JOÃO MARCELO MARQUES DELLIAS

“ ESTRUTURA E PROPRIEDADES ANTICOAGULANTES DE DERMATAM SULFATO DA PELE DE SEIS ESPÉCIES DE ARRAIAS ”

TESE SUBMETIDA À UNIVERSIDADE DO BRASIL – UFRJ VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR EM CIÊNCIAS

Orientador: Prof. Luiz Cláudio Francisco da Silva

Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde

Instituto de Bioquímica Médica

2006

Este trabalho foi realizado no Laboratório de Tecido

Conjuntivo do Instituto de Bioquímica Médica e Hospital

Universitário Clementino Fraga Filho, ambos da Universidade

Federal do Rio de Janeiro, sob a orientação do Prof. Luiz Cláudio

Francisco da Silva, tendo sido financiado pelas seguintes entidades:

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

(CNPq); Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de nível

superior (CAPES) e Fundação de Amparo à Pesquisa do Rio de

Janeiro (FAPERJ).

FICHA CATALOGRÁFICA

Dellias, J. M. M.

Estrutura e propriedades anticoagulantes de dermatam sulfato da pele de seis espécies de arraias.

N de páginas: 71

Tese: Doutor em Ciências 1. Dermatam sulfato; 2. Pele; 3. Arraia; 4. Anticoagulantes

I. Universidade Federal do Rio de Janeiro - CCS/ICB – Instituto de

Bioquímica Médica

II. Estrutura e propriedades anticoagulantes de dermatam sulfato da pele de seis espécies de arraias.

Tese preparada durante o Curso de Pós-graduação em Química Biológica e apresentada ao Instituto de Bioquímica Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Ciências.

Aprovada por:

Prof. ________________________________________________

Presidente da Banca

Prof. ________________________________________________

Prof. ________________________________________________

Prof. ________________________________________________

À minha mãe Tereza, por seu apoio incondicional, que embora não mais fisicamente continua presente em todos os momentos da minha vida.

Agradecimentos

Aos meus avós João e Nancy pelo exemplo de vida que foram e

ainda são.

Ao meu pai Antônio Carlos por ter feito sempre o máximo para me

ajudar a realizar meus objetivos.

Ao meu irmão Daniel por todas as coisas que já passamos juntos.

Ao meu primo Carlão pela ajuda e pelas inúmeras conversas que

tivemos nesses últimos anos.

Ao Prof. Luiz Cláudio Francisco da Silva não só pela sua

orientação, dedicação, paciência, mas também por toda a ajuda e apoio

e compreensão nessa importante etapa da minha vida.

A Maisa, minha melhor amiga, pelas nossas inúmeras conversas,

por sua grande e sincera amizade, seu alto astral, sua bondade, enfim,

por ser a pessoa que é.

Ao Leo também pela amizade, por sempre estar disposto a ajudar

e, obviamente, por colocar a Maisa na linha.

A Glaucia Rosa Onofre “minha eterna orientadora” por todo o

carinho que tem me dedicado nesses anos todos.

A Tuane a ex-mascote do laboratório. O “ex” não é por ter saído, e

sim por estar finalmente ficando velha. E também agradeço por ter sido

às vezes bem chata a ponto de fazer com que eu aprendesse a dar

esporro, começando por ela é claro.

Ao Celso, por nossas conversas, pelo seu alto astral e pela sua

amizade.

Ao Rodrigo que graças a ele estou conseguindo ficar mais de 1

hora em frente ao computador sem dor na coluna.

Ao pessoal do Lab. : Adriana (Brigite), Fábio, Luciana Vasconcelos, Luciana Dimas, Celso, Eliene, Paola, Carol, Cíntia, Cris, Leandra, Mariana, Ana Tovar, Mauro, Mourão, Nélson, Rafael, Bolo, Robertino, Miúdo, Bianca, Michele, Ricardo, Marianinha, Vitor, Bruno, Lisandra,

Moisés, Domingos, Camila e a todas as outras pessoas que ajudaram mesmo que indiretamente na realização deste trabalho.

Lista de Abreviações

∆ - insaturação entre os carbonos 4 e 5 do ácido urônico

α - ligação glicosídica do tipo α

β - ligação glicosídica do tipo β

AH - ácido hialurônico

APTT - tempo de tromboplastina parcial ativada

CS - condroitim sulfato

Dissacarídeo B – unidades dissacarídicas 2,4-dissulfatadas

Dissacarídeo D – unidades dissacarídicas 2,6-dissulfatadas

Dissacarídeo K – unidades dissacarídicas 3,6-dissulfatadas

DS - dermatam sulfato

EDTA - ácido etilenodinitrotetraacético

GAG - glicosaminoglicano

GalNAc - N-acetil galactosamina

GlcA - ácido glicurônico

GlcNAc - N-acetil glicosamina

GlcNS - glicosamina N-sulfatada

HCII - cofator II da heparina

HS - heparam sulfato

IdoA - ácido idurônico

mL - mililitro

mM - milimolar

PG - proteoglicano

QS - queratam sulfato

U/mg - unidades por miligrama

Abstract

The aim of the present work was to gain information on the composition and

structure of sulfated glycosaminoglycans (GAG) purified from ventral and dorsal

skin of six species of ray fish: Dasyatis americana, Dasyatis gutata, Dasyatis

centroura, Aetobatus narinari, Potamotrygon motoro and Rhinobatos

percellens. Chondroitin sulfate (CS) and Dermatan sulfate (DS) were detected

in the skin of all six ray species. Heparan sulfate (HS) was present only in the

skin of A. narinari. This may reflect heterogeneity on the sulfated GAG

composition among different species of ray fish or a specific contamination on

the preparation of skin samples from A. narinari. However, taking in account our

results on the sulfated GAG composition of the other five species of ray fish is

reasonable to suppose that it is very homogeneous. We also compared the

disaccharide composition of DS purified from the skin of the ray fish. DS

obtained from the six species were composed of variable amounts non-sulfated,

mono-sulfated disaccharides bearing esterified sulfate groups at positions C-4

or C-6 of N-acetyl galactosamine (GalNAc), and disulfated disaccharides

bearing esterified sulfate groups at positions C-2 of the uronic acid and at

position C-4 or C-6 of GalNAc. The anticoagulant actions of ray skin DS,

measured by both APTT clotting and HCII-mediated inhibition of thrombin

assays, were compared to that of mammalian DS. DS from D. americana had

both high APTT and HCII activities, whereas DS from D. gutatta showed activity

profiles similar to those of mammalian DS. In contrast, DS from the other four

ray species had no measurable activity in the APTT assay. Thus, the

anticoagulant activity of ray skin DS is not merely a consequence of their

charge density. We speculate that the differences among the anticoagulant

activities of these DS may be related to both different composition and

arrangements of the disulfated disaccharide units within their polysaccharide

chains.

RESUMO O objetivo deste trabalho foi obter informações sobre a composição e estrutura

dos glicosaminoglicanos sulfatados (GAG) purificados das peles ventral e

dorsal de seis espécies de arraias: Dasyatis americana, Dasyatis gutata,

Dasyatis centroura, Aetobatus narinari, Potamotrygon motoro e Rhinobatos

percellens. Condroitim sulfato (CS) e dermatam sulfato (DS) foram detectados

na pele de todas as seis espécies de arraias. Heparam sulfato (HS) estava

presente apenas na pele de A. narinari. Isto pode refletir uma heterogeneidade

na composição de GAGs sulfatados ou uma contaminação especifica na

preparação de amostras de pele de A. narinari. Contudo, levando-se em

consideração apenas os nossos resultados sobre a composição de GAGs

sulfatados da outras cinco espécies de arraias, é razoável se supor que esta

seja bastante homogênea. Nós comparamos também a composição

dissacarídica de DS purificado da pele das arraias. DS obtido das seis espécies

de arraias foram compostos de quantidades variáveis de dissacarídeos não-

sulfatados, monossulfatados carregando grupos ésteres de sulfato nas

posições C-4 ou C-6 da N-acetil galactosamina (GalNAc), e dissacarídeos

dissulfatados carregando grupos ésteres de sulfato nas posições C-2 do ácido

idurônico e nas posições C-4 ou C-6 da GalNAc. As atividades anticoagulantes

do DS de pele de arraia, medidas tanto pelo ensaio de APTT quanto pelo

ensaio de inibição da trombina mediada pelo cofator II da heparina (HC II)

foram comparadas com aquela do DS de mamífero. DS de D. americana

apresentou uma alta atividade nos ensaios de APTT e HCII, enquanto que o

DS de D. gutatta mostrou apenas um perfil de atividade similar aquela do DS

de mamífero. Em contraste, DS das outras quatro espécies de arraias não

apresentaram atividades significativas nos ensaios de APTT. Dessa forma, a

atividade anticoagulante do DS de pele de arraia não é meramente uma

conseqüência da sua densidade de carga. Nós especulamos que as diferenças

entre as atividades anticoagulantes desses DS podem estar relacionadas com

diferenças tanto na composição quanto nos arranjos das unidades

dissacarídicas dissulfatadas dentro de suas cadeias polissacarídicas.

11

ÍNDICE ________________________________________________________________________________________________

I – Introdução: 1

1.0 – Aspectos gerais dos Glicosaminoglicanos. 1

1.1 – Ácido hialurônico. 5

1.2 – GAGs sulfatados. 6

2.0 – Síntese de PGs. 9

3.0 – PGs e GAGs na pele de organismos marinhos. 12

4.0 – Aspectos gerais sobre a coagulação. 18

5.0 – Atividade anticoagulante dos GAGs. 21

6.0 – Atividade anticoagulante de DS obtido da pele de alguns

organismos marinhos. 25

II – Objetivos. 27

III – Materiais e Métodos: 28

1.0 – Materiais. 28

2.0 – Isolamento dos GAGs sulfatados de pele de arraia. 28

3.0 – Caracterização dos GAGs sulfatados de pele de arraia. 29

3.1 – Cromatografia de troca-iônica em coluna Mono Q-FPLC. 29

3.2 – Eletroforese em gel de agarose dos GAGs sulfatados

de pele de arraia. 30

3.3 – Análise por eletroforese em gel de poliacrilamida da massa

molecular de DS de pele de arraia. 30

4.0 – Análise dissacarídica do DS de pele de arraia. 30

4.1 – Digestão com condroitinases. 31

4.2 – Clivagem desaminativa por ácido nitroso. 32

5.0 – Tempo de tromboplastina parcial ativada (APTT). 32

6.0 – Inativação da trombina mediada por HCII em presença

de DS de pele de arraia. 32

IV – Resultados. 34

12

V – Discussão. 53

VI – Referências. 62

13

Parte dos resultados apresentados nesta tese fez parte de um artigo publicado recentemente (cópia em anexo) com o seguinte título:

Dellias J.M.M., Onofre G.R., Werneck C.C.,. Landeira-Fernandez A.M, Melo F.R., Farias W.L. and Silva L.C.F., “Structural composition and differential anticoagulant activities of dermatan sulfates from the skin of four species of rays, Dasyatis americana, Dasyatis gutatta, Aetobatus narinari and Potamotrygon motoro”. Biochimie (2004), 86, 677-683.

