J. Bacteriol. 1989 Cameron 547 57

7/28/2019 J. Bacteriol. 1989 Cameron 547 57

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1989, 171(1):547.J. Bacteriol.

B Cameron, K Briggs, S Pridmore, G Brefort and J Crouzetdenitrificans.coenzyme B12 biosynthesis in PseudomonasCloning and analysis of genes involved in

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V o l . 1 7 1 , N o . 1O U R N A L OF B A C T E R I O L O G Y , J a n . 1 9 8 9 , p . 5 4 7 - 5 5 70 0 2 1 - 9 1 9 3 / 8 9 / 0 1 0 5 4 7 - 1 1 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t C ) 1 9 8 9 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

C l o n i n g a n d A n a l y s i s o f G e n e s I n v o l v e d i n Coenzyme B 1 2B i o s y n t h e s i s i n P s e u d o m o n a s d e n i t r i f i c a n sBEATRI C E C AM ERO N, t KATHLEEN B R I G G S , 4 SYLVIE PRIDMORE,GEORGES BREFORT,t A ND JOEL CROUZETt*

G e n e ' t i c a S . A . , 1 6 0 Q u a i d e P o l a n g i s , 9 4 3 4 0 J o i n v i l l e - l e - P o n t , F r a n c eR e c e i v e d 1 7 F e b r u a r y 1 9 8 8 / A c c e p t e d 4 O c t o b e r 1 9 8 8

C o b a l a m i n s y n t h e s i s p r o b a b l y r e q u i r e s 2 0 t o 3 0 d i f f e r e n t e n z y m a t i c s t e p s . P s e u d o m o n a s p u t i d a a n dA g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s m u t a n t s d e f i c i e n t i n c o b a l a m i n s y n t h e s i s ( C o b m u t a n t s ) h a v e b e e n i s o l a t e d . I n P .p u t i d a , C o b m u t a n t s w e r e i d e n t i f i e d a s b e i n g u n a b l e t o u s e e t h a n o l a m i n e a s a s o u r c e o f n i t r o g e n i n t h e a b s e n c eo f a d d e d c o b a l a m i n ( d e a m i n a t i o n o f e t h a n o l a m i n e r e q u i r e s c o e n z y m e B 1 2 a s a c o f a c t o r ) . I n A . t u m e f a c i e n s , C o bm u t a n t s w e r e s i m p l y s c r e e n e d f o r t h e i r r e d u c e d c o b a l a m i n s y n t h e s i s . A g e n o m i c l i b r a r y o f P s e u d o m o n a sd e n i t r i f i c a n s w a s c o n s t r u c t e d o n a m o b i l i z a b l e w i d e - h o s t - r a n g e v e c t o r . E l e v e n p l a s m i ds f r o m t h i s l i b r a r y w e r ea b l e t o c o m p l e m e n t m o s t o f t h e s e m u t a n t s . B y c o m p l e m e n t a t i o n a n d r e s t r i c t i o n m a p p i n g a n a l y s i s , f o u r g e n o m i cl o c i o f P . d e n i t r i f i c a n s w e r e f o u nd t o b e r e s p o n s i b l e f o r c o m p l e m e n t a t i o n o f t h e C o b m u t a n t s . B y s u b c l o n i n gf r a g m e n t s f r o m t h e f o u r g e n o m i c l o c i , w e i d e n t i f i e d a t l e a s t 1 4 d i f f e r e n t g e n e s i n v o l v e d i n c o b a l a m i n s y n t h e s i s .C o b a l a m i n s a r e a m o n g t h e m o s t c o m p l e x n o n p o l y m e r i cn a t u r a l p r o d u c t s k n o w n ( 4 ) . T h e c o e n z y m e B 1 2 b i o s y n t h e t i cp a t h w a y c o n t a i n s t h e f o l l o w i n g s t e p s ( F i g . 1 ) : ( i ) f o r m a t i o no f u r o p o r p h y r i n o g e n I I I , t h e common i n t e r m e d i a t e f o r t h es y n t h e s i s o f h e m e s , c h l o r o p h y l l s , c o b a l a m i n , s i r o h e m e s , a n dF 4 3 0 ( 2 3 ) ; ( i i ) c o n v e r s i o n o f u r o p o r p h y r i n o g e n I I I i n t o c o b y -r i n i c a c i d ; ( i i i ) f o r m a t i o n o f c o b i n a m i d e f r o m c o b y r i n i c a c i d ;a n d ( i v ) c o n v e r s i o n o f c o b i n a m i d e i n t o c o e n z y m e B 1 2 ( f o rr e v i e w s o n c o b a l a m i n b i o s y n t h e s i s , s e e r e f e r e n c e s 3 , 2 2 , 2 6 ,4 1 , a n d 4 6 ) . U r o p o r p h y r i n o g e n I I I i s s y n t h e s i z e d i n f o u rd i s t i n c t a n d w e l l - k n o w n e n z y m a t i c s t e p s f r o m s u c c i n y l c o -e n z y m e A a n d g l y c i n e ( 3 ) . I n c o n t r a s t , t h e b i o s y n t h e t i cp a t h w a y f r o m u r o p o r p h y r i n o g e n I I I t o c o e n z y m e B 1 2 i s n o t

c l e a r l y u n d e r s t o o d , s i n c e o n l y o n e e n z y m a t i c a c t i v i t y h a sb e e n p a r t i a l l y p u r i f i e d ( 3 8 ) a n d t h e p r e c i s e n u m b e r o f e n z y -m a t i c s t e p s i s n o t k n o w n . I n a d d i t i o n , t h e i n t e r m e d i a t e sb e t w e e n p o r p h o b i l i n o g e n a n d c o b y r i n i c a c i d a r e v e r y u n s t a -b l e a n d s e n s i t i v e t o o x y g e n ( 3 ) .C l o n i n g o f g e n e s c o d i n g f o r e n z y m e s i n v o l v e d i n a d e n o s y l -c o b a l a m i n b i o s y n t h e s i s a n d t h e a s s o c i a t e d r e g u l a t o r y g e n e sw o u l d b e a v a l u a b l e t o o l i n u n d e r s t a n d i n g t h e p a t h w a y . T h ei s o l a t i o n a n d g e n e t i c c h a r a c t e r i z a t i o n o f m u t a n t s b l o ck ed i nc o b a l a m i n b i o s y n t h e s i s i n S a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m a n d B a -c i l l u s m e g a t e r i u m h a v e b e e n r e c e n t l y d e s c r i b e d ( 2 9 , 3 0 , 4 8 ) .T h r e e b a c t e r i a a r e p r e s e n t l y u s e d i n i n d u s t r y f o r v i t a m i nB 1 2 p r o d u c t i o n : P s e u d o m o n a s d e n i t r i f i c a n s , P r o p i o n i b a c t e -r i u m s h e r m a n i i , a n d P r o p i o n i b a c t e r i u m f r e u d e n r e i c h i i ( 1 9 ) .We r e p o r t h e r e a g e n e t i c s t u d y o f c o e n z y m e B 1 2 b i o s y n t h e s i si n a P . d e n i t r i f i c a n s s t r a i n o f i n d u s t r i a l i n t e r e s t ( 1 9 ) . We h a v ei s o l a t e d m u t a n t s o f P s e u d o m o n a s p u t i d a a n d A g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s t h a t a r e d e f i c i e n t i n t h e s y n t h e s i s o f c o b a l a m i n( C o b m u t a n t s ) . T h e s e b a c t e r i a w e r e u s e d t o i s o l a t e C o bm u t a n t s f o r t w o r e a s o n s : ( i ) m o l e c u l a r g e n e t i c t e c h n i q u e s a r e* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .t P r e s e n t a d d r e s s : L a b o r a t o i r e d e G d n d t i q u e , I n s t i t u t d e B i o t e c h -n o l o g i e , C e n t r e d e R e c h e r c h e d e V i t r y , R h 6 n e - P o u l e n c S a n t e , 9 4 4 0 3V i t r y s u r S e i n e C e d e x , F r a n c e .t P r e s e n t a d d r e s s : Amersham I n t e r n a t i o n a l P . L . C . , A m e r s h a m ,B u c k i n g h a m s h i r e HP7 9 L L , E n g l a n d . P r e s e n t a d d r e s s : 5 2 H a b s b a r g e r S t r a s s e , 4 3 1 0 R h e i n f e l d e n ,S w i t z e r l a n d .

f a r m o r e e s t a b l i s h e d i n P . p u t i d a a n d A . t u m e f a c i e n s t h a n i nP . d e n i t r i f i c a n s ( 2 , 2 5 ) , a n d ( i i ) t h e s e m u t a n t s a r e , l i k e P .d e n i t r i f i c a n s , g r a m - n e g a t i v e a e r o b i c r o d s t h a t s y n t h e s i z ec o b a l a m i n . We c o n s t r u c t e d a g e n o m i c l i b r a r y o f P . d e n i t r i -f i c a n s o n a m o b i l i z a b l e w i d e - h o s t - r a n g e v e c t o r , a n d t h i sl i b r a r y w a s u s e d t o c o m p l e m e n t P . p u t i d a a n d A . t u m e f a -c i e n s C o b m u t a n t s i n o r d e r t o c l o n e g e n e s f r o m t h e c o b a -l a m i n b i o s y n t h e t i c p a t h w a y . F o u r g e n o m i c f r a g m e n t s o f P .d e n i t r i f i c a n s w e r e f o u n d t o b e r e s p o n s i b l e f o r c o m p l e m e n -t a t i o n o f m o s t o f t h e m u t a n t s , w h i c h w e r e c l a s s i f i e d i n t o 1 4c o m p l e m e n t a t i o n g r o u p s .MATERIALS A ND METHODS

B a c t e r i a l s t r a i n s a n d p l a s m i d s . U n l e s s o t h e r w i s e s p e c i f i e d ,c h e m i c a l s w e r e p u r c h a s e d f r o m S i g m a C h e m i c a l C o . , S t .L o u i s , M o . B a c t e r i a l s t r a i n s a n d p l a s m i d s u s e d a r e l i s t e d ,w i t h t h e i r r e l e v a n t c h a r a c t e r i s t i c s , i n T a b l e 1 . S t r a i n s r e l a t e dt o S C 5 1 0 a r e u s e d f o r t h e i n d u s t r i a l p r o d u c t i o n o f v i t a m i nB 1 2 ( 1 9 ) . S t r a i n S C 5 1 0 , w h i c h i s c h a r a c t e r i z e d b y s i g n i f i -c a n t l y i m p r o v e d c o b a l a m i n p r o d u c t i v i t y , w a s d e r i v e d f r o ms t r a i n M B 5 8 0 , o r i g i n a l l y d e f i n e d a s a s t r a i n o f P . d e n i t r i f i -c a n s ( R h o n e - P o u l e n c S a n t e , U . S . p a t e n t 3 , 0 1 8 , 2 2 5 ) , a f t e rn u m e r o u s c h e m i c a l a n d p h y s i c a l m u t a g e n e s i s s t e p s . A l -t h o u g h t h e t a x o n o m i c v a l i d i t y o f t h e s p e c i e s P . d e n i t r i f i c a n si s q u e s t i o n a b l e ( 1 4 ) , we r e t a i n t h i s t a x o n o m i c d e f i n i t i o n f o rs t r a i n s d e r i v e d f r o m M B 5 8 0 , i n a c c o r d a n c e w i t h p r e v i o u sp u b l i c a t i o n s ( 1 7 , 3 3 , 4 7 ) . R i f a m p i n - r e s i s t a n t i s o l a t e s w e r eo b t a i n e d b y s p r e a d i n g f r e s h c u l t u r e ( 5 x 1 0 9 c e l l s p e r m l ) o nLB a g a r m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h 1 0 0 m g o f r i f a m p i n p e rl i t e r . R e s i s t a n t c o l o n i e s w e r e s t r e a k e d o n LB a g a r m e d i u mc o n t a i n i n g r i f a m p i n t o o b t a i n s i n g l e - c o l o n y i s o l a t e s , s o m e o fw h i c h w e r e c h e c k e d f o r p a r e n t a l c h a r a c t e r i s t i c s . T o o b t a i nn a l i d i x i c a c i d - r e s i s t a n t i s o l a t e s , a s i m i l a r p r o c e d u r e w a su s e d a t a n a l i d i x i c a c i d c o nc e n t r a t i o n o f 2 0 m g / l i t e r .M e d i a , b a c t e r i o l o g i c a l t e c h n i q u e s , a n d c h e m i c a l s . F o r r o u -t i n e c u l t u r e , a l l b a c t e r i a w e r e g r o w n i n LB m e d i u m ( 3 6 ) a t3 7 C f o r E s c h e r i c h i a c o l i a n d a t 3 0 C f o r P . d e n i t r i f i c a n s , P .p u t i d a , a n d A . t u m e f a c i e n s . P S 4 m e d i u m u s e d f o r t h ep r o d u c t i o n o f c o b a l a m i n , d e r i v e d f r o m t h e m e d i u m o f L a g oa n d D e m a i n ( 3 4 ) , c o n s i s t e d o f s u c r o s e ( 3 0 g / l i t e r ) , g l u t a m i ca c i d ( 5 . 8 g / l i t e r ) , NZ c a s e ( K r a f t I n c . , N o r w i c h , E n g l a n d ) ( 1 0g / l i t e r ) , b e t a i n e ( 1 0 g / l i t e r ) , MgSO4 - 7 H 2 0 ( 1 . 5 g / l i t e r ) ,

5 4 7


3/12

5 4 8 CAMERON ET AL.

