท่ีไมมีออกซิเจน ท่ีอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 5 วัน พบวา พืชสมุนไพรท่ีสามารถยับยั้งเช้ือไดดี คือ ใบขลูสด เปลือกหัวกวาวเครือสด เมล็ดสะเดาสดและแหง และใบชะนางแหง โดยการสกัดดวยเอทานอล 95% มีเสนผานศูนยกลางของโซนใส (inhibition zone) เทากับ 2.2, 2.07, 1.77, 1.70, 1.77 และ 1.67 เซนติเมตร ตามลําดับ นอกจากนี้ยังพบวาพืชสมุนไพรสดสามารถยับยั้งเช้ือไดดีกวาพืชสมุนไพรแหงและการสกัดดวยเอทานอล 95% สามารถยับยั้งเช้ือไดดีกวาการสกัดดวยน้ํา จีรเดช และคณะ (2547) ไดทดสอบความไวของเช้ือ Propionibacterium acnes ท่ีแยกมาจากผูปวยโรคสิวตอน้ํามันหอมระเหยท่ีสกัดจากพืชสมุนไพรไทย 3 ชนิด ไดแก ใบกระเพรา ผลมะกรูดและตนชา ดวยวิธี broth macrodilution โดยทดสอบเปรียบเทียบกับยาปฏิชีวนะมาตรฐาน erythromycin stearate เตรียมตัวอยางน้ํามันหอมระเหยโดยเจือจางดวย dimethylsulfonide (DMSO) และใช Tween 80 (0.5%) เปนสารลดแรงตึงผิวเพื่อชวยในการแตกตัวของน้ํามันหอมระเหยในอาหารเล้ียงเช้ือ brain heart infusion medium (BHI) และใช 2,3,5-triphynyl-tetrazolium chloride (TTC) เปน growth indicator เพื่อหาคา MBC ทําการเพาะเช้ือใน anaerobic chamber โดยบมท่ีอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 36-48 ช่ัวโมง จากการศึกษาพบวา น้ํามันหอมระเหยจากกระเพราสามารถยับยั้งไดดีท่ีสุด โดยมีคา MBC เทากับ 1,589.25 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร
11
พงษศิริ และคณะ (2549) ไดศึกษาประสิทธิภาพของสารสกัดหยาบจากใบแพทชูลีและ น้ํา มันหอมระเหยแพทชูลี ในการยับยั้งการเจริญของเชื้อ Propionibacterium acns (DMST14914) และ Staphylococcus epidermidis (DMST5038) ดวยวิธี agar disc diffusion และไดศึกษาเปรียบเทียบระหวางผลิตภัณฑโฟมลางหนาท่ีมีสวนผสมของน้ํามันหอมระเหยแพทชูลีกับโฟมลางหนาท่ีมีสวน ผสมของสารไตรโคซาน (trichosan) ท่ีระดับความเขมขนรอยละ 0.5 และ 1 ผลจากการศึกษาพบวา สารสกัดหยาบจากใบแพทชูลีและนํ้ามันหอมระเหยแพทชูลี มีคา MIC เทากับ 64 มิลลิกรัมตอมิลลิลิตรเทากัน ซ่ึงเปนไปตามมาตรฐานท่ีกําหนดไว แสดงใหเห็นวาสารสกัดเหลานี้มีประสิทธิภาพในการยับยั้งเช้ือแบคทีเรียท่ีกอใหเกิดสิวอักเสบได แตพบวาโฟมลางหนาท่ีมีสวนผสมของสารไตรโคซาน มีประสิทธิภาพในการยับยั้งเช้ือไดดีกวาโฟมลางหนาท่ีมีสวนผสมของน้ํามันหอมระเหยแพทชูลี
12
อุปกรณและวิธีการ
อุปกรณ 1. ผากรอง
2. กระดาษกรอง (Filter paper) (No.1, Qualitative Circles 110 mm Dia, Whatman®, England) 3. ชุดกรองสุญญากาศ 4. จานเล้ียงเช้ือ (Petri dish) ขนาดเสนผานศูนยกลาง 7 เซนติเมตร 5. Anaerobic jar 6. Millipore filter (NYLON 0.45 μm) 7. แผนโครมาโทกราฟแบบแผนเคลือบ (Thin Layer Chromatography, TLC) (aluminium sheet 20 x 20 cm Silicagel 60 F254, Darmstadt, MERCK, Germany) 1. เคร่ืองมือ 1.1 เคร่ืองบด 1.2 เคร่ืองช่ัง (4 ตําแหนง, Precisa XT220A, Switzerland) 1.3 ตูอบ (CONTHERM DIGITAL SERIES) 1.4 เคร่ืองระเหยแบบหมุน (rotary evaporator) (BUCHI, Flawil, Switzerland) 1.5 เคร่ืองควบคุมอุณหภูมิ 1.6 เคร่ืองฉายรังสี UV (UV lamp) (CONSORT E2101,Thailand) 1.8 เคร่ืองโครมาโทกราฟของเหลวแบบสมรรถนะสูง (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) (Varian) 2. เคร่ืองแกว
2.1 บีกเกอร ( Beaker)
2.2 คอลัมน (Column) ขนาด φ 2.5 x 60 cm 2.3 กระบอกตวง (Measuring cylinder)
13
2.4 ขวดรูปชมพู (Erlenmayer flask) 2.5 ขวดปรับปริมาตร (Volumetric flask) 2.6 กรวยกรอง (Funnel) 2.7 กรวยแยก (Separatorty funnel) 2.8 ขวดแกวขนาดเล็ก (Vial) 2.9 ปเปตต (Pipette) 3. สารเคมี
3.1 อะซิโตไนไตร (Acetonitrile, CH3CN) (absolute GR for analysis, MERCK, Darmstadt, Germany)
3.2 เบนซีน (Benzene, C6H6) (AnalaR®, England) 3.3 คลอโรฟอรม (Chloroform, CHCl3) (Analytical science, LAB-SCAN, Thailand) 3.4 ไดคลอโรมีเทน (Dichloromethane, CH2Cl2) (Analytical science, LAB-SCAN, Thailand) 3.5 95% เอทานอล (Ethanol, C2H5OH) 3.6 เอทิล อะซิเตด (Ethyl acetate, CH3COOCH2CH3) (Analytical science, LAB-SCAN, Thailand) 3.7 เฮกเซน (Hexane, C6H14) (Analytical reagent grade, Fischer Scientific, UK) 3.8 เมทานอล (Methanol, CH3OH) (Analytical reagent grade, Fischer Scientific, UK) 3.9 แมกนีเซียมซัลเฟตไรน้ํา (Anhydrous magnesium sulfate, anh.MgSO4) (extra pure, Scharlau, Spain) 3.10 ซิลิกาเจล (Silica gel) (Silicagel 60, 0,06-0,2 mm, Scharlau, Spain) 3.11 Gaspak (BBL GasPak Anaerobic System, Fischer Scientific, UK) 3.12 แซนโทน (Xanthone, C13H8O2) (99% xanthone, ACROS ORGANICS) 4. อาหารเล้ียงเชื้อ brain heart infusion (BHI) (BD, USA)