14

I - INTRODUÇÃO

1. Aspectos gerais dos glicosaminoglicanos

Os glicosaminoglicanos (GAGs) são uma classe específica de

macromoléculas biológicas distribuídas entre a maioria dos organismos.

Com exceção do ácido hialurônico (AH), todos os outros tipos de GAGs

estão covalentemente ligados à um esqueleto protéico formando os

proteoglicanos (PGs), que são um dos principais complexos

macromoleculares da matrix extracelular (MARCEL D, 2000, KRESSE H,

1993).

Os PGs podem apresentar um número diversificado de cadeias de

GAGs, que por sua vez podem ter diferentes massas moleculares e

constituição variada. A diversidade estrutural dos PGs é um fator

importante e que está associado às diversas funções biológicas à eles

atribuídas, sendo que estas funções podem estar associadas tanto às

cadeias de GAGs como a regiões específicas da cadeia de proteína dos

PGs. Pesquisas nas áreas da bioquímica, biologia celular e do

desenvolvimento mostram que os PGs não são apenas compostos

estruturais, mas que eles apresentam uma participação ativa na regulação

de vários eventos celulares e processos fisiológicos, incluindo proliferação

celular e diferenciação, interações célula-celula e célula-matrix

(BERNFIELD e cols, 1999). Seu potencial de interação resulta da

diversidade estrutural das suas cadeias de GAGs, ou seja, do tipo de

cadeia de GAG, do seu tamanho e composição, bem como do grau de

substituição e organização dos seus domínios.

GAGs são polissacarídeos lineares compostos por um número

variável de unidades dissacarídicas repetitivas. Cada dissacarídeo

consiste de uma hexosamina (N-acetil-D-galactosamina, GalNAc ou N-

15

acetil-D-glicosamina, GlcNAc) e um ácido urônico (ácido D-glicurônico,

GlcA ou ácido L-idurônico, IdoA) ou uma hexose neutra (D-galactose,

Gal). O primeiro GAG estudado foi o condroitim sulfato (CS) em 1861, que

foi isolado a partir de tecidos cartilaginosos como revisado por

YANAGISHITA (1993). Após isto, vários outros foram isolados e

caracterizados, como a heparina em 1916 por MCLEAN, o AH (MEYER e

PALMER, 1934), o dermatam sulfato (DS) (MEYER e CHAFFEE, 1941) e

o queratam sulfato (QS) (MEYER e cols., 1953).

A classificação dos GAGs está baseada na sua organização

estrutural, a qual é formada por unidades dissacarídicas repetitivas

(Tabela I e Figura 1). Cada monossacarídeo inserido na cadeia de GAG

pode apresentar grupos O- e/ou N-sulfatos em diferentes posições, que

juntamente com as carboxilas dos ácidos urônicos são responsáveis pela

carga altamente negativa destas moléculas.

16

TABELA I

PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS ESTRUTURAIS DOS GAGS (JEANLOZ, 1960)

GAG Dissacarídeos Posição de

Sulfatação

Ligação

Glicosídica

Heparam sulfato

Glicosamina

N-acetilglicosamina

Ácido Glicurônico

Ácido Idurônico

C-2, C-6

C-6

-

-

α(1→4)

α(1→4)

β(1→4)

α(1→4)

Heparina

Glicosamina

Ácido Glicurônico

Ácido Idurônico

C-2, C-6

-

C-2

α(1→4)

β(1→4)

α(1→4)

Condroitim 4-sulfato N-acetilgalactosamina

Ácido Glicurônico

C-4

-

β(1→4)

β(1→3)

Condroitim 6-sulfato N-acetilgalactosamina

Ácido Glicurônico

C-6

-

β(1→4)

β(1→3)

Dermatam sulfato N-actilgalactosamina

Ácido Idurônico

Ácido Glicurônico

C-4

-

-

β(1→4)

β(1→3)

α(1→3)

Queratam sulfato N-acetilglicosamina

Galactose

C-6

-

β(1→3)

β(1→4)

Ácido hialurônico N-acetilglicosamina

Ácido Glicurônico

-

-

β(1→4)

β(1→3)

Portanto, de acordo com o tipo de unidades dissacarídicas, e

segundo a nomenclatura de JEANLOZ (1960) os GAGs podem ser

divididos nos seguintes grupos:

17

R1

R1R2

R2

=

=

ou

ou

FIGURA 1: COMPONENTES DOS GAGS: A, B e F possuem ácido glicurônico; C possui ácido idurônico e D pode apresentar além do ácido glicurônico, o ácido idurônico como seu componente de ácido urônico. Quanto ao constintuinte de hexosamina A, B e C são formados por N-acetilgalactosamina e D, E e F por N-acetilglicosamina. Substituição de ácido urônico por galactose é encontrada em E.

ÁCIDO URÔNICO HEXOSAMINA

GLICOSAMINOGLICANO

A B C D E F

18

1.1. Ácido hialurônico (AH)

A unidade dissacaríca repetitiva do AH é composta por

[→4GlcAβ1→3GlcNAcβ→] e este é o único GAG não sulfatado, ou seja,

nenhuma das suas hidroxilas é esterificada com grupo sulfato.

Ele é sintetizado por uma ácido hialurônico sintase na membrana

plasmática, onde a elongação da cadeia glicídica ocorre através da adição

alternada de GlcA e GlcNAc apartir de doadores glicídicos UDP ao

terminal redutor da cadeia nascente.

O AH é o GAG de maior peso molecular e diferentemente de todos

os outros GAGs é isolado de vários tecidos na forma de GAG, ou seja,

sem estar covalentemente ligado a um esqueleto protéico (LAURENT e

cols, 1996). Ele é encontrado não apenas no tecido conjuntivo, mas

também em todos os tecidos e fluidos do corpo, demonstrando que a

maioria das células o sintetiza em algum estágio de sua vida (FRASER e

cols, 1989).

Quanto as suas funções, verifica-se que ele interage com uma

família de proteínas agregantes, as hialoaderinas, e estas interações são

importantes na morfogênese tecidual, angiogênese e remodelamento

tecidual (HELDIN e cols, 1989). O AH desempenha um papel particular no

microambiente das células tumorais. As células cancerígenas exibem

sítios de ligação para o ácido hialurônico (CD44, RHAMM) que podem

influenciar a motilidade celular (DELPECH, 1997).

Níveis aumentados de AH são descritos em tecidos e fluídos em

vários processos tumorais e em outras doenças como na aterosclerose.

Níveis aumentados também são descritos no soro de pacientes com

doença reumática inflamatória e com cirrose hepática. Este aumento dos

níveis de AH é conseqüência do aumento da síntese deste GAG em

resposta a diferentes mediadores inflamatórios e a fatores de crescimento,

19

exceto no caso da cirrose hepática, onde a remoção do AH do soro do

paciente é reduzida (ENGSTROM-LAURENT, 1989).

Todos os outros GAGs são sintetizados no aparelho de Golgi por

uma elaborada maquinária biossintética. A biossíntese do CS, DS,

heparina e HS é iniciada por uma região tetrassacarídica de ligação

(GlcA1β→3Gal1β→3Gal1β→4Xil1β→) glicosidicamente ligada a um

resíduo de serina ou treonina de um esqueleto protéico, onde Xil

representa a xilose.

A cadeia de GAG é alongada a partir deste tetrassacarídio e uma

série de modificações enzimáticas na cadeia polissacarídica crescente

determina a estrutura final dos GAGs, como por exemplo, a ação da 3´

fosfoadenosina 5´ fosfosulfato (PAPS) que insere resíduos de sulfato em

diferentes posições dos monossacarídeos conferindo o caráter altamente

negativo destes compostos. O peso molecular dos GAGs sulfatados

normalmente varia entre 20.000 e 30.000 Daltons.

1.2. GAGs sulfatados

Heparina / heparam sulfato (HS)

Tanto a heparina quanto o HS apresentam glicosamina como

açúcar aminado, a qual pode estar O-sulfatada na posição 6, no caso do

HS, e preferencialmente N-sulfatada na posição 2 e O-sulfatada na

posição 6, no caso da heparina. Em relação à composição do ácido

hexurônico, verifica-se que a heparina contém principalmente IdoA, com

quantidades variáveis de O-sulfatação na posição 2, enquanto que o HS

contém mais GlcA, geralmente não sulfatado (Tabela I). O grau de

sulfatação é um dos principais fatores utilizados na diferenciação destas

moléculas. A heparina possui densidade de carga maior do que qualquer

20

outra macromolécula biológica conhecida, enquanto o HS é geralmente

menos sulfatado e com um menor conteúdo de IdoA, logo, apresenta

maior variabilidade estrutural (GALLAGHER, 1997; SHRIVER e cols,

2002). Baseado nestas informações e de maneira resumida é possível

dizer que a heparina é composta principalmente por unidades

dissacarídicas do tipo IdoA (2S) → GlcNS (6SO4)* ,enquanto HS contém

uma pequena proporção deste dissacarídeo, sendo principalmente

caracterizado por apresentar uma maior variedade na composição de

suas unidades dissacarídicas, contudo estas apresentam-se menos

sulfatadas em relação àquelas presentes na heparina.

* IdoA (2S) → GlcNS (6SO4) - Ácido idurônico 2 0-sulfatado e

glicosamina N-sulfatada e 6 O-sulfatada.

É importante destacar que a heparina pode ser isolada a partir de

diferentes tecidos animais, sejam eles vertebrados ou invertebrados

(NADER e cols., 1984). Nos mamíferos, ela é sintetizada e estocada em

grânulos citoplasmáticos de mastócitos, sendo liberada como cadeias

livres, não ligadas a proteínas, após ativação e degranulação dos

mastócitos, em eventos associados ao sistema imune. O HS é sintetizado

por uma grande variedade de tipos celulares, podendo ser secretado tanto

na forma de cadeias livres de GAGs quanto de PGs (LINDAHL, 1989;

PIEPKORN e cols.,1989; SALMIVIRTA e cols., 1996).

Condroitim sulfato / dermatam sulfato

Os GAGs de CS e DS são considerados como sendo da

mesma família por apresentarem em sua estrutura, como hexosamina,

21

GalNAc ligada à um GlcA (CS) ou a um IdoA (DS). O CS pode ter a

GalNAc sulfatada na posição 4 (C4-S), ou sulfatada na posição 6 (C6-S)

(Figura 1), formando unidades dissacarídicas que podem assim ser

representadas:

GlcA → GalNAc-4 ou 6S

O DS é uma forma isomérica do CS onde na maioria das suas

unidades dissacarídicas encontramos IdoA em vez de GlcA que é

geralmente ligado a GalNAc sulfatada na posicão 4 (Figura 1).

IdoA → GalNAc-4S

Na verdade CS e DS são formados por misturas de unidades

dissacarídicas isômeras. CS pode ser misto contendo tanto GalNAc

sulfatada na posição 4, como sulfatada na posição 6, enquanto DS é

invariavelmente um co-polímero contendo IdoA e GlcA. (KOLSET e

GALLAGHER, 1990).