UROPORPHYRINOGEN I I IC O C H

COBYRINIC ACID

HEMES

" P I ' , )

( I V )

2 v

O C

COBINAMIDEF I G . 1 . C o b a l a m i n b i o s y n t h e t i c p a t h w a y . R = C H 3 , M e t h y l c o b a l a m i n ; R = OH, h y d r o x o c o b a l a m i n , R = 5 ' - d e o x y a d e n o s y l , a d e n o s y l -c o b a l a m i n ; R = CN, c y a n o c o b a l a m i n ; X , c o b a l t l i g a n d s ( e . g . , O H - ) ; C o A , c o e n z y m e A . Th e c o b a l a m i n p a t h w a y c o nt a i n s t h e f o l l o w i n g s t e p s :( i ) f o r m a t i o n o f u r o p o r p h y r i n o g e n I I I ; ( i i ) c o n v e r s i o n o f u r o p o r p h y r i n o g e n I I I t o c o b y r i n i c a c i d , w h i c h r e q u i r e s e i g h t m e t h y l a t i o n s ,d e c a r b o x y l a t i o n o f t h e a c e t i c a c i d s i d e c h a i n a t C - 1 2 , l o s s o f C - 2 0 , a n d i n s e r t i o n o f c o b a l t ( I I I ) ( 3 , 4 1 , 4 2 ) ; ( i i i ) f o r ma t i o n o f c o b i n a m i d e f r o mc o b y r i n i c a c i d t h r o u g h s i x a m i d a t i o n s a n d t h e a d d i t i o n o f a m i n o p r o p a n o l ( 2 2 ) ; a n d ( i v ) c o n v e r s i o n o f c o b i n a m i d e t o c o e n z y m e B 1 2 , w h i c hi n c l u d e s p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e a m i n o p r o p a n o l r e s i d u e a n d a d d i t i o n o f GMP f r o m GT P a n d o f t h e l o w e r b a s e , 5 , 6 - d i m e t h y l b e n z i m i d a z o l e ,

t o f o r m c o b a l a m i n p h o s p h a t e , w h i c h , a f t e r d e p h o s p h o r y l a t i o n , g i v e s c o e n z y m e B 1 2 ( 2 6 ) .( N H 4 ) 2 H P 0 4 ( 3 g / l i t e r ) , MnSO4* H20 ( 0 . 0 2 g / l i t e r ) , ZnSO4 .7H20 ( 0 . 0 2 g f l i t e r ) , F e S O 4 * 7H20 ( 0 . 0 3 g / l i t e r ) , MoO3Na-2H20 ( 0 . 0 0 5 g / l i t e r ) , C o C l 2 - 6H20 ( 0 . 1 2 g / l i t e r ) , K C I ( 0 . 9 g /l i t e r ) , a n d 5 , 6 - d i m e t h y l b e n z i m i d a z o l e ( 0 . 0 4 5 g / l i t e r ) . C o b a l ta n d 5 , 6 - d i m e t h y l b e n z i m i d a z o l e ar e i n c o r p o r a t e d i n t o c o b a -l a m i n , a n d b e t a i n e i s known t o s t i m u l a t e v i t a m i n B 1 2 pro-d u c t i o n ( 1 7 ) . E t h medium c o n s i s t e d o f g l uc os e ( 4 g / l i t e r ) ,K2HPO4 ( 7 g / l i t e r ) , KH2PO4 ( 3 g / l i t e r ) , N a 2 S O 4 (1 g / l i t e r ) ,MgSO4. 7H20 ( 0 . 2 5 g / l i t e r ) , a n d e t h a n o l a m i n e ( 1 m l / l i t e r ) a sa n i t r o g e n source. V i t a m i n B 1 2 o r c o b i n a m i d e d i c y a n i d e was

a d d e d a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 p L g / m l . F o r E . c o l i , a n t i b i o t i c sw e r e u s e d a t t h e f o l l o w i n g c o n c e n t r a t i o n s : k a n a m y c i n s u l -f a t e , 1 0 0 m g / l i t e r ; t e t r a c y c l i n e h y d r o c h l o r i d e , 1 2 m g / l i t e r ;a n d s p e c t i n o m y c i n d i h y d r o c h l o r i d e , 5 0 m g / l i t e r . F o r P .p u t i d a a n d A . t u m e f a c i e n s , t h e c o n c e n t r a t i o n s u s e d w e r e :k a n a m y c i n s u l f a t e , 5 0 m g / l i t e r ; l i v i d o m y c i n s u l f a t e ( R h o n e -P o u l e n c S a n t e ) , 1 0 0 m g / l i t e r ; r i f a m p i n , 1 0 0 m g / l i t e r ; a n dn a l i d i x i c a c i d , 2 0 m g / l i t e r . P . p u t i d a a n d A . t u m e f a c i e n sc o b a l a m i n p r o d u c t i o n was d e t e r m i n e d b y u s i n g t h e f o l l o w i n gp r o c e d u r e : ( i ) a c o l o n y f r o m a f r e s h r e i s o l a t e was c u l t u r e d i n

SUCCINYL C o AC O N C

C O N H

L 2GLYCINE

COBALAMIN

J . B A C T E R I O L .

HOOC


4/12

C O E N Z Y M E B 1 2 BIOSYNTHESIS I N P . DENITRIFICANS 5 4 9TABLE 1 . B a c t e r i a l s t r a i n s a n d p l a s m i d s u s e d

B a c t e r i a l s t r a i n o r p l a s m i d R e l e v a n t g e n o t y p e , p h e n o t y p e , o r p r o p e r t i e s S o u r c e o r r e f e r e n c eS t r a i nE . c o l iM C 1 0 6 0 A ( l a c I P O Z YA ) X 7 4 g a l U g a l K s t r A 2 h s d R 9LG90 A ( l a c - p r o ) X I I I ATCC 3 7 1 1 4

J 5 3 n a l P r o M e t 51 1 3 - 3 m e t E 1 11 1 3 - 3 C b l l M u t a n t o f 1 1 3 - 3 t h a t c a n n o t c o n v e r t c o b i n a m i d e d i c y a n i d e t o T h i s p a p e rc o b a l a m i nP . p u t i d aK T 2 4 4 0 r - m + 2K T 2 4 4 0 R i f N a l r S p o n t a n e o u s n a l i d i x i c a c i d - a n d r i f a m p i n - r e s i s t a n t d e r i v a t i v e o f T h i s p a p e rK T 2 4 4 0 R i fP . d e n i t r i f i c a n s S C 5 1 0 H i g h - c o b a l a m i n - p r o d u c i n g s t r a i n o b t a i n e d f r o m MB580 ( U . S . p a t e n t R h 6 n e - P o u l e n c S a n t d3 , 0 1 8 , 2 2 5 ) b y n u m e r o u s r a n d o m - s c r e e n i n g m u t a g e n e s i s c y c l e sA . t u m e f a c i e n sC 5 8 - C 9 S t r a i n C 5 8 c u r e d o f i t s T i p l a s m i d 2 5C 5 8 - C 9 R i f r N a l r S p o n t a n e o u s n a l i d i x i c a c i d - a n d r i f a m p i n - r e s i s t a n t d e r i v a t i v e o f C 5 8 - C 9 T h i s p a p e rP l a s m i dp R K 2 0 1 3 C o l E l Km r T r a + ( R K 2 ) 1 8p R K 2 0 7 3 ( p R K 2 0 1 3 : : T n 7 ) C o l E 1 S p ' T p r T r a + ( R K 2 ) 3 5p F R 1 0 C o l E l m u l t i p l e - s i t e c l o n i n g p o l y l i n k e r 4 3p F R 2 3 7 i n c Q Kmr M o b ' F . R i c h a u d , u n p u b l i s h e d d a t ap X L 5 9 i n c Q Km r M o b ' T h i s p a p e rp K T 2 3 0 i n c Q Km r S m r M o b ' 2p X L 4 3 5 i n c Q Kmr M o b ' m u l t i c l o n i n g s i t e T h i s p a p e rp J B 4 J 1 i n c P p P H I J 1 : : M u : : T n 5 5p R K 2 0 1 3 : : T n S C o l E l Km r T r a + ( R K 2 ) T h i s p a p e r

a 2 5 0 - m l E r l e n m e y e r f l a s k c o n t a i n i n g 2 5 m l o f P S 4 m e d i u m ;( i i ) a f t e r i n c u b a t i o n ( 4 d a y s f o r P . p u t i d a a n d 5 d a y s f o r A .t u m e f a c i e n s ) o n a r o t a r y s h a k e r a t 3 0 C , 1 m l o f t h e c u l t u r ew a s c y a n u r a t e d w i t h 1 m l o f a s o l u t i o n o f 5 0 % ( v o l / v o l )a c e t o n i t r i l e - 7 5 mM KC N a n d i n c u b a t e d f o r 1 h a t 5 6 C ;d u r i n g t h i s t r e a t m e n t , c e l l s w e r e l y s e d a n d c o b a l a m i n s w e r ec o n v e r t e d t o t h e m o r e s t a b l e c y a n o f o r m s , w h i c h c o u l d b ea s s a y e d .G e n e r a l m e t h o d s . G e n o m i c d i g e s t s w e r e o b t a i n e d b y i n c u -b a t i n g 5 j x g o f DNA w i t h 2 0 U o f r e s t r i c t i o n e n z y m e ( N e wE n g l a n d B i o L a b s , I n c . , B e v e r l y , M a s s . ) f o r 2 h . P l a s m i d sa n d DNA f r a g m e n t s w e r e l a b e l e d b y n i c k t r a n s l a t i o n w i t h[ a - 3 2 P ] d C T P a s d e s c r i b e d e l s e w h e r e ( 4 0 ) . E . c o l i s t r a i n sw e r e t r a n s f o r m e d b y t h e s t a n d a r d c a l c i u m c h l o r i d e p r o c e -d u r e ( 3 6 ) . A g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s , p u r i f i c a t i o n o f DNAf r a g m e n t s , p r e p a r a t i o n o f p l a s m i d DNA, a n d S o u t h e r n b l o t -t i n g w e r e c a r r i e d o u t a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 6 , 3 6 ) . G e -n o m i c DNA w a s p r e p a r e d a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o fS h e p a r d a n d P o l i s k y ( 4 4 ) .M u t a g e n e s i s . E . c o l i , P . p u t i d a , a n d A . t u m e f a c i e n s w e r em u t a g e n i z e d w i t h N - m e t h y l - N ' - n i t r o - N - n i t r o s o g u a n i d i n e a c -c o r d i n g t o p u b l i s h e d p r o c e d u r e s ( 3 7 ) . T n S t r a n s p o s o n m u t a -g e n e s i s w a s c a r r i e d o u t b y u s i n g e i t h e r p R K 2 0 1 3 : : T n S ( c o n -s t r u c t e d i n t h i s l a b o r a t o r y b y a T n S i n s e r t i o n i n t o p R K 2 0 1 3 ;d a t a n o t s h o w n ) o r p J B 4 J 1 , e a c h o f w h i c h i s a T n 5 - c a r r y i n gp l a s m i d . p R K 2 0 1 3 : : T n 5 a n d p J B 4 J 1 a r e s e l f - t r a n s m i s s i b l ep l a s m i d s ( 5 ) ; t h e y d o n o t r e p l i c a t e i n b a c t e r i a s u c h a s P .p u t i d a a n d A . t u m e f a c i e n s ( p R K 2 0 1 3 h a s o n l y t h e o r i g i n o fr e p l i c a t i o n o f C o l E l [ 1 8 ] , a n d p J B 4 J 1 c o n t a i n s b a c t e r i o p h a g eM u , w h i c h p r e v e n t s t h e e s t a b l i s h m e n t i n n o n - E n t e r o b a c -t e r i a c e a e o f t h e c a r r i e r p l a s m i d [ 5 ] ) . T h e s e p l a s m i d s w e r ei n t r o d u c e d i n t o t h e b a c t e r i a t o b e m u t a g e n i z e d b y m a t i n g t h ed o n o r o r g a n i s m , H B 1 O 1 ( p R K 2 0 1 3 : : T n S ) o r J 5 3 ( p J B 4 J 1 ) , a n dt h e r e c i p i e n t o r g a n i s m , K T 2 4 4 0 R i f N a l r o r C 5 8 - C 9 R i f ' N a l ra n d s e l e c t i n g r i f a m p i n - , n a l i d i x i c a c i d - , a n d k a n a m y c i n -r e s i s t a n t c l o n e s .

S c r e e n i n g f o r C o b m u t a n t s o f A . t u m e f a c i e n s a n d P . p u t i d a .I n t h e c a s e o f P . p u t i d a m u t a n t s , e a c h s i n g l e c o l o n y o b t a i n e da f t e r m u t a g e n e s i s w a s t r a n s f e r r e d t o 1 0 0 , u o f 1 0 mM MgSO4i n a 9 6 - w e l l m i c r o d i l u t i o n p l a t e . A d r o p o f e a c h s u s p e n s i o nw a s t r a n s f e r r e d , b y u s i n g a r e p l i c a t i n g d e v i c e , f r o m t h em i c r o d i l u t i o n p l a t e o n t o a s q u a r e p l a t e o f E t h m e d i u m w i t ho r w i t h o u t v i t a m i n B 1 2 i n o r d e r t o i d e n t i f y c l o n e s t h a t w e r ea u x o t r o p h s f o r v i t a m i n B 1 2 . F o r A . t u m e f a c i e n s , e a c h c o l o n yo b t a i n e d a f t e r m u t a g e n e s i s w a s i n d i v i d u a l l y t r a n s f e r r e d t o1 0 0 R I o f P S 4 m e d i u m i n a 9 6 - w e l l m i c r o d i l u t i o n p l a t e . A f t e ri n c u b a t i o n a n d c y a n u r a t i o n , t h e C o b m u t a n t s w e r e d e t e c t e db y m i c r o b i o l o g i c a l a s s a y o r e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n ta s s a y ( E L I S A ) .M o b i l i z a t i o n o f p l a s m i d D NA f r o m E . c o l i t o o t h e r g r a m -n e g a t i v e b a c t e r i a . T r i p a r e n t a l m a t i n g ( 1 3 ) w a s c a r r i e d o u t b ym i x i n g t h e r e c i p i e n t s t r a i n ( P . p u t i d a o r A . t u m e f a c i e n s ) w i t hH B 1 O 1 ( p R K 2 0 7 3 ) a n d t h e E . c o l i s t r a i n c a r r y i n g t h e m o b i -l i z a b l e p l a s m i d t o b e t r a n s f e r r e d . C l o n e s o f t h e g e n o m i cl i b r a r y s t o r e d i n H o g n e s s f r e e z i n g m e d i u m w e r e m o b i l i z e da s d e s c r i b e d e l s e w h e r e ( 2 1 ) . T h e t r a n s c o n j u g a n t s w e r e s e -l e c t e d o n LB m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h r i f a m p i n a n dn a l i d i x i c a c i d f o r s e l e c t i o n o f t h e r e c i p i e n t b a c t e r i a a n d w i t hk a n a m y c i n o r l i v i d o m y c i n f o r d e t e r m i n a t i o n o f t h e p r e s e n c eo f t h e p l a s m i d . L i v i d o m y c i n was u s e d f o r s e l e c t i o n o f pXL59d e r i v a t i v e s i n T n 5 m u t a n t s o f A . t u m e f a c i e n s a n d P . p u t i d as i n c e t h e e n z y m e , a m i n o g l y c o s i d e - O - p h o s p h o t r a n s f e r a s e( 3 ' ) I , e n c o d e d b y pXL59 ( o r i g i n a t i n g f r o m T n 9 O 3 ) c o n f e r sl i v i d o m y c i n r e s i s t a n c e , c o n t r a r y t o a m i n o g l y c o s i d e - O -p h o s p h o t r a n s f e r a s e ( 3 ' ) I I f r o m T n S ( 2 0 ) .C o m p l e m e n t a t i o n o f c o b a l a m i n - d e f i c i e n t m u t a n t s o f P . p u -t i d a a n d A . t u m e f a c i e n s . A f t e r t r a n s f e r o f p l a s m i d s f r o m t h eg e n o m i c l i b r a r y i n t o m u t a n t s , w e s c r e e n e d f o r c o m p l e m e n t -i n g p l a s m i d s . I n t h e c a s e o f P . p u t i d a , t r a n s c o n j u g a n t s w e r er e p l i c a t e d o n E t h m e d i u m w i t h o r w i t h o u t v i t a m i n B 1 2 ; a f t e r3 d a y s o f i n c u b a t i o n , c l o n e s t h a t w e r e a b l e t o g r o w o n b o t hm e d i a w e r e r e i s o l a t e d a n d t h e i r c o b a l a m i n p r o d u c t i o n w a s

