J09

Průkaz nukleové kyseliny

VLLM0421c (jaro 2016)

Osnova

● využití a metody průkazu NK● PCR a její modifikace● proces prokazování specifické sekvence NK

2/55

Přímé vs. nepřímé metody

přímé● hledáme mikroba, jeho

část či jeho produkt (produktem může být například nějaký bakteriální antigen či jed – toxin)

● agens je přítomno nyní

3/55

nepřímé● hledáme protilátky

● protilátka není součástí ani produktem mikroba (produkt makroorganismu, odezvou na činnost mikroba)

● agens bylo přítomno někdy v minulosti

Přímé metody – přehled

4/55

Metoda Průkaz ve vzorku

Identifikace kmene

Mikroskopie ano ano

Kultivace ano ano

Biochemická identifikace

ne ano

Průkaz antigenu, toxinu

ano ano

Pokus na zvířeti ano v praxi ne

Molekulární metody ano v praxi ne*

*netýká se molekulární epidemiologie (sledování příbuznosti kmenů)

Využití průkazu nukleové kyseliny

● dg. bakteriálních i virových nákaz, když není možné (nebo velmi obtížné) použít jiné metody (mikroskopie, kultivace, …)

– bakterie: Mycobacterium tuberculosis (kultivace trvá týdny), Borrelia burgdorferi (dlouhá a složitá kultivace)

– viry: virové průjmy, virus vztekliny, virus hepatitidy B, enteroviry, viry chřipky, adenoviry, RS-virus, viry parainfluenzy, herpex simplex virus, virus příušnic

● pro běžné patogeny se příliš nehodí (velká citlivost)

● virologická vyšetření často epidemiologický nebo výzkumný cíl

5/55

Metody průkazu nukleové kyseliny

● bez amplifikace: genové sondy

● s amplifikací: PCR (polymerázová řetězová reakce), LCR (ligázová řetězová reakce), NASBA (nucleic acid sequence based amplification)

● PCR:

– 1983 – vyvinuta (dr. Karry Mullis)

– 1985 – použita termostabilní polymeráza reakce →jak ji známe dnes (Taq polymeráza)

– 1993 – Nobelova cena za chemii (Mullis, Smith)

● LCR vyvinuta v roce 1991

● NASBA vyvinuta v roce 19916/55

Genové sondy

● proces hybridizace není přímo viditelný molekuly →sondy značeny (digoxigenin, biotin, …)

● značky specificky rozpoznány konjugátem (konjugace s fluoroforem nebo enzymem pro zviditelnění reakce)

7/55

Polymerázová řetězová reakce

● templátová DNA

● primery ohraničujícícílovou sekvenci

● polymeráza

● deoxynukleotidy

● pufr s hořečnatými ionty

8/55

Polymerázová řetězová reakce (2)

● cyklus:

– denaturace (oddělení vláken DNA)

– annealing (hybridizace primerů ke komplementární sekvenci DNA)

– elongace (prodlužování řetězce DNA polymerázou)

9/55

Polymerázová řetězová reakce (3)

10/55

Polymerázová řetězová reakce (4)

● „klasická“ PCR: end-point analýza (po proběhnutí všech cyklů analýza produktů gelovou elektroforézou)

● real-time PCR: sledování amplifikačních produktů po každém proběhlém cyklu („in real time“), nejčastěji používána kvantitativně (qPCR)

● reverzně transkripční PCR (RT-PCR): analýza RNA; samotné PCR předchází přepis RNA do cDNA reverzní transkriptázou

● qRT-PCR (RT-qPCR): kvantitativní (real-time) reverzně transkripční PCR

11/55

Polymerázová řetězová reakce (5)

● qPCR:

– denaturace

– annealing

– elongace

– kvantifikace● nespecifická fluorescenční

barviva (SYBR Green)● sekvenčně specifické sondy

(oligonukleotidy s fluoroforem)– TaqMan®, FRET, Molecular beacon, ...

12/55

Polymerázová řetězová reakce (6)

● hybridizační sondy (FRET)

– Fluorescence Resonance Energy Transfer

13/55

Polymerázová řetězová reakce (7)

● hydrolyzační sondy (TaqMan®)

– využívá 5´– 3´ exonukleázové aktivity Taq DNA polymerázy ke štěpení sondy

14/55

Polymerázová řetězová reakce (8)

● průběh a kvantifikace qPCR

15/55

Polymerázová řetězová reakce (9)

● specifické PCR (specifický gen pro enzym, faktor patogenity apod.)