O padrão de sulfatação destes GAGs pode apresentar uma

maior complexidade, pois, apesar de ser raro, as unidades dissacarídicas

podem apresentar uma sulfatação extra. No caso do CS, a GalNAc pode

ser sulfatada nas posições 4 e 6, dando origem à unidades dissacarídicas

dissulfatadas, enquanto no caso de DS, a sulfatação extra pode ser na

posição 2 do IdoA. Uma composição mais complexa pode ser vista

quando analisamos os polissacarídeos de invertebrados marinhos.

PAVÃO e cols. (1995, 1998) isolaram e caracterizaram DS de

invertebrados marinhos do sub-filo das Ascísdias, onde exemplares de

espécies diferentes apresentaram diferentes padrões de sulfatação. Em

22

trabalhos realizados com pepino do mar, foi extraído, isolado e

caracterizado da parede do corpo destes animais, um CS que apresenta

uma ramificação de fucose sulfatada na posição 3 do GlcA. (VIEIRA e

MOURÃO, 1988; VIEIRA e cols., 1991)

Queratam sulfato

O QS apresenta unidades dissacarídicas compostas por GlcNAc,

que pode ser sulfatada na posição 6, e Gal, ao invés de um ácido

hexurônico (Tabela I). Além desta particularidade, as cadeias de QS

podem ser tanto O- quanto N-ligadas à cadeia do PG, tendo como ponto

de ligação um resíduo de serina ou asparagina, respectivamente

(FUNDERBURGH e cols., 1996).

2. Síntese de PGs

Com exceção do AH, todos os outros GAGs são sintetizados como

PGs. Este processo inicia-se no retículo endoplasmático rugoso com a

adição, à cadeia protéica do polipetídeo nascente, de xilose O-ligada aos

resíduos de serina ou treonina (KJELLEN e LINDAHL, 1991, SALMIVIRTA

e cols., 1996). Em seguida, duas unidades de Gal e uma de GlcA são

adicionadas por transferases específicas da porção cis e mediana do

complexo de Golgi, formando o tetrassacarídeo de ligação, comum à

maioria dos GAGs. No caso do QS, a cadeia de GAG pode estar ligada a

proteína através de ligação O ou N-glicosídica da GalNac ou da GlcNAc

aos resíduos de serina ou asparagina, respectivamente (Figura 2).

23

O tetrassacarídeo de ligação funciona como uma seqüência

iniciadora para a polimerização da cadeia de GAG. A elongação desta

cadeia ocorre através da adição alternada de uma hexosamina e um ácido

hexurônico a partir de seus precursores ligados a nucleotídeos difosfatos,

por glicosiltransferases específicas da membrana da porção mediana do

complexo de Golgi.

Após a polimerização, a cadeia de GAG é modificada pela ação de:

epimerases – que alteram a conformação ao redor do átomo de carbono

de algumas unidades de GlcA do HS, DS e heparina transformando-o em

IdoA - e pelas sulfotransferases – que adicionam ésteres de sulfato à

cadeia em elongação a partir de uma forma metabolicamente ativada de

fosfoadenosilfosfosulfato (PAPS) - situadas na porção trans do Golgi que

determinam a estrutura final sulfatada que é então na maioria das vezes,

transportada para a superfície celular (revisado por JACKSON e cols.,

1991).

SILBERT e cols. (1995) fizeram uma ótima descrição do processo

de biossíntese dos PGs dizendo que este não é um processo aleatório,

“ele ocorre ao longo do transporte vesicular do polipeptídeo do retículo

endoplasmático rugoso para o complexo de Golgi sendo altamente

coordenado pela especificidade das transferases, funcionalmente

compartimentalizadas no complexo de Golgi”.

24

FIGURA 2: REGIÃO DE LIGAÇÃO ENTRE A CADEIA PROTÉICA E AS

CADEIAS DE GAGS; CS, DS, HS, e heparina. O QS pode estar ligado a porção

protéica através de ligação N-glicosídica (tipo I) ou O-glicosídica (tipo II). GlcUA

= ácido D-glicurônico; GalNAc = N-acetil-D-galactosamina; GlcNAc = N-acetil-D-

glicosamina; AS = ácido siálico; Man = D-manose; ( ) = ácido urônico;

( )= hexosamina; ( ) = D-galactose (Gal); Xil = D-xilose; SER = L-serina; ASN

= L-asparagina.

As evidências deste modelo no qual as reações de biossíntese dos

GAGs ocorrem em diferentes compartimentos de membranas, tornando-

se portanto necessário o transporte da cadeia protéica de uma cisterna

até outra através da via de secreção do complexo de Golgi, tiveram

origem em experimentos no qual o tráfego das membranas intracelulares

foi interrompido devido a ausência de citosol ou pela inclusão de inibidores

de transporte (ETCHISON e SRIKRISHNA, 1995; SPIRO e cols., 1991;

WONG-PALMS e PLAAS, 1995).

- O - Xil - Gal - Gal - GlcUA -

GlcNAc - Gal - - O - GalNac GlcNAc - SA

(CS, DS, HS ou Hep)

Man - GlcNAc - - N - GlcNAc - GlcNAc - Man Man - GlcNAc -

(QS - Tipo II)

(QS - Tipo I) ASN

SER

SER

25

Mais recentemente, a importância da integridade da via de secreção

do complexo de Golgi, dependente de proteínas citosólicas e ATP, foi

mostrada através da inibição da síntese de GAGs in vitro através do

desmantelamento desta via pela ação do ácido ocadáico ou através do

tratamento com nacadazole que sincroniza as células em metáfase, uma

das fases da mitose, caracterizando uma condição onde conhecidamente

o tráfego de vesículas é interrompido (FERNANDEZ e WARREN, 1998).

De acordo com estes experimentos, a síntese de GAGs utiliza a mesma

maquinaria empregada nos eventos de formação, direcionamento,

ancoramento específico e fusão de membranas das vesículas “coatomer”

associadas com o transporte não seletivo de substâncias.

3. PGs e GAGs na pele de organismos marinhos:

A pele de humanos contém como principais PGs o versican, a

decorina e a biglicana, e ainda o GAG do tipo AH (CARRINO e cols.,

2000). Versican é um grande PG com uma cadeia protéica de 265 kDa,

tendo de 12 a 15 cadeias de GAG do tipo CS ligadas, cada uma,

covalentemente à proteína (ZIMMERMANN e RUOUSLAHTI, 1989). Em

contraste, decorina é um pequeno PG com cadeia protéica de 36 kDa e

uma única cadeia de GAG, que na maioria das vezes é um DS, ligado à

proteína (DAY e cols., 1987). Decorina é um membro de uma família de

PGs, os quais são moléculas cujas cadeias protéicas são ricas em

leucina, e que proporcionam a habilidade desses PGs de interagir com

outras moléculas (IOZZO, 1997). Um outro membro desta família é a

biglicana, que tem uma cadeia protéica bastante homóloga a da decorina,

mas carrega duas cadeias de DS ligadas na proteína (NEAME e

26

ROSEMBERG, 1989). Recentemente, em um estudo do nosso grupo

mostrou-se que a composição de GAGs na pele humana de diferentes

regiões do corpo é similar e composta de DS e AH, sendo o primeiro o

GAG predominante (PASSOS e cols., 2003).

Em contraste com os estudos em pele humana, muito pouco ainda é

conhecido sobre a composição e a estrutura de GAGs provenientes da

pele de organismos marinhos. Estudos em pele de lula identificaram a

presença de três diferentes populações de CS com diferentes graus de

sulfatação (KARAMANOS e cols., 1988). Em pele de tubarão foram

encontrados AH, CS, DS. Além disso, identificou-se ainda uma população

de DS com um maior grau de sulfatação (ISOBE e SENO, 1971). Em um

trabalho recente em pele de enguia foi mostrado que o DS foi o GAG

majoritário acompanhado de uma pequena quantidade de QS (SAKAI e

cols., 2003).

As arraias, objeto do nosso presente estudo, são vertebrados com

endoesqueleto totalmente cartilaginoso, pertencentes ao grupo dos

chondrichthyes (“chondrichthyes” = cartilagem + peixe). A maioria das

arraias permanece a maior parte do tempo sobre o fundo do mar, ou

nadam vagarosamente à procura de mariscos ou outros itens alimentares

relativamente sedentários. Seus corpos são achatados dorso-

ventralmente e as largas nadadeiras peitorais estendem-se da cabeça até

a região mediana do tronco. Com relação à composição de GAGs na pele

das arraias marinhas, existem apenas dois estudos, ambos na pele da

arraia Raja clavata, e que mostram a presença de DS, DS pouco sulfatado

e traços de AH (CHATZIIOANIDIS e cols., 1999a,b), entretanto, os autores

não especificaram se os resultados foram obtidos da pele da região dorsal

ou ventral ou ainda de uma mistura de ambas. É importante ressaltar que

27

macroscopicamente as peles das duas regiões apresentam características

diferentes em várias espécies de arraias, como as utilizadas neste estudo.

A análise dissacarídica das duas populações de DS encontradas na pele

da arraia Raja clavata apresentou: um DS pouco sulfatado (DSII)

contendo como unidades dissacarídicas principais as unidades não-

sulfatadas e as unidades 4-monossulfatadas, e um DS com maior grau de

sulfatação (DSI) apresentando principalmente unidades dissacarídicas 4-

monossulfatadas (61%) e unidades dissufatadas com um padrão incomum

de sulfatação, apresentando grupos sulfato nas posições C-2 e C-3 do

ácido urônico. (Tabela II e Figura 3). Não existem dados na literatura

sobre a composição de GAGs em pele de arraias de água doce.

Unidades dissacarídicas (% do total)

Arraia GAG ∆di 0S ∆di 6S ∆di 4S ∆di-di

Raja clavata DSI* 3 4 61 32

Raja clavata DSII** 44 3 53 -

* Modificado de CHATZIIOANIDIS e cols., 1999a, ** Modificado de CHATZIIOANIDIS e cols., 1999b. ∆di = dissacarídeo insaturado ∆di 0S = dissacarídeo insaturado não-sulfatado ∆di 6S = dissacarídeo insaturado sulfatado na posição 6 da GalNAc ∆di 4S = dissacarídeo insaturado sulfatado na posição 4 da GalNAc ∆di-di = dissacarídeo insaturado dissulfatado

TABELA II. Análise dissacarídica das moléculas de DS obtidas da pele da arraia Raja clavata.

28

No presente estudo analisamos os GAGs tanto da pele ventral como

da pele dorsal de seis espécies de arraias, sendo cinco delas espécies

que vivem em habitat marinho, e uma espécie de água doce.

DSI

DSII

Figura 3 . Unidades dissacarídicas de DS preponderantes na pele da arraia Raja clavata.

unidades 4-monossulfatadas

unidades 4-monossulfatadas unidades não-sulfatadas

unidades 2,3-dissulfatadas

Adaptado de CHATZIIOANIDIS e cols. 1999a,b.