V O L . 1 7 1 , 1 9 8 9


5/12

5 5 0 CAMERON ET A L .s t u d i e d . I n t h e c as e o f A . t u m e f a c i e n s , t r a n s c o n j u g a n t s w e r ei n o c u l a t e d 8 8 b y 8 8 i n t o a 9 6 - w e l l m i c r o d i l u t i o n p l a t e , e a c hw e l l c o n t a i n i n g 1 0 0 , u l o f P S 4 m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t hk a n a m y c i n o r l i v i d o m y c i n . A f t e r i n c u b a t i o n a n d c y a n u r a -t i o n , v i t a m i n B 1 2 p r o du c t i o n w a s m e a s u r e d b y t h e m i c r o b i -o l o g i c a l a s s a y . C o b a l a m i n p r o d u c t i o n b y p o s i t i v e c l o n e s i n a2 5 0 - m l E r l e n m e y e r f l a s k w a s c o m p a r e d w i t h t h e l e v e l o fc o b a l a m i n s y n t h e s i z e d b y t h e m u t a n t a l o n e o r t h e m u t a n tc o n t a i n i n g p X L 5 9 . M u t a n t s w e r e c o ns i d er e d c o m p l e m e n t e df o r t h e C o b m u t a t i o n w h e n t h e c o b a l a m i n l e v e l w a s c o m p a -r a b l e w i t h t h a t o f t h e p a r e n t s t r a i n .V i t a m i n B 1 2 a s s a y s . T h r e e t y p e s o f a s s a y s w e r e a l t e r n a -t i v e l y u s e d t o d e t e r m i n e c o b a l a m i n c o n c e n t r a t i o n s : ( i ) am i c r o b i o l o g i c a l a s s a y f o r w h i c h t h e i n d i c a t o r s t r a i n i s a n E .c o l i v i t a m i n B 1 2 a u x o t r o p h ( 1 1 3 - 3 o r 1 1 3 - 3 C b l l ) ; ( i i ) ar a d i oc h e mi c a l a s s a y d e r i v e d f r o m a m e t h o d p r e v i o u s l y p u b -l i s h e d ( 2 4 ) t h a t u s e s i n t r i n s i c f a c t o r ( I F ) o r n o n i n t r i n s i cf a c t o r ( N I F ) ( f r o m p o r c i n e g a s t r i c m u c o s a ) ; a n d ( i i i ) a nELISA t h a t i n v o l v e s I F a n d a n a n t i - B 1 2 - K L H g o a t s e r u m .T h e s e a s s a y s a r e s e n s i t i v e i n t h e r a n g e o f 1 0 t o 8 0 , 0 . 0 2 t o0 . 0 8 , a n d 1 t o 5 , u g o f v i t a m i n B 1 2 p e r l i t e r , r e s p e c t i v e l y . T h es t a n d a r d d e v i a t i o n w a s 5% f o r t h e r a d i o c h e m i c a l a s s a y a n da r o u n d 1 5 % f o r t h e m i c r o b i o l o g i c a l a s s a y a n d E L I S A . T h em i c r o b i o l o g i c a l a s s a y w a s c a r r i e d o u t a s d e s c r i b e d p r e v i -o u s l y ( J . C r o u z e t , t h e s e d e d o c t e u r i n g e n i e u r , I n s t i t u t N a -t i o n a l A g r o n o m i q u e d e P a r i s - G r i g n o n , P a r i s , 1 9 8 7 ) .I n t h e r a d i o c h e m i c a l a s s a y , I F a n d NIF b i n d 5 7 C o - l a b e l e d ,3 H - l a b e l e d , a n d n o n r a d i o a c t i v e c y a n o c o b a l a m i n s i n d i s c r i m -i n a t e l y b u t d i s p l a y d i f f e r e n t s p e c i f i c i t i e s , s i n c e v i t a m i n B 1 2a n d c o b i n a m i d e b i n d t o NIF w i t h s i m i l a r a f f i n i t i e s w h e r e a sc o b i n a m i d e d oe s n o t b i n d t o I F , w h i c h i s m o r e s p e c i f i c f o rt h e a s s a y o f v i t a m i n B 1 2 a n d r e l a t e d p r o d u c t s ( 3 9 ) . T o a s s a y4 0 0 , u l o f a v i t a m i n B 1 2 s a m p l e , 3 2 5 p u l o f a s o l u t i o n o f 3 5 0mM T r i s h y d r o c h l o r i d e ( p H 1 0 ) , 7 5 mM N a C l , a n d 1 . 5 mg o fb o v i n e s e r u m a l b u m i n p e r m l , c o n t a i n i n g 1 0 n C i o f c y a n o [ G -3 H ] c o b a l a m i n ( 4 . 4 C i / m m o l ; A m e r s h a m , U n i t e d K i n g d o m )a n d 1 5 U o f I F o r N I F , w a s a d d e d . A f t e r i n c u b a t i o n f o r 1 ha t 3 7 C , 2 5 0 p . l o f a s u s p e n s i o n c o n t a i n i n g 2 . 5 % a c t i v a t e dc h a r c o a l a n d 0 . 5 % b o v i n e s e r u m a l b u m i n w a s a d d e d t o t h es o l u t i o n . A f t e r a 5 - m i n i n c u b a t i o n a t r o o m t e m p e r a t u r e , t h ec h a r c o a l w a s r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n ( t h e f r e e f o r m s o fc o b a l a m i n s a n d c o b i n a m i d e s b i n d t o a c t i v a t e d c h a r c o a l ,w h e r e a s I F o r NI F c o m p l e x e s d o n o t ) , t h u s a l l o w i n g e l i m i -n a t i o n o f t h e u n b o u n d c o r r i n o i d s ; t h e a m o u n t o f r a d i o a c t i v -i t y b o u n d t o I F o r NI F w a s t h e n m e a s u r e d b y c o u n t i n g t h er a d i o a c t i v i t y p r e s e n t i n t h e s u p e r n a t a n t . I f c y a n o [ 5 7 C o ]c o b a l a m i n ( 1 8 0 t o 3 0 0 p u C i / , u g ) w a s u s e d , t h e s e n s i t i v i t y o ft h e a s s a y c o u l d b e i m p r o v e d b y a f a c t o r o f 2 0 0 , t h u s a l l o w i n gd e t e r m i n a t i o n o f c o n c e n t r a t i o n s r a n g i n g f r o m 1 0 0 t o 4 0 0 p g /l i t e r .T h e ELISA w a s a s a n d w i c h - t y p e a s s a y d e r i v e d f r o m ap r e v i o u s l y d e s c r i b e d p r o c e d u r e ( 1 5 ) a n d a d a p t e d t o v i t a m i nB 1 2 . T h e s o l u t i o n t o b e a s s a y e d w a s a d d e d t o t h e I F - c o a t e dp l a t e s a n d i n c u b a t e d i n t h e p r e s e n c e o f a n a n t i - B 1 2 - K L Hg o a t s e r u m ( B i o s p e c i a L t d . , W e m b l e y , U n i t e d K i n g d o m ) . As h e e p a n t i - g o a t s e r u m c o n j u g a t e d w i t h a l k a l i n e p h o s p h a t a s e( B i o s y s S . A . , C o m p i e g n e , F r a n c e ) w a s t h e n a d d e d , a n da l k a l i n e p h o s p h a t a s e a c t i v i t y was a s s a y e d a s d e s c r i b e de l s e w h e r e ( 1 6 ) .C o n s t r u c t i o n o f p X L 5 9 , p X L 4 3 5 , a n d p l a s m i d s c a r r y i n g P .d e n i i f i c a n s D NA f r a g m e n t s . A v e c t o r w a s c o n s t r u c t e dw h i c h ( i ) h a s u n i q u e r e s t r i c t i o n s i t e s i n t h e c o d i n g r e g i o n o fa t e s t a b l e g e n e t i c m a r k e r a n d ( i i ) c a r r i e s a w i d e - h o s t - r a n g er e p l i c o n t h a t c a n b e m o b i l i z e d i n m a n y g r a m - n e g a t i v e b a c -t e r i a . T h e r e p l i c o n i s o f t h e I n c Q t y p e a n d c o n t a i n s p a r t o fp l a s m i d p F R 2 3 7 ( a g e n e r o u s g i f t o f F . R i c h a u d ) ( F i g . 2 ) .

BE

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pXL59 ~ ~ ~ ~ p X L 4 3 5 s r ip X L 5 9 i O. 6 k c bm b 1 7 k b s i cksic~~~~~~~~~~~~~~is r i a o b

xX b I M 2 M 3 E 4 MF I G . 2 . P h y s i c a l m a p s o f p l a s m i d s p F R 2 3 7 , p K T 2 3 0 , p X L 5 9 ,a n d p X L 4 3 5 . B , B a m H I ; C , C M a I ; E , E c o R I ; H , H i n d l I l ; P , P s t I ; S ,S s t I ; S a , S a l l ; X , X h o I ; X b , X b a I . K e y t o s y m b o l s : 1 , P s t I - S s t If r a g m e n t o f RSF 1 0 1 0 , w h i c h c o n t a i n s t h e o r i g i n o f v e g e t a t i v er e p l i c a t i o n ( o r i ) ( 1 2 ) , t h e r e l a x a t i o n n i c k s i t e ( n i c ) , a n d a d e t e r m i n a n t( m o b ) t h a t i s e s s e n t i a l f o r p l a s m i d m o b i l i z a t i o n ( 2 ) ; 2 , P s t I - B a m H If r a g m e n t o f p A C Y C 1 7 7 ( 2 ) ; 3 , B a m H I - S s t I f r a g m e n t c o n t a i n i n g t h eE . c o l i l a c t o s e o p e r o n w i t h o u t t h e p r o m o t e r , t h e o p e r a t o r , t h et r a n s l a t i o n i n i t i a t i o n s i t e s , a n d t h e f i r s t e i g h t n o n e s s e n t i a l c o d o n s o fl a c Z ( 9 ) ; 4 , S a u 3 A I f r a g m e n t o f P . p u t i d a c h r o m o s o m a l DNA.

P - G a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y w a s n o t d e t e c t e d i n s t r a i nM C 1 0 6 0 ( p F R 2 3 7 ) . We i n s e r t e d S a u 3 A I f r a g m e n t s o f P .p u t i d a K T 2 4 4 0 g e n o m i c DNA i n t o t h e B a m H I - l i n e a r i z e dv e c t o r p F R 2 3 7 a n d s e a r c h e d f o r r e c o m b i n a n t p l a s m i d s t h a ta l l o w e d e x p r e s s i o n o f P - g a l a c t o s i d a s e i n E . c o l i M C 1 0 6 0 .O n e o f t h e p l a s m i d s was s h o w n t o c a r r y a 7 5 - b a s e - p a i r ( b p )f r a g m e n t t h a t r e c o n s t i t u t e d t h e BamHI s i t e o n i t s r i g h tb o u n d a r y , t o w a r d t h e l a c Z g e n e , a n d was n a m e d p X L S 9( F i g . 2 ) . M o r e o v e r , i t was c o n f i r m e d t h a t p X L 5 9 c o u l d b em o b i l i z e d w i t h t h e s a m e e f f i c i e n c y a s c o u l d p F R 2 3 7 o rp K T 2 3 0 f r o m E . c o l i t o g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a s u c h a s A .t u m e f a c i e n s a n d P . p u t i d a ( d a t a n o t s h o w n ) . p X L 4 3 5 wasd e r i v e d f r o m p K T 2 3 0 b y s u b s t i t u t i n g t h e B a m H I - S s t I f r a g -m e n t f o r t h e m u l t i p l e - c l o n i n g f r a g m e n t f r o m p F R 1 0 ( 4 3 ) . T h et h r e e w i d e - h o s t - r a n g e v e c t o r s ( p K T 2 3 0 , p X L 4 3 5 , a n dp X L 5 9 ) w e r e c h o s e n f o r s u b c l o n i n g o f P . d e n i t r i f i c a n sf r a g m e n t s . M C 1 0 6 0 w a s u s e d a s t h e r e c i p i e n t s t r a i n e x c e p tf o r t h e c l o n i n g o f E c o R I o r S s t I f r a g m e n t s i n t o p K T 2 3 0 ; i nt h e s e c a s e s , t h e s t r e p t o m y c i n - s e n s i t i v e s t r a i n LG90 wasu s e d a n d s c r e e n e d f o r s t r e p t o m y c i n - s e n s i t i v e r e c o m b i n a n t s .C o n s t r u c t i o n o f a P . d e n i t r i i c a n s g e n o m i c D NA l i b r a r y . Ag e n o m i c DNA l i b r a r y f r o m s t r a i n S C 5 1 5 0 was c o n s t r u c t e d i np X L 5 9 . A p a r t i a l S a u 3 A I d i g e s t o f S C 5 1 0 c h r o m o s o m a lDNA ( 2 0 0 p u g ) was f r a c t i o n a t e d b y s u c r o s e g r a d i e n t c e n t r i f -u g a t i o n ( 3 6 ) . F r a c t i o n s c o r r e s p o n d i n g t o DNA f r a g m e n t sw i t h s i z e s r a n g i n g f r o m 1 0 t o 1 5 k b p w e r e p o o l e d . T h es i z e - f r a c t i o n a t e d g e n o m i c DNA f r a g m e n t s ( 1 0 0 p u g / m l e a c h )w e r e l i g a t e d w i t h B a m H I - d i g e s t e d p X L 5 9 , u s i n g T4 DNAl i g a s e ( N e w E n g l a n d B i o L a b s ) a t a c o n c e n t r a t i o n o f 3 0 0 U /m l . A f r a c t i o n o f t h e r e a c t i o n m i x t u r e was u s e d t o t r a n s f o r mc o m p e t e n t M C 1 0 6 0 ( p R K 2 0 7 3 ) c e l l s . T r a n s f o r m e d c e l l s w e r e