● multiplex PCR (několik specifických cílových míst v jedné reakci)

● univerzální (cílové místo je gen, který mají všechny bakterie, nejčastěji gen pro 16S rRNA)

● nested PCR (dvě sady primerů použité ve dvou následujících PCR; omezuje vznik nespecifický produktů)

16/55

DNA microarray (DNA chip, gene chip, biochip)

● soubor různých krátkých vláken DNA (oligonukleotidů) přichycených na podkladu ve známých konkrétnách místech (spotech)

● v konkrétním místě je přichyceno více kopií stejného oligonukleotidu (sonda, próba, reportér)

● vzorek:

– DNA (stanovování genového profilu různých organismů, často i blízce příbuzných)

– RNA jako cDNA (předchází krok RT-PCR) pro analýzu exprese

– cílové molekuly označeny flouroforem

17/55

DNA microarray (2)

● cílové molekuly hybridizují s komplementarními vlákny oligonukleotidů přichycenými k destičce

● promytí odplaví všechny neuchycené molekuly

● kvantifikace fluorescence v každém z míst (spotů)

● zpracování bioinformatickými postupy

18/55

DNA microarray (3)

● two-color microarrays nebo two-channel microarrays:

– využíváme jeden mikročip pro zpracování dvou rozdílných vzorků

– každý vzorek označen jiným fluoroforem● nejčastěji zelená a červená

– obyčejně pro porovnání genové exprese● pracujeme s cDNA (původně RNA)

– vzorky smíchány hybridizaze promytí detekce→ → →– zelená/červená: gen exprimován pouze v

jednom ze vzorků

– žlutá: gen exprimován v obou vzorcích 19/55

DNA microarray (3)

● two-color microarrays nebo two-channel microarrays:

– využíváme jeden mikročip pro zpracování dvou rozdílných vzorků

– každý vzorek označen jiným fluoroforem● nejčastěji zelená a červená

– obyčejně pro porovnání genové exprese● pracujeme s cDNA (původně RNA)

– vzorky smíchány hybridizaze promytí detekce→ → →– zelená/červená: gen exprimován pouze v

jednom ze vzorků

– žlutá: gen exprimován v obou vzorcích 20/55

DNA microarray (3)

21/55

Ligázová řetězová reakce

● amplifikace DNA pomocí dvou těsně sousedících sond a ligázy

● dvě sondy a ligáza vytváří specifičtější primer pro následnou PCR (tento krok není nutný)

● specifičtější, detekce SNP

22/55 Wiedmann, M et al. (1994) Ligase chain reaction (LCR) -- Overview and applications.PCR Methods and Applications

Ligázová řetězová reakce (2)

23/55 Wiedmann, M et al. (1994) Ligase chain reaction (LCR) -- Overview and applications.PCR Methods and Applications

Nucleic acid sequence based amplification (NASBA)

● amplifikace RNA (využíváno pro dg. a kvantifikaci HIV v séru)

● izotermická reakce (41 °C)

● reakce obsahuje:

– templátovou RNA

– dva primery (první obsahuje promotor pro T7 RNA polymerázu)

– reverzní transkriptázu (RdDp, DdDp)● Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase (AMV RT)

– RNázu H (v DNA/RNA hybridu odbourává RNA)

– T7 RNA polymerázu24/55

NASBA (2)

25/55

Postup analýzy DNA

● izolace DNA

● amplifikace specifického úseku DNA

● detekce produktu amplifikace

– gelovou elektroforézou

– metodou ELISA (≠ serologická ELISA k průkazu mikrobiálních antigenů nebo protilátek!)

– použitím fluorescenční sondy

26/55

Úkol 1: Izolace DNA

● prohlédněte si videoklip „Izolace DNA“

● ukazuje jen jednu z možností izolace, lze najít řadu dalších

● přečtěte si text a pokuste se odpovědět na dané otázky

27/55

Úkol 1: Izolace DNA (2)

● promíchání lyzátu buněk s roztokem fenolu, případně se směsí fenolu a chloroformu

● fenol je organické rozpouštědlo používané k oddělení proteinů od NK

● proteiny jsou hydrofobnější a zůstávají v organické fázi

● NK jsou vysoce nabité a přecházejí do vodné fáze

● chloroform denaturuje proteiny, rozpouští tuky a napomáhá oddělení jednotlivých fází získaných v následujícím centrifugačním kroku

28/55

Úkol 1: Izolace DNA (2)

● centrifugace: dojde k oddělení

– spodní organické fáze, tvořené fenolem (případně směsí fenolu a chloroformu)