29

A. Dasyatis americana

B. Dasyatis guttata

C. Dasyatis centroura

30

D. Aetobatus narinari

E. Rhinobatos percellens

F. Potamotrygon motoro

Figura 4. Espécies de arraias estudadas

31

4. Aspectos gerais sobre a coagulação

Para assegurar a manutenção da circulação sangüínea através dos

vasos, é necessário que o sangue se mantenha na forma fluida, livre de

coágulos, mas que também promova a interrupção do sangramento caso

haja uma injúria vascular. O balanço resultante da integração desses dois

aspectos é conhecido como hemostasia. Agressões que levam a

alterações ou perda de células endoteliais vasculares, desencadeiam uma

série de fenômenos que ocorrem de forma simultânea, para prevenir ou

bloquear possíveis eventos causados pela lesão. Desta forma, o sítio de

lesão vascular é inicialmente preenchido por plaquetas que aderem a

macromoléculas do tecido subendotelial exposto, passam para a forma

ativada e formam um tampão plaquetário inicial. Durante a formação do

tampão plaquetário, as plaquetas aderidas liberam uma série de

substâncias de seus grânulos, que juntamente com moléculas do espaço

subendotelial, promovem a ativação local de fatores da coagulação que se

encontram solúveis no plasma.

O sistema de coagulação envolve a ativação de uma série de

proteases plasmáticas inativas ou zimogênios, que culminam na formação

de um coágulo de fibrina (DAVIE e col., 1991). Esquematicamente, a

coagulação pode ser dividida em vias extrínseca e intrínseca, compostas

por uma série de serinoproteinaes que agem em cadeia convergindo para

a ativação do fator X, que após ser ativado, desencadeia a formação de

trombina, que finalmente promove a formação do coágulo de fibrina

(Figura 5). Em condições fisiológicas, esses dois sistemas não são

considerados isoladamente porque estão acoplados por uma série de

reações. Apesar disso, têm se demonstrado que a via extrínseca é crítica

32

para o início da coagulação, enquanto a via intrínseca exerce um papel

importante no crescimento e manutenção do coágulo.

Figura 5 – Sistema de coagulação através da formaçã o de fibrina pela ação

das vias intrínseca e extrínseca.

Quando fatores solúveis do plasma são expostos ao fator tecidual,

uma lipoproteína presente em células do espaço subendotelial, este se

liga ao fator VII ativando-o. A ativação deste fator leva a uma reação de

ativação em cadeia dos fatores IX, X e II (trombina). A reação de ativação

33

do fator X pelo IX conta com a participação do fator VIII, como um

acelerador do processo. Uma vez ativado, o fator X converte a

protrombina em trombina, uma reação que também conta com a

participação do fator V. Desta forma, a trombina cliva o fibrinogênio em

fibrina, que, ao se polimerizar, vai contribuir para a formação do coágulo

(ROSENBERG e AIRD, 1999).

A ativação do fator X e da protrombina ocorre através de um meio

catalisador, onde as enzimas, os cofatores e substratos são reunidos.

Esse meio é formado por uma superfície fosfolipídica carregada

negativamente, presente na membrana das plaquetas ativadas ou das

células lesadas. A reunião desses fatores sobre essa superfície acelera as

reações e restringem a formação do trombo ao sítio de lesão vascular

(DAVIE e col., 1991; DAHLBÄCK, 2000).

A trombina é a enzima do final do sistema de coagulação. Sua ação

não se restringe apenas a clivagem do fibrinogênio em fibrina, mas

também atua na amplificação do mecanismo de coagulação através da

ativação de alguns fatores do sistema (tais como os fatores V, VIII e XI) e

ainda age como potente agonista da ativação plaquetária (DAHLBÄCK,

2000).

O controle das reações desencadeadas durante a formação do

trombo é essencial para limitação do coágulo ao local da injúria,

impedindo um estado de coagulação disseminada. Esse papel é exercido

por uma série de inibidores de proteases que agem de forma regulada,

equilibrando os diferentes passos de propagação do coágulo.

A proteína C, um inibidor plasmático que circula na forma de

zimogênio e possui como cofator a proteína S, é ativada pela trombina

ligada a trombomodulina (PG presente na superfície de células

endoteliais). A proteína C ativada atua como um potente inibidor dos

fatores VIIIa e Va, que levam a inibição do sistema de coagulação. A

34

trombina ligada ao complexo perde sua propriedade procoagulante, além

de ser incapaz de ativar as plaquetas e o fator V (BOMBELI e col., 1997).

A antitrombina é uma glicoproteína plasmática considerada como o

principal inibidor fisiológico da trombina e do fator Xa (BOMBELI, 1997).

Durante a reação de inibição, a protease cliva a ligação peptídica entre os

resíduos Arg393 e Ser394 da molécula de antitrombina, liberando um

pequeno segmento peptídico e liga-se covalentemente ao restante da

molécula. Essa ligação inativa as duas proteínas do complexo de forma

irreversível (GILS e DECLERK, 1998; CARREL e col., 2001). A

antitrombina é relativamente ineficiente como inibidor na ausência de PG

de HS, presentes na superfície do endotélio ou da heparina (JIN et al.,

1997). Na presença desses GAGs, a taxa de inibição da antitrombina é

acelerada em milhares de vezes na ordem de magnitude (OLSON e

BJÖRK, 1992).

O cofator II da heparina (HCII) é uma glicoproteína plasmática, com

ação inibitória sobre a molécula de trombina. Assim como a antitrombina,

sua atividade inibitória ocorre através da formação de um complexo

covalente com a trombina, que cliva inicialmente a ligação peptídica entre

os resíduos Leu444 e Ser445, com liberação de um segmento peptídico. O

HCII também possui uma fraca atividade inibitória da trombina na

ausência de GAGs. Sua atividade in vivo é atribuída a presença de PGs

de DS, encontrados principalmente na matriz extracelular e em pequenas

quantidades na superfície de células endoteliais (BOMBELLI e col., 1997).

5. Atividade anticoagulante dos GAGs

A heparina é um GAG sulfatado que ocorre em grânulos no interior

de mastócitos. Sua obtenção para uso clínico é feita através da extração

35

de tecidos, como pulmão de bovinos e intestino de suínos. A heparina é

um dos polissacarídeos naturais com maior emprego na medicina,

suplantada apenas pelo hormônio insulina. A potente atividade

anticoagulante da heparina é atribuída a sua capacidade de

potencialização da antitrombina e do HCII, relatados como os maiores

inibidores das enzimas da coagulação, em particular trombina e fator Xa.

A heparina possui em sua estrutura, uma seqüência

pentassacarídica com uma composição específica de açúcares e padrão

distinto de sulfatação e esta seqüência é requerida para a interação com a

antitrombina (LINDAHL e BJÖRK, 1983) (Figura 6A). A heparina ativa a

antitrombina através de dois mecanismos distintos, cuja contribuição

relativa depende da protease inibida. Um destes mecanismos envolve a

mudança conformacional da antitrombina e outro a formação de um

complexo ternário entre a protease, o cofator plasmático e o GAG. Em

ambos os mecanismos, a antitrombina liga-se à sequência

pentassacarídica específica da heparina, sofrendo uma mudança

conformacional. Esta mudança é suficiente para acelerar a inibição do

fator Xa. No entanto, para a trombina, além da ativação da antitrombina, a

reação requer a ligação do inibidor e da protease à mesma cadeia de

GAG, formando um complexo ternário, onde a heparina atua como

superfície de aproximação (STREUSAND et al., 1995) (Figura 7).

O efeito da heparina na inibição da trombina também é mediado

pelo HCII. Para esse mecanismo de inibição, não há indicação de uma

seqüência oligossacarídica específica na heparina, responsável pela

interação com o inibidor (TOLLEFSEN, 1994). Entretanto, cadeias de

heparina com mais de vinte resíduos são necessárias para a catálise da

reação (LIAW et al., 1999).

Apesar de ser uma droga de amplo uso clínico e eficácia

reconhecida em eventos tromboembólicos, a heparina apresenta uma

36

série de efeitos indesejáveis, como trombocitopenia (WARKENTIN, 1999;

VISENTIN, 1999), hemorragia (KELTON e HIRSH, 1980), incapacidade de

ação em indivíduos com deficiências congênitas ou adquiridas de

antitrombina e incapacidade de inibir trombina ligada a fibrina (LIAW et al.,

2001), entre outras.

O DS é um GAG comercialmente isolado de mucosa intestinal de

bovinos e suínos. O efeito anticoagulante do DS é exercido através do

HCII, aumentando a taxa de inibição da trombina em cerca de 1000 vezes

(TOLLEFSEN e col., 1983).

Durante o processo de inibição, o HCII se liga preferencialmente a

um sítio de alta afinidade na cadeia de DS, constituído de três unidades

dissacarídicas consecutivas formadas por IdoA 2-O sulfatado e GalNAc 4-

O-sulfatada (MAIMONE e TOLLEFSEN, 1990) (Figura 6B). O mecanismo

molecular de ativação do HCII pelo DS ou heparina difere do descrito para

antitrombina. Nesse caso, o efeito estimulatório do GAG depende da

presença de um domínio polipeptídico ácido perto da região N-terminal do

HCII. Após se ligar nesse domínio, o GAG rompe interações moleculares

no HCII, que levam a interação do seu domínio N-terminal com o

exosítio I da trombina, facilitando o ataque proteolítico da enzima ao sítio

reativo do HCII (TOLLEFSEN, 1994).

37

Figura 6 – Região de ligação dos GAGs à antitrombin a e ao HCII. As estruturas representam a região de ligação da heparina à antitrombina (A) e do DS ao HCII (B). Os grupamentos sulfato marcados com asterisco (*) no pentassacarídeo de heparina, são críticos para ligação à antitrombina.

Figura 7 – Mecanismo de inibição da trombina pela a ntitrombina (A) e pelo HCII (B) na presença de GAGs. Exo I, exosítio I da trombina; Exo II, exosítio II da trombina. R e L representam os sítios de arginina e leucina da AT e HCII, respectivamente. S representa o resíduo de serina da antitrombina.

A B

38

O DS é também um agente antitrombótico, atualmente usado após

cirurgias de quadril e hemodiálise, e também como terapia anticoagulante

para pacientes com trombocitopenia induzida pelo uso de heparina

(NENCI, 2002).

6. Atividade anticoagulante de DS obtido da pele de alguns

organismos marinhos

DS é o GAG predominantemente expresso na pele de vertebrados

marinhos. DS isolado da pele da enguia, Anguilla japonica, foi mostrado

ser composto principalmente de unidades dissacaridicas monosulfatadas

contendo grupamentos ésteres de sulfato nas posições C-4 da GalNAc, e

unidades dissacarídicas dissulfatadas contendo grupamentos éster

sulfato nas posições C-2 do IdoA e C-4 da GalNAc (dissacarídeos B). Tem

sido mostrado que este DS de pele de enguia não apresenta atividade

anticoagulante significativa (SAKAI e col., 2003). NADER e col. (2001)

mostraram que DS extraído da pele de atum tem uma potente atividade na

inibição da trombina mediada pelo HC II, mas não há informações

disponíveis sobre a estrutura dissacarídica deste GAG.