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C O E N Z Y M E B 1 2 BIOSYNTHESIS I N P . DENITRIFICANS 5 5 1p l a t e d o n LB a g a r m e d i u m c o n t a i n i n g k a n a m y c i n , s p e c t i -n o m y c i n , a n d X - G a l ( 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y l - , - t - g a l a c -t o p y r a n o s i d e ) . A t o t a l o f 3 , 2 0 0 w h i t e c o l o n i e s o n X - G a l -s u p p l e m e n t e d m e d i u m w e r e p i c k e d a n d i n d i v i d u a l l yi n o c u l a t e d i n a 9 6 - w e l l m i c r o d i l u t i o n p l a t e s c o n t a i n i n g 2 0 0 , u do f H o g n e s s f r e e z i n g medium per w e l l f o r c o n s e r v a t i o n ( 2 1 ) .A n a l y s i s o f 2 4 c l o n e s s h o w e d t h a t t h e a ve r a g e s i z e o f t h ei n s e r t e d DNA f r a g m e n t s i n pXL59 w a s a r o u n d 1 3 k b p .A s s u m i n g t h a t t h e P . d e n i t r i f i c a n s g e n o m e h a s a m o l e c u l a rs i z e o f a b o u t 5 , 0 0 0 k b p , t h i s l i b r a r y i s l a r g e e n o u g h t or e p r e s e n t a n y DNA s e q u e n c e o f t h e genome w i t h a p r o b a -b i l i t y g r e a t e r t h a n 9 9% ( 1 0 ) .I s o l a t i o n o f a n E . c o l i m u t a n t d e f i c i e n t i n t h e t r a n s f o r m a t i o no f c o b i n a m i d e d i c y a n i d e i n t o m e t h y l c o b a l a m i n . I t h a s b e e nr e p o r t e d t h a t E . c o l i 1 1 3 - 3 , a metE m u t a n t , requires v i t a m i nB 1 2 t o g r o w w i t h o u t a n e x o g e n o u s s u p p l y o f m e t h i o n i n e ( 1 1 ) .I t h a s b e e n a l s o r e p o r t e d t h a t E . c o l i i s a b l e t o c a t a l y z e t h et r a n s f o r m a t i o n o f c o b i n a m i d e i n t o m e t h y l c o b a l a m i n ( 3 9 ) .T h e r e f o r e , we s e a r c h e d f o r a m u t a n t b l o c k e d i n m e t h y l c o -b a l a m i n b i o s y n t h e s i s f r o m c o b i n a m i d e d i c y a n i d e . A f t e r N -m e t h y l - N ' - n i t r o - N - n i t r o s g u a n i d i n e m ut a g e n e s i s , 8 0 0 c o l o -n i e s o f E . c o l i 1 1 3 - 3 p l a t e d o n LB medium w e r e r e p l i c ap l a t e d o n M9 medium s u p p l e m e n t e d w i t h c o b i n a m i d e d i c y a -n i d e . We f o u n d o n e m u t a n t , named 1 3 3 - 3 C b l l , t h a t wasc o m p l e m e n t e d b y v i t a m i n B 1 2 o r m e t h i o n i n e b u t n o t b yc o b i n a m i d e d i c y a n i d e o r 5 , 6 - d i m e t h y l b e n z i m i d a z o l e . E . c o l i1 1 3 - 3 C b l l i s a p p a r e n t l y b l o c k e d i n t h e s y n t h e s i s o f m e t h y l -c ob a l a m i n f r o m c o b i n a m i d e d i c y a n i d e , s i n c e i n E . c o l ic o b i n a m i d e d i c y a n i d e a n d v i t a m i n B 1 2 u s e t h e s a m e t r a n s -p o r t s y s t e m ( 7 ) . T h i s s t r a i n was u s e d as a n i n d i c a t o r s t r a i nf o r t h e m i c r o b i o l o g i c a l a s s a y o f c o m p o u n d s t h a t are f o r m e db e t w e e n c o b i n a m i d e a n d m e t h y l c o b a l a m i n . S i n c e a l l s a m -p l e s a s s a y e d f o r c o b a l a m i n c o n t e n t w e r e c y a n u r a t e d , m u t a n t1 1 3 - 3 C b l l i s a n i n d i c a t o r s t r a i n t h a t s h o u l d g i v e a mores p e c i f i c r e s p o n s e f o r t h e a s s a y o f t h e e n d p r o d u c t s i n t h eb i o s y n t h e s i s o f c o b a l a m i n .

RESULTSI s o l a t i o n o f m u t a n t s d e f i c i e n t i n c o b a l a m i n s y n t h e s i s . S i n c ec o b a l a m i n s y n t h e s i s i s a b i o c h e m i c a l p a t h w a y c o m p o s e d o f

many d i f f e r e n t s t e p s , tw o m u t a g e n e s i s s t r a t e g i e s w e r e u s e dt o o b t a i n a s many d i f f e r e n t m u t a n t s a s p o s s i b l e : t r a n s p o s o nm u t a g e n e s i s w i t h T n S , w h i c h i s k nown t o h a v e a l o wt r a n s l o c a t i o n s p e c i f i c i t y ( 3 2 ) , a n d N - m e t h y l - N ' - n i t r o - N -n i t r o s o g u a n i d i n e m u t a g e n e s i s . Tw o g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i at h a t p r o d u c e c o b a l a m i n u n d e r a e r o b i c g r o w t h c o n d i t i o n sw e r e m u t a g e n i z e d : P . p u t i d a K T 2 4 4 0 ( 2 ) a n d A . t u m e f a c i e n sC 5 8 - C 9 ( 2 5 ) . T h e s e tw o b a c t e r i a s y n t h e s i z e 5 0 a n d 5 0 0 p u g o fc o b a l a m i n p e r l i t e r , r e s p e c t i v e l y , u n d e r o u r c u l t u r e c o n d i -t i o n s ( s e e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s ) .I t i s known t h a t b a c t e r i a l e t h a n o l a m i n e a m m o n i a - l y a s e( E C 4 . 3 . 1 . 7 ) , w h i c h c a t a l y z e s t h e d e a m i n a t i o n o f e t h a n o l -a m i n e t o a c e t a l d e h y d e a n d a m m o n i a , r e q u i r e s a d e n o s y l c o -b a l a m i n a s a c o f a c t o r ; t h i s p r o p e r t y h a s b e e n d e s c r i b e d f o re n z y m e s o f v a r i o u s b a c t e r i a , s u c h a s E . c o l i , K l e b s i e l l aa e r o g e n e s , S . t y p h i m u r i u m , a n d C l o s t r i d i u m s p . ( 1 ) . I fe t h a n o l a m i n e i s t h e s o l e s o u r c e o f n i t r o g e n , t h e n t h e b a c t e -r i u m requires a d e n o s y l c o b a l a m i n t o g r o w ; t h e r e f o r e , E . c o l ia n d K . a e r o g e n e s , w h i c h d o n o t p r o d u c e c o b a l a m i n a e r o b i -c a l l y , g r o w a e r o b i c a l l y on e t h a n o l a m i n e a s a n i t r o g e n s o u r c eo n l y i n t h e p r e s e n c e o f a d d e d c o b a l a m i n ( 1 ) .S i n c e P . p u t i d a g r o w s on m i n i m a l medium w i t h e t h a n o l -a m i n e a s t h e s o l e s o u r c e o f n i t r o g e n , we h y p o t h e s i z e d t h a t i nP . p u t i d a t h i s p a t h w a y o f n i t r o g e n a s s i m i l a t i o n was a l s od e p e n d e n t o n e n d o g e n o u s a d e n o s y l c o b a l a m i n s y n t h e s i s . P .

TABLE 2 . C o b a l a m i n b i o s y n t h e s i s - d e f i c i e n t m u t a n t so f P . p u t i d a aS t r a i n P h e n o t y p e C o b a l a m i n C o f n c n M u t a n t c l a s s

K T 2 4 4 0 R i f ' N a l r 5 3G 5 4 7 C o b l 2 6G 5 4 8 C o b 2 0 . 3 4G 5 4 9 C o b 3 0 . 2 1G 5 5 0 C o b 4 0 . 2 5G 5 5 1 C o b S 0 . 2 4G 5 5 2 C o b 6 0 . 3 2G 5 5 3 C o b 7 0 . 1 3G 5 5 4 C o b 8 0 . 1 1G 5 5 5 C o b 9 0 . 2 6G 5 5 6 C o b l O 8 2G 5 5 7 C o b l l 0 . 2 2G 5 5 8 C o b l 2 0 . 0 6 5G 5 5 9 C o b l 3 0 . 1 4G 5 6 0 C o b l 4 0 . 6 2G 5 6 1 C o b l S 0 . 0 1 4G 5 6 2 C o b l 6 0 . 0 6 1G 5 6 3 C o b l 7 0 . 0 6 3G 5 6 6 C o b l 8 0 . 0 4 5G 5 6 7 C o b l 9 0 . 0 4 3G 5 6 8 C o b 2 O 0 . 0 6G 5 7 0 C o b 2 l 0 . 0 8G 5 7 1 C o b 2 2 0 . 8G 5 7 2 C o b 2 3 3G 5 7 3 C o b 2 4 0 . 1G 5 7 6 C o b 2 5 0 . 0 4G 5 7 7 C o b 2 6 Sa M u t a n t s G 5 6 8 , G 5 7 0 , G 5 7 1 , G 5 7 2 , G 5 7 3 , G 5 7 6 , a n d G 5 7 7 w e r e o b t a i n e db y N - m e t h y l - N ' - n i t r o - N - n i t r o s o g u a n i d i n e m u t a g e n e s i s . C o b a l a m i n c o r l c e n -t r a t i o n s w e r e d e t e r m i n e d b y I F , a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s , w h e nt h e s t r a i n s w e r e c u l t i v a t e d u n d e r s t a n d a r d c o n d i t i o n s f o r c o b a l a m i n p r o d u c -t i o n . D a t a a r e m e a n s o f t w o a s s a y s . M u t a n t c l a s s r e f e r s t o t h e s i x c l a s s e sd e f i n e d a c c o r d i n g t o t h e s i z e o f t h e m u t a n t g e n o m i e E c o R I DNA f r a g m e n th y b r i d i z i n g w i t h a 3 2 P - l a b e l e d T n 5 p r o b e .

p u t i d a K T 2 4 4 0 R i f ' N a l r w a s c h o s e n a s t h e r e c i p i e n t i n t h et r a n s p o s on - m ed i a t e d m u t a g e ne s i s e x p e r i m e n t ; 6 , 0 0 0 m u t a -g e n i z e d c o l o n i e s w e r e s e l e c t e d a t a f r e q u e n c y o f 1 0 - 5 p e rr e c i p i e n t c e l l a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . A f t e rr e p l i c a p l a t i n g o n e t h a n o l a m i n e m e d i u m w i t h o r w i t h o u tc y a n o c o b a l a m i n , m u t a n t s t h a t r e q u i r e d c y a n o c o b a l a m i n f o rg r o w t h w e r e f u r t h e r i n v e s t i g a t e d b y c o n f i r m i n g t h e i r p h e n o -t y p e a n d s t u d y i n g c o b a l a m i n p r o d u c t i o n i n P S 4 l i q u i d c u l -t u r e . A t o t a l o f 1 9 t r a n s p o s o n - m e d i a t e d m u t a n t s w e r e f o u n dt o p r o d u c e r e d u c e d l e v e l s o f c o b a l a m i n ( T a b l e 2 ) . T h e s et r a n s p o s o n - n m e d i a t e d m u t a n t s w e r e a l s o s t u d i e d b y S ou t h e r nb l o t a n a l y s i s o n t o t a l E c o R I - d i g e s t e d c h r o m o s o m a l DNA( t h e r e i s n o E c o R I r e s t r i c t i o n s i t e i n T n S [ 3 1 ] ) b y u s i n g3 2 P - l a b e l e d T n S a s a p r o b e . T h i s a n a l y s i s r e v e a l e d t h a t f o re a c h m u t a n t a s i n g l e f r a g m e n t o f g e n o m i c DNA h y b r i d i z e dw i t h t h e p r o b e ; i n e a c h c a s e , t h e r e f o r e , i n s e r t i o n o f t h et r a n s p o s o n w a s l i k e l y t o b e u n i q u e i n t h e c h r o m o s o m e o f t h es t r a i n . T h e r e w a s n o d e t e c t a b l e l e v e l o f h y b r i d i z a t i o n w i t hc h r o m o s o m a l DNA o f t h e p a r e n t s t r a i n ( d a t a n o t s h o w n ) .T h e C o b m u t a n t s w e r e t h e n c l a s s i f i e d a c c o r d i n g t o t h ee s t i m a t e d s i z e o f t h e E c o R I f r a g m e n t h y b r i d i z i n g t o 3 2 p _l a b e l e d T n S . T h i s c l a s s i f i c a t i o n d e f i n e d s i x c l a s s e s o f m u -t a n t s ( 1 t o 6 ; T a b l e 2 ) , w h i c h c o r r e s p o n d e d t o e s t i m a t e dE c o R I c h r o m o s o m n a l f r a g m e n t s o f 1 7 , 1 4 . 5 , 1 3 , 1 2 , 1 0 . 5 , a n d6 k b p , r e s p e c t i v e l y ( d a t a n o t s h o w n ) .P . p u t i d a m u t a n t s w e r e a l s o s e l e c t e d a f t e r t r e a t m e n t w i t hN - m e t h y l - N ' - n i t r o - N - n i t r o s o g u a n i d i n e a s d e s c r i b e d i n M a t e -r i a l s a n d M e t h o d s . T h e s c r e e n i n g p r o c e d u r e d e s c r i b e d a b o v ew a s a p p l i e d t o 1 , 4 0 0 m u t a g e n i z e d c o l o n i e s . S e v e n s e l e c t e d

V O L . 1 7 1 , 1 9 8 9


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5 5 2 C A ME R O N ET A L .TABLE 3 . A . t u m e f a c i e n s C o b m u t a n t s a

M u t a n t C o b a l a m i n c o n c nS t r a i n P h e n o t y p e c l a s s ( , u g / l i t e r )C 5 8 - C 9 R i f r N a i r C o b ' 5 0 0G 1 5 9 C o b l V I < 1 0G 1 6 0 C o b 2 I I < 1 0G 1 6 1 C o b 3 V < 1 0G 1 6 2 C o b 4 I V < 1 0G 1 6 4 C o b S I < 1 0G 1 6 5 C o b 6 I I < 1 0G 1 6 6 C o b 7 I < 1 0G 1 6 8 C o b 8 I < 1 0G 1 6 9 C o b 9 V I < 1 0G 1 7 0 C o b l O I I I < 1 0G 1 7 1 C o b l l V < 1 0G 1 7 2 C o b l 2 I < 1 0G 2 5 6 C o b l 3 I V < 1 0G 2 5 8 C o b l 4 V I < 1 0G 2 6 0 C o b l S I I I < 1 0G 2 6 1 C o b l 6 I < 1 0G 2 6 2 C o b l 7 I I I < 1 0G 6 0 9 - 6 1 7 C o b l 8 - 2 6 < 1 o bG 6 1 9 - 6 4 4 C o b 2 7 - 5 2 < 1 o bG 6 4 6 , G 6 4 8 C o b 5 3 - 5 4 < 1 o bG 1 % 3 - 2 0 5 4 C o b 5 5 - 1 4 6 < j o bG 2 0 5 6 , G 2 0 5 7 C o b l 4 7 - 1 4 8 < 1 0

a T h e c o b a l a m i n a s s a y w a s p e r f o r m e d w i t h E . c o l i 1 1 3 - 3 C b l l . C o b a l a m i nc o n c e n t r a t i o n s w e r e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t w h e n t e s t e d w i t h E . c o l i 1 1 3 - 3e x c e p t f o r m u t a n t s G 6 4 2 a n d G 2 0 3 8 t o G 2 04 3 . M u t an t s G 6 0 9 t o G 6 1 7 , G 6 1 9 t oG 6 4 4 , G 6 4 6 , G 6 4 8 , G 1 9 6 3 t o G 2 0 5 4 , G 2 0 5 6 , a n d G 2 0 5 7 w e r e o b t a i n e d b ym u t a g e n e s i s w i t h N - m e t h y l - N ' - n i t r o - N - n i t r o s o g u a n i d i n e .b M o s t o f t h e m u t a n t s p r o d u c e d c o b a l a m i n a t l e v e l s o f l o w e r t h a n 1 0 p . g /l i t e r . E x c e p t i o n s ( w i t h p r o d u c t i o n [ i n m i c r o g r a m s p e r l i t e r ] i n d i c a t e d i np a r e n t h e s e s ) w e r e G 6 1 4 ( 8 0 ) , G 6 1 5 ( 3 0 ) , G 6 1 6 ( 3 0 ) , G 6 1 7 ( 3 0 ) , G 6 4 0 ( 4 0 ) , G 6 4 3( 7 0 ) , G 6 4 4 ( 7 0 ) , G 6 4 6 ( 2 0 0 ) , G 1 6 6 3 ( 6 0 ) , G 1 9 6 5 ( 1 2 0 ) , G 1 9 7 5 ( 2 6 0 ) , G 1 9 8 3 ( 3 0 ) ,G 1 9 9 1 ( 2 6 0 ) , G 1 9 9 2 ( 2 0 0 ) , G 2 0 0 8 ( 2 0 ) , G 2 0 1 0 ( 1 5 0 ) , G 2 0 1 2 ( 9 0 ) , G 2 0 1 8 ( 2 2 0 ) ,G 2 0 2 6 ( 4 0 ) , G 2 0 3 4 ( 4 0 ) , G 2 0 4 5 ( 2 8 0 ) , a n d G 2 0 5 4 ( 2 0 ) . D a t a a r e m e a n s o f t w oa s s a y s . M u t a n t c l a s s r e f e r s t o t h e s i x c l a s s e s d e f i n e d a c c o r d i n g t o t h e s i z e o ft h e m u t a n t g e n o m i c E c o R I D NA f r a g m e n t h y b r i d i z i n g w i t h a 3 2 P - l a b e l e d T n 5p r o b e .