14
5. มังคุด
มังคุดท่ีศึกษามี 2 แหลง คือ จันทบุรีและภาคใต สวนท่ีศึกษาคือ เปลือกแข็ง (fruit hull) 6. เชื้อแบคทีเรีย
เช้ือแบคทีเรียท่ีใชทดสอบ คือ Propionibacterium acnes ซ่ึงไดรับความอนุเคราะหจาก อาจารยดร.มาลี ศรีสดสุข สาขาวิชาจุลชีววิทยา สายวิชาวิทยาศาสตร คณะศิลปศาสตรและวทิยาศาสตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร วิทยาเขตกําแพงแสน
15
วิธีการ
1. การสกัดสารจากเปลือกมังคุด คัดเลือกมังคุดจากจันทบุรีและจากภาคใต 1.1 การสกัดแบบแหง นําเปลือกมังคุดจากจันทบุรีหรือภาคใต มาลางดวยน้ําใหสะอาด ผ่ึงใหแหง แลวหั่นเปนช้ินเล็กๆ นําไปบดดวยเคร่ืองบดใหละเอียด แลวนําไปอบท่ีอุณหภูมิ 55 องศาเซลเซียส จนแหง สกัดดวย 95% เอทานอล ในอัตราสวน 30 กรัม : 100 มิลลิลิตร ท่ีอุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เปนเวลา 7 วัน นํามากรอง แลวนําสารสกัดท่ีไดไประเหยตัวทําละลาย โดยใชการระเหยภายใต ความดันตํ่าดวยเคร่ืองระเหยแบบหมุน (rotary evaporator) จนแหง หาเปอรเซ็นตสารสกัดหยาบจาก เปอรเซ็นตสารสกัดหยาบ = น้ําหนกัสารสกัดหยาบ x 100 น้ําหนักเปลือกมังคุดเร่ิมตน 1.2 การสกัดแบบสด นําเปลือกมังคุดจากจันทบุรีหรือภาคใต มาลางดวยน้ําใหสะอาด ผ่ึงใหแหง แลวหั่นเปนช้ินเล็กๆ นําไปบดใหละเอียด สกัดดวย 95% เอทานอล ในอัตราสวน 30 กรัม : 50 หรือ 100 มิลลิลิตร ท่ีอุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เปนเวลา 7 วัน นํามากรอง นําสารสกัดท่ีไดไประเหยตัวทําละลายจนแหง เนื่องจากการสกัดแบบสดอาจจะมีน้ําปน นําสวนท่ีเปนของเหลวท่ีเหลือจากการระเหยไปสกัดซํ้าอีกคร้ังดวย เอทิล อะซิเตด (ethyl acetate) ในปริมาตรท่ีเทากัน 2 คร้ัง รวมสารละลายช้ันตัวทําละลายอินทรีย (organic phase) เติมแมกนีเซียมซัลเฟตไรน้ํา (MgSO4 anhydrous) เพื่อกําจัดน้ําออก นําไประเหยตัวทําละลายจนแหง
16
2. การวิเคราะหสารสกัดโดยวิธีโครมาโทกราฟแบบแผนเคลือบ (Thin Layer Chromatography, TLC) นําสารสกัดหยาบที่ไดจากการสกัดท้ังแบบสดและแบบแหง มาละลายในเอทานอล เล็กนอย วิเคราะหสารสกัดหยาบที่ไดโดยวิธี TLC โดยใชแผน TLC ขนาด 20 x 20 เซนติเมตร และใชตัวทําละลาย (Developing solvent) คือ CHCl3 : CH3COOCH2CH3 (6:4) , CHCl3 : CH3COOH (4:1), CH3OH : CHCl3 : H2O (10:8:2), CH3OH : CHCl3 : H2O (10:8:2) + 2 หยด CH3COOH, CH3OH : CH3COOCH2CH3 : H2O (10:5:5), CH3OH : H2O (4:1), CH3OH : H2O (8:2) + 4 หยด CH3COOH, CH3OH : H2O (8:2) + 2 หยด conc. H2SO4, CHCl3 : C6H6 (5:5), CHCl3 : C6H6 (7:3), CHCl3 : C6H14 (7:3), CH2Cl2 : CH3OH (98:2), CH3COOCH2CH3 : C6H14 (7:3) โดยวิเคราะหผลภายใตแสงยูวี 3. การแยกกลุมสารสกัดโดยวิธีคอลัมนโครมาโทกราฟ (Column Chromatography)
ทําการแยกกลุมสารสกัดหยาบโดยวิธีคอลัมนโครมาโทกราฟ โดยใชคอลัมนขนาด φ 2.5 x 60 เซนติเมตร ซ่ึงบรรจุซิลิกาเจล (siliga gel) ตัวทําละลายท่ีใชชะ คือ CH2Cl2 : CH3OH (98:2) เติมสารสกัดหยาบแบบแหงจากเปลือกมังคุดจากภาคใต 5 กรัม โดยละลายใน 95% เอทานอล (ความเขมขน 1 กรัมตอมิลลิลิตร) สวนสารสกัดหยาบแบบสดจากเปลือกมังคุดจากภาคใต ตัวทําละลายท่ีใชชะ คือ CHCl3 : C6H6 (7:3) โดยใชปริมาณสารสกัดท่ีมีความเขมขนเทากัน เก็บสารละลาย 10 มิลลิลิตร ตอ 1 fraction อัตราการไหล ประมาณ 6 มิลลิลิตร/นาที แลวนําสารละลายท้ังหมดไปวิเคราะหโดยวิธี TLC โดยใชตัวทําละลาย คือ CH2Cl2 : CH3OH (98:2) สําหรับสารสกัดแบบแหง และ CHCl3 : C6H6 (7:3) สําหรับสารสกัดแบบสด รวมสารละลายแต fraction ท่ีมีอัตราเร็วในการเคล่ือนท่ี (Rate of flow, Rf) เทากัน นําแตละ fraction ท่ีรวมไดมาวิเคราะหโดยวิธี TLC อีกคร้ัง 4. การแยกกลุมสารสกัดโดยวิธีพรี-คอลัมนโครมาโทกราฟ (Pre-Column Chromatography) เนื่องจากการแยกสารสกัดหยาบจากแปลือกมังคุดจากภาคใตท่ีสกัดแบบแหง โดยวิธีคอลัมนโครมาโทกราฟ ดวยตัวชะตาง ๆ ไมสามารถแยกสารออกจากกันได จึงไดลองหาตัวทําละลายท่ีเหมาะสม โดยวิธีพรี-คอลัมนโครมาโทกราฟ โดยนําสารสกัดหยาบจากเปลือกมังคุดจากภาคใต ที่สกัดแบบแหง หนัก 14.96 กรัม มาผสมกับซิลิกาเจล (silica gel) เติมลงไปในกรวยของชุดกรองสุญญากาศ และใชตัวทําละลายในการชะ จากตัวทําละลายไมมีข้ัว มีข้ัวนอย และมีข้ัวมาก
17