Estudos sobre o DS da pele da arraia Raja clavata, a qual habita a

costa da Grécia, mostraram a presença de dois tipos de DS com

diferentes graus de sulfatação (KARAMANOS e coll., 1991; TSEGENIDIS,

1992; CHATZIIONANNIDIS e col., 1999a,b). Não se sabe ainda se o DS

da pele da arraia R. clavata apresenta ou não atividade anticoagulante

apreciável.

Recentemente, NANDINI e col. (2005) caracterizaram DS da pele

do tubarão azul Prionace glauca. Os autores mostraram que este GAG é

composto de cadeias híbridas de CS/DS com um padrão único de

sulfatação, e também que este tinha uma atividade moderada sobre a

39

inibição da trombina mediada pelo HC II (NANDINI e col., 2005). Não se

sabe ainda se o DS de pele de tubarão apresenta atividade anticoagulante

apreciável.

40

II - OBJETIVOS:

Esta tese teve como objetivo geral a análise da composição de

glicosaminoglicanos sulfatados purificados das peles ventral e dorsal de

cinco espécies de arraias marinhas (Dasyatis americana, Dasyatis guttata,

Dasyatis centroura, Rhinobatos percellens e Aetobatus narinari) e de uma

espécie de arraia de água doce (Potamotrygon motoro), com um enfoque

especial no estudo comparativo da estrutura e da atividade anticoagulante

das amostras de dermatam sulfato obtidas das seis espécies de arraias.

41

III - MATERIAIS E MÉTODOS 1. Materiais:

Condroitim 4-sulfato (C4-S), condroitim 6-sulfato (C6-S), DS, HS e

papaína bicristalizada (15U/mg proteína) foram adquiridos de Sigma

Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Condroitinase AC (EC 4.2.2.5) de

Arthrobacter aurescens e condroitinase ABC (EC 4.2.2.4) de Proteus

vulgaris foram adquiridos de Seikagaku American Inc. (Rockville, MD,

USA). Os padrões de dissacarídeos para análise da composição de DS:

α-∆GlcUA-1→3-GlcNAc, α-∆GlcUA-1→3-GlcNAc(4SO4), α-∆UA-1→3-

GalNAc(6SO4), foram obtidos de Seikagaku American Inc. (Rockville, MD,

USA). Os padrões de dissacarídeos α-∆GlcUA(2SO4)-1→3-GlcNAc(6SO4)

, α-∆GlcUA(2SO4)-1→3-GlcNAc(4SO4), α-∆GlcUA-1→3-GlcNAc(4,6diSO4)

e α-∆GlcUA(2SO4)-1→3-GlcNAc(4,6diSO4) foram adquiridos de Sigma

Chemical Co.(St. Louis, MO, USA). As amostras secas de pele das

regiões ventral e dorsal das arraias marinhas das espécies Dasyatis

americana, Dasyatis guttata, Dasyatis centroura, Aetobatus narinari e

Rhinobatos percellens e da arraia de água doce da espécie Potamotrygon

motoro foram obtidas após a incubação da pele dissecada em acetona a

4° C e posterior secagem ao ar. As arraias foram identificadas e as peles

dissecadas pelo grupo do Prof. Wladimir Lobo Faria do Departamento de

Engenharia de Pesca da Universidade Federal do Ceará.

2. Isolamento dos GAGs sulfatados de pele de arraia.

As peles secas foram cortadas em pequenos pedaços e estes então

foram incubados em tampão acetato de sódio (pH 5,5) contendo papaína

na proporção de 1:20 (peso,peso) e na presença de 5mM de EDTA e

42

5mM de cisteína a 60°C por 24 horas, em seguida os GAGs foram

precipitados com 3 volumes de etanol e mantidos a 4oC durante 24h. O

precipitado seco foi dissolvido em 1 mL de água destilada e os GAGs

foram purificados por cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-

Sephacel equilibrada com tampão acetato de sódio 0,05 M (pH 5,0). A

coluna foi lavada com 5 volumes do mesmo tampão e, a seguir, eluída

“stepwise” com 2M de NaCl no mesmo tampão (SILVA e cols., 1989). O

material eluído foi dialisado e liofilizado.

3. Caracterização dos GAGs sulfatados de pele de arraia.

Os GAGs foram analisados por cromatografia de troca-iônica em

coluna Mono Q-FPLC, eletroforese em gel de agarose antes e após

digestão com condroitinases específicas e clivagem desaminativa por

ácido nitroso (SILVA, 2002) e a análise da composição dissacarídica foi

feita em cromatografia de troca iônica em coluna SAX-HPLC, como

descrito a seguir:

3.1. Cromatografia de troca-iônica em coluna Mono Q-FPLC.

O material inicialmente purificado na coluna de DEAE-cellulose e

que continha os GAGs foi aplicado em uma coluna Mono Q-FPLC,

equilibrada com tampão Tris HCl 20 mM, pH 8,0. A coluna foi eluída com

um gradiente linear de 0 a 3 M de NaCl no mesmo tampão. O fluxo

utilizado foi de 0,5mL/min e frações de 0,5 mL foram coletadas. As frações

foram monitoradas pelo seu conteúdo de ácido urônico e pela sua

metacromasia (GALAMBOS, 1967; FARNDALE e cols., 1986). As frações

correspondentes aos GAGs sulfatados foram agrupadas e,

43

subseqüentemente, dialisadas exaustivamente contra água destilada e

liofilizadas.

3.2. Eletroforese em gel de agarose dos GAGs sulfatados de pele de

arraia.

Aproximadamente 10µg de GAGs sulfatados (obtidos pela

cromatografia de troca iônica Mono Q-FPLC), antes e após a digestão

enzimática com condroitinases ou clivagem desaminativa por ácido

nitroso, assim como uma mistura dos padrões de C4-S, DS e HS (10 µg

de cada), foram aplicados à um gel de agarose 0,5% em tampão 0,05 M

1,3 diaminopropano:acetato (pH 9,0). Após a eletroforese os GAGs foram

fixados ao gel com CETAVLON 0,1% em água, e corados com azul de

toluidina 0,1% em ácido acético:etanol:água (0,1:5:5, v/v).

3.3. Análise por eletroforese em gel de poliacrilamida da massa molecular

de DS de pele de arraia.

As amostras de DS foram aplicados em um gel de poliacrilamida 6%

com 1 mm de espessura. A eletroforese foi desenvolvida a 100 V por

aproximadamente 1 h em 0,06 M de barbital sódico (pH 8,6), o gel foi em

seguida corado com azul de toluidina 0,1% em ácido acético 1%. Após

serem corados os geles foram lavados por 6 horas em ácido acético 1%.

4. Análise dissacarídica do DS de pele de arraia.

Os GAGs sulfatados obtidos após o fracionamento em coluna Mono

Q-FPLC foram submetidos à digestão exaustiva com condroitinase AC

44

(degrada o CS). Os GAGs sulfatados resistentes ao tratamento, neste

caso, cadeias intactas de DS e HS, foram recuperados por gel filtração

em uma coluna Superdex-Peptide (Amersham Pharmacia Biotech) em

sistema de HPLC (Shimadzu, Tóquio, Japão). A coluna foi eluída com

água destilada:acetonitrila:ácido trifluoroacético (80 : 20 : 01, v/v), com um

fluxo de 0,5 mL/min. Frações de 0,25 mL foram coletadas, sendo

monitoradas pela propriedade metacromática. As frações correspondentes

aos GAGs sulfatados resistentes à condroitinase AC (eluídos no volume

de exclusão) foram agrupadas, congeladas e liofilizadas. Os GAGs

sulfatados resistentes à condroitinase AC, recuperados na coluna de gel

filtração e constituídos de DS e/ou HS foram submetidos a digestão

exaustiva com condroitinase ABC (degrada o DS). Os dissacarídeos

formados pela ação da enzima, bem como os dissacarídeos padrões

foram analisados em uma coluna analítica SAX-HPLC (250mm x 4,6 mm,

Sigma-Aldrich). Após o equilíbrio da coluna com a fase móvel (água

destilada a pH 3,5, ajustado com HCl) a um fluxo de 0,5 mL/min, as

amostras foram injetadas e os dissacarídeos eluídos com um gradiente

linear de 0 a 1,5 M de NaCl na mesma fase móvel.

4.1. Digestão com Condroitinases.

Digestões com condroitinases foram feitas como descrito

previamente por SAITO e cols. (1968). Resumidamente:

aproximadamente 10µg de GAGs sulfatados foram incubados com 0,3

unidades de condroitinase AC ou ABC por 12 horas a 37° C em 100 µL de

tampão Tris:HCl 50 µM (pH 8,0) contendo 5 mM de EDTA e 15 mM de

acetato de sódio.

45

4.2. Clivagem desaminativa por ácido nitroso.

Desaminação por ácido nitroso (que degrada GAGs sulfatados que

apresentam N-sulfatação, como a heparina e o HS) a pH 1,5 foi feita

conforme descrito por SHIVELY e CONRAD (1976). Resumidamente:

aproximadamente 10µg de GAGs foram incubados com 200 µL de HNO2,

recém produzido, à temperatura ambiente por 90 minutos. A reação foi,

então, neutralizada com 0,1 M de Na2CO3.

5. Tempo de tromboplastina parcial ativada (APTT)

Os testes de APTT foram realizados de acordo com a metodologia

descrita por ANDERSON e cols. (1976), com uso de um coagulômetro

Amelung KC4A (Sigma Diagnostics). Inicialmente foram colocados em

cada cubeta, 90 µL de plasma pobre em plaquetas e 10 µL da solução de

DS em diferentes concentrações. O material foi incubado a 37oC por 1 min

e após esse tempo 100 µL de cefalina ativada (Celite Biolab) foi

adicionado. Após incubação de 2 min a reação foi disparada com adição

de 100 µL de CaCl2 25 mM e o tempo necessário para formação do

coagulo registrado.

6. Inativação da trombina mediada por HC II em presença de DS de pele

de arraia.

Incubações foram realizadas em semi-microcubetas descartáveis. A

concentração final dos reagentes foram: 68 nm HCII, 15 nm trombina

(ambos da Diagnostica Stago, Asnières, França) e 0-1 mg/ml de amostras

46

de DS em 0,1 ml de 0,02 Tris:HCl, 0,15 M NaCl, e 1,0 mg/ml de polietileno

glicol (p.H 7,4) (TS/PEG tampão). Trombina foi adicionada por último para

iniciar a reação. Após 60s de incubação à temperatura ambiente, 0,5 ml

de 0,1 mM de substrato cromogênico S-2238 (Chromogenix AB, Molndal,

Sweden) em tampão TS/PEG foi adicionado, e foi medida a absorbância

em 405 nm durante 120 s. A variação da absorbância foi proporcional a

atividade da trombina remanescente na incubação. Nenhuma inibição

ocorreu nos experimentos controles, onde a trombina foi incubada com

HCII na ausência de DS. Também não houve inibição quando a trombina

foi incubada somente com o DS (sem o HCII) em diferentes

concentrações.