m u t a n t s w e r e f o u n d t o e x h i b i t t h e s a m e p r o p e r t i e s a s d i d t h eC o b l t o C o b l 9 m u t a n t s ( T a b l e 2 ) a n d t o p r o d u c e a l o w l e v e lo f c o b a l a m i n .We n o t i c e d t h a t a l l m u t a n t s e x c e p t G 5 4 7 , G 5 5 6 , G 5 7 2 , a n dG 5 7 7 p r o d u c e d 5 0 t i m e s l e s s c o b a l a m i n t h a n d i d t h e w i l d -t y p e s t r a i n a s d e t e r m i n e d b y t h e r a d i o c h e m i c a l a s s a y .A . t u m e f a c i e n s C 5 8 - C 9 R i f ' N a l r w a s a l s o m u t a g e n i z e d t oo b t a i n C o b m u t a n t s . U n f o r t u n a t e l y , we h a v e n o t b e e n a b l et o d e t e r m i n e a p r o c e d u r e f o r s c r e e n i n g v i t a m i n B 1 2 - n e g a t i v em u t a n t s o f A . t u m e f a c i e n s , a s h a s b e e n d o n e f o r P . p u t i d aa n d f o r S . t y p h i m u r i u m a n d B . m e g a t e r i u m ( 2 9 , 4 8 ) . T h e r e -f o r e , e a c h m u t a g e n i z e d c o l o n y was s c r e e n e d f o r c o b a l a m i np r o d u c t i o n ( s e e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s ) . M u t a n t s d e f i c i e n ti n a d e n o s y l c o b a l a m i n s y n t h e s i s w e r e k e p t o n t h e b a s i s o f a tl e a s t a 2 0 - f o l d - r e d u c e d p r o d u c t i o n c o m p a r e d w i t h t h a t o f t h ew i l d - t y p e s t r a i n . T r a n s p o s o n - m e d i a t e d m u t a g e n e s i s i n A .t u m e f a c i e n s was p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n dM e t h o d s . E a c h c o l o n y w a s s t u d i e d f o r a b i l i t y t o p r o d u c ec y a n o c o b a l a m i n a s d e t e r m i n e d b y E L I S A . A t o t a l o f 1 7c l o n e s f r o m 5 , 0 0 0 m u t a n t s w e r e d e f i c i e n t i n p r o d u c t i o n o fc o b a l a m i n . T h e m u t a n t s w e r e a n a l y z e d a s d e s c r i b e d a b o v e .S i x c l a s s e s , r e l a t e d t o t h e e s t i m a t e d s i z e o f t h e E c o R Ic h r o m o s o m a l f r a g m e n t o f t h e m u t a n t s h y b r i d i z i n g w i t h t h e3 2 P - l a b e l e d T n S p r o b e , w e r e f o u n d . F r a g m e n t s o f 1 7 , 1 5 . 5 ,1 4 . 5 , 1 3 . 5 , 8 . 5 , a n d 7 . 5 k b p c o r r e s p o n d e d t o c l a s s e s I , I I , I I I ,I V , V , a n d V I , r e s p e c t i v e l y ( d a t a n o t s h o w n ) . C h a r a c t e r i s -t i c s o f a n d c o b a l a m i n p r o d u c t i o n b y t h e s e m u t a n t s a r e

s h o w n i n T a b l e 3 . I n a d d i t i o n , 1 7 , 00 0 c o l o ni e s m u t a g e n i z e db y N - m e t h y l - N ' - n i t r o - N - n i t r o s o g u a n i d i n e w e r e s c r e e n e d f o rt h e a b s e n c e o f c o b a l a m i n p r o d u c t i o n , a n d 1 3 1 c o b a l am i n -n e g a t i v e m u t a n t s w e r e o b t a i n e d . Cob m u t a n t s w e r e d e t e c t e db y ELISA f o r t h e f i r s t 3 9 m u t a n t s ; t h e o t h e r m u t a n t s w e r ea n a l y z e d b y t h e m i c r o b i o l o g i c a l a s s a y , u s i n g E . c o l i 1 3 3 - 3C b l l . E x c e p t f o r 2 2 m u t a n t s , c o b a l a m i n p r o d u c t i o n a s d e -t e r m i n e d b y t h e m i c r o b i o l o g i c a l a s s a y w a s a t l e a s t 5 0 t i m e sl o w e r t h a n t h e p a r e n t a l l e v e l ( T a b l e 3 ) .S i n c e t h e C o b m u t a n t s w e r e o b t a i n e d i n t w o o b l i g a t ea e r o b e s , i t i s p r o b a b l e t h a t t h e y a r e n o t b l o c k e d i n t h e p a r t o ft h e c o b a l a m i n s y n t h e t i c p a t h w a y c o m m o n w i t h h e m e b i o -s y n t h e s i s ; o t h e r w i s e , t h e y s h o u l d h a v e b e e n s o m e h o w d e f i -c i e n t i n h e m e s y n t h e s i s a n d c h a r a c t e r i z e d b y a n i m p a i r e dr e s p i r a t i o n m e c h a n i s m l e a d i n g t o a l e t h a l p h e n o t y p e . F o ri n s t a n c e , R h i z o b i u m m e l i l o t i m u t a n t s b l o c k e d i n t h e f i r s te n z y m a t i c s t e p o f t h e h e m e p a t h w a y ( c o r r e s p o n d i n g t ob - a m i n o l e v u l i n i c a c i d s y n t h e t a s e , w h i c h c a t a l y z e s t h e c o n -d e n s a t i o n o f s u c c i n y l c o e n z y m e A a n d g l y c i n e i n t o 8 -a m i n o l e v u l i n i c a c i d ) r e q u i r e b - a m i n o l e v u l i n i c a c i d f o rg r o w t h ( 3 5 ) . S i n c e 5 , 6 - d i m e t h y l b e i z i m i d a z o l e i s a c o m p o -n e n t o f P S 4 m e d i u m , i t i s l i k e l y t h a t a l l o f t h e m u t a n t s t h a th a v e b e e n o b t a i n e d a r e n o t b l o c k e d i n 5 , 6 - d i m e t h y l b e n z i m i -d a z o l e s y n t h e s i s .I n S . t y p h i m u r i u m , c y s G m u t a n t s h a v e b e e n d e s c r i b e d ;t h e s e m u t a n t s , w h i c h d o n o t s y n t h e s i z e s i r o h e m e s , a r e a l s ob l o c k e d i n v i t a m i n B 1 2 s y n t h e s i s ( 2 9 ) . We i n v e s t i g a t e dw h e t h e r s u c h m u t a n t s w e r e i s o l a t e d i n o u r s t u d y . S i n c e t h eA . t u m e f a c i e n s m u t a n t s w e r e f i r s t p l a t e d o n LB m e d i u m a n dt e s t e d f o r c o b a l a m i n p r o d u c t i o n i n P S 4 m e d i u m ( c o n t a i n i n gNZ c a s e ) , c y s t e i n e - r e q u i r i n g m u t a n t s w o u l d n o t h a v e b e e ne l i m i n a t e d . T h i s p r o c e d u r e s h o u l d t h e r e f o r e h a v e a l l o w e d u st o i s o l a t e m u t a n t s b l o c k e d i n s i r o h e m e s a n d v i t a m i n B 1 2s y n t h e s i s i f s u c h m ut a n t s c o u l d b e f o u n d i n A . t u m e f a c i e n s .H o w e v e r , a m o n g a l l o f t h e A . t u m e f a c i e n s m u t a n t s s t u d i e d ,n o n e w e r e c y s t e i n e a u x o t r o p h s ; t h i s f i n d i n g i n d i c a t e d a na b s e n c e o f t h e s e m u t a n t s o r a d i f f e r e n t g e n e t i c o r g a n i z a t i o nt h a n e x i s t s i n S . t y p h i m u r i u m ( 3 0 ) . S i n c e P . p u t i d a C o bm u t a n t s w e r e s c r e e n e d o n E t h m e d i u m w i t h o u t c y s t e i n e , i t i sp r o b a b l e t h a t m u t a n t s d e f e c t i v e i n s i r o h e me s a n d v i t a m i nB 1 2 s y n t h e s i s w e r e n o t i s o l a t e d .C o m p l e m e n t a t i o n o f C o b m u t a n t s o f P . p u i d a a n d A .t u m e f a c i e n s b y a g e n o m i c l i b r a r y o f P . d e n i t f i c a n s . E a c hc l o n e o f t h e g e n o m i c l i b r a r y o f P . d e n i t r i f i c a n s w a s m o b i -l i z e d i n d i v i d u a l l y i n t o C o b m u t a n t s o f P . p u t i d a a s d e s c r i b e di n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . T h e r e s u l t i n g t r a n s c o n j u g a n t sw e r e t e s t e d f o r a b i l i t y t o g r o w o n E t h m e d i u m . C l o n e s t h a tw e r e n o l o n g e r v i t a m i n B 1 2 a u x o t r o p h s w e r e i d e n t i f i e d . I tw a s v e r i f i e d t h a t t h e y w e r e a l s o c o m p l e m e n t e d f o r c o b a -l a m i n s y n t h e s i s i n 2 5 - m l P S 4 m e d i u m c u l t u r e s . B e c a u s e t h ep l a s m i d s w e r e i n t r o d u c e d i n d i v i d u a l l y , b y r e p l i c a m a t i n g , i tw a s p o s s i b l e t o i d e n t i f y p l a s m i d s t h a t c o m p l e m e n t e d t h es a m e m u t a n t s . P l a s m i d s p X L 1 5 1 , p X L 1 5 2 , p X L 1 5 6 t op X L 1 5 8 , p X L 1 6 0 , a n d p X L 1 6 1 w e r e s h o w n t o c o m p l e m e n t1 6 P . p u t i d a C o b m u t a n t s ( T a b l e 4 ) . Among t h e o t h e r 1 0m u t a n t s , 9 ( G 5 4 7 , G 5 5 0 , G 5 5 3 , G 5 5 5 , G 5 6 3 , G 5 6 6 , G 5 6 7 ,G 5 6 8 , a n d G 5 7 1 ) w e r e n o t c o m p l e m e n t e d b y t h e g e n o m i cl i b r a r y o f P . d e n i t r i f i c a n s a n d 1 , G 5 7 6 , w a s p a r t i a l l y c o m -p l e m e n t e d ( 5 % o f t h e w i l d - t y p e l e v e l ) b y p X L 1 5 9 .T h e g e n o m i c l i b r a r y was a l s o u s e d t o c o m p l e m e n t Cobm u t a n t s o f A . t u m e f a c i e n s . C o b a l a m i n s y n t h e s i s b y e a c ht r a n s c o n j u g a n t w a s s t u d i e d a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n dM e t h o d s . M u t a n t s w e r e d e f i n e d a s c o m p l e m e n t e d whent r a n s c o n j u g a n t s p r o d u c e d t h e w i l d - t y p e l e v e l o f c ob a l a m i n .p X L 1 5 1 t h r o u g h 1 5 4 , p X L 1 5 6 t o 1 6 1 , a n d p X L S 1 9 c o m p l e -m e n t e d A . t u m e f a c i e n s C o b m u t a n t s ( T a b l e 4 ) . p X L 1 5 1 ,



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C OENZYME B 1 2 B I O S Y N T H I E S I S I N P . DENITRIFICANS 5 5 3TABLE 4 . C o b m u t a n t s o f P . p u t i d a a n d A . t u m e f a c i e n s a n d t h e c o r r e s p on d i n g p l a s m i ds f r o m t h e g e n o m i c l i b r a r yo f P . d e n i t r i f i c a n s t h a t a l l o w c o m p l e m e n t a t i o n a