– mezifáze, tvořené denaturovanými proteiny a zbytky buněk

– horní vodné fáze, v níž jsou rozpuštěny NK

● odebrání horní fáze a vysrážení NK etanolem, případně izopropanolem

● shromáždění precipitátu nukleových kyselin

● centrifugací a rozpuštění získaného sedimentu ve vhodném roztoku

29/55

Úkol 2: Amplifikace specifických úseků DNA

● amplifikace PCR v termocykléru

● termocyklér (dokáže rychle a přesně měnit teplotu v termobloku a tedy ve zkumavkách)

● prohlédněte si videoklip„Amplifikace“, přečtěte si text a odpovězte na otázky

30/55

Interní kontrola v PCR

● dochází k tzv. inhibici reakce (běžné)

● inhibice reakce je dána přítomností různých interferujících látek (např. talek z rukavic)

● pro detekci použita směs, obsahující kromě vzorku a jemu příslušných primerů ještě kontrolní DNA a druhou sadu primerů

● pozitivita IC → nedošlo k inhibici reakce● pozor: IC může být negativní u vysoce pozitivních

vzorků (reakce kompetují o nukleotidy)

31/55

Výsledky PCR s IC

● pozitivní výsledek:

– pozitivita vzorku

– IC je zpravidla také pozitivní, ale u silně pozitivních případů nemusí být

● negativní výsledek:

– negativní výsledek reakce při pozitivním výsledku IC

● vzorek i IC negativní = inhibice reakce

32/55

Výsledky PCR s IC: přehled

33/55

Vlastní reakce Interní kontrola Interpretace

negativní pozitivní negativní

negativní negativní inhibice reakce

pozitivní pozitivní pozitivní

pozitivní negativní (vysoce) pozitivní

Úkol 3: Detekce PCR produktu gelovou elektroforézou

● přidává se barvivo pro detekci (ethidium bromid, SYBR Green)

– interkalační barviva (vmezeření mezi báze v malém žlábku DNA)

– ozáření gelu ultrafialovým zářením

– barvivo navázané na DNA emituje světlo

● produkty putují gelem od katody směrem k anodě

● zviditelněny pomocí UV-transluminátoru

● každý vzorek obsahuje také interní kontrolu (IC)

● kromě vzorků je použit také žebříček (ladder) jako měřítko

34/55

Úkol 3a: Detekce PCR produktu

35/55

IC

vlastní reakce

Pacienti P3 a P4 – pozitivní, pacient P2 – negativní, pacient P1 – inhibice reakce. IK = kontrola, PK = pozitivní kontrola, NK = negativní kontrola; zcela vlevo ladder

Úkol 3b: Specifická detekce PCR produktu gelovou elektroforézou

36/55

Podobné jako předchozí, ale paralelní detekce tří fragmentů DNA. Interní kontrola není zařazena, nelze tedy odlišit negativitu od inhibice reakce.

Sta

FemMecA

Úkol 4: Srovnání výsledků průkazu DNA s výsledky průkazu protilátek

● nelze spoléhat jen na výsledek jediné reakce

● pro interpretaci potřebujeme kombinaci výsledků různých reakcí

● máme k dispozici výsledek PCR a výsledek reakce ELISA

● PCR je přímý průkaz, ELISA k průkazu protilátek je průkaz nepřímý

37/55

Úkol 4a: PCR nukleové kyseliny u lymeské borreliózy

38/55

Úkol 4b: Průkaz protilátek proti původci lymeské borreliózy

● A1 – K– (negativní kontrola)

● B1 – cut off č. 1

● C1 – cut off č. 2

● D1 – K+ (pozitivní kontrola)

● E1 – pacient P1

● F1 – pacient P2

● G1 – pacient P3

● Cut off = (B1 + C1) / 2

● interpretace platí pro IgM i IgG39/55

Úkol 4c: Závěr úkolů 4a a 4b

40/55

Pacient PCR ELISA IgM

ELISA IgG

Závěr

1 + + + Aktuálně nakažen

2 – – + Prodělal infekci

3 – – – Nikdy se nesetkal s i.

Úkol 5: Průkaz DNA pomocí PCR s detekcí produktu pomocí ELISA

● v minulém praktiku J08 využití metody ELISA k průkazu antigenů a protilátek

● ELISA k průkazu protilátek byla také použita jako součást předchozího úkolu

● zde nejde o sérologické použití této reakce

● detekce produktu PCR pomocí ELISA

● vedle důlku vzorku také důlek patřící IC

41/55

Úkol 5: Průkaz DNA pomocí PCR s detekcí produktu pomocí ELISA (2)

● A1 = pozitivní kontrola,

● D1 = negativní kontrola

● B1 a C1 = důlky cut off (cut off = jejich průměr)

● hodnoty nad „cut off“ (referenční hodnota) jsou považovány za pozitivní hodnoty.