คือ ไดคลอโรมีเทน 100 มิลลิลิตร, คลอโรฟอรม 100 มิลลิลิตร, เอทิล อะซิเตด 100 มิลลิลิตร และ เมทานอล 100 มิลลิลิตร ตามลําดับ นําสารละลายท่ีไดจากการชะแตละตัวทําละลาย มาวิเคราะหโดยวธีิ TLC หลังจากนั้นนําสารละลายท่ีไดจากการชะดวย คลอโรฟอรม 100 มิลลิลิตร มาทําการแยกกลุมสารตอ เนื่องจากพบวาตัวทําละลายท่ีใชในการชะยังไมเหมาะสม โดยใชตัวทําละลาย คือ เฮกเซน 100 มิลลิลิตร, CHCl3 : C6H14 (7:3) 100 มิลลิลิตร, CHCl3 : CH3COOCH2CH3 (5:5) 100 มิลลิลิตร, CHCl3 : CH3OH (8:2) 100 มิลลิลิตร นําสารละลายท่ีไดจากการชะแตละตัวทําละลาย มาวิเคราะหโดยวิธี TLC หลังจากนั้นนําสารละลายท่ีไดจากการชะดวย CHCl3 : C6H14 (7:3) 100 มิลลิลิตร และ CHCl3 : CH3COOCH2CH3 (5:5) 100 มิลลิลิตร มารวมกัน นํามาทําการแยกกลุมสารตอ เนื่องจากตัวทําละลายท่ีใชยังแยกสารออกจากกันไดไมดีเทาท่ีควร โดยใชตัวทําละลาย คือ เฮกเซน 200 มิลลิลิตร, C6H14 : CHCl3 (7:3) 200 มิลลิลิตร, คลอโรฟอรม 200 มิลลิลิตร และ CHCl3 : CH3OH (6:4) 200 มิลลิลิตร นําสารละลายท่ีไดจากการชะแตละตัวทําละลาย มาวิเคราะหโดยวิธี TLC 5. การทดสอบการยับยัง้การเจริญเติบโตของเชื้อ Propionibacterium acnes 5.1 การเตรียมสารสกัด เตรียมสารสกัดความเขมขน 4 มิลลิกรัมตอมิลลิลิตร โดยละลายใน CHCl3 : C6H6 (7:3) แลวจุด (spot) ลงบนแผน TLC ปริมาตร 10 ไมโครลิตร จุดซํ้า 4 คร้ัง ท้ิงไวใหแหง นําไปฆาเช้ือดวยรังสี UV นาน 5 นาที 5.2 การเตรียมเช้ือ Propionibacterium acnes เล้ียงเช้ือ Propionibacterium acnes ในอาหาร brain heart infusion (BHI) ในภาวะไรออกซิเจน โดยเล้ียงเช้ือใน anaerobic jar และใช gaspak เปนตัวกําจัดออกซิเจน บมเช้ือท่ี 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 72 ช่ัวโมง
18
5.3 การทดสอบ วางแผน TLC ท่ีมีสารสกัดลงในจานเล้ียงเช้ือ (petri dish) ขนาดเสนผานศูนยกลาง 7 เซนติเมตร เทเช้ือท่ีผสมกับอาหาร BHI หลอมเหลวลงไป ท้ิงไวใหแข็งตัว เกล่ียเช้ือลงบนอาหาร แลวนําไปบมท่ี 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 7 วัน 6. การวิเคราะหสารสกัดท่ีแยกไดโดยวิธีโครมาโทกราฟของเหลวแบบสมรรถนะสูง (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) นําสารสกัดหยาบจากเปลือกมังคุดภาคใต โดยการสกัดแบบสดท่ีแยกไดโดยวิธีคอลัมน โครมาโทกราฟ ซ่ึงรวม fraction แลว ได 9 fractions นํา fraction ท่ี 2 และ 7 มาเตรียมใหมีความเขมขน 50 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร 2 มิลลิลิตร โดยละลายใน อะซิโตไนไตร (acetronitrile) กรองดวย millipore filter วิเคราะหสารละลายท่ีไดดวยเคร่ือง HPLC (โดยศูนยเคร่ืองมือวิจัยวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี
จุฬาลงกรณมหาวิทยาลัย) โดยใชคอลัมน C18 ขนาด φ 4.6 x 250 มิลลิเมตร อัตราการไหล (flow rate) 1 มิลลิลิตรตอนาที ตัวทําละลายคือ น้ําและ acetronitrile แบบ linear gradient จาก 5% acetronitrile ถึง 100% acetronitrile ท่ี UV 280 นาโนเมตร
19
สถานท่ีและระยะเวลาในการทดลอง
สถานท่ี
หองปฏิบัติการ สาขาวิชาเคมีและจุลชีววิทยา สายวิชาวิทยาศาสตร คณะศิลปศาสตรและวิทยาศาสตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร วิทยาเขตกําแพงแสน จังหวัดนครปฐม
ระยะเวลาในการทดลอง
การทดลองนี้เร่ิมต้ังแต 27 กรกฎาคม 2549 - 19 มีนาคม 2550
20
ผลและวิจารณ
1. การสกัดสารจากเปลือกมังคุด
1.1 การสกัดแบบแหง
จากการนําเปลือกมังคุดจากจันทบุรีท่ีบดแหง 210 กรัม สกัดดวย 95% เอทานอล โดยใชอัตราสวนเทากับ 30 กรัม : 100 มิลลิลิตร ท่ีอุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เปนเวลา 7 วัน พบวา ไดสารสกัดหยาบ (crude extract) สีน้ําตาลมวง หนัก 7.70 กรัม คิดเปนเปอรเซ็นตสารสกัดหยาบ (% crude extract) เทากับ 3.67% สวนสารสกัดเปลือกมังคุดจากภาคใตท่ีบดแหง ซ่ึงสกัดในสภาวะเดียวกัน 660 กรัม พบวา ไดสารสกัดหยาบ สีน้ําตาลแดง หนัก 28.58 กรัม คิดเปนเปอรเซ็นตสารสกัดหยาบ เทากับ 4.33% จากการสกัดเปลือกมังคุดแบบแหงท้ังจากจันทบุรีและจากภาคใต พบวา สารสกัดหยาบที่ไดมีลักษณะแตกตางกัน โดยสารสกัดหยาบแบบแหงจากจันทบุรี มีสีน้ําตาลมวง แตสารสกัดหยาบแบบแหงจากภาคใต มีสีน้ําตาลแดง ท้ังนี้อาจมีสาเหตุมาจากสีของเปลือกมังคุดท้ังสองแหลงมีลักษณะแตกตางกันอยูแลว โดยเปลือกมังคุดจากจันทบุรีจะสีน้ําตาลมวง แตเปลือกมังคุดจากภาคใตมีสีน้ําตาลมวงออน ทําใหสารสกัดหยาบท่ีไดมีสีคลายกับสีเปลือก สวนเปอรเซ็นตสารสกัดหยาบจากเปลือกมังคุดท้ังสองแหลงมีคาใกลเคียงกัน คือ สารสกัดหยาบแบบแหงจากจันทบุรี มีเปอรเซ็นตสารสกัดหยาบ เทากับ 3.67% และสารสกัดหยาบแบบแหงจากภาคใต มีเปอรเซ็นตสารสกัดหยาบ 4.33% 1.2 การสกัดแบบสด จากการสกัดเปลือกมังคุดจากจันทบุรีท่ีบดละเอียดแบบสด 180 กรัม ดวย 95% เอทานอล ในอัตราสวน 30 กรัม : 100 มิลลิลิตร ท่ีอุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เปนเวลา 7 วัน พบวา ไดสารสกัดหยาบ สีน้ําตาลมวง หนัก 37.46 กรัม คิดเปนเปอรเซ็นตสารสกัดหยาบ เทากับ 20.81% สวนการสกดัเปลือกมังคุดจากภาคใตท่ีบดแหง 1,980 กรัม ดวย 95% เอทานอล ในอัตราสวน 30 กรัม : 50 มิลลิลิตร ในสภาวะเดียวกัน พบวาเม่ือระเหยตัวทําละลายดวยเคร่ืองระเหยแบบหมุน ท่ีอุณหภูมิแตกตางกัน คือ 40 องศาเซลเซียส และ 60 องศาเซลเซียส ไดสารละลายสีน้ําตาลแดงเหมือนกัน แสดงวา อุณหภูมิท่ีใชในการระเหยไมมีผลตอการเปล่ียนแปลงสมบัติทางกายภาพของสารสกัด สารสกัดหยาบที่ได
