Journal of Vietnam Agricultural Science and Technologyvaas.org.vn/Upload/Documents/So 6-2017/So 6.pdf · khối lượng nghìn hạt bằng phương pháp MABC vào giống lúa

1

TẠP CHÍKHOA HỌC CÔNG NGHỆNÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Journal of Vietnam Agricultural Science and Technology

NĂM THỨ MƯỜI HAI

SỐ 6 NĂM 2017

TỔNG BIÊN TẬPEditor in chief

GS.TS. NGUYỄN VĂN TUẤT

PHÓ TỔNG BIÊN TẬPDeputy Editor

GS.TS. BÙI CHÍ BỬUTS. TRẦN DANH SỬU

TS. NGUYỄN THẾ YÊN

THƯỜNG TRỰCThS. PHẠM THỊ XUÂN - THƯ KÝ

TÒA SOẠN - TRỊ SỰBan Thông tin

Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Vĩnh Quỳnh, Thanh Trì, Hà Nội

Điện thoại: (024) 36490503; (024) 36490504; 0949940399

Fax: (024) 38613937;Website: http//www.vaas.org.vn

Email: [email protected];[email protected]

ISSN: 1859 - 1558Giấy phép xuất bản số:

1250/GP - BTTTTBộ Thông tin và Truyền thôngcấp ngày 08 tháng 8 năm 2011

MỤC LỤC1. Nguyễn Thị Thúy Anh, Trần Trung, Khuất Hữu

Trung, Trần Đăng Khánh. Ứng dụng chỉ thị phân tử chọn lọc cá thể mang QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông ở quần thể BC2F1 để cải tiến năng suất giống lúa Khang dân 18

2. Lý Nguyễn Phước Điềm, Nguyễn Xuân Dũng, Dương Hoa Xô. Nghiên cứu chuyển gen vào lan Mokara qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

3. Nguyễn Hoàng Quân, Dương Hoa Xô. Tạo các dòng biến dị hoa chuông (Gloxinia speciosa) bằng tia Gamma nguồn Cobalt 60

4. Đào Thị Tuyết Thanh, Nguyễn Bảo Toàn. Sử dụng chỉ thị ISSR trong việc đánh giá đa dạng di truyền các dòng/giống hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) nuôi cấy mô do xử lý đột biến bằng tia gamma

5. Bùi Văn Thắng, Nguyễn Thị Hồng Gấm. Nhân giống cây Lan đuôi chồn [Rhynchostylis retusa (L.) Blume] bằng kỹ thuật nuôi cấy mô

6. Nguyễn Thị Hồng Gấm, Bùi Văn Thắng. Nhân giống vô tính cây Ngưu tất (Achyranthes bidentata Blume) từ chồi bằng kỹ thuật nuôi cấy mô

7. Đồng Huy Giới, Ngô Thị Ánh. Nghiên cứu sử dụng chế phẩm nano trong nuôi cấy mô cây mía (Saccharum offcinarum L.)

8. Nguyễn Văn Việt, Hà Thanh Tùng. Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng và phân bón NPK đến sinh trưởng của Gõ đỏ (Afzelia xylocarpa Craib) giai đoạn vườn ươm

9. Hà Thị Loan, Dương Hoa Xô. Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến sự nhân nhanh sinh khối rễ tóc sâm Ngọc Linh trên hệ thống plantima®

10. Nguyễn Kim Thu, Cao Văn Phụng, Trần Văn Dũng, Vũ Ngọc Minh Tâm, Hồ Nguyễn Hoàng Phúc. Ảnh hưởng của các phương pháp xử lý rơm lên phát thải khí CH4 và năng suất lúa trên đất phù sa tại Thới Lai, Cần Thơ

11. Nguyễn Văn Việt. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro trong nhân giống lan Hoàng thảo vôi (Dendrobium cretaceum Lindley)

3

8

14

20

25

30

35

41

45

50

55

2

TẠP CHÍKHOA HỌC CÔNG NGHỆNÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Journal of Vietnam Agricultural Science and Technology

NĂM THỨ MƯỜI HAI

SỐ 6 NĂM 2017

TỔNG BIÊN TẬPEditor in chief

GS.TS. NGUYỄN VĂN TUẤT

PHÓ TỔNG BIÊN TẬPDeputy Editor

GS.TS. BÙI CHÍ BỬUTS. TRẦN DANH SỬU

TS. NGUYỄN THẾ YÊN

THƯỜNG TRỰCThS. PHẠM THỊ XUÂN - THƯ KÝ

TÒA SOẠN - TRỊ SỰBan Thông tin

Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Vĩnh Quỳnh, Thanh Trì, Hà Nội

Điện thoại: (024) 36490503; (024) 36490504; 0949940399

Fax: (024) 38613937;Website: http//www.vaas.org.vn

Email: [email protected];[email protected]

ISSN: 1859 - 1558Giấy phép xuất bản số:

1250/GP - BTTTTBộ Thông tin và Truyền thôngcấp ngày 08 tháng 8 năm 2011

12. Nguyễn Xuân Dũng, Dương Hoa Xô. Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán Piper yellow mottle virus gây hại trên hồ tiêu (Piper nigrum L.) ở Việt Nam

13. Nguyễn Văn Giang, Nguyễn Thị Thu, Chu Đức Hà. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn VS18 đối kháng với nấm Corynespora cassiicola

14. Nguyễn Văn Giang, Nguyễn Đức Thái. Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng phân giải phosphate khó tan từ đất rừng Xuân Liên

15. Phạm Anh Tuấn, Hoàng Văn Đạt, Hồ Tuấn Anh. Tuyển chọn chủng nấm men, nấm mốc từ bánh men lá ứng dụng trong nâng cao chất lượng rượu làng nghề tại Hà Giang

16. Nguyễn Duy Tân, Võ Thị Xuân Tuyền, Nguyễn Minh Thủy. Phân tích so sánh hàm lượng các hợp chất sinh học của cây thuốc dòi thân tím đỏ và thân xanh được thu thập trên địa bàn tỉnh An Giang

17. La Việt Hồng, La Thị Hạnh, Ngô Tuyết Dung, Bùi Văn Thắng. Kết quả nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống, trồng và chăm sóc một số giống hoa cẩm chướng (Dianthus Caryophyllus L.) tại huyện Bắc Hà, Lào Cai

18. Đào Thị Thu Hương, Trần Văn Điền, Dương Thị Nguyên. Nghiên cứu phương thức bón phân và khoảng cách gieo hạt trong canh tác giống lúa nếp cạn Khẩu Nua Trạng tại Hà Giang

19. Đào Thị Thu Hương, Trần Văn Điền, Dương Thị Nguyên. Nghiên cứu các phương thức phòng trừ cỏ dại trong canh tác giống lúa nếp cạn Khẩu Nua Trạng tại tỉnh Hà Giang

20. Trần Thị Lệ Hăng, Trương Thanh Tân, Nguyễn Xuân Thịnh, Văn Phạm Đăng Trí. Ứng dụng mô hình đa tác tử trong quản lý nước mặn phục vụ nông nghiệp tại vùng ngọt hóa ven biển Đồng bằng sông Cửu Long

21. Phạm Đức Thụ, Hoàng Trọng Quý, Đinh Văn Hà. Tính chất đất nông nghiệp tỉnh Quảng Nam

22. Lê Minh Châu, Nguyễn Bích Thu. Nghiên cứu một số tính chất đất chọn lọc vùng trồng bưởi Tân Triều, huyện Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai

59

64

68

73

80

85

90

95

99

109

115

3

Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 6(79)/2017

1 Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Hưng Yên2 Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

I. ĐẶT VẤN ĐỀ Lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực quan

trọng nhất ở Việt Nam, đồng thời cũng là nguồn cung cấp thức ăn chính cho hơn một nửa dân số thế giới. Ngày nay, dân số ngày càng tăng nhanh gây áp lực lớn đến nền nông nghiệp toàn cầu và đặc biệt ở các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam. Một vấn đề đáng quan tâm là các ảnh hưởng cực đoan của biến đổi khí hậu như lũ lụt, hạn hán, xâm nhập mặn... đã và đang làm sản lượng lúa của nước ta bị sụt giảm đáng kể. Để đáp ứng nhu cầu lương thực, việc nghiên cứu, cải tiến các giống lúa có năng suất cao, chất lượng tốt là yếu tố quan trọng nhằm đảm bảo an sinh xã hội, tăng thu nhập cho người dân và là việc làm cấp bách của các nhà khoa học.

Năng suất và yếu tố cấu thành năng suất lúa là một tính trạng phức hợp gồm: Số bông trên khóm, số hạt trên bông và khối lượng nghìn hạt. Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại (MABC) là phương pháp thiết thực, hiệu quả trong việc lai chuyển locus gen hay gen quy định tính trạng di truyền số lượng (QTL) vào giống mới. Cho tới nay, nhiều QTL/gen kiểm soát các tính trạng năng suất đã được xác định vị trí trên bản đồ hệ gen lúa. Trên cơ sở đó, nhiều QTL/gen quy định tính trạng năng suất đã được lai chuyển thành công bằng phương pháp MABC vào các giống lúa ưu tú tại một số quốc gia trên thế giới. Chẳng hạn, tại Trung Quốc, năm 2014, các nhà chọn giống đã lai chuyển thành công gen GW6 quy định khối lượng nghìn hạt bằng phương pháp MABC vào giống lúa trồng đại trà và làm tăng 30% khối lượng nghìn hạt, tăng tương đương 7% năng suất lúa (Li Y và cs., 2014). Gần đây, năm 2016, các nhà khoa học Malaysia đã quy tụ gen năng suất và chịu hạn

vào dòng lúa truyền thống MR219. Đây là nghiên cứu đầu tiên về ảnh hưởng của QTL qDTYs làm tăng năng suất lúa trong điều kiện khô hạn (Noraziyah et al., 2016).

Vì vậy, ứng dụng chỉ thị phân tử kết hợp phương pháp lai trở lại để lai chuyển và quy tụ QTL/gen quy định tăng số hạt trên bông vào giống lúa Khang dân 18 nhằm tăng năng suất, đồng thời vẫn giữ nguyên đặc tính di truyền của giống nhận QTL/gen là việc làm cần thiết và có ý nghĩa.

II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu - Giống lúa KC25 và giống lúa Khang dân 18

(KD18); trong đó KD18 là giống lúa thuần nhập nội được trồng khá phổ biến ở các tỉnh Đồng bằng sông Hồng, giống KC25 có nguồn gốc nhập nội mang QTL/gen tăng số hạt trên bông.

- Cá thể số 74 và 109 là cá thể BC1F1 đã được xác định mang QTL/gen tăng số hạt trên bông và có nền di truyền cao nhất của cây nhận gen, được kế thừa từ những nghiên cứu trước đó (Nguyễn Thị Thúy Anh và cs., 2016).

- 03 chỉ thị phân tử đa hình tại vị trí QTL/gene quy định tăng số hạt trên bông gồm RM445, RM500, RM21615. Kế thừa kết quả nghiên cứu của tác giả Linh và cs. (2008) đã xác định được chỉ thị RM445 nằm trên vùng gen và chỉ thị RM500, RM21615 là 2 chỉ thị cận biên lần lượt tại các vị trí 17,46Mb, 15,91Mb, 18,25Mb.

- 62 chỉ thị phân tử đa hình trải đều trên 12 NST giữa hai giống lúa KD18 và giống KC25.

ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ CHỌN LỌC CÁ THỂ MANG QTL/GEN QUY ĐỊNH TÍNH TRẠNG TĂNG SỐ HẠT TRÊN BÔNG Ở QUẦN THỂ BC2F1

ĐỂ CẢI TIẾN NĂNG SUẤT GIỐNG LÚA KHANG DÂN 18Nguyễn Thị Thúy Anh1, Trần Trung1,

Khuất Hữu Trung2, Trần Đăng Khánh2

TÓM TẮTTrước những ảnh hưởng cực đoan từ biến đổi khí hậu cùng với quỹ đất trồng lúa bị thu hẹp do quá trình đô

thị hóa đã làm năng suất lúa ở nước ta bị sụt giảm rõ rệt. Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại (MABC) là phương pháp thiết thực, hiệu quả để lai chuyển QTL hoặc gen vào dòng/giống ưu tú. Trong nghiên cứu này, nhờ ứng dụng MABC, đã lai chuyển thành công QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông từ dòng cho gen KC25 vào giống nhận gen (Khang dân 18). Ở thế hệ BC2F1 đã chọn lọc được cá thể số 59 mang gen và có nền di truyền cao nhất giống cây nhận gen đạt 92,3%.

Từ khóa: Chọn giống phân tử kết hợp lai trở lại (MABC), QTL/gen, KD18, KC25

4


Bảng 2. Các chỉ thị cho đa hình giữa giống KD18 ˟ KC25 trải đều trên 12 NST

Hình 1. Vị trí của QTL/gen yd7 quy định tăng số hạt trên bông định vị trên nhiễm sắc thể số 7

(Linh và cs., 2008).

2.2. Phương pháp nghiên cứu- Phương pháp tách chiết và tinh sạch ADN theo

phương pháp CTAB cải tiến dựa trên cơ sở phương pháp của Shagai - Maroof và cộng tác viên (1984).

- Kỹ thuật PCR.- Kỹ thuật điện di trên gel Agarose 0,8%; 3,5%.- Phương pháp bố trí thí nghiệm nhà lưới của

Phạm Chí Thành (1986).- Phương pháp phân tích số liệu thống kê. Số liệu

được xử lý thống kê trên máy tính bằng chương trình Excel 2007, IRRISTART 5.0 và phần mềm GGT2.

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Chọn lọc cá thể BC2F1 mang QTL/gen tăng số hạt trên bông

Ở quần thể BC1F1 đã xác định được cá thể số 74 và 109 là 2 cá thể mang QTL/gen yd7 tăng số hạt trên bông và có nền di truyền gần nhất với mẹ đạt 83,4% và 80,2% (Nguyễn Thị Thúy Anh và cs., 2016). Do đó, 2 cá thể này được sử dụng để lai trở lại với Khang dân 18 tạo quần thể BC2F1. Kết quả thu được 210 hạt lai (trong đó từ tổ hợp lai cá thể số 74 và KD18 thu được 112 hạt và từ tổ hợp lai cá thể số 109 và KD18 thu được 98 hạt). Các hạt lai được gieo trồng để phát triển quần thể BC2F1. Sau khi cây lúa được khoảng 20 ngày tuổi tiến hành thu mẫu lá của các cá thể (cây lai có nguồn gốc từ cây 74 được đánh số thứ tự từ 1 - 67, cây lai có nguồn từ cây 109 được đánh số thứ tự từ 68 - 117). Mẫu thu được tách chiết và kiểm tra chất lượng ADN.

Trong nghiên cứu này, 03 chỉ thị liên kết chặt với QTL/gen yd7 gồm chỉ thị RM445, RM500, RM21615 được sử dụng để sàng lọc các cá thể dị hợp tử. Kết quả được thể hiện trong hình 2, hình 3 và hình 4.

Bảng 1. Các chỉ thị cho đa hình giữa giống KD18 ˟ KC25 tại vị trí QTL/gen

Tên mồi Mồi xuôi Mồi ngược Kích thước (bp)

RM445 CGTAACATGCATATCACGCC ATATGCCGATATGCGTAGCC 251

RM500 GAGCTTGCCAGAGTGGAAAG GTTACACCGAGAGCCAGCTC 259

RM21615 CTTTCCTCCTCGGCCGTTGC GAGGAGCCAGGCGAACATCACC 130

Chr 7

RM542

RM542

RM21619

RM418RM 21615

RM445

RM 500

RM21584

RM21560

RM21515

1079-1260 kb

NST Tên chỉ thị phân tử đa hình Số lượng

1

RM10115, RM10136, RM10694, RM10741, RM10800, RM10815, RM10916, RM11062, RM11438, RM11504, RM1287, RM3412b, RM493, RM5365, RM7075

15

2 RM526, RM5356, RM6, RM7355 4

3 RM14795, RM14820, RM282, RM3297, RM3654, RM5480, RM7389 7

4 RM16589, RM16820, RM280, RM3333, RM349, RM551 6

5 RM19199; RM31, RM7027 3

6 RM3, RM345, RM494, RM527, RM528, RM7434 6

7 RM11, RM21539, RM12769, RM248, RM7338 5

8 RM22825, RM331, RM447 39 RM296, RM7175, RM1208 3

10 RM24865, RM25181, RM25271, RM3628 4

11 RM7283, RM19840, RM341 312 RM1194, RM247, RM7102 3

Tổng 62

5


Kết quả sàng lọc với chỉ thị RM445 đã xác định được 61/117 cá thể mang kiểu gen dị hợp tử được lựa chọn gồm các cá thể số: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 38, 42, 43, 50, 51, 52, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 69, 70, 71, 74, 77, 84, 85, 86, 87, 88, 97, 101 và cá thể số 111.

Sáu mốt cá thể BC2F1 dị hợp tử tại vị trí chỉ thị

RM445 được đánh số thứ tự từ 1 - 61 và tiếp tục sàng lọc với chỉ thị RM500 và RM21615. Kết quả kiểm tra cá thể lai BC2F1 thể hiện trong hình 3 và hình 4.

Như vậy, việc kết hợp sử dụng hai chỉ thị RM500 và RM21615 đã chọn lọc được 15 cá thể lai BC2F1 mang QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông gồm các cá thể số: 8, 18, 22, 32, 35, 42, 56, 59, 60, 61, 70, 86, 88, 97 và 101.

Hình 2. Hình ảnh điện di sàng lọc cá thể trong quần thể BC2F1 với chỉ thị RM445 L: 50bp ladder, M: KD18 , B: KC25, 1-117: các cá thể BC2F1

Hình 3. Hình ảnh điện di sàng lọc cá thể trong quần thể BC2F1 với chỉ thị RM500

L: 50bp ladder, M: KD18 , B: KC25, A: Đồng hợp tử; H: Dị hợp tử; 1-61: Cá thể trong quần thể BC2F1

Hình 4. Hình ảnh điện di sàng lọc cá thể trong quần thể BC2F1với chỉ thị RM21615L: 50bp ladder; M: KD18; B: KC25; A: Đồng hợp tử; H: Dị hợp tử; 1-61: Cá thể BC2F1

6


3.2. Xác định cá thể con lai BC2F1 mang QTL/gen có nền di truyền cao nhất giống cây nhận gen

Mười năm cá thể con lai BC2F1 mang QTL/gen tăng số hạt trên bông đủ điều kiện lựa chọn, sàng

lọc, kiểm tra nền di truyền với 62/65 chỉ thị đa hình trải đều trên 12 NST (ngoại trừ những chỉ thị liên kết với với gen mục tiêu QTL/gen yd7). Kết quả được thể hiện qua một số hình ảnh điện di dưới đây.

Sau khi sàng lọc các cá thể BC2F1 với tất cả các chỉ thị (Hình 5) cho đa hình trên 12 nhiễm sắc thể để lựa chọn nền di truyền của cây nhận gen. Số liệu của từng cá thể được chấm điểm đưa vào phân tích trên chương trình phần mềm Graphical Genotyper 2

(GGT2) mục đích lựa chọn cá thể trong quần thể BC2F1 mang QTL/gen yd7 tăng số hạt trên bông và có nền di truyền cao nhất của cây nhận gen. Kết quả được thể hiện qua hình 6.

Hình 5. Hình ảnh điện di sàng lọc nền di truyền của 15 cá thể mang QTL/gen yd7 trong quần thể BC2F1 L: Ladder 50bp, M: KD18; B: KC25; điểm H: dị hợp tử; điểm A: đồng hợp tử với KD18; điểm B: đồng hợp với KC25

Hình 6. Biểu đồ phân tích của cá thể số 59 trong quần thể BC2F1 giữa tổ hợp lai KD18/KC25 A: Đồng hợp tử với Khang Dân 18; B: Đồng hợp tử với KC25; H: Dị hợp tử; U: Mẫu không biểu hiện

Ghi chú: Thứ tự các NST được biểu thị bằng số ở phía dưới và danh sách các chỉ thị sử dụng sàng lọc nền di truyền nằm ở phía bên trái, tương ứng với vị trí chỉ thị phân tử ghi bên phải NST. Vùng đỏ biểu thị nền di truyền tương đồng giống KD18, vùng xanh biểu thị nền di truyền của giống KC25. Vị trí và thứ tự chỉ thị phân tử được xây dựng dựa trên phần mềm GGT2.0

7


Trong nghiên cứu này, qua phân tích đánh giá nền di truyền, cá thể số 61 và cá thể số 59 mang QTL/gen tăng số hạt trên bông (yd7) được xác định có nền di truyền cao nhất giống cây nhận gen đạt 91,8 % và 92,3%. Hai cá thể này có nguồn gốc từ cá thể số 74 của thế hệ BC1F1 nên chúng tôi ký hiệu là C1-74- 59 và C1- 74-61.

Như vậy, quy trình chọn giống bằng phép lai trở lại với sự trợ giúp của chỉ thị phân tử có thể kết thúc ở ngay thế hệ sau, khi chọn ra được cá thể vừa mang QTL/gen tăng số hạt trên bông và mang xấp xỉ 100% nền di truyền hệ gen của cây nhận gen.

IV. KẾT LUẬNỨng dụng chỉ thị phân tử kết hợp lai trở lại

(MABC) bước đầu đã thành công trong quy tụ QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông vào giống lúa nhập nội tại Việt Nam. Cá thể số 59 (thế hệ BC2F1) là cá thể mang QTL/gen tăng số hạt trên bông có nền di truyền cao nhất giống cây nhận gen ở mức 92,3% sẽ tiếp tục được lựa chọn để sử dụng làm vật liệu cho các nghiên cứu tiếp theo.

LỜI CẢM ƠNNhóm tác giả xin gửi lời cảm ơn chân thành tới

Bộ Khoa học và Công nghệ đã cung cấp kinh phí cho đề tài mã số ĐT.ĐL.G36-2012 để thực hiện nghiên cứu này.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Thị Thúy Anh, Trần Trung, Khuất Hữu

Trung, Lê Hùng Lĩnh, Tạ Hồng Lĩnh, Hoàng

Kim Thành, Thân Thị Thành, Nguyễn Như Toản, Nguyễn Thị Loan, Trần Đăng Khánh, 2016. Ứng dụng chỉ thị phân tử chọn lọc cá thể BC1F1 (tổ hợp lai KD18/KC25) mang QTL/gen tăng số hạt trên bông và có nền di truyền cao nhất giống nhận gen. Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai, tr 331-336.

Phạm Chí Thành, 1986. Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng. Nhà xuất bản Nông nghiệp. Hà Nội.

Li Y.Y, Tao H.J, Zhao X.Q, Xu J, Li G.M, Hu S.K, Dong G.J, Shi Z.Y, Wu L. W, Hu J, Ye G.Y, Gou L.B, 2014. Molecular Improvement of Grain Weight and Yield in Rice by Using GW6 Gene. Rice Science 21(3): 127 - 132.

Linh L.H, 2008. Fine mapping of quantitative trait loci for heading date and yield component traits in NILs from an interspecific cross between Oryza sativa and O. Minuta. Doctoral Thesis, Chungnam National University, Daejeon, Korea.

Linh L.H, Hang N.T., Kang K.H, Lee Y.T, Kwon S.J, Ahn S.N, 2008. Introgression of a quantitative trait locut for spikelets per panicle from Oryza minuta to the O. sativa cultivar Hwaseongbyeo. Plant Breding 127:262-267.

Noraziyah A.A.S, Mallikarjuna S.B.P, Wickneswari R, Anitha R, Arvind K, 2016. Marker assisted pyramiding of drought yield QTLs into a popular Malaysian rice cultivar, MR219. BMC Genetics.

Saghai-Maroof M.A, Soliman K.M, Jorgensen R.A, Allard R.W, 1984. Ribosamal ADN spacer-length polymorphisms in barley: Medelian inheritance, chromosomal location, ADN population dynamics. PNAS 81:8014-8018.

Application of molecular breeding to select individual plants of BC2F1 population carrying the QTL/Gene (increasing grains number per panicle)

to improve yield of KD18 varietyNguyen Thi Thuy Anh, Tran Trung,

Khuat Huu Trung, Tran Dang KhanhAbstractThe pressure of rapid population growth, adverse effects from climate change and narrowing rice growing areas in Vietnam due to the urbanization and industrialization lead to decrease rice yield. Molecular breeding such as Marker - Assisted Backcrossing (MABC) is one of the efficient methods to transfer the specific quantitative trait loci (QTL) or gene into the elite varieties. In this study, MABC was applied to transfer QTL/gene which is responsible for increasing number of grains per panicle from donor (KC25) to recipient plant (KD18). The results showed that the successfully selected individual No.59 in BC2F1

population carrying QTL/gene and the highest genetic background of the recipient plant up to 92.3% were obtained.Key words: Marker - assisted backcrossing (MABC), QTL/gene, KD18, KC25

Ngày nhận bài: 8/5/2017 Người phản biện: GS.TS. Bùi Chí Bửu

Ngày phản biện: 20/5/2017 Ngày duyệt đăng: 29/5/2017

8


I. ĐẶT VẤN ĐỀMokara (Mokara spp.) là loài lan lai được tạo ra

từ 3 loài Ascocentrum, Vanda và Arachnis (Arditti, 2009). Đây là loài lan có hoa với màu sắc và hoa văn đa dạng, và đang là một trong hai loài hoa lan cắt cành chủ lực tại Việt Nam. Bệnh do virus gây ra gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến ngành sản xuất hoa lan do làm giảm năng suất và chất lượng hoa. Tuy nhiên, các biện pháp kiểm soát virus gây bệnh trên hoa lan theo phương thức truyền thống (bao gồm việc kiểm soát và loại bỏ nguồn nhiễm) vẫn chưa mang lại hiệu quả như mong muốn. Việc nghiên cứu chuyển gen để tạo giống hoa lan có khả năng kháng virus được xem là một trong những giải pháp triển vọng cho vấn đề kiểm soát bệnh virus trên hoa lan ở Việt Nam. Những kết quả khả quan ban đầu về việc tạo giống kháng bằng phương pháp chuyển gen đã được công bố trên loài lan Dendrobium (Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự, 2015). Đây là tiền đề quan trọng cho việc tiếp tục triển khai các nghiên cứu tạo giống kháng virus trên các loài lan quan trọng khác, trong đó có lan Mokara.

Là bước đầu tiên hướng đến việc tạo giống kháng virus, nghiên cứu này tiến hành thiết lập quy trình chuyển gen vào lan Mokara qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Trong đó, các yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen như môi trường tái sinh và tăng sinh PLB, nồng độ chất cảm ứng acetosyringone cũng như kháng sinh khử khuẩn và sàng lọc PLB chuyển gen đã được khảo sát.


2.1. Vật liệu nghiên cứuLá của cây lan Mokara Fullmoon in vitro (cao 3

- 4 cm) được nuôi cấy tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực Vật - Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh.

Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA4404 mang vector chuyển gen pCAMBIA1301 với vùng T-DNA chứa gen GUS và gen kháng hygromycin (Hình 1).

Hình 1. Cấu trúc vector pCAMBIA1301

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Khảo sát môi trường thích hợp để tạo PLBs từ mô lá

Cô lập mẫu lá từ cây con in vitro, tạo vết thương trên bề mặt và nuôi cấy trên môi trường MS

1 Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN VÀO LAN MokaraQUA TRUNG GIAN VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

Lý Nguyễn Phước Điềm1, Nguyễn Xuân Dũng1, Dương Hoa Xô1

TÓM TẮTTại Việt Nam, Mokara là một trong hai loài lan cắt cành đang được ưa chuộng trên thị trường hiện nay. Việc xây

dựng thành công quy trình chuyển gen vào lan này có thể được ứng dụng để nâng cao chất lượng hoa lan. Trong nghiên cứu này, vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chủng LBA4404 mang vector pCAMBIA1301 được sử dụng để chuyển gen mục tiêu vào PLBs của lan Mokara. Các yếu tố như môi trường kích thích sự tái sinh PLB từ mẫu lá, môi trường kích thích sự tăng sinh của PLBs, nồng độ chất cảm ứng acetosyringone, nồng độ kháng sinh khử khuẩn và nồng độ kháng sinh sàng lọc PLBs chuyển gen đã được khảo sát. Hiệu quả chuyển gen được xác định dựa trên tỷ lệ mẫu dương tính GUS trên tổng số mẫu được lây nhiễm. Kết quả cho thấy môi trường Murashige & Skoog (MS) bổ sung 0,5 mg/L BA kết hợp 2,0 mg/L NAA cho tỷ lệ tái sinh PLBs từ mẫu lá cao nhất (91,67%) sau 15 tuần nuôi cấy. Môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L kết hợp 1,0 mg/L NAA thích hợp cho sự tăng sinh PLBs, trọng lượng PLBs đạt 25,70 g sau 8 tuần nuôi cấy. Hiệu quả chuyển gen cao nhất đạt được khi có sự hiện diện của 50 µM acetosyringone trong quá trình chuyển gen với thời gian đồng nuôi cấy là 2 ngày. Kháng sinh cefotaxime ở nồng độ từ 300 mg/L đến 500 mg/L có khả năng loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn sau thời gian đồng nuôi cấy. Kháng sinh hygromycin ở nồng độ 10 mg/L thích hợp cho giai đoạn sàng lọc PLBs chuyển gen.

Từ khóa: Agrobacterium tumefaciens, chuyển gen, hoa lan, Mokara, PLBs

pCAMBIA130111849 bp

GUS First Exon35S promoter

LAC Z ALPHAMCS

CAMV35S

HYG(R)

POLY A SITET BORDER (L)

kanamycin (R)

pBR322 oripBR322 bom site pVS1-REP

pVS1 StaT-BORDER (R)

NOS polyAgusA1701gusA-1551gusA-1400gusA1403gusA-1256gusA1099

gusA-952gusA Second Exon

gusA779gusA-648

gusA478gusA350gusA-354

gusA176Catalase Intron

9


(PhytoTechnology Laboratories®) có bổ sung BA ở các nồng độ 0,1; 0,3 và 0,5 mg/L kết hợp với NAA ở các nồng độ 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 mg/L. Theo dõi sự tái sinh PLBs theo thời gian nuôi cấy.

2.2.2. Khảo sát môi trường thích hợp cho sự tăng sinh PLBs

Các PLB đơn (kích thước khoảng 1 mm) được tách từ cụm PLBs và nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung BA ở các nồng độ 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 mg/L kết hợp với NAA ở nồng độ 0,5 và 1,0 mg/L. Sự tăng sinh của PLB được theo dõi và ghi nhận sau 8 tuần nuôi cấy.

2.2.3. Khảo sát hiệu quả gây chết PLBs của hygromycin

Các PLB đơn được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung hygromycin ở các nồng độ 5; 7; 10 và 15 mg/L. Mẫu được cấy chuyền sang môi trường mới sau mỗi 7 ngày. Tỷ lệ mẫu chết được ghi nhận sau 7, 14 và 21 ngày. Kết quả của thí nghiệm được áp dụng để sàng lọc mẫu giả định chuyển gen.

2.2.4. Khảo sát nồng độ chất cảm ứng acetosyringone thích hợp cho chuyển gen

Một khuẩn lạc A.tumefaciens được nuôi lắc qua đêm ở điều kiện tối, trong 30 ml môi trường LB lỏng có bổ sung 50 mg/L rifamycin (Sigma-Aldrich) và 100 mg/L kanamycin (Sigma-Aldrich), tốc độ lắc 250 vòng/phút ở 28ºC đến khi đạt OD600 trong ngưỡng 0,6 - 0,8. Vi khuẩn sau khi tăng sinh được tiến hành ly tâm thu sinh khối ở 6000 vòng/phút trong 15 phút. Sinh khối vi khuẩn sau ly tâm được huyền phù trong 30ml môi trường MS lỏng có bổ sung chất cảm ứng acetosyringone (AS) (PhytoTechnology Laboratories®) ở các nồng độ 0, 50 và 100 µM.

Các PLB đơn được ngâm trong môi trường MS lỏng có bổ sung chất cảm ứng AS ở các nồng độ 0, 50 và 100 µM trong 30 phút. Sau đó mẫu được chuyển sang dịch huyền phù vi khuẩn có bổ sung AS ở nồng độ tương ứng và ủ trong 30 phút. PLBs được làm khô bề mặt trên giấy thấm tiệt trùng trước khi tiến hành đồng nuôi cấy 2 ngày trên môi trường có bổ sung AS ở các nồng độ tương ứng.

Đánh giá hiệu quả chuyển gen bằng phương pháp nhuộm GUS.

Các PLBs sạch khuẩn và sống sau quá trình sàng lọc với kháng sinh hygromycin được nhuộm GUS

theo quy trình của Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự (2014). Theo đó, PLBs được ủ trong dung dịch nhuộm GUS ở 37ºC trong 72 giờ; giải nhuộm với ethanol 70% ít nhất trong 4 giờ hoặc đến khi mẫu mất diệp lục hoàn toàn. Sự biểu hiện của gen GUS được ghi nhận dưới kính hiển vi soi nổi. Hiệu quả chuyển gen được tính bằng số mẫu biểu hiện gen GUS trên tổng số mẫu được lây nhiễm.

2.2.5. Khảo sát nồng độ cefotaxime thích hợp cho để khử khuẩn từ PLBs

Sau thời gian đồng nuôi cấy, PLBs được rửa 3 lần với nước cất vô trùng và 1 lần với môi trường MS lỏng có bổ sung kháng sinh cefotaxime ở các nồng độ 0; 100; 300 và 500 mg/L. Mẫu được làm khô bề mặt trên giấy thấm tiệt trùng trước khi cấy chuyển sang môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L BA kết hợp 1,0 mg/L NAA và cefotaxime ở các nồng độ tương ứng. Mẫu được cấy chuyền sang môi trường mới sau mỗi 7 ngày. Tỷ lệ mẫu sạch khuẩn và mẫu sống được ghi nhận sau 7 và 14 ngày.

2.2.6. Phân tích thống kêSố liệu từ các thí nghiệm được phân tích bằng

phần mềm xử lý thống kê Statistical Program Scientific System (SPSS) phiên bản 20.0 (IBM). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê được xem xét ở giá trị p < 0,05 và các giá trị trung bình được so sánh bằng Duncan’s test.

2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứuCác thí nghiệm được thực hiện trong khoảng

thời gian từ 01/2014 đến 12/2015 tại phòng Công nghệ Sinh học Thực Vật, thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh.


3.1 Tái sinh PLBs từ mẫu lá Sau 4 tuần nuôi cấy, hầu hết các mẫu đều có cảm

ứng với môi trường với phần cuống lá phình to. Sau 8 tuần, một số mẫu có biểu hiện tái sinh tạo cấu trúc mới như mô sẹo, rễ, chồi hoặc PLBs. Các cấu trúc này tiếp tục phát triển tạo thành cụm chồi, cụm PLBs hoặc tạo lá sau 11 tuần. Sau 15 tuần nuôi cấy, sự tái sinh tạo PLBs từ mẫu lá giữa các nghiệm thức có sự khác biệt rõ rệt (Hình 2). Tỷ lệ mẫu lá tái sinh tạo PLBs cao nhất đạt được là 91,67% khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L BA kết hợp 2,0 mg/L NAA (Bảng 1).

10


Bảng 1. Tỷ lệ mẫu lá tái sinh tạo PLBs sau 15 tuần nuôi cấy

Ghi chú: Bảng 1, 2, 3, 5: Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ ra sự sai khác có ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p < 0,05 05 (Duncan’s test).

3.2. Tăng sinh PLBs từ PLB đơnSau 8 tuần nuôi cấy, các mẫu đều có biểu hiện

phát triển và gia tăng khối lượng trên tất cả các môi trường. Tuy nhiên, việc bổ sung BA và NAA đã kích thích sự phát triển của PLB nhiều hơn so với môi trường không có chất kích thích sinh trưởng. Khối lượng mẫu cao nhất đạt được trên môi trường có bổ sung 2,0 mg/L BA kết hợp 1,0 mg/L NAA (36,17 g).

Môi trường MS có bổ sung 2,0 mg/L BA kết hợp 0,5 mg/L NAA và môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L BA kết hợp 1,0 mg/L NAA cho kết quả tăng sinh mẫu tương đương nhau: 25,57 g và 25,70 g (Bảng 2).

Bảng 2. Khối lượng của PLB sau 8 tuần nuôi cấy

Môi trường MS có bổ sung 2,0 mg/L BA kết hợp 1,0 mg/L NAA và môi trường MS có bổ sung 2,0 mg/L BA kết hợp 0,5 mg/L NAA tuy có kích thích PLB đơn tăng sinh thành cụm PLBs nhưng các cụm này nhanh chóng phát triển thành chồi (Hình 3A, Hình 3B). Mặt khác, môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L BA kết hợp 1,0 mg/L NAA có khả năng tăng sinh PLB đơn và duy trì trạng thái PLB sau 8 tuần (Hình 3C). Kết quả cho thấy đây là môi trường thích hợp để kích thích sự nhân nhanh số lượng của PLBs.

Hình 2. Các mẫu lá sau 15 tuần nuôi cấy trên các môi trường khác nhau A, B, C, D: MS có bổ sung 0,1 mg/L BA kết hợp lần lượt với 0,5; 1,0; 1,5; và 2,0 mg/L NAA E, F, G, H: MS có bổ sung 0,3 mg/L BA kết hợp lần lượt với 0,5; 1,0; 1,5; và 2,0 mg/L NAA I, J, K, L: MS có bổ sung 0,5 mg/L BA kết hợp lần lượt với 0,5; 1,0; 1,5; và 2,0 mg/L NAA

Môi trường

Chất kích thích sinh trưởng (mg/L) Tỷ lệ mẫu

tạo PLBs (%)BA NAA

MS

0,1

0,5 41,67abc ± 20,971,0 8,33c ± 16,671,5 25,00bc ± 25,002,0 0,00c ± 0,00

0,3

0,5 75,00ab ± 25,001,0 0,00c ± 0,001,5 75,00ab ± 15,962,0 33,33bc ± 23,57

0,50,5 45.83abc ± 20,831,0 0,00c ± 0,001,5 41,67abc ± 14,43

Môi trường

Chất kích thích sinh trưởng (mg/L) Khối lượng PLB

(g)BA NAA

MS

0 0 9,47g ± 0,36

0,50,5 12,90f ± 0,281,0 25,70b ± 0,37

1,00,5 16,53e ± 0,271,0 10,00g ± 0,38

1,50,5 17,67d ± 0,311,0 20,17c ± 0,28

2,00,5 25,57b ± 0,341,0 36,17a ± 0,36

11


3.3. Hiệu quả gây chết PLB của hygromycin Sau 7 ngày nuôi cấy, mẫu trên môi trường có bổ

sung 10 mg/L và 15 mg/L hygromycin có hiện tượng chết dần. Sau 14 ngày nuôi cấy, hiện tượng mẫu chết

xuất hiện ở tất cả các nồng độ hygromycin được khảo sát. Tỷ lệ này tiếp tục tăng dần và đạt 100% sau 21 ngày trên môi trường có bổ sung 10 mg/L và 15 mg/L hygromycin (Bảng 3).

Hình 3. Sự phát triển của PLB đơn sau 60 ngày nuôi cấy. A: MS bổ sung 2,0 mg/L BA kết hợp 1,0 mg/L NAA; B: MS bổ sung 2,0 mg/L BA kết hợp 0,5 mg/L NAA;

C: MS bổ sung 0,5 mg/L BA kết hợp 1 mg/L NAA. (thanh ngang tương ứng 5mm)

Bảng 3. Hiệu quả gây chết PLBs không chuyển gen của hygromycin theo thời gian nuôi cấy

Như vậy, hygromycin ở nồng độ 10 mg/L thích hợp để sàng lọc mẫu giả định chuyển gen. Kết quả này phù hợp với một nghiên cứu về chuyển gen trên PLBs lan Vanda của Shrestha và cộng sự (2010), trong đó, 10 mg/L hygromycin cũng được sử dụng để chọn lọc PLBs giả định chuyển gen.

3.4. Ảnh hưởng của acetosyringone đến hiệu quả chuyển gen vào PLBs

Sau khi nhuộm GUS và giải nhuộm, mẫu đối chứng không chuyển gen mất màu hoàn toàn (hình 4A), mẫu được chuyển gen có màu xanh đặc trưng xuất hiện thành từng chấm nhỏ (hình 4B), thành mảng (hình 4C) hoặc rải rác khắp bề mặt mẫu (hình 4D).

Hình 4. Kết quả nhuộm GUS các PLBs. A: PLB không chuyển gen; B, C và D: PLBs chuyển gen

Kết quả cho thấy, trường hợp không bổ sung AS vào giai đoạn lây nhiễm và đồng nuôi cấy có tỷ lệ dương tính GUS là 9,72%. Tỷ lệ này tăng lên 12,5% khi tăng nồng độ AS đến 50 µM nhưng lại giảm xuống 9,03% khi nồng độ AS tiếp tục tăng đến 100 µM(Bảng 4).

Bảng 4. Tỷ lệ mẫu dương tính GUS

Sự hiện diện của chất cảm ứng AS ngoại sinh được cho là có khả năng nâng cao hiệu quả chuyển gen trong một số nghiên cứu trên lan. Kết quả nghiên cứu của Gnasekaran và cộng sự (2014) cho thấy hiệu quả chuyển gen trên Vanda tăng từ 40 lên 75% khi tăng nồng độ AS ngoại sinh từ 150 lên 200 µM. Tuy nhiên nồng độ AS trên 200 µM lại gây tác động tiêu cực đến PLBs Vanda, làm gia tăng tỷ lệ mẫu hóa nâu và chết; đồng thời hiệu quả chuyển gen cũng giảm xuống 32%. Kết quả tương tự cũng đã được ghi nhận trong nghiên cứu của Uddain và cộng sự (2015) về chuyển gen trên PLB của lan Dendrobium.

Mặt khác, chất coniferyl alcohol được tìm thấy ở lan Dendrobium đã được khẳng định là chất cảm

CD

Nồng độ hygromycin (mg/L)

Tỷ lệ mẫu chết theo thời gian (%)7 ngày 14 ngày 21 ngày

0 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00c ± 0,005 0,00 ± 0,00 33,33c ± 13,33 53,33b ± 17,647 0,00 ± 0,00 46,67bc ± 6,67 80,00ab ± 11,55

10 6,67 ± 6,67 66,67ab ± 6,67 100,00a ± 0,0015 20,00 ± 20,00 73,33a ± 6,67 100,00a ± 0,00

Nồng độ AS (µM) Tỷ lệ dương tính GUS (%)0 9,72

50 12,50100 9,03

12


ứng vir genes ở A.tumefaciens tương tự như AS; và nồng độ của coniferyl alcohol ở PLBs cao hơn so với các mô khác (cao hơn 11 lần so với mô lá) (Nan et al., 1997). Đây là một trong những nguyên nhân PLBs được xem là nguồn vật liệu chuyển gen thích hợp. Bên cạnh đó, một số công trình cũng đã thu được các mẫu chuyển gen trong điều kiện không bổ sung chất cảm ứng AS ngoại sinh như nghiên cứu chuyển gen trên lan Oncidium (Liau et al., 2003), lan Vanda (Shrestha et al., 2007; Gnasekaran et al., 2014), lan Cattleya (Zhang et al., 2010), lan Phalaenopsis amabilis (L.) Blume (Semiarti et al., 2011) và lan Dendrobium chrysotoxum Lindl (Bunnag, Pilahome, 2012).

3.5. Hiệu quả khử khuẩn trên PLBs của cefotaxime Sau 7 ngày nuôi cấy, 100 mg/L cefotaxime cho

tỷ lệ mẫu sạch khuẩn cao nhất (99,39%). Tuy nhiên tỷ lệ này giảm khi kéo dài thời gian khử khuẩn, có thể do nồng độ này chỉ có khả năng ức chế tạm thời sức sống của vi khuẩn. Mặt khác, cefotaxime ở nồng độ 300 mg/L và 500 mg/L cho tỷ lệ mẫu sạch khuẩn tăng khi kéo dài thời gian khử khuẩn. Về mặt ý nghĩa thống kê, hiệu quả diệt khuẩn của cefotaxime ở 3 nồng độ là tương tự nhau. Tuy nhiên về số liệu thực tế, 300 mg/L và 500 mg/L cefotaxime có khả năng diệt trên 98% khuẩn sau 14 ngày (Bảng 5).

Kết quả cho thấy, kháng sinh cefotaxime ở nồng độ từ 300 mg/L đến 500 mg/L có thể được dùng để khử khuẩn trên mẫu PLBs sau thời gian đồng nuôi cấy và quá trình khử khuẩn có thể kéo dài đến 14 ngày để đảm bảo mẫu sạch khuẩn. Cefotaxime ít độc hại với thực vật khi so sánh với các loại kháng sinh khử khuẩn khác như carbenicillin, vancomycin và timentin (Teixeira da Silva, Fukai, 2001). Ảnh hưởng của cefotaxime đến sự sống và phát triển của PLB cũng đã được nghiên cứu bởi Artichart và cộng sự vào năm 2007; trong đó, PLB lan Dendrobium sescundum vẫn có khả năng sống trong điều kiện có 500 mg/L cefotaxime. Kháng sinh này đã được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens với nồng độ từ 250 mg/L đến 500 mg/L như công trình của Belarmino và Mii (2000), Men và cộng sự (2003), Artichart và cộng sự (2007), Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự (2015).

IV. KẾT LUẬN - Môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L BA kết hợp

2,0 mg/L NAA kích thích sự tái sinh PLBs từ mô lá lan Mokara và môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L BA kết hợp 1,0 mg/L NAA thích hợp để nhân nhanh PLBs từ PLB đơn.

- Gen GUS đã được chuyển thành công vào PLB với hiệu quả cao nhất là 12,5% khi bổ sung 50 µM acetosyrinone vào quá trình lây nhiễm và đồng nuôi cấy.

- Kháng sinh cefotaxime ở nồng độ từ 300 mg/L đến 500 mg/L thích hợp để khử khuẩn trên PLBs và kháng sinh hygromycin ở nồng độ 10 mg/L có hiệu quả trong việc sàng lọc mẫu giả định chuyển gen.

TÀI LIỆU THAM KHẢONguyễn Xuân Dũng, Dương Hoa Xô, Chu Hoàng Hà,

2014. Tối ưu hóa sự chuyển nạp gen ở lan Dendrobium Sonia qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Tạp chí sinh học 36(1se): 257-265.

Nguyễn Xuân Dũng, Dương Hoa Xô, Nguyễn Thị Thanh Thảo, Chu Hoàng Hà, 2015. Nghiên cứu chuyển gen RNAi qua trung gian Agrobacterium tumefacinens vào Dendrobium Sonia để tạo giống kháng virus khảm vàng. Tạp chí Khoa học và Phát triển 2015 13(2): 264-271.

Arditti, J., 2009. Micropropagation of Orchids, Vol. 1. John Wiley & Sons, NY.

Artichart, P., Bunnag, S. and Theerakulpisut, P., 2007. Agrobacterium-mediated transformation of Dendrobium secundum (BI.) Lindl with antisense ACC oxidase. Asian J Plant Sci 6(7): 1065-1071.

Bảng 5. Hiệu quả khử khuẩn trên PLBs của cefotaxime

Nồng độ cefotaxime (mg/L)

Thời gian khử khuẩn7 ngày 14 ngày

Tỷ lệ mẫu sạch khuẩn (%)

Tỷ lệ mẫu sống (%)

Tỷ lệ mẫu sạch khuẩn (%)

Tỷ lệ mẫu sống (%)

0 2,02b ± 2,02 85,86b ± 4,76 0,00b ± 0,00 73,74b ± 8,24100 99,39a ± 0,60 95,76a ± 1,36 88,49a ± 8,72 92,12a ± 2,51300 96,97a ± 2,44 96,36a ± 1,88 98,18a ± 1,30 88,39a ± 2,86500 98,79a ± 1,21 97,57a ± 1,01 100a ± 0,00 88,49a ± 3,25

13


Belarmino, M.M. and Mii, M., 2000. Agrobacterium-mediated genetic transformation of a Phalaenopsis orchid. Plant Cell Rep 19: 435-442

Bunnag, S. and Pilahome, W., 2012. Agrobacterium-mediated transformation of Dendrobium chrysotoxum Lindl. Afr J Biotechnol 11(10): 2472-2476.

Gnasekaran, P., Antony, J.J.J., Uddain, J. and Subramaniam, S., 2014. Agrobacterium-mediated transformation of the recalcitrant Vanda Kasem’s Delight orchid with higher efficiency. The Scientific World Journal 2014: 1-10.

Liau, C.H., You, S.J., Prasad, V., Hsiao, H.H., Lu, J.C., Yang, N.S. and Chan, M.T., 2003. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of an Oncidium orchid. Plant Cell Rep 21(10): 993-998.

Men, S., Ming, X., Liu, R., Wei, C. and Li, Y., 2003. Agrobacterium-mediated genetic transformation of a Dendrobium orchid. Plant Cell Tissue Organ Cult 75: 63-71.

Nan, G.L., Tang, C.S., Kuehnle, A.R. and Kado, C.I., 1997. Dendrobium orchids contain an inducer of Agrobacterium virulence genes. Physiol Mol Plant Pathol 51: 391-399.

Semiarti, E., Indrianto, A., Purwantoro, A., Martiwi, I.N.A., Feroniasanti, Y.M.L., Nadifah,

F., Mercuriani, I.S., Dwiyani, R., Kojima, S., Machida, Y. and Machida, C., 2011. Establishment of high-frequency genetic transformation method of Indonesian orchid species mediated by Agrobacterium tumefaciens. Proceedings of Nagoya International Orchid Congress, Japan, 32-39.

Shrestha, B.R., Chin, D.P., Tokuhara, K. and Mii, M., 2010. Agrobacterium-mediated transformation of Vanda using protocorm-like bodies. Asia Pac J Mol Biol Biotechnol 18(1): 225-228.

Teixeira da Silva, J.A. and Fukai, S., 2001. The impact of carbenicillin, cefotaxime and vancomycin on chrysanthemum and tabacco TCL morphogenesis and Agrobacterium growth. Journal of Applied Horticulture 3(1): 3-12.

Uddain, J., Zakaria, L., Lynn, C.B. and Subramaniam, S., 2015. Preliminary assessment on Agrobacterium-mediated transformation of Dendrobium Broga Giant orchid’s PLBs. Emir J Food Agric 27(9): 669-677.

Zhang, L., Chin, D.P., Fukami, M., Ichikawa, H., Nakamura, I. and Mii, M., 2010. Agrobacterium-mediated genetic transformation of Cattleya with an Odontoglossum ringspot virus replicase gene sequence. Plant Biotechnol 27: 421-426.

Study on Agrobacterium-mediated transformation of Mokara orchidLy Nguyen Phuoc Diem, Duong Hoa Xo, Nguyen Xuan Dung

AbstractMokara spp. is currently one of the most important orchid genera in Vietnam and it is favorite as a cut flower orchid as well as a potted plant. Therefore, developing an efficient genetic transformation protocol for this orchid is essential for improving its qualities. This study focused on examining the influence of the concentration of acetosyringone on transformation efficiency and evaluating suitable concentration of anitibiotics for bacteria elimination after co-culture period and selection of putative transformants using disarmed Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 harbouring vector pCAMBIA1301. Other factors such as proliferation of PLBs from leaf explants and multiplication of PLBs were also studied using Murashige & Skoog (MS) media supplemented with different concentrations of plant growth hormones BA and NAA. The results showed that MS media supplemented with 0.5 mg/L BA and 2 mg/L NAA induced highest PLB proliferation rate (91.67%) from leaf explants after 15 weeks of culture. MS media supplemented with 0.5 mg/L BA and 1 mg/L NAA is suitable for PLB multiplication and the fresh weight of PLBs was 25.70 g after 8 weeks of culture. The transformation efficiency was defined as the number of PLBs expressing GUS by the total number of inoculated PLBs. And the highest efficiency was obtained when 50 µM acetosyringone was added to the bacterial suspension and co-culturing media with 2 days of the co-culture period. Concentration of cefotaxime from 300 mg/L to 500 mg/L was able to eliminate bacteria on PLB after co-culture period and hygromycin at 10 mg/L was effective for selection of putative transformants.Key words: Agrobacterium tumefaciens, transformation, orchid, Mokara, PLBs

Ngày nhận bài: 9/6/2017Người phản biện: TS. Trần Danh Sửu

Ngày phản biện: 13/6/2017Ngày duyệt đăng: 25/6/2017

14



I. ĐẶT VẤN ĐỀ Các nghiên cứu về đột biến do phóng xạ cho

thấy trong một giới hạn liều lượng, tần số các đột biến phụ thuộc tuyến tính vào liều lượng chiếu xạ (Vũ Như Ngọc, 2005). Để thu được đột biến mong muốn, người ta cần chiếu xạ ở liều lượng thích hợp để tạo ra nhiều đột biến cho chọn lọc mà không làm chết nhiều cây cũng như làm tăng độ bất thụ của chúng (Lê Xuân Đắc, 2008; Từ Bích Thủy, 1994). Đó là liều lượng tới hạn mà ở mức liều này, số lượng đột biến thu được nhiều nhất, thường được xác định trong khoảng gần liều LD50. Liều LD50 là liều mà khi hấp thụ, 50% số cá thể được xử lý bức xạ bị chết.

Theo công bố chính thức của FAO/IAEA (2012) đã có 3200 giống đột biến trên 214 loài thực vật khác nhau ở 60 quốc gia trên thế giới. Tỷ lệ cây đột biến được công bố nhiều nhất ở châu Á (hơn 60%), trong đó Trung Quốc chiếm hơn 25%. Chiếu xạ trên mô thực vật nuôi cấy in vitro giúp khắc phục được các đột biến ở thể khảm khi chiếu xạ hạt giống hoặc cây hoàn chỉnh. Tác giả Đào Thanh Bằng (2006) nghiên cứu chọn giống hoa cúc (Fuji white standard) bằng phương pháp chiếu xạ in vitro, thu được 4 loại đột biến khác nhau theo màu sắc và cánh hoa. Lê Văn Hòa (2006) đã ứng dụng công nghệ gây đột biến bằng colchicine và tia gamma trên các mầm phôi tái sinh từ các mô nuôi cấy trong ống nghiệm, nhằm tạo ra các dòng Dendrobium chất lượng cao. Arunee (2007) chiếu xạ tia gamma lên mẫu lá của cây violet, sau đó tái sinh lá được chiếu xạ ở điều kiện tự nhiên và thu được các dòng hoa violet mang biến dị về màu sắc, hình dạng, kích thước hoa, màu sắc lá và độ dày của lá. Lê Quang Luân (2009) đã xác định liều chiếu xạ LD50 của bức xạ gamma Co60 đối với mẫu cấy in vitro ở cây lan hài và địa lan là 20 - 30 Gy trên PLB cho biến dị nhiều nhất và đã chọn lọc khoảng 100

dòng biến dị tâp trung vào 5 dạng sau: Mất sắc tố Chlorophyll, lá ngắn, lá dài, nhiều lá, thay đổi màu bẹ lá (xanh sang tím). Nagatomi khi ứng dụng kỹ thuật chiếu xạ tia gamma đối với cây hoa cúc đã xác định được liều chiếu xạ là 100 Gy đối với ngưỡng gây chết 50% và 150 Gy đối với ngưỡng gây chết hoàn toàn. Số lượng hoa tỷ lệ nghịch với liều lượng chiếu xạ (Nagatomi, 2009).

Cây hoa chuông (Gloxinia speciosa) là một trong những loại hoa mới được du nhập vào Việt Nam trong những năm gần đây dùng để trang trí nội thất, văn phòng, khách sạn. Hoa chuông kép được nhiều người tiêu dùng ưa thích do có kích thước lớn, nhiều cánh, lâu tàn, bộ lá to và trải đều. Nghiên cứu “Tạo các dòng biến dị hoa chuông (Gloxinia speciosa) bằng tia gamma nguồn Cobalt 60” được tiến hành để chọn, tạo nhiều dòng hoa chuông biến dị có màu sắc đẹp, kiểu hoa mới lạ, hoa lâu tàn, đáp ứng nhu cầu sản xuất và tiêu thụ tại thành phố Hồ Chí Minh và các vùng lân cận.


2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Nguồn mẫu in vitroCắt đốt thân của cây hoa chuông màu đỏ, mép

cánh hoa có viền trắng. Tiến hành khử trùng đốt thân bằng dung dịch Javel theo tỷ lệ 1 Javen (0,5% Cloride): 3 nước, trong thời gian 7 phút. Sau đó cấy mẫu vào môi trường MS trong 2 - 3 tuần để mẫu nảy chồi. Chồi hình thành nhiều lá, cắt lá, gây tổn thương đặt trên môi trường MS bổ sung 1 mg/L NAA sau 2 tuần để tạo sẹo. Các mô sẹo được chuyển sang môi trường MS để ổn định 3-5 ngày, đảm bảo mẫu vô trùng rồi tiến hành chiếu xạ tia gamma nguồn Cobalt 60.

TẠO CÁC DÒNG BIẾN DỊ HOA CHUÔNG (Gloxinia speciosa) BẰNG TIA GAMMA NGUỒN COBALT 60

Nguyễn Hoàng Quân1, Dương Hoa Xô1

TÓM TẮTPhương pháp gây đột biến nhân tạo bằng bức xạ tia Gamma nguồn Cobalt 60 được thực hiện nhằm đa dạng hóa

màu sắc hoa, lá, kiểu hoa và dạng lá của cây hoa chuông. Kết quả nghiên cứu cho thấy: Liều chiếu xạ gây chết 50% lượng mẫu (LD50) được xác định đối với mô sẹo/chồi non in vitro là 97,2 Gy sau 1 tháng; 85 Gy sau 2 tháng, đã xuất hiện nhiều biến dị về màu sắc lá trong giai đoạn in vitro. Các dòng biến dị sau khi được chọn lọc in vitro, tiếp tục được theo dõi biến dị về kiểu hình hoa ở giai đoạn ex vitro. Kết quả đánh giá và sàng lọc ex vitro đã phát hiện 6 dòng biến dị có màu sắc và kiểu hình hoa khác biệt so với dòng đối chứng. Kết quả cho thấy cả 6 dòng biến dị đều có khả năng sinh trưởng khỏe, hoa, lá đẹp và thích nghi với điều kiện sản xuất.

Từ khóa: Hoa chuông, Gloxinia speciosa, Cobalt 60, chiếu xạ, biến dị

15


2.1.2. Môi trường nuôi cấy in vitroMôi trường nuôi cấy là môi trường MS

(Murashige, Skoog, 1962) bổ sung 25 g/l sucrose, 7,5 g/l agar, các chất điều sinh trưởng cytokinin (BA), auxin (NAA). Sau đó, hiệu chỉnh pH môi trường từ 5,7 đến 5,8.