47

IV - RESULTADOS:

No presente estudo, os GAGs extraídos após degradação

proteolítica, seguido por precipitação com etanol e cromatografia de troca

iônica em coluna DEAE-Sephacel (vide materiais e métodos), de amostras

de peles ventral e dorsal de arraias das espécies Dasyatis americana,

Dasyatis guttata, Dasyatis centrora, Aetobatus narinari, Rhinobatos

Percellens e Potamotrygon motoro foram inicialmente fracionados e

analisados por cromatografia de troca iônica em coluna Mono Q-FPLC. As

frações obtidas das colunas foram monitoradas por pela sua propriedade

metacromática (detecta a presença de GAGs sulfatados) e pelo seu

conteúdo de acido urônico (componente comum a maioria dos GAGs

sulfatados, com exceção do QS) (Figura 8).

48

0 20 40 60 80

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5 Metacromasia Ácido urônico

Frações

0 20 40 60 80

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5 Metacromasia Ácido urônico

Frações

A1. D. americana (pele ventral)

A2. D. americana (pele dorsal)

Abs

(52

5 nm

)

49

0 20 40 60 80 0,0 0,1 0,2

0,3

0,4

0,5 Metacromasia Ácido urônico

Frações

0 20 40 60 80

0,0

0,1

0,2

0,3

Metacromasia Ácido urônico

Frações

B2. D. guttata (pele dorsal)

Abs

(52

5 nm

)

B1. D. guttata (pele ventral)

50

. D. centroura (pele dorsal)

. D. centroura (pele ventral) C1

C2

0 20 40 60 80

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5 Metacromasia Ácido urônico

Frações

0 20 40 60 80

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5 Metacromasia Ácido urônico

Frações

Abs

(52

5 nm

)

51

0 20 40 60 80

0,0

0,1

0,2

0,3 Metacromasia Ácido urônico

Frações

0 20 40 60 80

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4 Metacromasia Ácido urônico

Frações

D2. P. motoro (pele dorsal)

D1. P. motoro (pele ventral)

Abs

(52

5 nm

)

52

E2. R. percellens (pele dorsal)

E1. R. percellens (pele ventral)

0 20 40 60 80

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5 Metacromasia Ácido urônico

Frações

0 20 40 60 80

0,0

0,1

Metacromasia Ácido urônico

Frações

Abs

(52

5 nm

)

53

0 20 40 60 80

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Metacromasia Ácido urônico

Frações

F1. A. narinari (pele ventral)

0 20 40 60 80

0,0

0,1

0,2

0,3 Metacromasia Ácido urônico

Frações

F2. A. narinari (pele dorsal)

FIGURA 8. Cromatografia de troca iônica em coluna Mono-Q FPLC dos GAGs isolados das peles ventral e dorsal de arraias das espécies Dasyatis americana (A1 e A2), Dasyatis guttata (B1 e B2), Dasyatis centroura (C1 e C2), Potamotrygon motoro (D1 e D2), Rhinobatos percellens (E1 e E2) e Aetobatus narinari (F1 e F2). As frações contendo os GAGs sulfatados, indicadas pelo travessão sobre o respectivo pico, foram agrupadas, dialisadas e liofilizadas.

Abs

(52

5 nm

)

54

Os GAGs sulfatados purificados foram analisados por eletroforese

em gel de agarose antes e após a degradação com condroitinase AC,

condroitinase ABC e clivagem desaminativa com ácido nitroso (Figura 9).

CS DS HS

D. americana pele dorsal

GAG Padrão

D. americana pele ventral

GAG Padrão

CS DS HS

D. guttata pele dorsal

GAG Padrão

D. guttata pele ventral

GAG Padrão

origem

CS DS HS

CS DS HS

+

CS DS HS

+

origem

Condroitinase AC - - + - - - + - Condroitinase ABC - - - + - - - +

CS DS HS

+

origem

A2 A1

Condroitinase AC - - + - - - + - Condroitinase ABC - - - + - - - +

B2 B1

Condroitina se AC - - + - - - + - Condroitinase ABC - - - + - - - +

D. centroura pele dorsal

GAG Padrão

D. centroura pele ventral

GAG Padrão

C2 C1

55

CS DS HS

CS DS HS

CS DS HS

FIGURA 9. Eletroforese em gel de agarose dos GAGs sulfatados purificados obtidos das peles ventral e dorsal de arraias das espécies Dasyatis americana (A), Dasyatis guttata (B), Dasyatis centrora (C) Potamotrygon motoro (D), Rhinobatos percellens (E) e Aetobatus narinari (F), antes (-) e após (+) os tratamentos enzimáticos e a clivagem desaminativa com ácido nitroso. A esquerda estão mostrados os padrões de CS, DS e HS.

origem

CS DS HS

+

Condroitinase AC - - + - - - - + - - Condroitinase ABC - - - + - - - - + - Ácido Nitroso - - - - + - - - - +

origem

CS DS HS

+

Condroitinase AC - - + - - - + - Condroitinase ABC - - - + - - - +

P. motoro pele dorsal

GAG Padrão

P. motoro pele ventral

GAG Padrão

D2 D1

origem

CS DS HS

+

Condroitinase AC - - + - - - + - Condroitinase ABC - - - + - - - +

R. percellens pele dorsal

GAG Padrão

R. percellens pele ventral

GAG Padrão

E2 E1

GAG Padrão

A. narinari pele dorsal

GAG Padrão

A. narinari pele ventral

F2 F1

56

Após a coloração do gel apenas uma única banda pode ser

encontrada para o material proveniente das peles ventral e dorsal das

arraias D. americana, D. centroura e R. percellens, e que diminuiu

levemente após o tratamento com condroitinase AC, mas que foi

completamente degradada pelo tratamento com condroitinase ABC, com

exceção para a pele dorsal de R. percellens que teve uma sensível

diminuição com AC, mas também foi totalmente degradada com ABC

(Figura 9, A1, A2, C1, C2, E1 e E2). Em D. guttata e P. motoro ocorreram

duas bandas, a de maior intensidade com migração semelhante àquela

encontrada para D. americana, D. centroura e R. percellens, e que foi

resistente a condroitinase AC e totalmente degradada com condroitinase

ABC, e outra banda bem menos intensa que foi completamente

degradada com o tratamento com condroitinase AC (Figura 9, B1, B2, D1

e D2). Esses resultados indicam a presença majoritária de DS e uma

pequena quantidade de CS nessas cinco espécies. De maneira contrária,

o material proveniente da pele ventral de A.narinari, apresentou uma

composição bem mais heterogênea composta de: majoritariamente CS

acompanhado de DS, e ainda uma pequena porção de HS, cuja banda

tornou-se visível após o tratamento com condroitinase ABC e

desapareceu após o tratamento com acido nitroso (Figura 9, F1). Já a pele

dorsal de A. narinari apresentou um perfil parecido com as outras cinco

espécies, tendo DS como GAG sulfatado majoritário, porém apresentou

também uma pequena porção de HS (Figura 9, F2).

Na Tabela III nós temos um resumo das composições de GAGs

identificadas para as peles ventral e dorsal das espécies estudadas.

57

Após a obtenção desses resultados, focalizamos o nosso estudo no

DS, por ser este o GAG sulfatado majoritário em quase todas as amostras

analisadas, bem como, na pele da arraia da espécie Raja clavata como

descrito anteriormente por CHATZIIOANIDIS (1999a).

As frações que continham DS foram tratadas com condroitinase AC

para evitar a contaminação com GAGs do tipo CS, e as frações que

continham HS foram tratadas com ácido nitroso.

Inicialmente, as frações purificadas contendo unicamente DS foram

analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida com o objetivo de

Espécie GAGs

Dasyatis americana DS, CS

Dasyatis guttata DS, CS

Aetobatus narinari

DS, CS Potamotrygon motoro

DS, CS, HS

Região

PV

PV

PV

PV

PV

PV

PD

PD

PD

PD

PD

PD

Dasyatis centroura

Rhinobatos percellens

DS, CS

DS, CS

DS, CS

DS, CS

DS, CS

DS, CS

DS, CS, HS

DS, CS

TABELA III. Sumário dos resultados da composição de GAGs sulfatados nas peles ventral e dorsal das espécies: D. americana, D. guttata, D. centroura, A.

narinari, R. percellens e P. motoro.

* Em negrito está representado o tipo de GAG sulfatado majoritário

58

identificar possíveis diferenças nas massas moleculares dos DS tanto

entre as regiões ventral e dorsal dentro de uma mesma espécie quanto

entre espécies diferentes (Figuras 10, 11 e 12).

59

Padrões

P1 P2 P3 P4 V V D D

D.a D.g

FIGURA 10. Avaliação da massa molecular do DS das regiões ventral (V) e dorsal (D) das espécies Dasyatis americana (D.a) e Dasyatis guttata (D.g). Os padrões utilizados foram: P1, condroitim 6-sulfato de cartilagem de tubarão, 60 kDa; P2, dermatam sulfato de pulmão bovino, 35 kDa; P3, condroitim 4-sulfato de cartilagem de baleia, 40 kDa; P4, dextram sulfato 8 kDa.

FIGURA 11. Avaliação da massa molecular do DS das regiões ventral (V) e dorsal (D) das espécies Dasyatis centroura (D.c) e Aetobatus narinari (A.n). Os padrões utilizados foram: P1, condroitim 6-sulfato de cartilagem de tubarão, 60kDa; P2, dermatam sulfato de pulmão bovino, 35kDa; P3, condroitim 4-sulfato de cartilagem de baleia, 40kDa; P4, dextram sulfato 8 kDa.

Padrões

P1 P2 P3 P4 V V D D

D.c A.n

60

Após as eletroforeses em gel de poliacrilamida foi possível observar

que todos os DS provenientes das regiões dorsais das seis espécies

estudadas apresentaram uma massa molecular maior do que aquelas dos

DS das regiões ventrais. Diferenças também foram encontradas quando

comparamos as seis espécies entre si. Chama à atenção a elevada

massa molecular do DS da pele dorsal de D. guttata (Figura 10)

Com o objetivo de fazer uma caracterização mais detalhada, e ainda

avaliar possíveis diferenças estruturais nas cadeias de DS isoladas das

peles ventral e dorsal das diferentes arraias, resolvemos analisar a

estrutura dissacarídica do DS após a clivagem com condroitinase ABC e

FIGURA 12. Avaliação da massa molecular do DS da regiões ventral (V) e dorsal (D) das espécies Rhinobatos percellens (R.p) e Potamotrygon motoro (P.m). Os padrões utilizados foram: P1, condroitim 6-sulfato de cartilagem de tubarão, 60kDa; P2, dermatam 4-sulfato de pulmão bovino, 35kDa; P3, condroitim 4-sulfato de cartilagem de baleia, 40kDa; P4, dextram sulfato 8 kDa.

Padrões

P1 P2 P3 P4 V V D D

R.p P.m

61

posterior análise dos dissacarídeos formados por cromatografia de troca

iônica forte em coluna SAX-HPLC.