21
จากการระเหยตัวทําละลายท่ีอุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส มีน้ําหนักเทากับ 13.30 กรัม (จากปริมาตรเร่ิม ตน 850 มิลลิลิตร) และ สารสกัดหยาบที่ไดจากการระเหยตัวทําละลายท่ีอุณหภูมิ 40 องศาเซลเซียส มีน้ําหนักเทากับ 89.01 กรัม (จากปริมาตรเร่ิมตน 350 มิลลิลิตร) ซ่ึงสารละลายท้ังสองสวนมีสีน้ําตาลแดง เม่ือเก็บไวท่ีอุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส สารจะแยกออกเปนสองชั้น คือ ช้ันท่ีเปนของเหลวสีน้ํา ตาลแดงและช้ันท่ีเปนของเหลวขนสีเหลือง สารสกัดหยาบที่ไดท้ังหมดคิดเปนเปอรเซ็นตสารสกัดหยาบ เทากับ 5.17% จากการสกัดเปลือกมังคุดแบบสดทั้งจากจันทบุรีและจากภาคใต พบวา สารสกัดหยาบจากเปลือกมังคุดจากท้ังสองแหลงมีลักษณะแตกตางกัน โดยสารสกัดหยาบแบบสดจากจันทบุรี มีสีน้ําตาลมวง แตสารสกัดหยาบแบบสดจากภาคใต มีสีน้ําตาลแดง สวนเปอรเซ็นตสารสกัดหยาบจากเปลือกมังคุดจากท้ังสองแหลงมีคาแตกตางกันมาก คือ สารสกัดหยาบแบบสดจากจันทบุรี มี เปอรเซ็นตสารสกัดหยาบ เทากับ 20.81% และสารสกัดหยาบแบบสดจากภาคใต มีเปอรเซ็นตสารสกัดหยาบ เทากับ 5.17% อาจมีสาเหตุมาจากในการสกัดเปลือกมังคุดแบบสดจากจันทบุรี ไมไดทําการสกัดซํ้าดวยเอทิล อะซิเตด (ethyl acetate) และไมไดเติมแมกนีเซียมซัลเฟตไรน้ํา (MgSO4 anhydrous) จึงทําใหมีน้ําปน เปอรเซ็นตสารสกัดหยาบที่ไดจึงมีคาสูงกวาความเปนจริง และอาจมีสาเหตุมาจากการสกัดใชอัตราสวนท่ีแตกตางกัน โดยการสกัดเปลือกมังคุดแบบสดจากจันทบุรี ใชอัตราสวนเทากับ 30 กรัม : 100 มิลลิลิตร แตการสกัดเปลือกมังคุดแบบสดจากภาคใต ใชอัตราสวนเทากับ 30 กรัม : 50 มิลลิลิตร อาจเปนไปไดวาหากใชปริมาตรตัวทําละลายในการสกัดมากกวา จะไดปริมาณสารสกัดหยาบที่มากกวา เนื่องจากตัวทําละลายสามารถละลายสารออกมาไดมากกวา 2. การวิเคราะหสารสกัดโดยวิธีโครมาโทกราฟแบบแผนเคลือบ (Thin Layer Chromatography, TLC) จากการนําสารสกัดหยาบแบบแหงจากเปลือกมังคุดจากจันทบุรีมาละลายใน 95% เอทานอล เล็กนอย และวิเคราะหดวย TLC โดยใชตัวทําละลายท้ังท่ีมีข้ัวและไมมีข้ัวชนิดตางๆ พบวา ไดผลดังภาพที่ 7 ตัวทําละลายที่สามารถแยกสารสกัดหยาบไดดี ไดแก CHCl3 : CH3COOCH2CH3 (6:4) (หมายเลข 1), CHCl3 : C6H6 (5:5) (หมายเลข 9), CHCl3 : C6H6 (7:3) (หมายเลข 10), CHCl3 : C6H14 (7:3) (หมายเลข 11) และ CH2Cl2 : CH3OH (98:2) (หมายเลข 12) โดยแตละสารสกัดหยาบสามารถแยกสารไดประมาณ 3-4 กลุม แตสารสกัดหยาบท่ีแยกไดดีท่ีสุด คือ สารสกัดหยาบท่ีแยกดวยตัวทําละลาย CH2Cl2 : CH3OH 98:2 (หมายเลข 12) จะเห็นไดวา แยกสารไดประมาณ 4 กลุม ซ่ึงสารแตละกลุม
22
แยกออกมาไดเร็วและมีระยะหางกัน สวนสารสกัดหยาบท่ีเหลือไมแยกออกจากกันเลย เชน สารสกัดหยาบท่ีแยกดวยตัวทําละลาย CH3OH : CHCl3 : H2O (10:8:2) + 2 หยด CH3COOH (หมายเลข 4) จะเห็นไดวาสารออกมาไดเร็วแตสารไมแยกออกจากกันเลย
1 2 3 4 5 6
7 8 9 10 11 12 13 ภาพท่ี 7 TLC โครมาโทแกรมของสารสกัดหยาบแบบแหงจากเปลือกมังคุดจากจันทบุรี ในตัวทํา
ละลาย หมายเลข 1 คือ CHCl3 : CH3COOCH2CH3 (6:4) หมายเลข 2 คือ CHCl3 : CH3COOH (4:1) หมายเลข 3 คือ CH3OH : CHCl3 : H2O (10:8:2) หมายเลข 4 คือ CH3OH : CHCl3 : H2O (10:8:2) + 2 หยด CH3COOH หมายเลข 5 คือ CH3OH : CH3COOCH2CH3 : H2O (10:5:5) หมายเลข 6 คือ CH3OH : H2O (4:1) หมายเลข 7 คือ CH3OH : H2O (8:2) + 4 หยด CH3COOH หมายเลข 8 คือ CH3OH : H2O (8:2) + 2 หยด conc. H2SO4 หมายเลข 9 คือ CHCl3 : C6H6 (5:5) หมายเลข 10 คือ CHCl3 : C6H6 (7:3) หมายเลข 11 คือ CHCl3 : C6H14 (7:3) หมายเลข 12 คือ CH2Cl2 : CH3OH (98:2) หมายเลข 13 คือ CH3COOCH2CH3 : C6H14 (7:3)
23
และจากการนําสารสกัดหยาบแบบแหงจากเปลือกมังคุดจากภาคใต มาละลายใน 95% เอทานอลเล็กนอย และวิเคราะหดวย TLC โดยใชตัวทําละลาย ท้ังท่ีมีข้ัวและไมมีข้ัวชนิดตางๆ พบวาไดผลดังภาพท่ี 8 ตัวทําละลายท่ีสามารถแยกสารสกัดหยาบไดดี คือ CHCl3 : C6H6 (7:3) (หมายเลข 1) และ CH2Cl2 : CH3OH (98:2) (หมายเลข 2) แตตัวทําละลายท่ีแยกสารสกัดหยาบไดดีท่ีสุด คือ CH2Cl2 : CH3OH (98:2) (หมายเลข 2) จะเห็นไดวา แยกสารไดประมาณ 6 กลุม ดังท่ีลูกศรชี้ ซ่ึงสารแตละกลุมแยกออกจากกันคอนขางชัดเจน สวนสารสกัดหยาบท่ีแยกดวย CHCl3 : C6H6 (7:3) (หมายเลข 1) ก็ดีเชนกัน คือ สามารถแยกสารออกมาไดหลายกลุม แตสารแตละกลุมแยกออกมาไดชาและอยูติดกัน ตัวทําละลายจึงมีความเหมาะสมในการใชแยกกลุมสารนอยกวา CH2Cl2 : CH3OH (98:2) (หมายเลข 2) นอกจากน้ีสารสกัดหยาบที่แยกดวย CH3COOCH2CH3 : C6H14 (7:3) (หมายเลข 3) ก็แยกไดไมดี คือ สารแตละกลุมอยูติดกันมาก จนไมสามารถแยกออกจากกันไดชัดเจน ดังท่ีลูกศรช้ี ดังนั้นตัวทําละลาย CH2Cl2 : CH3OH (98:2) สามารถแยกสารสกัดหยาบแบบแหงจากเปลือกมังคุดท้ังจากจันทบุรีและจากภาคใต ไดดีท่ีสุดเหมือนกัน จากการนําสารสกัดหยาบแบบสดจากจันทบุรี มาละลายใน 95% เอทานอล เล็กนอย และวิเคราะหดวย TLC โดยใชตัวทําละลาย ท้ังท่ีมีข้ัวและไมมีข้ัวชนิดตางๆ พบวา ไดผลดังภาพท่ี 9 ตัวทําละลายท่ีสามารถแยกสารสกัดหยาบไดดี คือ CHCl3 : C6H6 (7:3) (หมายเลข 1) จะเห็นไดวา แยกสารไดประมาณ 4 กลุม ดังท่ีลูกศรช้ี ซ่ึงสารแตละกลุมมีระยะหางกัน สวนตัวทําละลายอ่ืนแยกสารสกัดหยาบไดไมดี เชน CH3OH : CHCl3 : H2O (10:8:2) (หมายเลข 4) จะเห็นไดวาสารแยกออกมาไดแตมีปริมาณนอยมาก เม่ือเปรียบเทียบกับสารท้ังหมด เนื่องจากตัวทําละลายไมเหมาะสม ดังท่ีลูกศรชี้ และจากการนําสารสกัดหยาบแบบสดจากภาคใตท้ัง 4 สวน (ในขอ 1.2) มาละลายใน 95% เอทานอลเล็กนอย แลวนําไปวิเคราะหดวย TLC โดยใชตัวทําละลาย CHCl3 : C6H6 (7:3) พบวา สารสกัดหยาบที่ไดจากการระเหยตัวทําละลายท่ีอุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส ท้ังสองช้ัน และสารสกดัหยาบท่ีไดจากการระเหยตัวทําละลายท่ีอุณหภูมิ 40 องศาเซลเซียส ช้ันท่ีเปนของเหลวขนสีเหลือง สามารถแยกไดดี จากภาพท่ี 10 เปนสารสกัดหยาบท่ีไดจากการระเหยตัวทําละลายที่อุณหภูมิ 40 องศาเซลเซียส ช้ันท่ีเปนของเหลวขนสีเหลือง จะเห็นไดวาสารสามารถแยกไดดี ซ่ึงแยกออกเปน 4 กลุม และมีระยะหางกัน ดังท่ีลูกศรชี้ สวนสารสกัดหยาบที่ไดจากการระเหยตัวทําละลายท่ีอุณหภูมิ 40 องศาเซลเซียส ช้ันท่ีเปนของเหลวสีน้ําตาลแดงแยกไดไมดี อาจมีสาเหตุมาจากในข้ันตอนการสกัด
24
อาจกําจัดน้ําออกไปไมหมด ทําใหเม่ือเก็บสารไวนานสารจะแยกช้ันเปนช้ันของสารสกัดหยาบและช้ันของสารท่ีมีน้ําปน และเนื่องจากการใชอุณหภูมิท่ีสูงเกินไปในการระเหยตัวทําละลายอาจมีผลทําใหสารสลายตัว ดังนั้นจึงเลือกสารสกัดหยาบที่ไดจากการระเหยตัวทําละลายท่ีอุณหภูมิ 40 ไปวิเคราะหดวยคอลัมนโครมาโทกราฟตอไป ดังนั้นตัวทําละลาย CHCl3 : C6H6 (7:3) สามารถแยกสารสกัดหยาบแบบสดจากเปลือกมังคุดท้ังจากจันทบุรีและจากภาคใต ไดดีเหมือนกัน
1 2 3
ภาพท่ี 8 TLC โครมาโทแกรมของสารสกัดหยาบแบบแหงจากเปลือกมังคุดจากภาคใต ในตัวทํา ละลาย หมายเลข 1 คือ CHCl3 : C6H6 (7:3) หมายเลข 2 คือ CH2Cl2 : CH3OH (98:2) หมายเลข 3 คือ CH3COOCH2CH3 : C6H14 (7:3)
25
1 2 3 4
ภาพท่ี 9 TLC โครมาโทแกรมของสารสกัดหยาบแบบสดจากเปลือกมังคุดจากจันทบุรี ในตัวทําละลาย หมายเลข 1 คือ CHCl3 : C6H6 (7:3) หมายเลข 2 คือ CHCl3 : CH3COOCH2CH3 (6:4) หมายเลข 3 คือ CHCl3 : CH3COOH (4:1) หมายเลข 4 คือ CH3OH : CHCl3 : H2O (10:8:2)
ภาพท่ี 10 TLC โครมาโทแกรมของสารสกัดหยาบแบบสดจากเปลือกมังคุดจากภาคใต (สารสกัด
หยาบท่ีไดจากการระเหยตัวทําละลายท่ีอุณหภูมิ 40 องศาเซลเซียส ชั้นท่ีเปนของเหลวขนสีเหลือง) ในตัวทําละลาย CHCl3 : C6H6 (7:3)
26
3. การแยกกลุมสารสกัดโดยวิธีคอลัมนโครมาโทกราฟ (Column Chromatography) 3.1 จากการนําสารสกัดหยาบจากเปลือกมังคุดจากภาคใต ท่ีสกัดแบบแหง มาแยกกลุมสารสกัดโดยวิธีคอลัมนโครมาโทกราฟ โดยตัวทําละลายท่ีใชในการชะ (Eluting solvent) คือ CH2Cl2 : CH3OH (98:2) โดยใชสารเร่ิมตน 5 กรัม ละลายใน 95% เอทานอล 5 มิลลิลิตร run column โดยเก็บสารละลาย fraction ละ 10 มิลลิลิตร ซ่ึงเก็บสารละลายไดท้ังหมด 90 fractions นําสารละลายท้ัง 90 fractions มาวิเคราะหโดยวิธี TLC รวมสารละลายแตละ fraction ท่ีมีคา Rf เทากัน ไดท้ังหมด 11 กลุม คือ กลุมท่ี 1 fraction ท่ี 8 กลุมท่ี 2 fraction ท่ี 9 กลุมท่ี 3 fraction ท่ี 10 กลุมท่ี 4 fraction ท่ี 11 กลุมท่ี 5 fraction ท่ี 12 กลุมท่ี 6 fraction ท่ี 13 กลุมท่ี 7 fraction ท่ี 14-15 กลุมท่ี 8 fraction ท่ี 16-23 กลุมท่ี 9 fraction ท่ี 24-47 กลุมท่ี 10 fraction ท่ี 48-50 กลุมท่ี 11 fraction ท่ี 51-90 นําสารละลายท้ัง 11 กลุม มาวิเคราะหโดยวิธี TLC พบวา ไดผลดังภาพท่ี 11 จากภาพจะเห็นไดวาสารแตละกลุมไมแยกออกจากกันอยางเดนชัด แสดงวา ตัวทําละลาย CH2Cl2 : CH3OH (98:2) ไมเหมาะสมท่ีจะใชในการแยกสารสกัดหยาบจากเปลือกมังคุดจากภาคใต ท่ีสกัดแบบแหง 3.2 จากการนําสารสกัดหยาบจากเปลือกมังคุดจากภาคใต ท่ีสกัดแบบสด มาแยกกลุมสารสกัดโดยวิธีคอลัมนโครมาโทกราฟ พบวาตัวทําละลาย CHCl3 : C6H6 (7:3) สามารถแยกสารสกัดหยาบจากเปลือกมังคุดจากภาคใต ท่ีสกัดแบบสดไดดี โดยใชสารเร่ิมตน 5 กรัม ละลายใน 95% เอทานอล 5 มิลลิลิตร run column เก็บสารละลาย fraction ละ 10 มิลลิลิตร ซ่ึงสามารถเก็บสารละลายไดท้ังหมด 91 fractions นําสารละลายท้ัง 91 fractions มาวิเคราะหโดยวิธี TLC รวมสารละลายแตละ fraction ท่ีมีคา Rf เทากัน ไดท้ังหมด 9 กลุม นําสารละลายท้ัง 9 กลุม มาวิเคราะหโดยวิธี TLC พบวา ไดผลดังภาพท่ี 12 สารแตละกลุมแยกออกจากกันไดดี โดยสารที่แยกออกมาสามารถแบงออกไดเปน 4 กลุม ดังท่ีลูกศรชี้ fraction ท่ีสามารถแยกออกมาไดดี ไดแก fraction ท่ี 1-3 และ 7-9