2.1.3. Điều kiện nuôi cấy in vitroNhiệt độ phòng nuôi cấy ở 25 ± 20C, cường độ

ánh sáng: 2500 - 3000 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, độ ẩm của phòng nuôi cấy từ 75% đến 80%.

2.1.4. Điều kiện trồng ngoài vườn ươmCây con in vitro được trồng trên giá thể xơ dừa:

tro trấu (với tỷ lệ 1:1), trong điều kiện vườn ươm có hệ thống tưới nhỏ giọt với lượng nước tưới 100 ml/chậu/lần tưới. Chậu có đường kính 12 cm, mỗi chậu trồng một cây. Các chậu được đặt lên giàn và gắn hệ thống tưới nhỏ giọt, ngày tưới 1 - 2 lần. Giai đoạn cây con: Bón NPK 20-10-10, lượng bón 1 kg/1000 lít nước.


2.2.1. Xác định LD50 bằng nguồn chiếu xạ tia Gamma Cobalt 60 lên mô sẹo/ chồi non

Các mẫu mô sẹo/chồi nhỏ mới tái sinh từ mô sẹo được cấy chuyền vào đĩa petri, để ổn định 3 - 5 ngày sau đó tiến hành chiếu xạ tia gamma với các liều xạ khác nhau (30 Gy, 50 Gy, 70 Gy, 90 Gy, 110 Gy, 130 Gy, 150 Gy). Mỗi công thức liều xạ chiếu 350 mẫu. Mỗi liều xạ chiếu 3 lần. Theo dõi tỷ lệ sống chết của mẫu sau chiếu xạ 4 tuần, 8 tuần.

2.2.2. Chọn lọc và nhân dòng cá thể biến dị in vitro Các mẫu mô sẹo/chồi non sau khi chiếu xạ được

chuyển vào môi trường MS bổ sung 2 mg/L BA để

tái sinh cụm chồi. Sau 2 tháng, quan sát và chọn lọc các chồi biến dị kiểu hình lá và tiếp tục nhân nhanh tạo dòng biến dị trong phòng thí nghiệm.

2.2.3. Đánh giá kiểu hình cây hoa chuông biến dị ngoài vườn

Các dòng biến dị in vitro đã chọn lọc in vitro được nhân dòng, tái sinh, tạo cây hoàn chỉnh và chuyển ra vườn ươm. Mỗi dòng biến dị cho ra 500 cây để đánh giá ngoài vườn ươm. Cây con của dòng biến dị được chuyển ra vườn ươm chăm sóc, trồng vào chậu chứa giá thể xơ dừa: tro trấu (1:1). Giai đoạn từ nụ đến ra hoa: Tiếp tục duy trì lượng dinh dưỡng trên, đồng thời bổ sung thêm phân bón gốc NPK 30-10-10, lượng bón 1g/chậu. Sau khi trồng 65 ngày theo dõi kiểu hình hoa biến dị (Harrison, 1914).

2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiên từ 7/2015 đến 8/2016

tại khu nuôi cấy mô và khu nhà màng của Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh.


3.1. Xác định LD50 băng nguồn chiếu xạ tia Gamma Cobalt 60 lên mô sẹo/ chồi non của cây hoa chuông

Kết quả từ đồ thị 1 cho thấy, ở liều xạ 30 Gy không làm ảnh hưởng đến sức sống của mẫu, biểu hiện 100% mẫu sống sau 4 tuần và 8 tuần chiếu xạ. Tuy nhiên, tỷ lệ mẫu sống giảm dần khi liều xạ càng tăng lên, cụ thể: ở liều xạ 97,2 Gy và 85 Gy (dựa theo đồ thị ở hình 1 để xác định LD50) làm cho mẫu chết 50% sau 4 tuần và 8 tuần; ở mức 150 Gy hầu hết mẫu đều bị chết sau 8 tuần chiếu xạ.

Hình 1. Đồ thị biểu hiện tỷ lệ mẫu sống của giống hoa chuông đỏ viền trắng sau khi chiếu xạ Gamma

y = -0.005x + 0.986R2 = 0.827

4 tuần120%

100%

80%

60%

40%

20%

0%10 30 50 70 90 110 130 150

Liều xạ (Gy)

Tỷ

lệ m

ẫu số

ng (%

)

8 tuần120%

100%

80%

60%

40%

20%

0%10 30 50 70 90 110 130 150

Liều xạ (Gy)

Tỷ

lệ m

ẫu số

ng (%

)

y = -0.006x + 1.012R2 = 0.867

3.2. Chọn lọc và nhân dòng biến dị giai đoạn in vitroKhi áp dụng chiếu xạ lên mẫu mô sẹo, tần suất

của sự tái sinh chồi từ mô sẹo bị ảnh hưởng rõ rệt nhất, nhiều dạng biến dị hình thái được quan sát

ở thế hệ M1V2 với các đặc tính nghiên cứu (Zhen, 2001b). Đồng thời, số lượng chồi và sự biệt hóa tạo chồi từ mô sẹo ở tất cả liều xạ được sử dụng, việc cảm ứng tạo chồi giảm khi tăng liều xạ tác động

16


Bảng 1. Các cá thể biến dị ở giai đoạn in vitro của hoa chuông đỏ viền trắng

lên mẫu (Zhen, 2001a). Số liệu từ bảng 1 cho thấy, những mẫu hoa chuông qua chiếu xạ đều xuất hiện biến dị. Ở các liều xạ lân cận với LD50, số lượng các biến dị tái sinh xuất hiện nhiều hơn so với các liều xạ còn lại. Ở mẫu đối chứng, các chồi tái sinh không thấy xuất hiện biến dị trong quá trình nuôi cấy in vitro. Đặc biệt, mẫu biểu hiện biến dị mang kiểu hình lá xoăn lại cụp xuống có tần suất xuất hiện cao nhất đạt 7,7 0/00 và mẫu có biến dị mang kiểu hình bạch tạng chỉ xuất hiện 1,04 0/00. Dựa vào các biến dị về hình thái đã chọn lọc và nhân nhanh được 6 dòng thế hệ M1V2. Hình 2. Mẫu đĩa petri hoa chuông chiếu xạ ở 30 Gy

STT Liều xạ Số chồi hình thành Dạng biến dị ở lá Số cá thể

biến dịTần suất biến dị

(0/00)1 (ĐC) 850 0 0,000

2 30 Gy 930

Xanh nhạt 3 3,2Màu xanh pha hồng 0 0,000Xoăn lại, cụp xuống 3 3,2

Cuốn tròn 0 0,000Bạch tạng 0 0,000

3 50 Gy 950



4 70 Gy 810



5 90 Gy 760

Xanh nhạt 2 2,63Màu xanh pha hồng 6 7.9Xoăn lại, cụp xuống 7 9,21


6 110 Gy 550



7 130 Gy 450



8 150 Gy 350



17


Bảng 2. Đánh giá kiểu hình hoa của các dòng biến dị ex vitro của mẫu hoa chuông nghiên cứu

Bảng 3. Đánh giá về một số tiêu chí của hoa chuông biến dị

3.3. Khảo sát khả năng sinh trưởng, phát triển và phân lập các dạng biến dị của các cây hoa chuông ở điều kiện vườn ươm

Sau 60 - 65 ngày trồng, cây hoa chuông phát triển thành thục bắt đầu ra hoa đầu tiên. Giai đoạn này

cây có hình dạng và màu sắc của hoa, lá được biểu hiện rõ nhất. Từ đó, căn cứ vào những khác biệt so với cây đối chứng về kiểu hình hoa để chọn lọc các biến dị tốt.

Với cùng chế độ chăm sóc, lượng phân bón và thời gian chiếu sáng trong nhà màng. Sau thời gian 62 - 65 ngày, các cây hoa chuông bị chiếu xạ và cây đối chứng sẽ xuất hiện hoa nở. Các kiểu hình lá của cá thể biến dị không khác biệt so với đối chứng. Vì vậy, dựa màu sắc và kiểu hình hoa phân lập thành 3 nhóm chính để so sánh, chọn dòng hoa đáp ứng thị hiếu người chơi:

- Nhóm 1: Chủ yếu hoa có màu đỏ, mép cánh hoa có viền nhỏ màu trắng, màu trẳng khoảng 10% trong cánh hoa (Hình 3, B, C, D).

- Nhóm 2: Hoa có màu sắc đỏ và trắng pha trộn lẫn nhau (Hình 3, E, F, G, H).

- Nhóm 3: Màu đỏ tập trung ở phần gốc cánh hoa,

phần trên cánh hoa chủ yếu là màu trắng, chiếm gần 90% trên cánh hoa (hình 3, I, J, K, L).

Về kiểu cánh hoa: Dựa trên kiểu hình cánh hoa, cánh hoa phẳng giống mẫu đối chứng, cánh hoa cong và rũ xuống. Cánh hoa có mức độ cong khác nhau giữa các mẫu biến dị và khác biệt so với mẫu không chiếu xạ. Kiểu hình hoa màu đỏ nhạt, không đều giữa màu trắng và đỏ (G, H, I, J) có đường kính hoa thường nhỏ hơn đường kính hoa đối chứng. Kiểu hình hoa viền cánh nhúng và cong xuống (C) và kiểu hình cánh hoa giống hoa đối chứng (B, K, L) cây phát triển tốt, hoa lâu tàn hơn 2 ngày so với đối chứng. Kiểu hình hoa cánh ngoài cùng đốm xanh lá (E, F) có đường kính hoa nhỏ bằng 2/3 so với hoa đối chứng, hoa mau tàn hơn hoa đối chứng.

Các biểu hiện biến dị Số kiểu hình Kiểu hìnhHoa có màu đỏ nhiều hơn màu trắng, cánh hoa phẳng 2 B,CHoa có màu đỏ đậm, trắng rất ít, cánh hoa xoắn xuống 1 DHoa có màu trắng và đỏ xen lẫn, có điểm xanh 2 E, FHoa có màu trắng xen đều với màu đỏ 2 G,HHoa có màu trắng nhiều hơn màu đỏ, màu đỏ tập trung ở giữa 3 I,JHoa có màu trắng chiếm tỷ lệ cao hơn màu đỏ, cánh đứng 2 K,L

Kiểu hình Kiểu cánh hoa

Thời gian sinh trưởng

(ngày)

Thời gian ra hoa ( ngày)

Độ bền của hoa (ngày)

Đường kính hoa (cm)

Số nụ hoa

A Đối chứng 65 68 12 7,7 16B Giống đối chứng 65 67 14 7,6 15C Cong xuống 63 65 11 6,5 14D Cong xuống 64 66 12 6,4 15E Có đốm xanh lá 66 67 10 5,1 16F Có đốm xanh lá 65 68 9 5,2 15G Cong xuống 64 68 12 7,3 16H Cong xuống 64 68 12 7,2 18

I Cong xuống, cánh nhỏ, nhiều 66 68 10 7,0 18

J Cong xuống, cánh nhỏ, nhiều 66 69 11 7,1 17

K Giống đối chứng 65 68 14 7,8 17L Giống đối chứng 65 68 14 7,6 18

18


Dựa vào biến dị kiểu hình hoa, màu sắc cánh hoa, khả năng sinh trưởng của các dòng biến dị được trồng trong điều kiện nhà màng, các dòng này được đánh giá và chọn lọc lại 6 dòng chủ yếu (B, C, H, I , K, L). Các dòng này được khảo sát ý kiến của 100 người yêu thích hoa. Kết quả cho thấy, kiểu hình (K) có số người lựa chọn cao nhất là 25%, tuy nhiên kiểu hình hoa đối chứng vẫn được nhiều người ưa chuộng (21%); Ngoài ra, kiểu hình L cũng được nhiều lựa chọn là 17%.

Hình 4. Tỷ lệ phần trăm yêu thích các kiểu hình biến dị của hoa chuông đỏ viền trắng

IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận- Mô sẹo/chồi non hoa chuông đỏ viền trắng in

vitro sau khi bị chiếu xạ bởi tia gamma nguồn Co60 thì liều xạ gây chết 50% sau 1 tháng là 97,2 Gy; sau 2 tháng là 85 Gy.

- Nhiều kiểu hình biến dị in vitro xuất hiện ở các liều xạ khác nhau với tần suất khác nhau; trong đó kiểu hình lá xoăn lại, cụp xuống có tần suất cao nhất, cây sinh trưởng tốt ở điều kiện ống nghiệm, còn kiểu hình lá bạch tạng chỉ sống được một khoảng thời gian rồi chết dần.

- Đã đánh giá và chọn lọc được 6 dòng biến dị ngoài vườn sinh trưởng phát triển tốt, hoa lâu tàn, trong đó kiểu hình K phù hợp với thị hiếu của nhiều người chơi hoa. Các biến dị này có kiểu hình cánh hoa, màu sắc hoa khác biệt rất nhiều so với đối chứng, tỷ lệ gam màu đỏ và trắng thay đổi trong cánh hoa của các biến dị, đồng thời cánh hoa có kiểu hình cong, xoắn và cụp xuống.

Nhóm 1. Cánh hoa có màu đỏ chiếm tỷ lệ nhiều hơn màu trắng (A: đối chứng)

Nhóm 2. Màu đỏ và màu trắng lẫn vào nhau

Nhóm 3. Cánh hoa có màu trắng chiếm tỷ lệ cao hơn màu đỏHình 3. Các dạng biến dị kiểu hình hoa của giống chuông đỏ viền trắng

A

A21%17%

25%

12%

2%

13%

10.00%

B

C

H

I

K

L

19


4.2. Kiến nghị- Đánh giá về mặt kiểu gene giữa các dòng biến

dị bằng chỉ thị sinh học phân tử RAPD, SSR nhằm chọn tạo nguồn gene tốt phục vụ cho công tác lai tạo giống.

- Cần đánh giá và theo dõi các kiểu hình biến dị qua 3 - 4 lần nhân giống vô tính để đảm bảo kiểu hình hoa ổn định về mặt di truyền, không thay đổi qua các thế hệ; từ đó tiến hành công nhận giống hoa chuông mới được tạo ra bằng phương pháp chiếu xạ.

LỜI CẢM ƠNNhóm tác giả xin chân thành cảm ơn phòng

Thực nghiệm Cây trồng, Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện để thực hiện nghiên cứu này. Xin gởi lời tri ân đến Hội đồng Khoa học của Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh đã có những góp ý, định hướng để nghiên cứu này được thực hiện chính xác nhất. Đồng thời, cũng xin cảm ơn sự giúp đỡ chân thành và rất nhiệt tình của các bạn sinh viên Trường Đại học Tôn Đức Thắng để hoàn thành tốt các nghiệm thức thí nghiệm trong nghiên cứu này.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Đào Thanh Băng, Nguyễn Phương Đoài, 2006. Kết

quả chọn giống hoa cúc (Fuji white standard) bằng phương pháp chiếu xạ in vitro. Tuyển tập báo cáo Hội nghị Khoa học và công nghệ Hạt nhân toàn quốc lần thứ VI. NXB khoa học và kỹ thuật: 247- 252.

Lê Xuân Đắc, 2008. Nghiên cứu ứng dụng biện pháp công nghệ sinh học nhằm khắc phục nhược điểm sinh lý cao cây và cảm quang của giống lúa tám. Luận án tiến sĩ sinh học. Viện Công nghệ Sinh học. Hà Nội.

Lê Văn Hòa, 2006. Xác định khả năng gây đột biến giống hoa lan cắt cành (Dendrobium sp.) bằng colchicine

và tia gamma. Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng - Trường Đại học Cần Thơ.

Lê Quang Luân và cộng sự, 2009. Nghiên cứu tạo dòng hoa địa lan (Cymbidium) và lan hài vệ nữ (Paphiopedilum) bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp kỹ thuật nhân giống in vitro. Trung tâm hạt nhân TP. Hồ Chí Minh.

Vũ Như Ngọc, 2005. Ứng dụng kỹ thuật hạt nhân trong sinh học và nông nghiệp. Nhà xuất bản Nông nghiệp: 159-174.

Từ Bích Thủy, 1994. Chọn tạo giống đậu nành bằng phương pháp xử lý phóng xạ. Luận án phó tiến sĩ khoa học nông nghiệp. Đại học Nông lâm TP. HCM.

Arunee Wongpiyasatid, Tanita Thinnok, Thanya Taychasinpitak, Peeranuch Jompuk, Katarat Chusreeaeom and Siranut Lamseejan, 2007. Effects of Acute Gamma Irradiation on Adventitious Plantlet Regeneration and Mutation from Leaf Cuttings of African Violet (Saintpaulia ionantha). Kasetsart J. (Nat. Sci.) 41: 633- 640.

Harrison H.C., 1914. How to grow tuberous-rooted begonias & Gloxinias.(ed) Cooperative Extension Publication.

Murashige T., Skoog F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol.plant: 473-497.

Nagatomi S., Degi K., 2009. Mutation Breeding of Chrysanthemum by Gamma Field Irradiation and In vitro Culture, Induced Plant Mutations in the Genomics Era. Food and Agriculture Organization of the United Nations. Rome, 258-261.

Zhen H. R., 2001a. In vitro technique for selection of radiation induced mutants of garlic. Shanghai Academy of Agricultural Sciences.

Zhen H. R., 2001b. In vitro technique for selection of radiation induced mutants of sweet potato. Shanghai Academy of Agricultural Sciences.

Creating mutation lines of bell flower (Gloxinia spesiosa) by Cobalt-60 gamma ray radiation

Nguyen Hoang Quan, Duong Hoa XoAbstractThe application of artificial mutation method by using Cobalt-60 gamma ray radiation was performed to diversify the color of flowers, leaves, flower and leaf style of the bell flower. The results showed that irradiation lethal dose to 50% of samples (LD50) which was determined to callus/ immature buds in vitro at 97.2 Gy after one month; 85 Gy after 2 months, appearing much variation in leafy color in vitro stage. The variable lines were selected in vitro and were continuously observed the flower phenotype ex vitro stage. Screening and evaluating results ex vitro showed that 6 variable lines had different colour and flower phenotype from that of the control line. Initial results indicated that 6 variable lines had strong growth, beautiful flowers, leaves and were suitable to production condition.Key words: Bell Flower, Gloxinia speciosa, Cobalt-60, irradiation, variation

Ngày nhận bài: 10/6/2017Người phản biện: PGS.TS. Nguyễn Thị Kim Lý


20


I. ĐẶT VẤN ĐỀCây hoa huệ (Polianthes tuberosa) là một trong

những loại hoa cắt cành phổ biến và có giá trị kinh tế cao. Có hai giống hoa huệ được canh tác phổ biến là giống hoa huệ đơn và giống hoa huệ kép. Hoa huệ kép thường được sử dụng để cắt cành vì phát hoa dài và hoa lâu tàn, giống huệ đơn ngoài mục đích làm hoa cắt cành còn được sử dụng để ly trích tinh dầu và có giá trị cao trong công nghiệp nước hoa, mỹ phẩm và dược phẩm (Rodrigo et al., 2012; Jitendriya và Mohammad, 2013). Hiện nay, chỉ có hai giống hoa huệ với một tràng hoa gồm 6 cánh hoặc với hai tràng hoa gồm 12 cánh được canh tác phổ biến ở Đồng bằng sông Cửu Long. Trong quá trình chọn tạo giống hoa huệ bằng xử lý đột biến tia gamma kết hợp kỹ thuật nuôi cấy mô đã chọn được hai dòng hoa huệ đột biến với số lượng cánh hoa trung bình khoảng 22 cánh và 36 cánh với kích thước hoa to và có mùi thơm (Đào Thị Tuyết Thanh, Nguyễn Bảo Toàn, 2014; Đào Thị Tuyết Thanh và ctv., 2017). Đây là hai dòng hoa có tiềm năng có thể đưa vào sản xuất. Kiểu hình về dạng hoa và số lượng cánh hoa khác nhau là thông tin hữu ích để nghiên cứu nhận dạng bằng chỉ thị phân tử, nhằm xác định sự khác biệt về kiểu gen của các dòng hoa huệ đột biến so với giống đối chứng. Kỹ thuật thường được sử dụng là phân tích ISSR (Kỹ thuật chuỗi lặp lại đơn giản giữa - Inter Simple Sequence Repeat) (Khandagale, 2014; Bharti et al., 2012; Kameswari et al., 2014). Nghiên cứu này được thực hiện để xác định sự khác biệt về

mặt di truyền của ADN hai giống huệ địa phương với các dòng hoa huệ đột biến.


2.1. Vật liệu nghiên cứuMẫu lá của hai giống hoa huệ đối chứng từ An

Giang và hai dòng hoa huệ đột biến (Hình 1). Hai dòng hoa huệ đột biến có 22 và 36 cánh được hình thành từ nuôi cấy mô kết hợp với xử lý đột biến bằng tia gamma 60Co ở liều chiếu xạ 20 Gy với suất liều 1,58 kGy/giờ .

2.2. Phương pháp nghiên cứuĐánh giá sự đa dạng di truyền bằng phương pháp

đánh dấu phân tử ISSR – PCR.- Quy trình tách chiết ADN tổng số: Mẫu lá của

từng giống được thu thập riêng rẽ và tách chiết AND theo mô tả bởi Rogers và Bendich (1988) có thay đổi nhỏ, sử dụng 2% dung dịch trích đệm CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) (Trần Nhân Dũng, 2011).

- Công thức của mỗi phản ứng PCR gồm: H2O: 16,25 µl; Buffer: 2,5 µl; dNTPS: 2 µl; mồi ngược và xuôi: 1 µl; Taq: 0,25 µl; 3 µl ADN mẫu. Tổng cộng: 25 µl/phản ứng.

- Sử dụng 14 mồi ISSR (Mengli et al., 2012; Khandagale et al., 2014) được Công ty TNHH Sinh Hóa Phù Sa (Phusa Biochem) sản xuất và cung cấp (Bảng 1).

1 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ 2 Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ

SỬ DỤNG CHỈ THỊ ISSR TRONG VIỆC ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÒNG/GIỐNG HOA HUỆ (Polianthes tuberosa L.) NUÔI CẤY MÔ

DO XỬ LÝ ĐỘT BIẾN BẰNG TIA GAMMAĐào Thị Tuyết Thanh1, Nguyễn Bảo Toàn2

TÓM TẮTNghiên cứu sử dụng 14 mồi ISSR để đánh giá mức độ đa dạng di truyền của giống hoa huệ đơn, kép và hai dòng

đột biến có 22 và 36 cánh hoa được tạo ra từ giống gốc 12 cánh do xử lý đột biến in vitro bằng tia gamma. Kết quả cho thấy 4 mồi có thể sử dụng để đánh giá sự đa dạng của các dòng/giống hoa, cho tổng số là 84 băng với trung bình 21,0 ± 5,89 băng/mồi. Trong đó có 100% băng đa hình, với số lượng dao động từ 13 đến 27 băng và có kích thước trong khoảng 150 - 3000 bp. Đặc biệt hai dòng hoa huệ đột biến có sự xuất hiện băng mới hoặc mất băng ADN so với giống gốc. Cây phân loại dựa trên hệ số tương đồng cho thấy hệ số này dao động trong khoảng 0,375 - 0,786. Trong đó, giống hoa huệ gốc 12 cánh và dòng hoa huệ đột biến 22 cánh có sự khác biệt nhau về khoảng cách di truyền, giống hoa 6 cánh và dòng đột biến 36 cánh thể hiện mối quan hệ di truyền gần nhau nhất. Kết quả này là thông tin hữu ích, tạo tiền đề cho việc chọn tạo giống hoa huệ.

Từ khóa: Cánh hoa, ADN, đột biến, gamma, hoa huệ, ISSR, tương đồng

21


- Chạy PCR: Các phản ứng PCR được thực hiện theo chu trình nhiệt: 920C (5 phút), 920C (1 phút), 350C (30 giây), 720C (1 phút) và kết thúc ở 720C (5 phút). Thực hiện 45 chu kỳ và trữ ở 40C. Kết quả sản phẩm phản ứng PCR được kiểm tra trên gel agarose 1,5%.

- Các đoạn ADN khuếch đại là đa hình sẽ được ghi nhận và xác định vị trí các băng ADN xuất hiện mới hoặc mất đi (tính bằng bp) của 2 dòng huệ đột biến so với đối chứng (giống hoa huệ 12 cánh).

Bảng 1. Thông tin về các mồi ISSR sử dụng cho đánh giá đa dạng di truyền các dòng hoa huệ đột biếnSTT Tên mồi Trình tự (5’ - 3’) STT Tên mồi Trình tự (5’ - 3’)

1 3A01 (GA)8TC 8 808 (AG)8C

2 3A07 (AG)7CTT 9 836 (AG)8YA

3 3A21 (TG)7ACC 10 840 (AG)8YT

4 3A39 (CA)7GTA 11 842 (AG)8YG

5 3A42 (GACA)4C 12 855 (AC)8YT

6 3A62 (TG)7ACT 13 857 (AC)8YG

7 UBC873 GACAGACAGACAGACA 14 P23SR1 GGCTGCTTCTAAGCCAAC

Hình 1. Các giống hoa huệ địa phương và dòng hoa huệ đột biếnGhi chú: a) Giống hoa có 6 cánh; b) giống hoa có 12 cánh; c) dòng hoa đột biến 22 cánh; d) dòng hoa đột biến có 36 cánh.

a

c

b

d

22


2.3. Phương pháp xử lý số liệuSố liệu ISSR được ghi nhận dựa vào thang chuẩn

100 bp sự có mặt hoặc không có mặt của một băng nào đó trên gel sẽ được ghi nhận là 1 và 0 cho mỗi cá thể. Sau khi ghi nhận tất cả các băng trên mỗi mẫu cây, số liệu thu thập được lưu trữ trong phần mềm Excel. Đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các giống cũng dựa trên ma trận hệ số tương đồng (Similarity coefficient) và phân tích sơ đồ hình nhánh (Cluster) bằng phần mềm NTSYSpc v2.1 (Rohlf, 2000).


3.1. Kết quả phân tích sự đa hình chỉ thị ISSR sử dụng trong đánh giá đa dạng di truyền các dòng/giống hoa huệ nghiên cứu

Trong nghiên cứu này đã sử dụng 14 mồi ISSR để đánh giá mức độ đa dạng di truyền của các dòng/giống hoa huệ. Kết quả thu được 4 mồi có khuếch đại rõ và cho tổng số là 84 phân đoạn được nhân lên với trung bình 21,0±5,89 băng/đoạn mồi. Trong đó có 84 phân đoạn đa hình chiếm tỷ lệ 100%. Số lượng băng đa hình dao động từ 13 (đoạn mồi 808) đến 27 băng (đoạn mồi 3A39). Kích thước các mồi dao động trong khoảng 150 - 3.000 bp (Bảng 2).

Theo nghiên cứu của Khandagale et al., (2014), việc khuếch đại ADN của 10 giống hoa huệ được thực hiện với 20 mồi ISSR. Trong số 132 băng được khuếch đại, 95 là đa hình, chiếm (73,53%) và phần trăm đa hình là 100% (mồi UBC - 829, 852, 850) đến 33,3% (UBC - 817); kích thước từ 250 bp đến 2.300 bp.

Bảng 2. Sự đa hình của chỉ thị ISSR ở các dòng/giống hoa huệ nghiên cứu

Mồi Tổng số băng

Băng đa hình

Tỉ lệ đa hình

(%)

Kích thước mồi

(bp)UBC873 23 23 100 250 - 3.000P23SR1 21 21 100 150 - 3.0003A39 27 27 100 400 - 1.500808 13 13 100 700 - 1.500Tổng 84 84Trung bình±SD 21,0±5,89 21,0±5,89 100

3.2. Đánh giá đa dạng di truyền của các dòng/giống hoa huệ nghiên cứu bằng sự khác biệt vị trí các băng ADN

Ở hoa ly (Lilium longiflorum) và cà chua (Solanum lycopersicum), dấu phân tử ISSR đã được dùng để

đánh giá các dòng đột biến sau khi xử lý đột biến băng tia gamma hoặc với chất gây đột biến EMS (Mengli et al., 2012; Aswandy et al., 2015). Trong nghiên cứu này, phân tích ISSR với mồi UBC 873 cho sản phẩm khuếch đại 23 băng ADN có kích thước phân tử trong khoảng 200 đến 3.000 bp (Hình 2). Các mẫu phân tích đều thể hiện sự đa hình nhiều hơn các mồi còn lại. Trong đó, dễ dàng nhận ra sự khác nhau giữa hai cây hoa huệ 6 cánh và 12 cánh (giếng 1 và 4) với 2 dòng hoa huệ đột biến (giếng 2 và 3). Cây hoa huệ đột biến với 22 cánh xuất hiện thêm băng ADN ở hai vị trí 250 bp và 1.000 bp, trong khi đó băng ADN mất đi ở vị trí 300; 350; 850; 1.250 và 3.000 bp so với giống hoa huệ gốc có 12 cánh. Đối với dòng hoa huệ đột biến có 36 cánh, băng ADN bị mất đi ở vị trí 300; 350; 850 và 1.250 bp còn ở các vị trí 1.000 và 2.750 bp lại xuất hiện băng ADN mới so với giống gốc. Trong khi đó, với mồi P23SR1, sự xuất hiện các băng ADN mới ở cả hai dòng hoa huệ đột biến ở các vị trí 500; 600; 800; 1.750 và 2.000 bp so với giống gốc. Đồng thời 2 dòng đột biến này cũng có vị trí các băng ADN khác biệt nhau nên có thể phân biệt với nhau. Hai mồi 3A39 và 808 cho sản phẩm khuếch đại cũng có sự xuất hiện mới và mất đi băng ADN nhưng với số lượng ít hơn chỉ với 1 băng khác biệt so với giống đối chứng.

Hình 2. Ảnh điện di của các mồi ISSR đối với các dòng/giống hoa huệ nghiên cứu

Ghi chú: a) Mồi UBC 873; b) mồi P23SR1; c) Mồi 3A39; d) Mồi 808. 1: giống hoa huệ đơn 6 cánh, 2: dòng hoa huệ 22 cánh, 3: dòng hoa huệ 36 cánh, 4: giống hoa huệ kép 12 cánh, M: Thang chuẩn 100 bp; : băng ADN mới, : băng ADN mất đi

23


3.3. Kết quả về mối quan hệ di truyền giữa các dòng/giống hoa huệ nghiên cứu

Kết quả hệ số tương đồng di truyền về kiểu gen của các dòng/giống hoa huệ nghiên cứu, dựa trên cơ sở phân tích 4 mồi ISSR đa hình được trình bày ở bảng 3. Hệ số này biến thiên trong khoảng 0,375 đến 0,786. Trong những kiểu gen nghiên cứu, chỉ số

tương đồng thấp nhất là 0,375 được ghi nhận giữa giống hoa huệ gốc 12 cánh và dòng hoa huệ đột biến có 22 cánh. Vì vậy hai dòng/giống này thể hiện sự khác biệt lớn về mặt di truyền. Kiểu gen hoa có 6 cánh và dòng đột biến có 36 cánh cho thấy có mối quan hệ di truyền gần nhau vì có chỉ số tương đồng cao nhất (0,786).

Sơ đồ nhánh dựa trên sự phân tích đa hình các mồi ISSR đã chia 4 kiểu gen hoa huệ thành hai nhóm chính với chỉ số tương đồng 0,43% (Hình 3). Nhóm thứ nhất gồm 3 kiểu gen với hoa 6; 22 và 36 cánh. Nhóm thứ hai chỉ có giống có hoa 12 cánh. Điều này cho thấy, mặc dù hai dòng hoa huệ đột biến phát sinh từ việc xử lý đột biến giống hoa huệ gốc có 12 cánh nhưng lại có mối quan hệ di truyền gần gũi với giống hoa huệ 6 cánh hơn. Kết quả này cũng tương

tự như nghiên cứu của Kameswari et al. (2014) về phân tích đa dạng di truyền ở 7 kiểu gen gồm các giống hoa huệ đơn và kép ở Ấn Độ cho kết quả 62 băng, 53 băng là đa hình chiếm 85,48%. Sơ đồ nhánh cũng chia các giống hoa huệ thành hai nhóm chính trong đó có giống hoa huệ đơn và giống hoa huệ kép cùng thuộc một nhóm với hệ số tương đồng cao nhất khoảng 0,706.

Bảng 3. Hệ số tương đồng di truyền của các dòng/giống hoa huệ nghiên cứu với 4 cặp mồi ISSR

Hình 3. Sơ đồ hình nhánh về mối quan hệ di truyền giữa các kiểu gen hoa huệ dựa trên dữ liệu ISSR

Giống hoa Giống hoa có 6 cánh

Dòng đột biến có 22 cánh


Giống hoa có 12 cánh

Giống hoa có 6 cánh 1,000Dòng đột biến có 22 cánh 0,643 1,000Dòng đột biến có 36 cánh 0,786 0,571 1,000Giống hoa có 12 cánh 0,429 0,375 0,500 1,000

IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1. Kết luậnTrong nghiên cứu này, 4 chỉ thị ISSR gồm UBC

873, P23SR1, 3A39 và 808 có thể sử dụng để đánh giá mối quan hệ giữa các dòng/giống hoa huệ đột biến. Sự đa dạng được thể hiện các giống hoa huệ cấy mô được xử lý đột biến cho kết quả 100% băng ADN đa hình. Đồng thời có sự khác biệt về vị trí xuất hiện băng ADN giữa hai giống đối chứng với nhau và giữa hai dòng hoa huệ đột biến với giống gốc có 12 cánh. Phân tích hệ số tương đồng và sơ đồ nhánh cho thấy có thể chia 4 kiểu gen hoa huệ thành

2 nhóm và kiểu gen của 2 dòng hoa huệ đột biến lại có mối quan hệ di truyền khác biệt nhau so với giống gốc. Kết quả cho thấy đây là phương pháp rà soát đột biến giai đoạn đầu rất hiệu quả để xác định giống mới.

4.2. Đề nghịTiếp tục theo dõi đặc điểm nông học của giống

hoa huệ đột biến mới để để đánh giá tính ổn định giống về tính trạng đột biến ở số lượng cánh hoa đi kèm với đặc điểm hoa to hơn và phát hoa dài. Sau đó, nhân nhanh số lượng cây để ứng dụng cho sản xuất và thương mại.

0.43 0.52 0.61 0.70 0.79





Coefficient

24


TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Nhân Dũng, 2011. Sổ tay thực hành sinh học phân

tử. Nhà xuất bản Đại học Cần Thơ, 169 trang.Nguyễn Thị Thanh Nga và Đinh Đoàn Long, 2012.

Đánh giá đa dạng di truyền một số loài cây dược liệu Việt Nam thuộc chi Đảng Sâm (Codonopsis sp.) bằng kỹ thuật AND mã vạch. Luận văn Thạc sỹ ngành Di truyền học. Trường Đại học Khoa học Tự nhiên.

Đào Thị Tuyết Thanh và Nguyễn Bảo Toàn, 2016. Hiệu quả của liều lượng tia gamma 60Co trên sự sinh trưởng của cụm chồi hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) in vitro, sự xuất hiện các cấu trúc bất thường và xác định LD50. Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ. Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản và Công nghệ Sinh học, 45: 25-32.

Đào Thị Tuyết Thanh, Lê Thị Ngọc Quý và Nguyễn Bảo Toàn, 2017. Nghiên cứu đa dạng về sinh trưởng và dạng hoa của các dòng huệ đơn cánh (Polianthes tuberosa L.) nuôi cấy mô được xử lý bằng tia gamma 60Co. Tạp chí Khoa học Công Nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 2(75): 47-52.

Bharti, H., K.P. Singh, R. Singh, R. Kumar and M.C. Singh, 2012. Genetic diversity and relationship study of single and double petal tuberose (Polianthes tuberosa L.) cultivars based on RAPD and ISSR markers. Indian J. Hort, 73(2): 238-244.

Jitendriya P. and S. L. S. Mohammad, 2013. In vitro propagation of Polianthes tuberosa L. cultivars

(Calcutta single). International journal of plant, animal and enviromental sciences, 3(3): 76-79.

Kameswari, P.L., A. Girwani and K. RadhaRani, 2014. Genetic diversity in tuberose (Polianthes tuberose L.) using morphological and ISSR markers. Electronic Journal of Plant Breeding, 5(1): 52-57.

Khandagale K., B. Padmakar, D.C.L. Reddy, A. Sane and C. Aswath, 2014. Genetic diversity analysis and barcoding in tuberose (Polianthes tuberosa L.) cultivars using RAPD and ISSR markers. Journal of Horticultural Sciences, 9(1): 5-11.

Mengli, X., L. Sun, S. Qui J. Liu, J. Xu and J. Shi., 2012. In vitro mutagenesis and identification of mutans via ISSR in lily (Lilium longiflorum). Plant Cell Reports, 31: 1043-1051.

Rodrigo B. G., M. R. D. José, C. C. S. Ma, R. Aaron, M. V. T. Jaap and T. C. Ernesto, 2012. Mexican Geophytes I. The Genus Polianthes. Floriculture and Ornamental Biotechnology. Global Science Books, 6(1): 122-128.

Rogers, S.O. and A.J.B. Bendich, 1988. Extraction of DNA from plant tissues. Plant molecular Biology Manual. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Belgium, 4(6): 1-10.

Rohlf, F.J., 2000. NTSYS-pc: Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System. Version 2.1 Exceter Software, New York, USA.

Study on genetic diversity of tissue cultured tuberose lines (Polianthes tuberosa) irradiating with Co60 by using ISSR marker

Dao Thi Tuyet Thanh, Nguyen Bao ToanIn this study, 14 ISSR primers were used to evaluate the genetic diversity of single and double - flower petal of tuberose varieties and two mutant lines with 22 and 36 petals that were irradiated by gamma from original variety with 12 petals. The results showed that four among 14 primers could be use for evaluation of tuberose line genetic diversity. A total of 84 amplified bands were polymorphic with an average of 21.0 ± 5.89 bands per primer. The polymorphism ratio was 100%, the number of scorable bands ranged from 13 - 27 bands and band size was varied from 150 - 3.000 bp. In particular, there were some new bands or absent bands in both mutation lines. The phylogenic tree based on genetic similarity varied from 0.375 - 0.786. The results indicated that a pair of cultivars 12 flower petals and 22 flower petals showed the highest genetic diversity. A pair of cultivars with 6 flower petals and mutant line with 36 flower petals showed most genetic similarity. Our results can provide the useful information for further research on tuberose breeding.Key words: DNA, gamma, ISSR, mutation, petal, similarity, tuberose

Ngày nhận bài: 15/6/2017Người phản biện: TS. Vũ Thị Thu Hiền


25


I. ĐẶT VẤN ĐỀLan đuôi chồn [Rhynchostylis retusa (L.) Blume]

là loài lan rừng, có hoa rất đẹp và hương thơm được thị trường trong nước, cũng như quốc tế ưa chuộng nên có giá trị kinh tế cao. Rất nhiều loài lan thuộc chi Rhynchostylis có giá trị thương mại quan trọng trong ngành công nghiệp hoa trồng chậu. Lan R. retusa thường được tìm thấy trong các khu rừng có độ cao 1200 m so với mực nước biển, phân bố chủ yếu ở Việt Nam, Lào, Campuchia, Indonesia, Malaysia, Thái Lan, Nepal, Philipin, Singapore, Sri Lanka, Bangladesh, Benin, Miến Điện, Trung Quốc và Ấn Độ (Chowdhury et al., 2014). Ngoài giá trị làm cảnh, loài lan R. retusa còn có giá trị dược liệu rất lớn; toàn bộ các bộ phận của cây được sử dụng để làm thuốc điều trị bệnh thấp khớp, lao phổi, động kinh, rối loạn kinh, bệnh gút, hen và bệnh ngoài da (Shanavaskhan et al., 2012; Das et al., 2012). Rễ được sử dụng để chữa bệnh sốt rét (Tiwari et al., 2012, Radhika et al., 2013). Hoa khô được sử dụng làm thuốc chống côn trùng và để gây nôn (Subedi et al., 2013). Dịch chiết từ các bộ phận của loài lan này cho thấy có tính kháng khuẩn mạnh đối với Bacillus subtilis và Escherichia coli (Hossain, 2011).

Do có giá trị lớn nên loài lan rừng R. retusa ở Việt Nam đang bị khai thác một cách quá mức, có nguy cơ cạn kiệt trong rừng tự nhiên. Vì vậy, việc nghiên cứu một quy trình nhân nhanh giống, có khả năng đáp ứng nguồn cấy giống cho mục đích thương mai hiện nay là cần thiết. Phương pháp nhân giống in vitro không những góp phần bảo tồn hữu hiệu nguồn gen, mà còn góp phần phát triển thương mại loài hoa lan quý này hiệu quả. Nghiên cứu nhân giống loài lan R. retusa từ vật liệu là phôi hạt non, đoạn

nốt đỉnh thân thông qua tạo mô sẹo, protocorm, tái sinh chồi cũng đã được một vài công trình báo cáo (Pinaki and Miskat, 2012; Parab and Krishnan, 2012; Bakul and Shahinul, 2015). Tuy nhiên, các báo cáo cho thấy nhân giống của loài lan R. retusa có xuất xứ từ các quốc gia khác nhau (kiểu gen khác nhau) thì hiệu suất nhân giống khác nhau. Do đó, đối với mỗi giống cần xác định được quy trình nhân giống phù hợp mới đem lại hiệu quả.Trong công trình này, thông báo kết quả nghiên cứu nhân nhanh giống thành công cho loài Lan đuôi chồn Việt Nam bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, đạt hiệu suất cao.


2.1. Vật liệu nghiên cứuVật liệu nghiên cứu là hạt non từ quả chín sinh lý

của cây lan rừng (cây không bị sâu bệnh, kiểu dáng hoa đẹp, có hương thơm) thuộc loài Lan đuôi chồn (R. retusa) trồng tại Vườn lan rừng của Trung tâm Phát triển Lâm nghiệp Hà Nội.

Môi trường dinh dưỡng khoáng cơ bản Knops, (Knops,1865).

2.2. Phương pháp nghiên cứu- Tạo mẫu sạch in vitro: Quả lan được rửa sạch

bằng nước máy, ngâm mẫu trong nước xà phòng loãng 10 phút và rửa sạch xà phòng. Sau đó, mẫu được cho vào các bình nút vặn và đưa vào tủ cấy vô trùng; khử trùng bề mặt bằng dung dịch cồn 70% trong 1 phút; tiếp theo khử trùng mẫu bằng dung dịch 0,1% HgCl2 trong 8 phút, tráng lại bằng nước cất vô trùng (3 lần) và thấm khô bằng giấy thấm. Quả lan sau khi khử trùng được cắt dọc quả bằng lưỡi dao, tách lấy hạt non và cấy lên môi trường

1 Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Đại học Lâm nghiệp

NHÂN GIỐNG CÂY LAN ĐUÔI CHỒN [Rhynchostylis retusa (L.) Blume] BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ

Bùi Văn Thắng1, Nguyễn Thị Hồng Gấm1

TÓM TẮTMột quy trình nhân nhanh giống Lan đuôi chồn bằng kỹ thuật nuôi cấy mô đã được nghiên cứu thành công, với

hệ số nhân giống cao: Hạt non từ quả lan chín sinh lý được nuôi trên môi trường Knops + 100 ml/l dịch chiết khoai tây (PH), 100 ml/l nước dừa (CW) và 20 g/l sucrose, cho tỷ lệ hạt nảy mầm 95% sau 6 tuần nuôi cấy. Nhân nhanh protocorm trên môi trường Knops + 0,5 mg/l BAP, 0,5 mg/l NAA, 0,3 mg/l Kinetin, 100 ml/l PH, 100 ml/l CW và 30 g/l sucrose, cho hệ số nhân 16,09 lần/chu kỳ nhân sau 5 tuần nuôi cấy. Môi trường Knops + 0,5 mg/l BAP, 0,3 mg/l NAA, 0,3 mg/l GA3, 100 ml/l PH, 100 ml/l CW và 30 g/l sucrose, cho tỷ lệ protocorm tái sinh chồi 97,55% và 8,82 chồi/cụm sau 6 tuần nuôi cấy. Nuôi cấy chồi trên môi trường Knops + 0,3 mg/l IBA, 100 ml/l PH và 20 g/l sucrose, cho tỷ lệ chồi ra rễ 100% và 6,5 rễ/chồi sau 4 tuần nuôi cấy. Cây con hoàn chỉnh được trồng trên giá thể dớn khô và xơ dừa (1:1), cho tỷ lệ sống 90% sau 8 tuần ra ngôi. Quy trình này có thể áp dụng để sản xuất một lượng lớn cây giống chất lượng tốt đáp ứng nhu cầu thương mại.

Từ khóa: Lan đuôi chồn, nhân giống, nuôi cấy in vitro, thể chồi

26


khoáng Knops + 100 ml/l (tương ứng 100 g/l) dịch chiết khoai tây (PH) + 100 ml/l nước dừa (CW) + 20 g/l sucrose, nuôi trong 6 tuần để phôi hạt nảy mầm tạo thể chồi (protocorm).

- Nhân nhanh protocorm: Cụm protocorm được cấy lên môi trường khoáng cơ bản Knops + (0,2 – 1,0 mg/l) BAP + (0,2 – 0,5 mg/l) NAA + (0,2 – 0,5 mg/l) Kinetin + 100 ml/l PH + 100 ml/l CW + 30 g/l sucrose (Bảng 1); nuôi trong 5 tuần dưới ánh sáng giàn đèn để khảo sát khả năng nhân nhanh protocorm. Thí nghiệm: 2 g protocorm/bình tam giác 250 ml.

- Tái sinh chồi từ protocorm: Các cụm protocorm cấy lên môi trường tái sinh chồi, môi trường Knops + (0,3 – 1,0 mg/l) BAP + ( 0,3 – 0,5 mg/l) NAA + (0,1 – 0,5 mg/l) GA3 + 100 ml/l PH + 100 ml/l CW + 30 g/l sucrose (bảng 2); nuôi trong 6 tuần dưới ánh sáng giàn đèn để protocorm tái sinh chồi. Thí nghiệm: 5 cụm protocorm/bình tam giác 250 ml.

- Tạo cây hoàn chỉnh: Dùng mũi dao tách các chồi hữu hiệu có chiều cao ≥ 2,0 cm và cấy chuyển lên môi trường kích thích chồi ra rễ tạo cây hoàn chỉnh, môi trường Knops + (0,1 - 0,3 mg/l) IBA và (0,1 và 0,2 mg/l) NAA + 100 ml/l PH + 20 g/l sucrose (bảng 3). Các bình chồi được nuôi 4 tuần dưới ánh sáng giàn đèn, chồi ra rễ tạo cây con hoàn chỉnh.

- Huấn luyện và ra ngôi: Các bình cây con ra rễ in vitro được đưa ra nhà huấn luyện cây mô trong thời gian 5 ngày để cây thích nghi dần với điều kiện tự nhiên. Sau thời gian huấn luyện cây con cứng cáp lấy ra khỏi bình và rửa bộ rễ loại bỏ thạch bằng nước máy (rửa nhẹ nhàng tránh làm gãy rễ, dập thân). Sau đó, cây con được cấy vào giá thể dớn khô và xơ dừa (tỷ lệ 1 :1), cây được che chắn ánh sáng chiếu trực xạ bằng lưới đen, ngày tưới nước bằng cách phun sương 2 - 4 lần, đảm bảo độ ẩm ≥ 95%.

Tất cả các môi trường nuôi cấy được bổ sung thêm 7 g/l agar chuẩn độ đến pH = 5,8; khử trùng ở 121oC trong 20 phút. Điều kiện phòng nuôi cấy: nhiệt độ phòng nuôi 25 ± 20C, cường độ ánh sáng dàn đèn 35 μEm−2 s−1, thời gian chiếu sáng 14 h/ngày.

- Phương pháp thu thập và xử lý số liệu: Mỗi thí nghiệm trên thực hiện ít nhất với 30 mẫu và 3 lần lặp lại; số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS (version 16.0) và phương pháp Duncan’s test (Duncan, 1995) với mức sai khác có ý nghĩa P = 0,05.

2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Thời gian nghiên cứu từ tháng 6 năm 2015 đến

6 năm 2017.- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Công

nghệ nuôi cây mô tế bào và khu nhà lưới ra cây mô của Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Đại học Lâm nghiệp.


3.1. Hạt nảy mầm và nhân nhanh thể chồi (protocorm)

Hạt của các loài hoa lan không có nội nhũ chứa chất dinh dưỡng cho quá trình nảy mầm nên ở ngoài môi trường tự nhiên, hầu hết hạt không thể nảy mầm thành cây. Nhu cầu dinh dưỡng cho hạt lan nảy mầm được cho là rất cụ thể với từng loài (Arditti and Ernst, 1984; Kauth et al., 2008). Nitơ là nguồn dinh dưỡng rất cần thiết cho sự nảy mầm các loài lan khác nhau (Stewart et al., 2006). Bakul and Shahinul (2015), đánh giá khả năng nảy mầm của hạt lan R. retusa trên 4 loại môi trường khoáng khác nhau, MS (Murashige and Skoog, 1962), 1/2MS, B5 (Gamborg et al. 1968) và PM (PhytamaxTM), cho thấy môi trường MS cho tỷ lệ hạt nảy mầm cao nhất (72,6%). Trong nghiên cứu này, hạt non từ quả lan R. retusa chín sinh lý được cho nảy mầm trên môi trường Knops (1965) bổ sung thêm 100 ml/l PH + 100 ml/l CW + 20 g/l sucrose, cho tỷ lệ hạt nảy mầm đạt 95% sau 6 tuần nuôi cấy (Hình 1A).

Sau khi hạt nảy mầm tạo protocorm, các cụm protocorm (hình 1B) được cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh protocorm, môi trường Knops bổ sung chất ĐHST với hàm lượng khác nhau để đánh giá khả năng nhân nhanh. Kết quả thu được cho thấy, trên công thức môi trường có hoặc không có chất ĐHST, thể hiện sự khác biệt rõ rệt về hệ số nhân; môi trường không có chất ĐHST thì hệ số nhân protocorm đạt rất thấp (2,66 lần), ngược lại trên các môi trường bổ sung chất ĐHST hệ số nhân protocorm đạt được cao, dao động từ 6,05 đến 16,09 lần sau 5 tuần nuôi cấy (Bảng 1). Khi thay đổi hàm lượng BAP và giữ nguyên hàm lượng NAA, cho thấy hàm lượng BAP bổ sung vào môi trường ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả nhân protocorm. Sử dụng hàm lượng 0,5 mg/l BAP kết hợp với (0,2 và 0,3 mg/l) NAA cho hệ số nhân protocorm khá cao (tương ứng 12,74 và 13,86 lần). Kết quả này tương tự với báo cáo của Bakul and Shahinul (2015), khi nghiên cứu nhân nhanh protocorm thứ cấp của loài lan R. retusa cũng cho thấy hàm lượng BAP ảnh hưởng mạnh đến hệ số nhân protocorm; nồng độ (0,5 - 1,0 mg/l) BAP kết hợp với (0,5 - 1,0 mg/l) NAA cho hệ số nhân cao nhất (tương ứng 12,86 và 16 lần). Cũng theo báo cáo của Parab and Krishnan (2012), tái sinh protocorm của loài lan này từ vật liệu mô sẹo phát triển từ hạt non trên môi trường khoáng bổ sung thêm 1,0 mg/l BAP và 1,0 mg/l NAA cho hiệu quả mô sẹo tạo protocorm cao nhất (13,93 protocorm/mô sẹo).

27


Trong nghiên cứu này, khi môi trường bổ sung thêm tổ hợp chất ĐHST gồm BAP, NAA và Kinetin đã tăng hiệu quả nhân protocorm lên rõ rệt. Ở công thức môi trường bổ sung 0,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA + 0,3 mg/l Kinetin cho hệ số nhân đạt cao nhất trong các công thức thí nghiệm (16,09 lần/chu kỳ nhân, 5 tuần nuôi cấy). Ngược lại, theo nghiên cứu của Bakul and Shahinul (2015) và Parab and Krishnan (2012), khi môi trường chỉ bổ sung BAP và Kinetin thì cho hiệu quả nhân protocorm không cao. Nhận thấy, môi trường chỉ có chất ĐHST nhóm cytokinin (BAP, Kinetin) thì hiệu suất nhân protocorm thấp hơn nhiều so với môi trường bổ sung cytokinin (BAP, Kinetin) và auxin (NAA) ở hàm lượng phù hợp.

Bảng 1. Ảnh hưởng của chất ĐHST đến nhân nhanh protocorm

Ghi chú: Bảng 1, 2, 3: Trong phạm vi cùng một cột, các giá trị mang các chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức P = 0,05.

3.2. Tái sinh chồi từ protocormTrong nghiên cứu này, sử dụng 6 công thức môi

trường có sự kết hợp các loại chất ĐHST thuộc nhóm cytokinin, gibberellin và auxin với hàm lượng khác nhau và công thức đối chứng không bổ sung chất ĐHST, môi trường dinh dưỡng sử dụng đồng nhất gồm: Knops + 100 ml/l PH + 100 ml/l CW + 30 g/l sucrose + chất ĐHST; Sau thời gian theo dõi 6 tuần, kết quả tổng hợp trong bảng 2. Kết quả thu được cho thấy rằng: trên môi trường bổ sung loại và hàm lượng chất ĐHST khác nhau ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng tái sinh chồi của protocorm, tỷ lệ tai sinh chồi dao động từ 64,27 - 97,55% và số chồi/cụm dao động từ 4,14 - 8,82 chồi sau 6 tuần nuôi cấy. Ngược lại, ở công thức không bổ sung chất ĐHST

cho tỷ lệ tái sinh chồi rất thấp (13,85%) và số chồi/cụm chỉ đạt trung bình 1,68 chồi. Từ kết quả nghiên cứu này cho thấy môi trường dinh dưỡng khoáng cơ bản Knops bổ sung 0,5 mg/l BAP, 0,3 mg/l NAA và 0,3 mg/l GA3 cho tỷ lệ protocorm tái sinh chồi và số chồi/cụm đạt cao nhất trong các công thức thí nghiệm (97,55% và 8,82 chồi/cụm) (Hình 1D,E,F). Pinaki and Miskat (2012) khi nghiên cứu tái sinh chồi từ đoạn đốt thân của loài lan R. retusa cho tỷ lệ tạo cụm chồi và số chồi/mẫu cấy đạt cao nhất là 89,5% và 8,0 chồi/mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 1,5 mg/l BAP, 0,5 mg/l NAA, 10% (v/v) CW, 2 g/l peptone và 20 g/l sucrose. Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, tỷ lệ tái sinh chồi, số chồi tái sinh có thể phụ thuộc vào nhiều nguyên nhân, một trong nguyên nhân chính là khác biệt về kiểu gen giữa các giống nghiên cứu, loại vật liệu sử dụng và thành phần môi trường nuôi cấy.

Bảng 2. Ảnh hưởng của chất ĐHST đến tái sinh chồi từ protocorm

3.3. Tạo cây hoàn chỉnh và ra ngôiCác chồi lan hữu hiệu in vitro (chiều cao ≥ 2,0

cm) tạo ra ở bước tái sinh chồi được tách ra thành các chồi đơn và cấy lên môi trường ra rễ bổ sung chất ĐHST NAA và IBA với các hàm lượng khác nhau. Sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả thu được cho thấy rằng, môi trường khoáng Knops không bổ chất ĐHST có tỷ lệ chồi ra rễ rất thấp (35,37%), số rễ trung bình/chồi chỉ đạt 2,61 rễ và rễ có kích thước ngắn và mảnh; ngược lại, trên các công thức môi trường bổ sung chỉ IBA (0,1 - 0,3 mg/l) hoặc tổ hợp BAP kết hợp với NAA thì tỷ lệ chồi ra rễ tăng cao, dao động từ 75,29% đến 100% và số rễ trung bình/chồi đạt từ 3,97 - 6,5 rễ, rễ dài và mập (Bảng 3, Hình 1G,H). Tỷ lệ chồi ra rễ đạt cao nhất ở công thức môi trường bổ sung 0,3 mg/l IBA, 100% chồi ra rễ và 6,5 rễ/chồi. Theo báo cáo của Bakul and Shahinul (2015), chất điều hòa

Chất điều hòa sinh trưởng (mg/l)

Sinh khối protocorm/

bình (g)

Hệ số nhân protocorm

(lần)BAP NAA Kinetin- - - 5,32 ± 0,97 e 2,66

0,2 0,2 - 12,10 ± 2,19 d 6,050,3 0,2 - 18,53 ± 2,39 c 9,270,5 0,2 - 25,47 ± 2,19 b 12,740,2 0,3 - 11,55 ± 1,78 d 5,780,3 0,3 - 20,30 ± 0,86 c 10,150,5 0,3 - 27,72 ± 1,60 b 13,860,3 0,5 0,2 28,84 ± 1,81 b 14,420,5 0,5 0,3 32,19 ± 2,16 a 16,091,0 0,5 0,5 26,05 ± 2,14 b 13,02

Chất điều hòa sinh trưởng

(mg/l)

Tỷ lệ tái sinh chồi

(%)

Số chồi/cụm

BAP NAA GA3- - - 13,85 ± 1,82 e 1,68 ± 0,21 e

0,3 0,3 0,3 83,93 ± 1,56 b 6,70 ± 0,22 c0,3 0,3 0,5 95,16 ± 4,78 a 7,92 ± 0,42 b0,5 0,3 0,3 97,55 ± 2,70 a 8,82 ± 0,24 a0,5 0,5 0,5 78,72 ± 2,21 bc 4,14 ± 0,28 d1,0 0,5 0,3 76,13 ± 2,34 c 4,33 ± 0,19 d1,0 0,5 0,5 64,27 ± 7,12 d 4,51 ± 0,25 d

28


sinh trưởng IAA cho hiệu quả chồi ra rễ tốt hơn chất NAA; số rễ trên chồi đạt cao nhất là 7 rễ khi nuôi chồi trên môi trường ½ MS + 1,0 mg/l IAA và 6,4 rễ khi nuôi chồi trên môi trường ½ MS + 1,0 mg/l NAA. Ngược lại, Parab and Krishnan (2012) ra rễ chồi trên môi trường ½ MS không bổ sung chất ĐHST, chỉ bổ sung 5 g/l bột chuối, 10% (v/v) nước dừa, 2% pepton,

0,5% than hoạt tính và 20 g/l sucrose, cho chồi ra rễ nhiều nhất 5 rễ/chồi. Trong nghiên cứu này nhận thấy, hầu hết các chồi lan tách ra từ cụm chồi đã có dấu hiệu ra rễ nên trong giai đoạn ra rễ tạo cây hoàn chỉnh chỉ cần cung cấp một lượng nhỏ chất ĐHST là đủ, nếu hàm lượng cao rễ thường bị mô sẹo hóa, ảnh hưởng đến tỷ lệ sống khi ra cây.

Hình 1. Nhân giống in vitro Lan đuôi chồn (Rhynchostylis retusa).