G r o u p P l a s m i d s t h a t c o m p l e m e n t C o m p l e m e n t e d C o b m u t a n t sroup ~ C o bm u t a n t s . vP . p u t i d a A . t u m e f a c i e n sA p X L 1 5 1 G 5 5 8 , b G 5 7 0 G 1 6 4 / ' G 2 6 1 , / G 6 0 9 , G 6 1 0 , G 6 3 8 , G 1 9 8 5 G 1 9 9 8 ,G 2 0 5 6 , G 2 0 5 7

p X L 1 5 1 , p X L 1 5 2 G 5 4 8 , b G 5 5 1 ,b G 5 5 2 ,b G 5 5 7 ,b G 1 6 6 , b G 6 1 1 - 6 1 7 , G 6 1 9 , G 6 2 0 , G1963-1984G 5 5 9 / b G 5 6 0 / b G 5 5 6 , b G 5 6 1 bB p X L 1 5 3 , p X L 1 5 4 G 1 5 9 , b G 1 6 9 , / G 2 5 8 , b G 2 0 3 5p X L 1 5 4 G 1 6 1 , / G 1 7 1 , b G 2 0 3 4 , G 2 0 3 7C p X L 1 5 6 G 5 4 9 , . c G 5 6 2 , b G 5 7 3 c G 1 7 0 , b G 2 6 0 , ' G 2 6 2 b , G 6 2 2 - 6 3 0 , G 6 4 2 , cG 2 0 2 1 - G 2 0 3 3 , G 2 0 3 6 , G 2 0 4 3 Cp X L 1 5 6 , p X L 1 5 7 G 6 3 2 , G 6 3 3 , G 2 0 1 8 - G 2 0 2 0p X L 1 5 7 G 6 3 1 , G 2 0 0 5 - G 2 0 1 7p X L 1 5 7 , p X L 1 5 8 , p X L 1 6 0 , p X L 1 6 1 G 5 5 4 / ' G 5 7 2 , G 5 7 7 G 1 6 0 / ' G 1 6 5 , b G 6 3 4 , G 6 4 4 , G 1 9 9 9 - 0 2 0 0 4 ,G 2 0 5 4p X L 1 5 7 - p X L 1 6 1 G 1 6 2 , b G 2 5 6 , b G 6 3 5 - 6 3 7 , 6 6 3 9 , 6 6 4 0 , 6 6 4 3 ,G 6 4 6 , G 6 4 8D p X L 5 1 9 G 2 0 3 8 , c G 2 0 3 9 , c G 2 0 WO ,c G 2 0 4 1 , c G 2 0 4 2 Ca U n c o m p l e m e n t e d m u t a n t s f o r P . p u t i d a : G 54 7 , G 5 5 0 , G 5 5 3 , G 5 5 5 , G 5 6 3 , G 5 6 6 , G 5 6 7 , G 5 6 8 , a n d G 5 7 1 ( G 5 7 6 i s p a r t i a l l y c o mp l e m en t e d b y p X L 1 5 9 ) .U n c o m p l e m e n t e d m u t a n t s f o r A . t u m e f a c i e n s : G 1 6 8 , G 1 7 2 , G 6 2 1 , G 64 1 , a n d G 2 0 4 4 t o G 2 0 5 3 .b C o b m u t a n t s o b t a i n e d b y i n s e r t i o n o f t r a n s p o s o n T n S .c M u t a n t s p o s i t i v e l y a s s a y e d w i t h E . c o l i 1 3 3 - 3 .

p X L 1 5 2 , p X L 1 5 6 t o p X L 1 5 8 , a n d p X L 1 6 1 w e r e t h e r e f o r ea b l e t o c o m p l e m e n t C o b m u t a n t s o f b o t h A . t u m e f a c i e n s a n dP . p u t i d a . T h e c o m p l e m e n t a t i o n d a t a a l l o w e d u s t o c l a s s i f yt h e p l a s m i d s i n t o f o u r c o m p l e m e n t a t i o n g r o u p s , d e s i g n a t e dA , B , C , a n d D . P l a s m i d s i n e a c h g r o u p c o m p l e m e n t e d as p e c i f i c s e t o f m u t a n t s n o t c o m p l e m e n t e d b y p l a s m i d s f r o mt h e o t h e r g r o u p s ( T a b l e 4 ) . G r o u p A c o n s i s t e d o f p X L 1 5 1a n d p X L 1 5 2 , g r o u p B c o n t a i n e d p X L 1 5 3 a n d p X L 1 5 4 , g r o u pC i n c l u d e d p X L 1 5 6 t o p X L 1 6 1 , a n d g r o u p D c o n t a i n e d o n l yp X L 5 1 9 .T h e r e s t r i c t i o n m a p s o f t h e i n s e r t s c a r r i e d b y t h e s e v a r i o u sp l a s m i d s w e r e e s t a b l i s h e d ( F i g . 3 ) . T h e m a p s a r e i n a g r e e -m e n t w i t h c o m p l e m e n t a t i o n g r o u p s , s i n c e o v e r l a p p i n g i n -s e r t s a l w a y s c o r r e s p o n d t o p l a s m i d s b e l o n g i n g t o t h e s a m ec o m p l e m e n t a t i o n g r o u p . An y p h y s i c a l l i n k a g e d e d u c e d f r o mt h e r e s t r i c t i o n p a t t e r n w a s c h e c k e d b y S o u t h e r n b l o t a n a l y -s i s . F o r i n s t a n c e , t h e 2 . 6 - k b p E co RI - S s t I f r a g m en t o fp X L 1 5 6 , w h i c h o v e r l a p s w i t h p X L 1 5 7 4 w a s p u r i f i e d a n dr a d i o l a b e l e d w i t h 3 2 p ; h y b r i d i z a t i o n w i t h E c o R I - S s t I d i g e s t so f p X L 1 5 6 a n d p X L 1 5 7 s h o w e d t h a t t h e s a m e f r a g m e n t w a sp r e s e n t o n b o t h p X L 1 5 6 a n d p X L 1 5 7 ( d a t a n o t s h o w n ) . T h es i z e s o f c l o n e d DNA c o r r e s p o n d i n g t o g r o u p s A t o D w e r e1 5 . 5 , 2 5 . 5 , 2 9 , a n d 8 k b p , r e s p e c t i v e l y . N o c o r r e l a t i o n c o u l db e f o u nd a m o n g t h e r e s t r i c t i o n m a p s o f t h e f o u r g r o u p s ( F i g .3 ) , w h i c h i n d i c a t e d t h a t t h e r e i s n o o v e r l a p b e t w e e n t h e f o u rd i f f e r e n t f r a g m e n t s . T h e r e f o r e , a t l e a s t f o u r g e n o m i c l o c i o fP . d e n i t r i f i c a n s a r e i n v o l v e d i n c o b a l a m i n s y n t h e s i s a n d c a nc o m p l e m e n t C o b m u t a n t s o f P . p u t i d a a n d A . t u m e f a c i e n s .We d o n o t y e t know w h e t h e r t h o s e l o c i a r e t i g h t l y c l u s t e r e do r s c a t t e r e d o n t h e c h r o m o s o m e .G e n e t i c o r g a n i z a t i o n o f t h e C o b l o c i . A m o r e p r e c i s ec o m p l e m e n t a t i o n m ap o f t h e Cob l o c i w a s e s t a b l i s h e d t o g a i nd e e p e r i n s i g h t i n t o t h e g e n e t i c o r g a n i z a t i o n o f t h e p a t h w a y .S m a l l e r f r a g m e n t s r e p r e s e n t a t i v e o f t h e f o u r g e n o m i c l o c i , i nt h e r a n g e o f 2 t o 4 k b p , w e r e s u b c l o n e d i n t o p K T 2 3 0 ,p X L 4 3 5 , o r p X L 5 9 , d e p e n d i n g o n t h e a v a i l a b l e r e s t r i c t i o ns i t e s ( F i g . 2 ) . We t h u s i d e n t i f i e d 1 4 d i f f e r e n t p l a s m i d s t h a ts p e c i f i c a l l y c o m p l e m e n t e d m o s t o f t h e m u t a n t s i n v e s t i g a t e d

( T a b l e 5 ) : p X L 2 2 0 , p X L2 2 7 , p X L 2 3 9 , p X L 4 3 6 , p X L4 4 4 ,p X L 4 5 2 , p X L 5 5 6 , p X L 6 1 7 , p X L 6 2 2 , p X L 6 7 8 , p X L 6 8 4 ,p X L 6 9 8 , p X L 7 3 5 , a n d p X L 8 3 7 ( F i g . 3 ) . A l l o f t h e s e p l a s m i d sc o m p l e m e n t e d m u t a n t s t h a t w e r e n o t c o m p l e m e n t e d b y t h eo t h e r s . A l l o f t h e p l a s m i d s e x c e p t p X L 2 2 0 c o m p l e m e n t e d A .t u m e f a c i e n s C o b m u t a n t s .C o m p l e m e n t a t i o n d a t a w i t h s u b c l o n e s a r e i n a g r e e m e n tw i t h t h e c l a s s i f i c a t i o n o f P . p u t i d a a n d A . t u m e f a c i e n s T n Sm u t a n t s . F o r i n s t a n c e , a s u b c l o n e c o m p l e m e n t e d T n S m u -t a n t s o f P . p u t i d a o r A . t u m e f a c i e n s b e l o n g i n g t o t h e s a m eh y b r i d i z a t i o n c l a s s ( i . e . , p X L 6 8 4 c o m p l e m e n t e d t h e t h r e e P .p u t i d a m u t a n t s o f c l a s s 2 ; T a b l e 5 ) ; t h i s f i n d i n g s u g g e s t s t h a ti n c o m p l e m e n t e d T n 5 m u t a n t s t h e t r a n s p o s o n h a s i n s e r t e di n t o C o b g e n e s . C o m p l e m e n t e d m u t a n t s o f a h y b r i d i z a t i o nc l a s s w e r e a l l c o m p l e m e n t e d b y t h e s a m e s u b c l o n e ( s e ee x a m p l e c i t e d a b o v e ) o r b y s u b c l o n e s o f t h e s a m e c l u s t e r( p X L 6 1 7 , p X L 6 2 2 , a n d p X L 2 3 9 c o m p l e m e n t e d t h e P . p u t i d am u t a n t s G 5 6 2 , G 5 4 9 , a n d G 5 5 4 , r e s p e c t i v e l y , w h i c h c o n s t i -t u t e c l a s s 1 ; T a b l e 5 ) . T h i s r e s u l t ma y i n d i c a t e t h a t s o m eh y b r i d i z a t i o n c l a s s e s r e p r e s e n t a g e n o m i c E c o R I f r a g m e n tt h a t c a r r i e s m o r e t h a n o n e g e n e i n v o l v e d i n c o e n z y m e B 1 2s y n t h e s i s . I n a d d i t i o n , u n c o m p l e m e n t e d P . p u t i d a T n S m u -t a n t s b e l o n g e d t o t h e s a m e h y b r i d i z a t i o n c l a s s e s ( c l a s s e s 3a n d 6 ) .A l t h o u g h s o m e i n s e r t s o f t h e s e 1 4 p l a s m i d s o v e r l a p , w ec a n d e d u c e t h a t e a c h i n s e r t c a r r i e s a t l e a s t o n e d i f f e r e n t g e n ei n v o l v e d i n c o b a l a m i n b i o s y n t h e s i s , s i n c e e a c h p l a s m i dd e f i n e s a s p e c i f i c c o m p l e m e n t a t i o n g r o u p ( T a b l e 5 ) . A t o t a lo f a t l e a s t 1 4 P . d e n i t r i f i c a n s g e n e s i n v o l v e d i n t h e t r a n s f o r -m a t i o n o f u r o p o r p h y r i n o g e n I I I t o c o e n z y m e B 1 2 h a v e t h u sb e e n c l o n e d .C o m p l e m e n t a t i o n b y p X L 1 8 9 , p X L 1 9 0 , p X L 1 9 1 , o rp X L 3 0 0 ( F i g . 3 ) was n o t s p e c i f i c b e c a u s e s e v e r a l m u t a n t sw e r e c o m p l e m e n t e d b y t h e s e p l a s m i d s a n d n o t b y t h e i rs u b c l o n e s ( T a b l e 5 ) . F o r i n s t a n c e , p X L 1 9 0 c o m p l e m e n t e dG 1 6 2 , w h i c h was n o t c o m p l e m e n t e d b y pXL239 o r pXL556( F i g . 3 ) . p X L 1 8 9 , p X L 1 9 0 , p X L 1 9 1 , a n d p X L 3 0 0 s h o u l dc a r r y a d d i t i o n a l g e n e s t h a t a r e n o t r e v e a l e d b y t h e c o m p l e -

V O L . 1 7 1 , 1 9 8 9


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5 5 4 CAMERON ET A L .

GROUP A H E H Be

p X L 1 5 1p XL 1 5 21 kb

s o x a 8 8 EI I I I I - -pXL444 p X L 6 7 S pXL4528 Sp X L S S 8

Sg S9 IpXL436GROUP B Ep X L S O O

IXS H l ~ ~ ~ ~ I S H E EaXsXHB BH H B HS E XX ES XI I I I I 1 1 1 1 - 1 I I I1 1 1 I 1 1 I I I I 1

pXL1 5 3p X L 1 5 4

pXL735 E xpXLS37GROU P C

H _S E S S S 8 X S B X SB E B S I X H H E SH H S E X XI1II I I I I II- I I I IpXLI 56

pXL157pXLI58

p X L I 59pAL J V Up X L 6 I S

S SI -p X L 6 1 7S PpXL622

GRO UP D

E S C EcoRVI I IpXL227 pXL556H S . uI I

S a u C p X L 2 3 9aE BpXL189 I IpXL220C S a uI IpXLl90C

pXL1 9 1

S S BE SpXL519

B g B gp X L 6 S S

F I G . 3 . P h y s i c a l map o f i n s e r t s o f t h e 1 1 p l a s m i d s f r o m t h e g e n o m i c l i b r a r y o f P . d e n i t r i f i c a n s t h a t c o m p l e m e n t Cob m u t a n t s o f P . p u t i d aa n d A . t u m e f a c i e n s . S h o w n a r e i n s e r t s o f e a c h p l a s m i d a s w e l l a s i n s e r t s o f t h e 1 4 s u b c l o n e s a n d p l a s m i d s p X L 3 0 0 , p X L 1 8 9 , p X L 1 9 0 , a n dp X L 1 9 1 . T h e 1 1 p l a s m i d s a n d t h e i r s u b c l o n e s w e r e i n t r o d u c e d i n t o m u t a n t s b y t r i p a r e n t a l m a t i n g ; t h e t r a n s c o n j u g a n t s w e r e s t u d i e d f o rc o b a l a m i n s y n t h e s i s i n a 2 5 - m l P S 4 c u l t u r e . T h e m u t a n t s c o m p l e m e n t e d b y t h e s e a r e l i s t e d i n T a b l e s 4 a n d 5 . B , BamHI; B g , B g I I I ; C , C l a I ;E , E c o R I ; H , H i n d l I l ; P , P s t I ; S a , S a l l ; S a u , S a u 3 A I ; S , S s t I ; X , X h o I .