27
8 9 10 11 12 13 14-15 16-23 24-47 48-50 51-90 ภาพท่ี 11 TLC โครมาโทแกรมของสารสกัดแบบแหงจากเปลือกมังคดุจากภาคใต ท่ีแยกไดจาก คอลัมนโครมาโทกราฟ ในตัวทําละลาย CH2Cl2 : CH3OH (98:2)
1(16) 2(17) 3(18-19) 4(20-22) 5( 23-24) 6(25-29) 7(30-32) 8(33-41) 9(42-71) ภาพท่ี 12 TLC โครมาโทแกรมของสารสกัดแบบสดจากเปลือกมังคุดจากภาคใต ท่ีแยกไดจาก คอลัมนโครมาโทกราฟ ในตัวทําละลาย CHCl3 : C6H6 (7:3)
28
4. การแยกกลุมสารสกัดโดยวิธี พรี-คอลัมนโครมาโทกราฟ (Pre-Column Chromatography) จากการแยกกลุมสารสกัดหยาบจากเปลือกมังคุดจากภาคใตท่ีสกัดแบบแหง โดยใชตัวทําละลาย CH2Cl2 : CH3OH (98:2) พบวาไมสามารถแยกไดดี ดังภาพท่ี 11 จึงไดลองนําสารสกัดหยาบอีกสวนหนึ่งมาทําการแยกโดยวิธีพรี-คอลัมนโครมาโทกราฟ โดยใชสารเร่ิมตน 14.96 กรัม ตัวทําละลายท่ีใชในการชะจากตัวทําละลายไมมีข้ัว มีข้ัวนอย และมีข้ัวมาก ไดแก ไดคลอโรมีเทน, คลอโรฟอรม, เอทิล อะซิเตด และ เมทานอล ตามลําดับ แลวนําสารสกัดท่ีไดท้ัง 4 สวน มาวิเคราะหโดยวิธี TLC โดยใชตัวทําละลาย คือ CH2Cl2 : CH3OH (98:2) ไดผลดังภาพท่ี 13 จากภาพ หมายเลข 1 คือ สารสกัดท่ีแยกไดจากตัวทําละลายไดคลอโรมีเทน มีน้ําหนักเทากับ 1.74 กรัม จะเห็นไดวามีสารอยูประมาณ 4 กลุม ไดแก a, b, c และ d ดังท่ีลูกศรช้ี ซ่ึงสารไมแยกออกจากกัน นอกจากน้ี หมายเลข 2, 3 และ 4 ซ่ึงเปนสารสกัดท่ีแยกไดจากตัวทําละลาย คลอโรฟอรม, เอทิล อะซิเตด และ เมทานอล ตามลําดับ ก็ไมแยกออกจากกัน ซ่ึงมีน้ําหนักเทากับ 3.02, 4.67 และ 3.06 กรัม ตามลําดับ
a b
c
d
1 2 3 4 ภาพท่ี 13 TLC โครมาโทแกรมของสารสกัดหยาบแบบแหงจากเปลือกมังคุดจากภาคใต ท่ีแยกได
จากพรี-คอลัมนโครมาโทกราฟ คร้ังท่ี 1 หมายเลข 1, 2, 3 และ 4 คือ สารสกัดท่ีแยกไดจากตัวทําละลาย ไดคลอโรมีเทน, คลอโรฟอรม, เอทิล อะซิเตด และ เมทานอล ตามลําดับ
ดังนั้นจึงนําสารสกัดหมายเลข 2 ซ่ึงเปนสารสกัดท่ีแยกไดจากตัวทําละลายคลอโรฟอรม มาแยกกลุมสารตอโดยวิธีพรี-คอลัมนโครมาโทกราฟ โดยใชสารเร่ิมตน 0.02 กรัม ตัวทําละลายท่ีใชในการชะจากตัวทําละลายไมมีข้ัว มีข้ัวนอย และมีข้ัวมาก ไดแก เฮกเซน4, CHCl3 : C6H14 (7:3), CHCl3 : CH3COOCH2CH3 (5:5) และ CHCl3 : CH3OH (8:2) ตามลําดับ แลวนําสารสกัดท่ีไดท้ัง 4 สวน มา
29
วิเคราะหโดยวิธี TLC โดยใชตัวทําละลาย คือ CH2Cl2 : CH3OH (98:2) ไดผลดังภาพท่ี 14 จากภาพจะเห็นไดวาสารสกัดหมายเลข 5 ซ่ึงเปนสารสกัดท่ีแยกไดจากตัวทําละลายเฮกเซน แยกไดคอนขางดี แตสารในตําแหนง b และ d หายไป ดังท่ีลูกศรชี้ สวนหมายเลข 2, 3 และ 4 ซ่ึงเปนสารสกัดท่ีแยกไดจากตัวทําละลาย CHCl3 : C6H14 (7:3), CHCl3 : CH3COOCH2CH3 (5:5) และ CHCl3 : CH3OH (8:2) ตามลําดับ ก็ไมแยกออกจากกัน ซ่ึงมีน้ําหนักเทากับ 0.98, 1.19 และ 0.12 กรัม ตามลําดับ จากนั้นนําสารสกัดหมายเลข 6 และ 7 ซ่ึงเปนสารสกัดท่ีแยกไดจากตัวทําละลาย CHCl3 : C6H14 (7:3), CHCl3 : CH3COOCH2CH3 (5:5) ตามลําดับ มารวมกัน แลวมาแยกกลุมสารตอโดยวิธีพรี-คอลัมนโครมาโทกราฟ โดยใชสารเร่ิมตน 2.17 กรัม ตัวทําละลายท่ีใชในการชะจากตัวทําละลายไมมีข้ัว มีข้ัวนอย และมีข้ัวมาก ไดแก เฮกเซน, C6H14 : CHCl3 (7:3), คลอโรฟอรม และ CHCl3 : CH3OH (6:4) ตามลําดับ แลวนําสารสกัดท่ีไดท้ัง 4 สวน มาวิเคราะหโดยวิธี TLC โดยใชตัวทําละลาย คือ CH2Cl2 : CH3OH (98:2) ไดผลดังภาพท่ี 15 จากภาพจะเห็นไดวาสารสกัดหมายเลข 10 ซ่ึงเปนสารสกัดท่ีแยกไดจากตัวทําละลาย C6H14 : CHCl3 (7:3) แยกไดคอนขางดี แตสารในตําแหนง a และ b ติดกัน ดังท่ีลูกศรชี้ และหมายเลข 9 ซ่ึงเปนสารสกัดท่ีแยกไดจากตัวทําละลายเฮกเซน แยกไดคอนขางดี แตสารในตําแหนง a และ c หายไป ดังท่ีลูกศรชี้ จากการแยกกลุมสารสกัดหยาบโดยวิธีวิธีพรี-คอลัมนโครมาโทกราฟ ท้ัง 3 คร้ัง โดยใชตัวทําละลายตาง ๆ จากไมมีข้ัว มีข้ัวนอย และมีข้ัวมาก แลวนําสารสกัดท่ีได มาวิเคราะหโดยวิธี TLC โดยใชตัวทําละลาย คือ CH2Cl2 : CH3OH (98:2) พบวาสารสกัดไมสามารถแยกออกจากกันไดดี ดังนั้นสรุปไดวา การแยกสารสกัดโดยวิธีวิธีพรี-คอลัมนโครมาโทกราฟ ดวยตัวทําละลายท่ีใชยงัไมเหมาะสม จะตองมีการปรับเปล่ียนความมีข้ัว-ความไมมีข้ัวของตัวทําละลายใหม
30
b
d
5 6 7 8
ภาพท่ี 14 TLC โครมาโทแกรมของสารสกัดหยาบแบบแหงจากเปลือกมังคุดจากภาคใต ท่ีแยกไดจากพรี-คอลัมนโครมาโทกราฟ คร้ังท่ี 2 หมายเลข 5, 6, 7 และ 8 คือ สารสกัดท่ีแยกไดจากตัวทําละลาย เฮกเซน, CHCl3 : C6H14 (7:3), CHCl3 : CH3COOCH2CH3 (5:5) และ CHCl3 : CH3OH (8:2) ตามลําดับ
c
a a b
9 10 11 12
ภาพท่ี 15 TLC โครมาโทแกรมของสารสกัดหยาบแบบแหงจากเปลือกมังคุดจากภาคใต ท่ีแยกไดจากพรี-คอลัมนโครมาโทกราฟ คร้ังท่ี 3 หมายเลข 9, 10, 11 และ 12 คือ สารสกัดท่ีแยกไดจากตัวทําละลาย เฮกเซน, C6H14 : CHCl3 (7:3), CHCl3 และ CHCl3 : CH3OH (6:4) ตามลําดับ