A - Phôi hạt nảy mầm thành protocorm; B - cụm protocorm (thước 0,5 cm); C - Protocorm nảy chồi sau 2 tuần nuôi cấy (thước 0,5 cm) ; D,E - Protocorm nảy chồi sau 5 tuần nuôi cấy (thước 1 cm); F - Cụm chồi (thước 01 cm); G,H - Chồi ra rễ tạo cây hoàn chỉnh (thước 2 cm); I - Cây con trồng trên giá

thể dớn sau 8 tuần tuổi (thước 1,0 cm).

Huấn luyện và ra ngôi: Giai đoạn chuyển cây in vitro từ trong bình nuôi ra trồng ở nhà lưới là giai đoạn có ý nghĩa quan trọng, quyết định khả năng ứng dụng của toàn bộ quy trình nhân giống in vitro vào trong thực tiễn sản xuất. Giai đoạn này thường gặp nhiều khó khăn do cây in vitro đang trong điều kiện ổn định về mặt dinh dưỡng, nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng khi tiến hành chuyển cây ra

ngoài sẽ làm cây dễ bị “sốc” về điều kiện sống dẫn tới cây có thể bị chết. Trong nghiên cứu này, các bình cây lan ra rễ được huấn luyện trong nhà lưới 5 ngày để cây thích nghi dần với điều kiện tự nhiên trước khi lấy ra khỏi bình. Sau thời gian huấn luyện, cây được rửa sạch loại bỏ thạch dưới vòi nước chảy và được cấy vào chậu đã chuẩn bị giá thể cây dớn khô và xơ dừa. Đặt chậu cây trong nhà lưới có mái che bằng lưới đen tránh ánh sáng mặt trời chiếu trực xạ, tưới nước đảm bảo độ ẩm ≥ 95%. Kết quả cho tỷ lệ cây sống 90% sau 8 tuần trồng (Hình 1I).


4.1. Kết luậnXây dựng thành công quy trình vi nhân giống

Lan đuôi chồn, loài lan rừng bản địa của Việt Nam, đạt hệ số nhân giống cao: Tỷ lệ hạt nảy mầm đạt 95% sau 6 tuần nuôi cấy; hệ số nhân protocorm đạt 16,09 lần/chu kỳ nhân sau 5 tuần nuôi cấy; tỷ lệ protocorm tái sinh chồi đạt 97,55% và trùng bình 8,82 chồi/cụm sau 6 tuần nuôi cấy; tỷ lệ chồi ra rễ đạt 100% và trung bình 6,5 rễ/chồi, rễ dài và mập sau 4 tuần nuôi cấy. Cây hoàn chỉnh được huấn luyện 5 ngày trong nhà lưới cho thích nghi dần với điều kiện tự nhiên, cây được trồng trên giá thể dớn khô và xơ dừa (1: 1), cho tỷ lệ cây sống đạt 90% sau 8 tuần ra ngôi.

4.2. Đề nghịĐề nghị áp dụng quy trình nhân giống Lan đuôi

chồn bằng kỹ thuật nuôi cấy mô này để sản xuất một lượng lớn cây giống có chất lượng tốt cung cấp cho thị trường.

Bảng 3. Ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng ra rễ in vitro của chồiChất điều hòa sinh trưởng (mg/l) Ti lệ chồi ra rễ

(%)Số rễ

trung bình/chồi Đặc điểm của rễIBA NAA

- - 35,37 ± 4,18 e 2,61 ± 0,21 d Rễ ngắn và mảnh0,1 - 75,29 ± 2,82 d 3,97 ± 0,47 c Rễ dài và mập0,2 - 87,84 ± 4,00 c 5,42 ± 0,33 b Rễ dài và mập0,3 - 100,00 ± 0,00 a 6,50 ± 0,47 a Rễ dài và mập0,1 0,2 91,85 ± 3,47 bc 5,82 ± 0,23 b Rễ dài và mảnh0,2 0,1 95,26 ± 4,36 ab 6,00 ± 0,26 ab Rễ dài và mập

29


LỜI CẢM ƠNTập thể tác giả xin chân thành cảm ơn sự giúp

đỡ của ThS. Nguyễn Thị Thu Hằng, Giám đốc Trung tâm Phát triển Lâm nghiệp Hà Nội, đã cung cấp quả Lan đuôi chồn để làm vật liệu nghiên cứu.

TÀI LIỆU THAM KHẢOArditti, J. and R Ernst, 1984. Physiology of germinating

orchid seeds. In: Arditti J, ed. Orchid Biology: Reviews and perspectives III. New York: Cornell University Press, 177-222.

Bakul, B. and S.M.I. Shahinul, 2015. The effect of PGRs on in vitro development of protocorms, regeneration and mass multiplication derived from immature seeds of Rhynchostylis retusa (L.) Blume. Global Journal of Bio-Science and Biotechnology, 4(1): 121-127.

Chowdhury, A., 2014. Pharmacological screening of four medicinally important plants: Curcuma zedoaria, Nymphoides indica, Drynaria quercifolia and Rhynchostylis retusa, A dissertation for Bachelor of Pharmacy, Department of Pharmacy, East West University. Dhaka, Bangladesh.

Das, P.R., M.J. Islam, A.S.M. Salehtim, B.M.H. Kabir, M.E. Hasa, Z. Khatun, M.M. Rahman, M. Nurunnab, K. Zehedina, Y.K. Lee, R. Jahan, and M. Rahmatullah, 2012. An ethanomedicinal survey conducted among the folk medicinal practitioners of three villages in Kurigram district, Bangladesh. American-Eurasian J. Sustain. Agri., 6(2): 85-96.

Hossain M.M., 2011. Therapeutic orchids: Traditional uses and recent advances- an overview. Fitoterapia, 82(2): 102-140.

Kauth P.J, D. Dutra, T.R. Johnson, S.L. Stewart, M.E. Kane, and W. Vendrame, 2008. Techniques and applications of in vitro orchid seed germination. In:

Teixeira da Silva JA, ed. Floriculture, ornamental and plant biotechnology: advances and topical issues. Vol. V, 1st Ed., UK: Global Science Books Ltd., 375-391.

KNOP, W., 1865. Quantitative Untersuchungen Über die Ernahrungsprozesse der Pflanzen. Landwirtsch. Versuchssat. Stn 7: 93-107.

Parab G.V. and S. Krishnan, 2012. Rapid in vitro mass multiplication of orchids Aerides maculosa Lindl. and Rhynchostylis retusa (L.) Bl. from immature seeds. Indian Journal of Biotechnology, 11: 288-294.

Pinaki S. and A.A.J Miskat, 2012. Clonal Propagation of Rhynchostylis retusa (Lin.) Blume through in vitro Culture and their Establishment in the Nursery. Plant tissue cult. and Biotech., 22(1): 1‐11.

Radhika B. and N. Murthy, 2013 Preliminary phytochemical analysis and in vitro bioactivity against clinical pathogens on medicinally important orchid of Rhynchostylis retusa Blume. Am. J. Pharm. Tech. Res., 3: 510-520.

Shanavaskhan, A.E., M. Sivadasan, A.H. Al-Farhan, and J. Thomas, 2012. Ethnomedical aspects of angiospermic epiphytes and parasites of Kerala, India. Indian J. Trad. Know., 11(2): 250-258.

Stewart S.L. and M.E. Kane, 2006. Symbiotic seed germination of Habenaria macroceratitis (Orchidaceae), a rare Florida terrestrial orchid. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 86: 159-167.

Subedi A., B. Kunwar, Y. Choi, Y. Dai, T.V. Andel, R.P. Chaudhury, H.J.D. Boer, and B. Gravendeel, 2013. Collection and trade of wild-harvested orchids in Nepal. J. Ethnobio. Ethnomed., 9(1): 64-74.

Tiwari A.P., B. Joshi, and A.A. Ansari, 2012. Less known ethnomedicinal uses of some orchids by the tribal inhabitants of Amarkantak Plateau, Madhya Pradesh. India. Nat. Sci., 10(12): 33-37.

Clonal propagation of Rhynchostylis retusa (L.) Blume from immature seeds by in vitro culture

Bui Van Thang, Nguyen Thi Hong GamAbstractA procedure for clonal propagation of R. retusa has been developed. The result showed that the seeds of immature capsule were grown on Knops medium supplemented with 100 ml/l potato homogenate (PH), 100 ml/l coconut water (CW), and 20 g/l sucrose, by which the rate of seed germination achieved 95% after 6 weeks of culture. Secondary protocorms were developed from primary protocorms on medium fortified with different concentrations and combinations of cytokinins (BAP and Kin) and auxins (NAA). The highest numbers of secondary protocorms were 16.09 times/cycle of propagation after 5 weeks obtained from the primary protocorms in Knops medium supplemented with 0.5 mg/l BAP, 0.5 mg/l NAA, 0.3 mg/l Kin, 100 ml/l PH, 100 ml/l CW, and 30 g/l sucrose. Knops medium supplemented with 0.5 mg/l BAP, 0.3 mg/l NAA, 0.3 mg/l GA3, 100 ml/l PH, 100 ml/l CW, and 30 g/l sucrose was the optimal medium for shoot regeneration from protocorms (97,55%, 8.82 shoots/explant). 100% shoots have rooted on Knops medium contained 0.3 mg/l IBA, 100 ml/l PH, and 20 g/l sucrose, with the remarkable figures being 6.5 roots/shoot after 4 weeks of culture. In vitro regenerated plantlets were acclimatized under greenhouse conditions. The survival rate of plantlets were 90% in the potting mixture containing sphagnum moss and coconut husk in the ratio of 1:1. This procedure can be applied for mass production of R. retusa to meet the commercial demand. Key words: Rhynchostylis retusa (L.) Blume, in vitro culture, propagation, protocorm



30


I. ĐẶT VẤN ĐỀCây Ngưu tất (Achyranthes bidentata Blume) là

một trong những loài cây thuốc quan trọng của họ Amaranthaceae. Ngưu tất là một loài cây thảo mộc, lâu nâm được tìm thấy ở nhiều vùng nhiệt đới ở châu Á và châu Phi bao gồm Việt Nam, Trung Quốc, Ấn Độ, Java, Nhật Bản, v.v. (Chopra, 1958; Đỗ Tất Lợi, 1999). Cây này có chứa nhiều chất phytochemicals như alkaloids (achyranthine), rutin, axit oleanolic, axit caffeic, polysaccharides, saponin, terpenoids, triterpenoid, sitosterol, stigmasterol, ecdysterone, rubrosterone, v.v. hầu hết đều có giá trị trị liệu (Nguyen et al., 1995; Nguyen and Doan, 1989). Các bộ phận khác nhau của cây được sử dụng có hiệu quả để điều trị một số bệnh như ho, hen, sốt, phát ban da, tiêu chảy, tiểu đường, đau răng, viêm loét, viêm khớp, bệnh về gan và thận, giảm huyết áp, tăng cường tuần hoàn máu, kích thích miễn dịch (Chandra and Pandey 1983; Manandhar, 2002; Zhao et al., 2004). Do có giá trị nên loài cây dược liệu này đã bị khai thác quá mức, dẫn đến khan hiếm ngoài tự nhiên. Vì vậy, việc nghiên cứu nhân giống, bảo tồn và phát triển nguồn gen loài cây Ngưu tất là cần thiết hiện nay.

Trong những năm gần đây, kỹ thuật nuôi cấy mô đã được áp dụng cho việc bảo tồn nguồn gen và nhân giống nhiều loài cây thuốc. Với sự hỗ trợ của phương pháp nuôi cấy mô, có thể tạo ra một số lượng lớn các cây giống từ một nguồn mẫu hạn chế trong khoảng thời gian ngắn nhất. Một số nghiên cứu về mô nuôi cấy cây Ngưu tất cũng được báo cáo, tuy nhiên tần suất tái sinh chồi từ các loại mẫu cấy là rất thấp; thậm chí có sự khác nhau về tỷ lệ tái sinh khi nuôi cấy cùng một loại mẫu (Dong et al., 2002;

Li et al., 2004; Wesely et al., 2012; Md. Jakir et al., 2013). Trong nhân giống in vitro, mỗi giống xuất xứ khác nhau thì hiệu suất nhân giống khác nhau. Do đó, đối với mỗi giống cần xác định được môi trường nhân giống phù hợp mới đem lại hiệu quả. Trong công trình này, thông báo kết quả nghiên cứu nhân giống thành công cho loài cây Ngưu tất thu mẫu tại tỉnh Hà Giang, Việt Nam bằng kỹ thuật nuôi cấy mô.


2.1. Vật liệu nghiên cứuVật liệu nghiên cứu là đoạn chồi non của cây

Ngưu tất sinh trưởng, phát triển tốt và không bị sâu bệnh đã được tuyển chọn tại Hà Giang, do Trung tâm Giống cây trồng Đạo Đức, Hà Giang cung cấp.

Môi trường dinh dưỡng khoáng cơ bản MS, (Murashige and Skoog, 1962).


2.2.1. Khử trùng và nuôi cấy khởi động Các đoạn chồi (15 - 20 cm) được rửa sạch bằng

nước máy, ngâm mẫu trong nước xà phòng loãng 5 - 10 phút và rửa sạch xà phòng. Sau đó, mẫu được cho vào các bình thủy tinh có nút vặn và đưa vào tủ cấy vô trùng; khử trùng bề mặt bằng dung dịch cồn 70% trong 30 giây; tiếp theo khử trùng mẫu bằng 0,1% (w/v) HgCl2 trong các khoảng thời gian khác nhau (2; 3; 4; 5; 7 phút), tráng lại bằng nước cất vô trùng (5 lần) và thấm khô bằng giấy thấm. Các đoạn chồi sau khi khử trùng được cắt thành các đoạn ngăn (khoảng 2 cm) chứa mắt ngủ và cấy lên môi trường cơ bản MS bổ sung 0,3 mg/l BAP và 30 g/l sucrose, nuôi dưới ánh sáng giàn đèn trong 4 tuần để mẫu cấy tái sinh chồi.

1 Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Đại học Lâm nghiệp

NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY NGƯU TẤT (Achyranthes bidentata Blume) TỪ CHỒI BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ

Nguyễn Thị Hồng Gấm1, Bùi Văn Thắng1

TÓM TẮTNhân giống cây Ngưu tất bằng kỹ thuật nuôi cấy mô đã được nghiên cứu thành công, với hệ số nhân giống cao:

Chồi non chứa mắt ngủ khử trùng bằng 0,1% (w/v) HgCl2 trong thời gian 4 phút và nuôi cấy trên môi trường MS + 0,3 mg/l BAP + 30 g/l sucrose cho tỷ lệ mẫu sạch tái sinh chồi (72,5%) sau 4 tuần nuôi cấy; tỷ lệ chồi tái sinh tạo cụm chồi (95,7%), 12,2 số chồi/mẫu cấy và 92,5% chồi hữu hiệu sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS + 0,3 mg/l BAP + 0,1 mg/l Kin + 0,1 mg/l NAA + 30 g/l sucrose; tỷ lệ chồi ra rễ đạt 94,8% và trung bình 7,2 rễ/chồi sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS + 0,3 mg/l IBA + 0,2 mg/l NAA + 30 g/l sucrose. Cây hoàn chỉnh được huấn luyện 10 ngày trong nhà lưới cho thích nghi dần với điều kiện tự nhiên, cây con trồng trên giá thể đất đồi tầng B và cát (tỷ lệ 3:1), cho tỷ lệ cây sống đạt 83,3% sau 2 tuần ra ngôi. Quy trình này có thể áp dụng để sản xuất cây giống Ngưu tất chất lượng tốt phục vụ công tác bảo tồn nguồn gen và phát triển loài cây dược liệu quý này.

Từ khóa: Cây Ngưu tất, nhân giống vô tính, nuôi cấy mô

31


2.2.2. Nhân nhanh chồi từ chồi chứa mắt ngủ Các mẫu cấy tái sinh chồi sau 4 tuần nuôi cấy từ

thí nghiệm trên được cắt thành các mẫu nhỏ (1,0 cm) chứa mắt ngủ và cấy lên môi trường MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) với hàm lượng khác nhau (0,1 - 0,5 mg/l) BAP + (0,1 và 0,2 mg/l) NAA + (0,1 và 0,3 mg/l) Kinetin (bảng 2); nuôi trong 4 tuần dưới ánh sáng giàn đèn để khảo sát khả năng tái sinh chồi.

2.2.3. Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh Các cụm chồi được tạo ra từ thí nghiệm trên được

sử dụng để làm vật liệu nghiên cứu. Dùng mũi dao tách các chồi đơn hữu hiệu có chiều cao ≥ 2,0 cm ra khỏi cụm chồi và cấy lên môi trường kích thích chồi ra rễ tạo cây hoàn chỉnh, môi trường MS bổ sung chất ĐHST khác nhau (0,1 - 0,5 mg/l) IBA và (0,2 và 0,3 mg/l) NAA (Bảng 3). Các bình chồi được nuôi 3 tuần dưới ánh sáng giàn đèn, chồi ra rễ tạo cây con hoàn chỉnh.

2.2.4. Huấn luyện và ra ngôiCác bình cây con ra rễ in vitro được đưa ra nhà

lưới huấn luyện cây mô trong thời gian 10 ngày để cây thích nghi dần với điều kiện tự nhiên. Sau thời gian huấn luyện cây con cứng cáp lấy ra khỏi bình và rửa bộ rễ loại bỏ thạch bằng nước máy (rửa nhẹ nhàng tránh làm gãy rễ, dập thân). Sau đó, cây con được cấy vào 4 loại giá thể khác nhau để đánh giá tỷ lệ sống và chất lượng cây con (giá thể 100% đất đồi tầng B, 75% đất đồi tầng B và 25% cát, 50% đất đồi tầng B và 50% cát và 100% cát). Cây con được che chắn ánh sáng chiếu trực xạ bằng lưới đen, ngày tưới nước bằng cách phun sương 2 - 4 lần, đảm bảo độ ẩm ≥ 95%.

Tất cả các môi trường nuôi cấy được bổ sung thêm 30 g/l sucrose và 7 g/l agar, môi trường được chuẩn độ đến pH = 5,8; khử trùng ở 121oC trong 20 phút. Điều kiện phòng nuôi cấy: nhiệt độ phòng nuôi 25 ± 20C, cường độ ánh sáng dàn đèn 35 μEm−2 s−1, thời gian chiếu sáng 14 h/ngày.

2.2.5. Phương pháp thu thập và xử lý số liệuMỗi thí nghiệm trên thực hiện ít nhất với 30 mẫu

và 3 lần lặp lại; số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS (version 16.0) và phương pháp Duncan’s test (Duncan, 1995) với mức sai khác có ý nghĩa a = 0,05.

2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiên từ tháng 2 năm 2016

đến 5 năm 2017 tại Phòng thí nghiệm Công nghệ nuôi cây mô tế bào và khu nhà lưới ra cây mô của Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Đại học Lâm nghiệp.


3.1. Khử trùng tạo mẫu sạch in vitroCác đoạn chồi non chứa mắt ngủ sau khi rửa sạch

và sát khuẩn bề mặt bằng cồn 70% trong 30 giây và được khử trùng bằng 0,1% (w/v) HgCl2 trong các khoảng thời gian khác nhau (2 - 7 phút), mẫu được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 0,3 mg/l BAP + 30 g/l sucrose; sau 4 tuần nuôi cấy thu được kết quả như bảng 1. Tỷ lệ mẫu sạch và tái sinh chồi phụ thuộc vào nồng độ HgCl2 và thời gian khử trùng. Kết quả thu được cho thấy ở cùng một nồng độ chất khử trùng HgCl2 khi tăng (2 - 7 phút) thì tỷ lệ tạo mẫu sạch tăng (34 - 96,8%) theo tỷ lệ thuận, nhưng tỷ lệ mẫu sạch tái sinh chồi lại giảm mạnh theo tỷ lệ nghịch. Thời gian khử trùng trong 2 phút chỉ cho tỷ lệ mẫu sạch là 34% và tái sinh chồi là 32,2%; khi tăng thời gian khử trùng khoảng 3 - 4 phút cho tỷ lệ mẫu sạch (70,6 - 80,9%) và tái sinh chồi cao nhất (64,8 - 72,5%) (Hình 1A). Ngược lại, khi tăng thời gian khử trùng lên 5 - 7 phút thì cho tỷ lệ mẫu sạch đạt rất cao (92,9 - 96,8%) nhưng mẫu sạch lại mất khả năng tái sinh chồi, tỷ lệ mẫu tái sinh chồi chỉ đạt (4,0 - 17,6%), hầu hết chồi bị nâu đen và chết. HgCl2 là một chất độc đối với tế bào sống, HgCl2 không chỉ gây chết đối với vi sinh vật mà còn gây chết đối với mô - tế bào thực vật khi thời gian khử trùng kéo dài. Kết quả này phù hợp với quan sát của Wesely et al., (2012) khi khử trung tạo mẫu sạch từ chồi non A. bidentata sử dụng 0,1% (w/v) HgCl2, thời gian khử trùng 5 phút cho tỷ lệ mẫu sạch 100% nhưng 95 -100% chồi bị chết, thời gian khử trùng 3 phút là hiệu quả đối với chồi non; kết quả nghiên cứu cũng phù hợp với các báo cáo của Johnson et al. (2005) khi nghiên cứu tái sinh cây Rhinacanthus nasutus; Wesely et al. (2011) khi nhân giống cây Alternanthera sessilis. Các báo cáo cho thấy rằng việc khử trùng quá 5 phút sẽ gây chết mẫu, mẫu mất khả năng tái sinh chồi.

Bảng 1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng 0,1% HgCl2 đến tỷ lệ tạo mẫu sạch và tái sinh chồi

Ghi chú: Trong phạm vi cùng một cột, các giá trị mang các chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức α = 0,05.

Thời gian khử trùng băng 0,1%

HgCl2 (phút)

Tỷ lệ mẫu sạch (%) ± SD

Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi

(%) ±SD2 34,0 ± 4,2 d 32,2 ± 3,5 c3 70,6 ± 6,3 c 64,8 ± 4,0 b4 80,9 ± 4,7 b 72,5 ± 3,8 a5 92,9 ± 2,3 a 17,6 ± 4,3 d7 96,8 ± 2,9 a 4,0 ± 1,5 e

32


3.2. Nhân nhanh chồi cây Ngưu tất in vitroTrong nuôi cấy mô tế bào thực vật, chất ĐHST

thực vật ảnh hưởng rõ rệt và rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái của tế bào, kính thích hình thành chồi và rễ (Himanen et al., 2002; Randy et al., 2009). Trong nghiên cứu, các chất ĐHST thuộc nhóm cytokin (BAP, Kinetin) và auxin (NAA) đã được sử dụng bổ sung vào môi trường nuôi cấy để đánh giá khả năng tái sinh chồi từ đoạn chồi cây Ngưu tất chứa mắt ngủ nuôi cấy in vitro. Kết quả thu được cho thấy khi môi trường nuôi cấy MS bổ sung chất ĐHST ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ mẫu cảm ứng tái sinh chồi, số chồi/mẫu và tỷ lệ chồi hữu hiệu; cao hơn so với môi trường không bổ sung chất ĐHST. Đối với nuôi cấy chồi Ngưu tất chứa mắt ngủ trên môi trường MS không bổ sung chất ĐHST thì chồi vẫn tái sinh tạo cụm chồi nhưng chỉ đạt 12,9% và trung bình 4 chồi/mẫu cấy, chất lượng chồi kém (chồi mảnh, còi và yếu). Môi trường MS bổ sung chất ĐHST với hàm lượng khác nhau cho tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo cụm chồi (61,5 - 95,7%), số chồi/mẫu cấy (5,8 - 12,2 chồi) và tỷ lệ chồi hữu hiệu (28 - 92,5%) (Bảng 2). Kết quả cho thấy khi sử dụng hàm lượng BAP khác nhau kết hợp với cùng một hàm lượng Kinetin (Kin) và NAA thì hiệu suất tái sinh chồi biến động lớn; hàm lượng (0,2 - 0,4 mg/l BAP) cho tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi cao. Ở công thức môi trường bổ sung 0,2 mg/l NAA kết hợp với BAP và Kin cho tỷ lệ mẫu cảm ứng cụm chồi và số chồi/mẫu cấy khá cao nhưng tỷ lệ chồi hữu hiệu lại rất thấp,

chồi có chất lượng kém. Công thức môi trường MS bổ sung 0,3 mg/l BAP, 0,1 mg/l Kin và 0,1 mg/l NAA cho tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi cao nhất (95,7%), 12,2 chồi/mẫu cấy và 92,5% chồi hữu hiệu (chồi ≥ 2 cm), chồi có chất lượng tốt (chồi cao, mập, thân và lá xanh đồng đều) đủ tiêu chuẩn cho ra rễ tạo cây hoàn chỉnh (Hình 1C). Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy đối với chồi cây Ngưu tất sử dụng hàm lượng chất ĐHST (BAP, Kin, NAA) với hàm lượng thấp kích thích chồi tái sinh tốt, số chồi hữu hiệu cao, khi tăng hàm lượng chất ĐHST thì tỷ lệ chồi hữu hiệu giảm rõ rệt. Ngược lại, trong nghiên cứu của Wesely et al. (2012) khi chồi non A. bidentata trên môi trường chỉ bổ sung BAP hoặc Kin ở hàm lượng cao, kết quả cho thấy ở hàm lượng 3,0 mg/l BAP cho tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo cụm chồi cao nhất (94,7%) và 4,6 chồi/mẫu cấy; ở hàm lượng 5,0 mg/l BAP cho tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo cụm chồi (79,4%) và 9,5 chồi/mẫu cấy; Kinetin ở hàm lượng 2,0 mg/l cho tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo cụm chồi (82,4%) và 2,7 chồi/mẫu cấy là cao nhất. Theo báo của Md. Jakir et al., (2013) khi nghiên cứu tái sinh chồi A. bidentata từ đoạn chồi chứa mắt ngủ sử dụng BAP ở nồng độ cao kết hợp với NAA ở nồng độ thấp cho thấy công thức có 3,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA cho tỷ lệ tao cụm chồi (96,67%) và chỉ đạt 5,6 chồi/mẫu cấy là công thức tốt nhất. Trong nghiên cứu này, việc kết hợp giữa 3 loại chất ĐHST (BAP, Kin và NAA) ở nồng độ thấp trong môi trường đã kích thích mẫu tái sinh chồi hiệu quả; điều này sẽ tiết kiệm được hóa chất trong sản xuất, giảm giá thành cây giống.

Bảng 2. Ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng tái sinh chồi của đoạn chồi chứa mắt ngủ

Ghi chú: Trong phạm vi cùng một cột, các giá trị mang các chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức α = 0,05. * chất lượng chồi kém (chồi mảnh, còi, yếu); ** chất lượng chồi khá (chồi trung bình, mọng nước, xanh); *** chất lượng chồi tốt (chồi cao, mập, thân và lá xanh đồng đều).

Chất điều hòa sinh trưởng (mg/l) Tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi (%) ± SD

Số chồi/mẫu cấy ± SD

Tỷ lệ chồi hữu hiệu (%) ± SD

Chất lượng chồiBAP Kin NAA

- - - 12,9 ± 2,7 g 4,0 ± 0,5 f 0,0 ± 0,0 h *

0,1

0,1 0,1

61,5 ± 3,7 f 6,7 ± 0,5 e 63,0 ± 6,8 d **

0,2 85,3 ± 2,9 c 10,6 ± 0,7 b 89,6 ± 2,8 a ***

0,3 95,7 ± 3,2 a 12,2 ± 0,4 a 92,5 ± 1,7 a ***

0,4 93,5 ± 2,7 ab 9,2 ± 0,6 c 79,5 ± 3,6 b **

0,5 90,6 ± 2,2 abc 6,4 ± 0,8 e 75,4 ± 2,7 b **

0,1

0,3 0,2

88,3 ± 4,3 bc 5,8 ± 0,3 e 68,9 ± 3,3 c **

0,2 92,7 ± 2,3 ab 6,2 ± 0,5 e 54,6 ± 3,6 e *

0,3 84,8 ± 2,4 c 8,8 ± 0,4 cd 35,3 ± 2,7 f *

0,4 78,8 ± 3,6 d 8,1 ± 0,5 d 30,6 ± 3,5 fg *

0,5 70,5 ± 4,4 e 8,5 ± 0,2 cd 28,0 ± 2,3 g *

33


3.3. Kích thích chồi ra rễ tạo cây hoàn chỉnh in vitroChất điều hòa sinh trưởng thực vật IBA và NAA

thuộc nhóm auxin là các chất có hiệu quả cao trong việc ra rễ của chồi cây nuôi cấy in vitro. Nuôi cấy ra rễ chồi cây A bidentata, Wesely et al. (2012); Md. Jakir et al. (2013) chỉ sử dụng IBA ở nồng độ (1,0 - 1,5 mg/l) cho tỷ lệ chồi ra rễ cao. Trong nghiên cứu này, đánh giá khả năng ra rễ chồi Ngưu tất trên môi trường MS bổ sung IBA và NAA ở nồng độ thấp (0,1 - 0,5 mg/l IBA) và (0,2 hoặc 0,3 mg/l NAA). Kết quả cho thấy, ở các công thức môi trường bổ sung chất ĐHST (IBA và NAA) chồi ra rễ với tỷ lệ cao (77,5 - 94,8%), ngược lại ở công thức môi trường không bổ sung chất ĐHST thì chồi không có dấu hiệu ra rễ (bảng 3). Số rễ trung bình/chồi ở các công thức bổ sung chất ĐHST dao động từ 5,2 - 7,8 rễ. Công thức môi trường MS bổ sung 0,3 mg/l IBA và 0,2 mg/l NAA cho tỷ lệ chồi ra rễ cao nhất 94,8% và 7,2 rễ/chồi (hình 1 D,E). Theo báo cáo của Wesely et al., (2012) khi môi trường nuôi cấy MS chỉ bổ sung IBA ở nồng độ 1,0 mg/l cho tỷ lệ chồi ra rễ là 74,7% và 9,4 rễ/chồi; Md. Jakir et al. (2013) nuôi cấy chồi A bidentata trên môi trường MS bổ sung 1,5 mg/l IBA cho tỷ lệ chồi ra rễ là 97,78% và 15,8 rễ/mẫu cấy; môi trường ½ MS bổ sung 1,5 mg/l IBA cho tỷ lệ chồi ra rễ là 77,33% và 10,6 rễ/mẫu cấy, cao nhất trong các công thức thí nghiệm. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy môi trường bổ sung kết hợp giữa IBA và NAA ở nồng độ thấp nhưng hiệu quả ra rễ cao. Khi sử dụng hàm lượng auxin cao gốc chồi thường bị mô sẹo hóa, ảnh hưởng đến tỷ lệ sống khi ra cây.

Bảng 3. Ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng ra rễ in vitro của chồi

Ghi chú: Trong phạm vi cùng một cột, các giá trị mang các chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức α = 0,05.

3.4. Trồng cây Ngưu tất nuôi cấy mô ra vườn ươm Sau khi chồi ra rễ tạo cây hoàn chỉnh, các bình

cây được huấn luyện trong nhà lưới có mát che (thời gian 10 ngày) để cây thích nghi dần với điều kiện môi trường tự nhiên. Sau thời gian huấn luyện, cây được rửa sạch loại bỏ thạch dưới vòi nước chảy và được cấy vào chậu đã chuẩn bị với các thành phần giá thể khác nhau (bảng 4) để đáng giá tỷ lệ sống của cây mô. Sau 2 tuần trồng, tỷ lệ cây sống ra lá mới trên các loại giá thể khác nhau dao động từ 56,7% đến 83,3%. Giá thể đất đồi tầng B phối trộn với cát tạo sự thông thoáng tốt nên cho tỷ lệ cây sống cao. Tỷ lệ cây sống cao nhất là 83,3% trồng trên giá thể 75% đất và 25% cát, cây sinh trưởng, phát triển tốt (hình 1F). Theo báo cáo của Md. Jakir et al. (2013) ra cây Ngưu tất nuôi cấy mô trên giá thể đất vườn và phân ủ (tỷ lệ 1: 1), đất được hấp vô trùng cho tỷ lệ cây sống gần 80% sau 28 ngày ra ngôi.

Bảng 4. Ảnh hưởng của thành phần giá thể ruột bầu đến tỷ lệ sống của cây Ngưu tất nuôi cấy mô

* Cây con có thân cứng cáp, lá và bộ rễ phát triển chậm; ** Cây con có thân yếu, bộ rễ phát triển tốt; *** Cây con có thân cứng cáp, lá và bộ rễ phát triển rất tốt

Hình 1. Nhân giống in vitro cây Ngưu tất (A. bidentata)

A: Chồi tái sinh trên môi trường MS + 0,3 mg/l BAP + 30 g/l sucrose sau 4 tuần nuôi cấy; B, C: Mẫu tái sinh tạo cụm chồi trên môi trường MS + 0,3 mg/l BAP + 0,1 mg/l Kin + 0,1 mg/l NAA+ 30 g/l sucrose sau 4 tuần nuôi cấy; D: Chồi ra rễ trên môi trường MS + 0,3 mg/l IBA + 0,2 mg/l NAA+ 30 g/l sucrose sau 3 tuần nuôi cấy; E: Cây hoàn chỉnh; F: Cây con trồng trên giá thể 75% đất đồi

tầng B + 25% cát sau 2 tuần ra ngôi.

Chất điều hòa sinh trưởng

(mg/l)Tỷ lệ chồi ra rễ (%) ± SD

Số rễ trung bình/chồi ± SD

IBA NAA- - 0,0 ± 0,0 d 0,0 ± 0,0 e

0,10,2

77,5 ± 2,5 c 5,2 ± 0,4 d0,3 94,8 ± 3,1 a 7,2 ± 0,4 ab0,5 85,6 ± 2,6 b 7,3 ± 0,2 ab0,1

0,385,7 ± 5,1 b 6,4 ± 0,6 c

0,3 90,3 ± 2,6 ab 7,8 ± 0,3 a0,5 87,5 ± 2,5 b 6,6 ± 0,6 bc

Loại giá thể Tỷ lệ cây sống (%)

Chất lượng cây con

100% đất 66,7 *75% đất - 25%cát 83,3 ***50% đất - 50% cát 80,6 ***100% cát 56,7 **

34



4.1. Kết luậnQuy trình nhân giống vô tính cây Ngưu tất từ

chồi bằng kỹ thuật nuôi cấy mô đã được nghiên cứu thành công, với hệ số nhân giống cao: Chồi non chứa mắt ngủ khử trùng bằng 0,1% (w/v) HgCl2 trong thời gian 4 phút và nuôi cấy trên môi trường MS + 0,3 mg/l BAP + 30 g/l sucrose cho tỷ lệ mẫu sạch tái sinh chồi (72,5%) sau 4 tuần nuôi cấy; tỷ lệ chồi tái sinh tạo cụm chồi (95,7%), 12,2 số chồi/mẫu cấy và 92,5% chồi hữu hiệu sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS + 0,3 mg/l BAP + 0,1 mg/l Kin + 0,1 mg/l NAA + 30 g/l sucrose; tỷ lệ chồi ra rễ đạt 94,8% và trung bình 7,2 rễ/chồi sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS + 0,3 mg/l IBA + 0,2 mg/l NAA + 30 g/l sucrose. Cây hoàn chỉnh được huấn luyện 10 ngày trong nhà lưới cho thích nghi dần với điều kiện tự nhiên, cây con trồng trên giá thể đất đồi tầng B và cát (tỷ lệ 3:1), cho tỷ lệ cây sống đạt 83,3% sau 2 tuần ra ngôi.

4.2. Đề nghịĐề nghị áp dụng quy trình nhân giống vô tính

cây Ngưu tất bằng kỹ thuật nuôi cấy mô này để sản xuất cây giống.

TÀI LIỆU THAM KHẢOĐỗ Tất Lợi, 1999. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam.

NXB Y học.Chandra, K. H. Pandey, 1983. Collection of plants

around agora-Dodital in Uttarkashi district, at U.P., Medicinal value and folklore claim. INT. J. Crude Drug Res. 21: 21-28.

Chopra, R.N., 1958. “Indigenous Drugs of India” Art Press, Calcutta, 457-462.

Dong, C.M. L.P. Zhang, J. Liu, 2002. Study on tissuce culture of Achyranthes Bidentata. Henan Tradit. Chin. Med., 22 (4): 63-64.

Himanen, K. E. Boucheron, S. Vanneste, E.J. de Almeida, D. Inze, T. Beeckman, 2002. Auxin-mediated cell cycle activation during early lateral root initiation. Plant Cell, 14: 2339-2351.

Li, M.J. X.L. Yu, M.X. Chen, M.J.Yang, X.L. Zhang, 2004. Induction of callus and plantlet regeneration of Achyranthes bidentata. Plant Physiol. Commun. 40(3): 343.

Manandhar, N.P., 2002. Plants and People of Nepal. Timber Press. Oregon. ISBN 0-88192-527-6.

Md. Jakir, H. K. Laila, Al-F. Mohammad, 2013. Development of an efficient in vitro micropropagation protocol for medicinally important plant Achyranthes bidentata Blume. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 2(4): 6-13.

Murashige, T. and F. Skoog, 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. plant, 15: 473-497.

Nguyen, T. S. Nikolov, T.D. Nguyen, 1995. Chemical research of the aerial parts of Achyranthes bidentata Blume. Tạp chí Dược học, 6:17-18.

Nguyen, V.D. and T.N. Doan, 1989. Medicinal Plants in Vietnam. World Health Organization. ISBN 92 9061 1014.

Randy, O.C. C.C. Hexon Angel, M.R. Lourdes, L.B. Jose, 2009. The role of microbialsignals in plant growth and development. Plant Signal Behav, 4(8): 701-712.

Wesely, E.G. M.A. Johnson, R.B. Mohanamathi, and M.S. Kavitha, 2012. In vitro clonal propagation of Achyranthes aspera L. and Achyranthes bidentata Blume using nodal explants. Asian Pac J Trop Biomed., 2(1): 1-5.

Zhao, X.M. G.Z. Xu, J.L. Li, 2004. Progress in modern pharmacological study of radix cyathulaeand Achyranthes bidentata. West China J Pharm Sci. 19(3): 205-207.

In vitro clonal propagation of medicinally important plant Achyranthes bidentata Blume from nodal explants

Nguyen Thi Hong Gam, Bui Van ThangAbstractAchyranthes bidentata Blume belongs to the family Amaranthaceae and are found to possess lots of medicinal properties. A procedure for in vitro clonal propagation of this plant has been developed. The result showed that the optimal method for young shoots sterilization was soaked in 0.1% HgCl2 for 4 minutes. The nodal explants were then grown in vitro on MS medium supplemented with 0.3 mg/l BAP and 30 g/l sucrose, by which the regeneration rate achieved 72.5% after 4 weeks of culture. MS medium supplemented with 0.3 mg/l BAP, 0.1 mg/l kinetin, 0.1 mg/l NAA, and 30 g/l sucrose was the optimal medium for multi-shoot regeneration (95.7% and 12.2 shoots/nodal explant). The percentage of potential shoots (which are more than 2.0 cm in length) was 92.5% after 4 weeks of culture. 94.8% shoots have rooted on MS medium containing 0.3 mg/l IBA, 0.2 mg/l NAA, and 30 g/l sucrose, with the remarkable figures being 7.2 roots/shoot after 3 weeks of culture. The survival rate of plantlets archived 83.3% after transplanting to pots of 75% soil and 25% sand. This procedure can be applied for mass production of A. bidentata for conservation and the development of this medicinal plant.Key words: Achyranthes bidentata Blume, clonal propagation, tissue cultureNgày nhận bài: 12/6/2017Người phản biện: TS. Trần Danh Sửu


35


I. ĐẶT VẤN ĐỀCây mía (Saccharum offcinarum L.) là nguồn

nguyên liệu chính của ngành công nghiệp chế biến đường. Đường mía hiện chiếm trên 60% tổng sản lượng đường thô của toàn thế giới. Ngoài ra, mía còn là nguyên liệu hoặc trực tiếp hoặc gián tiếp của nhiều ngành công nghiệp. Ở Việt Nam, ngành mía đường đã và đang được ưu tiên đầu tư phát triển. Tuy nhiên, một trong những khó khăn cơ bản của ngành mía đường nước ta là các giống mía trồng hiện đang bị suy thoái, giảm năng suất và tăng chi phí thuốc phòng trừ sâu bệnh. Nuôi cấy mô là biện pháp an toàn nhất trong cung cấp giống sạch bệnh, làm phục tráng, trẻ hóa, sạch bệnh, tăng năng suất mía một cách đáng kể so với trồng bằng ngọn (Hoàng Thị Kim Hoa, 2004). Giống mía ROC22 có cây khỏe, cho năng suất cao, có khả năng thích nghi rộng với nhiều loại đất từ đất bãi ven sông đến đất pherarit ở vùng đồi thấp cho đến đất phù sa trong đê. Vì vậy, nó góp phần khai thác tốt hơn tiềm năng đất đai ở nhiều địa phương nhất (Phan Thị Thu Hiền và ctv., 2009).

Tuy nhiên, nhân giống in vitro nói chung vẫn gặp phải thách thức là sự nhiễm nấm và vi khuẩn gây ảnh hưởng lớn tới hiệu suất và chất lượng cây. Hiện nay, người ta thường sử dụng một số chất khử trùng như HgCl2, CaClO2, gây độc hại cho người và các sinh vật khác. Ngoài ra, các hóa chất trên có hiệu quả chưa cao mà còn làm giảm hệ số nhân chồi và mô cấy chậm phát triển (Kharrazi et al., 2011). Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng vật liệu nano mà đặc biệt là nano bạc có khả năng diệt khuẩn một cách hiệu quả, ngoài ra nano bạc còn có tác động tích cực đến quá trình phát sinh hình thái của cây in vitro (Rostami A and Shahsavar A, 2012). Vì vậy, trong báo cáo này, nano

bạc đã được nghiên cứu sử dụng để nâng cao hiệu quả nhân giống mía ROC22.


2.1. Vật liệu nghiên cứu- Giống mía ROC22 (Sacharum officinarum L.)

do Trung tâm khảo kiểm nghiệm giống, sản phẩm cây trồng và phân bón Quốc gia nhập nội và sản xuất thử từ năm 2004.

- Chế phẩm nano bạc kích thước 15 - 20 nm, được điều chế tại Bộ môn Sinh học, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.

2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 7 năm 2016 đến

tháng 5 năm 2017.- Địa điểm nghiên cứu: Phòng Công nghệ sinh

học - Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng và Phát triển Công nghệ sinh học Thanh Hóa.


2.3.1. Khử trùng mẫu tạo vật liệu khởi đầu:- Khử trùng cơ bản: Ngọn mía được cắt bỏ phiến

lá, phần bẹ, lá già, lau sạch bằng cồn etanol 700. Sau đó đưa ngọn vào box vô trùng, tách lấy phần ngọn với lá non.

- Khử trùng mẫu bằng chế phẩm nano: Sử dụng nano bạc với các nồng độ 50; 100; 150; 200 ppm lắc mẫu trong 60 phút. Lô đối chứng là các mẫu được lắc trong dung dịch nước cất vô trùng. Mẫu được nuôi cấy trong môi trường MS* là MS cơ bản (Murashige, T. and Skoog, F., 1962) có thiamin 1 mg/l và 150 ml/l nước dừa và ở thời điểm sau 9 ngày nuôi cấy xác định tỷ lệ mẫu sạch sống, tỷ lệ mẫu sống.

1 Học viện Nông nghiệp Việt Nam2 Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng và Phát triển Công nghệ sinh học Thanh Hóa

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CHẾ PHẨM NANO TRONG NUÔI CẤY MÔ CÂY MÍA (Saccharum offcinarum L.)

Đồng Huy Giới1, Ngô Thị Ánh2

TÓM TẮTNghiên cứu này đã xác định được: (i) 150 ppm nano bạc để khử trùng mẫu Roc 22 với tỷ lệ mẫu sống sạch đạt

trên 75%; (ii) tỷ lệ lớn các mảnh lá in vitro (96,70%) tạo mô sẹo ở môi trường có bổ sung 6 ppm nano bạc và 96,67% mẫu mô sẹo bật chồi trong môi trường bổ sung 4 ppm nano bạc; (iii) Môi trường nhân chồi bổ sung 4 ppm nano bạc cho tỷ lệ tái sinh cũng như chất lượng chồi cấp 1 từ mẫu ngọn mang chồi bên là tốt nhất, 100% mẫu bật chồi; bổ sung 4 ppm nano bạc vào môi trường nhân chồi với hệ số nhân chồi cấp 1 là 15,64 (lần) và 6 ppm vào môi trường nhân chồi từ chồi cấp 2 với hệ số nhân 9,43 (lần); (iv) Môi trường bổ sung 4 ppm nano bạc cho tỷ lệ chồi ra rễ 100%, 14,63 rễ/chồi.

Từ khóa: Giống mía Roc 22, nuôi cấy mô, nano bạc

36


2.3.2. Phương pháp bổ sung dung dịch nano bạc (NS) vào môi trường nuôi cấy mô

- Tạo mô sẹo và tái sinh mô sẹo: Lá non in vitro được cắt thành miếng (1 cm2) và cấy vào môi trường MS* có 2,4D và bổ sung NS 0; 2; 4; 6; 8 hoặc 10 ppm. Sau 4 tuần xác định tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo, đường kính (cm) và đặc điểm mô sẹo.

- Mô sẹo hình thành được cấy vào môi trường MS* có bổ sung BAP và NS với nồng độ 0; 2; 4; 6; 8 hoặc 10 ppm để nghiên cứu ảnh hưởng của NS đến khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo. Mẫu được đánh giá sau 4 tuần trên môi trường nuôi cấy với các chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu bật chồi (%), số chồi/ mẫu và đặc điểm chồi.

- Nhân nhanh in vitro: Các chồi bên, hay chồi cấp 1, 2 được nuôi cấy trên MS* có một số chất kích thích sinh trưởng (tùy thí nghiệm) và NS 0; 2; 4; 6; 8 hoặc 10 ppm. Sau 3 tuần xác định tỷ lệ mẫu bật chồi, chiều cao chồi và đặc điểm chồi.

- Tạo rễ cho chồi in vitro: Tiến hành tách chồi, cắt bớt lá ngọn và bỏ lá già, cấy vào môi trường nền MS*+1 mg/l NAA và bổ sung NS với các nồng độ 0 ppm, 2 ppm, 4 ppm, 6 ppm, 8 ppm, 10 ppm. Sau 3 tuần xác định các chỉ tiêu như tỷ lệ chồi ra rễ, chiều cao trung bình của rễ (cm), số rễ/ chồi.

2.3.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm và phân tích số liệu

- Điều kiện thí nghiệm: Các môi trường nuôi cấy MS* là môi trường MS có bổ sung 6,3 g/l agar, 30 g/l

sucrose (thí nghiệm ra rễ bổ sung 60 g/l), 150 ml/l nước dừa, 1 mg/l thiamin, pH 5,7 - 5,8; khử trùng ở 121OC, 1,1 atm, 20 phút. Các mẫu nuôi cấy in vitro trong phòng được duy trì ở điều kiện: 25 ± 2°C, ánh sáng 2500 lux, 14 - 16 giờ/ngày (trừ thí nghiệm tạo mô sẹo, điều kiện tối hoàn toàn). Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 3 lần nhắc lại, mỗi lần 30 mẫu/công thức.

- Phân tích số liệu: Các số liệu được xử lý theo chương trình IRRISTAT 5.0.


3.1. Ảnh hưởng của hỗn hợp nano bạc (NS) đến hiệu quả khử trùng mẫu

Mẫu sau khi được xử lý trong dung dịch NS 60 phút được cấy trong MS*. Sau 9 ngày, kết quả thu được thể hiện ở bảng 1. Ở CT0 tỷ lệ mẫu sạch thấp (25,00% ở chồi bên và 58,30% ở lá non). Khi sử dụng NS để khử trùng thì tỷ lệ mẫu sạch tăng dần theo nồng độ của NS. CT3 (NS 150 ppm) được cho là tốt nhất, vì tỷ lệ mẫu sạch cao và cho tỷ lệ mẫu sống sạch cũng cao nhất. Khi tăng nồng độ NS lên thì tỷ lệ nhiễm giảm hẳn, tuy nhiên một số mẫu có hiện tượng đen và chết. Kết quả này gần giống với công bố của Shokri et al. (2014) sử dụng NS ở 200 ppm để xử lí cho chồi mang mắt ngủ Rosa hybrida L., cho tỷ lệ mẫu sống sạch là 80%. Nasser et al. (2013) cũng đã nghiên cứu cho thấy hiệu quả của NS trong khử trùng hạt Arabidopsis và lá cà chua, khoai ở nồng độ thấp (100 ppm).

3.2. Ảnh hưởng của nano bạc (NS) đến sự tạo mô sẹo và tái sinh chồi từ mô sẹo

Thí nghiệm khảo sát đã xác định 2,5 mg/l 2,4-D kích thích tạo mô sẹo từ mẫu cấy lá non nghiên cứu, tuy nhiên hiệu quả không cao (khoảng 82%). Mặc dù công bố của Behera K. K. và S. Sahoo (2009) với

mía S. officinarum L. cv - Nayana cho rằng, với 2,5 mg/l 2,4-D cho tỷ lệ mô sẹo 100%, chất lượng mô sẹo tốt. Kết quả sau 4 tuần nuôi thể hiện (bảng 2) cho thấy: 2,4-D kết hợp với nano bạc ảnh hưởng đáng kể đến sự phát sinh mô sẹo của lá in vitro. Khi tăng NS mô sẹo bị ức chế (ở 10 ppm NS). Sau 4 tuần theo

Bảng 1. Hiệu quả khử trùng của nano bạc (NS) đến mẫu mía

Ghi chú: Bảng 1, 2, 3, 4, 5, 6: Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa 95%.

Công thức Nano bạc (ppm)

Chồi bên Lá non Tỷ lệ mẫu sạch

(%) Tỷ lệ mẫu

sống sạch (%) Tỷ lệ mẫu sạch

(%) Tỷ lệ mẫu

sống sạch (%)CT0 0 25,0 ±0,43e 23,3±0,43d 58,3±0,49e 58,3±0,49e

CT1 50 46,7± 0,50d 43,3±0,50c 68,3±0,48d 68,3±0,48d

CT2 100 48,3± 0,50c 46,7±0,50 b 73,3±0,45c 73,3±0,45bc

CT3 150 76,7± 0,42b 76,7±0,42a 75,0±0,44b 75,0±0,44a

CT4 200 80,0± 0,40a 76,7±0,42a 78,3±0,42a 73,3±0,42c

LSD0,05 6,9 9,7 4,9 11,9CV(%) 3,30 4,90 1,80 4,50

37


dõi, mẫu ở môi trường có 6 ppm NS thì 96,70% mẫu tạo mô sẹo và kích thước mô sẹo lớn nhất (3,80 cm). Ewais et al. (2015) đã chỉ ra ảnh hưởng của các hạt NS đến mô sẹo của Solanumnigrum. Khi chưa tiếp xúc với NS thì mô sẹo nhỏ, màu trắng và màu xanh lá cây, làm tăng kích thước và thay đổi hình thái mô sẹo. Đặc biệt, khi bổ sung 8 ppm NS là tốt nhất, tỷ lệ mô sẹo cao (89%), chất lượng mô sẹo tốt, thời gian xuất hiện mô sẹo sớm (10 ngày sau khi nuôi cấy).

Bảng 2. Ảnh hưởng của nano bạc (NS) đến khả năng hình thành mô sẹo từ lá non

Ghi chú: Môi trường nền MS* + 2,5 mg/l 2,4-D.

Các mô sẹo được nghiên cứu tái sinh chồi trên môi trường bổ sung 0,2 mg/l kinetine và BA ở nồng độ 1,5 mg/l (Hà Thị Thúy và ctv., 2013) và bổ sung NS nồng độ khác nhau. Sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả (bảng 3) cho thấy, ở môi trường có NS, tỷ lệ mẫu tái sinh chồi, số chồi/mẫu, chất lượng chồi tốt hơn nhiều. Ở nồng độ NS 4 ppm cho kết quả tốt nhất, tỷ lệ mẫu bật chồi 96,67%, số chồi/ mẫu 161,33, chồi cao và mập. Song, ở NS trên 8 ppm, sự tạo chồi có hiện tượng giảm dần và bị ức chế.

Bảng 3. Ảnh hưởng của nano bạc (NS) đến khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo

Ghi chú: Môi trường nền: MS* +1,5 mg/l BA + 0,2 mg/l kinetine.

Hình 1. Mô sẹo hình thành từ lá non ở môi trường có lượng nano bạc khác nhau0 ppm NS 2 ppm NS 4 ppm NS 6 ppm NS 8 ppm NS 10 ppm NS

Hình 2. Ảnh hưởng của nano bạc đến khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo0 ppm NS 2 ppm NS 4 ppm NS 6 ppm NS 8 ppm NS 10 ppm NS

Công thức

NS (ppm)

Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo

(%)

Đường kính mô sẹo (cm)

Đặc điểm mô sẹo

CT0 0 83,30±0,38e 3,13±0,28d Trắng, chắcCT1 2 83,30±0,38e 3,13± 0,27cd Trắng, chắcCT2 4 88,30±0,32c 3,30±0,22 b Trắng, chắcCT3 6 96,70±0,18a 3,80±0,16 a Trắng, xốp

CT4 8 91,70±0,28b 2,23±0,15e Trắng, xốp, 1số nâu hóa

CT5 10 83,30±0,38de 1,53±0,14f Trắng, xốp, 1số nâu hóa

LSD0,05 12,0 0,24CV(%) 3,50 4,7

Công thức

Nano bạc

(ppm)

Tỷ lệ mẫu bật chồi

(%)

Chồi/mẫu (chồi)

Đặc điểm chồi

CT0 0 93,31±0,25bc 134,65±2,76b Cao, mậpCT1 2 93,33±0,50c 80,00±5,40de Cao, mậpCT2 4 96,67±0,18a 161,33±4,34a Cao, mậpCT3 6 91,67±0,28 d 117,67±1,56c Cao, mậpCT4 8 86,67±0,34e 78,67±1,82e Cao, nhỏCT5 10 81,67±0,39f 65,33±3,63f Cao, nhỏ

LSD0,05 9,2 4,49 CV(%) 2,8 2,3

3.3. Ảnh hưởng của nano bạc (NS) đến khả năng tái sinh chồi in vitro

Thí nghiệm khảo sát cho thấy, ở MS* + 0,5 mg/l BA cho tỷ lệ bật chồi khá cao, tuy nhiên chồi không mập. Thân Thị Thu Hạnh và Lưu Thị Duyên (2003) nghiên cứu trên mía VN84-422 và VN85-1427 cũng cho rằng, tỷ lệ mẫu bật chồi cao nhất là 48,33% ở MS + 0,5 mg/l BA. Sau 3 tuần nuôi cấy, ở môi trường có NS (bảng 4), tỷ lệ mẫu bật chồi cũng như chất

lượng chồi cao tỷ lệ mẫu bật chồi 100%, chồi cao 10,3 cm, mập. Hediat M và H. Salama (2012) cũng sử dụng NS cho thấy, từ NS 2 - 6 ppm làm tăng chiều dài chồi, diện tích bề mặt lá, hàm lượng protein và cacborhydrat, nhưng ở NS 4 - 6 ppm làm tăng tuổi thọ của cành và gốc lạc và ngô nuôi cấy mô. Tuy nhiên, NS cao (ở 8 - 10 ppm) đã ức chế khả năng tái sinh chồi.

38


Bảng 4. Ảnh hưởng của nano bạc (NS) đến sự tạo chồi in vitro từ chồi bên

Ghi chú: Môi trường nền MS* + 0,5 mg/l BA

Các chồi in vitro trên được cấy trong MS* +1,5 mg/l BA +0,2 mg/l kinetine (kết quả thí nghiệm khảo sát) có bổ sung NS. Kết quả (bảng 5) sau 3 tuần cho thấy, đối với chồi cấp 1, CT2 (4 ppm) 100% mẫu bật chồi, hệ số nhân lớn nhất (15,64 lần), chất lượng chồi tốt, cao và mập. Tuy nhiên khi nồng độ NS từ 6 ppm thì khả năng nhân chồi giảm, và bị giảm mạnh ở 10 ppm. Điều này gần giống với công bố của A. Rostami and A. Shahsavar (2009); Nabeel K. Al-Ani (2011) nuôi cấy đoạn cành ô liu và cây lá máu ở MS có 4 ppm NS thì có hệ số nhân cao nhất.

Công thức

NS (ppm)

Tỷ lệ mẫu bật chồi

(%)

Chiều cao chồi (cm)

Chất lượng chồi

CT0 0 90,00±0,30 bc 8,17±0,20bc NhỏCT1 2 100,00±0,00a 8,17±0,29 c MậpCT2 4 100,00±0,00 a 10,03±0,43 a MậpCT3 6 100,00±0,00 a 7,20 ±0,33d MâpCT4 8 90,00±0,30 c 6,13±0,38 e MậpCT5 10 86,67±0,34d 3,20± 0,32f Mập

LSD0,05 14,7 0,47CV(%) 4,3 3,6

Công thức NS (ppm)

Nhân chồi từ chồi cấp 1 Nhân chồi từ chồi cấp 2

Tỷ lệ mẫu bật chồi (%)

Hệ số nhân chồi (lần)

Hệ số nhân chồi (lần)

Chiều cao chồi (cm) Đặc điểm chồi

CT0 0 98,30±0,23bc 5,79± 0,96e 8,39±1,04cd 11,70 ±1,20e Mập, mềmCT1 2 98,33±0,13c 8,76±1,06d 8,40± 0,89cd 11,63±1,13e Mập, mềmCT2 4 100,00± 0,00a 15,64±1.31a 8,53±0,79bc 12,40± 1.04d Mập, mềmCT3 6 100,00±0,00a 9,58±1,01cd 9,43±0,98 a 13,07±0,88 c Mập, cứngCT4 8 91,67±0,28d 9,61±1,00bcd 5,80±0,89 e 14,10±0,99a Nhỏ, cứngCT5 10 86,67±0,13e 5,42±1,03e 5,77±0,96 f 13,43±0,98 bc Nhỏ, cứng

LSD0,05 9,4 1,49 0,23 0,52CV(%) 2,7 1,5 2,0 2,3

Hình 4. Ảnh hưởng của nano bạc (NS) đến khả năng tái sinh chồi

Bảng 5. Ảnh hưởng của với nano bạc (NS) đến khả năng nhân chồi in vitro

Ghi chú: Môi trường nền MS* +1,5 mg/l BA+ 0,2 mg/l kinetine.

0 ppm NS 2 ppm NS 4 ppm NS 6 ppm NS 8 ppm NS 10 ppm NS

Hình 5. Ảnh hưởng của nano bạc (NS) đến khả năng nhân chồi từ chồi cấp 1 0 ppm NS 2 ppm NS 4 ppm NS 6 ppm NS 8 ppm NS 10 ppm NS

Môi trường MS* + 1,5 mg/l BA + 0,2 mg/l Ki cũng là kết quả nhân chồi tốt nhất của thí nghiệm khảo sát cho nuôi cấy các chồi in vitro cấp 2. Hệ số

nhân chồi cấp 2 đạt tốt nhất ở công thức bổ sung 6ppm NS (9,43 lần), cao hơn so với đối chứng (8,39 lần).

