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Eletroforese de DNA
IV Curso de Verão em Biologia Molecular e Genômica 05/02/2013
Elisa Beatriz Prestes
Arne Tiselius
Prêmio Nobel de Química – 1948
Eletroforese de DNA A partir de 1970, após advento da eletroforese de proteínas
Grupo fosfato
Pentose
Base nitrogenada
Qual a carga elétrica dos ácidos nucléicos?
Estrutura de um nucleotídeo
Em pH neutro, DNA tem carga elétrica negativa.
Eletroforese de ácidos nucléicos
Tipo de gel Moléculas pequenas
Moléculas médias
Moléculas grandes
Poliacrilamida 10 pb – 3 Kb
Agarose 100 pb – 60 Kb
PFGE* 50 Kb – 10 Mb
*Eletroforese de Campo Pulsado (do inglês Pulsed Field Gel Electrophoresis)
Fragmentos de DNA
Fragmentos de DNA
Plasmídeos
Cromossomos
Eletroforese em Agarose
Polissacarídeo composto por subunidades de galactose
Obtida a partir do ágar
Compõe a parede celular de algas
Agarose
Gel horizontal
Eletroforese em Agarose
Concentração do gel (%)
Faixa de separação (Kb)
0,3 5 – 60
0,6 1 – 20
0,7 0,8 – 10
0,9 0,5 – 7
1,2 0,4 – 6
1,5 0,2 – 3
2,0 0,1 – 2
Tamanho dos poros na matriz é determinado por % de agarose
Eletroforese em Poliacrilamida
Poliacrilamida
Acrilamida é monômero neurotoxina absorvida pela pele, com efeitos cumulativos
29 monômeros acrilamida: 1 Bis-acrilamida
Gel vertical
Eletroforese em Poliacrilamida
Polimerização da poliacrilamida depende de radicais livres (persulfato – APS), estabilizados
por TEMED.
Reação rápida de polimerização.
Fatores que influenciam a migração
Tamanho do DNA
Migração de forma end-on
Fragmentos pequenos percorrem maiores distâncias
que fragmentos grandes
Fatores que influenciam a migração
Conformação do DNA
Migração mais rápida de moléculas mais condensadas: supercoiled > linear > circular
Observação de 3 bandas no gel:
Fatores que influenciam a migração
Voltagem
Taxa de migração do DNA linear é proporcional à voltagem baixa aplicada
Faixa de separação diminui com o aumento
da voltagem
Fatores que influenciam a migração
Direção do campo elétrico
Direção única em géis de agarose e poliacrilamida
Mas moléculas > 50-100 Kb tendem a migrar na mesma taxa se direção do campo for igual...
Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)
Direção do campo elétrico muda, forçando moléculas a mudar de curso moléculas maiores
demoram mais para serem realinhadas
Separação de moléculas de até 10 Mb!
Fatores que influenciam a migração
Composição de bases e temperatura
Presença de corantes intercalantes
Mais importante para géis de poliacrilamida, em agarose estes fatores influenciam pouco
Brometo de etídio (grupo planar que se intercala entre as bases nitrogenadas) reduz a mobilidade do DNA em 5%
É vantajoso realizar a coloração após a corrida!
Corantes de ácidos nucléicos
Brometo de Etídio
Agente que se intercala ao DNA luz UV (laranja)
Carcinogênico, mutagênico e teratogênico
Corantes de ácidos nucléicos
SYBR Green
Agente que se intercala ao DNA luz UV (verde)
Potencialmente carcinogênico
Aplicação em PCR em tempo real (qPCR)
Fatores que influenciam a migração
Composição do tampão
Força iônica. Resistência ~ igual ao gel
Poucos íons: DNA migra pouco ou nada
Íons demais: condutância gera muito calor (gel derrete e DNA desnatura)