31
5. การทดสอบการยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อ Propionibacterium acnes จากการนําสารสกัดหยาบจากเปล ือกมังคุดภาคใต โดยการสกัดแบบสด มาแยกสารสกัดโดยวิธีคอลัมนโครมาโทกราฟ โดยใชตัวทําละลาย คือ CHCl3 : C6H6 (7:3) แลวนําสารสกัดท่ีแยกไดท่ีรวม fraction แลวไดท้ังหมด 9 fractions (ขอ 3.2 ภาพท่ี 12) มาทดสอบการยับยั้งการเจริญเติบโตของเช้ือ Propionibacterium acnes โดยวิธี agar diffusion พบวาไดผลดังแสดงในภาพท่ี16 สวนท่ีลูกศรชี้ ไดแก 1-3 (ภาพ A) และ 6-9 (ภาพ C) คือ สวนท่ีเปนบริเวณโซนใส แสดงวาสารสกัด fraction ท่ี 1-3 และ 6-9 สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเช้ือ Propionibacterium acnes ได แต fraction ท่ี 4-5 (ภาพ B) ไมปรากฏบริเวณโซนใส แสดงวาสารสกัด fraction ท่ี 4-5 ไมสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเช้ือ Propionibacterium acnes ได ซ่ึงไดมีรายงานการศึกษากอนนี้ พบวาสารสกัดจากมังคุดสามารถยับยั้ งการเจริญเติบโตของเช้ือแบคทีเรีย อ่ืนๆ อีกหลายชนิด เชน Mycobacterium tuberculosis (Suksamrarn, et al., 2003), vancomycin resistant Enterococci (VRE) และ methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) (Suksamrarn, et al., 2003) ดังนั้นมังคุดจึงเปนพืชสมุนไพรท่ีนาสนใจนํามาศึกษาวิจัยและพัฒนาเปนยา เคร่ืองสําอางตอไป
32
A
B
C
5 4
3 1 2
9 8 7 6
ภาพท่ี 16 ผลการทดสอบการยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อ Propionibacterium acnes โดยวิธี agar diffusion A คือ สารสกัด fraction ท่ี 1-3 B คือ สารสกัด fraction ท่ี 4-5 C คือ สารสกัด fraction ท่ี 6-9
33
6. การวิเคราะหสารสกัดท่ีแยกไดโดยวิธีโครมาโทกราฟของเหลวแบบสมรรถนะสูง (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) เม่ือนําสารสกัด fraction ท่ี 2 และ 7 ท่ีแยกไดจากคอลัมนโครมาโทกราฟ (ขอ 3.2 และ ภาพท่ี 12) ซ่ึงเปนสารสกัดจากเปลือกมังคุดจากภาคใต ท่ีสกัดแบบสด และเปนสวนท่ีสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเช้ือ Propionibacterium acnes ได มาวิเคราะหโดยวิธี HPLC โดยเปรียบเทียบกับสารมาตรฐาน 9-xanthone พบวา เวลาท่ีสารแตละชนิดใชผานคอลัมนจากจุดเร่ิมตนถึงจุดสูงสุดของพีก (retention time, tR) ของสารมาตรฐาน 9-xanthone คือ 27.069 นาที ดังภาพที่ 17 แตคา tR ของสารสกัด fraction ท่ี 2 และ 7 มีคามากกวา คือ คา tR ของสารสกัด fraction ท่ี 2 มีคาเทากับ 32.149, 35.132 และ 36.672 นาที ดังภาพที่ 18 แสดงวา สารสกัด fraction ท่ี 2 ประกอบ ดวยสารท้ังหมด 3 ชนิด สวนคา tR ของสารสกัด fraction ท่ี 7 มีคาเทากับ 32.222 และ 37.431 นาที ดังภาพท่ี 19 แสดงวาสาร fraction ท่ี 7 ประกอบดวยสารท้ังหมด 2 ชนิด และสารที่มีคา tR เทากับ 32.333 นาที มีปริมาณสารนอยมาก แตสารท่ีมีคา tR เทากับ 37.431 นาที มีปริมาณสารมาก แสดงวาสาร fraction ท่ี 7 คอน ขางบริสุทธ์ิ ซ่ึงคา tR ของสารสกัด fraction ท่ี 2 และ 7 ไมมีคาไหนเทากับคา tR ของสารมาตรฐาน 9-xanthone แสดงวา สารสกัด fraction ท่ี 2 และ 7 ไมใชสาร 9-xanthone แตอาจจะเปนสารท่ีเปน อนุพันธุของแซนโทน ซ่ึงเปนสารท่ีมีโครงสรางคลายกับ 9-xanthone แตมีขนาดโมเลกุลใหญกวา และอาจจะเปนสาร mangostin เนื่องจากมีรายงานการศึกษาของ Chomnawang et al. (2005) พบวา สารสกัดจากมังคุดท่ีสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเช้ือ Propionibacterium acnes ได เปนสาร mangostin นอกจากนี้ ไดทําการวิเคราะหสารสกัดท้ัง 9 fractions เปรียบเทียบกับสารมาตรฐาน 9-xanthoneโดยวิธี TLC เพื่อสนับสนุนผลจากการวิเคราะหโดยวิธี HPLC วา สารสกัด fraction ท่ี 2 และ 7 ไมใชสาร 9-xanthone และจากการวิเคราะหพบวา คา Rf ของสารมาตรฐาน 9-xanthone มีคามากกวาคา Rf ของสารสกัด fraction ท่ี 2 และ 7 คือ มีคาเทากับ 0.82 แตสารสกัด fraction ท่ี 2 และ 7 มีคาเทากับ 0.62 และ 0.17 ตามลําดับ ดังภาพที่ 20 แสดงวา สารสกัด fraction ท่ี 2 และ 7 ไมใชสาร 9-xanthone ซ่ึงสอดคลองกับผลจากการวิเคราะหโดยวิธี HPLC นอกจากนี้สารสกัด fraction ท่ี 1, 3-6, 8-9 มีคา Rf นอยกวาสารมาตรฐาน 9-xanthone แสดงวา สารสกัด fraction ดังกลาว ไมใชสาร 9-xanthone เชนกัน
34
ภาพท่ี 17 HPLC โครมาโทแกรมของสารมาตรฐาน 9-xanthone
ภาพท่ี 18 HPLC โครมาโทแกรมของสารสกัด fraction ท่ี 2 ซ่ึงเปนสารสกัดแบบสดจากเปลือก มังคุดจากภาคใต ท่ีไดจากการแยกสารสกัดดวยวิธีคอลัมนโครมาโทกราฟ
35
ภาพท่ี 19 HPLC โครมาโทแกรมของสารสกัด fraction ท่ี 7 ซ่ึงเปนสารสกัดแบบสดจากเปลือก มังคุดจากภาคใต ท่ีไดจากการแยกสารสกัดดวยวิธีคอลัมนโครมาโทกราฟ
Rf = 0.82
Rf = 0.62
Rf = 0.17
1 2 3 4 5 6 7 8 9 std.