39


3.4. Ảnh hưởng của nano bạc (NS) đến khả năng ra rễ của chồi

Mặc dù Hà Thị Thúy và cs., (2013) cho rằng, nồng độ NAA thích hợp nhất cho quá trình hình thành rễ là 0,5 mg/l khi đó tỷ lệ mẫu ra rễ là 94,5% ở giống ROC26 và 97,3% ở giống BH1; Behera K. K and S. Sahoo (2009) cho rằng, sử dụng 2,5 mg/l NAA cho khả năng hình thành rễ của giống mía Saccharum officinarum L. cv-Nayana là tốt nhất với tỷ lệ mẫu ra rễ 85%, số rễ/chồi 11,2 (rễ), chiều dài rễ (4,0 cm); theo kết quả khảo sát, môi trường bổ sung 1mg/l NAA cho khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh từ chồi cấp 2 là thích hợp nhất. Hơn nữa, nhằm xác định được độ NAA kết hợp NS thích hợp nhất đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh từ chồi cấp 2. Các chồi cấp 2 được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung 1 mg/l NAA kết hợp với NS, theo dõi sau 3 tuần thu

được kết quả thể hiện ở bảng 6. Kết quả cho thấy: Sau 8 ngày rễ mới bắt đầu xuất hiện ở CT0 khi chưa bổ sung nano bạc (đối chứng), còn sau 5 ngày tất cả các thí nghiệm NAA kết hợp với nano đều xuất hiện rễ, điều này chứng tỏ rằng NS có khả năng kích thích sự hình thành rễ sớm. Sau 3 tuần, khả năng ra rễ của chồi đã khác nhau rõ rệt ở các công thức.. CT2 cho kết quả tốt nhất, với tỷ lệ chồi ra rễ 100%, rễ nhiều và dài, mập và cứng hơn so với các nồng độ nano bổ sung khác và so với đối chứng (tỷ lệ chồi ra rễ 98,31%), số rễ ít và chiều dài ngắn hơn. Theo công bố của Rostami A. and A. Shahsavar (2009) đối với chồi ô liu, hệ số rễ được cải thiện khi nồng độ NS tăng, hệ số cao nhất là 0,97 (lần) khi nuôi cấy trong môi trường bổ sung 8 ppm NS. Như vậy, mỗi loài khác nhau thì sự ảnh hưởng của nano bạc đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh là khác nhau.

Hình 6. Ảnh hưởng của nano bạc đến khả năng nhân nhanh chồi từ chồi cấp 2

Bảng 6. Ảnh hưởng của nano bạc (NS) đến khả năng ra rễ của chồi cấp 2

Ghi chú: Môi trường nền MS* + 1 mg/l NAA.

0 ppm NS 2 ppm NS 4 ppm NS 6 ppm NS 8 ppm NS 10 ppm NS

Công thức Nano bạc (ppm)

Tỷ lệ chồi ra rễ (%)

Số rễ/ chồi (rễ)

Chiều dài rễ (cm) Đặc điểm rễ

CT0 0 98,31±0,13b 12,35±0,86d 3,68±0,68cd Mập, khỏe CT1 2 95,00±0,22c 15,20±1,32a 4,10±0,60b Mập, cứng, khỏe CT2 4 100,00±0,00a 14,63±0,80b 4,23±1,06a Mập, cứng, khỏe CT3 6 90,00±0,30e 13,20±1,03c 3,47±1,02de Nhỏ, cứng, khỏe CT4 8 90,00±0,30e 10,53±1,74e 3,27±0,64e Nhỏ, cứng, khỏe CT5 10 78,33±0,42f 8,27±0,90f 2,83±0,71f Nhỏ, mềm, yếu,

LSD0,05 2,6 0,31 1,47CV(%) 3,9 1,4 4,4

Hình 7. Ảnh hưởng nano bạc (NS) đến khả năng ra rễ của chồi in vitro0 ppm NS 2 ppm NS 4 ppm NS 6 ppm NS 8 ppm NS 10 ppm NS

40


IV. KẾT LUẬN - Nồng độ nano bạc thích hợp nhất cho khử trùng

mẫu mía là 150 ppm tỷ lệ mẫu sống sạch ở chồi bên là 76,70% và ở lá non là 75%.

- Bổ sung 6 ppm NS vào môi trường nuôi cấy đã kích thích quá trình tạo mô sẹo cũng như chất lượng mô sẹo tốt nhất. Môi trường bổ sung 4 ppm nano bạc cho tỷ lệ mẫu bật chồi từ mô sẹo cao (96,67%), chồi, mập, khỏe.

- Môi trường bổ sung 4 ppm nano bạc là thích hợp nhất cho việc tái sinh chồi từ chồi cấp 1, với tỷ lệ mẫu bật chồi 100,00%; hệ số nhân 15,64 lần và chất lượng chồi tốt. Môi trường bổ sung 6 ppm nano bạc là tốt nhất cho sự nhân chồi từ chồi cấp 2 với hệ số nhân 9,43 lần, chồi mập, cứng khỏe.

- Môi trường bổ sung 4 ppm nano bạc thích hợp nhất đến khả năng ra rễ của chồi cấp 2 (cho tỷ lệ chồi ra rễ 100%), số rễ/chồi là 14,63 (rễ), đồng thời rễ mập, khỏe.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Thân Thị Thu Hạnh, Lưu Thị Hồng Duyên, 2003.

Nghiên cứu kĩ thuật nhân nhanh giống mía VN84-422, VN85-1427 bằng phương pháp in vitro. Tuyển tập kết quả nghiên cứu khoa học 1997 - 2007. Viện Nghiên cứu Mía đường, Bến Cát, 1-50.

Phan Thị Thu Hiền, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà, 2009. Quy trình nhân nhanh giống mía ROC22 (Saccharum officinarum L.) từ đỉnh sinh trưởng và chồi nách. Tạp chí Khoa học, Trường ĐHSP Hà Nội 2, Vol 35: 62-71.

Hoàng Thị Kim Hoa, 2004. Ứng dụng công nghệ sinh học trong vi nhân nhanh giống cây trồng và chế biến bảo quản quả. Hội nghị tổng kết hoạt động KHCN giai đoạn 1996-2001, Viện Nghiên cứu ứng dụng công nghệ: 156-176.

Hà Thị Thúy, Trần Thị Hạnh, Vũ Anh Tuấn, Đỗ Năng Vịnh, 2013. Nghiên cứu xây dựng và phát triển quy trình sản xuất giống mía sạch bệnh theo quy mô

công nghiệp bằng công nghệ tế bào. Viện KHNN Việt Nam. Hội thảo Quốc gia về khoa học cây trồng lần thứ nhất, 839-847.

Behera K. K and S. Sahoo, 2009. Rapid in vitro Micro propagation of Sugarcane (Saccharum officinarum L. cv-Nayana) Through Callus Culture. Nature and Science, Vol. 7, No. 4: 1-10.

Ewais E. A., S. A. Desouky and E. H. Elshazly, 2015. Evaluation of Callus Responses of Solanum nigrum L. Exposed to Biologically Synthesized Silver Nanoparticles. Scientific and academic publising, Vol. 5, No. 3: 45-56.

Kharrazi M., Nemati H., Tehranifar A., Bagheri A. and Sharifi A., 2011. In vitro culture of Carnation (Dianthus caryophyllus L.) Focusing on the Problem of Vitrification. J. Biol. Environ Sci, Vol. 13:1-6.

Hediat M. and H. Salama, 2012. Effects of silver nanoparticles in some crop plants. Common bean (Phaseolus vulgaris L.) and corn (Zea mays L.). International research journals of Biotechnology. Vol. 3, No.10: 190-197

Murashige T. and F. Skoog, 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, Vol 15: 473-497.

Nabeel K.Al-Ani, 2011. Using Silver Nano- Particles to Increase Efficiency Of Sterile Solution for in vitro Techniques. Iraqi Journal of Cancer and Medical Genetics, Vol. 4, No. 1: 48- 51.

Nasser M., Z. V. Sepideh and K. Sajjad, 2013. Plant In vitro Culture goes Nano: Nanosilver-Mediated Decontamination of Ex vitro Explants. Journal of Nanomedicine & Nanotechnology, Vol. 4, No. 2: 1-4.

Rostami A.A. and A. Shahsavar, 2009. Nano-Silver Particles Eliminate the in vitro Contaminations of Olive ‘Mission’ Explants. Journal of Plant Sciences, Vol. 8, No. 7: 505-509.

Shokri, A. Babaei, M. Ahmadian, M.M. Arab, S. Hessami, 2015. The effects of different concentrations of nano - silver on elimination of bacterial contaminations and phenolic exudation of rose (Rosa hybrida L.) in vitro culture. International Society for Horticultural Science.Vol. 3, No.1: 50-54.

Research on the use of nanosilver in sugarcane (Sacchrum offcinarum L.) tissue culture

Dong Huy Gioi, Ngo Thi Anh AbstractThis study identified: (i) 150 ppm of silvernano solution was the best treatment for sterilization the Sugar cane explants that made more than 75% samples clean and survival; (ii) The formation of callus from the young leaf piece of sugarcane were best in medium 6 ppm nanosilver (96,7% samples forming callus). The shotting medium supplementated with 4 ppm nanosilver was the best medium for the formation of shoots from sugarcane callus; (iii) The concentration of 4 ppm nanosilver was also the best for for shoot micropagating from lateral bud in the shooting medium (100% samples appreared shoots). The best concentration of nanosilver for micropagating from in vitro primary shoot was 4 ppm added to invitro shooting medium (the coefficient were 15.64 times), and the best concentration of nanosilver for micropagating from in vitro secondary shoot was 6 ppm added to the shooting medium (the coefficient were 9.43 times); (iv) The medium supplementation with 4 ppm nanosilver was the best medium for rooting of in vitro shoots with 100%.Key words: Sugar cane variety Roc22, tissue culture, silver nanoNgày nhận bài: 19/5/2017Người phản biện: TS. Trần Danh Sửu


41


1 Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp Việt Nam

I. ĐẶT VẤN ĐỀGõ đỏ (Cà te, Gõ cà te) có tên khoa học là Afzelia

xylocarpa Craib thuộc họ Đậu (Fabaceae), họ phụ Vang (Caesalpinoideae) (Nguyễn Hoàng Nghĩa và cộng sự, 2007), là loài cây gỗ lớn, cao tới 30 m và đường kính đạt tới 80 - 100 cm. Cây sống trong rừng nhiệt đới thường xanh hay nửa rụng lá, có phân bố ở Kon Tum, Gia Lai, Đắc Lắk, Khánh Hoà và các tỉnh vùng Đông Nam bộ. Phân bố không tập trung mà gặp như các cây cá thể rải rác cùng các loài cây khác trong rừng (Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1999). Cây sống trong rừng kín lá rộng thường xanh hay nửa rụng lá mưa ẩm hoặc hơi khô nhiệt đới núi thấp, phân bố ở Việt Nam (Kon Tum, Gia Lai, Đắc Lắk, Khánh Hoà và các tỉnh vùng Đông Nam bộ), Lào (Bolykhămxay, Thủ đô Viên Chăn), Thái Lan và Myanma (Nguyen Duc Thanh et al., 2012; Nguyễn Đức Thành, 2016).

Theo sách Đỏ Việt Nam (2007), Gõ đỏ thuộc phân hạng EN A1c,d. Gỗ Gõ đỏ rất được ưa chuộng trên thị trường như dựng nhà cửa và các đồ nội thất, đồ thủ công mỹ nghệ chất lượng cao (Nguyễn Đức Thành, 2016). Hiện số lượng cá thể trưởng thành của loài trong tổ thành rừng tự nhiên là rất thấp, đang bị suy giảm nghiêm trọng nguồn gen cây bản địa có giá trị cao.

Hiện nay, những tài liệu nghiên cứu về cây Gõ đỏ còn hạn chế, chủ yếu mới tập trung mô tả về đặc điểm hình thái và sinh thái của cây, chưa đi sâu nghiên cứu về kỹ thuật nhân giống, ươm trồng. Đối với nhân giống Gõ đỏ rất cần thiết vì thiếu nguồn giống do cây phân bố rải rác (Sounthone Douangmala và cộng sự, 2016), chu kỳ quả không ổn định nên hạn chế hạt giống. Để nâng cao hiệu quả cho nhân giống cây này, nghiên cứu một số nhân tố ảnh hưởng đến sinh trưởng Gõ đỏ trong giai đoạn vườn ươm được tiến hành nhằm xây dựng cơ sở khoa học áp dụng

vào thực tiễn phục vụ công tác bảo tồn và phát triển nguồn gen quý.


2.1. Vật liệu nghiên cứuSử dụng túi bầu polyetylen cỡ 10 × 15 cm, hỗn

hợp ruột bầu gồm 95% đất tầng B dưới tán rừng tự nhiên kết hợp với 5% phân chuồng hoai và 1% sufe lân Lâm Thao. Hạt giống Gõ đỏ (nguồn từ Cộng hòa Dân chủ Nhân dân Lào) đã xử lý nứt nanh, mỗi bầu gieo 1 hạt. Phân chuồng hoai ngâm nước, phân NPK tỷ lệ 5 : 10 : 3. Dung dịch benlat 0,5% để xử lý nấm.


2.2.1. Phương pháp nghiên cứu chungBố trí thí nghiệm theo phương pháp sinh thái

thực nghiệm, lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại có dung lượng mẫu lớn (n = 36), số liệu thu thập sau 3 tháng.

Đánh giá chất lượng cây bằng phương pháp cho điểm dựa vào các tiêu chí như: chiều cao, đường kính gốc, số lóng, tái sinh cành, còn hoặc mất ngọn.

2.2.2. Bố trí thí nghiệm- Thí nghiệm 1. Ảnh hưởng của chế độ che sáng

đến tỷ lệ sống, sinh trưởngThí nghiệm được bố trí với 3 công thức che sáng

khác nhau là: CS1 che sáng 25%; CS2 che sáng 50%; CS3 che sáng 75% và 1 công thức đối chứng (ĐC) không che sáng. Dàn che ánh sáng bằng phên nứa đan với khoảng cách và kích thước của các nan nứa trên phên được tính toán theo công thức thực nghiệm của Nguyễn Hữu Thước và cộng sự (1966).

- Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của phân bón NPK đến tỷ lệ sống, sinh trưởng

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ÁNH SÁNG VÀ PHÂN BÓN NPK ĐẾN SINH TRƯỞNG CỦA GÕ ĐỎ (Afzelia xylocarpa Craib) GIAI ĐOẠN VƯỜN ƯƠM

Nguyễn Văn Việt1, Hà Thanh Tùng1

TÓM TẮTBài báo trình bày một số kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ chiếu sáng và phân bón đến sinh trưởng của

cây Gõ đỏ (Afzelia xylocarpa Craib) trong giai đoạn vườn ươm. Kết quả cho thấy trong giai đoạn 3 tháng tuổi kể từ khi gieo ươm, che sáng 50% là phù hợp, tỷ lệ sống và khả năng sinh trưởng về chiều cao đạt 96,17%; 44,78 cm. Bón thúc bằng cách tưới phân NPK (5 : 10 : 3) hoà tan trong nước với nồng độ 3% cho tỷ lệ sống, khả năng sinh trưởng về đường kính gốc và chiều cao của cây con Gõ đỏ đạt được lần lượt là 94,33%; 1,07 cm và 45,31 cm. Đánh giá sinh trưởng cây Gõ đỏ giai đoạn vườn ươm nhằm cung cấp cơ sở khoa học để phục vụ sản xuất cây giống trong bảo tồn và phát triển nguồn gen quý.

Từ khóa: Afzelia xylocarpa Craib, Gõ đỏ, che sáng, sinh trưởng, Doo, Hvn

42


Bảng 1. Ảnh hưởng của ánh sáng đến tỷ lệ sống, sinh trưởng của Gõ đỏ

Phân NPK tỷ lệ 5 : 10 : 3 hoà tan trong nước với nồng độ 1 - 3%, tưới vào lần tưới cuối cùng trong ngày khi kiểm tra thấy cây con đã có lá thật (sau cấy 15 - 20 ngày) và bón định kỳ 7 ngày một lần cho đến khi kết thúc thí nghiệm (sau 90 ngày). Các công thức cụ thể như sau: ĐC: không bón phân; BP1: nồng độ 1% (20 g NPK/2lít/100bầu); BP2: nồng độ 2% (40 g NPK/2lít/100bầu); BP3: nồng độ 3% (60 g NPK/2lít/100bầu).

2.2.3. Phương pháp xử lý số liệuXử lý số liệu theo phương pháp thống kê sinh học

ứng dụng các phần mềm đã lập trình trên máy tính điện tử như Excel và SPSS (Nguyễn Hải Tuất và các cộng sự, 2005 và 2006).

2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứuNghiên cứu được thực hiện tại Vườn ươm của

Viện Công nghệ sinh học, Trường Đại học Lâm nghiệp từ tháng 2 đến tháng 6 năm 2016.

III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Ảnh hưởng của ánh sáng đến tỷ lệ sống, sinh trưởng của Gõ đỏ

Tỷ lệ sống (TLS) và khả năng sinh trưởng của cây con là hai chỉ tiêu quan trọng để đánh giá mức độ thích hợp với điều kiện ngoại cảnh cũng như tác động của các biện pháp kỹ thuật. Che sáng là một trong những biện pháp kỹ thuật lâm sinh có ảnh hưởng rất lớn đến tỷ lệ sống cũng như khả năng sinh trưởng của cây con trong giai đoạn vườn ươm nói riêng và cây trồng nói chung. Kết quả theo dõi về tỷ lệ sống và khả năng sinh trưởng (D00, Hvn) của cây con Gõ đỏ sau 3 tháng tuổi được thể hiện ở bảng 1.

Từ kết quả ở bảng 1 cho thấy, ở tất cả các công thức thí nghiệm, tỷ lệ sống của cây con Gõ đỏ sau 3 tháng thí nghiệm ít có sự thay đổi (Sigtls = 0,522 > 0,05), giá trị trung bình về tỷ lệ sống đạt 88,76% - 96,17%. Trong đó tỷ lệ sống trung bình cao nhất ở CS2 đạt 96,17%, thấp nhất ở ĐC đạt 88,76%.

Sinh trưởng đường kính gốc có xu hướng tăng dần từ công thức đối chứng đến công thức CS2 (che 50%), tuy vậy đến công thức CS3 (che 75%) đường kính gốc có xu hướng giảm, đường kính gốc đạt giá trị trung bình ở các nghiệm thức từ 0,95 đến 1,30 cm. Cao nhất là ở công thức che sáng CS2 (che 50 %) và thấp nhất là ở công thức không che sáng. Sai tiêu chuẩn trung bình đạt được là từ 0,03 đến 0,33 cm.

Kết quả xử lý thống kê cũng cho thấy SigDoo = 0,0001 < 0,05 nghĩa là chế độ che sáng khác nhau ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng về đường kính gốc cây Gõ đỏ.

Về chỉ tiêu chiều cao vút ngọn, kết quả (bảng 1) cho thấy, ở tất cả các công thức thí nghiệm, sinh trưởng về chiều cao vút ngọn có có sự khác nhau rõ rệt, giá trị chiều cao cũng có xu hướng tăng dần từ công thức không che sáng đến công thức CS2 (che 50%), giảm ở CS3 (che 75%), chiều cao vút ngọn trung bình đạt được từ 41,06 đến 44,78 cm. Cao nhất là ở công thức CS2 (che sáng 50%) và thấp nhất là ở công thức chỉ có ĐC. Sai tiêu chuẩn trung bình đạt được là từ 0,44 đến 0,63 cm. Từ các kết quả trên có thể nói mặc dù Gõ đỏ là loài cây ưa sáng nhưng ở

CTTN Lần lặp TLS (%)

Doo(cm)

Sd (cm)

Hvn(cm)

Sh (cm)

ĐC1 87,98 0,98 0,04 40,28 0,692 89,11 0,97 0,05 41,41 0,603 89,20 0,90 0,04 41,49 0,61

CS1

1 95,41 1,01 0,04 43,81 0,492 97,21 1,07 0,04 43,58 0,613 95,48 1,08 0,04 43,95 0,48

CS2

1 97,21 1,33 0,33 45,39 0,582 95,17 1,33 0,32 44,68 0,633 96,13 1,25 0,33 44,28 0,55

CS3

1 91,67 1,03 0,03 43,62 0,412 94,75 1,04 0,04 43,80 0,433 93,58 1,04 0,04 44,01 0,48

Sig 0,522 0,0001 0,0001

43


giai đoạn vườn ươm thì yêu cầu về ánh sáng chỉ ở mức trung bình. Kết quả kiểm tra thống kê cho thấy SigHvn = 0,0001 < 0,05 chứng tỏ công thức che sáng khác nhau ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng chiều cao vút ngọn của cây Gõ đỏ giai đoạn vườn ươm.

3.2. Ảnh hưởng của ánh sáng đến chất lượng cây con

Chất lượng cây con là một tiêu chí quan trọng đánh giá hiệu quả của việc nhân giống cây Gõ đỏ tại vườn ươm. Để so sánh về chất lượng cây con ở các công thức thí nghiệm, tiến hành tổng hợp và tính toán và xử lý thống kê. Kết quả được thể hiện ở bảng 2.

Bảng 2. Chất lượng cây con ở các công thức thí nghiệm

Kết quả bảng 2 cho thấy tỷ lệ cây tốt, trung bình (TB) và cây xấu ở các công thức thí nghiệm có sự sai khác rõ rệt, cây tốt ở các công thức đạt giá trị từ 41,67% đến 50%, cây trung bình 20,37 - 40,74%, cây xấu 17,59 - 29,62%. Kết quả xử lý thống kê cũng cho

thấy Sig = 0,001 < 0,05, như vậy có thể nói chế độ che sáng ảnh hưởng rõ rệt đến chất lượng cây giống Gõ đỏ trong giai đoạn vườn ươm.

3.3. Ảnh hưởng của phân bón đến tỷ lệ sống, sinh trưởng của Gõ đỏ

Phân bón là nhân tố dinh dưỡng quan trọng quyết định đến sinh trưởng và phát triển của cây trồng, ngay cả đối với cây con trong giai đoạn vườn ươm. Trong nghiên cứu này, bố trí thí nghiệm với 3 công thức bón phân và 1 công thức đối chứng không bón phân.

Sau 3 tháng thí nghiệm, thu được kết quả về tỷ lệ sống, sinh trưởng đường kính gốc, chiều cao vút ngọn trình bày ở bảng 3. Kết quả cho thấy (bảng 3) tỷ lệ sống của cây Gõ đỏ ở các công thức bón phân có sự khác nhau không rõ rệt (Sigtls = 0,867 > 0,05), tỷ lệ sống ở các công thức thí nghiệm đạt 91,53 - 94,33%, ở công thức đối chứng tỷ lệ sống thấp nhất đạt 87,78%.

Đường kính gốc đạt giá trị trung bình từ 0,84 đến 1,07 cm, cho kết quả cao nhất là ở công thức PB3 (60g NPK / 2 lít / 100 bầu) và thấp nhất là ở công thức PB1 (20g NPK/2 lít nước/100 bầu). Kết quả xử lý thống kê cho thấy SigDoo = 0,0001 < 0,05, như vậy công thức bón phân khác nhau ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng đường kính gốc Gõ đỏ.

Bảng 3. Ảnh hưởng của phân bón đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của Gõ đỏ

CTTNTốt TB Xấu

n % n % n %ĐC 29 26,85 50 46,30 29 26,85CS1 54 50,00 22 20,37 32 29,63CS2 48 44,44 34 31,48 26 24,07CS3 45 41,67 44 40,74 19 17,59

Sig = 0,001

Sinh trưởng chiều cao ở tất cả các nghiệm thức trong nghiên cứu này có xu hướng tăng theo chiều tỷ lệ thuận với lượng phân bón, chiều cao vút ngọn

trung bình đạt được từ 42,19 đến 45,31 cm. Có giá trị cao nhất ở công thức BP3 (60 g NPK/2 lít/100 bầu) và thấp nhất là ở công thức PB1 (20 g NPK/2 lít

CTTN Lần lặp TLS (%)

Doo(cm)

Sd (cm)

Hvn(cm)

Sh (cm)

ĐC1 86,69 0,83 0,04 42,18 0,542 86,87 0,82 0,04 42,22 0,543 89,78 0,87 0,04 42,17 0,51

PB1

1 92,89 0,96 0,04 43,06 0,522 90,45 0,93 0,03 43,57 0,513 93,16 0,97 0,04 44,45 0,54

PB2

1 92,11 0,99 0,04 44,38 0,422 94,21 1,04 0,04 43,90 0,423 93,69 1,06 0,04 43,86 0,43

PB3

1 90,11 1,07 0,03 45,96 0,532 91,20 1,06 0,04 44,08 0,483 93,29 1,09 0,03 45,90 0,57

Sig 0,867 0,0001 0,003

44


/100 bầu). Sai tiêu chuẩn trung bình đạt được là từ 0,42 đến 0,57 cm. Kết quả kiểm tra thống kê cho thấy SigHvn = 0,003 < 0,05 như vậy có thể kết luận công thức bón phân ảnh hưởng rõ rệt đến chiều cao cây Gõ đỏ giai đoạn vườn ươm.

IV. KẾT LUẬN- Che ánh sáng 50% cho cây Gõ đỏ sẽ ảnh hưởng

tốt nhất đến sinh trưởng về đường kính cũng như là chiều cao và phẩm chất của cây con ở giai đoạn vườn ươm. Tỷ lệ sống, giá trị đường kính gốc (D00) và chiều cao vút ngọn (Hvn) cho kết quả lần lượt là 96,17%, 1,30 cm và 44,78 cm. Công thức che sáng

khác nhau có ảnh hưởng rõ rệt đến đường kính gốc và chiều cao vút ngọn của cây Gõ đỏ giai đoạn vườn ươm.

- Công thức bón phân PB3 (60 g NPK / 2 lít / 100 bầu) phù hợp cho Gõ đỏ ở giai đoạn vườn ươm. Tỷ lệ sống, giá trị về đường kính gốc và chiều cao vút ngọn lần lượt là 94,33%, 1,07 cm và 45,31 cm. Công thức bón phân khác nhau có ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng chiều cao và đường kính gốc của cây Gõ đỏ giai đoạn vườn ươm.

Kết quả là cơ sở khoa học có thể áp dụng trong nhân giống phục vụ công tác bảo tồn và phát triển cây gỗ quý như Gõ đỏ.

LỜI CẢM ƠNNhóm tác giả xin chân thành cảm ơn sự hỗ

trợ của Nghiên cứu sinh Sounthone Douangmala (Trường Cao đẳng Nông - Lâm Bolikhămxay, Thủ đô Viên Chăn, Cộng hòa Dân chủ Nhân dân Lào) đã cung cấp vật liệu hạt Gõ đỏ để nhân giống. Cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp Việt Nam - đơn vị đã tạo điều kiện cơ sở vật chất và hiện trường để làm thí nghiệm.

TÀI LIỆU THAM KHẢOBộ Khoa học và Công nghệ, Viện Khoa học và Công

nghệ Việt Nam, 2007. Sách Đỏ Việt Nam phần II - Thực vật. NXB Khoa học Kỹ thuật và Công nghệ. Hà Nội.

Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1999. Một số loài cây bị đe doạ ở Việt Nam. NXB Nông nghiệp. Hà Nội.

Nguyễn Hoàng Nghĩa, Nguyễn Đức Thành, Trần Thuỳ Linh, 2007. Kết quả phân tích đa dạng di truyền loài Gõ đỏ (Afzelia xylocarpa Craib) bằng chỉ thị phân tử RAPD. Tạp chí Nông nghiệp và PTNT, 14/2007: 44-48.

Nguyễn Đức Thành, 2016. Các kỹ thuật chỉ thị DNA trong nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen và chọn giống thực vật. NXB Khoa học tự nhiên và Công nghệ. Hà Nội. tr 134 - 141.

Nguyễn Hữu Thước, Nguyễn Liên, Đặng Xuân Khương, 1966. Sơ bộ nghiên cứu yêu cầu ánh sáng của cây lim dưới một tuổi. Tập san SVĐH V.I. 47-51.

Nguyễn Hải Tuất, Nguyễn Trọng Bình, 2005. Khai thác và sử dụng SPSS xử lý số liệu trong Lâm nghiệp. NXB Nông nghiệp. Hà Nội.

Hình 1. Hình ảnh cây Gõ đỏ tại các công thức thí nghiệmGhi chú: a) Hạt nảy mầm; b) Cây 5 ngày tuổi; c) Cây ở công thức đối chứng; d) Cây ỏ ở công thức CS1; e) Cây ở công

thức CS2; f) Cây ở công thức CS3

(a) (b) (c)

(d) (e) (f)

45


1 Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh

ẢNH HƯỞNG ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN SỰ NHÂN NHANH SINH KHỐI RỄ TÓC SÂM NGỌC LINH TRÊN HỆ THỐNG PLANTIMA®

Hà Thị Loan1, Dương Hoa Xô1

TÓM TẮTSâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha and Grushv) là loại thực vật quý hiếm của Việt Nam, một trong 4 loại

sâm quý trên thế giới. Hiện nay, có rất nhiều nghiên cứu ứng dụng trên sâm, trong đó tạo rễ tóc sâm là hướng đi mới có tính chất thương mại cao. Việc tạo rễ tóc sâm Ngọc Linh ở điều kiện in vitro chứa nhiều hoạt chất saponin nhóm protopanaxadiol (PPD), protopanaxatriol (PPT), ocotillol (OCT) đã thực hiện thành công tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh. Bên cạnh đó, sử dụng hệ thống ngập chìm tạm thời plantima ® nuôi cấy mô thực vật cho hệ số nhân cao. Chính vì vậy, việc ứng dụng hệ thống này vào việc nuôi cấy rễ tóc được thực hiện, nhằm khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến sự nhân nhanh sinh khối rễ tóc sâm Ngọc Linh để thu được nhiều hoạt chất saponin. Kết quả cho thấy nuôi cấy rễ tóc sâm Ngọc Linh trên plantima trong 2 tháng, mật độ nuôi cấy ban đầu 3 g cho hệ số nhân là 13,2 lần, khoảng cách bơm là 5 giờ/lần và tần suất bơm 3 phút/lần cho hệ số cao nhân là 13,5; 13,1 lần. Sinh khối rễ tóc nuôi cấy trên hệ thống ngập chìm tạm thời có hệ số nhân cao, ứng dụng để sản xuất thương mại saponin.

Từ khóa: Sâm Ngọc Linh, sinh khối, rễ tóc, saponin, plantima®

I. ĐẶT VẤN ĐỀNhân sinh khối trên môi trường thạch gặp nhiều

khó khăn như: Thể tích nuôi cấy nhỏ, toàn bộ mẫu không tiếp xúc hết với môi trường, khả năng nhân mẫu chậm. Vì vậy, Tisserat và Vandercook (1985) báo cáo sự sinh trưởng của phôi cây cà-rốt và cây chà là (Phoenix dactylifera) nuôi trong hệ thống ngập chìm tạm thời APCS, thời gian ngập chìm là 5 - 10 phút sau mỗi 2 giờ. So sánh với những cây

nuôi cấy trên môi trường rắn, sự sinh trưởng gấp 1,9 lần trong trường hợp cây cà-rốt, và 4 lần đối với cây chà là trong hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời, thêm vào đó chất lượng cũng như số lượng của phôi soma và cây con cà-rốt được nâng lên. Alvard (1993) đã báo cáo: Chồi chuối trong môi trường nuôi cấy lỏng đơn giản hay trên giá thể bằng cellulose có sự nhân chồi bình thường hay không có gì khác biệt. Các chồi trên môi trường bàn rắn có

Nguyễn Hải Tuất, Vũ Tiến Hinh, Ngô Kim Khôi, 2006. Phân tích thống kê trong lâm nghiệp. NXB Nông nghiệp. Hà Nội.

Sounthone Douangmala, Nguyễn Văn Việt, Trần Việt Hà, 2016. Nghiên cứu xác định khả năng nhân giống cây Gõ đỏ (Afzelia xylocarpa Craib) bằng phương pháp giâm hom. Tạp chí Nông nghiệp và PTNT, 12/2016: 231-236.

Nguyen Duc Thanh, Le Thi Bich Thuy and Nguyen Hoang Nghia, 2012. Genetic diversity of Afzelia xylocarpa Craib in Vietnam based on analyses of chloroplast markers and random amplified polymorphic DNA (RAPD). African Journal of Biotechnology, 11 (80): 14529-14535.

Effects of light regime and NPK fertilizer on growth of Afzelia xylocarpa in nurseryNguyen Van Viet, Ha Thanh Tung

AbstractThis article shows the results of effect of light regime and fertilizer on growth of Afzelia xylocarpa in nursery. Research results showed that by shading of 50%, the highest survival ratio and growth height were recorded at 96.17% and 44.78 cm, respectively. The survival ratio, tree base diameter and height reached at 94.33%, 1.07 cm, 45.31 cm, respectively, when top dressing by fertilizer NPK (5:10:3) dissolved in water at concentration of 3%. The results provide scientific basis to propagate Afzelia xylocarpa in nursery for breeding purpose and for conservation and development of precious genetic resources.Key words: Afzelia xylocarpa, light regime, growth, propagation, nursery, survival

Ngày nhận bài: 7/6/2017Người phản biện: TS. Nguyễn Tử Kim


46


sự ngập một phần và trong môi trường lỏng có sục khí có hệ số nhân chồi từ 2,2 - 3,1. Đặc biệt hệ số nhân chồi cao nhất (>5) thu được trên mẫu nuôi cấy trong điều kiện nuôi cấy ngập chìm tạm thời. Theo nhóm tác giả, kết quả trên thu được khi sử dụng hệ thống RITA®với thời gian ngập là 20 phút cứ mỗi 2 giờ. Tương tự như vậy, Escalona (1998) đã sử dụng hệ thống trên để nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây Dứa Ananas comosus, kết quả cũng cho thấy hệ số nhân đã được gia tăng khoảng 300% so với nuôi cấy lỏng và 400% so với nuôi cấy trên môi trường rắn. Có gần 5.000 cây Dứa thu được từ một hệ thống. Trên đối tượng cây mía Saccharum spp. Lorenzo (1998) đã chứng minh rằng hệ thống nuôi cấy ngập chìm dạng bình đôi đã đẩy hệ số nhân (23,9 chồi trong 30 ngày) gấp 6 lần so với quy trình thông thường (3,96 chồi trong 30 ngày; Jimenez, 1995). Trong đó, Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh đã ứng dụng hệ thống ngập chìm tạm thời trong nhân nhanh lan Hồ điệp, Mokara, Renantherra. Kết quả trên lan Hồ điệp: Tần suất ngập chìm 5 phút trong chu kỳ 2 giờ, nhân nhanh PLBs trên thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời gấp 2,77 lần so với nhân trên môi trường thạch và gấp 1,2 lần so với nuôi cấy lỏng lắc, tần suất ngập 3 phút trong chu kỳ 6 giờ hệ thống này cho tỉ lệ nhân chồi gấp 3,7 lần so với nuôi cấy trên môi trường thạch, trong giai đoạn phát triển cây con, sử dụng 30 chồi nuôi trong bình Plantima® có thể tích môi trường 250 ml và tần suất ngập là 3 phút trong chu kỳ 6 giờ cho thấy thời gian tạo cây con để có thể đưa ra vườn ươm trên hệ thống này là 8 tuần so với 10 tuần trên môi trường thạch. Ngoài ra, tỉ lệ sống của cây con từ hệ thống TIS sau 1 tháng ở giai đoạn vườn ươm là 95%, trong khi tỉ lệ sống của các cây trên môi trường thạch là 79%), tính tất cả các giai đoạn từ nhân PLB đến ra cây con trên hệ thống ngập chìm tạm thời cho hệ số nhân giống gấp 10,3 lần so với nuôi cấy trên môi trường thạch, tạo cây con sớm hơn 2 tuần và tỉ lệ sống cao hơn (Cung Hoàng Phi Phượng và ctv., 2007). Theo Nguyễn Phúc Trường

(2010) số lượng chồi kiểng lá Lan Ý Mỹ tạo ra trong hệ thống TIS cao hơn xấp xỉ 4 lần so với trên môi trường thạch, chồi tăng trưởng mạnh và khỏe hơn trên môi trường thạch.

Vì vậy, dựa vào các kết quả thí nghiệm, ứng dụng hệ thống ngập chìm để nuôi cấy rễ tóc sâm Ngọc Linh được thực hiện, nhằm tạo được sinh khối lớn từ các dòng rễ tóc chuyển gen thành công với khối lượng rễ rất ít. Rễ tóc chuyển gen được tạo ra từ việc lây nhiễm Agrobacterium rhizogenes chủng (15834) trên cây sâm Ngọc Linh (Panax Vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro, các rễ tóc này đã được chọn lọc và đánh giá hoạt chất saponin (Hà Thị Loan, 2009).


2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Nguồn mẫu in vitroNguồn mẫu in vitro thí nghiệm là rễ tóc

chuyển gene sâm Ngọc Linh thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes. Rễ tóc này đã được tạo ra tại Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh.2.1.2. Môi trường nuôi cấy in vitro

Môi trường nuôi cấy là môi trường cơ bản thường sử dụng trong các nghiên cứu cây sâm trên thế giới. Môi trường SH (Schenk và Hildebrandt, 1972) có bổ sung 60 g/l sucrose, đặc biệt không sử dụng agar và các chất điều hòa sinh trưởng, môi trường thường được điều chỉnh pH từ 5,7 đến 5,8.

2.1.3. Thiết bị nuôi cấyTrong nghiên cứu này, nhóm sử dụng hệ

thống ngập chìm tạm thời Plantima® (Temporary immersion system- TIS) nuôi cấy rễ tóc sâm Ngọc Linh. Một hệ thống ngập chìm tạm thời chứa 40 hộp plantima do công ty A-Tech Bioscientific của Đài Loan cung cấp, mỗi hộp Plantima chứa khoảng 250 ml môi trường SH.

Hình 1. Thành phần hộp Plantima và hệ thống TIS

Nắp

Mâm chứa mẫu cấy

Vách ngăn giữa hai tầng

Ron cao su

Màng lọc

Ống silicone

Bình Plantima

47


2.1.4. Điều kiện nuôi cấyPhòng nuôi rễ tóc sâm Ngọc Linh có hệ thống TIS

ngập chìm tạm thời hoạt động. Nhiệt độ của phòng là 25 ± 20C, không cần chiếu sáng, độ ẩm trung bình từ 75 - 80%.


2.2.1. Khảo sát mật độ ban đầu của rễ tóc sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy ngập chìm tạm thời

Rễ tóc sâm Ngọc Linh được tạo ra bởi Hà Thị Loan (2014), thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. Mỗi hộp plantima chứa 1 g; 3 g; 5 g; 7 g mẫu rễ tóc. Các hộp plantima gắn vào hệ thống bơm điều khiển, cài đặt khoảng cách bơm là 5 giờ/lần, mỗi lần bơm 3 phút.

2.2.2. Khảo sát tần suất bơm của hệ thống TIS trong nuôi cấy rễ tóc sâm Ngọc Linh

Rễ tóc sâm Ngọc Linh được lấy trọng lượng tươi là 3 g cho vào mỗi hộp plantima®, gắn vào hệ thống điều chỉnh tần suất bơm là 4; 5; 6 giờ/lần, mỗi lần bơm ngập 3 phút. Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần.

2.2.3. Khảo sát lưu lượng bơm của hệ thống TIS trong nuôi cấy rễ tóc sâm Ngọc Linh

Mỗi hộp plantima chứa 3 g mẫu rễ tóc, gắn vào hệ thống bơm điều chỉnh lưu lượng bơm là 2; 3; 4 phút/lần, mỗi nghiệm thức có khoảng cách bơm 5 giờ/lần. Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần.

2.2.4. Chỉ tiêu theo dõiCác thí nghiệm đều lấy trọng lượng tươi của rễ

tóc sâm Ngọc Linh sau khi nuôi cấy 2 tháng trên hệ thống ngập chìm tạm thời.

2.2.5. Xử lý số liệuSố liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft

Excel và phần mềm thống kê SPSS 16.0.

2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứuNghiên cứu được thực hiện từ tháng 10/2015 -

2/2017 tại khu nuôi cấy mô của Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh.


3.1. Khảo sát mật độ nuôi cấy rễ tóc sâm Ngọc Linh trên hệ thống TIS

Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời thường sử dụng trong vi nhân giống cho hệ số nhân cao hơn. Trong đó, mật độ mẫu ban đầu cho vào nuôi cấy ảnh hưởng rất nhiều đến khối lượng, hệ số nhân

của mẫu (Etienne, 2002). Theo bảng 1, số lượng gam mẫu rễ tóc ban đầu khác nhau cho khối lượng rễ tóc sau 2 tháng khác nhau, hệ số nhân nhau. Với mật độ ban đầu của rễ tóc 3 và 5 g cho khối lượng rễ cao nhất sau khi nuôi hai tháng. Mặc dù, mật độ 7 g ban đầu nhiều hơn nhưng kết quả nuôi cấy lại thấp hơn, kết quả cho thấy mật độ nuôi cấy ban đầu càng cao chưa chắc cho khối lượng sau 2 tháng càng cao. Tuy nhiên, giữa mật độ 3 g và 5 g ban đầu lại cho hệ số nhân rất khác biệt nhau về mặt thống kê học, ở 3 g cho hệ số nhân là 13,289 lần cao hơn. Trong khi đó, nuôi cấy rễ tóc nhân sâm Hàn Quốc trong bình bioreactor 20-Lit có hệ số nhân là 11,67 lần sau hai tháng nuôi cấy (Choi, 2000).

Bảng 1. Ảnh hưởng của mật độ nuôi cấy đến hệ số nhân rễ tóc sâm Ngọc Linh

Ghi chú: Những chữ cái khác nhau (a,b,c) trong các cột biểu diễn sự khác biệt có ý nghĩa với α=0,05 trong Duncan’s test.

3.2. Khảo sát tần suất bơm của hệ thống TIS trong nuôi cấy rễ tóc sâm Ngọc Linh

Theo Alvard (1993), tần suất bơm của hệ thống TIS ảnh hưởng nhiều đến khả năng nhân giống của cây chuối, nếu khoảng cách bơm ngắn có thể làm mẫu bị hóa nâu hoặc thủy tinh thể, còn khoảng cách bơm dài làm mẫu ít tiếp xúc với môi trường làm mẫu chết hoặc chậm phát triển. Vì vậy, khoảng cách giữa hai lần bơm cũng ảnh hưởng đến sinh khối rễ tóc sâm Ngọc Linh. Kết quả thí nghiệm như bảng 2.

Bảng 2. Tần suất bơm ảnh hưởng đến nuôi cấy rễ tóc sâm Ngọc Linh

Ghi chú: Những chữ cái khác nhau (a,b) trong các cột biểu diễn sự khác biệt có ý nghĩa với α=0,05 trong LSD 0.05.

Khối lượng ban đầu

Khối lượng sau 2 tháng Hệ số nhân

1 g 7,1800 c 7,1800 b3 g 39,567 a 13,289 a5 g 36,9150 a 7,3830 b7 g 23,1167 b 3,2216 c

CV(%) 22,1 17,67

Khoảng cách thời gian bơm


4h 12,3200 b 4,1067 b5h 40,4930 a 13,4977 a6h 39,458 a 13,1527 a

CV(%) 10,2 9,8

48


Sau 2 tháng nuôi cấy, khối lượng rễ tóc sâm Ngọc Linh với khoảng cách bơm 5 giờ và 6 giờ là khác biệt về mặt thống kê học so với 4 giờ bơm. Tuy nhiên, khối lượng sinh khối ở nghiệm thức 5 giờ có khối lượng cao hơn (40.4930 > 39.458). Bên cạnh đó, hệ số nhân ở nghiệm thức 5 giờ và 6 giờ không khác biệt về mặt thống kê học nhưng nghiệm thức 5 giờ vẫn cho hệ số nhân cao hơn.

3.3. Khảo sát lưu lượng bơm của hệ thống TIS trong nuôi cấy rễ tóc sâm Ngọc Linh

Kết quả bảng 3 chứng tỏ rằng, thời gian mỗi lần bơm cũng ảnh hưởng đến sinh khối rễ, hệ số nhân mẫu. Thời gian ngập thấp cũng là mẫu tiếp xúc môi trường rất ít, không cung cấp đủ dinh dưỡng để rễ phát triển, ngược lại thời gian tiếp xúc nhiều quá, mẫu ngập nhiều trong dinh dưỡng cũng làm sinh khối tăng trưởng chậm. Ở đây, nghiệm thức ngập 3 phút cho khối lượng rễ sau hai tháng cao nhất, vượt trội so với thời gian bơm 2 phút, 4 phút. Đồng thời, hệ số nhân cũng khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê học (13,12 lần).

Bảng 3. Lưu lượng bơm ảnh hưởng đến nuôi cấy rễ tóc sâm Ngọc Linh

Ghi chú: Những chữ cái khác nhau (a,b) trong các cột biểu diễn sự khác biệt có ý nghĩa với α=0,05 trong LSD 0.05.


4.1 Kết luậnĐề tài đã thiết lập được điều kiện tối ưu để nhân

rễ tóc sâm Ngọc Linh trên hệ thống ngập chìm tạm thời (TIS). Mật độ nuôi cấy tối ưu là 3 gam trên một hộp plantima, tần suất bơm là 5 giờ/lần, thời gian ngập mẫu rễ là 3 phút. Với điều kiện này, hệ số nhân của sinh khối rễ tóc sâm Ngọc Linh sau 2 tháng cao nhất là 13 lần.

Qua các thí nghiệm này, khối lượng mẫu rễ cho vào một hộp TIS nuôi cấy rất ít, (khoảng 3 g), nhưng sau 2 tháng đạt trên 40 g/ hộp plantima®. Với khối lượng mẫu đạt được này, một hệ thống TIS vận hành bao gồm 40 hộp phantima®, sau 2 tháng thì hệ thống cho ra từ 1.200 - 1.400 g, nguồn vật liệu này rất lớn để cung cấp cho sản xuất sinh khối rễ tóc sâm Ngọc Linh.

4.2. Kiến nghị Đề tài nên khảo sát thêm các điều kiện hàm

lượng oxy cung cấp cho mẫu, độ khuếch tán không khí trong hộp plantima, cường độ ánh sáng cũng như thành phần môi trường nuôi cấy… để đạt sinh khối rễ tóc sâm Ngọc Linh nhiều nhất.

Ngoài ra, sinh khối trên hệ thống TIS nên sử dụng làm nguồn nguyên liệu nuôi cấy cho hệ thống bioreactor thể tích lớn (20L, 50L, 100L) để thu được sinh khối nhiều hơn.

LỜI CẢM ƠNNhóm tác giả xin chân thành cảm ơn các đồng

nghiệp làm việc tại phòng Thực nghiệm Cây trồng, Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện để thực hiện nghiên cứu này. Xin gửi lời tri ân đến Hội đồng Khoa học của

Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh đã có những góp ý, định hướng để nghiên cứu này được thực hiện chính xác nhất. Đồng thời, cũng xin cảm ơn sự giúp đỡ chân thành và rất nhiệt tình của các bạn sinh viên từng tham gia trong nghiên cứu để hoàn thành tốt đề tài này.

Hình 2. Rễ tóc sâm Ngọc Linh nhân trên hệ thống ngập chìm tạm thời A. Hệ thống TIS nuôi cấy sinh khối rễ tóc. B. Sinh khối rễ tóc trong một hộp Plantima sau 2 tháng nuôi cấy.

C. Khối lượng sâm Ngọc Linh nuôi cấy

Khoảng cách thời gian bơm


2 p 23,2900 b 7,7633 b3 p 44,6833 a 14,8944 a4 p 18, 3333 b 6,1111 b

CV(%) 13,3 13,34

49


TÀI LIỆU THAM KHẢOHà Thị Loan, 2009. Triển khai quy trình nhân nhanh

các giống lan Mokara, Renanthera, Phalaenopsis bằng phương pháp ngập chìm tạm thời. Báo cáo nghiệm thu tại Sở Khoa học và Công nghệ TP. Hồ Chí Minh.

Hà Thị Loan, Dương Hoa Xô, Nguyễn Quốc Bình, Nguyễn Hoàng Quân, Vũ Thị Đào, Nathalie Pawlicki- Julian, Eric Gontier, 2014. Nghiên cứu tạo rễ tóc sâm Ngọc Linh Panax vietnamensis bằng phương pháp chuyển gen rol nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes. Tạp chí Công nghệ sinh học 2014, 36(1se): 293-300.

Cung Hoàng Phi Phượng, Nguyễn Văn Hiếu, Nguyễn Quốc Thiện, Nguyễn Quốc Bình và Dương Hoa Xô, 2007. Bước đầu ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời cho nhân giống lan Hồ Điệp lai - Phalaenopsis huybrid. Hội nghị khoa học công nghệ sinh học thực vật trong nhân giống và chọn tạo giống hoa. NXB Nông nghiệp, trang 7-16.

Nguyễn Phúc Trường, 2010. Ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nhân giống cây kiểng lá. Báo cáo nghiệm thu tại Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh.

Alvard D, Cote F, Teisson C., 1993. Comparison of methods of liquid medium culture for banana

micropropagation. Effects of temporary immersion of explants. Plant Cell Tiss Org Cult 32:55-60.

Choi S. M., Son S. H., Yun S. R., Kwon O. W., Seon J. H., Paek K. Y., 2000. Pilot-scale culture of adventitious roots of ginseng in a bioreactor system. Plant Cell Tissue Org. Cult. 62: 187-193.

Escalona M, Lorenzo J.C., Gonzalez B., Daquinta M., Fundora Z., Borrto C.G., Espinosa D., Arias E. and Aspiolea M.E., 1998. New system for in vitro propagation of pineapple [Ananas comosus (L.) Merr]. Pineapple News, 5, pp: 5-7.

Etienne H., Berthouly M., 2002. Temporary immersion systems in plant micropropagation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 69: 215-231.

Lorenzo J., González B., Escalona M., Teisson C., Espinosa P. & Borroto C., 1998. Sugarcane shoot formation in an improved temporary immersion system. Plant Cell, Tiss. Org. Cult. 54: 197-200.

Schenk R. U.; Hildebrandt A. C., 1972. Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Can. J. Bot. 50: 199-204.

Tisserat B., Vandercook C. E., 1985. Development of an automated plant culture system. Plant Cell, Tiss. Org. Cult. 5: 107-117.

Effect of cultural conditions on propagating hairy root biomass of Ngoc Linh ginseng in the Plantima® system

Ha Thi Loan, Duong Hoa XoAbstractNgoc Linh Ginseng (Panax vietnamensis Ha and Grushv) is a rare and precious plant of Viet Nam, one of the four precious ginseng types in the world. Currently, there are many applicable studies on ginseng, among them study on creating hairy root is a new approach for highly commercial production. Creating hairy root from Ngoc Linh ginseng in vitro which contains many saponin groups such as protopanaxadiol (PPD), protopanaxatriol (PPT), ocotillol (OCT) have been successfully implemented at the Biotechnology Center of Ho Chi Minh City. Besides, using Platima® temporary immersion system for culturing plant tissue can give high multiplication coefficient. Therefore, the application of this system to culture hairy root was carried out to investigate the conditions which affected biomass rapid multiplication of Ngoc Linh Ginseng hairy root for obtaining more saponins. The results showed that the multiplication coefficient of Ngoc Linh ginseng roots was recorded at 13.2 times after 2 months of culturing on Plantima with the initial cultural density of 3 grams; The high multiplication coefficient reached 13.5; 13.1 times when timing interval of pumping was 5 hours/times with pumping frequency of 3 minutes/times. Hairy root biomass which cultured on Temporary immersion system has a high multiplier, application for producing commercial saponin.Key words: Ngoc Linh ginseng, biomass, hairy roots, sapoinin, plantima®



50


I. ĐẶT VẤN ĐỀNông nghiệp không chỉ là ngành chịu tác động

của Biến đổi khí hậu mà còn là tác nhân gây phát thải khí nhà kính (KNK) lớn làm gia tăng sự nóng lên toàn cầu. Canh tác lúa nước, lên men dạ cỏ gia súc nhai lại, sử dụng đất nông nghiệp, quản lý chất thải chăn nuôi và phế phụ phẩm nông nghiệp là những nguồn phát thải KNK lớn. Phát thải KNK từ canh tác lúa nước chiếm tỷ trọng cao nhất do phát thải CH4 từ quá trình phân giải chất hữu cơ trong điều kiện yếm khí. Báo cáo kết quả kiểm kê KNK (Bộ Tài Nguyên và Môi trường, 2010) ở Việt Nam cho thấy chỉ riêng canh tác lúa nước đã phát thải 1,78 triệu tấn CH4, tương đương 37,43 triệu tấn CO2e, chiếm 69,42% tổng lượng phát thải KNK của ngành trồng trọt, và 57,5% tổng lượng KNK phát thải của ngành nông nghiệp, tương đương 26,1% tổng lượng phát thải KNK quốc gia. Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là vùng sản xuất lúa trọng điểm của Việt Nam, với diện tích chỉ chiếm 12,1% diện tích của cả nước, nhưng sản lượng lúa chiếm khoảng 51,5% và đóng góp hơn 90% lượng gạo xuất khẩu của cả nước. Diện tích trồng lúa của ĐBSCL đã và đang không ngừng tăng qua các năm, đến năm 2011 diện tích lúa đã đạt khoảng 4 triệu ha với sản lượng 23 triệu tấn (Tổng cục Thống kê, 2013). Tương ứng với diện tích canh tác và sản lượng lúa thì lượng rơm thải bỏ hoặc đốt hằng năm ở ĐBSCL là rất lớn (Bộ Tài nguyên và Môi trường, 2010). Hiện nay, hầu hết các nguồn tài nguyên rơm này chưa được khai thác và sử dụng một cách hiệu quả. Theo Corton et al. (2000) có các biện pháp bón phân rơm hữu cơ trên ruộng

lúa vùng nhiệt đới như để rơm lại ruộng lúa sau thu hoạch, vùi rơm vào đất và ủ phân hữu cơ giúp trả lại nguồn dinh dưỡng trong đất. Điều này góp phần giảm lượng phân bón vô cơ và cải thiện các đặc tính lý đất, hóa học đất và sinh học đất (Wassmann et al., 1996). Xử lý rơm rạ bằng nấm Trichoderma sp. và ủ với phân vi sinh cố định đạm ở ĐBSCL được ghi nhận đạt kết quả tốt trong bảo vệ môi trường, chống lại các nấm bệnh gây hại trong đất, giảm lượng phân hóa học và giảm chi phí sản xuất lúa (Tran Thi Ngoc Son et al., 2008); tuy nhiên, các biện pháp trên có thể ảnh hưởng đến phát thải khí CH4. Do vậy, tính toán phát thải CH4 từ các biện pháp xử lý rơm là rất cần thiết, nhằm mục tiêu đánh giá ảnh hưởng của các biện pháp xử lý rơm đến khả năng phát thải khí CH4 và năng suất lúa trên cơ sở đó khuyến cáo các biện pháp xử lý rơm phù hợp trong canh tác lúa.


2.1. Vật liệu nghiên cứuNghiên cứu được thực hiện trên nền đất phù

sa nhiễm phèn nhẹ trồng lúa tại ấp Thới Thuận, xã Tân Thạnh, huyện Thới Lai, TP. Cần Thơ. Đất thí nghiệm là đất chua nhẹ có pH: 4,98 (USDA, 1983); hàm lượng %N trung bình 0,11%, N dễ tiêu cao 90,0 mg/kg, Ca2+ thấp 1,08 meq/100 g và Mg2+ thấp 4,18 meq/100 g (Metson, 1961); %P tổng số nghèo 0,04% và P dễ tiêu trung bình 17,14 (Lê Văn Căn, 1978); CEC trung bình 19,4 meq/100 g (Landon, 1984).

Nghiên cứu được thực hiện vào vụ Hè Thu (2016), rơm rạ được thu thập sau vụ thu hoạch lúa

1 Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long 2 Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ

ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ RƠM LÊN PHÁT THẢI KHÍ CH4 VÀ NĂNG SUẤT LÚA TRÊN ĐẤT PHÙ SA TẠI THỚI LAI, CẦN THƠ

Nguyễn Kim Thu1, Cao Văn Phụng1, Trần Văn Dũng2, Vũ Ngọc Minh Tâm1, Hồ Nguyễn Hoàng Phúc1

TÓM TẮTNghiên cứu được thực hiện nhằm mục tiêu đánh giá ảnh hưởng của các biện pháp xử lý rơm lên tốc độ, tích lũy

khí CH4 phát thải và năng suất lúa trên đất phù sa tại xã Tân Thạnh, huyện Thới Lai, thành phố Cần Thơ. Nghiên cứu được thực hiện trên diện rộng (1500m2/1 mô hình), với 3 công thức xử lý rơm khác nhau và 6 lần lặp lại cho từng mô hình. Các công thức xử lý rơm gồm: (i) Cày vùi rạ (350 kg rạ/1.000 m2), (ii) Phun nấm Tricoderma sp. trực tiếp lên rơm, rạ và sau đó cày vùi vào đất (520 kg rơm, rạ/1.000 m2) và (iii) Đốt rơm và rạ (cháy không hoàn toàn). Kết quả nghiên cứu cho thấy việc cày vùi rơm rạ không làm gia tăng tốc độ và tổng lượng khí CH4 phát thải so với các phương pháp xử lý nấm Trichoderma sp. sau đó cày vùi rơm rạ và đốt đồng. Cày vùi rơm rạ giúp gia tăng hàm lượng C và N tổng số trong đất vào giai đoạn cuối vụ (p<0,05), nhưng năng suất khác biệt không có ý nghĩa (p>0,05) giữa ba phương pháp xử lý rơm rạ.

Từ khóa: Đốt rơm rạ, khí CH4, nấm Trichoderma sp., phát thải khí và vùi rạ

51


Đông xuân (2015 - 2016) năng suất lúa trung bình 5,2 tấn/ha, rơm có các thành phần dinh dưỡng chủ yếu là C, N, P và K tổng với các giá trị lần lượt là 49,5% C, 0,59%N, 0,137% P2O5, 2,49% K2O và C/N là 84,8. Chế phẩm Trichodema sp. dùng để xử lý rơm rạ có nguồn gốc bản địa do Viện Lúa ĐBSCL phân lập và sản xuất dùng để xử lý rơm rạ nhằm tăng tốc độ phân hủy rơm rạ. Các chủng nấm Trichodema sp. được thu thập và phân lập từ các hệ thống canh tác lúa ở ĐBSCL, chế phẩm có mật độ tế bào VSV đạt từ 108 đến 109 CFU/g chế phẩm. Giống lúa được sử dụng trong thí nghiệm là giống OM 5451 có thời gian sinh trưởng 90 - 95 ngày. Liều lượng phân vô cơ bổ sung là 60 N - 40 P

2O

5 - 30 K

2O, và chia thành

3 lần bón vào các giai đoạn 7 - 10, 20 - 25 và 40 - 45 ngày sau khi sạ (NSKS), các dạng phân được sử dụng gồm Urea (46% N), DAP (18% N và 46% P2O5) và KCl (60% K2O).