● E1, F1, G1, H1 = pacienti 1, 2, 3, 4

● E2, F2, G2, H2 = interní kontroly k 1, 2, 3, 4

● pozitivní reakce = pozitivní výsledek

● negativní reakce, positivní IC = negativní výsledek

● negativní reakce, negativní IC = inhibice reakce

42/55

Úkol 6: Real-time PCR

● vyhodnoťte pozitivní a negativní kontroly a čtyři obrázky Real-time PCR, které máte na pracovním stole

● osa x ukazuje počet cyklů

● osa y vyjadřuje množství produktu

● pozitivní křivka by měla dosáhnout limitní linie („threshold“) před 42. cyklem

● plná čára označuje produkt vlastní reakce, čerchovaná čára ukazuje interní kontrolu

43/55

Úkol 6: Real-time PCR (2)

● průběh Real-time PCR

44/55

Úkol 7: Real-time PCR: kvantifikace

● díky Real-time PCR detekujeme nejen pozitivitu vzorku, ale kvantifikujeme i virovou nálož

● spočítejte virovou nálož u čtyř případů podle vzorce v protokolu

45/55

Úkol 7: Real-time PCR: kvantifikace

● díky Real-time PCR detekujeme nejen pozitivitu vzorku, ale kvantifikujeme i virovou nálož

● spočítejte virovou nálož u čtyř případů podle vzorce v protokolu

46/55

počet kopií viru na μl

počet kopií viru na 1 ml

plné krve

P1 14,75 1,5.103

P2 2,3 230

P3 1589 1,6.105

P4 0,5

Sekvenování DNA

● biochemické metody zjišťující pořadí nukleotidových bází v sekvenci DNA

● Maxam–Gilbertova metoda (chemické sekvenování, radioaktivní značky, dnes téměř nepoužívaná)

● Sangerova metoda (současná modifikace: fluorescenční barviva navázaná na jednotlivé dideoxynukleotidy)

● Pyrosekvenování (uvolnění pyrofosfátu z nově začleněného nukleotidu dalšími reakcemi je energie v →pyrofosfátu (difosfát) využita na vznik ATP využito →luciferázou k oxidaci luciferinu a emise světelného kvanta)

● Next-generation sequencing (NGS) 47/55

Pyrosekvenování

48/55

Sangerova metoda

● současná modifikace: fluorescenční barviva navázaná na jednotlivé dideoxynukleotidy

● proces připomíná PCR:

– místo dvou primerů pouze jeden

– kromě deoxynukleotidů ještě dideoxynukleotidy

● detekce elektroforézou (vetšinou kapilární nebo gelová)

49/55

Sangerova metoda (2)

50/55

Vzorek pro sekvenování

● vzorek do laboratoře izolace DNA amplifikace DNA → → vizualizace gelovou elektroforézou → → vyříznutí

vzorku z gelu prečištění sekvenace→ →

51/55

Přiřazení sekvence známému organismu

● bioinformatické přístupy:

– BLAST: Basic Local Alignment Search Tool (NCBI)

– další (specializované) databáze: 16SpathDB

● vyhledávání podobností v databázi

52/55

Přiřazení sekvence známému organismu (BLAST)

53/55

Úkol 8 – správné odpovědi

54/55

Po tomto cvičení byste měli umět:

● vysvětlit využití a metody používané pro průkaz NK (zejména detailně popsat „klasickou“ PCR a Real-time PCR)

● uvést příklady dg. NK

● vysvětlit postup při izolaci DNA a následném zpracování

● popsat metody sekvenování (zejména Sangerovu metodu)

55/55

Snímek 1Snímek 2Snímek 3Snímek 4Snímek 5Snímek 6Snímek 7Snímek 8Snímek 9Snímek 10Snímek 11Snímek 12Snímek 13Snímek 14Snímek 15Snímek 16Snímek 17Snímek 18Snímek 19Snímek 20Snímek 21Snímek 22Snímek 23Snímek 24Snímek 25Snímek 26Snímek 27Snímek 28Snímek 29Snímek 30Snímek 31Snímek 32Snímek 33Snímek 34Snímek 35Snímek 36Snímek 37Snímek 38Snímek 39Snímek 40Snímek 41Snímek 42Snímek 43Snímek 44Snímek 45Snímek 46Snímek 47Snímek 48Snímek 49Snímek 50Snímek 51Snímek 52Snímek 53Snímek 54Snímek 55