S o u

I


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CO ENZYME B 1 2 BIOSYNTHESIS I N P . DENITRIFICANS 5 5 5TABLE 5 . R e l e v a n t C o b m u t a n t s o f A . t u m e f a c i e n s a n d P . p u t i d a a n d t h e s u b c l o n e s t h a t c o m p l e m e n t t h e m

S u b c l o n e s t h a t C o m p l e m e n t e d m u t a n t s aG r o u p c o m p l e m e n t m u t a n t s P . p u t i d a A . t u m e f a c i e n sA pXL444 G 6 1 2p X L 6 7 8 G 5 5 1 ( 4 ) , G 5 5 9 ( 4 ) , G 5 6 1 ( 4 ) G 6 1 4 , G 6 1 6 , G 6 1 7p X L 4 5 2 G 5 5 8 ( 5 ) , G 5 7 0 G 6 0 9 , G 6 1 0p X L 6 8 4 G 5 5 2 ( 2 ) , G 5 5 6 ( 2 ) , G 5 5 7 ( 2 ) , G 5 6 0 ( 2 ) G 1 6 6 ( 1 ) , G 6 2 0p X L 4 3 6 G 5 4 8 ( 4 ) G 6 1 5p X L 3 0 0 b G 1 6 4 ( 1 ) , G 2 6 1 ( 1 ) , G 6 1 3 , G 6 1 1 , G 6 1 9 , G 6 3 8B p X L 7 3 5 G 1 5 9 ( V I ) , G 1 6 9 ( V I ) , G 2 5 8 ( V I ) , G 2 0 3 5p X L 8 3 7 G 1 6 1 ( V ) , G 1 7 1 ( V ) , G 2 0 3 4 , G 2 0 3 7C p X L 6 1 7 G 5 6 2 ( 1 ) G 1 7 0 ( I I I ) , G 2 6 0 ( I I I ) , G 2 6 2 ( I I I ) , G 6 2 4 , G 6 2 9p X L 6 2 2 G 5 4 9 ( 1 ) , G 5 7 3 G 6 4 2 , c G 2 0 4 3 Cp X L 2 2 7 G 6 3 2 , G 6 3 3p X L 5 5 6 G 6 3 7 , G 6 4 8p X L 2 3 9 G 5 5 4 ( 1 ) , G 5 7 7 G 6 4 3p X L 2 2 0 G 5 7 2p X L 1 8 9 d G 6 3 1p X L 1 9 0 e G 1 6 2 ( I V ) , G 2 5 6 ( I V ) , G 63 5 , G 6 3 6 , G 6 3 9p X L 1 9 1 f G 1 6 0 ( I I ) , G 1 6 5 ( I I ) , G 6 3 4D p X L 6 9 8 G 2 0 3 8 , C G 2 0 3 9 , c G 2 0 4 0 , c G 2 0 4 1 , c , G 2 0 4 2 Ca A r a b i c a n d r o m a n n u m e r a l s i n p a r e n t h e s e s i n d i c a t e g e n e t i c c l a s s e s t o w h i c h t h e T n S m u t a n t s b e l o n g .b C o m p l e m e n t s a l l m u t a n t s c o m p l e m e n t e d b y p X L 4 5 2 , p X L 6 7 8 , p X L 6 8 4 .c M u t a n t s p o s i t i v e l y a s s a y e d w i t h E . c o l i 1 1 3 - 3 .d C o m p l e m e n t s a l l m u t a n t s c o m p l e m e n t e d b y p X L 2 2 7 .e C o m p l e m e n t s a l l m u t a n t s c o mp l e m en t e d b y p X L 5 5 6 o r p X L 2 3 9 .f C o m p l e m e n t s a l l m u t a n t s c o m p l e m e n t e d b y p X L5 5 6 , p X L2 3 9 , p X L2 2 0 , o r p X L 1 9 0 .

m e n t a t i o n d a t a o b t a i n e d w i t h t h e 1 4 s u b c l o n e s m e n t i o n e da b o v e .A n a l y s i s o f m u t a n t s b l o ck e d i n t h e c o nv e r s i on o f c o b i n a m i d ei n t o c o b a l a m i n . Among t h e v a r i o u s C o b m u t a n t s i s o l a t e d ,s o m e e x h i b i t e d t h e s a m e l e v e l s o f c o b a l a m i n p r o d u c t i o n a sd i d t h e w i l d t y p e w h e n a s s a y e d w i t h E . c o l i 1 1 3 - 3 a s t h ei n d i c a t o r s t r a i n ( T a b l e 5 ) ; i n c o n t r a s t , w h e n p r o d u c t i o n o fc o b a l a m i n was a s s a y e d b y u s i n g E . c o l i 1 1 3 - 3 C b l l ( w h i c h i sb l o c k e d i n t h e c o n v er s i o n o f d i c y a n o c o b i n a m i d e i n t o c o b a -l a m i n ) , s y n t h e s i s o f c o b a l a m i n b y t h e s e m u t a n t s w a s a t l e a s t5 0 t i m e s l o w e r t h a n t h a t o f t h e w i l d t y p e . Among t h e s e C o bm u t a n t s w e r e t w o m u t a n t s o f P . p u t i d a ( G 5 4 9 a n d G 5 7 3 ) a n ds e v e n m ut a n t s o f A . t u m e f a c i e n s ( G 6 4 2 a n d G 2 0 3 8 t oG 2 0 4 3 ) . I n a d d i t i o n , c o b a l a m i n p r o d u c t i o n w a s c o m p a r a b l ew i t h t h a t o f t h e w i l d t y p e w h e n a s s a y e d w i t h NI F b u t w a ss i g n i f i c a n t l y r e d u c e d w h e n a s s a y e d w i t h I F ( d a t a n o ts h o w n ) . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t s u c h m u t a n t s a r e b l o c k e di n t h e c o n v e r s i o n o f c o b i n a m i d e t o c o b a l a m i n . T h e y w e r ec o m p l e m e n t e d b y t w o s u b c l o n e s , p X L 6 2 2 a n d p X L 6 9 8 ,d e f i n i n g t w o c l a s s e s o f m u t a n t s ( T a b l e 5 a n d F i g . 3 ) . p X L 6 2 2a n d p X L 6 9 8 s h o u l d e a c h c a r r y a t l e a s t o n e g e n e w h o s ep r o d u c t i s i n v o l v e d i n t h e c on v e r s i o n o f c o b i n a m i d e t oc o b a l a m i n . Among t h e 1 4 g e n e s c l o n e d , t w o a r e t h u s i m p l i -c a t e d i n t h e l a s t p a r t o f t h e c o b a l a m i n b i o s y n t h e t i c p a t h w a ya n d a r e c a r r i e d b y p l a s m i d s p X L 6 2 2 a n d p X L 6 9 8 .

DISCUSSIONT h e s e l e c t i o n o f m u t a n t s u n a b l e t o g r o w o n e t h a n o l a m i n ea s t h e s o l e s o u r c e o f n i t r o g e n h a s e na b l e d u s t o i s o l a t e P .p u t i d a m u t a n t s d e f i c i e n t i n c o b a l a m i n b i o s y n t h e s i s . T h i sr e s u l t s u p p o r t s t h e i d e a t h a t i n P . p u t i d a , e t h a n o l a m i n ea m m o n i a - l y a s e r e q u i r e s a d e n o s y l c o b a l a m i n t o b e a c t i v e .S i m i l a r r e s u l t s h a v e b e e n o b t a i n e d w i t h B . m e g a t e r i u m ( 4 8 ) ,f r o m w h i c h c o b a l a m i n b i o s y n t h e s i s - d e f i c i e n t m u t a n t s w e r e

i s o l a t e d b y s c r e e n i n g f o r m u t a n t s a u x o t r o p h i c f o r v i t a m i nB 1 2 i n t h e p r e s e n c e o f e t h a n o l a m i n e a s t h e s o l e s o u r c e o fn i t r o g e n . I t i s l i k e l y t h a t t h i s p r o c e d ur e c a n b e g e n e r a l i z e d t omany c o b a l a m i n - p r o d u c i n g b a c t e r i a t h a t a r e a b l e t o m e t a b -o l i z e e t h a n o l a m i n e . H o w e v e r , a t t e m p t s t o f i n d s c r e e n i n gc o n d i t i o n s f o r t h e d e t e c t i o n o f A . t u m e f a c i e n s Cob m u t a n t sh a v e f a i l e d , a n d m o s t A . t u m e f a c i e n s C o b m u t a n t s d e s c r i b e di n t h i s r e p o r t g r o w o n E t h m e d i u m . A s i m i l a r a p p r o a c h ,b a s e d o n t h e v i t a m i n B 1 2 r e q u i r e m e n t i n a n a e r o b i o s i s f o r t h eg r o w t h o f a n S . t y p h i m u r i u m metE m u t a n t , h a s b e e n d e -s c r i b e d t o s c r e e n C o b m u t a n t s ( 2 9 ) . T h i s t y p e o f s c r e e n i n gc a n p r o b a b l y b e u s e d f o r b a c t e r i a s u c h a s R . m e l i l o t i , t h eg r o w t h o f w h i c h d e p e n d s o n t h e p r e s e n c e o f v i t a m i n B 1 2 i nt h e m e d i u m w h e n c o b a l t i o n s a r e a b s e n t ( 2 7 , 2 8 ) . I n t h i sc a s e , t h e v i t a m i n B 1 2 - d e p e n d e n t e n z y m e s i n v o l v e d a r e ar i b o n u c l e o t i d e r e d u c t a s e ( 2 8 ) a n d a m e t h i o n i n e s y n t h e t a s e( 2 7 ) . R . m e l i l o t i C o b m u t a n t s c o u l d p r o b a b l y b e d e t e c t e d b yt h e a b s e n c e o f g r o w t h o n a m i n i m a l m e d i u m a n d c o r r e c t i o no f t h i s d e f e c t b y v i t a m i n B 1 2 . S u c h a s c r e e n i n g p r o c e d u r e d i dn o t a l l o w t h e i s o l a t i o n o f C o b m u t a n t s i n A . t u m e f a c i e n s .A t l e a s t 1 4 g e n e s i n v o l v e d i n c o b a l a m i n s y n t h e s i s i n P .d e n i t r i f i c a n s h a v e b e e n c l o n e d ; 1 2 a r e i m p l i c a t e d i n t h ec o n v e r s i o n o f u r o p o r p h y r i n o g e n I I I t o c o b i n a m i d e , a n d 2 a r ei m p l i c a t e d i n t h e c o n v e r s i o n o f c o b i n a m i d e t o c o e n z y m eB 1 2 . T h e s e g e n e s h a v e b e e n i d e n t i f i e d b y h e t e r o l o g o u sc o m p l e m e n t a t i o n o f P . d e n i t r i f i c a n s o r A . t u m e f a c i e n s Cobm u t a n t s w i t h a m p l i f i e d P . d e n i t r i f i c a n s DNA. We d o n o tknow w h e t h e r t h e a b s e n c e o f c o m p l e m e n t a t i o n f o r 1 0 o f 2 6P . d e n i t r i f i c a n s C o b m u t a n t s a n d f o r 1 5 o f 1 4 8 A . t u m e f a -c i e n s C o b m u t a n t s i s d u e t o t h e l a c k o f t h e d e s i r e d f r a g m e n t si n t h e g e n o m i c l i b r a r y o r t o p r o b l e m s r e l a t e d t o e i t h e r t h ea b s e n c e o f h e t e r ol o g o us g e n e e x p r e s s i o n o r d i f f e r e n c e s i ng e n e t i c o r g a n i z a t i o n b e t w e e n P . d e n i t r i f i c a n s a n d A . t u m e -f a c i e n s o r P . p u t i d a . A n o t h e r p o s s i b i l i t y i s t h a t a t l e a s t somee n z y m e s i n v o l v e d i n s u c h a m e t a b o l i c p a t h w a y a r e a r r a n g e d

V O L . 1 7 1 , 1 9 8 9


11/12

5 5 6 C A ME R O N ET A L .i n m u l t i e n z y m a t i c c o m p l e x e s ( 4 5 ) , w h i c h w o u l d m a k e i t l e s sp r o b a b l e t h a t m u t a n t s i n t h e c o r r e s p o n d i n g g e n e s w o u l d b ec o m p l e m e n t e d b y h e t e r o l o g o u s DNA. On t h e b a s i s o f t h ep e r c e n t a g e o f c o m p l e m e n t e d m u t a n t s w i t h P . d e n i t r i f i c a n sa m p l i f i e d DNA, i t a p p e a r s t h a t c o m p l e m e n t a t i o n o f A .t u m e f a c i e n s m u t a n t s w a s m o r e s u c c e s s f u l t h a n w a s t h a t o fP . p u t i d a m u t a n t s .

I t c a n b e d e d u c e d f r o m s e v e r a l p u b l i c a t i o n s ( 3 , 2 2 , 2 6 , 4 1 ,4 2 , 4 6 ) t h a t m o r e t h a n 2 0 i n t e r m e d i a t e s s h o u l d b e r e q u i r e d i nt h e p a t h w a y f r o m u r o p o r p h y r i n o g e n I I I t o c o b a l a m i n . H o w -e v e r , t h e n u m b e r o f e n z y m e s i n v o l v e d i n t h i s p a t h w a y c o u l db e s m a l l e r , s i n c e ( i ) d u r i n g t h e b u i l d i n g o f t h e c o r r i n m a c r o -c y c l e , o n e c o u l d c a r r y o u t m o r e t h a n o n e m e t h y l a t i o n w h e nm e t h y l g r o u p s a r e t r a n s f e r r e d a t e q u i v a l e n t p o s i t i o n s ( 4 2 ) ( i ts e e m s , f o r i n s t a n c e , t h a t o n e e n z y m e i n P r o p i o n i b a c t e r i u ms h e r m a n i i c a t a l y z e s t h e t r a n s f e r o f t w o m e t h y l g r o u p s t ou r o p o r p h y r i n o g e n I I I [ 3 8 ] ) ; a n d ( i i ) d u r i n g t h e c o n v e r s i o n o fc o b y r i n i c a c i d t o c o b i n a m i d e , t h e s i x a m i d a t i o n s o f t h ep r o p i o n i c a n d a c e t i c g r o u p s i n t h e c o r r i n m a c r o c y c l e m a yn o t r e q u i r e s i x d i f f e r e n t e n z y m e s . A n a l y s e s o f m u t a n t s a n dt h e i r p r o d u c t s c o u l d e s t a b l i s h t h i s p o i n t . M o r e o v e r , t h en u m b e r o f c l o n e d g e n e s i s l i k e l y t o b e u n d e r e s t i m a t e db e c a u s e m o r e t h a n o n e g e n e c o u l d b e p r e s e n t o n e a c hs u b c l o n e d e f i n i n g a c o m p l e m e n t a t i o n g r o u p . A l t h o u g h wec a n n o t y e t d e t e r m i n e w h e t h e r a l l o f t h e c l o n e d g e n e s a r es t r u c t u r a l o r w h e t h e r s o m e o f t h e m p l a y o n l y a r e g u l a t o r yr o l e , o u r r e s u l t s i l l u s t r a t e t h e g e n e t i c a n d b i o c h e m i c a l c o m -p l e x i t y o f t h i s p a t h w a y .T h e c l o n e d g e n e s a r e g r o u p e d i n t o f o u r g e n o m i c r e g i o n s ,a n d we d o n o t y e t k n o w w h e t h e r t h o s e C o b l o c i a r e c l u s t e r e do r l o c a t e d a t d i s t a n t p o s i t i o n s o n t h e c h r o m o s o m e o f P .d e n i t r i f i c a n s . C l u s t e r i n g o f Cob g e n e s i s n o t p e c u l i a r t o P .d e n i t r i f i c a n s , h a v i n g a l r e a d y b e e n r e p o r t e d f o r B . m e g a t e -r i u m a n d S . t y p h i m u r i u m ( 8 , 2 9 ) . I n B . m e g a t e r i u m , a l l o f t h eC o b m u t a t i o n s f o u n d a r e l i n k e d b y c o t r a n s d u c t i o n ( 4 8 ) ; i n S .t y p h i m u r i u m , t h e s a m e r e s u l t s h a v e b e e n f o u n d e x c e p t f o rt h e c y s G m u t a t i o n , w h i c h i n d i c a t e s t h a t m o s t o f t h e Cobg e n e s a r e l o c a t e d i n t h e s a m e r e g i o n o n t h e c h r o m o s o m e .F o r P . d e n i t r i f i c a n s , t h e c l u s t e r w o u l d c o v e r a t l e a s t 7 8 k b pi f a l l o f t h e Cob g e n e s w e r e l i n k e d o n t h e c h r o m o s o m e .F u r t h e r m o r e , t h e i n s e r t s o f t h e 1 4 s u b c l o n e s c o m p l e m e n t i n gC o b m u t a n t s ( F i g . 3 ) t o g e t h e r r e p r e s e n t 3 2 k b p , w h i c h i sm u c h m o r e t h a n t h e t o t a l l e n g t h o f 1 2 k b p f o r t h e c l o n e dDNA f r a g m e n t s o f B . m e g a t e r i u m c o n t a i n i n g 1 1 C o b g e n e s( 8 ) ; t h i s f a c t may s u g g e s t t h a t P . d e n i t r i f i c a n s C o b g e n e s a r em o r e s p r e a d o u t t h a n a r e t h e c o r r e s p o n d i n g g e n e s f r o m B .m e g a t e r i u m .