2.2.1. Phương pháp bố trí thí nghiệmThí nghiệm được bố trí theo mô hình diện rộng

(1500 m2/1 mô hình), với 3 phương pháp xử lý rơm khác nhau và 6 lần lặp lại cho từng mô hình.

Các công thức xử lý rơm gồm: - Công thức 1 (Vùi rạ): Rơm sau khi thu hoạch

lúa được chuyển hoàn toàn ra khỏi ruộng, phần rạ còn lại (350 kg rạ khô/1.000 m2) trên ruộng sẽ được cày vùi vào đất.

- Công thức 2 (Phun nấm Tricoderma sp. trực tiếp lên rơm, rạ và sau đó cày vùi): Rơm rạ sau khi thu hoạch lúa vụ Đông Xuân 2015 - 2016 (520 kg rơm rạ khô/ 1.000 m2) được rải đều trên đồng ruộng, để 1 tuần sẽ phun nấm Tricoderma sp. lên rơm rạ với liều lượng 4 kg chế phẩm/ha (400g/1.000 m2). Sau đó tiến hành cày vùi cả vào đất phần rơm và rạ vào đất và cho nước ngập 24 giờ (khoảng 5 cm), sau đó tháo cạn nước.

- Công thức 3 (Đốt rơm và rạ): Sau khi thu hoạch lúa rải đều rơm lên ruộng 1 tuần cho rơm khô, sau đó đốt với khối lượng khoảng 200 kg rơm khô/1.000 m2, do lượng rơm rạ cháy không hết chỉ cháy khoảng 60 - 70% và lượng rơm rạ còn lại sẽ được cày vùi vào đất.

2.2.2. Phương pháp lấy và phân tích mẫu khíMẫu khí được lấy vào thời điểm 6; 13; 20; 27; 34;

41; 48; 55; 62; 69; 76; 83 và 90 NSS, tổng cộng có 13 đợt lấy mẫu khí cho toàn vụ lúa. Mẫu khí bắt đầu lấy từ 8 - 10 giờ sáng vào các thời điểm 0, 10, 20 và 30 phút thông qua hệ thống buồng khép kín (gồm

phần đế có đường kính 50 cm, cao 30 cm; buồng có thể tích 100 lít) để lấy khí phát thải CH4, các mô hình được lấy mẫu cùng một thời điểm. Trước khi lấy mẫu CH4, thùng lấy mẫu được đặt trên đế kính để tránh không khí không bị khuếch tán vào trong hay ra ngoài thùng; trong thùng có gắn quạt để đảo khí, một nhiệt kế để xác định nhiệt độ và dùng ống tiêm rút khí và được trữ trong lọ có thể tích 15 ml đã được hút chân không. Khí CH4 được phát hiện bằng đầu dò ion hóa ngọn lửa (FID) của máy sắc ký khối phổ (GC-SRI 8610C), với độ nhạy lên đến 10 - 13 g/s tại bộ môn Khoa học đất và vi sinh - Viện Lúa ĐBSCL. Lượng phát thải CH4 được qui đổi thành lượng phát thải CO2 như sau: Lượng phát thải CO2e (kg CO2 tương đương/ha) = Lượng phát thải CH4 (kg/ha) ˟ 25.

2.2.3. Phương pháp lấy mẫu đấtMẫu đất được lấy vào thời điểm cuối vụ lúa và

mẫu đất được lấy bằng khoan tay, độ sâu từ 0 đến 20 cm. Mẫu đất được để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng, sau đó nghiền mẫu đất khô và rây qua rây có đường kính 2 mm. Mẫu đất sau khi được nghiền phân tích các chỉ tiêu N và C tổng số, nhằm mục tiêu đánh giá ảnh hưởng của các phương pháp xử lý rơm đến hàm lượng dinh dưỡng trong đất.

2.2.4. Phương pháp lấy thành phần năng suất và năng suất lúa

Mẫu hạt sau khi tách, cân trọng lượng tươi, đo ẩm độ và tính năng suất ở ẩm độ 14%. Thành phần năng suất lúa gồm số bông/m2, tổng số hạt/bông, trọng lượng 1000 hạt, số hạt chắc/bông, tỷ lệ hạt chắc và năng suất lý thuyết được tính từ mẫu lấy trong khung có diện tích 0,25 m2 với 2 lặp lại cho mỗi lô thí nghiệm. Năng suất lúa được lấy trong khu vực có diện tích 5 m2.

2.3. Phương pháp phân tíchMẫu đất được phân tích theo các phương pháp:

pH H2O trích đất: Nước theo tỷ lệ 1:2,5 và xác định độ chua bằng pH kế; chất hữu cơ (%OC) xác định bằng phương pháp Walkley - Black, 1934, cacbon (C) hữu cơ được oxy hóa bằng hỗn hợp K2Cr2O7 + H2SO4 và xác định lượng thừa K2Cr2O7 sau khi oxy hóa C hữu cơ bằng dung dịch FeSO4; %N: vô cơ hóa bằng hỗn hợp H2SO4 đậm đặc và Se và được xác định bằng phương pháp chưng cất Kjeldahl; đạm hữu dụng (NH4

+ và NO3-): trích bằng dung dịch KCl

2M với tỷ lệ đất : dung dịch = 1: 20 sau đó được xác định bằng phương pháp chưng cất Kjeldahl; %P2O5: xác định bằng cách vô cơ hóa mẫu đất bởi hỗn hợp axit H2SO4 đậm đặc và Se để chuyển tất cả các hỗn

52


hợp vô cơ và hữu cơ trong đất thành dạng H3PO4 hòa tan. Mẫu được đo trên máy so màu có bước sóng 880 nm; lân hữu dụng (mgP/kg) xác định bằng phương pháp Olsen và Sommers, 1982: trích đất với dung dịch trích NaHCO3 ở pH 8,5 và so màu ở bước sóng 880 nm; Ca2+ và Mg2+ trao đổi: trích bằng amon acetate pH: 7.0 đo bằng máy hấp thu nguyên tử; CEC trích bằng amon acetate pH: 7,0 và xác định bằng phương pháp chưng cất Kjeldahl.

2.4. Phương pháp xử lý số liệuSử dụng phần mềm Microsoft Excel để tính toán

kết quả phân tích đất, năng suất lúa và tốc độ phát thải khí CH4 giữa các phương pháp xử lý rơm khác nhau. Phân tích ANOVA để đánh giá sự khác biệt giữa phát thải khí CH4 và năng suất lúa cũng như hàm lượng dinh dưỡng trong đất giữa các phương pháp xử lý rơm với khác biệt ở mức ý nghĩa 5%.


3.1. Ảnh hưởng của các biện pháp xử lý rơm đến tốc độ phát thải khí CH4

Kết quả cho thấy, giai đoạn 6 - 20 ngày sau sạ (NSS) tốc độ phát thải khí thấp, dao động trong khoảng 36 - 95 mg/m2/ngày và khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở ba mô hình (trừ 6 NSS). Tương tự, giai đoạn 27 - 41 NSS tốc độ phát thải khí khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở ba mô hình và tốc độ phát thải khí (93 - 212 mg/m2/ngày) ở giai đoạn này phát thải khí tăng cao hơn so với giai đoạn 6 - 20 NSS. Giai đoạn 48 - 62 NSS và giai đoạn 69 - 90 NSS tốc độ phát thải khí CH4 khác biệt không có ý nghĩa thống kê so giữa cả ba mô hình xử lý rơm (trừ 69 NSS), ở giai đoạn 69 - 90 ngày tốc độ phát thải khí giảm so với giai đoạn 48 - 62 NSS, có thể ở giai đoạn này người dân cho ruộng khô nên làm giảm tốc độ phát thải khí CH4 (Bảng 1). Nghiên cứu này cho thấy việc vùi rạ trên đất ruộng lúa trong nghiên cứu có tốc độ phát thải khí ở hầu hết các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây lúa chỉ sai khác trong phạm vi sai số không có ý nghĩa về mặt thống kê so với đốt rơm rạ và phun nấm Trichoderma sp. và vùi rạ. Trong khi theo nghiên cứu của Bronson et al. (1997) cho rằng, việc vùi rơm rạ trên đất ruộng lúa gia tăng đáng kể lượng CH4, cụ thể bón rơm rạ (5-12 tấn/ha; C/N khoảng 60) làm gia tăng bốc thoát CH4 từ 2-9 lần trên đất canh tác lúa (Schütz et al., 1989; Wassmann et al., 1996). Lượng CH4 bốc thoát gia tăng tuyến tính với lượng (0-3%) rơm rạ bón vào và khi tăng lượng rơm vùi vào đất nhưng có xử lý nấm Tricoderma sp. giúp giảm lượng khí phát thải CH4 so với mô hình chỉ cày vùi rạ và đốt rơm rạ (Wang et al., 1992).

Bảng 1. Ảnh hưởng của các phương pháp xử lý rơm đến tốc độ phát thải khí CH4

Ghi chú: Bảng 1, 2, 3, 4: Công thức 1 (MH1): vùi rạ; Công thức 2 (MH2): Phun nấm Tricoderma trực tiếp lên rơm rạ; Công thức 3 (MH3): Đốt rơm và rạ; * khác biệt có ý nghĩa thống kê 5%; ns: khác biệt không có ý nghĩa thống kê; trong cùng một hàng các chữ khác nhau thì khác nhau với mức ý nghĩa 5%.

3.2. Diễn biến mực nước trên ruộng thí nghiệmMực nước ở các mô hình được ghi nhận suốt

vụ lúa dao động trong khoảng 0 - 10 cm. Các thời điểm mức nước cao tương ứng sau khi bơm nước. Do mức nước ruộng không ngập sâu điều này giúp khống chế phần nào phát thải khí CH4 từ ruộng lúa.

Hình 1. Mực nước ruộng tại các thời điểm thu mẫu khí thải

3.3. Ảnh hưởng của các biện pháp xử lý rơm đến ước lượng tổng tích lũy khí CH4

Ước lượng tổng lượng khí CH4 phát thải cao nhất

ở mô hình vùi rạ 190 kg/ha/vụ thấp nhất ở mô hình

Ngày sau sạ

Mô hình/ tốc độ phát thải khí CH4

(mg/m2/ngày) F-test CV(%)

MH1 MH2 MH36 36b 59a 51ab * 26,6

13 49 60 56 ns 31,520 82 87 95 ns 35,927 93 98 101 ns 32,434 181 127 162 ns 27,441 193 212 126 ns 21,748 142 152 112 ns 25,455 329 364 307 ns 47,062 196 254 178 ns 29,269 541a 390b 293c * 13,076 499 421 407 ns 20,983 144 158 138 ns 27,290 144 127 125 ns 42,2

MH112.0

10.0

8.0

6.0

4.0

2.0

0.07 13 20 27 34 41 48 55 62 69 76 83 90

Mực

nướ

c (c

m)

NSS

MH2MH3

53


đốt rơm rạ 155 kg/ha/vụ và tổng qui đổi ra lượng CO

2 lần lượt là 4.746 kg CO2e/ha/vụ và 3.873 kg

CO2e/ha/vụ (Bảng 2). Vùi rơm rạ ở đất ngập nước dẫn đến các tiến trình phân hủy chất hữu cơ trong điều kiện hạn chế oxi ra nhiều axit hữu cơ, sản phẩm trung gian trong tiến trình phân hủy này là CH

4,

CO2, H

2, H

2S, NH3 (Yoshida, 1981). Trong khi đó

việc đốt đồng rơm rạ đã làm giảm lượng rơm rạ vùi vào đất nên đã làm giảm lượng khí CH4 so với hai mô hình còn lại. Tuy nhiên đốt đồng trong canh tác lúa thâm canh hàng năm thải ra một lượng lớn khói bụi gây ô nhiễm môi trường không khí và gây hại cho sức khỏe của người dân làm việc trên đồng và cộng đồng xung quanh. Đốt đồng là một giải pháp dễ thực hiện và có thể diệt trừ các dịch bệnh có thể gây hại cho lúa. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho rằng việc đốt đồng đã làm cho môi trường sinh thái mất cân bằng, mất đi một số lượng đáng kể N, P và C trên đồng ruộng theo Ngô Thị Thanh Trúc (2005) ước tính khi đốt 1 tấn rơm sẽ thải ra 1.068 kg CO2, 12,6 kg NO và 13,4 kg CH4 làm tăng lượng khí gây ô nhiễm môi trường. Theo ước tính khi đốt 1 tấn rơm có ẩm độ 12,6-17% sẽ phát thải trung bình 80 kg CO, 700 kg CO

2, 0,07 kg N

2O và 20 kg CH

4.

Bảng 2. Ảnh hưởng của các phương pháp xử lý rơm đến ước lượng tổng lượng khí CH4

và qui đổi thành lượng khí phát thải CO2

3.4. Ảnh hưởng của các biện pháp xử lý rơm đến hàm lượng N tổng số và chất hữu cơ trong đất

Kết quả cho thấy, hàm lượng chất hữu cơ ở mô hình cày vùi rạ và phun nấm Trichoderma sp. sau đó cày vùi rơm rạ khác biệt có ý nghĩa thống kê so với mô hình đốt rơm rạ. Cụ thể, hàm lượng chất hữu cơ trong đất cao nhất ở mô hình phun nấm Trichoderma sp. sau đó cày vùi rơm rạ (2,53% OC), tiếp đến mô hình cày vùi rạ (2,45% OC) và thấp nhất mô hình đốt rơm rạ (2,29% OC). Hàm lượng N tổng số trong đất cuối vụ ở mô hình mô hình phun nấm Trichoderma sp. sau đó cày vùi rơm rạ khác biệt có ý nghĩa thống kê so với hai mô hình cày vùi rạ và đốt rơm rạ (Bảng 3). Nguyên nhân hàm lượng chất hữu cơ và N tổng số trong đất của mô hình cày vùi rạ và cày vùi rơm rạ bổ sung từ 350 - 520 kg rơm rạ/ 1.000

m2 so với mô hình đốt rơm. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với nghiên cứu của Lưu Hồng Mẫn và ctv. (2006) đã ghi nhận rằng việc vùi rơm rạ vào đất ở đầu vụ Hè thu đã làm giảm pH, tăng hàm lượng chất hữu cơ, N tổng số trong đất, tăng mật số vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm trong đất.

Bảng 3. Ảnh hưởng của các phương pháp xử lý rơm đến hàm lượng chất hữu cơ (CHC) và N tổng số

trong đất cuối vụ lúa

3.5. Ảnh hưởng của các biện pháp xử lý rơm đến thành phần năng suất và năng suất lúa

Kết quả bảng 4 cho thấy, khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa trọng lượng 1.000 hạt, số bông/ m2, số hạt/ bông và tỷ lệ hạt chắc giữa các mô hình. Mô hình vùi rơm có xử lý với Trichoderma sp. có số bông/m2 và tỷ lệ hạt chắc có khuynh hướng tăng cao hơn mô hình vùi rạ vào đất sau thu hoạch lúa và đốt rơm rạ. Năng suất lúa ở cả ba mô hình khác biệt không ý nghĩa thống kê (bảng 4), sau một vụ mô hình vùi rơm có xử lý với Trichoderma sp. năng suất lúa có khuynh hướng gia tăng, nhưng không khác biệt so với vùi rạ và đốt rơm. Năng suất lúa tăng 1,0-1,2 tấn/ha trong vụ mùa khô và tăng khoảng 0,4-0,8 tấn/ha trong vụ mùa mưa sau hai vụ vùi rơm rạ vào đất so với đốt rơm (Surekha et al., 2003). Như vây, qua một vụ nghiên cứu vùi rơm rạ có xử lý Trichoderma sp. chưa thấy hiệu quả rõ về năng suất lúa so với đốt rơm và vùi rạ vào đất. Nghiên cứu của Dobermann và Fairhurst (2002) vùi rơm trả lại cho đất là đưa vào đất 40% N, 30% P2O5 và 80% K2O mà cây lúa đã hấp thu, đồng thời tăng chất hữu cơ trong đất.

Bảng 4. Ảnh hưởng của các phương pháp xử lý rơm đến thành phần năng suất và năng suất thực tế

Mô hìnhLượng khí

phát thải CH4 (kg/ha/vụ)

Qui đổi thành lượng phát thải CO2

(kg CO2 tương đương)MH1 190 4.746MH2 180 4.503MH3 155 3.873

Nghiệm thức CHC (%OC) %NMH1 2,45 a 0,11 bMH2 2,53 a 0,13 aMH3 2,29 b 0,11 b

CV(%) 3,1 10,8F-test * *

Nghiệm thức

TL 1.000 (g)

(Ẩm độ 14%)

Số bông/

m 2

Số hạt/

bông

Tỷ lệ hạt

chắc (%)

NSTT (t/ha)

MH1 26,35 470 70 70,62 5,09MH2 26,81 483 67 73,26 5,22MH3 26,39 451 66 72,40 5,06

CV(%) 2,6 15,0 13,0 10,6 5,5F-test ns ns ns ns ns

54



4.1. Kết luậnMô hình cày vùi rơm rạ có xử lý với Trichoderma

sp. không làm gia tăng tốc độ và tổng lượng khí CH4 phát thải so với các phương pháp xử lý cày vùi rạ và đốt rơm rạ. Cày vùi rơm rạ giúp gia tăng hàm lượng C và N tổng số trong đất vào giai đoạn cuối vụ, nhưng qua một vụ thử nghiệm chưa thấy khác biệt năng suất lúa của phương pháp cày vùi rơm rạ so với cày vùi rạ và đốt rơm rạ.

4.2. Đề nghịCần có thí nghiệm dài hạn để đánh giá hiệu quả

của cày vùi rơm rạ đến năng suất lúa cũng như gây phát thải khí nhà kính.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Tài nguyên và Môi trường, 2010. Báo cáo Môi

trường Quốc gia năm 2010 - Tổng quan Môi trường Việt Nam.

Lưu Hồng Mẫn, Vũ Tiến Khang và Nguyễn Ngọc Hà, 2006. Ứng dụng chế phẩm sinh học để sản xuất phân hữu cơ vi sinh phục vụ cho thâm canh lúa ở Đồng bằng sông Cửu Long. Tạp chí Nông nghiệp và PTNT, (10), trang 10-13.

Ngô Thị Thanh Trúc, 2005. Hướng phát triển trồng nấm rơm ở Đồng bằng sông Cửu Long: Thực trạng và giải pháp.

Tổng cục Thống kê, 2013. http://gso.gov.vn/default.aspx?tabid=717. Truy cập ngày 18/11/2013.

Bronson K.F., Neue H.U., Singh U, 1997. Automated chamber measurement of CH4 and N2O flux in a flooded rice soil. I. Effect of organic amendments, nitrogen source, and water management. Soil Sci. Soc. Am. 61: 981-987.

Corton, T.M., Bajita, J.B., Grospe, F.S., Pamplona, R.R., Asis, C.A., Wassmann, R. and Lantin, R.S., 2000. Methane emission from irrigated and intensively managed rice fields in Central Luzon (Philippines). Nutrient Cycl. Agroecosys. 58: 37-53.

Dobermann A., T.H. Fairhurst, 2002. Rice straw management. Better crop International. Vol.16.

Schütz H., Holzapfel-Pschorn A., Conrad R., Rennenberg H., Seiler W., 1989. A three years continuous record on the influence of daytime, season and fertilizer treatment on methane emission rates from an Italian rice paddy field. J. Geophys. Res. 94: 16405-16416.

Surekha K., A.P. Padma Kumari, M. Narayana Reddy, K. Satyanarayana and P.C. Sta Cruz., 2003. Crop residue management to sustain soil fertility and irrigated rice yields. Nutrient Cycling in Agroecosystems, Volume 67, Number 2,145-154.

Tran Thi Ngoc Son, Luu Hong Man, Cao Ngoc Diep, Tran Thi Anh Thu and Nguyen Ngoc Nam, 2008. Bioconversion of paddy straw and biofertilizer for sustainable rice baced cropping systems, A Journal of the Cuu Long Delta Rice research Institute, ISSN 1815-4662. Issue 16, Omonrice 16:57-70.

Wang Z.P., Delaune R.D., Lindau C.W., Patrick W.H., 1992. Methane production from anaerobic soil amended with rice straw and nitrogen fertilizers. Fert. Res. 33: 115–121.

Wassmann R., Neue H.U., Alberto M.C.R., Lantin R.S., Bueno C., Llenaresas D., Arah J.R.M., Papen H., Seiler W., Rennenberg H., 1996. Fluxes and pools of methane in wetland rice soils with varying organic inputs, Environ. Monit. Assess. 42: 163-173.

Yoshida, S., 1981. Fundamentals of rice crop science. International Rice Research Institute. Los banos, Philippines.pp. 111-121.

Effects of straw treatments on methane emissions and rice yield on alluvial soil in Thoi Lai district, Can Tho city

Nguyen Kim Thu, Cao Van Phung, Tran Van Dung, Vu Ngoc Minh Tam, Ho Nguyen Hoang Phuc

AbstractThe study was conducted to assess the effect of straw treatment on the accumulation rate of CH4 emissions and rice yield on alluvial soil in Tan Thanh commune, Thoi Lai district, Can Tho city. The experiments were designed in a wide area of 1500 m2/1 model with 3 different straw processing treatments and 6 sampling replications for each model. Models included: (i) Incorporating only rice stubble into soil (350 kg/1.000 m2), (ii) Incorporating both rice straw and stubblepre-treated with Tricoderma sp. (520 kg rice straw/1.000 m2) and (iii) Burning all rice and stubble. The results showed that incorporating only rice stubble into soil did not increase the rate and total CH4 as compared to other two residue managements. Rice stubble incorporation helped increase the total C and N content in the soil at the end of the crop (p <0.05), but rice yields were not significant different (p> 0.05) among three models.Key words: Burning all rice and stubble, CH4 gas, gas emissions, rice stubble into soil, Trichoderma sp.

Ngày nhận bài: 14/5/2017Người phản biện: PGS.TS. Mai Văn Trịnh


55


I. ĐẶT VẤN ĐỀ Lan Hoàng thảo vôi (Dendrobium cretaceum)

phân bố ở nhiều quốc gia như Ấn Độ, Nepal, Myanmar, Thái Lan, Lào ở độ cao 1000 - 1800 mét so với mặt nước biển. Tại Việt Nam, lan Hoàng thảo vôi phân bố tự nhiên tại các tỉnh Nam Bộ là loài lan có hoa mọc thành chùm, rất đẹp và lâu tàn rất được ưa chuộng trên thị trường. Hiện nay, ngoài tự nhiên loài lan này rất hiếm do bị thu mua và khai thác tận diệt, khiến giá thành rất cao và trở thành loài hoa có giá trị thương mại lớn. Việc bảo tồn và nhân giống Hoàng thảo vôi là hết sức cần thiết.

Kỹ thuật nhân giống in vitro là phương pháp hiệu quả hiện nay với các ưu điểm như tạo được cây con trẻ hoá và sạch bệnh nên tiềm năng sinh trưởng, phát triển và năng suất cao, tạo số lượng cây lớn và chất lượng đảm bảo, đáp ứng nhu cầu sản xuất trên quy mô rộng (Vũ Ngọc Lan và ctv., 2013).

Trên thế giới cũng như ở Việt Nam có nhiều nghiên cứu về nhân giống in vitro cây Dendrobium đã được thực hiện (Jaime A et al., 2015; Lita Soetopo et al., 2012; Sana Asghar et al., 2011; Nguyễn Văn Kết và ctv., 2010; Vũ Kim Dung và ctv., 2016) nhưng các nghiên cứu về nhân giống lan trên còn rất hạn chế. Bài báo công bố kết quả nhân giống in vitro lan Hoàng thảo vôi đạt hiệu quả cao, góp phần vào công tác bảo tồn nguồn gen loài lan có giá trị thẩm mỹ cao này.


2.1. Vật liệu nghiên cứuVật liệu nuôi cấy là quả lan Hoàng thảo vôi

(Dendrobium cretaceum) thu thập tại Đồng Nai, được lưu giữ tại vườn ươm Viện Công nghệ sinh

học Lâm nghiệp - Trường Đại học Lâm nghiệp Việt Nam.

Hóa chất dùng để khử trùng mẫu là dung dịch HgCl2 0,1%; NaClO 6%.


2.2.1. Phương pháp nghiên cứu chungBố trí thí nghiệm theo phương pháp sinh học

thực nghiệm, lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp có dung lượng mẫu lớn (n ≥ 30), số liệu thu thập sau 5 tuần.

Điều kiện nuôi cấy: Chiếu sáng bằng giàn đèn neon cường độ 2000 lux, 14 giờ/ngày; nhiệt độ phòng nuôi 24 ± 20C. Môi trường nuôi cấy được chuẩn độ pH = 5,8; khử trùng môi trường ở 1180C, áp suất 1atm trong 17 phút.

2.2.2. Bố trí thí nghiệm - Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của kỹ thuật khử

trùng đến tạo mẫu sạch và tạo thể chồiQuả lan được làm sạch, sau đó sát khuẩn bằng

ethanol 70% trong 2 phút. Khử trùng mẫu bằng dung dịch HgCl2 0,1% (5 - 15 phút) và NaClO 6% (10 - 25 phút). Tách vỏ quả, trải hạt lên môi trường nuôi cấy khởi động là môi trường cơ bản MS bổ sung thêm 30 g/l sucrose, 7g/l agar.

- Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến nhân nhanh chồi

Dùng các môi trường khoáng: Knops, MS, WPM bổ sung 0,2 mg/l BAP, 30 g/l sucrose, 7 g/l agar, 100 ml/l dịch chiết khoai tây, 100 ml/l nước dừa.

- Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến nhân nhanh chồi

Dùng môi trường khoáng MS bổ sung 0,3 - 0,6 mg/l BAP, 0,2 - 0,3 mg/l NAA và 0,1 - 0,6 mg/l

1 Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp Việt Nam

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO TRONG NHÂN GIỐNG LAN HOÀNG THẢO VÔI (Dendrobium cretaceum Lindley)

Nguyễn Văn Việt1

TÓM TẮTVi nhân giống lan Hoàng thảo vôi (Dendrobium cretaceum) đã được nghiên cứu thành công. Kết quả

nghiên cứu cho thấy, sát khuẩn bề mặt quả lan bằng ethanol 70% trong 2 phút, khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 10 phút và nuôi cấy trên môi trường MS, cho tỷ lệ mẫu sạch là 94,7%, tỷ lệ mẫu phát sinh thể chồi là 90% với thời gian phát sinh chồi 20 ngày. Cảm ứng tạo đa chồi trên môi trường bổ sung 0,5 mg/l BAP, 0,3 mg/l NAA, 0,3 mg/l Kinetin, 100 ml/l dịch chiết khoai tây, 100 ml/l nước dừa, 30 g/l sucrose, 5 g/l agar cho hệ số nhân chồi cao nhất 12,3 sau 5 tuần nuôi cấy. Chồi ra rễ đạt 93,3%, số rễ trung bình đạt 4,1 rễ/cây và chiều dài rễ trung bình 3,6 cm khi nuôi trên môi trường MS bổ sung 0,2 mg/l IBA, 0,3 mg/l NAA, 100 ml/l dịch chiết khoai tây, 20 g/l sucrose sau 5 tuần nuôi cấy.

Từ khóa: Dendrobium cretaceum, Hoàng thảo vôi, cụm chồi, nuôi cấy mô, in vitro

56


Kinetin, 30 g/l sucrose, 7 g/l agar, 100 ml/l dịch chiết khoai tây, 100 ml/l nước dừa.

- Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng ra rễ

Dùng môi trường khoáng MS bổ sung 0,1 - 0,4 mg/l IBA, 0,2 - 0,4 mg/l NAA, 20 g/l sucrose, 7 g/l agar, 100 ml/l dịch chiết khoai tây, 100 ml/l nước dừa.

2.2.3. Phương pháp xử lý số liệuXử lý số liệu theo phương pháp thống kê sinh học

ứng dụng các phần mềm đã lập trình trên máy tính điện tử như Excel.

2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứuNghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm

Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp Việt Nam, từ tháng 10 năm 2016 đến tháng 6 năm 2017.


3.1. Tạo mẫu sạch và tái sinh thể chồi in vitroTrong quy trình kỹ thuật nhân giống cây trồng

bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, tỷ lệ mẫu sạch có khả năng tái sinh chồi có ý nghĩa rất quan trọng đối với các bước tiếp theo. Việc xác định công thức khử trùng tối ưu để nâng cao hiệu quả tạo mẫu sạch in vitro và khả năng nẩy mầm của mẫu sạch. Môi trường nuôi cấy là môi trường khoáng cơ bản MS bổ sung 30 g/l sucrose, 7g/l agar để bào mẫu. Kết quả thu được sau 4 tuần theo dõi được trình bày ở bảng 1.

Bảng 1. Ảnh hưởng của hóa chất và thời gian khử trùng đến tạo mẫu sạch và nảy mầm

Từ kết quả thu được (bảng 1), cho biết dùng dung dịch HgCl20,1% với thời gian khử trùng 5 - 15 phút và dung dịch NaClO 6% với thời gian 15 - 25 phút, tỷ lệ mẫu sạch tương đối cao, đạt giá trị từ 76 - 100%. Trong đó, ảnh hưởng của từng loại hóa chất đến kết quả khử trùng là rõ rệt khi bố trí thời gian khử trùng khác nhau. Khi tăng thời gian khử trùng thì tỷ lệ

mẫu sạch đều tăng, nhưng tỷ lệ mẫu nảy mầm có xu hướng giảm (đạt 30 - 90%), chứng tỏ hóa chất khử trùng có thể làm sạch mẫu nhưng đều là chất rất độc, nếu khử trùng lâu hóa chất sẽ ngấm vào mô thực vật sẽ làm hỏng hoặc gây độc, do đó hạt không thể nảy mầm (Lita Soetopo et al., 2012). Với kết quả ở bảng trên, có thể chọn dung dịch HgCl 2 0,1%, để khử trùng mẫu với thời gian 10 phút, hoặc NaClO 6% khử trùng mẫu trong 20 phút là phù hợp.

3.2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng nhân nhanh chồi

Môi trường khoáng cơ bản cung cấp dinh dưỡng cho cây và có thể quyết định tới khả năng nhân nhanh chồi. Tuy vậy, mỗi loài cây sẽ thích hợp với mỗi loại môi trường khoáng nhất định. Trong thí nghiệm này, sử dụng 3 loại môi trường nuôi cấy với các môi trường khoáng cơ bản khác nhau (MS, WPM, Knops) bổ sung 0,2 mg/l BAP, 30 g/l sucrose, 7 g/l agar, 100 ml/l dịch chiết khoai tây, 100 ml/l nước dừa. Kết quả được trình bày qua bảng 2.

Bảng 2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng nhân nhanh chồi

Kết quả ở bảng 2 cho thấy, môi trường khoáng cơ bản MS có khả năng tái sinh chồi cao (87,6%), thích hợp cho tái sinh chồi, chất lượng chồi tốt, phát triển nhanh và chồi mập, màu xanh đậm, số chồi nhiều (5,6 chồi/mẫu). Kết quả phân tích phương sai 1 nhân tố cho thấy, Ftính = 90,97 > Fcrit = 5,14, chứng tỏ có sự khác biệt rõ rệt giữa tỷ lệ tái sinh chồi ở các môi trường cơ bản khác nhau.

3.3. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi

Việc bổ sung Kinetin, BAP và NAA kết hợp làm cho hệ số nhân của chồi tăng lên rõ rệt. Các chất này thường được sử dụng để kích thích sự phân hóa, sinh trưởng và phát triển chồi của mẫu cấy in vitro. Tác dụng chủ yếu của chúng là kích thích sự phân chia mạnh mẽ của tế bào, đặc biệt ảnh hưởng rất lớn đến sự hình thành và phân hóa chồi (Nguyễn Văn Kết và ctv., 2010).

Loại hóachất

Thời gian

(phút)

Tỷ lệ mẫu sạch (%)

Tỷ lệ mẫu nảy

mầm (%)

Thời gian nẩy

mầm (ngày)

HgCl 20,1%

5 83,3 80,0 2010 94,7 90,0 2015 100 66,7 30

NaClO6%

15 76,7 66,7 2020 91,5 86,7 2025 100 30,0 25

CTTN Môi trường dinh dưỡng

Tỷ lệ (%)

Số chồi TB/mẫu

Chất lượng chồi

D1 MS 87,6 5,6 Chồi mập, xanh lá

D2 Knops 71,3 4,1 Chồi mập, ít, xanh đậm

D3 WPM 80,9 4,0 Chồi mập, xanh đậm

57


3.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ BAP và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi

Một số công trình nghiên cứu đã công bố về nhân giống chi lan Dendrobium của các tác giả, cho thấy chất điều hòa sinh trưởng BAP, NAA ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ mẫu tái sinh chồi (Sana và ctv., 2011). Trong thí nghiệm này đã sử dụng môi trường khoáng cơ bản là MS bổ sung 0,3 - 0,6 mg/l BAP và 0,2 - 0,3 mg/l NAA, 30 g/l sucrose, 7 g/l agar, 100 ml/l dịch chiết khoai tây, 100 ml/l nước dừa. Kết quả được trình bày tại bảng 3.

Kết quả cho thấy ở tất cả các công thức thí nghiệm có tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi đều đạt trên 50%, trong đó công thức thí nghiệm NC2 (bổ sung 0,4 mg/l BAP, 0,2 mg/l NAA) cho kết quả tốt với tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi đạt 76,7%, số chồi TB/mẫu đạt 8,9, chất lượng chồi tốt, mập, đồng đều, màu xanh đậm (Bảng 3). Tương tự ở công thức NC6 (bổ sung 0,5 mg/l BAP, 0,3 mg/l NAA) cho tỷ lệ mẫu tạo chồi cao (90%), số chồi TB/mẫu đạt 9,6. Kết quả phân tích phương sai một nhân tố cho thấy Ftính = 85,14 > Fcrit = 2,66, như vậy hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng có ảnh hưởng rõ rệt tới khả năng nhân nhanh chồi.

Bảng 3. Ảnh hưởng của nồng độ BAP và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi

Ghi chú: Bảng 3, 4: +: Chồi mảnh, yếu, lá xanh; ++: Chồi thấp, gầy, yếu, lá xanh; +++: Chồi cao, mập, lá xanh đậm

3.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP, NAA và Kinetin đến nhân nhanh chồi

Xác định ảnh hưởng của tổ hợp BAP, NAA và Kinetin đến khả năng tạo chồi, thí nghiệm được bố trí với môi trường khoáng cơ bản MS bổ sung 0,5 mg/l BAP, 0,3 mg/l NAA, 0,2 - 1 mg/l Kinetin, 30 g/l sucrose, 7 g/l agar, 100 ml/l dịch chiết khoai tây, 100 ml/l nước dừa. Kết quả thu được sau 4 tuần được trình bày ở bảng 4.

Bảng 4. Ảnh hưởng của nồng độ BAP, Kinetin và NAA đến nhân nhanh chồi

Kết quả cho thấy khi bổ sung đồng thời BAP, NAA và Kinetin vào môi trường nuôi cấy, ở các công thức thí nghiệm cho tỷ lệ tạo cụm chồi đều cao. Với giá trị tỷ lệ tạo cụm chồi đạt 63,3% đến 96,7%, số chồi trung bình của một mẫu đạt từ 9,6 đến 12,3. Đặc biệt là công thức N3 đạt giá trị cao nhất, tỷ lệ tạo cụm chồi, số chồi trung bình của mỗi mẫu lần lượt là 96,7% và 12,3 (Bảng 4). Kết quả phân tích phương sai một nhân tố cho thấy: Ftính = 94,15 > Fcrit = 3,11, chứng tỏ tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng có ảnh hưởng rõ rệt tới nhân nhanh chồi.

3.4. Ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng ra rễ

Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh in vitro là khâu quan trọng trước khi cho cây ra ngoài huấn luyện. Thí nghiệm được tiến hành với việc cấy chuyển chồi lan đủ tiêu chuẩn (chồi đạt 3 - 4 cm, mập, lá xanh) vào môi trường khoáng cơ bản MS bổ sung 0,1 - 0,4 mg/l IBA, 0,2 - 0,4 mg/l NAA, 20 g/l sucrose, 7 g/l agar, 100 ml/l dịch chiết khoai tây, 100 ml/l nước dừa. Kết quả thí nghiệm được thu thập và trình bày ở bảng 5.

Kết quả ở bảng 5 cho thấy, ở các công thức thí nghiệm chỉ bổ sung một chất ĐHST (IBA hoặc NAA) cho tỷ lệ ra rễ thấp. Môi trường bổ sung 0,2 – 0,4 mg/l IBA, tỷ lệ ra rễ đạt 63,3 đến 80,3% và chỉ số ra rễ đạt 8,0 đến 9,8. Với các công thức môi trường bổ sung 0,2 - 0,4 mg/l NAA, tỷ lệ ra rễ và chỉ số ra rễ cao nhất lần lượt là 80,3% và 12,2. Các công thức môi trường bổ sung phối hợp hai chất 0,1 - 0,3 mg/l IBA và 0,2 - 0,4 mg/l NAA, cho kết quả cao hơn so với bổ sung một trong hai chất trên, cụ thể là ở công thức R8, môi trường khoáng cơ bản MS bổ sung 0,2 mg/l IBA và 0,3 mg/l NAA cho kết quả cao nhất về tỷ lệ chồi ra rễ và chỉ số ra rễ lần lượt là 93,3% và 14,7. Kết quả phân tích phương sai một nhân tố cho thấy Ftính = 75,52 > Fcrit = 2,39, như vậy nồng độ chất ĐHST khác nhau ảnh hưởng rõ rệt tới khả năng ra rễ của Hoàng thảo vôi.

CTTNNồng độ

ĐHST (mg/l)Tỷ lệ tạo cụm chồi

(%)


Chất lượng chồiBAP NAA

ĐC 0 0 50,1 5,6 + NC1 0,3

0,266,7 8,1 +++

NC2 0,4 76,7 8,9 +++NC3 0,5 83,3 7,9 ++NC4 0,3

0,3

70,0 6,4 +++NC5 0,4 80,0 8,4 +++NC6 0,5 90,0 9,6 +++NC7 0,6 83,3 7,8 +++

CTTN

Nồng độ ĐHST (mg/l)

Tỷ lệ tạo cụm

chồi (%)


Chất lượng chồiBAP NAA Kinetin

N1

0,5 0,3

0,1 63,3 9,8 +N2 0,2 76,7 10,1 +++N3 0,3 96,7 12,3 +++N4 0,4 80,0 10,4 ++N5 0,5 73,3 9,6 +++

58


Using in vitro culture technique for propagation of Dendrobium cretaceum LindleyNguyen Van Viet

AbstractMicropropagation of Dendrobium cretaceum Lindley by in vitro cultural technique has been successfully studied. The results showed that bud sterilization by soaking in ethanol 70% for 2 minutes, HgCl2 0.1% solution for 10 minutes, then culturing in MS medium could provide survival ratio of 94.7% and protocorm ratio of 90% after 20 days. Forming multi-buds induction in Knops with 6-benzylaminopurine (BAP) 0.5 mg/l, α-naphthaleneacetic acid (NAA) 0.3 mg/l, Kinetin 0.3 mg/l, coconut water 100 ml/l, potatoes extract 100 ml/l, sucrose 30g/l, agar 7 g/l gave the highest multiplication coefficient (12.3) of formed buds after 5 weeks. The rooted shoots reached 93.3%, the average number of roots was 4.1 per individual and the average length of roots was 3.6 cm when cultured in MS medium supplemented with IBA 0.2 mg/l, NAA 0.3 mg/l, and potatoes extract 100 ml/l, sucrose 20g/l after 5 weeks. Key words: Dendrobium cretaceum, in vitro, knops, propagation, protocormNgày nhận bài: 8/6/2017Người phản biện: TS. Trần Danh Sửu


Bảng 5. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng tới khả năng ra rễ

CTTN

ĐHST (mg/l)

Tỷ lệ chồi ra rễ (%)

Số rễ TB/cây

Chiều dài

TB/rễ

Chỉ số ra rễ

IBA NAAĐC - - 23,3 2,7 2,0 5,4R1 0,2

063,3 3,2 2,5 8,0

R2 0,3 70,0 3,3 2,6 8,6R3 0,4 80,0 3,5 2,8 9,8R4

00,2 73,3 3,1 2,4 7,4

R5 0,3 80,3 3,7 3,3 12,2R6 0,4 78,5 3,7 3,0 11,1R7 0,1 0,2 89,7 3,8 3,4 12,9R8 0,2 0,3 93,3 4,1 3,6 14,7R9 0,3 0,4 91,3 4,0 3,3 13,2

Hình 1. Hình ảnh cây lan Hoàng thảo vôi qua các giai đoạn nuôi cấy

a) Tạo mẫu sạch; b) Thể chồi lan Hoàng thảo vôi; c) Cụm chồi ở môi trường MS; d) Cụm chồi ở môi trường Knops; e) Cụm chồi ở môi trường WPM; f) Cụm chồi ở CTMT NC6; g) Cụm chồi ở CTMT NC2; h) Cụm chồi ở CTMT N3;

i) Cây lan hoàn chỉnh

IV. KẾT LUẬN- Khử trùng mẫu bằng dung dịch HgCl2 0,1%

trong 10 phút đạt tỷ lệ sạch 94,7%, tạo thể chồi là 90%. - Môi trường để nhân nhanh chồi và cụm chồi

là môi trường khoáng cơ bản MS có bổ sung 0,5 mg/l BAP, 0,3 mg/l NAA và 0,3 mg/l Kinetin, 30 g/l sucrose, 7 g/l agar, 100 ml/l dịch chiết khoai tây, 100 ml/l nước dừa, pH = 5,8. Tỷ lệ tạo cụm chồi và số chồi TB/mẫu lần lượt là 96,7% và 12,3.

- Môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh là môi trường khoáng cơ bản MS bổ sung 0,2 mg/l IBA và 0,3 mg/l NAA, 100 mg/l dịch chiết khoai tây, 20 g/l sucrose, 5 g/l agar. Tỷ lệ chồi ra rễ 93,3%, số rễ trung bình là 4,1, chiều dài rễ trung bình là 3,6 cm, chỉ số rễ 14,7.

TÀI LIỆU THAM KHẢOVũ Kim Dung, Nguyễn Văn Việt, Bùi Văn Thắng,

2016. Nhân giống lan Hoàng thảo ý thảo ba màu (Dendrobium gratiosissimum Reichenb.f) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Lâm nghiệp 6: 156-161.

Nguyễn Văn Kết, Nguyễn Văn Vinh, 2010. Nghiên cứu khả năng nhân giống loài Lan Hoàng Thảo Sáp (Dendrobium crepidatum Lindl, & Paxt,) in vitro. Tạp chí khoa học và công nghệ, 48(5): 89-95.

Vũ Ngọc Lan, Nguyễn Thị Lý Anh, 2013. Nhân giống in vitro loài lan bản địa Dendrobium nobile Lindl. Tạp chí Khoa học và phát triển, 11 (7): 917-925.

Jaime A, Teixeira da Silva, Jean Carlos Cardoso, Judit Dobranszki, Songjun Zheng, 2015. Dendrobium micropropagation a review. Plant Cell Rep, 34: 671-704.

Lita Soetopo and Sri Lestari Purnamaningsih, 2012. In vitro propagation of Dendrobium and Phalaenopsis through tissue culture for conservation. Agrivita, 34(2): 115-126.

Sana Asghar, Touqeer Ahmad, Ishfaq Ahmad Hafiz, Mehwish, 2011. In vitro propagation of orchid (Dendrobium nobile) var, Emma white. African Journal of Biotechnology, 10(16): 3097-3103.

(a)

(d)

(g)

(b)

(e)

(h)

(c)

(f)

(i)

59



I. ĐẶT VẤN ĐỀHồ tiêu (Piper nigrum L.) là một loại cây trồng có

giá trị kinh tế hiện đang được trồng phổ biến ở Việt Nam. Bệnh do virus gây ra gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến ngành sản xuất hồ tiêu do làm giảm năng suất thu hoạch. Các triệu chứng đặc trưng của bệnh bao gồm lá bị giảm kích thước, khảm và biến dạng; cây còi cọc, tạo ra gié hoa ngắn và ít hoa. Triệu chứng bệnh có thể khó phân biệt được bằng mắt thường ở một số thời điểm, giai đoạn sinh trưởng và dưới tác động của một số nhân tố khác (de Silva et al., 2002).

Piper yellow mottle virus (PYMoV) là virus DNA mạch kép, gây nhiễm trên các loài thuộc giống tiêu (Piper spp) (Lockhart et al.,1997) và đã được phát hiện trên cây hồ tiêu ở các nước như Brazil (Duarte et al., 2001), Sri Lanka (de Silva et al., 2002), Ấn độ (Bhat et al., 2003; Hareesh và Bhat, 2008; Bhat et al., 2009), Malaysia, Philippin, Thái Lan (Lockhart et al. 1997). Tuy nhiên, tại Việt Nam, các nghiên cứu phát hiện PYMoV trên hồ tiêu vẫn còn rất ít. Một số ng-hiên cứu về nhân giống hồ tiêu sạch virus đã công bố chỉ tiến hành kiểm tra sự hiện diện của các loại virus như TMV (Tobaco mosaic virus) (Nguyễn Thị Kim Linh et al., 2006), ToMV (Tomato mosaic virus), PVX (Potato virus X), PVY (Potato virus Y) (Đoàn Thị Ái Thuyền et al., 2005; Nguyễn Thị Kim Linh et al., 2006) và CMV (Cucumber mosaic virus) (Đoàn Thị Ái Thuyền et al., 2005). Vì vậy, việc nghiên cứu chẩn đoán và từ đó xác định sự hiện diện của PYMoV trên hồ tiêu trồng tại Việt Nam là vấn đề có ý nghĩa

quan trọng đối với việc chẩn đoán bệnh virus trên hồ tiêu ở trong nước.

Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đề xuất quy trình chẩn đoán nhanh PYMoV trên hồ tiêu, góp phần then chốt trong công tác sản xuất giống hồ tiêu sạch virus ở Việt Nam.


2.1. Vật liệu nghiên cứuMẫu lá hồ tiêu có biểu hiện các triệu chứng như

khảm và biến dạng được thu thập tại các vườn trồng hồ tiêu ở Việt Nam.

Mồi PYMoI và PYMoIII dùng cho khuếch đại đoạn gen của virus.

Chủng vi khuẩn E.coli DH5α sử dụng cho nhân dòng gen.

2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứuCác thí nghiệm được thực hiện trong khoảng thời

gian từ 01/2012 đến 12/2014 tại phòng Công nghệ Sinh học Thực vật, thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh.


2.3.1. Tách chiết DNA ADN tổng số được tách chiết từ mẫu lá hồ tiêu

có biểu hiện triệu chứng nhiễm virus (100 mg) bằng kít tách chiết ADN EZ-10 Spin Column Plant DNA Minipreps (Biobasic, Canada). DNA sau khi tách

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR CHẨN ĐOÁN PIPER YELLOW MOTTLE VIRUS GÂY HẠI TRÊN HỒ TIÊU (Piper nigrum L.) Ở VIỆT NAM

Nguyễn Xuân Dũng1, Dương Hoa Xô1


TÓM TẮTPiper yellow mottle virus (PYMoV) là một trong 2 loại virus gây hại chính trên hồ tiêu đã được phát hiện ở nhiều

nước trên thế giới. Tuy nhiên, vấn đề chẩn đoán virus PYMoV trên hồ tiêu vẫn chưa được quan tâm nhiều tại Việt Nam. Để hỗ trợ cho việc chẩn đoán chính xác tác nhân gây bệnh virus trên hồ tiêu, trong đó có PYMoV, và sản xuất giống tiêu sạch virus ở Việt Nam, quy trình PCR đã được phát triển để chẩn đoán virus này. Theo đó, kỹ thuật PCR được áp dụng để khuếch đại đoạn gen có kích thước khoảng 450 bp hay 400 bp từ bộ gen virus với mồi PYMoI hay PYMoIII tương ứng. Quy trình chẩn đoán được sử dụng cho việc xác định sự hiện diện của virus ở các vườn trồng hồ tiêu tại các khu vực Tây Ninh, Đồng Nai và Đăk Lăk. Kết quả cho thấy đã phát triển thành công quy trình chẩn đoán PYMoV. Phản ứng PCR có thể phát hiện virus ở mức 100 bản sao/µL. Trình tự đoạn gen khuếch đại có độ tương đồng từ 85% - 87% so với trình tự đã được công bố trên Ngân hàng gen. Sự hiện diện của virus được ghi nhận ở tất cả các khu vực khảo sát với tỷ lệ nhiễm trung bình 41,12% (88 trong tổng số 214 mẫu). Tỷ lệ nhiễm virus cao nhất được ghi nhận tại Tây Ninh (57,69%) và thấp nhất tại Đồng Nai (24,51%). Kết quả này cho thấy PYMoV hiện đang gây nhiễm khá phổ biến trên hồ tiêu ở Việt Nam.

Từ khóa: Bệnh virus, Piper yellow mottle virus, Piper nigrum, PCR, chẩn đoán virus

60


chiết được phân tích và xác định hàm lượng bằng máy đo quang phổ NanoDrop (Thermo).

2.3.2. Khuếch đại gen mục tiêu bằng PCRĐoạn gen ORFI hay ORFIII được khuếch đại

bằng phản ứng PCR với mồi PYMoI (Mồi xuôi: 5’-TAACAGGACTAGGGATCG-3’, Mồi ngược: 5’-CAGCTGGTCTTGATAATAG-3’ (Bhat và Siju, 2007) hay PYMoIII (Mồi xuôi: 5’-CTATATGAAT-GGCTAGTGATG-3’, Mồi ngược: 5’-TTCCTAG-GTTTGGTATGTATG-3’) (Bhat et al., 2009). Phản ứng được thực hiện với thể tích 25 µL, chứa 5 µLDream TaqBuffer (10X), 0,2µLDream Taq DNA Polymerase (5 U/µL), 0,5µL dNTP (10 mM) (Ther-mo), 0,2µLRiboSafe RNase Inhibitor (40U/µL) (Biobasic), 17µL Nuclease-free H2O, 0,5 µL(10 μM) mỗi loại mồi xuôi và mồi ngược, và 1 µL mẫu DNA. Chương trình nhiệt gồm 1 chu kỳ 95oC/5 phút; 39 chu kỳ 95oC/15 giây, 45oC/30 giây, 72oC/1 phút và 1 chu kỳ 72oC/15 phút. Sản phẩm PCR được phân tích bằng điện di trên gel agarose 1,5% với hiệu điện thế 100 V trong thời gian 30 phút.

2.3.3. Xác định trình tự genĐoạn gen mục tiêu sau khi khuếch đại bằng

phản ứng PCR được gắn vào vector pJET1.2 (CloneJETTM PCR Cloning Kit-Fermentas). Vector sau khi đã gắn gen được biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5α bằng phương pháp hóa biến nạp. Dịch tế bào vi khuẩn E. coli DH5α sau khi biến nạp được cấy trãi trên đĩa petri chứa môi trường LB bổ sung 100mg/L ampicillin, nuôi cấy qua đêm ở 37oC. Khuẩn lạc của các dòng tế bào mọc được trên môi trường kháng sinh được kiểm tra trực tiếp bằng phản ứng PCR với mồi pJET1.2 (Mồi xuôi: 5’CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3’, Mồi ngược: 5’-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3’) định vị trên vector ở hai đầu của vị trí đoạn gen được chèn vào. Dòng vi khuẩn thu được sau khi sàng lọc và kiểm tra được tách plasmid (sử dụng kit ADN-SpinTM Plasmid ADN Purification Kit - Intron) và tiến hành giải trình tự thông qua hãng Macrogen (Hàn Quốc). Kết quả giải trình tự sẽ được so sánh trở lại với các trình tự của virus được công bố trên Ngân hàng gen.

2.3.4. Xác định độ nhạy của phản ứng PCRTiến hành tách plasmid từ dòng vi khuẩn đã

được tạo dòng, đo hàm lượng DNA và tính toán số lượng bản sao có được theo công thức:

Trong đó khối lượng DNA tính bằng đơn vị ng và chiều dài đoạn gen tính bằng bp (Nguồn: URI Ge-nomics & Sequencing Cente, http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html).

Độ nhạy của phản ứng sẽ được kiểm tra dựa trên việc thực hiện phản ứng với mẫu có số bản sao biết trước, đươc pha loãng thành các nồng độ khác nhau theo hệ số bậc 10 (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5,…). Xác định mẫu có nồng độ thấp nhất mà phản ứng có thể phát hiện được, từ đó tính ra số bản sao tương ứng.

2.3.5. Chẩn đoán sự hiện diện của PYMoV trên hồ tiêu ngoài thực tiễn sản xuất

Mẫu lá, thu thập ngẫu nhiên từ các vườn trồng hồ tiêu ở các khu vực Tây Ninh, Đồng Nai, Đăk Lăk, được tách chiết ADN và thực hiện phản ứng PCR khuếch đại gen để xác định sự hiện diện của virus. Tình trạng nhiễm virus được đánh giá dựa trên tỷ lệ giữa số mẫu cho kết quả dương tính với phản ứng PCR và tổng số mẫu được kiểm tra.


3.1. Tách chiết ADNKết quả phân tích ADN cho thấy chỉ số OD260/280

và nồng độ ADN của các mẫu tách chiết đều đạt giá trị gần với mức chuẩn về chất lượng DNA dùng cho phản ứng PCR (OD~1,8 và nồng độ ~ 50-100 ng/µL) (Bảng 1). Các mẫu ADN như vậy có thể đảm bảo độ tinh khiết và nồng độ để sử dụng cho phản ứng PCR khuếch đại gen.

Bảng 1. Kết quả phân tích ADN tách chiết

3.2. PCR chẩn đoán PYMoVTheo tính toán lý thuyết, hai cặp mồi PYMoI và

PYMoIII có khả năng khuếch đại phân đoạn gen có kích thước tương ứng là 450 bp và 400 bp từ vùng gen ORFI và ORFIII của virus. Kết quả phản ứng PCR đã thu được băng DNA ở vị trí giữa 400 bp và 500 bp cho trường hợp mồi PYMoI; và một băng DNA ở vị trí khoảng 400 bp cho trường hợp mồi PYMoIII (Hình 1). Kết quả này cho thấy phản

Mẫu OD260/280Nồng độ DNA

(ng/ µL)M1 1,74 41,4M2 1,75 58,2M3 1,76 43,3M4 1,75 53,5M5 1,77 45,8Trung bình 1,75 48.4

61


ứng PCR đã khuếch đại được hai phân đoạn DNA có kích thước như dự kiến từ DNA tách chiết từ mẫu lá tiêu. Theo thiết kế của mồi khuếch đại, các phân đoạn DNA này là sản phẩm được khuếch đại từ gen của virus. Mặc dù vậy, vẫn không thể khẳng định chắc chắn các trình tự đã được khuếch đại có phải là trình tự gen của virus hay không, bởi vì khả năng bắt cặp và khuếch đại của mồi với một đoạn DNA nào đó trong DNA tổng số tách chiết từ mẫu lá vẫn có thể xảy ra. Vì vậy, để khẳng định chắc chắn điều này, các phân đoạn DNA thu được sau khi thực hiện phản ứng khuếch đại đã được dòng hóa và giải trình tự.

Hình 1. Kết quả kiểm tra sản phẩm của phản ứng khuếch đại gen virus PYMoV với cặp mồi PYMoI (A) và PYMoIII (B). 1. Chứng âm (nước cất), 2. Thang DNA (GeneRuler 100 bp, Thermo Scientific), 3-5. Mẫu.

3.3. Xác định trình tự gen Sau khi gắn gen vào vector và biến nạp vào vi

khuẩn, đã thu được các khuẩn lạc phát triển trên

môi trường LB bổ sung100 mg/L ampicilin. Các khuẩn lạc này tiếp tục được kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi pJET1.2. Kết quả phản ứng thu được băng DNA ở vị trí khoảng 600 bp và 500 bp tương ứng cho trường hợp mồi PYMoI và PYMoIII, phù hợp với kích thước sản phẩm dự kiến là 568 bp và 518 bp (Hình 2). Điều này cho thấy các dòng vi khuẩn này có mang vector chứa gen mục tiêu

Hình 2. Kết quả kiểm tra sự hiện diện của đoạn gen mục tiêu trong các dòng vi khuẩn với cặp mồi pJET1.2 nằm trên vector. 1: Thang DNA; 2, 3. Khuẩn lạc mang đoạn gen được khuếch đại với mồi PYMoI; 4,5. Khuẩn lạc mang đoạn gen được khuếch đại với mồi PYMoIII

Kết quả giải trình tự gen từ plasmid và so sánh trên Ngân hàng gen cho thấy đoạn gen khuếch đại được đúng là gen (ORF1/hypothetical protein) của virus PYMoV, với độ tương đồng đạt 85-87% so với các trình tự đã được công bố (Hình 3). Kết quả này cho thấy phản ứng PCR đã khuếch đại đúng đoạn gen cũng như virus mục tiêu.

BA

5 5

Hình 3. Kết quả so sánh trình tự đoạn gen khuếch đại được của virus PYMoV với các trình tự được công bố trên Ngân hàng gen.

3.4. Xác định độ nhạy của phản ứng PCRĐể xác định ngưỡng phát hiện, phản ứng PCR

đã được thực hiện với cặp mồi PYMoI trên 10 mẫu virus PVY có nồng độ virus từ 1010 đến 101 bản sao/µL, tương ứng ở mức 10 tỉ đến 10 bản sao/µL. Kết quả phản ứng đã thu được băng DNA ở vị trí gần 500 bp, phù hợp với kích thước sản phẩm dự kiến

450 bp. Sản phẩm khuếch đại hiện diện ở các mẫu có nồng độ từ 1010 đến 102 bản sao/µL. Ở trường hợp mẫu có nồng độ 101 bản sao/µL, không thu được sản phẩm khuếch đại (Hình 4). Như vậy, phản ứng PCR trong trường hợp này có thể phát hiện được gen virus ở mức 100 bản sao/µL.