ภาพท่ี 20 TLC โครมาโทแกรมของสารสกัดท้ัง 9 fractions ซ่ึงเปนสารสกัดแบบสดจากเปลือก มังคุดจากภาคใต ท่ีไดจากการแยกสารสกัดดวยวิธีคอลัมนโครมาโทกราฟเปรียบเทียบ กับสารมาตรฐาน 9-xanthone ในตัวทําละลาย CHCl3 : C6H6 (7:3)
36
สรุป 1. การสกัดสารจากเปลือกมังคุด (Fruit Hull) ท้ังแบบสดและแบบแหง ดวย 95% เอทานอลโดยมังคุดท่ีศึกษามี 2 แหลง คือ จันทบุรีและภาคใต พบวา เม่ือใชสภาวะของการสกัดเหมือนกัน (อัตราสวนการสกัด น้ําหนักเปลือกมังคุด : 95% เอทานอล เทากับ 30 กรัม : 100 มิลลิลิตร สกัดท่ี 4 องศาเซลเซียส เปนเวลา 7 วัน) จะไดปริมาณสารสกัดหยาบที่ใกลเคียงกัน 2. การแยกสารสกัดหยาบจากเปลือกมังคุดโดยวิธี TLC และ คอลัมนโครมาโทกราฟ พบวา CHCl3 : C6H6 (7:3) มีความเหมาะสมในการแยกสารสกัดหยาบแบบสดจากเปลือกมังคุดจากภาคใตในระดับหนึ่ง เนื่องจากยังมีบาง fraction ท่ีมีสารผสมกันอยู 3. สารสกัดแบบสดจากเปลือกมังคุดจากภาคใต ท่ีไดจากการแยกสารสกัดโดยวิธีคอลัมนโครมาโทกราฟ สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเช้ือแบคทีเรีย Propionibacterium acnes ได 4. สารสกัดท่ีสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเช้ือ Propionibacterium acnes ไมใชสาร 9-xanthone แตอาจเปนสารท่ีเปนอนุพันธุของแซนโทนชนิดอ่ืน ๆ
37
ขอเสนอแนะ 1. มังคุดเปนพืชสมุนไพรท่ีนาสนใจนํามาศึกษาวิจัยและพัฒนาเปนยาหรือเคร่ืองสําอาง เพื่อนํามาใชรักษาสิวอักเสบ เนื่องจากสารสกัดจากเปลือกมังคุดสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเช้ือแบคทีเรีย Propionibacterium acnes ไดดี 2. สารท่ีพบในเปลือกมังคุดมีหลายชนิด เชน แซนโทนและแทนนิน แตสารท่ีสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเช้ือแบคทีเรีย Propionibacterium acnes ไดดี อาจเปนสารท่ีเปนอนุพันธุของแซนโทน เนื่องจากสารแซนโทนมีฤทธ์ิลดอาการอักเสบและมีรายงานการศึกษากอนหนานี้พบวา สาร mangostin ซ่ึงเปนอนุพันธุของแซนโทนชนิดหนึ่ง ท่ีสกัดไดจากเปลือกมังคุด ดวย 95% เอทานอล สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเช้ือแบคทีเรียดังกลาวไดดี
38
เอกสารและสิ่งอางอิง จีรเดช มโนสรอย, เรวดี ทองใบ และ อรัญญา มโนสรอย. 2547. B: Biologycal Science,
SUSCEPTIBILITY TEST OF Propionibacterium acnes TO AROMATIC OIL SAMPLES EXTRACTED FROM MEDICINAL PLANTS BY BROTH MACRODILUTION METHOD. การประชุมวิชาการวทิยาศาสตรและเทคโนโลยีแหง ประเทศไทย คร้ังท่ี 30. แหลงท่ีมา: http://www.scisoc.or.th/stt/30/sec_b/paper/ stt30_B0041.pdf. 8 มกราคม 2550.
พิยดา แสงหิรัญ. 2548. การใชสารสกัดจากพืชสมุนไพรเพื่อยับยั้งการเจริญของ
Propionibacterium acnes. ปญหาพิเศษปริญญาตรี สายวิชาวิทยาศาสตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร. พงษศิริ วินจิฉัย, วารุณ ี ธนะแพทย, วุฒินนัท คงทัด, เจษฎาภรณ เรืองมะเริง, เชาวนี มีหวัง และ
สุพัฒนชลี ทรัพยเจริญ. 2549. O: Special Session, Antimicrobial property of the essential oil and crude extract from Patchouli leaves (Pogostemon cablin). การประชุมวิชาการวิทยาศาสตรและเทคโนโลยีแหง ประเทศไทย คร้ังท่ี 32. แหลงท่ีมา: http://www.scisoc.or. th/stt/32/sec_o/paper/stt32_O2_O0009.pdf. 8 มกราคม 2550.
วันดี กฤษณพนัธ. 2537. สมุนไพรนารู. จุฬาลงกรณมหาวิทยาลัย, กรุงเทพฯ. 257 น. สุวิมล สุรัสโม, วีณา นุกูลการ, วันด ี กฤษณพนัธ และ มัลลิกา ชมนาวัง. 2548. N: Science &
Technology of Thai Herbs, Effects of Thai Medicinal Plants on Inflammation caused by Acne-Inducing Bacteria. การประชุมวิชาการวิทยาศาสตรและเทคโนโลยีแหงประเทศไทย คร้ังท่ี 31. แหลงท่ีมา: http://www.scisoc.or.th/stt/31/sec_n/paper/stt31_N0011.pdf.
8 มกราคม 2550. Anonymous. 2006a. Flowers, developing mangosteens. www.mangosteen.com. แหลงท่ีมา:
http://www.mangosteen.com/Flowersanddevelopingmangosteens.htm. 8 มกราคม 2550.
39
Anonymous. 2006b. Fruit pictures page two. www.mangosteen.com. แหลงท่ีมา: http://www. mangosteen.com/FruitPicturesPageTwo.htm. 8 มกราคม 2550. Answers Corporation. 1999. mangostin. answers.com. แหลงท่ีมา:http://www.answers.com/ mangostin. 8 มกราคม 2550. Chomnawang, M.T., S. Surassmo, V.S. Nukoolkarn and W. Gritsanapanb. 2005. Antimicrobial
effects of Thai medicinal plants against acne-inducing bacteria. Journal of Ethnophar macology. 101(1-3): 330-333. Daniel, B., T. Drew, T. Ryo, S. Molly and K. Shrochis . 2006. Propionibacterium.
MicrobeWiki. แหลงท่ีมา: http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/ Propionibacterium.php/Propionibacterium. 8 มกราคม 2550.
Mahabusarakam, W., P. Wiriyachitra and W.C. Taylor, 1987. Chemical constituents of Garcinia mangostana. Journal of Natural Products. 50(3): 474–478. Nakatani, K., M. Atsumi, T. Arakawa, K. Oosawa, S. Shimura, N. Nakahata and Y. Ohizumi. 2002. Inhibition of histamine release and plostaglandin E2 synthesis by mangosteen, a thai medicine plant. Biol. Pharm. Bull. 25(9): 1137-1141. Nakatani, K., N. Nakahata, T. Arakawa, H.Yasuda and Y. Ohozumi. 2001. Inhibition of cyclo oxygenase and prostaglandin E2 synthesis by γ-mangostin, a xanthone derivative in
mangosteen, in C6 rat glioma cell. Biochemical Pharmacology. 63: 73-79. Sakagami, Y., M. Iinuma, K.G.N.P. Piyasena and H.R.W. Dharmaratne. 2005. Antibacterial
activity of α- mangostin against vancomycin resistant Enterococci (VRE) and synergism with antibiotics. Phytomedicine. 12: 203-208.
40
Suksamrarn, S., N. Suwannaopch, W. Phakhodee, J. Thanuhiranlert, P. Ratananukul, N. Chimnoi and A. Suksamrarn. 2003. Antimycobacterial Activity of Prenylated Xanthone from the Fruits of Garcinia mangostana. Chem. Pharm. Bull. 51(7): 857-859.
41
ประวัติการศึกษา
ช่ือ-สกุล นางสาวสมนกึ อูอรุณ ว/ด/ป เกิด 6 มิถุนายน พ.ศ. 2527 สถานท่ีเกิด จังหวดัสุพรรณบุรี ประวัติการศึกษา 1. ประถมศึกษาปท่ี 6 โรงเรียนนิคมสรางตนเองกระเสียว 1 อ.ดานชาง จ.สุพรรณบุรี 2. มัธยมศึกษาปท่ี 3 โรงเรียนดานชางวิทยา อ.ดานชาง จ.สุพรรณบุรี 3. มัธยมศึกษาปท่ี 6 โรงเรียนประชาราษฎรอุปถัมภ เขตหวยขวาง กรุงเทพมหานคร ทุนการศึกษา ทุนทํางานของคณะศิลปศาสตรและวิทยาศาสตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร วิทยาเขตกําแพงแสน จงัหวัดนครปฐม ปการศึกษา 2547