Foram detectadas diferenças significativas na estrutura

dissacarídica dos DS das regiões ventral e dorsal na maioria das espécies

estudadas (Tabela IV), destacando-se as seguintes: a) D. centroura, cujo

DS apresentou na pele dorsal uma grande quantidade de unidades 2,6-

dissulfatadas (32%) e uma menor quantidade de unidades 4-

monossulfatadas (38%), quando comparadas com a pele ventral; b) R.

percellens, onde o DS apresentou uma grande quantidade de unidades

2,6-dissulfatadas (35%) na pele ventral, enquanto que na pele dorsal

observa-se uma quantidade razoável de unidades 2,4-dissulfatadas

(25%); c) O padrão de sulfatação de DS da pele ventral das espécies D.

americana e D. gutata foi bastante similar, apresentando pequenas

diferenças apenas nos teores de unidades dissacarídicas não sulfatadas e

6-monossulfatadas. Em ambas as espécies a unidade dissacarídica

majoritária foi a unidade 4-monossulfatada (~50%), e foram observados

ainda, quantidades bastante significativas de unidades 2,4-dissulfatadas

(~30%); d) O DS da pele da arraia de água doce P. motoro foi a que

apresentou o menor grau de sulfatação, apenas 6% de unidades

dissacarídicas dissulfatadas na pele ventral e 10% na dorsal. Além disso,

apresentou como unidade dissacarídica majoritária a unidade 4-

monossulfatada (75% e 60%) e quantidades menores de unidades 6-

monossulfatadas e unidades não sulfatadas.

62

Unidades dissacarídicas (% do total)

Pele Ventral ∆di 0S ∆di 6S ∆di 4S ∆di-di 2-6S ∆di-di 2-4S

D. americana 12 5 50 3 30

D. guttata 3 11 51 2 33

D. centroura 8 14 65 4 9

P. motoro 3 16 75 - 6

R. percellens 20 15 28 35 2

A. narinari 10 11 47 8 24

Pele Dorsal

D. americana 7 9 56 5 23

D. guttata 8 12 35 5 40

D. centroura 16 12 38 32 2

P. motoro 12 18 60 1 9

R. percellens 21 10 31 13 25

A. narinari 18 9 53 3 17

Já foi mostrado na literatura que cadeias de DS enriquecidas com

unidades dissacarídicas 2,4-dissulfatadas (dissacarídeo B) apresentam

potente atividade anticoagulante (PAVÃO e cols. 1998), dessa forma,

devido a presença de dissacarídeo B nos DS da pele das arraias

estudadas (em proporções variáveis entre as espécies) nós decidimos

analisar o potencial anticoagulante dessas moléculas através de ensaios

de APTT (Figuras 13, 14 e 15).

TABELA IV. Análise dissacarídica do DS obtidos da pele ventral e dorsal das arraias D.americana, D. guttata, D. centroura, P. motoro, R. percellens e A. narinari.

63

FIGURA 13. Análise da atividade anticoagulante do DS da pele ventral (PV) das espécies D. americana, D. guttata, A. narinari e P. motoro medidos através do APTT. DS de mamífero foi incluído para comparação.

AP

TT

(s)

FIGURA 14. Análise da atividade anticoagulante do DS da pele ventral (PV) das espécies D. centroura e R. percellens medidos através do APTT. DS de mamífero foi incluído para comparação.

AP

TT

(s)

Dermatam sulfato (mg/mL)

Mamífero D. americana(PV) D. guttata(PV) A. narinari(PV) P. motoro(PV)

0,01 0,1 1

20

40

60

80

100

64

O DS que apresentou a maior atividade anticoagulante foi aquele

obtido da pele ventral da espécie D. americana (Figura 13). Tanto o DS da

pele ventral de D. guttata (Figura 13) quanto o DS da pele dorsal de D.

americana (Figura 15) apresentaram atividades anticoagulantes próximas

aquela do DS obtido de mamífero. As demais frações de DS não

apresentaram atividades anticoagulantes significativas (Figuras 13 a 15).

Foi realizado também o ensaio de inativação da trombina mediada

por HC II em presença de DS (Figura 16). Realizamos esse ensaio com os

DS das peles ventrais de D. americana e D. guttata, os quais tiveram

atividades anticoagulantes significativas e de A. narinari e P. motoro, que

não apresentaram atividades anticoagulantes para comparação.

FIGURA 15. Análise da atividade anticoagulante do DS da pele dorsal (PD) das espécies D. americana, D. guttata, D. centroura, A. narinari, R. percellens e P. motoro medidos através do APTT. DS de mamífero foi incluído para comparação.

AP

TT

(s)

65

Como esperado, o DS da pele ventral de D. americana apresentou

maior inibição da trombina pelo HCII, do que o DS da pele ventral de D.

guttata e do DS de mamífero. Um dado interessante aparece quando

observamos os valores de IC50, onde o DS da PV de D. americana e D.

guttata são 12 e 4 vezes menores do que o valor de IC50 encontrado para

o DS de mamífero (Figura 16).

V - DISCUSSÃO:

FIGURA 16. Dependência da concentração de DS da pele ventral (PV) para a inativação da trombina por HCII. DS de mamífero foi utilizado para comparação.

Dermatam sulfato ( µg/ml)

○ Mamífero ● D. americana(PV) ■ D. guttata(PV) □ A. narinari(PV) ▲ P. motoro(PV)

Ativ

idad

e da

Tro

mbi

na (

%)

0,1 1 10 1000

20

40

60

80

100

66

Nesta tese nós avaliamos a composição de GAGs sulfatados e

fizemos um estudo da estrutura e do potencial anticoagulante de DS das

peles ventral (PV) e dorsal (PD) de arraias das espécies D.americana, D.

guttata, D. centroura, A.narinari, R. percellens e P. motoro. A composição

de GAGs sulfatados das peles ventral e dorsal entre as 6 espécies de

arraias são bastante semelhantes, sendo constituída de DS e CS onde o

DS é o GAG sulfatado majoritário, com exceção dos GAGs sulfatados

encontrados nas peles ventral e dorsal de A. narinari, que possui além de

DS e CS, também o HS, entretanto, este GAG ocorre em pequena

quantidade. Contrariamente ao observado para as outras espécies,

observa-se que CS é o GAG sulfatado majoritário na pele ventral de A.

narinari.

De um modo geral os nossos resultados mostram que o DS é o

GAG sulfatado majoritário em pele de arraia. Observamos ainda que CS

ocorre em proporções variáveis. Por outro lado, a ocorrência de uma

diminuta quantidade HS foi restrita apenas a uma única espécie dentre as

seis estudadas, podendo talvez ser resultado de uma contaminação da

amostra de pele durante o processo de obtenção do material.

Uma vez determinada à composição qualitativa dos GAGs

sulfatados nas peles ventral e dorsal das seis espécies de arraias, o

próximo passo então foi analisar possíveis similaridades e/ou diferenças

na estrutura das diversas populações de DS obtidas dessas amostras. As

análises da composição dissacarídica das moléculas de DS obtidas de

amostras de pele ventral e dorsal das seis espécies revelaram aspectos

estruturais importantes. A principal unidade dissacarídica monossulfatada

do DS nas seis espécies foi identificada como sendo a unidade 4-

monossulfatada. Notamos a ocorrência de quantidades significativas de

unidades 2,4-dissulfatadas (dissacarídeo B) em D. americana (PV e PD),

67

D. guttata (PV e PD), A. narinari (PV e PD) e PD de R. percellens.

Observamos ainda quantidades relevantes de unidades dissacarídicas

2,6-dissulfatadas em PD de D. centroura e em R. percellens (PV e PD).

Analisando-se o perfil estrutural do DS obtido das cinco arraias

marinhas (excluindo-se P. motoro) observamos que estes apresentam

uma heterogeneidade, tanto entre as diferentes espécies quanto entre as

diferentes regiões (PV ou PD). Os DS das espécies D. americana e A.

narinari foram os que apresentaram uma menor diferença entre as suas

unidades dissacarídicas quando comparadas as regiões ventral e dorsal.

Contudo, a maior diferença estrutural foi observada no DS derivado da

espécie de água doce P. motoro, que apresentou, tanto na região ventral

como na dorsal, um grau de sulfatação menor do que aquele observado

para o DS das espécies marinhas. A composição dissacarídica do DS de

P. motoro apresentou um percentual de apenas 6% na PV e de 10% na

PD de unidades dissacarídicas dissulfatadas.

DS é o GAG predominantemente expresso na pele de vertebrados

marinhos. Moléculas de DS com composição dissacarídica e grau de

sulfatação únicos têm sido encontrados na pele de arraias

(CHATZIIONANNIDIS e cols., 1999a,b). DS da pele da arraia da espécie

Raja clavata, a qual habita a costa Grega, foi mostrado conter dois tipos

de DS com diferentes graus de sulfatação: DSI, o qual foi o tipo principal

de DS na pele da arraia, e um DS pouco sulfatado (DSPS) como o tipo

minoritário (CHATZIIONANNIDIS e cols., 1999a,b). DSPS é composto de

dissacarídeos não-sulfatados (44%), e monosulfatados carregando grupos

de ésteres de sulfato nas posições C-4 ou C-6 da GalNAc (53% e 3%,

respectivamente). Enquanto que DSI apresenta principalmente

dissacarídeos monosulfatados carregando grupos de ésteres de sulfato

nas posições C-4 ou C-6 da GalNAc (61% e 4%, respectivamente), e

dissacarídeos dissulfatados com um padrão de sulfatação peculiar (32%)

68

e uma pequena porção de dissacarídeos não-sulfatados (3%). Usando

análises dissacarídicas por métodos de HPLC os autores sugeriram que

os dissacarídeos dissulfatados eram compostos de: unidades carregando

grupos ésteres de sulfato nas posições C-2 e C-3 dos resíduos de ácido

urônico ligados a GalNAc (64%), unidades carregando grupos ésteres de

sulfato na posição C-3 do ácido urônico e posição C-6 da GalNAc

(dissacarídeo K) (20%) e unidades carregando grupos ésteres de sulfato

na posição C-2 do ácido urônico e posição C-6 da GalNAc (dissacarídeo

D) (13%).

DS da pele do tubarão P. glauca (NANDINI e cols., 2005), um GAG

híbrido de CS/DS, foi descrito como sendo altamente heterogêneo e

caracterizado por múltiplos dissacarídeos, incluindo dissacarídeos não-

sulfatados contendo GlcA e GalNac, dissacarídeos monossulfatados

carregando GlcUA ou IdoA e grupos ésteres de sulfato nas posições C-4

ou C-6 da GalNAc, e unidades dissacarídicas dissulfatadas de

dissacarídeos B, dissacarídeos D e dissacarídeos E. Inesperadamente,

estes dissacarídeos dissulfatados foram mostrados conter unidades GlcA

ou IdoA.