400bp400bp300bp

450bp500bp400bp

500bp

600bp

62


Hình 4. Kết quả kiểm tra sản phẩm của phản ứng khuếch đại gen virus PYMoV với mồi PYMoI ở các nồng độ mẫu (DNA plasmid) khác nhau

1 - 10: Mẫu có nồng độ 101 - 1010 theo thứ tự pha loãng bậc 10; 11: Thang DNA

Độ nhạy có ý nghĩa rất quan trọng đối với một phản ứng PCR sử dụng cho mục đích chẩn đoán tác nhân gây bệnh, đặc biệt đối với các tác nhân có biểu hiện tiềm ẩn như virus thực vật. Độ tin cậy của kết quả trong các trường hợp được kết luận âm tính phụ thuộc rất nhiều vào độ nhạy của phản ứng. Một số nghiên cứu sử dụng PCR chẩn đoán virus PYMoV trên hồ tiêu đã xác định độ nhạy thông qua việc thực hiện phản ứng với các mẫu pha loãng theo hệ số bậc 10 từ DNA tách chiết (de Silva et al., 2002; Bhat et al.,2007; Bhat et al., 2009, Bhat và Siljo, 2014). Tuy nhiên, phương thức này chỉ cho phép ước lượng độ nhạy tương đối vì không thể xác định được lượng virus có trong mẫu tách chiết ban đầu là bao nhiêu. Giá trị này nhiều hay ít phụ thuộc vào mức độ nhiễm virus của mẫu được tách chiết DNA. Cùng phương thức sử dụng mẫu pha loãng như trên, tuy nhiên nghiên cứu này đã thực hiện phản ứng trên các mẫu có số lượng bản sao gen virus được biết trước, do đó có thể xác định chính xác độ nhạy của phản ứng. Với độ nhạy đạt mức 100 bản sao/1µL, phản ứng PCR có thể cho phép phát hiện được sự hiện diện của virus trong cây ở giai đoạn sớm của sự lây nhiễm. Kết quả này có ý quan trọng đối với việc tầm soát virus cũng như chọn lọc nguồn cây đầu dòng sạch virus để sản xuất giống hồ tiêu phục vụ cho sản xuất.

3.5. Chẩn đoán sự hiện diện của PYMoV trên hồ tiêu trong thực tế sản xuất

Kết quả kiểm tra cho thấy có 88 mẫu nhiễm PYMoV, chiếm tỷ lệ 41,12%, trong tổng số 214 mẫu hồ tiêu được thu thập tại các khu vực có diện tích trồng hồ tiêu lớn ở Việt Nam như Tây Ninh, Đồng Nai và Đăk Lăk. Trong đó, tỷ lệ nhiễm virus cao nhất được ghi nhận tại Tây Ninh (57,69%) và thấp nhất tại Đồng Nai (24,51%) (Bảng 1). Kết quả này cho thấy có sự hiện diện của PYMoV trên cây hồ tiêu

trồng ở Việt Nam và virus này hiện đang gây hại khá phổ biến ở các vườn trồng tiêu với tỷ lệ trung bình vượt trên mức 40%.

Bảng 2. Tỷ lệ nhiễm PYMoV của mẫu hồ tiêu thu thập tại các khu vực

PYMoV là một trong hai loại virus gây hại nghiêm trọng trên hồ tiêu, tuy nhiên vẫn chưa được đề cập đến trong các nghiên cứu về phát hiện virus gây hại trên hồ tiêu được công bố chính thức tại Việt Nam. Điều này đã vô tình tạo ra kẽ hở trong việc kiểm soát bệnh do virus gây ra trên hồ tiêu cũng như công tác sản xuất giống hồ tiêu sạch bệnh. Với việc thiết lập được quy trình phát hiện có độ nhạy cao đồng thời khẳng định sự hiện diện của PYMoV tại Việt Nam, nghiên cứu này sẽ mang lại những thay đổi tích cực đối với việc trồng và sản xuất hồ tiêu trong nước.


4.1. Kết luận- Quy trình PCR sử dụng 2 cặp mồi PYMoI và

PYMoIII đều có thể chẩn đoán nhanh và chính xác PYMoV trên cây hồ tiêu với ngưỡng phát hiện ở mức 100 bản sao/µL.

- Ứng dụng quy trình trên vào việc chẩn đoán đã ghi nhận được tỷ lệ trung bình 41,12% nhiễm PY-MoV trên tổng số 214 mẫu hồ tiêu thu thập tại 3 tỉnh Tây Ninh, Đồng Nai và Đăk Lăk.

Khu vực lấy mẫu

Số mẫu kiểm tra

Số mẫu nhiễm virus

Tỷ lệ (%)

Tây Ninh 104 60 57,69Đồng Nai 102 25 24,51Đăk Lăk 8 3 37,50Tổng số 214 88 41,12

500bp

250bp

63


4.2. Đề nghịQuy trình chẩn đoán có thể được áp dụng để phát

hiện nhanh PYMoV trên mẫu lá hồ tiêu. Quy trình này cần được sử dụng rộng rãi để kiểm chứng tính đặc hiệu và độ chính xác của nó trong công tác chẩn đoán bệnh virus gây hại hồ tiêu ở Việt Nam.

LỜI CẢM ƠNCông trình này được tài trợ kinh phí từ Sở Khoa

học và Công nghệ tỉnh Đồng Nai.

TÀI LIỆU THAM KHẢONguyễn Thị Kim Linh, Nguyễn Hữu Định, Lê Đình

Đôn, Trần Thị Dung, 2006. Nhân giống tiêu (Piper nigrum L.) sạch bệnh virus bằng phương pháp nuôi cấy mô. Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp, 3(2006): 13-18.

Đoàn Thị Ái Thuyền, Thái Xuân Du, Đỗ Đăng Giáp và Nguyễn Tăng Tôn, 2005. Bước đầu nghiên cứu nhân giống in vitro một số giống hồ tiêu (Piper nigrum L.) sạch virus. Tạp chí Sinh học, 27(3): 39-45.

Bhat, A.I., Siljo, A., Jiby, M.V., Thankamani, C.K. and Mathew, P.A., 2009. Polymerase chain reaction (PCR) based indexing of black pepper (Piper nigrum L.) plants against Piper yellow mottle virus. JOSAC., 18: 28-32.

Bhat, A.I. and Siju, S., 2007. Development of a single-tube multiplex RT-PCR for the simultaneous detection of

Cucumber mosaic virus amd Piper yellow mottle virus associated with stunt disease of black pepper. Curr. Sci., 93(7): 973-976.

Bhat, A.I. and Siljo, A., 2014. Detection of viruses infecting black peper by SYBR green-based real-time PCR assay. JPP., 96 (1): 105-109.

Bhat, A.I., Devasahayam, S., Sarma, Y.R. and Pant, R.P., 2003. Association of a Badnavirus transmitted by mealybug (Ferrisia virgata) with black pepper (Piper nigrum L.) in India. Curr. Sci., 84: 1547-1550.

De Silva, D.P.P., Jones, P. and Shaw, M.W.,2002. Identification and transmission of Piper yellow mottle virus and Cucumber mosaic virus infecting black pepper (Piper nigrum L.) in Sri Lanka. Plant Pathol., 51: 537-545.

Duarte, M.L.R., Albuquerque, F.C. and Chu, E.Y., 2001. New diseases affecting black pepper crop in Brazil. Int. Pepper Bull. Apr-Dec: 51-57.

Hareesh, P.S. and Bhat, A.I.,2008. Detection and partial nucleotide sequence analysis of Piper yellow mottle virus infecting black pepper (Piper nigrum L.) in India. Indian J. Virol. 19: 160-167.

Lockhart, B.E.L., Kiratiya-Angul, K., Jones, P., Eng, L., de Silva, P., Olszewski, N.E., Lockhart, N., Deema, N. and Sangalang, J., 1997. Identification of Piper yellow mottle virus, a mealybug-transmitted badnavirus infecting Piper spp. In Southeast Asia. EUR J. Plant Pathol, 103: 303-11.

Application of PCR technique for detection of Piper yellow mottle virus infecting pepper (Piper nigrum L.) in Vietnam

Nguyen Xuan Dung, Duong Hoa XoAbstractPiper yellow mottle virus (PYMoV) is one of two main types of pepper-infecting viruses that has been identified in many countries in the world. However, in Vietnam, the diagnosis of this virus in pepper has not been adequate attention. For supporting accurate diagnosis of the agents causing viral diseases in pepper, including PYMoV, and production of the pepper free-virus seedlings in Vietnam, a PCR protocol was developed to detect PYMoV. Accordingly, the PCR was designed to amplify the 400 or 450 bp segment of the viral genome using primer of PYMoI or PYMoIII, respectively. This diagnosis protocol was also used for determining the presence of PYMoV in pepper growing areas of Tay Ninh, Dong Nai and Dak Lak provinces of Vietnam. The results showed that the PCR protocol was successfully developed for detecting PYMoV from pepper leaf. The PCR was able to detected the virus in a pepper leaf sample at a level of 100 copies/µL. The sequence of amplified gene fragment with homology of 85% to 87% compared to its published sequence on Genebank. The presence of virus was determined at an average rate of 41.12% (88 of 214 samples) in all surveyed areas. The highest rate of viral infection was recorded in Tay Ninh (57.69%) and the lowest one was in Dong Nai (24.51%). This suggests that the PYMoV is quite prevalent on the pepper in Vietnam.Key words: Piper yellow mottle virus, Piper nigrum, PCR, virus detection, viral desease

Ngày nhận bài: 7/6/2017Người phản biện: TS. Nguyễn Thị Nhung


64


I. ĐẶT VẤN ĐỀBệnh vàng lá, rụng lá cây trồng, do nấm

Corynespora cassiicola có ảnh hưởng rất nghiêm trọng tới sản lượng trên đồng ruộng. Bệnh phổ biến trên đối tượng cà chua (Solanum lycopersicum) (Sener, 2005), dưa chuột (Cucumis sativus) (Muhamad et al., 2010) và đậu tương (Glycine max) (Ferreira et al., 2017). Nấm có khả năng phát triển quanh năm, ở mọi giai đoạn phát triển của cây (Sener, 2005). Hiện nay, nhiều nghiên cứu đã tập trung vào chọn giống cây trồng kháng bệnh kết hợp phòng bệnh bằng thuốc trừ sâu hóa học.

Tuy nhiên, việc sử dụng quá nhiều thuốc hóa học đã ảnh hưởng lớn đến chất lượng sản phẩm, tăng tồn dư thuốc trong nông sản. Do đó, biện pháp đấu tranh sinh học trong quản lý bệnh hại có ý nghĩa to lớn trong sản xuất nông sản bền vững. Nghiên cứu này đã được tiến hành nhằm tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng nấm C. cassiicola phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh hại cây trồng.


2.1. Vật liệu nghiên cứuNấm C. cassiicola gây bệnh được thu thập từ

Trung tâm Nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới và 86 chủng xạ khuẩn từ Bộ môn Công nghệ vi sinh, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.

2.2. Phương pháp nghiên cứu- Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng với

nấm C. cassiicola: Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy

trên môi trường Gause I. Nấm C. cassiicola gây bệnh được hoạt hóa và cấy thuần trên môi trường Potato Dextrose Agar (PDA). Khả năng đối kháng của xạ khuẩn với C. cassiicola được tiến hành theo phương pháp được mô tả bởi Nguyễn Lân Dũng và Phạm Thị Trân Châu (1978); Dhanasekaran et al. (2012).

- Phương pháp khảo sát đặc điểm sinh học của xạ khuẩn: Hình thái của xạ khuẩn được xác định dựa trên các đặc điểm nuôi cấy, bao gồm màu sắc của khuẩn ty khí sinh (KTKS), màu sắc của khuẩn ty cơ chất (KTCC), cuống sinh bào tử, khả năng sinh sắc tố tan và sự hình thành sắc tố melanin trên hệ thống môi trường Gause I, Gause II, hệ thống môi trường ISP (Newman et al., 2003).

- Phương pháp đánh giá khả năng sinh enzym cellulaza và chitinaza: Chủng xạ khuẩn được nuôi trên môi trường có bổ sung 1% carboxymethylcellulose (thử hoạt tính cellulaza) hoặc 1% chitin (thử hoạt tính chitinaza) theo phương pháp được mô tả bởi Nguyễn Lân Dũng và Phạm Thị Trân Châu (1978).

- Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy: Khả năng đồng hóa các nguồn C, N được đánh giá theo thang điểm chuẩn (Shirling và Gottlied, 1966), ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ NaCl được phân tích theo phương pháp được mô tả bởi Nguyễn Xuân Cảnh và ctv., 2016.

2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứuNghiên cứu được thực hiện tại Bộ môn Công

nghệ vi sinh, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam từ tháng 3/2016 - tháng 3/2017.

1 Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam2 Bộ môn Sinh học Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN VS18 ĐỐI KHÁNG VỚI NẤM Corynespora cassiicola

Nguyễn Văn Giang1, Nguyễn Thị Thu1, Chu Đức Hà2

TÓM TẮTNghiên cứu này được tiến hành với mục đích sàng lọc và tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với

nấm Corynespora cassiicola gây bệnh vàng lá, rụng lá trên cây trồng. Từ 86 chủng xạ khuẩn, chủng VS18 có khả năng kháng nấm C. cassiicola mạnh nhất đã được tuyển chọn và khảo sát một số đặc tính. Chủng xạ khuẩn VS18 không tạo sắc tố melanin, có khả năng tổng hợp enzym chitinaza và cellulaza. Khuẩn lạc có màu trắng, hình tròn, kích thước 4 - 6 mm, bề mặt xù xì, sợi khí sinh có dạng thẳng, phân nhánh, có xoắn lò xo mang bào tử ở đầu sợi. Đánh giá khả năng sinh trưởng của VS18 trên các nguồn dinh dưỡng khác nhau cho thấy, chủng VS18 có thể đồng hóa tốt các nguồn đường như I-inositol, sucrose và raffinose và nguồn nitơ khác nhau bao gồm NaNO3, KNO3. Mặt khác, chủng xạ khuẩn VS18 sinh trưởng tốt trong dải nhiệt độ 25 - 30oC, pH 6 - 8, chịu được nồng độ muối trong môi trường tới 4%. Dựa trên phân loại ISP, chủng VS18 có thể thuộc loài S. noursei.

Từ khóa: Corynespora cassiicola, phân lập, Streptomyces, xạ khuẩn

65



3.1. Tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với nấm Corynespora cassiicola

Xạ khuẩn, đặc biệt là chi Streptomyces có tiềm năng để sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp như thuốc kháng sinh (Keiser et al., 2000). Các chủng xạ khuẩn được hoạt hóa trên môi trường Gause I, sau đó được sử dụng để kiểm tra khả năng đối kháng với nấm C. cassiicola bằng phương pháp giếng thạch, thỏi thạch và đồng nuôi cấy (Nguyễn Lân Dũng và Phạm Thị Trân Châu, 1978; Dhanasekaran et al., 2012). Các đĩa petri thí nghiệm được đặt trong tủ lạnh 4oC trong 4 giờ, sau đó chuyển sang tủ nuôi ở 30oC, quan sát đường kính vòng đối kháng sau 7 ngày. Trong số 86 mẫu phân tích, chủng xạ khuẩn VS18 có hoạt tính đối kháng mạnh nhất (đường kính vòng đối kháng đạt 23,33 ± 0,58 mm).

Khi nuôi cấy chủng xạ khuẩn VS18 trên các môi trường ISP khác nhau, KTKS và KTCC biểu hiện

các màu sắc khác nhau (Bảng 1). Theo báo cáo của Shirling và Gottlied (1966), rất nhiều chủng xạ khuẩn khi nuôi trên môi trường ISP6 sẽ tiết ra melanin làm thay đổi màu sắc môi trường, đây cũng là đặc điểm để phân loại xạ khuẩn.

Sau 21 ngày nuôi trên ISP6, không ghi nhận thấy sự thay đổi màu sắc của môi trường, chứng tỏ chủng xạ khuẩn VS18 không có khả năng sinh sắc tố melanin (Hình 1A).

Đặc điểm hình thái của chủng VS18 được quan sát trên môi trường Gause I ở 30oC sau 7 ngày nuôi (Bảng 1). Màu sắc của chủng VS18 thay đổi theo thời gian nuôi cấy. Sau 4 ngày, khuẩn lạc có màu trắng, hình tròn, kích thước 4 - 6 mm, bề mặt khô, xù xì, trong khi từ ngày thứ 5 trở đi, khuẩn lạc chuyển sang màu nâu, trung tâm khuẩn lạc lồi lên, viền ngoài màu trắng. Quan sát dưới kính hiển vi, sợi khí sinh của chủng VS18 có dạng thẳng, phân nhánh, không phân đốt, có xoắn lò xo ở đầu sợi (Hình 1D).

Bảng 1. Màu sắc khuẩn lạc của chủng VS18 trên các môi trường nuôi cấy

Môi trường

7 ngày 14 ngày 21 ngàyKTKS KTCC KTKS KTCC KTKS KTCC

Gause I Nâu trắng Nâu Nâu trắng Nâu Nâu trắng NâuGause II Trắng Trắng Trắng Trắng Trắng TrắngISP-1 Nâu trắng Nâu Nâu trắng Nâu Nâu trắng NâuISP-2 Nâu trắng Nâu Nâu trắng Nâu Nâu trắng NâuISP-3 Nâu trắng Nâu Nâu trắng Nâu Nâu trắng NâuISP-4 Vàng Vàng Vàng Vàng Vàng VàngISP-5 Trắng Trắng Trắng Trắng Trắng TrắngISP-6 Trắng Vàng Trắng Vàng Trắng VàngISP-7 Trắng Trắng Trắng Trắng Trắng Trắng

Hình 1. Kết quả kiểm tra khả năng hình thành melanin (A), xác định hình thái (B), màu sắc khuẩn lạc (C),

sợi khí sinh (D), khả năng sinh enzym cellulaza (E) và enzym chitinaza (F) của chủng xạ khuẩn VS18

Tiếp theo, trong quá trình sống, xạ khuẩn sinh tổng hợp enzym để tạo ra các thành phần cần thiết cho cơ thể mà không có sẵn trong môi trường. Vì thế, khi tuyển chọn chủng giống vi sinh vật cần tiến hành kiểm tra và lựa chọn các chủng có hoạt tính enzym mạnh, sinh nhiều enzym mong muốn theo từng mục đích. Trong nghiên cứu này, khả năng tổng hợp enzym chitinaza và cellulaza được khảo sát nhằm làm rõ cơ chế tấn công C. cassiicola của xạ khuẩn VS18. Kết quả sau đó được thể hiện ở Hình 1E và 1F. Khả năng sản sinh enzym mạnh, đặc biệt là chitinaza, của chủng VS18 đã đặt ra giả thuyết rằng, chủng xạ khuẩn này có khả năng phá vỡ thành tế bào nấm C. cassiicola, từ đó ngăn chặn sự phát triển của nấm bệnh trên cây trồng.

66


3.2. Kết quả đánh giá khả năng sử dụng các nguồn dinh dưỡng của chủng VS18

Để tối ưu hóa trong sản xuất, chủng VS18 được nuôi trên môi trường ISP9 có bổ sung một số nguồn C và N khác nhau. Ở đây, nguồn C được sử dụng bao gồm đường glucose, fructose, I-inositol, manitol, sucrose, xylose, rhamnose, L-arabinose, raffinose và cellulose, trong khi nguồn N được thay thế lần lượt là NaNO3, KNO 3, Urê, NH4NO3 và (NH4)2SO4. Khả năng đồng hóa các nguồn dinh dưỡng của VS18 đánh giá theo thang tiêu chuẩn (Shirling và Gottlied, 1966) và được thể hiện ở bảng 2.

Bảng 2. Khả năng sử dụng các nguồn C và N khác nhau của chủng VS18

Ghi chú: (+++): Sử dụng rất tốt, (++): Sử dụng tốt, (+): Có khả năng sử dụng

Kết quả cho thấy, chủng VS18 có khả năng sử dụng nhiều nguồn đường khác nhau, tốt nhất là inositol, sucrose và raffinose (Bảng 2). Bên cạnh đó,

VS18 cũng có khả năng sử dụng được một số nguồn N khác nhau, như NaNO3, KNO3, (NH4)2SO4, urê và NH4NO3. Chủng VS18 có khả năng đồng hóa tốt NaNO3, KNO3, tuy nhiên, urê, (NH4)2SO4 và NH4NO3 chỉ đạt ở mức bình thường.

3.3. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của chủng VS18

Nhằm tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy của chủng xạ khuẩn VS18, ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đã được tiến hành khảo sát. Chủng xạ khuẩn VS18 được nuôi trên trên môi trường Gause 1 lần lượt ở các điều kiện nhiệt độ (0ºC, 4ºC, 20ºC, 25ºC, 30ºC, 35ºC và 40ºC), dải pH từ 4 - 12 và các nồng độ muối từ 0 - 9%. Sau 5 ngày nuôi cấy, sinh trưởng và phát triển của chủng đã được tiến hành kiểm tra. Kết quả cho thấy VS18 có khả năng sinh trưởng tốt trong môi trường có nồng độ muối từ 0 - 2%, chịu được nồng độ muối tới 4%. So sánh với kết quả nghiên cứu trước đó của Larsen (1986), chủng VS18 thuộc nhóm xạ khuẩn chịu muối thấp. Bên cạnh đó, chủng VS18 cũng có thể sinh trưởng được trong điều kiện pH môi trường từ 5 - 11, nhiệt độ từ 20 - 40 oC. Ngưỡng tối ưu đạt tại dải pH 6 - 8, nhiệt độ trong khoảng 25 - 30 oC. Kết quả này cũng được ghi nhận tương tự như trong đánh giá trước đó (Biền Văn Minh và Vũ Thị Phương Uyên, 1998; Lê Thị Hiền và ctv., 2014).

Kết hợp kết quả khảo sát đặc điểm hình thái, hóa sinh của chủng xạ khuẩn VS18 và so sánh với đặc điểm mô tả trong khóa phân loại ISP cho thấy, chủng VS18 có đặc điểm tương đồng với chủng Streptomyces noursei, được Haxen và Brown phát hiện vào năm 1950. Nghiên cứu này sẽ tiếp tục được tiến hành nhằm phát triển chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh hại do nấm C. cassiicola.

Hình 2. Ảnh hưởng của nồng độ muối (A), pH (B) và nhiệt độ tới sinh trưởng của chủng xạ khuẩn VS18

Nguồn

Khả năng phát triển Nguồn

Khả năng phát triển

Ngu

ồn C

Glucose ++

Ngu

ồn N

NaNO 3 +++Fructose + KNO3 +++I-Inositol +++ Urê ++Manitol ++ NH4NO3 +Sucrose +++ (NH4)2SO4 +Xylose +Rhamnose ++L-Arabinose +Raffinose +++Cellulose ++

67



4.1. Kết luậnĐã sàng lọc và tuyển chọn được chủng xạ khuẩn

VS18 có khả năng đối kháng mạnh nhất với nấm Corynespora cassiicola. Chủng xạ khuẩn VS18 không có khả năng tạo sắc tố melanin, có thể tổng hợp được enzym chitinaza và cellulaza. Khuẩn lạc có màu trắng, hình tròn, kích thước 4 - 6 mm, bề mặt khô, xù xì, sợi khí sinh có dạng thẳng, phân nhánh, không phân đốt, có xoắn lò xo ở đầu sợi.

Chủng VS18 có khả năng đồng hóa nhiều nguồn đường khác nhau, tốt nhất là inositol, sucrose và raffinose. Một số nguồn N khác cũng có thể được sử dụng tốt như như NaNO3 và KNO3.

Chủng VS18 sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 25 - 30oC, pH 6 - 8, chịu được nồng độ muối trong môi trường tới 4%. Dựa trên phân loại ISP, chủng VS18 có thể thuộc loài S. noursei.

4.2. Đề nghịNghiên cứu này sẽ tiếp tục được tiến hành nhằm

phát triển chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh hại do nấm C. cassiicola.

TÀI LIỆU THAM KHẢONguyễn Xuân Cảnh, Hồ Tú Cường, Nguyễn Thị

Định, Phạm Thị Hiếu, 2016. Nghiên cứu chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh trên tôm. Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 14(11): 1809-1816.

Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, 1978. Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học - Tập III. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.

Lê Thị Hiền, Đinh Văn Lợi, Vũ Thị Vân, Nguyễn Văn Giang, 2014. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn (Streptomyces spp.) đối kháng nấm bệnh cây. Tạp chí Khoa học và Phát triển, 12(5): 656-664.

Biền Văn Minh, Vũ Thị Phương Uyên, 1998. Một số kết quả nghiên cứu xạ khuẩn (Streptomyces) sinh kháng sinh được phân lập từ đất Thừa Thiên-Huế. Thông báo khoa học - Đại học Huế, 2: 46-51.

Dhanasekaran, D., Thajuddin, N., Panneerselvam, A., 2012. Applications of actinobacterial fungicides in agriculture and medicine, fungicides for plant and animal diseases, Dr. Dharumadurai Dhanasekaran (Editor). In Tech, ISBN: 978-953-307-804-5.

Ferreira, A.F., Bentes, J.L., 2017. Pathogenicity of Corynespora cassiicola on different hosts in Amazonas State, Brazil. Summa Phytopathologica, 43(1): 63-65.

Larsen, H., 1986. Halophilic and halotolerant microorganism: an overview historical perspective. FEMS Microbiol Biotechnol, 24: 2235-2241.

Muhamad, Z.R., Hosneara, K., Makoto, U., Junichi, K., Yuichi, H., Sakae, A., 2010. Suppression by red light irradiation of corynespora leaf spot of cucumber caused by Corynespora cassiicola. J Phytopathol, 158:378-381.

Newman, D.J., Cragg, G.M., Snader, K.M., 2003. Natural products as sources of new drugs over the period. J Nat Prod, 66: 1022-1037.

Sener, K., 2005. Genetic variation in Corynespora cassiicola, the target leaf spot pathogen. Pakistan Journal of Biological Sciences, 8(4): 618-621.

Shirling, E.B., Gottlieb, D., 1966. Methods for characterization of Streptomyces species. Int J Syst Bacteriol, 16:313-340.

Study on biological characteristics of a newly isolated Streptomyces strain ‘VS18’ with potential anti-microbial activity against Corynespora cassiicola

Nguyen Van Giang, Nguyen Thi Thu, Chu Duc HaAbstractThis study was carried out to screen and isolate new isolated Streptomyces strain with potential anti-microbial activity against Corynespora cassiicola causing Corynespora leaf fall disease. Among 86 isolated samples, Streptomyces strain ‘VS18’ has showed highest anti-microbial activity against C. cassiicola. The ‘VS18’ strain could not synthesize biopigments melanin, but had the ability to produce chitinase and cellulase. Typical colonies were recorded to be circular, with white color, size 4 - 6 mm, scabrous surface, aerial hyphae consists of long, straight branching filaments with a chain of spherical spore. Evaluation of growth and development under various nutrition conditions showed that ‘VS18’ strain could grow on medium with I-inositol, sucrose and raffinose, and with different N resources such as NaNO3 and KNO3. Additionally, the results revealed that the optimal temperature was at 25 - 30oC and and pH ranged from 6 to 8; this strain also was resistant to 4% NaCl. Finally, based on the ISP classification, ‘VS18’ strain was proposed to belong to Streptomyces noursei.Key words: Corynespora cassiicola, isolation, Streptomyces, actinobacteria



68


ĐẶT VẤN ĐỀPhotpho (P) là nguyên tố quan trọng thứ 2 trong

3 nguyên tố dinh dưỡng đa lượng chính của cây trồng (N, P, K). Photpho có tác dụng thúc đẩy phát triển và tăng khả năng chống chịu của cây trồng. Thiếu photpho, sự hình thành tế bào mới bị chậm lại, cây còi cọc ít phân cành, đẻ nhánh, lá có màu xanh lục bẩn, không sáng, năng suất cây trồng bị giảm sút nghiêm trọng, ngay cả khi được cung cấp đủ nitơ (Havlin et al., 1999). Tính khả dụng sinh học của photpho trong đất bị giới hạn vì phosphate trong đất tồn tại chủ yếu ở dạng không hòa tan (Lowell Busman et al., 2009). Chỉ có 0,1% trong tổng số P là khả dụng, không đủ đáp ứng cho nhu cầu của cây trồng. Để đáp ứng đầy đủ nhu cầu dinh dưỡng cho cây trồng, photpho thường được bón vào đất dưới dạng phân bón hóa học. Quá trình tổng hợp và sử dụng phân bón hóa học photpho đòi hỏi chi phí lớn và có tác động lâu dài đến môi trường gây ra hiện tượng phú dưỡng, làm tăng lượng khí thải carbon (Sharma et al., 2013) đồng thời làm chết các vi sinh vật có lợi vốn tồn tại tự nhiên trong đất, phá hủy cấu trúc địa lý tự nhiên của đất dẫn đến đất đai bị chai cứng, bạc màu, làm giảm năng suất cây trồng và gây ảnh hưởng đến sản xuất nông nghiệp lâu dài.

Khai thác và sử dụng vi sinh vật phân giải phosphate (Phosphate Solubilizing Microorganisms/PSMs) được xem như là biện pháp thân thiện với môi trường và cung cấp photpho tốt nhất cho cây trồng. Các PSMs không những làm tăng lượng phosphate dễ tiêu trong đất mà còn làm tăng lượng nitơ sinh học hoặc tăng cường sự sẵn có của các nguyên tố vi lượng khác như sắt, kẽm, silic, đồng… đồng thời các vi sinh vật này khi bón vào đất có khả năng sản sinh các yếu tố thúc đẩy sự sinh trưởng thực vật

(Kucey, 1983; Sharma et al., 2013). Một số tác giả như Nguyễn Văn Giang và cộng sự (2015), Trần Thị Huế và cộng sự (2015) đã phân lập được một số chủng vi khuẩn có khả năng phân giải phosphate khó tan từ đất trồng lúa, trồng chè. Các nghiên cứu về vi sinh vật phân giải phosphate khó tan từ đất rừng còn hạn chế. Vườn Quốc gia Xuân Liên thuộc Khu bảo tồn thiên nhiên Xuân Liên, nằm ở vùng rừng thượng nguồn sông Chu thuộc huyện Thường Xuân, nằm ở phía Tây tỉnh Thanh Hóa, là nơi bảo tồn nhiều loại động vật, thực vật quý. Đất ở đây ẩm, được phủ lớp thảm mục từ lá, cành cây. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng phân giải phosphate khó tan từ đất rừng Xuân Liên, làm phong phú thêm nguồn vật liệu trong sản xuất chế phẩm phân bón sinh học


2.1. Vật liệu nghiên cứuMẫu đất được lấy từ Vườn Quốc gia Xuân Liên

(Thanh Hóa), các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải phosphate khó tan.

Các môi trường được sử dụng: 1/ Môi trường NBRIP (g/l): glucose 10; Ca3(PO4)2 5; MgCl2.6H2O 5; MgSO4.7H20 0,25; KCl 0,2; (NH4)2SO4 0,1, pH 7.0; 2/ Môi trường Buck’s (g/l): MgSO4 0.2; K2HPO4 0.8; KH2PO4 0.2; CaSO4 0.13, FeCl2 0.00145, Na2MoO4 0.000253; Sucrose 20; 3/ Môi trường O-CAS: Chrome azurol S (CAS) 60,5 mg, hexadecyltrimetyl amoni bromua (HDTMA) 72,9 mg, Piperazin-1,4-bis (axit 2-ethanesulfonic) (PIPETS) 30,24 g, và 1mM FeCl3.6H2O trong 10 mM HCl 10 ml. Agar (0,9% w/v); 4/ Môi trường LB (g/l): pepton 10, NaCl 5, yeast extract 5.

1 Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI PHOSPHATE KHÓ TAN TỪ ĐẤT RỪNG XUÂN LIÊN

Nguyễn Văn Giang1, Nguyễn Đức Thái1

TÓM TẮTBài báo trình bày kết quả tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải phosphate từ đất Vườn Quốc

gia Xuân Liên. Từ các mẫu đất thu tại Vườn Quốc gia Xuân Liên, dựa trên hoạt tính phân giải phosphate canxi, 25 chủng vi sinh vật đã được phân lập, trong đó chủng XL3.1 và RL4 biểu hiện hoạt tính phân giải Ca3(PO4)2 mạnh nhất, tương ứng là 470,47µg/ml và 459,58 µg/ml. Hai chủng này cũng có khả năng phân giải cả AlPO4, FePO4, cố định N2 và tổng hợp IAA. Khi được nuôi ở nhiệt độ từ 25 - 300C, pH 7 trong môi trường có nguồn carbon, nitơ thích hợp nhất như: glucose, lactose, maltose, pepton, yeast extract và KNO3, hai chủng XL3.1 và RL4 đều phát triển tốt và biểu hiện hoạt tính phân giải phosphate cao nhất.

Từ khóa: Vi sinh vật phân giải phosphate, cố định N2, tổng hợp IAA

69



2.2.1. Phân lập các chủng vi sinh vật Các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải

phosphate khó tan từ các mẫu đất thí nghiệm được phân lập trên môi trường NBRIP (Chung et al., 2005). Mẫu đất được phơi khô, nghiền mịn, pha loãng tới nồng độ 10-6. Cấy trong 50 µl dịch pha loãng trên đĩa Petri chứa môi trường NBRIP, các đĩa này được ủ ở 300C. Các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải phosphate khó tan sẽ hòa tan canxi phosphate trong môi trường làm cho xung quanh miền khuẩn lạc của chúng có màu sáng trong. Hoạt độ phân giải phosphate khó tan của các chủng vi khuẩn phân lập được xác định dựa trên nồng độ PO4

3- có trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp xanh molybdate (Nguyễn Văn Giang và cộng sự, 2015) thông qua giá trị OD đo được tại bước sóng 820nm. Mối tương quan giữa giá trị OD và nồng độ PO4

3- trong dung dịch thể hiện qua phương trình: Y (giá trị OD) = 0.9308x - 0.0955 với R² = 0.9924.

2.2.2 Đánh giá ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH, nguồn carbon, nitơ)

Các chủng vi sinh vật được tuyển chọn được nuôi cấy trong môi trường NBRIP với các giá trị pH thay đổi từ 5 - 10, nhiệt độ 5oC, 17oC, 25oC, 30oC, 35oC, 40oC với mỗi thông số thí nghiệm đều có bình môi trường không tiếp giống vi sinh vật làm đối chứng, trong điều kiện nuôi lắc và nuôi tĩnh, nguồn carbon, nitơ trong môi trường NBRIP lần lượt được thay thế bằng glucose, fructose, xylose, maltose, manitose, lactose, sucrose, ribose, dextrin, (NH2)2CO, (NH4)2SO4, NaNO3, KNO3, NH4NO3, NH4Cl, Pepton, Yeast extract (YE). Môi trường không có cacbon và nitơ là đối chứng âm. Sau 4 ngày tiến hành li tâm dịch nuôi và xác định hàm lượng PO4

3-.

2.2.3 Khảo sát khả năng sinh IAA và cố định N2

Khả năng sinh IAA của các chủng vi sinh vật thí nghiệm được xác định theo Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10784:2015 và khả năng cố định N2

- theo phương pháp được mô tả bởi Qurban và cộng sự (2011).

2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứuThí nghiệm được tiến hành tại Khoa Công nghệ

sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam từ tháng 5 đến tháng 12/2016.

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật phân giải

phosphate khó tan.Từ các mẫu đất rừng Xuân Liên, sau khi tiến

hành phân lập trên môi trường NBRIP, chúng tôi đã chọn được 25 chủng vi sinh vật có khả năng phân giải phosphate khó tan dựa trên sự xuất hiện các vòng phân giải Ca3(PO4)2.

Hình 1.Vi sinh vật phân giải phosphate mọc trên môi trường NBRIP

Sau 4 ngày nuôi cấy, 7 trong số 25 chủng thí nghiệm có hoạt tính phân giải phosphate mạnh nhất là RL4 (470,47 µg/ml), XL3.1 (459,58 µg/ml), PT (436,73 µg/ml), VC4 (455,52 µg/ml), NC2 (415,58 µg/ml), NT1 (399,14 µg/ml), HT3.3 (391,02 µg/ml) trong khi đó chủng có hoạt tính yếu nhất là XL1.1 (24,12 µg/ml) (Hình 2). Kết quả này cao hơn kết quả đã được công bố bởi Nguyễn Văn Giang và cộng sự (2015), tuy nhiên thấp hơn kết quả thu được trong nghiên cứu của Buddhi và Min-Ho Yoon (2013). Tofazzal và các cộng sự (2007) khi khảo sát khả năng phân giải phosphate của các chủng vi sinh vật từ rễ lúa cũng thu được kết quả tương đương và cao hơn một chút. Từ kết quả đó chọn 7 chủng có hoạt tính phân giải phoshate canxi mạnh nhất để tiến hành thử hoạt độ phân giải trên các nguồn phosphate khó tan khác là AlPO4, FePO4 và phytate.

Vi sinh vật có khả năng phân giải phosphate

Hình 2. Hoạt độ phân giải phosphate của các chủng vi sinh vật mới phân lập

0100200300400500600

HT3

HT3.

1HT

3.2

HT3.

3XL

1.1

XL1.

2XL

1.3

XL2.

1XL

3.1

XL4.

2XL

5XL

6VC

1VC

4VC

5NC

1NC

2NT

1NT

4RL

1RL

4 PTXR

L2PN

1 N1

PO43-

µg/

ml

70


Tất cả 7 chủng đều có khả năng phân giải các nguồn phosphate này, tuy nhiên hoạt độ phân giải phosphate canxi vẫn cao nhất, do dạng này dễ bị hòa tan hơn AlPO4, FePO4. Các chủng này có thể tổng hợp enzyme phosphatase nên có thể phân giải phytate để giải phóng từ 1 đến 6 gốc phosphate từ phân tử phytate, do đó hoạt độ phân giải phytate của chúng khác nhau (Hình 3).

Hình 3. Hoạt độ phân giải một số dạng phosphate khóa tan của 7 chủng thí nghiệm

Hoạt độ phân giải AlPO4, FePO4 của 7 chủng vi sinh vật trong thí nghiệm này cao hơn của các chủng đã được Trần Thị Huế và cộng sự (2015) công bố.

Chủng XL3.1 và RL4 biểu hiện khả năng phân giải mạnh nhất, nên được chọn để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Hai chủng này có tế bào dạng thẳng, gram âm, mầu sắc khuẩn lạc trắng ngà.

3.2. Ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng phân giải phosphate khó tan của các chủng XL3.1 và RL4

3.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độMỗi chủng vi sinh vật khác nhau có một khoảng

nhiệt độ thích hợp khác nhau mà tại đó chúng sinh trưởng phát triển và thể hiện hoạt tính sinh học mạnh nhất. Trong nghiên cứu này hai chủng XL3.1 và RL 4 biểu hiện khả năng phân giải phosphate khó tan mạnh nhất tại nhiệt độ từ 25 - 300C, nhiệt độ thấp hay cao hơn đều làm giảm khả năng phân giải cơ chất của hai chủng này (hình 4A). Chủng RL4 có hoạt tính mạnh nhất tại 30oC (đạt 357,2 µg/l), tăng đến 35oC họat tính của chủng này giảm mạnh (chỉ còn 187,78 µg/l), tại 40oC thì hoạt tính có xu hướng đi ngang không tiếp tục giảm. Chủng XL3.1 có hoạt tính mạnh nhất tại 25oC (đạt 386,2 µg/l), tại 30oC hoạt tính bắt đầu giảm, đến 40oC sự sụt giảm mạnh hoạt tính được ghi nhận.

Talat và cộng sự (2015) đã khẳng định khả năng hòa tan phosphate của các chủng tăng lên xung quanh ngưỡng nhiệt độ 25 - 300C, khi nhiệt độ cao hơn thì hoạt tính giảm trong khi sinh khối vi sinh vật vẫn phát triển mạnh. Mardad và cộng sự (2014) chỉ ra 30°C là nhiệt độ tối ưu cho tất cả các chủng vi sinh vật phân giải phosphate và nhận thấy chúng có thể phân giải phosphaste ở 4oC. Sonia và Saksham (2016) cho thấy 40oC là nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển và hòa tan phosphate của các chủng vi sinh vật trong nghiên cứu của mình. Điều này cho thấy các hoạt động trao đổi chất của các chủng vi sinh vật khác nhau có liên quan đến nhiệt độ của môi trường.

3.2.2. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôiHai chủng vi khuẩn XL3.1 và Rl4 đều sinh trưởng

được trong khoảng pH nghiên cứu (hình 4B). Trong điều kiện nuôi tĩnh chủng RL4 có hoạt tính phân giải phosphate mạnh nhất tại pH 6 (100,24 µg/l) và yếu nhất tại pH 10 (45,23 µg/l), chủng XL3.1 họat tính mạnh nhất tại pH 7 (108,45 µg/l) và yếu tại pH 5 (73,37 µg/l). Trong điều kiện nuôi lắc cả hai chủng đều có hoạt tính mạnh nhất tại pH7 (hoạt độ của chủng RL4 đạt 204,62 µg/l; của chủng XL3.1 (294,4 µg/l). Talat và cộng sự (2015) cũng chỉ ra các chủng nghiên cứu có hoạt tính phân giải phosphate trong khoảng pH 5-8, tối ưu tại pH từ 6 đến 7, một số chủng khi pH tăng lên đến 8 thì hoàn toàn mất hoạt

-500

50100150200250300350400

VC4 XL3.1 RL4 NC2 NT1 HT3.3 PT

PO43-

µg/

ml

Phytate Ca3(PO4)2 AlPO4 FePO4

Hình 4. Ảnh hưởng của nhiệt độ (A) và pH (B) đến hoạt độ phân giải phosphatecủa chủng XL3.1 và Rl4

050

100150200250300350

5 6 7 8 9 10pH

RL4 Tĩnh XL3.1 Tĩnh RL4 Lắc XL3.1 Lắc

PO43-

µg/

ml

050

100150200250300350400450500

5oC 18oC 25oC 30oC 35oC 40oC

PO

43- µ

g/m

l

RL4 XL3.1

71


tính. Nguyễn Văn Giang và cộng sự (2015) cũng kết luận tương tự.

3.2.3. Ảnh hưởng của nguồn carbon và nitơ Vi sinh vật có thể sử dụng nhiều nguồn carbon

khác nhau để sinh trưởng, phát triển và biểu hiện các hoạt tính. Trong thí nghiệm này hai chủng XL3.1 và RL4 được nuôi trong môi trường NBRIP nhưng có sự thay đổi về nguồn carbon. Các nguồn carbon

được sử dụng là glucose, fructose, xylose, maltose, manitose, lactose, sucrose, ribose, dextrin, các nguồn nitơlà (NH2)2CO, (NH4)2SO4, NaNO3, KNO3, NH4NO3, NH4Cl, Pepton, Yeast extract (YE). Môi trường không có cacbon và nitơ là đối chứng âm. Các nguồn carbon khác nhau đã làm thay đổi khả năng phân giải phoshate của hai chủng XL3.1 và RL4 (Hình 5).

Hình 5. Ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng phân giải phosphate của chủng RL4 và XL3.1

-100-50

050

100150200250300350400450

PO43-

(µg/

l)

Nguồn C

RL4 tĩnh RL4 Lắc

-100

0

100

200

300

400

500

600

Nguồn C

XL3.1 Tĩnh Xl3.1 Lắc

PO43-

(µg/

l)

Hoạt tính phân giải phosphate mạnh nhất của hai chủng trong cả hai điều kiện nuôi tĩnh và lắc trong môi trường nuôi cấy có nguồn C là glucose (hoạt độ phân giải phosphate của chủng RL4 khi nuôi lắc đạt 348,89 µg/l, nuôi tĩnh - 154,72 µg/l; tương tự chủng XL3, khi nuôi lắc - 499,43 µg/l, nuôi tĩnh - 167,84 µg/l). Khi trong môi trường dinh dưỡng không có C thì hai chủng mất hoàn toàn khả năng phân giải phosphate khó tan do chúng không có nguồn năng lượng cũng như cơ chất để sinh trưởng và tổng hợp enzyme phân giải phosphate.

Hai chủng XL3.1 và RL4 đều sinh trưởng và biểu hiện hoạt tính phân giải phosphats khó tan khi được nuôi trên môi trường với nguồn nitơ khác nhau. Hoạt tính của hai chủng khá mạnh khi chúng được nuôi trong môi trường có nguồn N là pepton, yeast extract và KNO3. Khi nuôi lắc, chủng XL3.1 và RL4 có hoạt tính phân giải phosphate mạnh hơn khi nuôi tĩnh.

Hình 6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng phân giải phosphatecủa chủng RL4 và XL3.1

3.2.4. Khả năng tổng hợp IAA và cố định N2

Các chủng vi khuẩn tuyển chọn được nuôi cấy để thử khả năng sinh IAA với mục đích tìm kiếm các chủng vi khuẩn vừa có khả năng phân giải phosphate khó tan vừa có khả năng sinh IAA nhằm bổ sung vào các chế phẩm hoặc phân bón sinh học. Các chủng XL3.1 và RL4 được nuôi cấy trong môi trường LB có bổ sung L-tryptophan, sau đó thu dịch ly tâm và thử với thuốc thử Salkowski, mẫu có sinh IAA sẽ chuyển sang màu hồng, nồng độ IAA sinh ra nhiều có thể làm cho dịch nuôi cấy chuyển thành màu đỏ (Hình 7A). Cường độ màu đậm hay nhạt phụ thuộc vào khả năng sinh IAA của từng chủng vi khuẩn. Dịch nuôi cấy hai chủng XL3.1 và RL4 đã thay đổi màu sau khi bổ sung thuốc thử Slkowski, chứng tỏ chúng đã tổng hợp phytohormone IAA.

Hình 7. Khả năng sinh IAA (A) và cố định nitơ (B) của chủng XL3.1 và RL4

0

100

200

300

400

500

600

NGUỒN N VÔ CƠ

RL4T XL3.1T RL4L XL3.1L

NGUỒN N HỮU CƠ

PO43-

(µg/

l)

A B

72


Chủng XL3.1 và RL4 được nuôi trên đĩa petri chứa môi trường Buck’s không có nitơ, chủng nào có khả năng mọc được chứng tỏ có khả năng cố định N. Kết quả thu được cả hai chủng đều có khả năng cố định N tự do (Hình 7B). Trần Thị Giang và cộng sự năm 2014 cũng đã phân lập được 63 chủng vi sinh vật vừa có khả năng cố định N và phân giải phosphate khó tan.

IV. KẾT LUẬN- 25 chủng vi sinh vật có khả năng phân giải

phosphate khó tan được phân lập và tuyển chọn từ các mẫu đất thu thập tại Vường Quốc gia Xuân Liên, trong đó hai chủng XL3.1 và Rl4 vừa có hoạt tính phân giải phosphate mạnh nhất (lần lượt đạt 470,47 µg/ml và 459,58 µg/ml),

- Hai chủng XL3.1 và Rl4 sinh trưởng phát triển tốt và biểu hiện hoạt tính phân giải phosphate mạnh tại 25 - 300C, pH7, nguồn carbon, nitơ thích hợp nhất là glucose, tiếp theo là lactose, maltose, pepton, yeast extract và KNO3. Đây là các chủng vi sinh vật có tiềm năng bổ sung vào các chế phẩm hoặc phân bón sinh học.

TÀI LIỆU THAM KHẢONguyễn Văn Giang, Hoàng Thị Vân, Trần Thị Đào,

Trần Thị Huế, 2015. Phân lập và nghiên cứu đặc điểm của một số chủng vi khuẩn có khả năng phân giải phốt phát khó tan trong đất. Tạp chí Công nghệ Sinh học 13(2A): 753-762.

Trần Thị Giang, Nguyễn Thị Quyên, Cao Ngọc Điệp, 2014. Phân lập và nhận diện vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng (PGPR) từ một số loại rau ăn lá trồng tại thành phố Cần Thơ. Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ, Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản và Công nghệ Sinh học, 35: 65-73.

Trần Thị Huế, Tống Kim Thuần, Nguyễn Văn Giang, 2015. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật phân giải phốt phát sắt, phốt phát nhôm từ đất trồng chè Shan Yên Bái. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, Số 6(59), 97-102.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10784: 2015 về Vi sinh vật - Xác định khả năng sinh tổng hợp axit 3-indol-axetic (IAA).

Buddhi Charana Walpola and Min-Ho Yoon, 2013. Isolation and characterization of phosphate solubilizing bacteria and their co-inoculation efficiency on tomato plant growth and phosphorous uptake. African Journal of Microbiology Research, Vol. 7(3):266-275.

Chung H, Park M, Madhaiyan M, Seshadri S, Song J, Cho H, Sa T, 2005. Isolation and characterization of phosphate solubilizing bacteria from the rhizosphere of crop plants of Korea. Soil Biol Biochem 37 (10):1970-1974.

Havlin, J.L., J.D. Beaton, S.L. Tisdale, and W.L. Nelson. 1999. Soil Fertility and Fertilizers. 6th Edition. Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. 499 p.

Kucey, R. M. N., 1983. Phosphate-solubilizing bacteria and fungi in various cultivated and virgin Alberta soils. Can. J. Soil Sci. 63:671-678.

Lowell Busman, John Lamb, Gyles Randall, George Rehm, and Michael Schmitt,2009. The nature of phosphorus in soils. University of Minnesota http://www.extension.umn.edu/

Mardad I, Serrano A, Soukri A., 2014. Effect of Carbon, Nitrogen Sources and Abiotic Stress on Phosphate Solubilization by Bacterial Strains Isolated from a Moroccan Rock Phosphate Deposit. J Adv Chem Eng 1:102.

Qurban Ali Panhwar, Radziah Othman, Zaharah Abdul Rahman, Sariah Meon and Mohd Razi Ismail, 2011. Isolation and characterization of phosphate-solubilizing bacteria from aerobic rice. African Journal of Biotechnology Vol. 11(11), pp. 2711-2719.

Sharma Seema B, Riyaz Z Sayyed, Mrugesh H Trivedi and Thivakaran A Gobi, 2013. Phosphate solubilizing microbes: sustainable approach for managing phosphorus deficiency in agricultural soils. Springer Plus 2013, 2:587.

Sonia Sethi & Saksham Gupta, 2016. Optimisation of Parameters for Fermentation Conditions of Phosphate Solubilising Bacteria. G.J.B.A.H.S.,-Vol.5(2):35-39.

Tofazzal Islam Md., Abhinandan Deora, Yasuyuki Hashidoko, Atiqur Rahman, Toshiaki Ito and Satoshi Tahara, 2007. Isolation and Identification of Potential Phosphate Solubilizing Bacteria from the Rhizoplane of Oryza sativa L. cv. BR29 of Bangladesh. http://btlbsmrau.org/wp-content/uploads/2014/01/PSB-ZNC2007.pdf

Talat Yasmeen Mujahid, Syed Abdus Subhan, Abdul Wahab, Javeria Masnoon, Nuzhat Ahmed and Tanveer Abbas, 2015. Effects of Different Physical and Chemical Parameters on Phosphate Solubilization Activity of Plant Growth Promoting Bacteria Isolated from Indigenous Soil. Journal of Pharmacy and Nutrition Sciences, 64-70.

73


Isolation and selection of potential phosphate solubilizing bacterial strains from soil of Xuan Lien National park

Nguyen Van Giang, Nguyen Duc ThaiAbstractThis study was conducted to isolate and select microbial strains that can solubilize phosphate from soil of Xuan Lien National park. 25 bacterial strains which could solubilize phosphate from soil samples of Xuan Lien National park were isolated. Based on concentration of PO4

3- released in cultivation media, two strains XL3.1 and RL4 were selected. Strains XL3.1 and RL4 exhibited N2-fixing and IAA producing ability. When culturing at 25-300C, pH7 in medium with suitable carbon and nitrogen sources such as glucose, lactose, maltose, peptone, yeast extract and KNO3, these two strains developed well and expressed the highest capability of phosphate solubilization.Key words: Phosphate solubilizing microorganisms (PSM), N2-fixing, IAA production

Ngày nhận bài: 6/6/2017Người phản biện: PGS.TS. Lê Như Kiểu


1 Viện kỹ thuật Bia - Rượu - Nước giải khát, Tổng Công ty cổ phần Bia - Rượu - Nước giải khát Hà Nội 2 Trường Đại học Kinh tế Kỹ thuật Công nghiệp

TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MEN, NẤM MỐC TỪ BÁNH MEN LÁ ỨNG DỤNG TRONG NÂNG CAO CHẤT LƯỢNG RƯỢU LÀNG NGHỀ TẠI HÀ GIANG

Phạm Anh Tuấn1, Hoàng Văn Đạt1, Hồ Tuấn Anh2

TÓM TẮTNghiên cứu tiến hành tuyển chọn chủng nấm men, nấm mốc từ các vi sinh vật có trong các loại bánh men của

các làng nghề sản xuất rượu tại các huyện Hoàng Su Phì và Quản Bạ, tỉnh Hà Giang. Kết quả đã tuyển chọn được chủng nấm mốc Aspergillus niger NLN.218 hỗ trợ thủy phân tinh bột và chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae RLN.168 có hiệu suất lên men đạt 93,07% ở nồng độ đường 18,14%, nồng độ cồn đạt 11,2% v/v. Kết quả đánh giá cảm quan cho thấy tất cả các mẫu thử nghiệm có điểm cảm quan thị hiếu cao hơn mẫu đối chứng được sản xuất từ loại bánh men truyền thống. Triển khai sản xuất thử nghiệm ở quy mô rộng hơn, kết quả đạt được cho thấy hiệu suất trung bình đạt từ 1,29 - 1,514 kg nguyên liệu/ lít rượu 30% v/v, tăng 6,5 - 24% so với bánh men lá truyền thống.

Từ khóa: Nấm mốc, nấm men, rượu làng nghề, bánh men lá, đánh giá cảm quan

I. ĐẶT VẤN ĐỀTheo thống kê của sở Công thương tỉnh Hà

Giang, đến năm 2014, toàn tỉnh có 17 cơ sở tham gia sản xuất kinh doanh rượu chủ yếu theo mô hình Hợp tác xã với năng lực sản xuất khoảng 160.000 lít/năm. Các thương hiệu rượu truyền thống đã đạt được nhiều giải thưởng chất lượng bao gồm rượu Nàng Đôn xã Nàng Đôn, huyện Hoàng Su Phì, rượu Thanh Vân xã Thanh Vân, huyện Quản Bạ. Tuy nhiên do điều kiện sản xuất thủ công chủ yếu dựa trên kinh nghiệm của người sản xuất nên chất lượng rượu cũng như hiệu suất thu hồi chưa ổn định (HABECO, 2103).

Đối với sản phẩm rượu làng nghề, chất lượng bánh men quyết định hiệu suất lên men và hương, vị rượu sản phẩm. Bánh men là môi trường nuôi dưỡng và bảo quản hệ vi sinh vật có lợi trong sản xuất rượu thủ công. Nấm mốc sinh tổng hợp enzyme α-amylase

và glucoamylase xúc tác quá trình thủy phân tinh bột tạo thành dextrin và các loại đường có khả năng lên men. Nấm men Saccharomyces cerevisiae có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa đường thành cồn, tạo các thành phần hương và các sản phẩm phụ khác của quá trình lên men (Lương Đức Phẩm, 2009). Nghiên cứu thành phần vi sinh vật có trong bánh men rượu tại các làng nghề Hà Giang, nhóm nghiên cứu của Viện Kỹ thuật Bia - Rượu - Nước giải khát đã xác định được 4 chủng nấm mốc là Aspergillus oryzae NLN.216, Aspergillus niger NLN.217, Aspergillus niger NLN.218, Mucor sp. NLN.219 và 05 chủng nấm men là Saccharomyces cerevisiae RLN.168, RLN.169, RLN.170, RLN.171, RLN.172. Nhằm nâng cao chất lượng và duy trì được các tính chất cảm quan đặc trưng của rượu làng nghề, việc tuyển chọn chủng nấm men, nấm mốc từ các vi sinh vật từ nguồn bánh men lá của các làng nghề, ứng dụng sản xuất bánh men giống là cần thiết.

74



2.1. Vật liệu nghiên cứuCác loại bánh men của các làng nghề sản xuất

rượu tại Hà Giang; Các loại thảo dược truyền thống của các làng nghề sản xuất rượu; Các loại nguyên liệu ngô hoặc thóc được sử dụng làm lương thực và sản xuất rượu tại các làng nghề.

Trang thiết bị chuyên dụng trong phòng nghiên cứu của Viện kỹ thuật Bia - Rượu - Nước giải khát. Các thiết bị và hóa chất phân tích được sử dụng đáp ứng theo yêu cầu các phương pháp phân tích chuyên ngành, mô tả trong mục 2.3.

Trang thiết bị, dụng cụ sản xuất bánh men, rượu được đầu tư phục vụ sản xuất tại các làng nghề sản xuất rượu của huyện Hoàng Su Phì và Quản Bạ, tỉnh Hà Giang.


2.2.1. Tuyển chọn chủng vi sinh vật Từ bộ sưu tập chủng giống vi sinh vật của Viện

Kỹ thuật Bia - Rượu - Nước giải khát Hà Nội tiến hành đánh giá, tuyển chọn chủng nấm mốc, nấm men trên cơ sở phân tích các đặc tính công nghệ của chủng. Khả năng sinh amylase của 4 chủng nấm mốc được đánh giá dựa trên hiệu số đường kính vòng phân giải tinh bột và đường kính khuẩn lạc trên môi trường Czapek’s Dox bằng cách thay thế đường sucrose bằng 1% tinh bột và sử dụng chỉ thị Lugol. Để đánh giá khả năng thủy phân cellulose sử dụng môi trường Czapex’s Dox với nồng độ CMC là 1%.

Hoạt lực lên men của 5 chủng nấm men được đánh giá thông qua lượng CO2 sinh ra từ bình Engol Smith có cột CO2 10 ml, chứa 25 ml dịch chiết malt 80S đã thanh trùng, sử dụng 1ml canh trường nấm men thuần chủng được nuôi cấy trên môi trường Hansen lỏng.

Khả năng lên men của chủng nấm men được đánh giá thông qua chất lượng rượu theo cách xác định nồng độ cồn (v/v) và hàm lượng các sản phẩm phụ của quá trình lên men. Môi trường lên men được

tạo ra bằng cách dịch hóa gạo với enzyme Termamyl SC 0,025%, dịch lên men sau khi được thanh trùng, làm nguội, bổ sung enzyme glucoamylase 0,1% và canh trường nấm men (Nguyễn Văn Thưởng, 2000).

2.2.2. Quy trình sản xuất bánh men lá Để đảm bảo mục tiêu của nhiệm vụ là lưu giữ

được những tính chất cảm quan đặc trưng của vùng Hoàng Su Phì và Quản Bạ, nhóm thực hiện đã sử dụng chính quy trình sản xuất bánh men lá truyền thống để sản xuất bánh men giống. Sử dụng các chủng nấm mốc, nấm men được tuyển chọn để thu được bánh men giống nhằm đưa đi sản xuất bánh men sản phẩm. Bánh men sản phẩm dùng để thử nghiệm sản xuất rượu được tạo thành từ các công thức bổ sung bánh men giống và thảo dược khác nhau (Bảng 1). Quy trình sản xuất bánh men sản phẩm để nghiên cứu sản xuất rượu tại các làng nghề được thể hiện trên hình 1.