ACKNOWLEDGMENTSWe a c k n o w l e d g e A . R a m b a c h , f o r m e r p r e s i d e n t o f G d n e t i c a S . A . ,f o r h i s c o n t i n u e d i n t e r e s t a n d s u p p o r t d u r i n g t h i s w o r k . Wee x p r e s s o u r g r a t i t u d e t o M . K n a p p f o r h i s h e l p d u r i n g t h e i n i t i a l p a r to f t h e w o r k a n d f o r h i s a d v i c e . We t h a n k P . E . B o s t , G . B o u r a t , a n dJ . L u n e l ( R h 6 n e - P o u l e n c S a n t e ) f o r t h e i r c o n s t a n t i n t e r e s t i n o u rw o r k . We e x p r e s s o u r g r a t i t u d e t o G . D i t t a , D . H e l i n s k i , F .R i c h a u d , a n d K . T i m m i s f o r t h e g i f t o f p l a s m i d s o r s t r a i n s ; J . D a v i e s( I n s t i t u t P a s t e u r ) a n d J . - F . M a y a u x f o r c r i t i c a l r e a d i n g o f t h em a n u s c r i p t a n d h e l p f u l d i s c u s s i o n s ; a n d F . B l a n c h e , D . T h i b a u t ,a n d S . S c h i l . We a l s o t h a n k S . B o n n a m y , L. C a u c h o i s , A . D r i v e r ,N . F a u l c o n n i e r , S . R i g a u l t , a n d M . - C . R o u y e z f o r t h e i r e x c e l l e n tt e c h n i c a l a s s i s t a n c e .T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y R h o n e - P o u l e n c S a n t e .

LITERATURE CITED1 . B a b i o r , B . M. 1 9 8 2 . E t h a n o l a m i n e a m m o n i a - l y a s e , p . 1 0 7 - 1 4 4 .I n D . D o l p h i n ( e d . ) , B 1 2 , v o l . 1 . J o h n W i l e y & S o n s , I n c . , Ne wY o r k .

2 . B a g d a s a r h n, M . , R . L u r z , B . R i e k e r t , F . C . F r a n k l i n , M. M.B a g d a s a r i a n , J . F r e y , a n d K . T I m m i s . 1 9 8 1 . S p e c i f i c - p u r p o s ep l a s m i d c l o n i n g v e c t o r s . I I . B r o a d h o s t r a n g e , h i g h c o p y n u m -b e r , R S F 1 0 1 0 - d e r i v e d v e c t o r s , a n d a h o s t v e c t o r s y s t e m f o rg e n e c l o n i n g i n P s e u d o m o n a s . G e n e 1 6 : 2 3 7 - 2 4 7 .3 . B a t t e r s b y , A . R . , a n d E . M a c D o n a l d . 1 9 8 2 . B i o s y n t h e s i s o f t h ec o r r i n m a c r o c y c l e , p . 1 0 7 - 1 4 4 . I n D . D ol p h i n ( e d . ) , B 1 2 , v o l . 1 .J oh n W i l e y & S o n s , I n c . , Ne w Y o r k .4 . B e c k , W. S . 1 9 8 2 . B i o l o g i c a l a n d m e d i c a l a s p e c t s o f v i t a m i n B 1 2 ,p . 1 - 3 0 . I n D . D o l p h i n ( e d . ) , B 1 2 , v o l . 1 . J o h n W i l e y & S o n s ,I n c . , Ne w Y o r k .5 . B e r i n g e r , J . E . , J . L . B e y n o n , A . V . B u c h a n a n - W o l a s t o n , a n dA . W. B . J oh n s t on . 1 9 7 8 . T r a n s f e r o f t h e d r u g - r e s i s t a n c e t r a n s -p o s o n T n S t o R h i z o b i u m m e l i l o t i . N a t u r e ( Lo n do n ) 2 7 6 : 6 3 3 -6 3 4 .6 . B i r n b o i m , H . C . , a n d J . D o l y . 1 9 7 9 . A r a p i d a l k a l i n e e x t r a c t i o np r o c e d u r e f o r s c r e e n i n g r e c o m b i n a n t p l a s m i d DNA. N u c l e i cA c i d s R e s . 7 : 1 5 1 3 - 1 5 2 3 .7 . B r a d b e e r , C . 1 9 8 2 . C o b a l a m i n t r a n s p o r t i n m i c r o o r g a n i s m s , p .1 4 5 - 1 6 7 . I n D . D o l p h i n ( e d . ) , B 1 2 , v o l . 2 . J oh n W i l e y & S o n s ,I n c . , Ne w Y o r k .8 . B r e y , R . N . , C . D . B . B a n n e r , a n d J . B . W o l f . 1 9 8 6 . C l o n i n g o fm u l t i p l e g e n e s i n v o l v e d w i t h c o b a l a m i n ( v i t a m i n B 1 2 ) b i o s y n -t h e s i s i n B a c i l l u s m e g a t e r i u m . J . B a c t e r i o l . 1 6 7 : 6 2 3 - 6 3 0 .9 . C a s a d a b a n , M. J . , A . M a r t i n e z - A r i a s , S . T . S h a p i r a , a n d J .

C h o u . 1 9 8 3 . , B - G a l a c t o s i d a s e g e n e f u s i o n f o r a n a l y s i n g g e n ee x p r e s s i o n i n E s c h e r i c h i a c o l i a n d y e a s t . M e t h o d s E n z y m o l .1 0 0 : 2 9 3 - 3 0 8 .1 0 . C l a r k e , L . , a n d J . C a r b o n . 1 9 7 6 . A c o l o n y b a n k c o n t a i n i n gs y n t h e t i c C o l E 1 h y b r id p l a s m i ds r e p r e s e n t a t i v e o f t h e e n t i r e E .c o l i g e n o m e . C e l l 9 : 9 1 - 9 9 .1 1 . D a v i s , B . D . , a n d E . M i n g i o l i . 1 9 5 0 . M u t a n t s o f E s c h e r i c h i a c o l ir e q u i r i n g m e t h i o n i n e o r v i t a m i n B 1 2 . J . B a c t e r i o l . 6 0 : 1 7 - 2 8 .1 2 . D e G r a f f , J . , J . H . C r o s a , F . H e f f r o n , a n d S . F a l k o w . 1 9 7 8 .R e p l i c a t i o n o f t h e n o n c o n j u g a t i v e p l a s m i d R S F 1 0 1 0 i n E s c h e -r i c h i a c o l i K - 1 2 . J . B a c t e r i o l . 1 4 6 : 1 1 7 - 1 2 2 .1 3 . D i t t a , G . , S . S t a n f i e l d , D . C o r b i n , a n d D . R . H e l n s k i . 1 9 8 0 .B r o a d h o s t r a n g e DNA c l o n i n g s y s t e m f o r G r a m - n e g a t i v eb a c t e r i a : c o n s t r u c t i o n o f a g e n e l i b r a r y o f R h i z o b i u m m e l i l o t i .P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 7 : 7 3 4 7 - 7 3 5 1 .1 4 . D o u d o r o f f , M . , R . C o n t o p o ul o u , R . K u n i s a w , a n d N . J . P a L e r o n i .1 9 7 4 . T a x o n o m i c v a l i d i t y o f P s e u d o m o n a s d e n i t r i f i c a n s ( C h r i s t -e n s e n ) B e r g e y e t a l . I n t . J . S y s t . B a c t e r i o l . 2 4 : 2 9 4 - 3 0 0 .1 5 . D o y e n , N . , A . J . P e s c e , a n d C . L a p r e s l e . 1 9 8 1 . S p e c i f i c i t y o f t w oa n t i - h u m a n a l b u m i n m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s . I m m u n o l . L e t t . 3 :3 6 5 - 3 7 0 .1 6 . E n g v a l l , E . 1 9 8 0 . E n z y m e i m m u n o a s s a y ELISA a n d E M I T .M e t h o d s E n z y m o l . 7 0 : 4 1 9 4 3 9 .1 7 . F a , Y . H . , J . P . K u s e l , a n d A . L . D e m a i n . 1 9 8 4 . D e p e n d e n c e o fb e t a i n e s t i m u l a t i o n o f v i t a m i n B 1 2 o v er p r o du ct i o n o n p r o t e i ns y n t h e s i s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 7 : 1 0 6 7 - 1 0 6 9 .1 8 . F i g u r s k l , D . H . , a n d D . R . H e U I n s k l . 1 9 7 9 . R e p l i c a t i o n o f a no r i g i n - c o n t a i n i n g d e r i v a t i v e o f p l a s m i d RK2 d e p e n d e n t o n ap l a s m i d f u n c t i o n p r o v i d e d i n t r a n s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U SA7 6 : 1 6 4 8 - 6 5 2 .1 9 . F l o r e n t , J . 1 9 8 6 . V i t a m i n s , p 1 1 5 - 1 5 8 . I n H . - J . Rehm a n d G .R e e d ( e d . ) , B i o t e c h n o l o g y , v o l . 4 . VC H V e r l a g s g e s e l l s c h a f tm b H , W e i n h e i m , F e d e r a l R e p u b l i c o f G e r m a n y .2 0 . F o s t e r , T . J . 1 9 8 3 . P l a s m i d - d e t e r m i n e d r e s i s t a n c e t o a n t i m i c r o -b i a l d r u g s a n d t o x i c m e t a l i o n s i n b a c t e r i a . M i c r o b i o l . R e v . 4 7 :3 6 1 4 0 9 .2 1 . F r e y , J . , M. B a g d a a n , D . F e i s s , F . C . H . F r a n k l i n , a n d J .D e h u s s e s . 1 9 8 3 . S t a b l e c o s m i d v e c t o r s t h a t e n a b l e t h e i n t r o d u c -t i o n o f c l o n e d f r a g m e n t s i n t o a w i d e r a n g e o f G r a m - n e g a t i v eb a c t e r i a . G e n e 2 4 : 2 9 9 - 3 0 8 .2 2 . F r i e d m a n n , H . C . 1 9 7 5 . B i o s y n t h e s i s o f c o r r i n o i d s , p . 7 5 - 1 0 9 . I nB . B a b i o r ( e d . ) , C o b a l a m i n b i o c h e m i s t r y a n d p a t h o p h y s i o l o g y .J o h n W i l e y & S o n s , I n c . , Ne w Y o r k .2 3 . G i l l e s , H . , a n d R . K . T h a u e r . 1 9 8 3 . U r o p o r p h y r i n o g e n I I I , a ni n t e r m e d i a t e i n t h e b i o s y n t h e s i s o f t h e n i c k e l - c o n t a i n i n g F 4 3 0 i nM e t h a n o b a c t e r i u m t h e r m o a u t o t r o p h i c u m . E u r . J . B i o c h e m .1 3 5 : 1 0 9 - 1 1 2 .2 4 . G o t l i e b , C . , K . S . L a u , a n d L . R . W a s s e r m a n . 1 9 6 5 . R a p i d



12/12

C OENZYME B 1 2 BIOSYNTHESIS I N P . DENITRIFICANS 5 5 7c h a r c o a l a s s a y f o r i n t r i n s i c f a c t o r ( I F ) , g a s t r i c j u i c e u n s a t u r a t e dB 1 2 b i n d i n g c a p a c i t y , a n t i b o d y t o I F , a n d s e r um u n s a t u r a t e d B 1 2b i n d i n g c a p a c i t y . B l o o d 2 5 : 8 7 3 - 8 8 3 .2 5 . H o y k a a s , P . J . J . , R . P e e r b o l t , A . J . G . R eg e n s b u r g - Tu i n g , P . d eV r i e s , a n d R . A . S c h i l p e r o r t . 1 9 8 2 . A c h r o m o s o m a l l i n k a g e mapo f A g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s a n d a c o m p a r i s o n w i t h t h e m a p so f R h i z o b i u m s p . M o l . G e n . G e n e t . 1 8 8 : 1 2 - 1 7 .2 6 . H u e n n e k e n s , F . M . , K . S . V i t o l s , K . F u j i i , a n d D . W. J a c o b s e n .1 9 8 2 . B i o s y n t h e s i s o f c o b al a m i n c o e nz y m e s , p . 1 4 5 - 1 6 7 . I n D .D o l p h i n ( e d . ) , B 1 2 , v o l . 1 . J o h n W i l e y & S o n s , I n c . , Ne w Y o r k .2 7 . I n u k a i , S . , K . S a t o , a n d S . S h i m i z u . 1 9 7 7 . T h e r e l a t i o n s h i p o fc o b a l t r e q u i r e m e n t t o v i t a m i n B 1 2 - d e p e n d e n t m e t h i o n i n e s y n -t h e s i s i n R h i z o b i u m m e l i l o t i . A g r i c . B i o l . C h e m . 4 1 : 2 2 2 9 - 2 2 3 4 .2 8 . I n u k a i , S . , K . S a t o , a n d S . S h i n i z u . 1 9 7 9 . P u r i f i c a t i o n a n dp r o p e r t i e s o f v i t a m i n B 1 2 - d e p e n d e n t r i b o n u c l e o t i d e r e d u c t a s ef r o m R h i z o b i u m m e l i l o t i . A g r i c . B i o l . C h e m . 4 3 : 6 3 7 - 6 4 6 .2 9 . J e t e r , R . M . , B . M. O l i v e r a , a n d J . R . R o t h . 1 9 8 4 . S a l m o n e l l at y p h i m u r i u m s y n t h e s i z e s c o b a l a m i n ( v i t a m i n B 1 2 ) d e n o v o u n d e ra n a e r o b i c g r o w t h c o n d i t i o n s . J . B a c t e r i o l . 1 5 9 : 2 0 6 - 2 1 6 .3 0 . J e t e r , R . M . , a n d J . R. R o t h . 1 9 8 7 . C o b a l a m i n ( v i t a m i n B 1 2 )

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J. Bacteriol. 1989 Cameron 547 57