DS isolado da pele da enguia A. japonica, foi descrito como sendo

composto principalmente de dissacarídeos monossulfatados carregando

grupos ésteres de sulfato nas posições C-4 da GalNAc (81%), e unidades

dissacarídicas dissulfatadas de dissacarídeos B (12%). Baseado em

espectroscopia de ressonância magnética 1H, foi também sugerida a

presença de resíduos IdoA 3-sulfatados e/ou 2,3-sulfatados (Sakai e cols.,

2003).

A composição dissacarídica do DS da pele tanto das arraias

marinhas quanto da de água doce, aqui estudada, difere de maneira

significativa daquela relatada para o DS obtido de pele da arraia marinha

Raja clavata (CHATZIIOANNIDIS e cols., 1999a,b, KARAMANOS e cols.,

69

1991). Os autores reportaram que o DS da pele desta arraia é composto

principalmente de dissacarídeos apresentando ésteres de sulfato na

posição C-4 da GalNAc (~60%), semelhante ao encontrado por nós para a

maioria das amostras analisadas no presente estudo. Entretanto, as

unidades dissacarídicas dissulfatadas derivadas do DS de Raja clavata

apresentaram ésteres de sulfato somente nas posições C-2 e C-3 da

unidade de ácido urônico (unidades 2,3-dissulfatadas), diferindo do

encontrado no nosso presente estudo, onde as unidades dissacarídicas

dissulfatadas apresentaram ésteres de sulfato nas posições C2 do ácido

idurônico e C4 ou C6 da galactosamina (unidades 2,4- ou 2,6-

dissulfatadas).

Conjuntamente, o nosso estudo sobre o DS da pele de seis

espécies de arraias e os dados publicados sobre o DS da pele dos

seguintes vertebrados marinhos: enguia A. japonica, arraia R. clavata, e

tubarão P. glauca, mostraram a existência de heterogeneidades

estruturais entre DS de pele de diferentes vertebrados marinhos.

A análise da massa molecular das moléculas de DS também nos

revelou diferenças entre os DS das espécies estudadas. Em todas as

espécies o DS proveniente da pele dorsal mostrou uma massa molecular

maior do que o da pele ventral para a respectiva espécie. Houve apenas

variações nessas diferenças, onde a espécie D. guttata foi a que

apresentou maior variação na massa do DS entre as duas regiões (ventral

e dorsal), e a espécie D. centroura foi a que apresentou uma menor

diferença entre o DS das duas regiões. Outro fator interessante diz

respeito ao trabalho já relatado para a espécie Raja clavata onde foram

encontradas duas populações diferentes de DS, chamadas de DSI e DSII,

que apresentavam pesos moleculares diferentes. Cabe ressaltar, que os

estudos feitos na arraia Raja clavata mencionam apenas a caracterização

de DS da pele da arraia sem, entretanto, especificar se a amostra foi

70

proveniente da região dorsal ou ventral, ou ainda, da mistura das duas

regiões, o que nos leva a especular a possibilidade de que também nessa

espécie existam diferenças de massa molecular para o DS das regiões

ventral e dorsal.

Os nossos resultados apontam para uma diversidade no padrão de

DS na pele de arraias, principalmente no que diz respeito a estrutura fina

destes compostos. Em particular, o DS das cinco espécies de arraias

marinhas aqui estudadas apresentou cerca de quatro vezes mais

unidades dissacarídicas dissulfatadas do que o DS da espécie de água

doce (P. motoro), sugerindo que arraias provenientes de um ambiente de

maior salinidade apresentam um maior grau de sulfatação nos seus GAGs

dermais (veja as Tabelas III e IV). Em um estudo recente foi mostrado que

a quantidade total de GAGs sulfatados em invertebrados varia e aumenta

com o aumento da salinidade de seu habitat (NADER e cols., 1999).

BRANDAN e cols. (1990) documentaram que a expressão de GAGs

sulfatados aumenta após a eclosão de larvas do gastrópode marinho

Concholepas concholepas e que sulfato inorgânico presente na água do

mar é crucial para a expressão dessas moléculas numa fração de matriz

extracelular nas larvas. Os autores investigaram se ocorriam mudanças no

grau de sulfatação quando as larvas eram incubadas em água do mar

artificial com diferentes concentrações de sulfato radioativo. Os resultados

mostraram que a incorporação de sulfato radioativo nos GAGs aumentou

com o aumento da concentração da salinidade no meio de incubação. Os

autores concluíram então que o sulfato presente na água do mar poderia

induzir mudanças especificas no grau de sulfatação de GAGs podendo ser

relevante para o desenvolvimento deste gastrópode.

Finalmente, um outro aspecto importante revelado pela análise

estrutural do DS dermal de arraias marinhas, foi a identificação de

quantidades significativas de unidades dissacarídicas 2,4- e/ou 2,6-

71

dissulfatadas na estrutura deste GAG. DS tem sido usado como um

agente terapêutico experimental para a modulação de numa variedade de

processos biológicos, em particular, DS é um dos mais importantes

candidatos aprovados como um agente antitrombótico para a profilaxia

contra trombose venosa pós-operatória (SAKAI e cols. 2003). DS tem

importantes atividades anticoagulante e antitrombótica. A atividade

associada ao DS mais bem investigada diz respeito à aceleração da

inibição da trombina pelo HC II.

DS com estruturas únicas têm sido relatados em vísceras de

diversas espécies de ascidias (um tunicato marinho) (PAVÃO e cols.

1998, CAVALCANTE e cols. 2000, GANDRA e cols. 2000). DS altamente

sulfatado e apresentando uma elevada atividade estimuladora do HC II,

apresentando, portanto, atividade anticoagulante e um alto teor de

unidades dissacarídicas 2,4-dissulfatadas foi purificado de vísceras de

ascidias das espécies Halocynthia pyriformis e Styela plicata (PAVÃO e

cols. 1998). Os autores mostraram ainda que um DS apresentando um

alto teor de unidades dissacarídicas 2,6-dissulfatadas ocorre no corpo da

ascidia Ascidia nigra. Diferente do observado para os DS derivados de

mamíferos ou das outras duas espécies de ascidias, o DS de Ascidia nigra

não apresenta a capacidade de potencializar a inibição da antitrombina

pelo HC II (PAVÃO e cols., 1998). DS da pele de enguia (A. japonica), o

qual tem um conteúdo significativo de dissacarídeos do tipo B, mostrou

uma atividade anticoagulante menor quando comparado com aquela de

DS de pele suína, o qual tem duas vezes menos unidades dissacarídicas

B do que o DS de pele de enguia (SAKAI e cols., 2003). Tem sido

reportado que a presença na estrutura do DS de seqüências contíguas de

dissacarídeos B, no mínimo quatro seqüências repetidas, é requerida para

a atividade anticoagulante mediada pelo HC II (MASCELLANI e cols.,

1996). Portanto, SAKAI e cols. (2003) sugeriram, como uma possível

72

explicação para o fato do DS de pele de enguia ter uma atividade

anticoagulante muitíssimo baixa, que as sequências dissacarídicas B no

DS de pele de enguia poderiam estar deslocadas e logo não haveriam

seqüências contíguas dessas unidades dissacarídicas neste DS.

Esses fatos nos estimularam a avaliar a atividade anticogulante das

diferentes populações de DS das espécies estudadas. Apenas o DS da

pele ventral de D. americana e o DS da pele ventral de D. guttata

apresentaram atividade anticoagulante. Uma pequena atividade foi

encontrada também para o DS da pele dorsal de D. americana. Um dado

curioso é que a análise dissacarídica do DS da pele ventral de D.

americana e do DS da pele ventral de D. guttata mostrou um perfil muito

semelhante entre as duas populações de DS. Mas, a atividade

anticoagulante foi bem diferente, o DS da pele ventral de D. americana

teve uma atividade anticoagulante muito superior àquela encontrada para

o DS da pele ventral de D. guttata, a qual apresentou uma atividade bem

próxima do DS de mamífero, que foi utilizado como padrão de

comparação. Esta diferença na atividade, mesmo tendo um perfil de

unidades dissacarídicas semelhantes, pode estar relacionada com um

arranjo diferenciado das unidades dissacarídicas, já que o grau de

sulfatação entre os dois tipos de DS é muito semelhante, como

previamente sugerido por SAKAI e cols. (2003) para o DS de pele de

enguia. Outro resultado que reforça esta idéia é a falta de atividade

anticoagulante do DS da pele dorsal de D. guttata, onde foram

encontrados 40% de unidades 2,4-dissulfatadas e mesmo com uma alta

proporção dessas unidades o ensaio de APTT não mostrou nenhuma

atividade anticoagulante significativa. Outros autores reportaram

previamente padrões similares quando eles analisaram as relações entre

estrutura e atividade anticoagulante de preparações de DS bovino

(MASCELLANI e cols. 1993; DENTI e cols. 1995).

73

Diferenças foram também observadas na ação anticogulante do DS

de pele de arraias, medida pela inibição da trombina mediada pelo HC II,

quando comparado ao DS de mamífero. DS da pele ventral de

D.americana apresentou uma alta atividade estimulatória para o HC II. Em

contraste, DS das outras espécies de arraias estudadas não apresentou

atividade anticoagulante apreciável. A habilidade do DS de arraia D.

americana em estimular a inibição da trombina pelo HC II sugere que o

arranjo de unidades dissacarídicas B no interior da cadeia do DS seja

importante. O nosso estudo sugere que moléculas de DS presentes na

pele de arraias contenham arranjos diferentes de unidades dissacarídicas

dissulfatadas capazes ou não de ativar o HC II. DS de pele da arraia D.

americana poderia apresentar seqüências contíguas de unidades

dissacarídicas dissulfatadas B, enquanto que no DS das outras espécies

de arraias estudadas essas unidades poderiam estar deslocadas,

resultando na ausência de seqüências contíguas desta unidade.

Alternativamente, a atividade anticoagulante diferencial entre os DS

de pele de arraias pode ser explicada pelas diferenças na massa

molecular desses GAGs. Contudo, resultados conflitantes têm sido

reportados com respeito à importância da massa molecular na

estimulação in vitro do HC II pelo DS de diferentes fontes. MASCELLANI e

cols. (1993) demonstraram que diferenças na massa molecular de

preparações de DS bovino foram correlacionadas com as suas

habilidades diferenciais para ativar o HC II. Eles mostraram que a

capacidade de ativação do HCII por fragmentos de DS diminuía com a

diminuição da massa molecular. Por outro lado, KYOGASHIMA e cols.

(1999) mostraram que DS de intestino bovino com uma massa molecular

média de 16 KDa exibiu um efeito de estimulação do HC II maior do que

aquele de DS de intestino de galinha, o qual apresenta massa molecular

média de 38 KDa. Os nossos resultados mostram diferenças na

74

distribuição de massa molecular entre as diferentes populações de DS de

pele de arraias. Embora, nós acreditemos que a distribuição de unidades

dissacarídicas B na estrutura do DS de pele de arraias seja um ponto-

chave na sua atividade anticoagulante, nós não podemos descartar

completamente a possibilidade de que diferenças na atividade

anticoagulante das diferentes populações de DS de pele de arraias

possam estar relacionadas com as diferenças nas suas massas

moleculares.

VI - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

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