Hình 1. Quy trình sản xuất bánh men sản phẩm

Rượu được sản xuất thử nghiệm với các bánh men sản phẩm theo các công thức thể hiện trong bảng 1 được so sánh, đối chứng với sản phẩm rượu truyền thống của người dân địa phương.

Ngô, thócThảo dược

Nghiền

Phối trộnBánh men

giống

Bánh men sản phẩm

Sấy khô

Nhân giống

Tạo hình xếp khay

Nước

Phơi khô, băm nhỏ

Bảng 1. Công thức bổ sung bánh men giống và lượng thảo dược, tính theo % so với khối lượng bánh men

CT1: 2% bánh men giống, 0,2% thảo dược CT4: 2% bánh men giống, 0,8% thảo dược



75


2.2.3. Sản xuất rượu tại làng nghề Các thí nghiệm được thực hiện tại chính các hộ

dân sản xuất rượu bằng cách cung cấp bánh men giống, quá trình sản xuất do chính người dân tự thực hiện từ khâu nấu, ủ men đến chưng cất sản phẩm. Phương pháp sản xuất rượu tại làng nghể bao gồm: Ngô, thóc rửa sạch, hấp chín; Làm nguội; Trộn bánh men; Ủ hở; Ủ kín (Lên men); Chưng cất; Rượu thành phẩm.

2.3. Các phương pháp phân tích

2.3.1. Xác định các chỉ tiêu hóa - lý và vi sinh- Xác định nồng độ đường ban đầu, đường sót,

hàm lượng cồn và hiệu suất lên men bằng máy phân tích tự động Anton Par- Thụy Sĩ.

- Phương pháp phân tích các chất thơm bằng sắc ký khí theo phương pháp AOAC.972.10. Sử dụng máy sắc ký khí (GC) ThermoQuest.

- Xác định hàm lượng axit bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH, xác định mật độ tế bào nấm men bằng buồng đếm Neubauer (Lê Thanh Mai và ctv., 2007).

2.3.3 Phương pháp đánh giá cảm quan rượu - Chỉ tiêu: Viện dẫn tiêu chuẩn TCVN 7043:2013.

Rượu trắng chưng cất. Yêu cầu đối với nguyên liệu và đối với sản phẩm.

- Phép thử cho điểm thị hiếu: Viện dẫn Kỹ thuật

phân tích cảm quan thực phẩm (Hà Duyên Tư, 2006). Mẫu thử được xắp xếp thứ tự theo sơ đồ đường chéo sao cho nhưng người thử ngồi kế tiếp nhau sẽ không nhận được mẫu thử có thứ tự xắp xếp giống nhau nhằm tránh hiện tượng thảo luận kết quả. Người thử nhận được các mẫu sản phẩm được đánh số theo thứ tự và phiếu đánh giá cảm quan thị hiếu bao gồm các chỉ tiêu đề nghị đánh giá, người thử cho điểm thị hiếu các chỉ tiêu bằng cách ngửi và nếm mẫu rượu sau đó đánh dấu vào mức cảm nhận từ mức 1 (cực kỳ không thích) đến mức 9 (cực kỳ thích) như được đề xuất trong mẫu thử. Người tổng hợp, xử lý số liệu cảm quan sẽ quy đổi điểm đánh giá ở các mức cảm nhận thành từ 1 đến 9, sau đó tiến hành xử lý thống kê số liệu.

2.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Các thí nghiệm được tiến hành từ tháng 5 -

12/2014 tại các làng nghề sản xuất rượu thuộc các huyện Hoàng Su Phì và Quản Bạ, Hà Giang và Viện Kỹ thuật Bia - Rượu - Nước giải khát, Tổng Công ty cổ phần Bia - Rượu - Nước giải khát Hà Nội.


3.1. Tuyển chọn chủng nấm mốc Một số đặc điểm hình thái của các loài nấm mốc

đã được phân lập từ các mẫu nấm men lá của các làng nghề thể hiện trên bảng 2.

Bảng 2. Đặc điểm hình thái các loài nấm mốc phân lập từ bánh men truyền thống

STT Loại nấm Đặc điểm hình thái Hình ảnh

1Aspergillus oryzae

Khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn, cuống bào tử dài 1mm, bọng bào tử hình tròn, thể bình một tầng, bào tử đính màu vàng, bông nấm hình chùy.

2Aspergillus niger

Khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn, cuống bào tử dài 1mm, bọng bào tử hình tròn, thể bình một tầng hay hai tầng, bào tử đính màu đen, bông nấm hình cầu giống hoa cúc

3 Mucor sp. Khuẩn ty phân nhánh không có vách ngăn, bào tử túi, bào tử hình thoi có vân dọc theo , bào tử màu đen

76


Các chi tiết mô tả trong bảng 1 phù hợp về đặc điểm vách ngăn, dạng bào tử, màu sắc của các loài tương ứng (Nguyễn Lân Dũng, 2006).

Do đặc điểm sử dụng phương pháp lên men khô tại các làng nghề sản xuất rượu truyền thống, ngoài việc tuyển chọn chủng nấm mốc sinh enzyme thủy phân tinh bột cao còn có yêu cầu thủy phân cellulose. Kết quả thử nghiệm khả năng phân giải tinh bột và cellulose của 4 chủng nấm mốc Aspergillus oryzae NLN.216, Aspergillus niger NLN.217, Aspergillus

niger NLN.218, Mucor sp. đã được phân lập và định danh được thể hiện trên bảng 3.

Khi thử nghiệm trên cơ chất tinh bột, chủng Aspergillus niger NLN.218 có hiệu số đường kính vòng phân giải và đường kính khuẩn lạc D-d = 10 mm lớn nhất, trên môi trường CMC hiệu số D-d = 6 mm cũng lớn nhất so với các chủng còn lại. Phân tích các kết quả đạt được, chủng Aspergillus niger NLN.218 được tuyển chọn do có khả năng phân giải tinh bột và cellulose cao nhất.

3.2. Tuyển chọn chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae

Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái của 05 chủng nấm men đã được phân lập và định danh từ các mẫu bánh men truyền thống Saccharomyces cerevisiae RLN.168, RLN.169, RLN.170, RLN.171, RLN.172 được mô tả trong bảng 4.

Theo các kết quả đạt được, các chủng nấm men có sự khác biệt không nhiều về các đặc điểm hình thái. Chủng Saccharomyces cerevisiae RLN.168 có nổi trội hơn so với các chủng còn lại về kích thước tế bào, kích thước khuẩn lạc.

Kết quả đánh giá hoạt lực lên men của 5 chủng nấm men được thể hiện trên bảng 5.

Bảng 3. Khả năng phân giải tinh bột và cellulose của chủng nấm mốc

STT Chủng Khả năng phân giải tinh bột (mm/mm)

Khả năng phân giải cellulose (mm/mm)

1Aspergillus oryzaeNLN.216

d/D=2/3 d/D =2/5

2Aspergillus nigerNLN.217

5/15 2/4

3Aspergillus nigerNLN.218

5/17 2/8

4 Mucor sp.NLN.219

2/3 2/5

77


Kết quả đạt được trong bảng 5 cho thấy, sau 8h quan sát, số ml CO2 sinh ra từ quá trình lên men với các chủng nấm men đã xác định là không đồng nhất do sự khác biệt về hoạt lực lên men. Chủng RLN.171 có hoạt lực lên men thấp hơn, các chủng RLN.168 và RLN.169 có hoạt lực lên men cao nhất.

Khả năng lên men của chủng nấm men được đánh giá thông qua khả năng tạo nồng độ cồn cao, nhiều chất thơm tương tự như ethylacetate, tạo ít các sản phẩm phụ có ảnh hưởng tiêu cực đến tính chất cảm quan cũng như an toàn vệ sinh thực phẩm. Kết quả thử nghiệm được thể hiện trên bảng 6.

Bảng 4. Đặc điểm hình thái các chủng nấm men phân lập từ bánh men truyền thống

TT Đặc điểm hình tháiChủng nấm men Saccharomyces cerevisiae

RLN.168 RLN.169 RLN.170 RLN.171 RLN.172

1 Kích thước khuẩn lạc (KL), mm 5,4 5,0 4,8 4,85 4,6

2 Hình dạng chung KL Tròn, to Tròn, to Tròn Tròn Tròn, nhỏ3 Bề mặt KL Trơn, bóng Trơn, bóng Nhăn Trơn, bóng Trơn, bóng

4 Mép KL Không có răng cưa

Không có răng cưa Có răng cưa Không có

răng cưaKhông có răng cưa

5 Chiều dày KL, mm 1,2 1,2 1,15 1,20 1,106 Màu sắc KL Trắng đục Trắng đục Trắng Trắng, đục Trắng

7 Hình dạng tế bào (TB) Elip, cầu, trứng

Elip, cầu, trứng

Cầu, ovan, trứng



8 Hình thức này chồi Nhiều phía Nhiều phía Nhiều phía Nhiều phía Nhiều phía9 Kích thước TB, µm 5,7 ÷ 6,2 5,6 ÷ 6,2 5,2 ÷ 6,0 5,3 ÷ 5,8 5,4 ÷ 6,0

Bảng 5. Hoạt lực lên men của các chủng nấm men từ bánh men truyền thống, ml CO2

Bảng 6. Đánh giá khả năng lên men của 5 chủng nấm men từ bánh men truyền thống

Thời gian, giờ

Chủng nấm menRLN.168 RLN.169 RLN.170 RLN.171 RLN.172

1 0,4 0,5 0,4 0,3 0,32 0,9 1,1 0,8 0,7 0,73 1,7 2,3 1,5 1,2 1,34 2.6 3,7 2,4 1,9 2,15 4,1 5,5 3,6 2,8 3,56 6,3 7,9 5,1 3,9 5,27 8,5 9,9 7,2 5.3 7,18 10 >10 9,5 6,7 9,3

Thành phầnChủng nấm men

RLN.168 RLN 169 RLN 170 RLN 171 RLN 172Nồng độ đường ban đầu, % 18,14 18,23 18,03 18.09 17,93Hàm lượng cồn, % v/v 11,20 10,87 10,08 8.73 9,16Hiệu suất lên men, % 93,07 88,9 83,04 70,90 67,28Acetaldehyde, mg/l 91,5 97,6 103,7 99,5 103,7Ethylacetate, mg/l 62,987 47,723 57,38 58,385 66,313Methanol, mg/l 18,55 30,67 78,901 98,665 92,717Iso-propanol, mg/l 93,5 106,53 107,92 113,78 113,78n-propanol, mg/l 10,72 14,063 59,929 62,068 57,43iso-butanol, mg/l 83,587 120,157 785,608 66,579 57,715iso-amylic, mg/l 172,135 357,39 348,266 285,67 317,75Furfurol, mg/l 22,656 45,42 30,206 41,18 61,286Hàm lượng axit, g/l 5,62 5,85 6,48 7,2 8,74

78


Phân tích, so sánh các kết quả nghiên cứu từ các bảng 4, 5, và 6, chủng Saccharomyces cerevisiae RLN.168 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo do có một số đặc điểm nổi trội như sau: Khả năng tạo độ cồn cao nhất (11,2% v/v) và hiệu suất lên men đạt cao nhất (93,07%); Các sản phẩm phụ của quá trình lên men do chủng này sinh ra phù hợp nhất trong số các chủng được nghiên cứu; Khả năng lên men tương đối nhanh do có hoạt lực lên men cao sẽ hạn chế được sự nhiễm tạp trong quá trình lên men ở điều kiện sản xuất thủ công thực tế; Tạo ít axit, sản phẩm ít mùi vị chua.

3.3. Nghiên cứu xác định nồng độ đường lên men cho chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae RLN.168

Khả năng lên men của chủng nấm men ở điều kiện nồng độ đường ban đầu từ 14 - 22% được khảo sát nhằm đánh giá khả năng tạo cồn. Kết quả thử nghiệm tại phòng nghiên cứu thể hiện trên bảng 7.

Kết quả nghiên cứu tại phòng thí nghiệm cho thấy chủng nấm men được lựa chọn có khả năng lên men tạo hàm lượng cồn lớn hơn 12% v/v ở hàm lượng đường ban đầu 20,06% và hiệu suất lên men đạt 87,06%. Tuy nhiên hiệu suất lên men của chủng nấm men đạt cao nhất là 93,07% ở nồng độ đường 18,14%, nồng độ cồn 11,2% v/v ở mức khá tốt trong công nghệ sản xuất rượu. Tại các vùng sản xuất rượu truyền thống của huyện Hoàng Su Phì và Quản Bạ nồng độ đường dao động trong khoảng 16 - 18%.

Như vậy, chủng nấm men được tuyển chọn phù hợp với điều kiện sản xuất tại vùng sản xuất rượu.

Bảng 7. Khả năng tạo cồn của chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae RLN.168

3.4. Kết quả sản xuất thử nghiệm tại làng nghềCác sản phẩm rượu làng nghề luôn có những

tính chất cảm quan đặc trưng của từng vùng, tính đặc trưng đó có được không chỉ bởi số lượng, chủng loại vi sinh vật có trong bánh men hay điều kiện khí hậu mà còn bởi do nguồn thảo dược được sử dụng. Các thử nghiệm lên men sản xuất rượu được thực hiện tại chính các hộ dân sản xuất rượu bằng cách cung cấp bánh men giống, quá trình sản xuất do người dân tự thực hiện từ khâu nấu, ủ men cho đến chưng cất sản phẩm. Kết quả đánh giá cảm quan thị hiếu rượu lên men với các bánh men tạo thành theo bảng 1 và mẫu rượu đối chứng (CT7) là rượu truyền thống không sử dụng các chủng vi sinh vật tuyển chọn được thể hiện trong bảng 8.

Từ kết quả đánh giá cảm quan cho thấy tất cả các mẫu thử nghiệm có điểm cảm quan thị hiếu cao hơn so với mẫu đối chứng (CT7) được sản xuất từ loại bánh men truyền thống. Như vậy, việc ứng

dụng chủng vi sinh vật thuần khiết vào bánh men lá truyền thống đã nâng cao được chất lượng cảm quan của sản phẩm. Các chỉ tiêu đánh giá cảm quan rượu đạt giá trị cao nhất tại CT5.

STTĐộ

đường (%)

Đường sót

(%)

Nồng độ cồn

(% v/v)

Hiệu suất lên men

(%)

1 13,59 1,37 7,95 90,52

2 15,09 1,38 9,03 91,50

3 18,14 1,38 11,20 93,07

4 20,06 2,94 12,03 87,06

5 22,15 4,54 12,18 81,42

Ghi chú: Vị chua: điểm càng cao rượu cảng ít chua.

Bảng 8. Tổng hợp kết quả đánh giá cảm quan rượu

Chỉ tiêuĐiểm trung bình của mẫu rượu theo công thức bánh men

CT 1 CT 2 CT3 CT4 CT5 CT 6 CT7 (đối chứng)

Độ trong 5,38 6,25 5,0 5,18 7,5 5,17 5,1

Mùi thơm rượu 6,25 5,11 5,4 5,78 7,2 5,8 4,5

Mùi thơm lá 5,86 6,0 5,57 5,71 7,0 5,56 4,0

Vị ngọt 5,25 6,0 5,78 6,11 7,09 5,5 3,67

Vị chua 5,67 6,11 6,11 6,11 7,0 6,1 3,11

Vị đắng 5,88 6,38 5,88 6,38 6,8 6,0 3,38

Sở thích 5,67 5,44 4,89 6,0 6,6 5,4 3,22

79


Cũng từ kết quả thử nghiệm trên, nhóm thực hiện đã tiếp tục triển khai sản xuất ở quy mô rộng hơn. Bánh men được sản xuất theo công thức CT5 của bảng 1. Kết quả thống kê từ các hộ gia đình tham gia sản xuất thử cho thấy hiệu suất lên men trung bình (kg nguyên liệu/lít rượu 30% v/v) đạt từ 1,29 - 1,514 kg/lít, tăng từ 6,5 - 24% so với bánh men lá truyền thống.

IV. KẾT LUẬN - Đã tuyển chọn được chủng nấm mốc Aspergillus

niger NLN.218 và chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae RLN.168 từ các vi sinh vật có trong bánh men truyền thống để ứng dụng sản xuất men lá phục vụ sản xuất rượu làng nghề tại Hoàng Su Phì và Quản Bạ, Hà Giang;

- Đã thử nghiệm thành công việc bổ sung chủng vi sinh vật thuần khiết vào quy trình sản xuất bánh men lá truyền thống. Rượu sản phẩm được sản xuất từ bánh men lá thử nghiệm đáp ứng được yêu cầu nâng cao giá trị cảm quan của sản phẩm rượu truyền thống và nâng cao được hiệu suất lên men từ 6,5 - 24%.

LỜI CẢM ƠNNhóm tác giả xin chân thành cảm ơn Tổng Công

ty Cổ phần Bia - Rượu - Nước giải khát Hà Nội đã tạo điều kiện về tài chính và cơ sở vật chất cho các nghiên cứu đã tiến hành.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Lân Dũng, 2002. Vi sinh vật học. NXB Giáo dục.Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thủy,

Nguyễn Thanh Hăng, Lê Thị Lan Chi, 2007. Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men. NXB Khoa học và Kỹ thuật. Hà Nội.

Lương Đức Phẩm, 2009. Nấm men công nghiệp. NXB Khoa học và Kỹ thuật.

TCVN 7043:2013. Rượu trắng chưng cất. Yêu cầu đối với nguyên liệu và đối với sản phẩm: Chỉ tiêu cảm quan, chỉ tiêu hóa học.

Hà Duyên Tư, 2006. Kỹ thuật phân tích cảm quan thực phẩm, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. Hà Nội.

Tổng công ty CP Bia –Rượu – Nước giải khát Hà Nội (HABECO), 9/2103. Báo cáo khảo sát hiện trạng sản xuất rượu làng nghề tại tỉnh Hà Giang do HABECO phối hợp thực hiện với Cục công nghiệp Địa phương – Bộ Công thương và Sở Công thương tỉnh Hà Giang thực hiện theo Thông báo số 367/TB-BCT.

AOAC.972.10, Alcohols (Higher) and Ethyl Acetate in Distilled Liquors, Alternative Gas Chromatographic Method.

Selection of mold and yeast strains from yeast cake for improving the quality of velves alcohol in Ha Giang

Pham Anh Tuan, Hoang Van Dat, Ho Tuan Anh

AbstractThis study presents steps for selecting mold and yeast strains from microorganisms found in the yeast cakes of the wineries in Hoang Su Phi and Quan Ba districts. The mold strain Aspergillus niger NLN.218 for starch hydrolysis and yeast strain Saccharomyces cerevisiae RLN.168 with fermentation efficiency of 93.07% at 18.14% sugar concentration and alcohol concentration of 11.2% v/v were selected. The results of sensory evaluation showed that all samples had higher scores than that of the control samples produced from traditional yeast cake. The results of larger scale production showed that the average fermentation efficiency was 1.29 - 1.514 kg of raw material per liter of alcohol at 30% v/v, increasing by 6.5 - 24% compared to the traditional yeast cake.Key words: Mold, yeast, velves alcohol, yeast cake, sensory analysis.

Ngày nhận bài: 4/6/2017Ngày phản biện: 10/6/2017

Người phản biện: TS. Trần Danh SửuNgày duyệt đăng: 25/6/2017

80


I. ĐẶT VẤN ĐỀCây thuốc dòi có tên khoa học là Pouzolzia

zeylanica L.Benn, thuộc họ Gai (Urticaceae), là một trong những loài thực vật có tác dụng trị bệnh. Theo Đông y, cây thuốc dòi có vị ngọt nhạt, tính mát, có tác dụng chỉ khái, tiêu đờm, dùng chữa ho lâu ngày, ho lao, viêm họng, viêm thanh phế quản (Võ Văn Chi, 2012). Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu cho thấy trong cây thuốc dòi có chứa một số chất có hoạt tính sinh học cao như: isoflavone, alkaloid, polyphenol, tannin, flavonoid, glycoside. Những chất này có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế sự phát triển của tế bào, ngăn ngừa ung thư (Lê Thanh Thủy, 2007; Paul and Saha, 2012).

Cây thuốc dòi có một vị trí khá quan trọng đối với người dân ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long, được người dân sử dụng như một loại rau để ăn sống, nấu canh hoặc phối hợp với các loại nguyên liệu khác như mã đề, rễ tranh, lá dứa, mía lau để nấu nước uống bồi bỗ cơ thể, thanh nhiệt, trị ho. Ngày nay, cùng với sự phát triển nhanh về kinh tế, thì con người cũng phải đối mặt với rất nhiều áp lực trong công việc cũng như nhiều căn bệnh mới do đó yêu cầu ngày càng phải có nhiều dược liệu mới với số lượng lớn cung cấp cho ngành công nghiệp sản xuất thuốc. Vì vậy, trong những năm gần đây các nhà khoa học đã không ngừng nghiên cứu và đẩy mạnh việc ứng dụng cây thuốc mới vào sản xuất thực phẩm chức năng và dược phẩm.

Tuy nhiên, việc nghiên cứu trên cây thuốc dòi hiện nay còn rất ít, kỹ thuật canh tác hầu như chưa

được nghiên cứu. Phần lớn cây thuốc dòi được trồng xen canh trong các vườn cây ăn trái với diện tích nhỏ và chỉ xem là cây trồng phụ, mỗi hộ trồng với phương pháp khác nhau nên cây thuốc dòi được bày bán trên thị trường với những màu thân cây tím đỏ khác nhau. Một số cây thuốc dòi mọc tự nhiên thì có thân cây màu xanh. Cho đến nay chưa có nghiên cứu nào công bố về hàm lượng các thành phần hóa học có trong cây thuốc dòi. Do đó, đây là nghiên cứu đầu tiên được thực hiện để phân tích hàm lượng một số hợp chất sinh học hiện diện trong cây thuốc dòi thân tím đỏ được trồng từ các hộ dân và cây thuốc dòi thân xanh mọc tự nhiên trên địa bàn tỉnh An Giang. Để từ đó trả lời câu hỏi được đặt ra là cây thuốc dòi nào có chứa các hợp chất sinh học nhiều hơn, vì ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long hiện nay có 2 loại cây thuốc dòi: loại cây thân tím đỏ và cây thân xanh, người dân chỉ trồng loại cây thân tím đỏ vì cho là có tác dụng trị bệnh tốt hơn và cây thân xanh thì chỉ mọc trong môi trường tự nhiên. Điều này rất có ý nghĩa cho các nghiên cứu tiếp theo về quy trình trồng cây thuốc dòi (khảo sát điều kiện trồng trọt và chăm sóc). Nhằm có sự khuyến cáo cho người dân trồng loại cây thuốc này một cách hiệu quả nhất trong tương lai.


2.1. Hóa chất và thiết bị phân tích- Hóa chất chuẩn sử dụng: Acid gallic, acid

tannic, quercetin, thuốc thử Folin-Cioalteau, Folin Denis (Sigma/Aldrich, Hoa Kỳ và Merck, Đức). Các

1 Khoa Nông nghiệp và Tài nguyên thiên nhiên, Trường Đại học An Giang2 Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ

PHÂN TÍCH SO SÁNH HÀM LƯỢNG CÁC HỢP CHẤT SINH HỌCCỦA CÂY THUỐC DÒI THÂN TÍM ĐỎ VÀ THÂN XANH

ĐƯỢC THU THẬP TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH AN GIANGNguyễn Duy Tân1, Võ Thị Xuân Tuyền1, Nguyễn Minh Thủy2

TÓM TẮTNghiên cứu được thực hiện nhằm phân tích so sánh hàm lượng các hợp chất sinh học (anthocyanin, flavonoid,

polyphenol và tannin) của 04 mẫu cây thuốc dòi, trong đó có 03 mẫu cây thuốc dòi thân tím đỏ được thu thập từ các hộ dân trồng khác nhau: (M1) hộ dân trồng trong vườn nhà, khu vực chân Núi Cấm thuộc xã An Hảo, huyện Tịnh Biên; (M2) hộ dân trồng xen canh trong vườn xoài, khu vực Cù lao thuộc xã Hòa Bình, huyện Chợ Mới; (M3) nghiên cứu trồng ở khu thực nghiệm Trường Đại học An Giang, khu vực Đồng bằng thuộc thành phố Long Xuyên và 01 mẫu cây thuốc dòi thân xanh mọc tự nhiên trong khu viên trường (M4). Kết quả cho thấy, hàm lượng các hợp chất sinh học trong các mẫu thu thập được có sự khác nhau ở mức ý nghĩa P < 0,05. Cụ thể, hàm lượng anthocyanin cao nhất (41,55 mgCE/100g FW) ở mẫu M1, kế đến là M3 > M2 > M4; ngược lại hàm lượng flavonoid cao nhất (2,71 mgQE/g FW) ở mẫu M4, kế đến là M3 > M2 > M1; trong khi đó, hàm lượng polyphenol và tannin cao nhất lần lượt là 4,26 mgGAE/g FW và 3,78 mgTAE/g FW ở mẫu M3, kế đến là M2 > M1 > M4.

Từ khóa: Cây thuốc dòi (Pouzolzia zeylanica L. Benn), anthocyanin, flavonoid, polyphenol, tannin

81


hóa chất khác: AlCl3, Na2CO3, KCl, CH3COONa, HCl, Ethanol (AR, Trung Quốc).

- Thiết bị sử dụng: Thiết bị đo độ hấp thu quang phổ (SPUVS, model SP-1920, Japan); thiết bị ly tâm (EBA 20 Hettich, Germany), cân sấy hồng ngoại (AND MX-50, Japan), Bể điều nhiệt (Menmert, France), Vortex lab (VELP Scientifica, Europe).

2.2. Thu thập và trích ly mẫuCác mẫu cây thuốc dòi được thu thập một cách

ngẫu nhiên từ các hộ dân trồng khác nhau. Chiều cao cây thuốc dòi thu thập là trong khoảng 35 - 40 cm (thời gian sinh trưởng 1,5 - 2 tháng tuổi sau khi trồng). Các mẫu được thu thập nguyên cây (dùng dao bén cắt ngang thân cây vị trí gần sát đất) vào buổi sáng sớm, sau đó phun cồn 90o và cho vào bao bì polypropylen, rồi vận chuyển về phòng thí nghiệm phân tích ngay trong ngày. Lượng mẫu thu thập 1 kg/mẫu.

Trong đó, 03 mẫu cây thuốc dòi thân tím đỏ được thu thập từ các hộ dân trồng khác nhau: (i) mẫu M1 hộ dân trồng trong vườn nhà, đất trồng thuộc vùng đồi núi, không bón phân đạm bổ sung, chỉ tưới nước, khu vực chân Núi Cấm thuộc xã An Hảo, huyện Tịnh Biên; (ii) mẫu M2 hộ dân trồng xen canh trong vườn xoài, đất trồng thuộc đất Cù lao, có bón phân đạm bổ sung 15 kg ure/1000 m2, khu vực xã Hòa Bình, huyện Chợ Mới; (iii) mẫu M3 nghiên cứu trồng thực nghiệm, đất trồng thuộc đất đồng bằng, có bón phân đạm bổ sung 15 kg ure/1000 m2, khu vực thành phố Long Xuyên; và 01 mẫu cây thuốc dòi mọc tư nhiên (mọc hoang dại) trong khu viên trường được ký hiệu mẫu M4. Các mẫu này được biết với tên gọi cây thuốc dòi (bọ mắn) với tên khoa học Pouzolzia zeylanica L. Benn, chưa có nghiên cứu định danh về giống loài.

Các mẫu cây thuốc dòi tươi được băm nhỏ, lấy mỗi mẫu 5 g cho vào bình tam giác có nút đậy, cho tiếp 100 ml ethanol 60% và đem trích ly trong bể điều nhiệt ở 60oC trong thời gian 60 phút. Mỗi mẫu được lặp lại 03 lần trong 03 bình tam giác khác nhau để tiến hành trích ly. Sau đó dịch trích ly được lọc qua giấy lọc (Whatman’s No.1). Định mức thể tích dịch lọc và tiến hành phân tích các hợp chất sinh học anthocyanin, flavonoid, polyphenol và tannin trong mỗi mẫu trích ly được.

2.3. Phương pháp phân tích các hợp chất sinh học Phân tích các hợp chất sinh học: (1) xác định

hàm lượng anthocyanin theo phương pháp pH vi

sai (Ahmed et al., 2013); (2) xác định hàm lượng flavonoid theo phương pháp Aluminium Chloride Colorimetric (Mandal et al., 2013); (3) xác định hàm lượng polyphenol theo phương pháp Folin-Ciocalteau (Hossain et al., 2013) và (4) xác định hàm lượng tannin theo phương pháp Folin-Denis (Laitonjam et al., 2013). Kết quả được thể hiện là milligram đương lượng cyanidin-3-glycoside (CE), quercetin (QE), acid gallic (GAE), acid tannic (TAE) trên gram hoặc 100 gram khối lượng tươi (FW).

2.4. Phương pháp xử lý số liệuCác số liệu sau khi thu thập được tính toán bằng

phần mềm Microsoft Excel và vẽ đồ thị. Kết hợp với phần mềm Statgraphic Centurion XV để phân tích phương sai ANOVA, kiểm tra mức độ khác biệt ý nghĩa của các nghiệm thức thông qua LSD.

2.5. Thời gian và địa điểm nghiên cứu- Thời gian nghiên cứu: Tháng 7 năm 2014.- Địa điểm nghiên cứu: Các huyện Tịnh Biên,

Chợ Mới và thành phố Long Xuyên, tỉnh An Giang.

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬNCác hợp chất sinh học như anthocyanin,

flavonoid, polyphenol và tannin là những chất trao đổi bậc hai của thực vật đóng vai trò quan trọng trong việc thích nghi của thực vật với môi trường sống (Bourgaud et al., 2001). Các điều kiện môi trường như nhiệt độ, lượng mưa, độ ẩm tương đối và các thông số trồng trọt ảnh hưởng đến thành phần các hợp chất trao đổi của thực vật (Iqbal và Bhanger, 2006). Vì thế, cây thuốc dòi thân tím đỏ được thu thập từ các hộ dân trồng khác nhau về điều kiện bón phân (không bón phân, có bón phân); về đất trồng (đất vùng Núi, đất Cù lao và đất Đồng bằng); về khí hậu (nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm) có màu sắc lá và thân cây tím đỏ khác nhau. Mẫu 1 được trồng ở điều kiện (đất vùng núi, không bón phân) thân cây có màu tím đỏ đậm, mặt lá màu xanh ngã vàng; còn mẫu 2 và 3 được trồng ở điều kiện (đất Cù lao hoặc Đồng bằng, có bón phân) thân cây có màu tím đỏ, mặt lá có màu xanh đậm. Điều này chứng tỏ điều kiện đất trồng, chế độ chăm sóc và khí hậu khác nhau đã tác động lên màu sắc của cây thuốc dòi thân tím đỏ. Còn mẫu 4 cây thuốc dòi thân xanh mọc tự nhiên có lá và thân cây màu xanh đậm (hình 1) điều này có thể là do cùng chi thuốc dòi nhưng khác loài, cần có một nghiên cứu định danh rõ ràng hơn.

82


Bên cạnh đó, kết quả phân tích hàm lượng các hợp chất sinh học của các mẫu cũng thể hiện sự khác nhau khá rõ rệt (Hình 2). Hàm lượng anthocyanin cao nhất (41,55 mg CE/100 g FW) được tìm thấy ở mẫu M1 và khác biệt với các mẫu còn lại, thấp nhất là mẫu M4 (7,83 mg CE/100 g FW). Hai mẫu M2 và M3 có hàm lượng anthocyanin lần lượt là 27,89 mg CE/100 g FW, 28,94 mg CE/100 g FW tuy nhiên giữa hai mẫu này chưa có sự khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa P< 0,01 (Hình 2a). Trong khi đó, hàm lượng flavonoid cao nhất (2,71 mg QE/g FW) được tìm thấy ở mẫu M4 và khác biệt có ý nghĩa so với các mẫu còn lại, thấp nhất là mẫu M1 (1,21 mg QE/g FW), tương tự hàm lượng flavonoid của mẫu

M2 (1,98 mg QE/g FW) thấp hơn mẫu M3 (2,15 mg QE/g FW) nhưng giữa chúng chưa có sự khác biệt ở mức ý nghĩa P < 0,01 (Hình 2b). Hàm lượng polyphenol và tannin cao nhất được tìm thấy ở mẫu M3 lần lượt là 4,26 mg GAE/g FW và 3,78 mg TAE/g FW và khác biệt so với các mẫu còn lại (P< 0,01). Thấp nhất là mẫu M4 với hàm lượng polyphenol và tannin lần lượt là 2,62 mg GAE/g FW và 1,22 mg TAE/g FW. Mẫu M2 có hàm lượng polyphenol và tannin cao thứ hai lần lượt là 3,59 mg GAE/g FW và 2,86 mg TAE/g FW; mẫu M1 có hàm lượng hai hợp chất này lần lượt là 3,12 mg GAE/g FW và 1,64 mg TAE/g FW (Hình 2c và 2d).

Hình 2. Đồ thị biểu diễn hàm lượng anthocyanin (a), flavonoid (b), polyphenol (c) và tannin (d) của các mẫu cây thuốc dòi khác nhau

Hình 1. Các mẫu cây thuốc dòi thu thập trong nghiên cứu Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4

41,55 a

27,89 b 28,94 b

7,83 c

0

10

20

30

40

50

60

M1 M2 M3 M4

Hàm

lượn

g an

thoc

yani

n(m

g Q

E/1

00g

FW)

Mẫu thu nhận

(a)

Hàm

lượn

g fla

vono

id(m

g Q

E/g

FW

)

1,21 c

1,98 b2,15 b

2,71 a

0

1

2

3

4

M1 M2 M3 M4

(b) Mẫu thu nhận

3,12 c3,59 b

4,26 a

2,62 d

0

1

2

3

4

5

6

M1 M2 M3 M4

(c) Mẫu thu nhận

Hàm

lượn

g po

lyph

eno

l (m

g G

AE

/g F

W)

1,64 c

2,86 b

3,78 a

1,22 d

0

1

2

3

4

5

M1 M2 M3 M4

(d) Mẫu thu nhận

Hàm

lượn

g ta

nnin

(mg

TAE

.g F

W)

83


Nghiên cứu của Sultana et al. (2009) cho thấy hàm lượng phenolic và flavonoid tổng trong các thực vật thuốc trong khoảng 0,31 - 16,5 g GAE/100g theo trọng lượng khô (DW); 2,63 - 8,66 g CE/100g DW. Hàm lượng anthocyanin, flavonoid và polyphenol trong cây bụt giấm là 16,53 mg/g; 3,5 mg/g và 7,4 mg/g (Obouayeba et al., 2014). Hàm lượng phenol và tannin tổng trong cây tinh thảo kép (Desmostachya bipinnata) là 7,09 mg GAE/g và 12,53 mg TAE/g cao trích (Padma et al., 2013). Hoặc trong rễ cây nhân sâm Ấn độ (Withania somniferia) hàm lượng flavonoid tổng 136,97 mg QE/100g, phenolic tổng 180,80 mg GAE/100g và tannin 0,6 mg CE/g cao trích (Chaudhuri et al., 2012). Hàm lượng flavonoid và tannin trong một số loại thực vật thuốc ở Nigeria lần lượt là 120 ÷ 255 mg/100 g và 80 ÷ 180 mg/100 g cao

trích (Abidemi, 2013). Kết quả phân tích các hợp chất sinh học anthocyanin, flavonoid, polyphenol và tannin trong cây thuốc dòi lần lượt là 7,83÷41,55 mg CE/100g; 1,21÷2,71 mg QE/g; 2,62÷4,26 mg GAE/g và 1,22÷3,78 mg TAE/g FW khối lượng tươi. Các hợp chất này hiện diện trong cây thuốc dòi ở mức cao so với một số cây dược liệu khác đã được công bố.

Ngoài ra, kết quả phân tích ẩm trong các mẫu thu thập được cho thấy hàm ẩm trong 03 mẫu có sự chênh lệch nhau 84,81% (M1), 85,39% (M2) và 84,21% (M3) tuy nhiên giữa các mẫu này chưa có sự khác biệt thống kê (P < 0,05). Mẫu M4 có hàm ẩm thấp nhất là 82,82%. Và các mô tả hình thái học cơ bản của các mẫu thuốc dòi thu thập được trình bày ở bảng 1.

IV. KẾT LUẬNKết quả phân tích hàm lượng các hợp chất sinh

học anthocyanin, flavonoid, polyphenol và tannin trong một số mẫu cây thuốc dòi được thu thập trên địa bàn tỉnh An Giang cho thấy hàm lượng các hợp chất sinh học hiện diện với hàm lượng cao hay thấp còn phụ thuộc vào điều kiện chăm sóc (bón phân) và các yếu tố môi trường như đất đai, nhiệt độ, độ ẩm tương đối, lượng mưa, ánh sáng và giống loài (thân xanh, thân tím đỏ). Mẫu M1 cây thuốc dòi thân tím đỏ được thu thập từ vùng trồng Tịnh Biên có hàm lượng anthocyanin cao nhất. Mẫu M4 cây thuốc dòi thân xanh thu thập từ môi trường tự nhiên (hoang dã) có hàm lượng flavonoid cao nhất nhưng hàm lượng các hợp chất còn lại thì thấp nhất. Mẫu M3 từ vùng trồng thực nghiệm ở Long Xuyên có hàm lượng polyphenol và tannin cao nhất. Mẫu M2 từ vùng trồng Chợ Mới có hàm lượng 4 hợp chất sinh học ở mức trung bình và cao hơn so với M1 và M4.

Đây là kết quả công bố đầu tiên về hàm lượng các hợp chất anthocyanin, flavonoid, polyphenol và tannin trong cây thuốc dòi thân tím đỏ và thân xanh được thu thập trên địa bàn tỉnh An Giang, Việt Nam.

TÀI LIỆU THAM KHẢOVõ Văn Chi, 2012. Từ điển cây thuốc Việt Nam. Nhà

xuất bản Y học. Hà Nội. Lê Thanh Thủy, 2007. Khảo sát thành phần hóa học của

cây bọ mắm. Luận văn thạc sĩ hóa học, Trường Đại học Khoa học tư nhiên TP. HCM.

Abidemi, O.O., 2013. Phytochemicals and spectrophotometric determination of metals in various medicinal plant in Nigeria. International Journal of Engineering Science Investion, 2 (5): 51-54.

Ahmed, J.K., Salih, H.A.M. and Hadi, A.G., 2013. Anthocyanin in red beet juice act as scavenger for heavy metals ions such as lead and cadmium. International Jouranl of Science and Technology, 2 (3): 269-273.

Bảng 1. Kết quả phân tích ẩm và mô tả hình thái học của các mẫu trong nghiên cứu

Ghi chú: Kết quả trung bình của 3 lần lặp lạị và độ lệch chuẫn SD; các chữ số có cùng mẫu tự theo sau trong cùng một hàng thể hiện sự không khác biệt (P<0,05).

Chỉ tiêu Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4Hàm ẩm (%) 84,81±0,921a 85,39±0,605a 84,21±0,249a 82,82±0,652b

Một số đặc điểm hình thái học cơ bản

Cây thân thảo; thân hình trụ màu tím đỏ, có lông tơ; lá hình mác hơi tròn nhỏ, mọc đối xứng, mặt trên màu xanh ngả vàng, mặt dưới tím đỏ và nhám

Cây thân thảo; thân hình trụ màu nâu đỏ, có lông tơ; lá hình mác hơi tròn lớn, mọc đối xứng, mặt trên màu xanh đậm, mặt dưới tím nhạt và nhám

Cây thân thảo; thân hình trụ màu nâu đỏ, có lông tơ; lá hình mác hơi tròn lớn, mọc đối xứng, mặt trên màu xanh đậm, mặt dưới tím nhạt và nhám

Cây thân thảo; thân hình trụ màu xanh, có lông tơ; lá hình mác hơi nhọn dài, mọc so le, mặt trên màu xanh đậm, mặt dưới màu xanh nhạt và nhám

84


Bourgaud, F., Gravot, A., Milesi, S. and Gontier, E., 2001. Production of plant secondary metabolites: A historical perspective. Plant Science, 16 (5): 839-851.

Chaudhuri, D., Ghate, N.B., Sarkar, R. and Mandal, N., 2012. Phytochemical analysis and evaluation of antioxidant and free radical scavenging activity of Withania somniferia root. Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, 5 (4): 193-199.

Hossain, M.A., Raqmi, K.A.S., Mijizy, Z.H., Weli, A.M. and Riyami, Q., 2013. Study of total phenol, flavonoids contents and phytochemical sreening of various leaves crude extracts of locally grown Thymus vularis. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 3 (9): 705-710.

Iqbal, S, Bhanger, M.I., 2006. Effect of season and production location on antioxidant activity of Moringa oleifera leaves grown in Pakistan. Journal Food Comp. Anal., 19: 544-551.

Laitonjam ,W.S., Yumnam, R., Asem, S.D. and Wangkheirakpam, S.D., 2013. Evaluative and comparative study of biochemical, trace elements and antioxidant activity of Phlogacanthus pubinervius T. Anderson and Phlocanthus jenkincii C.B. Clarke leaves. Indian Journal of Natural Products and Resources, 4 (1): 67-72.

Mandal, S., Patra, A., Samanta, A., Roy, S., Mandal, A., Mahapatra, T.D., Pradhan, S., Das, K. and Nandi, D.K., 2013. Analysis of phytochemical profile of Terminalia arjuna bark extract with antioxidative and antimicrobial properties. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 3 (12): 960-966.

Obouayeba, A.P., Djyh, N.B., Diabate, S., Djaman, A.J., N’Guessan, J.D., Kone, M. and Kouakou, T.H., 2014. Phytochemical and antioxidant activity of Roselle (Hibiscus sabdariffa L.) petal extracts. Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences, 5 (2): 1453-1465.

Padma, R., Parvathy, N.G., Renjith, V. and Kalpana, P.R., 2013. Quantitative estimation of tannins, phenols and antioxidant activity of methanolic extract of Imperata cylindrica. International Journal of Research in Pharmaceutical Sciences, 4 (1): 73-77.

Paul, S. and Saha, D., 2012. In vitro screening of cytotoxic activities of ethanolic extract of Pouzolzia Zeylanica (L.) Benn. International Journal of Pharmaceutical Innovations (IJPI), 2 (1): 52-55.

Sultana, B., Anwar, F. and Ashraf, M., 2009. Effect of extraction solvent/technique on the antioxidant activity of selected medicinal plant extracts. Molecules Journal, 14: 2167-2180.

Comparative analysis of bioactive compounds content in red-purple and wild green Pouzolzia zeylanica collected from An Giang province

Nguyen Duy Tan, Vo Thi Xuan Tuyen, Nguyen Minh ThuyAbstractThis research was carried out to comparatively analyze bioactive compounds contents (anthocyanin, flavonoid, polyphenol and tannin) of three red-purple Pouzolzia zeylanica samples collected from different planters: (M1) sample was cultivated in home garden in the area near the foot of Cam mountain, Tinh Bien district; (M2) sample was intercroped in mango garden in Hoa Binh commune, Cho Moi district; (M3) sample was planted for the experiment at An Giang University, Long Xuyen City and (M4) green Pouzolzia zeylanica sample was collected from nature on campus. The results indicated that bioactive compounds content in obtained samples had statistical difference (p < 0.01). Specifically, the highest anthocyanin content (41.55 mg CE/100g FW) was in M1 sample, then in M3> M2> M4 sample, respectively. On the other hand, the highest value of the flavonoid content (2.71 mg QE/g FW) was in M4 sample, then in M3 > M2 > M1 sample, respectively. Meanwhile, the highest polyphenol and tannin content (4.26 mg GAE/g FW and 3.78 mg TAE/g FW) were in M3 sample, then in M2 > M1 > M4 sample, respectively.Key words: Pouzolzia zeylanica, anthocyanin, flavonoid, polyphenol, tannin

Ngày nhận bài: 10/5/2017Người phản biện: PGS. TS. Ninh Thị Phíp


85


1 Khoa Sinh - Kỹ thuật Nông nghiệp, Đại học Sư phạm Hà Nội 22 Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp

I. ĐẶT VẤN ĐỀCây cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L.)

thuộc họ Cẩm chướng gồm 88 chi với 1750 loài (Arif, 2014). Các giống hoa cẩm chướng thuộc loài Dianthus caryophyllus L. rất đa dạng, thường được trồng để thu hoa thương phẩm dưới dạng hoa cắt cành, được người tiêu dùng ưa chuộng. Ở nước ta, cây hoa cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L.) được trồng từ đầu thế kỷ XX, chủ yếu ở những nơi có khí hậu mát mẻ như Sa Pa (Lào Cai), Đà Lạt (Lâm Đồng). Hầu hết các giống cẩm chướng hiện có ở nước ta đều được nhập nội từ Hà Lan, Pháp, Đức, Ý và Trung Quốc (Lê Huy Hàm và ctv., 2012). Ở nước ta, đã có một số quy trình sản xuất được công bố: Quy trình nhân giống hoa cẩm chướng bằng phương pháp giâm cành áp dụng cho vùng Đồng bằng sông Hồng (Viện Nghiên cứu Rau quả), quy trình kĩ thuật trồng hoa cẩm chướng tại Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng (Sở Nông nghiệp và PTNT Lâm Đồng), quy trình sản xuất hoa cẩm chướng (Lê Huy Hàm và ctv., 2012).

Bắc Hà là một huyện miền núi của tỉnh Lào Cai, là nơi có điều kiện thời tiết, khí hậu nhiều thuận lợi giúp phát triển nông, lâm nghiệp đa dạng. Tuy nhiên, kinh tế của huyện Bắc Hà còn nhiều khó khăn do địa hình đồi núi phức tạp, trình độ dân trí thấp, sản xuất còn lạc hậu. Xuất phát từ những lý do trên, đề tài này được thực hiện để hoàn chỉnh quy trình nhân giống hoa cẩm chướng tại Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Sau đó, hoàn thiện một số biện pháp kĩ thuật trồng và chăm sóc hoa cẩm chướng thương phẩm

tại huyện Bắc Hà, Lào Cai nhằm khai thác thế mạnh vùng miền và hỗ trợ phát triển kinh tế địa phương một cách bền vững.


2.1. Vật liệu nghiên cứu- 5 giống cẩm chướng thương mại gồm: Trắng

viền đỏ - TVĐ (Breezer), hồng cánh sen - HCS (Cerise rosy barbara), vàng chanh - VC (Regatta), đỏ nhung - ĐN (Plantom) và đỏ chùm - ĐC (Red barbara), là các giống hoa chùm, do Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng Kĩ thuật Nông nghiệp Đà Lạt (Lâm Đồng) cung cấp.

- Hóa chất đa lượng, vi lượng trong nuôi cấy mô (Trung Quốc), BAP (6-Benzylaminopurine), NAA (Naphthyl acetic acid) (Dulchefa, Hà Lan), chế phẩm kích thích ra rễ N3M (Công ty TNHH MTV Sinh hóa nông Phú Lâm), chế phẩm Atonik 1.8DD (công ty ADC, Cần Thơ), phân bón hữu cơ vi sinh (Sông Gianh), phân bón Đầu trâu (NPK-13:13:13) (Bình Điền).


2.2.1. Bố trí thí nghiệm và phương pháp xác định chỉ tiêu nghiên cứua) Hoàn thiện quy trình nhân giống

Tiến hành 3 thí nghiệm, mỗi công thức được nhắc lại 3 lần theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên. Đối chứng (ĐC) là công thức không sử dụng chất điều hòa sinh trưởng hoặc chế phẩm. TN 1: Tái sinh và

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG, TRỒNG VÀ CHĂM SÓC MỘT SỐ GIỐNG HOA CẨM CHƯỚNG

(Dianthus Caryophyllus L.) TẠI HUYỆN BẮC HÀ, LÀO CAILa Việt Hồng1, La Thị Hạnh1,

Ngô Tuyết Dung1, Bùi Văn Thắng2

TÓM TẮTNghiên cứu này nhằm hoàn chỉnh một số biện pháp kĩ thuật để nhân giống, trồng và chăm sóc hoa cẩm chướng

thương mại: Trắng viền đỏ, hồng cánh sen, vàng chanh, đỏ nhung và đỏ chùm. Đốt thân được sử dụng làm vật liệu khởi đầu cho nuôi cấy in vitro. Môi trường phù hợp để tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro của các giống cẩm chướng: MS, 3% saccarozơ, 0,7% agar có bổ sung BAP 0,1 mg/l. Ở công thức tái sinh này, tỷ lệ mẫu bị thủy tinh hóa thấp. Môi trường phù hợp để ra rễ cho chồi in vitro: MS, 3% saccarozơ, 0,7% agar có bổ sung NAA 0,1 mg/l. Chế phẩm kích thích ra rễ N3M nồng độ 20 g/ml phù hợp để tạo rễ cho chồi ex vitro. Khoảng cách trồng là 25 x 30 cm hoặc 30 x 35 cm, bón lót bằng phân bón vi sinh hữu cơ (30 kg/360 m2), bón thúc bằng phân bón NPK Đầu trâu (13 :13 :13) tưới hàng tuần (20 - 30 kg/360 m2) và phun chế phẩm Atonik (0,5 mg/l) là phù hợp sinh trưởng và phát triển của các giống cẩm chướng.

Từ khóa: Bắc Hà, cẩm chướng, Dianthus caryophyllus, nhân giống, sản xuất, thương mại

86


nhân nhanh chồi in vitro: đốt thân được khử trùng bằng dung dịch javel (NaClO) và nuôi cấy lên môi trường nghiên cứu sử dụng BAP: 0,0; 0,1; 0,2; 0,3 (mg/l) (kí hiệu: S0-ĐC; S1; S2; S3). Theo dõi các chỉ tiêu: Số chồi/mẫu; Chiều cao chồi (cm) và Số lá/chồi sau 6 tuần nuôi cấy. TN 2: Ra rễ cho chồi in vitro: Nghiên cứu sử dụng NAA: 0,0; 0,1; 0,2; 0,3 (mg/l) (kí hiệu: RI0-ĐC, RI1, RI2 và RI3). Theo dõi các chỉ tiêu: Số rễ/chồi, Chiều dài rễ (cm) sau 20 ngày nuôi cấy. TN 3: Ra rễ cho chồi ex vitro: sử dụng chồi bên 20 - 30 ngày tuổi nhúng vào chế phẩm kích thích ra rễ N3M trong 5 phút, giâm lên cát ẩm: 0,0; 20; 30; 40 (g/ml) (kí hiệu: RE0-ĐC, RE1, RE2 và RE3). Theo dõi chỉ tiêu: Tỷ lệ ra rễ (%), Số rễ/chồi, Chiều dài rễ (cm), Số lá non hình thành sau 20 ngày thí nghiệm. b) Nghiên cứu một số biện pháp kĩ thuật trồng và chăm sóc hoa cẩm chướng

Tiến hành 3 thí nghiệm, mỗi công thức được nhắc lại 3 lần theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên. Xác định chỉ tiêu: Chiều cao cây tối đa (cm) được xác định khi chồi có biểu hiện phân hóa thành mầm hoa; số nụ/cành và Số cành hoa thực thu/cây.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của khoảng cách trồng: Gồm các công thức: 10 ˟ 20 (cm); 20 ˟ 25 (cm); 25 ˟ 30 (cm) và 30 ˟ 35 (cm). Kí hiệu: M1, M2, M3 và M4.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của phân bón: Các công thức được bón lót bằng phân hữu cơ vi sinh (Sông Gianh): 30 kg/360 m2. Bón thúc bằng phân vô cơ hàng tuần (tính cho 1 sào 360 m2) gồm: PB1: Phân đầu trâu NPK (13:13:13): 20 - 30 kg; PB 2: Amonnitrat 13 kg + Supelân 22,5 kg + Kali nitrat 24,4 kg + Canxi nitrat 20 kg + Axit boric 200 g; PB 3: Ure 9,6 kg + Supe lân 22,5 kg + Kali nitrat 24,4 kg + Canxi nitrat 20 kg + Axit boric 200 g.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của Atonik: Sử dụng Atonik 0,5 mg/l để phun vào các thời điểm khác nhau: At1-ĐC: không dùng Atonik; At2: phun lần 1 sau trồng 15 ngày; phun lần 2 khi cây có biểu hiện ra nụ, phun lần 3 khi hoa đầu tiên lớn hết cỡ; At3: phun

lần 1 sau trồng 20 ngày, lần 2 khi xuất hiện nụ hoa đầu tiên, lần 3 hoa đầu tiên có biểu hiện chín; At4: Phun lần 1 phun sau trồng 25 ngày, phun lần 2 khi nụ hoa xuất hiện đủ, phun lần 3 hoa đầu tiên có biểu hiện chín hoàn toàn.

2.2.2. Phân tích thống kêSố liệu được xử lý thống kê trên chương trình

Excel 2010 (Nguyễn Văn Mã, 2013), giá trị thể hiện là giá trị trung bình, LSD0,05, CV(%). Trong cùng một cột, chữ theo sau (a, b, c…) khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê với α=0,05.

2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Thời gian nghiên cứu: Tháng 2/2016-5/2017. - Địa điểm nghiên cứu: Hoàn thiện quy trình

nhân giống tại Khoa Sinh - Kỹ thuật nông nghiệp, Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Trồng, chăm sóc hoa cẩm chướng tại Khu Nông nghiệp công nghệ cao của Công ty TNHH Anh Nguyên (Bắc Hà, Lào Cai).


3.1. Hoàn thiện quy trình nhân giống một số giống hoa cẩm chướng

3.1.1. Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitroKết quả được thể hiện ở bảng 1 cho thấy môi

trường S1 và S2 là phù hợp nhất để tái sinh và nhân nhanh chồi cẩm chướng in vitro của 4 giống cẩm chướng TVĐ, VC, ĐN và ĐC. Số chồi/mẫu cao nhất ở giống TVĐ và ĐC (5,00 - 6,66 chồi/mẫu), thấp hơn ở hai giống còn lại (đạt 4,00 chồi/mẫu), riêng giống HCS, không thể hiện rõ khác biệt về tác động của BAP. Chiều cao chồi của cả 5 giống ở các công thức S1 và S2 đều cao hơn so với công thức S0 và S3, dao động từ 8,00 - 15,33 cm. Số lá/chồi cũng thể hiện sự khác biệt ở công thức S1 và S2 so với S0 và S3 ở cả 5 giống, dao động từ 2,66 - 7,00. Tỷ lệ mẫu bị thủy tinh hóa ở công thức nuôi cấy S1 thấp và gặp ở hầu hết các giống.

Bảng 1. Kết quả tái sinh và nhân nhanh chồi in vitroChỉ tiêu Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm) Số lá/chồi

GiốngCT TVĐ HCS VC ĐN ĐC TVĐ HCS VC ĐN ĐC TVĐ HCS VC ĐN ĐC

S0 2,33b 1,66a 1,66b 1,66b 2,33c 3,00b 3,00b 2,33a 5,00bc 3,00a 6,00b 5,33c 4,66c 5,00c 5,00c

S1 6,00a 4,03a 4,00a 4,00a 6,66a 16,33a 11,30a 13,30a 10,00a 8,00b 5,66a 4,00a 2,66a 7,00a 3,00a

S2 5,00a 4,00a 4,00a 3,00a 5,00ab 15,00a 9,60ab 9,00b 8,00b 15,33a 6,00a 3,66a 2,66a 6,33a 2,66a

S3 3,00b 3,00a 3,00a 2,66a 3,66b 7,00b 6,00b 5,00c 6,00c 5,00b 2,33b 3,33a 2,33a 4,30b 2,33a

LSD0,05 1,99 2,40 1,99 1,70 2,70 2,40 4,70 3,88 1,99 2,97 1,48 0,94 1,15 1,48 0,94CV(%) 22.3 39.7 28.8 28.8 27.7 19.2 18.4 23.0 14.4 23.4 10.4 25.5 21.3 13.7 16.2

87


3.1.3. Ra rễ cho chồi ex vitroNhân giống cẩm chướng bằng phương pháp giâm

cành giúp sản xuất nhanh chóng số lượng cây giống cho sản xuất, giảm đáng kể chi phí sản xuất. Nghiên cứu này sử dụng chế phẩm kích thích ra rễ N3M để kích thích ra rễ cho chồi cẩm chướng ex vitro để tạo cây giống hoàn chỉnh cho sản xuất, kết quả thể hiện ở bảng 3 và bảng 4.

Bảng 3. Ảnh hưởng của chế phẩm N3M đến tỷ lệ ra rễ (%)

3.1.2. Ra rễ cho chồi in vitro-tạo cây hoàn chỉnhKết quả cho thấy quá trình ra rễ của chồi cẩm

chướng in vitro ở môi trường bổ sung NAA khác nhau là khác nhau (Bảng 2). Môi trường ra rễ phù hợp đối với các giống là RI-1: số rễ/chồi thấp nhất ở giống HCS (đạt 4,66) và cao nhất là ở giống TVĐ đạt

6,00. Chiều dài rễ từ 4,33 (HCS) và cao nhất ở giống TVĐ (đạt 4,66), riêng giống ĐC không thể hiện sự khác biệt về chiều dài rễ ở các công thức. Như vậy, môi trường phù hợp để ra rễ cho chồi cẩm chướng in vitro của các giống là RI-1 (NAA 0,1 mg/l).

Bảng 2. Kết quả ra rễ cho chồi in vitro-tạo cây hoàn chỉnh

Bảng 4. Kết quả ra rễ cho chồi ex vitro

Chỉ tiêu Số rễ/chồi Chiều dài rễ (cm)Giống

CT TVĐ HCS VC ĐN ĐC TVĐ HCS VC ĐN ĐC

RI-0 3,00b 2,66a 2,66b 3,00b 2,66b 2,66c 2,33a 3,00b 2,66b 2,66a

RI-1 6,00a 4,66a 5,33a 5,00a 4,66a 5,66a 4,33a 3,66ab 4,66a 2,66a

RI-2 5,00a 3,66ab 4,33a 4,00ab 3,33ab 4,66ab 4,00a 4,66a 4,00a 4,00a

RI-3 4,03b 3,33b 5,00a 4,66ab 4,33a 4,33b 3,33a 4,00ab 4,33a 3,66a

LSD0,05 1,71 1,08 1,63 1,71 1,43 1,08 2,10 1,53 1,33 1,63CV(%) 19,91 16,11 19,98 21,90 20,36 13,32 31,94 21,29 18,05 25,34

Kết quả cho thấy tỷ lệ ra rễ và số rễ/chồi của các giống tốt nhất ở công thức RE-2 tương ứng là 80,0 - 96,6% và 3,00 - 4,33 rễ/chồi: Về chỉ tiêu chiều dài rễ và số lá mới hình thành đều không thể hiện sự khác biệt rõ rệt giữa các công thức thí nghiệm.

3.2. Hoàn thiện biện pháp kĩ thuật trồng và chăm sóc một số giống hoa cẩm chướng

3.2.1. Ảnh hưởng của khoảng cách trồng đến sinh trưởng và phát triển

Kết quả được thể hiện ở bảng 5 cho thấy: Công thức M3 và M4 là phù hợp cho sự sinh trưởng, phát triển và năng suất hoa của tất cả các giống cẩm chướng được nghiên cứu, cụ thể chiều cao cây cây tối đa, chiều cao cây ra hoa, số nụ/cành cao nhất ở giống TVĐ, thấp nhất ở giống ĐN. Số cành thực thu không có sự khác biệt rõ rệt giữa các giống, đạt 6,33 (ĐN), 6,66 (HCS, VC, ĐC) và 7,00 (TVĐ).

Chỉ tiêu Số rễ/chồi Chiều dài rễ (cm) Số lá mới hình thànhGiống

CT TVĐ HCS VC ĐN ĐC TVĐ HCS VC ĐN ĐC TVĐ HCS VC ĐN ĐC

RE-0 2,66a 2,00a 1,33a 1,33b 2,00b 2,00a 2,33a 1,66a 2.00a 2,00a 2,33a 2,00a 1,66a 2,00a 2,00a

RE-1 2,33a 3,66a 1,66a 3,00ab 3,33ab 3,00a 3,00a 1,66a 2,33a 3,66a 2,66a 3,00a 1,66a 2,33a 3,66a

RE-2 4,00a 3,00a 3,00a 4,00a 4,33a 3,66a 2,66a 2,33a 3,66a 4,00a 3,33a 3,66a 2,66a 3,66a 3,33a

RE-3 2,66a 2,33a 2,00ab 2,33ab 3,00a 2,33a 2,00a 2,66a 2,66a 4,00a 2,33a 2,00a 2,00a 2,66a 3,00a

LSD0,05 2,10 2,60 1,53 2,03 2,60 2,43 2,24 1,43 2,49 2,54 1,43 1,95 1,33 2,49 2,43CV(%) 38,3 50,3 40,8 40,5 30,2 46,9 47,6 36,6 49,6 42,7 28,6 39,0 35,3 49,6 43,0

GiốngCT TVĐ HCS VC ĐN ĐC

RE-0 80,0 66,6 20,0 50,0 66,6RE-1 83,3 83,3 50,0 86,6 93,3RE-2 90,0 93,3 80,0 93,3 96,6RE-3 76,6 70,0 66,6 83,3 80,0

88


3.2.2. Ảnh hưởng của phân bón đến sinh trưởng, phát triển

Thành phần và trạng thái dinh dưỡng của đất trồng sẽ giúp cây ra hoa có chất lượng cao như kích thước hoa và số hoa nhiều hơn (Carlile, 2008). Kết quả được thể hiện ở bảng 6.

Phân tích cho thấy công thức PB1 (phân vi sinh đa năng kết hợp phân đầu trâu 13 : 13 : 13) là thích hợp cho sự phát triển của các giống, trong đó cao

nhất ở giống TVĐ và thấp nhất ở giống ĐN, cụ thể chiều cao cây tối đa (54,00 - 87,33 cm), chiều cao cây ra hoa (55,33 - 87,00 cm), số nụ cành/cành đạt 5,66 - 6,66), số hoa thực thu (5,66 - 7,00). Theo Yasmeen (2012) nghiên cứu trên giống D.caryophyllus cv. “Chauband Mixed” cho rằng hoạt động phân giải xác hữu cơ của vi sinh vật làm cho cấu trúc, thuộc tính của đất phù hợp cho sinh trưởng của cây cẩm chướng.

Bảng 5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của khoảng cách trồng đến sinh trưởng, phát triển của cây cẩm chướng

Bảng 6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của phân bón đến sinh trưởng, phát triển của cây cẩm chướng

Bảng 7. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Atonik đến sinh trưởng, phát triển của cây cẩm chướng

Chỉ tiêu Chiều cao cây tối đa (cm) Số nụ/cành Số cành hoa thực thu/câyGiống


M1 67,66b 51,00a 57,66b 43,33b 64,00b 5,33a 4,00b 5,00a 4,00b 4,66b 5,00b 5,00b 4,33b 4,66b 4,66b

M2 76,33ab 52,66a 64,66b 43,33b 66,66ab 5,66a 5,00ab 5,33ab 4.33ab 6,00a 6,00ab 6,66a 6,00ab 5,66ab 6,00a

M3 77,33ab 42,66a 66,66ab 47,33ab 72,43ab 6,33a 5,33ab 5,66a 5,33ab 6,33a 6,66a 6,00ab 6,00ab 6,00ab 6,33a

M4 87,33a 61,66a 77,33a 58,33a 76,93a 6,66a 6,00a 5,66a 6,33a 6,66a 7,00a 6,66a 6,66a 6,33a 6,66a

LSD0,05 14,1 18,5 11,2 11,7 10,0 1,7 1,7 1,88 2,1 1,3 1,0 1,5 2,0 1,3 1,3CV(%) 9,7 18,9 8,9 12,9 7,6 15,2 17,9 18,4 23,3 11,9 9,36 13,4 18,7 12,4 11,9

3.2.3. Ảnh hưởng của Atonik đến sinh trưởng, phát triển

Phương pháp bổ sung dinh dưỡng qua lá cho thực vật là một giải pháp dinh dưỡng thay thế để

cải thiện sinh trưởng và sự ra hoa của cây hoa cẩm chướng (Sharaf và El-Naggar, 2003). Kết quả được thể hiện ở bảng 7.



PB1 87,33a 60,00a 68,66a 54,00a 67,33a 6,66a 6,33a 6,33a 5,66a 6,00a 7,00a 6,66a 6,33a 5,66a 6,00aPB2 76,33ab 51,33ab 59,33ab 50,66ab 61,33ab 5,66a 5,33ab 5,00ab 4,66ab 5,0ab 5,66b 5,00b 5,33ab 4,33ab 5,66a

PB3 67,66b 45,33b 54,00b 43,33b 55,33b 4,00b 4,33b 3,66b 3,33b 3,33b 4,00c 3,33c 3,66b 3,00b 4,33a

LSD0,05 11,1 11,6 12,5 9,9 10,6 1,4 1,1 2,4 1,9 2,1 1,3 1,4 1,9 1,4 1,8CV(%) 7,2 11,2 10,3 10,0 8,6 13,6 10,8 24,9 21,9 22,0 12,0 14,9 19,5 17,2 17,6



At1 47,00b 37,00b 35,66b 37,33b 36,33b 3,00b 4,00b 2,33b 3,00b 3,66c 4,00b 3,33b 3,00b 4,00b 3,66b

At2 62,33b 57,33ab 55,66ab 57,66ab 59,66ab 5,33b 5,00ab 5,33a 4,66ab 5,00bc 6,00a 5,33a 5,00ab 5,33ab 5,33a

At3 70,00ab 61,33ab 60,33a 62,33a 60,33ab 6,00a 5,33ab 5,00a 5,00a 6,00ab 6,33a 6,00a 5,66a 5,33ab 6,00a

At4 78,66a 71,33a 58,00ab 60,66a 64,66a 6,33a 6,00a 6,33a 6,00a 6,66a 6,66a 6,33a 6,33a 6,33a 6,66a

LSD0,05 27,7 26,3 22,7 22,4 25,3 2,0 1,7 1,3 1,7 1,5 1,5 1,5 2,0 1,6 1,3CV(%) 22,8 25,1 23,0 21,8 24,1 20,9 17,9 14,8 19,5 15,3 14.1 19.0 21.6 16.4 13.0

89


Phân tích cho thấy công thức At4 là thích hợp cho sự phát triển của tất cả các giống cẩm chướng nghiên cứu, cụ thể chiều cao cây tối đa đạt từ 58,00 (VC) đến 78,66 (TVĐ), chiều cao cây ra hoa đạt từ 58,33 (VC) đến 79,33 (TVĐ), số nụ/cành đạt từ

6,00 - 6,66 và số hoa thực thu đạt 6,33 - 6,66. Kết quả nhân giống, trồng và chăm sóc một số

giống hoa cẩm chướng thương mại được tóm tắt ở hình 1.

Hình 1. Hoàn thiện quy trình nhân giống, trồng và chăm sóc hoa cẩm chướng(a): đốt thân in vitro; (b): tái sinh chồi in vitro ở S1; (c): mẫu bị thủy tinh hóa; (d): chồi in vitro ra rễ ở công thức RI-1;

(e): chồi ex vitro ra rễ ở RE-2; (f, g, h-được thực hiện tại Bắc Hà, Lào Cai): trồng thử nghiệm (M3, PB1, At4).


4.1. Kết luận- Giai đoạn nhân giống: Sử dụng đốt thân của

năm giống cẩm chướng: trắng viền đỏ, hồng cánh sen, vàng chanh, đỏ nhung và đỏ chùm làm vật liệu khởi đầu in vitro; môi trường tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro là MS, 3% saccarozơ, 0,7% agar có bổ sung BAP 0,1 mg/l: số chồi/mẫu: 5,00 - 6,66; chiều cao chồi: từ 8,00 - 15,33 (cm); số lá/chồi: từ 2,66 - 7,00. Môi trường ra rễ cho chồi in vitro: MS, 3% saccarozơ, 0,7% agar có bổ sung NAA 0,1 mg/l, số rễ/chồi: 4,66 - 6,00; chiều dài rễ: 4,33 - 4,66. Sử dụng chế phẩm kích thích ra rễ N3M (20 g/l) là phù hợp để kích thích sự ra rễ của chồi ex vitro.

- Một số biện pháp kĩ thuật để trồng và chăm sóc hoa cẩm chướng: Khoảng cách trồng là 25 x 30 hoặc 30 x 35 (cm); bón lót bằng phân hữu cơ vi sinh (Sông Gianh): 30 kg/360 m2, bón thúc bằng phân Đầu trâu

NPK (13 : 13 : 13) (Bình Điền): 20 - 30 kg/360 m2, phân được hòa với nước và tưới hàng tuần; phun chế phẩm Atonik (0,5 mg/l): phun lần 1 phun sau trồng 25 ngày, phun lần 2 khi nụ hoa xuất hiện đủ và phun lần 3 hoa đầu tiên có biểu hiện chín hoàn toàn.

4.2. Kiến nghịTiếp tục thử nghiệm sản xuất hoa cẩm chướng

thương mại bằng công nghệ tiên tiến tại Bắc Hà, Lào Cai.

TÀI LIỆU THAM KHẢOLê Huy Hàm, Nguyễn Thị Kim Lý, Lê Đức Thảo, Dad-

lani N.K, Nguyễn Xuân Linh, Phạm Thị Lý Thu, Trịnh Xuân Hoạt, 2012. Kĩ thuật sản xuất một số loại hoa. NXB Nông nghiệp.

Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong, 2013. Phương pháp nghiên cứu sinh lý học thực vật. NXB Đại học Quốc gia Hà Nội.

90


1 Trường Cao Đẳng Kinh tế - Kỹ thuật Thái Nguyên 2 Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG THỨC BÓN PHÂN VÀ KHOẢNG CÁCH GIEO HẠT TRONG CANH TÁC GIỐNG LÚA NẾP CẠN KHẨU NUA TRẠNG TẠI HÀ GIANG

Đào Thị Thu Hương1, Trần Văn Điền2, Dương Thị Nguyên2

TÓM TẮTNghiên cứu được thực hiện nhằm xác định phương thức bón phân và khoảng cách gieo hạt hợp lý trong canh

tác giống lúa nếp cạn Khẩu Nua Trạng trên đất không chủ động nước tưới tại xã Đạo Đức, huyện Vị Xuyên tỉnh Hà Giang. Thí nghiệm tổ hợp phương thức bón phân và khoảng cách gieo hạt gồm 3 phương thức bón phân: P1 (phân NPK rời bón vãi trên mặt luống theo truyền thống); P2 (phân NPK rời bón theo rạch hàng sâu 6 - 8 cm); P3 (phân NPK được nén và bón vùi sâu) kết hợp với ba khoảng cách gieo hạt A1 (mật độ 30 khóm/m2, 17 ˟ 20 ˟ 20 cm); A2 (mật độ 30 khóm/m2, 17 ˟ 30 ˟ 10 cm); A3 (mật độ 30 khóm/m2, 13 ˟ 40 ˟ 10 cm). Thí nghiệm được thực hiện trên nền phân bón tính cho 1 ha là 1 tấn phân hữu cơ vi sinh + 60 kg N + 60 kg P2O5 + 45 kg K2O + 300 kg vôi bột. Kết quả cho thấy các tổ hợp A1P2; A2P2; A1P3; A2P3 là những tổ hợp cho năng suất lý thuyết và năng suất thực thu đạt hiệu quả tốt nhất.

Từ khóa: Khẩu Nua Trạng, lúa nếp cạn, phân bón, khoảng cách, sinh trưởng, năng suất

Sở Nông nghiệp và PTNT Lâm Đồng, 2012. Quy trình kĩ thuật tạm thời trồng hoa cẩm chướng trên địa bàn tỉnh Lâm Đồng (QĐ 1251/QĐ-SNN ngày 13/12/2012).

Viện Nghiên cứu Rau quả. Quy trình nhân giống hoa cẩm chướng bằng phương pháp giâm cành (dẫn lại từ http://favri.org.vn).

Arif M, Rauf S, Din A.U, Rauf M, Afrasiab H, 2014. “High Frequency Plant Regeneration from Leaf Derived Callus of Dianthus caryophyllus L.”. American Journal of Plant Science, 5:2454-2463.

Carlile W.R, 2008. The Use of Composted Materials in Growing Media. Proc. IS on Growing Media. Acta-Hort., 77:321-328.

Sharaf A.I, El-Naggar A.H, 2003. Response of carna-tion plant to phosphorus and boron foliarfertiliza-tion under greenhouse conditions. Alex. J. Agric. Res. 48 (1):147-158.

Yasmeen S, Younis A, Rayit A, Riaz A, Shabeer S, 2012. Effect of Different Substrates on Growth and Flowering of Dianthus caryophyllus cv. ‘Chauband Mixed’. American-Eurasian J. Agric. & Environ. Sci.12 (2):249-258.

Improvement of multiplication, growing and caring procedures for commercial carnations in Bac Ha, Lao Cai Province

La Viet Hong, La Thi Hanh, Ngo Tuyet Dung, Bui Van Thang

Abstract This study aimed to improve multiplication, growing and caring technical measures for some commercial carnations (Breezer, Cerise rosy barbara, Regatta, Plantom, and Red barbara). The sterilized flower stalk cuttings were used for in vitro culture. MS Medium with 3% saccharose, 0.7% agar add 0.1 mg/l BAP was suitable for regeneration and multiplication in vitro shoots. In this medium, vitrification shoot ratio showed relavitively low. Medium MS with 0% saccharose, 0.7% agar supplemented 0,1 mg/l NAA was favorable for rooting in vitro mircoshoots. The solution of N3M preparation (20 g/l) were suitable for rooting sprayed ex vitro shoots. The distance of planting was 25 x 30 (cm) or 30 x 35 (cm); 30 kg/360 m2 of biodegradable organic fertilizer (Song Gianh) was applied as basal fertilizer and supplemented NPK (13 : 13 :13, Binh Dien) (20 - 30 kg/360 m2) once a week. Application of foliar nutrients by spraying Atonik 1.8 DD (0.5 mg/l) preparation increased growth and flower yield.Key words: Bac Ha, carnation, commercial, Dianthus caryophyllus, production, propagation

Ngày nhận bài: 2/6/2017Người phản biện: TS. Đinh Thị Dinh


91


I. ĐẶT VẤN ĐỀLúa cạn chủ yếu là các giống lúa địa phương, được

bà con miền núi trồng trong điều kiện khó khăn về nguồn nước, nơi mà các giống lúa lai năng suất cao khó có thể sinh trưởng phát triển được. Tuy nhiên, hiện nay năng suất lúa cạn không cao, trung bình chỉ đạt từ 1 - 1,5 tấn/ha tùy khu vực. Điều này làm cho sản lượng lúa cạn rất thấp, chỉ góp khoảng 4% tổng sản lượng toàn thế giới (Maclean et al., 2013). Nguyên nhân của vấn đề này là lúa cạn được trồng hoàn toàn phụ thuộc vào nước trời, đất đai nghèo dinh dưỡng, không được đầu tư về phân bón, bảo vệ thực vật và phòng trừ cỏ dại, dẫn đến năng suất không cao (Oghalo, 2011).

Hà Giang là một trong các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam có 9/11 huyện gieo trồng lúa cạn (Niên giám thống kê tỉnh Hà Giang năm 2016). Bên cạnh một số giống lúa tẻ như lúa nương, lúa tẻ Già Dui…, một số giống lúa nếp cạn cũng được trồng phổ biến là các giống Khẩu Vai, Khẩu Nua Đeng, Khẩu Nua Trạng, Khẩu Nua Cồ, Lổng Râu, Đổng Đẹo Bụt, Nếp Nương… Giống nếp cạn Khẩu Nua Trạng (Khảu Nua Trạng) được thu thập tại hai xã Trung Thành và xã Đạo Đức huyện Vị Xuyên tỉnh Hà Giang. Giống có đặc điểm thân đứng, cao, bông to, vỏ trấu tím có sọc tím, hạt to, bán thon (KL1000 hạt cao 33 - 35 gam), gạo dẻo, có vị đậm thơm nhẹ. Đây là giống thuần của địa phương có khả năng chịu hạn và chống chịu sâu bệnh tốt. Tuy nhiên, cũng như các giống lúa cạn khác tại vùng năng suất giống không cao nguyên nhân là do thiếu đạm và thiếu lân là hai yếu tố chính làm giảm năng suất (Fageria et al., 2010; Franzini et al., 2013). Mặc dù đã có nhiều công trình nghiên cứu phân bón, tuy nhiên trong điều kiện đất cạn, có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến việc sử dụng đạm của cây. Do đó nghiên cứu bón phân cho lúa cạn như thế nào cho hiệu quả vẫn đang là vấn đề cần được nhiều nhà khoa học quan tâm. Trước thực trạng đó việc thực hiện “Nghiên cứu phương thức bón phân và khoảng cách gieo hạt trong canh tác đối với giống lúa nếp cạn Khẩu Nua Trạng tại Hà Giang” là một yêu cầu hết sức cần thiết trong canh tác.


2.1. Vật liệu nghiên cứu- Giống lúa nếp cạn Khẩu Nua Trạng được thu

thập tại hai xã Trung Thành và xã Đạo Đức thuộc huyện Vị Xuyên, tỉnh Hà Giang.

- Phân viên nén nhả chậm do Công ty cổ phần Phát triển Phân bón Nông nghiệp I, nhãn hiệu Lục thần nông sản xuất, thành phần đạm (N2O) 10%; Lân

(P2O5) 10%; Kali (K2O) 7,5%, bổ sung các nguyên tố dinh dưỡng trung và vi lượng dạng vết (phần triệu), trọng lượng viên phân nén 0,8 gam.

- Phân đạm Urê Phú Mỹ có hàm lượng ni tơ là 46,3%; Phân supe lân Lâm Thao có hàm lượng phốt pho là 16,5%; Phân kaliclorua có hàm lượng kali là 60%. Phân vi sinh vi sinh Sông Gianh dùng bón lót có thành phần độ ẩm 30%, hữu cơ: 15%, P2O5: 1,5%, Acid Humic: 2,5%, trung lượng: Ca, Mg, S, các chủng vi sinh vật hữu ích: 3 ˟ 106 CFU/g.


2.2.1. Phương pháp bố trí thí nghiệmTiến hành bố trí thí nghiệm 2 nhân tố (phương

thức bón phân và khoảng cách gieo hạt) tại Trung tâm Khoa học kỹ thuật Giống cây trồng Đạo Đức thuộc xã Đạo Đức, huyện Vị Xuyên, tỉnh Hà Giang. Thí nghiệm gồm 9 công thức, là tổ hợp của 3 phương thức bón phân và 3 khoảng cách gieo hạt với 3 lần nhắc lại được bố trí theo kiểu ô chính ô phụ. Nhân tố phương thức phân bón (P) được bố trí vào ô chính và yếu tố khoảng cách gieo hạt (A) được bố trí vào ô phụ. Phương thức bón gồm 3 mức là: P1 (NPK rời vãi trên mặt luống theo truyền thống); P2 (phân NPK rời bón theo rạch hàng sâu 6 - 8 cm); P3 (phân NPK được nén thành viên bón vùi sâu). Khoảng cách hàng gieo gồm 3 mức A1 (mật độ 30 khóm/m2, khoảng cách 17 ˟ 20 ˟ 20 cm); A2 (mật độ 30 khóm/m2, khoảng cách 17 ˟ 30 ˟ 10 cm); A3 (mật độ 30 khóm/m2, khoảng cách 13 ˟ 40 ˟ 10 cm). Diện tích một ô thí nghiệm là 10m2 (5 m ˟ 2 m). Rạch hàng gieo hạt theo hốc, gieo 3 - 4 hạt/ hốc sau đó tỉa định cây khi được 2 - 3 lá thật chỉ để lại 1 cây/ hốc.

2.2.2. Biện pháp kỹ thuật- Liều lượng phân bón cho1 ha: 1 tấn phân hữu

cơ vi sinh + 60 kg N + 60 Kg P2O5 + 45 kg K2O + 300 kg vôi bột. Công thức được kế thừa từ thí nghiệm nghiên cứu tổ hợp mật độ và phân bón đối với giống lúa nếp cạn Khẩu Nua Trạng tại Hà Giang năm 2015 (Hoàng Thị Bích Thảo và cs., 2015).

- Cách bón:+ Phân bón nền: Bón lót toàn bộ phân hữu cơ vi

sinh, vôi, lân trước khi trồng.+ P1 (NPK rời vãi trên mặt luống theo truyền

thống): Bón thúc lần 1 sau khi lúa mọc 15 - 20 ngày, 60% đạm urê và 40% kali clorua. Bón thúc lần 2 sau khi lúa mọc 50 - 60 ngày, 40% đạm urê, 40% kali clorua.

+ P2 (phân NPK rời bón theo rạch hàng sâu 6 - 8 cm): Bón thúc lần 1 sau khi lúa mọc 15 - 20 ngày,

92


60% đạm urê và 40% kali clorua. Bón thúc lần 2 sau khi lúa mọc 50 - 60 ngày, 40% đạm urê, 40% kali clorua.

+ P3 (phân NPK được nén thành viên bón vùi sâu): Toàn bộ lượng phân viên nén được bón khi gieo hạt, rạch hàng cách gốc 5 - 7 cm, sâu 6 - 8 cm, lượng bón 600 kg phân viên nén bón cho 1 ha.

- Thời vụ: Gieo hạt vào 15/6/2016.- Phòng trừ sâu bệnh: Theo dõi sâu bệnh, tiến

hành phòng trừ khi cần thiết.

2.2.3. Các chỉ tiêu theo dõiCác chỉ tiêu và phương pháp theo dõi được áp

dụng theo QCVN 01-55: 2011/BNN&PTNT của Bộ Nông nghiệp và PTNT.

2.3. Phương pháp xử lý số liệuSố liệu của các lần nhắc lại là trung bình của các

số liệu thu được từ các cây theo dõi ô thí nghiệm. Các số liệu khi tính toán được xử lý trên Excel và phần mềm SAS 9.1.3.

2.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứuThí nghiệm được tiến hành tại xã Đạo Đức,

huyện Vị Xuyên, tỉnh Hà Giang trong vụ Mùa năm 2016 (tháng 6 năm 2016).


3.1. Ảnh hưởng của phương thức bón phân và khoảng cách gieo hạt đến một số chỉ tiêu sinh trưởng phát triển

Kết quả ở bảng 1 cho thấy khi đánh giá ảnh hưởng của yếu tố khoảng cách gieo hạt (trung bình qua các phương thức bón phân), có thể thấy khoảng cách gieo hạt ảnh hưởng có ý nghĩa đến chỉ tiêu chiều dài bông, nhánh hữu hiệu (P<0,05). Chiều dài bông ở khoảng cách A1 tương đương với chiều dài bông khi gieo ở khoảng cách A2 và ở hai khoảng cách gieo hạt này chiều dài bông dài hơn so với khoảng cách gieo hạt A3. Nhận xét kết quả phân tích chỉ tiêu số nhánh hữu hiệu của giống chúng tôi cũng nhận thấy tại khoảng cách gieo hạt A1và A2 số nhánh hữu hiệu đạt tương đương nhau và nhiều nhánh hữu hiệu hơn ở khoảng cách A3. Như vậy giống đã tự điều chỉnh quần thể rất tốt khi thay đổi khoảng cách gieo hạt, không nên bố trí gieo hạt ở khoảng cách A3 sẽ ảnh hưởng không tốt chiều dài bông, số nhánh hữu hiệu vì các cá thể trong quần thể bị cạnh tranh mạnh về ánh sáng và dinh dưỡng.

Đánh giá ảnh hưởng của các phương thức bón phân (trung bình qua các khoảng cách hàng gieo) thấy rằng các phương thức bón phân ảnh hưởng mạnh mẽ đến các chỉ tiêu sinh trưởng chiều dài

bông, nhánh hữu hiệu của giống (P<0,05). Ở các chỉ tiêu theo dõi sinh trưởng của giống khi bón vãi phân trên mặt đất luôn cho chiều dài bông, nhánh hữu hiệu thấp hơn so với hai công thức bón phân rời và phân viên nén chậm tan vùi sâu vào đất 6 - 8cm. Cụ thể bón vãi phân trên mặt đất chiều dài bông giảm 15,7% so với bón phân rời vùi sâu và phân viên nén chậm tan; số nhánh hữu hiệu cũng giảm 16,4% so với bón phân rời vùi sâu và 12,1% so với bón phân viên nén chậm tan. Như vậy việc bón phân vãi trên bề mặt đất đã làm giảm các chỉ tiêu sinh trưởng của giống về chiều dài bông, số nhánh hữu hiệu. Nguyên nhân là do bón vãi phân trên bề mặt đã làm cho phân bón bị rửa trôi và bay hơi ảnh hưởng trực tiếp đến việc hấp thu dinh dưỡng của cây.

Bảng 1 cũng cho thấy giữa khoảng cách gieo hạt và phương thức bón phân không ảnh hưởng tương tác lẫn nhau lên các chỉ tiêu chiều dài bông, số nhánh hữu hiệu (P>0,05).

Bảng 1. Ảnh hưởng của phương thức bón phân và khoảng cách gieo hạt đến một số chỉ tiêu

sinh trưởng phát triển

Ghi chú: Bảng 1, 3: Trong cùng một cột, các công thức có kí tự giống nhau không sai khác ở mức tin cậy 95%; P1 (NPK rời vãi trên mặt luống theo truyền thống); P2 (phân NPK rời bón theo rạch hàng sâu 6 - 8 cm); P3 (phân NPK được nén thành viên bón vùi sâu). A1 (mật độ 30 khóm/m2, khoảng cách 17 ˟ 20 ˟ 20 cm); A2 (mật độ 30 khóm/m2, khoảng cách 17 ˟ 30 ˟ 10 cm); A3 (mật độ 30 khóm/m2, khoảng cách 13 ˟ 40 ˟ 10 cm).

Chỉ tiêu Phân bón

Khoảng cách

A1 A2 A3Trung bình

Chiều dài bông

(cm)

P1 26,1 25,9 22,2 24,7b

P2 30,1 29,9 28,1 29,3a

P3 29,8 30,2 27,9 29,3a

Trung bình 28,7a 28,6a 26,0b

P(A) <0,05P(P) <0,05

P(A*P) >0,05

Số nhánh hữu hiệu(dảnh)

P1 5,2c 5,1c 4,9c 5,1b

P2 6,6a 6,3a 5,5ab 6,1a

P3 6,1ab 6,5a 4,9c 5,8a


P(A) <0,05P(P) <0,05

P(A*P) <0,05

93


3.2. Ảnh hưởng của phương thức bón phân và khoảng cách gieo hạt đến khả năng chống chịu sâu bệnh hại

Kết quả bảng 2 cho thấy gieo hạt ở khoảng cách A3 kết hợp bón vãi phân trên bề mặt đất làm cho mức độ hại của một số sâu bệnh có xu hướng tăng như sâu đục thân, bệnh đạo ôn, bệnh khô vằn, bệnh bạc lá so với khoảng cách A1 và A2 kết hợp với bón phân NPK rời vùi sâu trong đất và phân viên nén chậm tan. Riêng bệnh bạc lá tại tổ hợp A3P1 diện tích vết bệnh nằm trong khoảng ranh giới giữa hai điểm 1 - 3, tuy nhiên nghiêng về điểm 3 vì khoảng cách gieo hạt không hợp lý kết hợp với bón vãi phân trên bề mặt làm cho mức độ bị nhiễm bệnh cao hơn so với các tổ hợp còn lại.

Bảng 2. Ảnh hưởng của phương thức bón phân và khoảng cách gieo hạt đến khả năng

chống chịu sâu bệnh của giống

3.3. Ảnh hưởng của phương thức bón phân và khoảng cách gieo hạt đến các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của giống

Đánh giá ảnh hưởng của các phương thức bón phân (trung bình qua các khoảng cách hàng gieo) thấy rằng các phương thức bón phân ảnh hưởng mạnh mẽ đến các chỉ tiêu cấu thành năng suất của giống (P<0,05) (Bảng 3).

Chỉ tiêu số hạt chắc/bông tại công thức bón phân rời vùi sâu và phân viên nén chậm tan cho số hạt chắc/bông tăng 16,6 - 16,8% so với công thức vãi phân trên bề mặt. Kết quả cũng được ghi nhận đối

với chỉ tiêu năng suất lý thuyết và năng suất thực thu. Tại công thức bón phân rời vùi sâu và phân viên nén chậm trong đất làm tăng năng suất lý thuyết lên 28,3% và 31,7% so với bón phân vãi trên bề mặt, năng suất thực thu tăng lên 28,2% và 29,3% so với bón vãi phân trên bề mặt. Điều này cho thấy cùng một lượng phân bón sử dụng cho các ô thí nghiệm trên cùng một giống và cùng một biện pháp kỹ thuật canh tác, nhưng phương thức bón phân khác nhau thì hiệu quả phân bón ảnh hưởng rất khác nhau tới các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của giống. Do vậy việc lựa chọn ra phương thức bón phân phù hợp, nâng cao hiệu quả sử dụng phân bón, tiết kiệm chi phí và công lao động là rất quan trọng.

Bảng 3. Ảnh hưởng của phương thức bón phân và khoảng cách gieo hạt đến các yếu tố

cấu thành năng suất và năng suất của giống

Chỉ tiêu Phân bónKhoảng cách

A1 A2 A3

Sâu đục thân(điểm)

P1 5 5 5P2 1 1 1P3 1 1 3

Rầy nâu(điểm)

P1 1 1 1P2 1 1 1P3 1 1 1

Bệnh đạo ôn(điểm)

P1 1 1 2P2 1 1 1P3 1 1 2

Bệnh bạc lá(điểm)

P1 1 1 1-3P2 1 1 1P3 1 1 1

Bệnh khô vằn(điểm)

P1 1 1 3P2 1 1 1P3 1 1 1

Chỉ tiêu Phân bón Khoảng cách

A1 A2 A3Trung bình

Hạt chắc/bông (hạt)

P1 75,9 73,5 69,6 73,0b

P2 88,1 88,8 85,8 87,5a

P3 89,9 89,6 83,6 87,7a

Trung bình 84,6 83,9 79,7

P(A) >0,05P(P) <0,05

P(A*P) >0,05NSLT (tạ/ha) P1 39,0 37,9 34,2 37,0b

P2 58,6 56,9 47,1 54,2a

P3 55,0 58,9 41,0 51,6a


P(A) <0,05P(P) <0,05

P(A*P) >0,05NSTT (tạ/ha) P1 29,2 28,3 25,1 27,5b

P2 39,3 39,0 36,9 38,3a

P3 39,9 39,2 35,9 38,9a


P(A) <0,05P(P) <0,05

P(A*P) >0,05

94


Đánh giá ảnh hưởng của khoảng cách hàng gieo (thông qua các phương thức bón phân) chúng tôi có một số nhận định. Khoảng cách hàng gieo ảnh hưởng đến các yếu tố cấu thành năng suất (P < 0,05). Các chỉ tiêu về năng suất thực thu và năng suất lý thuyết tại khoảng cách A1 và A2 cũng luôn cho kết quả cao hơn tại khoảng cách gieo hạt A3. Cụ thể NSLT ở khoảng cách A1 và khoảng cách A2 cao hơn so với khoảng cách A3 là 20,1% và 25,8%. NSTT khi gieo với khoảng cách A1 và với khoảng cách A2 cũng cao hơn NSTT ở công thức A3 là 9,7% và 8,2%. Như vậy gieo hạt ở khoảng cách A1 và A2 tạo điều kiện cho giống sinh trưởng đầy đủ ánh sáng và không bị tranh chấp dinh dưỡng giữa các cá thể với nhau nên cho NSLT và NSTT cao. Khi đánh giá tổ hợp khoảng cách hàng gieo và các phương thức bón phân cho thấy không có sự tương tác giữa phương thức bón phân và khoảng cách hàng gieo (P(A*P)>0,05) ở các chỉ tiêu năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất.

Như vậy việc bón phân rời và phân nén vùi sâu trong đất đã làm tăng NSTT của giống. Kết luận trên phù hợp với nghiên cứu của Raj et al. (2014) khi cho rằng năng suất lúa cạn tăng khi sử dụng phân viên nén ure vùi sâu trong đất so với việc vãi phân đạm thông thường trên bề mặt.

IV. KẾT LUẬNCác tổ hợp A1P2 (mật độ 30 khóm/m2, 17 ˟ 2 ˟ 20

cm kết hợp với phương thức bón phân rời vùi sâu);

A2P2 (mật độ 30 khóm/m2, 17 ˟ 30 ˟ 10 cm kết hợp với phương thức bón phân rời vùi sâu); A1P3 (mật độ 30 khóm/m2, 17 ˟ 20 ˟ 20 cm kết hợp với phương thức bón phân viên nén chậm tan); A2P3 (mật độ 30 khóm/m2, 17 ˟ 30 ˟ 10 cm kết hợp với phương thức bón phân viên nén chậm tan) là những tổ hợp cho NSLT và NSTT của giống lúa Khẩu Nua Trạng cao nhất.

TÀI LIỆU THAM KHẢOHoàng Thị Bích Thảo, Trần Văn Điền, Đào Thị Thu

Hương, 2015. Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật canh tác đối với giống lúa nếp cạn đặc sản Khẩu Nua Trạng tại Hà Giang. Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 23:52-58.

Fageria, N& Gilkes, R., 2010. Root growth of upland rice genotypes as influenced by nitrogen fertilization. Soil Solutions for a Changing World, Australia, 11:120-122.

Maclean J., Hardy B., and Hettel G, 2013, Rice Almanac: Source Book for one of the Most Important Economic Activities on Earth, IRRI.

Oghalo S.O, 2011. Effect of Population Density on the Performance of Upland Rice (Oryza Sativa) in a Forest-Savanna Transition Zone. International Journal of Sustainable Agriculture , 3 (2):44-48.

Raj, S., Bindhu, J. &Girijadevi, L, 2014. Nitrogen availability and uptake as influenced by time of application and N sources in semi-dry rice (Oryza sativa). Journal of Crop and Weed, (10), pp 295-302.

Research on the combination of fertilizing method and sowing distance in cultivation of upland rice variety Khau Nua Trang in Ha Giang province

Dao Thi Thu Huong, Tran Van Dien, Duong Thi NguyenAbstractThe research was conducted to determine the effective combination of fertilizing method and sowing distance in cultivation of upland rice variety Khau Nua Trang on non-irrigated areas in Dao Duc commune, Vi Xuyen district, Ha Giang province. The experiments were designed by combining of 3 fertilizing treatments (P1, P2 and P3) with 3 sowing distances (A1, A2, and A3). Where P1, P2 and P3 were fertilizers scattered on beds, fertilizers applied on furrows (6 - 8 cm in depth) and slowly realeased fertilizers buried in depth, respectively. A1, A2, A3 were sown with density and distances of (30 hills/m2, 17 ˟ 20 ˟ 20 cm), (30 hills/m2, 17 ˟ 30 ˟ 10 cm) and (30 hills/m2, 13 ˟ 40 ˟ 10 cm), respectively (all the distances are measured in cm). The amount of neutral microbial organic fertilizer applied was 1 ton with inorganic fertilizer of 60 N (kg) + 60 P2O5 (kg) + 45 K2O (kg) + 300 CaCO3 (kg) (in powder) per hectare. The results showed that the most effective combinations were A1P2, A2P2, A1P3 and A2P3 and these combinations had the highest both theoritical and actual yield .Key words: Upland rice, Khau Nua Trang, fertilizer, distance, growth, yield



95


I. ĐẶT VẤN ĐỀTrong canh tác lúa cạn, cỏ dại được xếp vào

nguyên nhân rất quan trọng làm giảm năng suất lúa và hiệu quả kinh tế. Cỏ dại phát triển làm giảm quá trình quang hợp, ảnh hưởng mạnh đến năng suất thực thu, hiệu quả kinh tế thấp do chi phí công lao động cao... (Gupta và Toole, 1986). Tại Nigeria, các nghiên cứu đánh giá đều cho rằng cỏ dại chính là nguyên nhân cơ bản làm cho năng suất và chất lượng lúa cạn giảm (Ukungwu và Abo, 2004). Tại Trung Quốc, theo các báo cáo đưa ra hàng năm có hơn 10 triệu tấn lúa bị mất đi do sự tranh chấp của cỏ dại, số lượng lúa gạo này đủ để cung cấp nguồn lương thực ít nhất 56 triệu người trong một năm (Zhang và Ze pu, 2001). Tác hại của cỏ dại tại các nương lúa cạn vô cùng lớn, tuy nhiên trên thế giới và Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về vấn đề này. Để đáp ứng được yêu cầu thực tiễn chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu các phương thức phòng trừ cỏ dại trên nương trồng giống lúa nếp cạn Khẩu Nua Trạng tại Hà Giang.


2.1. Vật liệu nghiên cứu- Giống lúa nếp cạn Khẩu Nua Trạng nguồn gốc

phổ biến tại xã Trung Thành và xã Đạo Đức, huyện Vị Xuyên, tỉnh Hà Giang.

- Thuốc trừ cỏ không chọn lọc, hậu nảy mầm (Pre-emergency): Lyphoxim 41 SL hoạt chất Glyphosate isopropylamine salt 480gr/l của công ty Bảo vệ thực vật Sài Gòn.

- Thuốc trừ cỏ tiền nẩy mầm và hậu nẩy mầm sớm (Post - emergency): Mizin 80WP gồm có hoạt chất Atrazine 80% và chất phụ gia 20%.


2.2.1. Phương pháp bố trí thí nghiệmThí nghiệm gồm 5 công thức (CT) trừ cỏ: CT1:

Làm cỏ bằng tay sau gieo 25 ngày (đối chứng); CT2: Làm cỏ bằng tay sau gieo 25 ngày và 45 ngày; CT3: Xử lý cỏ trước gieo 15 ngày bằng Lyphoxim và làm cỏ bằng tay sau 45 ngày gieo; CT4: Xử lý cỏ sau gieo bằng Mizin 80WP khi cỏ mọc được 1 - 3 lá; CT5: Làm cỏ bằng tay sau gieo 25 ngày + Phun Mizin 80WP sau khi cỏ mọc lại được 1 - 3 lá.

Ghi chú: Thuốc trừ cỏ Lyphoxim 41 SL được pha 4 lít thuốc trong 500 lít nước để sử dụng cho 1 ha, phun 6 bình cho 1000 m2. Thuốc trừ cỏ Mizin 80WP được pha 30 - 35 g/bình 8 lít nước, phun 6 bình/1000 m2.

Các ô thí nghiệm được gieo và thực hiện bón phân trong cùng 1 ngày. Diện tích ô thí nghiệm là 30 m2 (5 m ˟ 6 m). Giữa các ô thí nghiệm có dải phân cách là 1m. Xung quanh khu thí nghiệm bố trí dải bảo vệ có chiều rộng 1m. Thí nghiệm một nhân tố được bố trí kiểu khối ngẫu nhiên hoàn toàn (RCBD) với 5 phương thức trừ cỏ và ba lần nhắc lại.

2.2.2. Các chỉ tiêu theo dõiCác chỉ tiêu theo dõi theo Quy chuẩn 01-

145:2013/BNNPTNT khảo nghiệm trên đồng ruộng hiệu lực của các thuốc trừ cỏ và 10 TCN 285:1997 - Quy phạm khảo nghiệm hiệu lực của thuốc trừ cỏ hại trên cây trồng cạn dài ngày.

- Điều tra thành phần của các loài cỏ thuộc nhóm cỏ chính trên khu khảo nghiệm: bằng kinh nghiệm, hình thái cỏ dại, so sánh tranh ảnh cỏ, tài liệu phân loại, liệt kê các loài cỏ có trên khu thí nghiệm.

- Mức độ phổ biến: Trên mỗi ô chọn 5 điểm ngẫu nhiên, mỗi điểm là 1 khung có kích thước 0,5 ˟ 0,4 m.

1 Trường Cao ĐẳngKinh tế - Kỹ thuật Thái Nguyên2 Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

NGHIÊN CỨU CÁC PHƯƠNG THỨC PHÒNG TRỪ CỎ DẠI TRONG CANH TÁC GIỐNG LÚA NẾP CẠN KHẨU NUA TRẠNG TẠI TỈNH HÀ GIANG

Đào Thị Thu Hương1, Trần Văn Điền2, Dương Thị Nguyên2

TÓM TẮTNghiên cứu được tiến hành nhằm xác định phương thức phòng trừ cỏ dại có hiệu quả nhất trong canh tác giống

lúa nếp cạn Khẩu Nua Trạng gieo trồng trên đất nương rẫy tại xã Đạo Đức, huyện Vị Xuyên, tỉnh Hà Giang. Thí nghiệm được bố trí với 5 công thức trừ cỏ và 3 lần nhắc lại. Kết quả thí nghiệm cho thấy CT5 (Làm cỏ bằng tay sau gieo 25 ngày + Phun Mizin 80WP sau khi cỏ mọc lại được 1 -3 lá); CT2 (làm cỏ tay sau gieo 25 ngày và 45 ngày); CT3 (Xử lý cỏ trước gieo 15 ngày bằng Lyphoxim và làm cỏ bằng tay sau gieo 45 ngày) là những công thức có hiệu quả trừ cỏ tốt. Tại CT5 năng suất giống Khẩu Nua Trạng đạt 39,9 tạ/ha; CT2 năng suất giống đạt 39,1 tạ/ha; CT3 năng suất giống đạt 38,9 tạ/ha, CT 4 (xử lý cỏ sau gieo bằng Mizin 80WP khi cỏ mọc được 1-3 lá) năng suất đạt 36,8 tạ/ha, CT1 (làm cỏ bằng tay sau gieo 25 ngày) có năng suất đạt thấp nhất 32,6 tạ/ha.

Từ khóa: Lúa nếp cạn, Khẩu Nua Trạng, phòng trừ cỏ dại

96


Đếm số cây cỏ và chia thành 3 mức: Rất phổ biến: +++ Loại cỏ đó chiếm > 70% trong tổng số cây cỏ; Phổ biến: ++ Loại cỏ đó chiếm từ 10 - 70% trong tổng số cây cỏ; Ít phổ biến (hiếm): + Loại cỏ đó chiếm < 10% trong tổng số cây cỏ.

Ngoài ra cần quan sát trên cả khu thí nghiệm, nếu có thêm loại cỏ nào mới cần bổ sung vào thành phần cỏ cho đầy đủ. Điều tra 1 ngày trước khi xử lý thuốc.

- Khối lượng cỏ tươi (gam/m2): Mỗi ô công thức điều tra 5 điểm đối, mỗi điểm dùng khung kích thước 0,4 m ˟ 0,5 m, nhổ toàn bộ số cỏ có trong khung, rũ sạch đất, thả các mẫu cỏ vào nước ngâm 1h cho cỏ tươi lại, vớt ra vẩy cho hết nước phân theo nhóm rồi đem cân. Theo dõi 30 ngày sau khi xử lý thuốc.

- Đánh giá tác động của thuốc đối với cây trồng thí nghiệm: Cần quan sát mọi ảnh hưởng tốt, xấu của thuốc (nếu có) đến cây trồng. Phương pháp điều tra các chỉ tiêu này theo đúng quy chuẩn quốc gia về khảo nghiệm giá trị canh tác và sử dụng của giống lúa QCVN 01-55: 2011/BNNPTNT. Các chỉ tiêu có thể đánh giá bằng mắt như độ cháy lá, sự thay đổi màu sắc lá… được đánh giá theo phân cấp mức độ độc của thuốc khảo nghiệm đối với cây trồng. Mọi triệu chứng gây hại hoặc kích thích của thuốc đối với cây được mô tả mộ cách đầy đủ và tỉ mỉ.

2.3. Phương pháp xử lý số liệuCác số liệu thống kê được xử lý theo phương

pháp thống kê sinh học được tính toán bằng phần mềm Excel và phần mềm SAS 9.1.

2.4. Thời gian, địa điểm nghiên cứuThí nghiệm được thực hiện tại xã Đạo Đức,

huyện Vị Xuyên, tỉnh Hà Giang (22044’04’’B, 104058’21’’Đ) trong vụ Mùa 2016 (từ tháng 6 đến tháng 11 năm 2016).


3.1. Thành phần và mức độ xuất hiện của các loài cỏ dại trên khu đất trồng lúa nếp cạn thí nghiệm

Thành phần cỏ dại chính được điều tra tại khu thí nghiệm về lúa cạn đều là các loài nằm trong mục các loài cỏ dại đối với cây trồng cạn thuộc họ lá rộng, họ hoà thảo cỏ năn lác. Bảng 1 cho thấy mức độ xuất hiện của các loại cỏ như vừng ráp, vừng đất, trinh nữ, cỏ gấu ở mức độ vừa phải (loài chiếm >70%), tiếp theo là các loại cỏ xuất hiện ở mức độ trung bình như cỏ mần trầu, cỏ chân nhện, cỏ bông lau, cỏ gừng bò, cỏ lông công, có lác xoà, cỏ cứt lợn (loài chiếm 50 - 60%), xuất hiện ở mức độ thấp là các loài cỏ giày, cỏ tranh, thài lài, rau dệu, dền cơm, rau sam (loài chiếm <10%). Kết quả điều tra trên phù hợp với Nguyễn Thị Tân và ctv. (2000) khi nghiên cứu về thành phần cỏ dại trên đất trồng lúa cạn có tới 35 loài và đều thuộc vào các loài cỏ lá rộng, cỏ năn lắc, cỏ thuộc họ hoà thảo.

Bảng 1. Thành phần và mức độ xuất hiện của các loài cỏ dại trên khu đất trồng lúa nếp cạn thí nghiệm

Ghi chú: + Mức độ thấp; ++ Mức độ trung bình; +++ Mức độ vừa phải

STT Tên Việt Nam Tên Khoa học Họ thực vậtMức độ xuất hiện trên khu đất trồng

lúa nếp cạn1 Cỏ mần trầu Elusine indica (L.) Gaertn Poaceae ++2 Cỏ chân nhện Dighitaria timorensis Pest Miq Poaceae ++3 Cỏ giầy Rotboallia compressa Linn.f. Poaceae +4 Cỏ bông lau Saccharum spontaneum L. Poaceae ++5 Cỏ mía Saccharum officianarum L. Poaceae +6 Cỏ gừng bò Panicumrepens Linn Poaceae ++7 Cỏ lông công Sparobolus elonggatusR. Br Poaceae ++8 Cỏ tranh Imperata cyfindrica(L) Beauv Poaceae +9 Cỏ gấu Cyperus rontundus Linn Cyperaceae +++

10 Cỏ lác xoà Cyperus serotinus Rott Cyperaceae ++11 Vừng ráp Leucas aspera (Wirld) Link Lamiaceae +++12 Vừng đất Leucas zeylanica (Wirld) Link Lamiaceae +++13 Cứt lợn Agaratum conyjoides L. Astaraceae ++14 Thài lài Cyanotisaxillaris (L) Roemat Schult Commalinaceae +

15 Rau dệu Altemathera sessilis (L) R. Br.ex Roem&Schult Amaranthaceae +

16 Dền cơm Amranthus viridis L. Amaranthaceae +17 Cây trinh nữ Mimosa invisa Mart Mimosaceae +++18 Rau sam Portulacacleraceae L. Portulacaceae +

97


3.2. Khối lượng cỏ tươi (g/m2) sau khi tiến hành thực hiện các phương thức phòng trừ cỏ dại trên giống lúa nếp cạn Khẩu Nua Trạng

Kết quả phân tích thống kê cho thấy các công thức có hiệu lực trừ cỏ dại sai khác nhau có ý nghĩa (P<0,01). Biện pháp làm cỏ bằng tay sau gieo 25 ngày (CT1) có hiệu lực phòng trừ cỏ dại thấp nhất, tiếp theo là công thức phun Mizin 80WP khi cỏ mọc được 1 - 3 lá (CT4). Các công thức trừ cỏ còn lại là công thức làm cỏ bằng tay sau gieo 25 ngày và 45 ngày (CT2); công thức xử lý cỏ trước gieo 15 ngày

bằng thuốc Lyphoxim 41SL kết hợp làm cỏ tay sau gieo 45 ngày (CT3); công thức làm cỏ tay sau gieo 25 ngày và phun Mizin 80WP khi cỏ mọc lại được 1 - 3 lá (CT5) là những công thức có hiệu lực trừ cỏ tương đương nhau và tốt hơn so với hai công thức 1 và 4. Kết quả trên cũng được ghi nhận bởi Ismaila U et al. (2011) nghiên cứu hiệu lực của các công thức trừ cỏ cho lúa cạn tại Badeggi, Nigeria đã nhận xét việc kết hợp công thức làm cỏ bằng tay sau gieo 25 ngày và kết hợp phun thuốc thảo dược Orizo plus cho hiệu quả phòng trừ cỏ dại tốt.

Bảng 2. Khối lượng cỏ (g/m2) sau khi tiến hành thực hiện các biện pháp xử lý cỏ dại đối với giống lúa nếp cạn Khẩu Nua Trạng

Đơn vị tính: g/m2

Bảng 2, 3, 4: Ghi chú: Trong cùng một cột, các công thức có kí tự giống nhau không sai khác ở mức tin cậy 95%, P: Mức sác xuất.

Bảng 3. Ảnh hưởng của các phương thức trừ cỏ đến một số chỉ tiêu sinh trưởng và phát triển của giống lúa nếp cạn thí nghiệm

Ghi chú: Cấp 1: Cây sinh trưởng bình thường.

Công thức Khối lượng cỏ (g/m2)

Hiệu quả (%)

CT1: Làm cỏ bằng tay sau gieo 25 ngày (đối chứng) 112,2a -CT2: Làm cỏ tay sau gieo 25 ngày và 45 ngày 32,9c 70,7CT3: Xử lý cỏ trước gieo 15 ngày bằng Lyphoxim và làm cỏ bằng tay sau 45 ngày gieo 35,8c 68,1

CT4: Xử lý cỏ sau gieo bằng Mizin 80WP khi cỏ mọc được 1 - 3 lá 65,6b 41,5CT5: Làm cỏ bằng tay sau gieo 25 ngày + Phun Mizin 80WP sau khi cỏ mọc lại được 1 - 3 lá. 21,5c 80,8

P <0,01

3.3. Ảnh hưởng của các phương thức trừ cỏ đến một số chỉ tiêu sinh trưởng phát triển của giống lúa nếp cạn thí nghiệm

Kết quả bảng 3 cho thấy các phương thức trừ cỏ không ảnh hưởng đến tỷ lệ nẩy mầm, thời gian mọc và chiều cao cây của giống (P<0,05). Sau 8 ngày gieo hạt cây bắt đầu mọc mầm bình thường ở tất cả các

ô thí nghiệm, tỷ lệ nẩy mầm của giống đạt 87,9% - 89,2%, chiều cao cây dao động trong khoảng 126,2 - 127,6 cm. Theo dõi các triệu trứng nhiễm độc của cây tại các công thức có sử dụng thuốc trừ cỏ Lyphoxim và Mizin trước khi gieo hạt và sau khi gieo hạt cây sinh trưởng bình thường (cấp 1) không có biểu hiện bên ngoài như cháy lá, thay đổi màu sắc lá...

Chỉ tiêu theo dõi Công thức

Tỷ lệ nẩy mầm(%)

Thời gian mọc

(ngày)

Chiều cao cây

(cm)

Triệu chứng nhiễm độc

của cây (cấp)CT1: Làm cỏ bằng tay sau gieo 25 ngày (đối chứng) 89,2a 8a 126,2a -CT2: Làm cỏ tay sau gieo 25 ngày và 45 ngày 88,1a 8a 127,5a -CT3: Xử lý cỏ trước gieo 15 ngày bằng Lyphoxim và làm cỏ bằng tay sau 45 ngày gieo 87,9a 8a 126,9a 1

CT4: Xử lý cỏ sau gieo bằng Mizin 80WP khi cỏ mọc được 1 - 3 lá 88,5a 8a 127,1a 1

CT5: Làm cỏ bằng tay sau gieo 25 ngày + Phun Mizin 80WP sau khi cỏ mọc lại được 1 - 3 lá. 88,8a 8a 127,6a 1

P > 0,05 >0,05 > 0,05

98


3.4. Ảnh hưởng của các phương thức trừ cỏ đến số nhánh tối đa, số bông/ khóm, năng suất thực thu của giống lúa nếp cạn thí nghiệm

Các công thức xử lý cỏ khác nhau cho số nhánh tối đa khác nhau (P <0,01). Công thức xử lý cỏ trước gieo 15 ngày bằng Lyphoxim và làm cỏ bằng tay sau 45 ngày gieo cho số nhánh tối đa đạt cao nhất (10,9 nhánh/khóm), tiếp theo là công thức làm cỏ bằng tay sau gieo 25 ngày và 45 ngày và công thức làm

cỏ tay sau gieo 25 ngày và phun Mizin 80WP khi cỏ mọc lại được 1 - 3 lá. Thấp hơn nữa là công thức xử lý cỏ bằng Mizin 80WP khi cỏ mọc được 1 - 3 lá. Số nhánh tối đa đạt thấp nhất ở công thức xử lý cỏ bằng tay sau gieo 25 ngày (6,8 bông/khóm). Như vậy, ở các công thức có số nhánh tối đa cao đều là những công thức có hiệu lực trừ cỏ tốt vì tại các công thức trên giống ít bị tranh chấp dinh dưỡng và ánh sáng bởi cỏ dại.

Bảng 4. Ảnh hưởng của các phương thức trừ cỏ đến số nhánh tối đa, số bông/ khóm, năng suất thực thu của giống lúa nếp cạn thí nghiệm

Công thức thức làm cỏSố nhánh

tối đa(nhánh)

Số bông/khóm(bông)

NSTT(tạ/ha)

CT1: Làm cỏ bằng tay sau gieo 25 ngày (đối chứng) 6,8c 3,9b 32,6c

CT2: Làm cỏ tay sau gieo 25 ngày và 45 ngày 10,1ab 7,9a 39,1ab

CT3: Xử lý cỏ trước gieo 15 ngày bằng Lyphoxim và làm cỏ bằng tay sau 45 ngày gieo 10,9a 7,6a 38,9ab

CT4: Xử lý cỏ sau gieo bằng Mizin 80WP khi cỏ mọc được 1-3 lá 8,1abc 6,1ab 36,8b

CT5: Làm cỏ bằng tay sau gieo 25 ngày + Phun Mizin 80WP sau khi cỏ mọc lại được 1 - 3 lá. 10,2ab 8,1a 39,9a

P <0,01 <0,01 <0,01

Kết quả bảng 4 cho thấy số bông/khóm của giống bị biến động khi được xử lý cỏ bằng các biện pháp khác nhau (P <0,01). Công thức làm cỏ tay sau 25 ngày có số bông/khóm đạt thấp nhất (3,9 bông/khóm). Nguyên nhân là do sau gieo 25 ngày lúc này lúa cạn bắt đầu được 2 - 3 lá thật đây là thời điểm thích hợp để làm cỏ. Tuy nhiên sau khi làm cỏ xong cây lúa chưa khép tán do vậy cỏ dại vẫn bùng phát nếu không được xử lý kịp thời sẽ tranh chấp dinh dưỡng ánh sáng ảnh hưởng đến đẻ nhánh hữu hiệu của cây. Tiếp theo là công thức phun Mizin 80WP sau khi cỏ mọc được 1 - 3 lá có số bông/khóm đạt 6,1 bông/khóm. Nhóm các công thức làm cỏ tay sau gieo 25 ngày và 45 ngày; công thức xử lý cỏ trước gieo 15 ngày bằng Lyphoxim và làm cỏ bằng tay sau 45 ngày gieo; công thức làm cỏ bằng tay sau gieo 25 ngày và phun Mizin 80WP sau khi cỏ mọc lại được 1 - 3 lá đạt số bông/ khóm cao nhất (7,6 - 8,1 bông/khóm). Điều này được giải thích bởi các công thức trên đều là những công thức có hiệu lực trừ cỏ tốt.

Bảng 4 cũng cho thấy các công thức xử lý cỏ khác nhau ảnh hưởng rõ nét đến năng suất thực thu của giống lúa nếp cạn Khẩu Nua Trạng (P <0,01). Tại công thức làm cỏ tay sau 25 ngày năng suất thực thu đạt thấp nhất 28,6 tạ/ha. Điều này cho thấy đối với lúa cạn việc làm cỏ một lần sau gieo đã làm hạn chế rất lớn đến năng suất lúa. Nhận định trên cũng được Ukungwu et al. (2004) ghi nhận khi cho rằng cỏ

dại là một trong những nguyên nhân hàng đầu làm giảm năng suất của cây lúa cạn nếu chúng ta không phòng trừ chúng một cách triệt để. Công thức xử lý cỏ sau gieo bằng Mizin 80WP khi cỏ mọc được 1-3 lá cho năng suất lúa thực thu đạt 36,8 tạ/ha cao hơn đối chứng 12,9%. Năng suất thực thu của công thức xử lý cỏ trước gieo 15 ngày bằng Lyphoxim và làm cỏ bằng tay sau 45 ngày gieo và công thức làm cỏ tay sau 25 ngày + 45 ngày là hai công thức có năng suất thực thu tương đương nhau và cao hơn so với đối chứng 19,9% và 19,3%. Công thức đạt năng suất thực thu tốt nhất là công thức làm cỏ tay sau gieo 25 ngày và phun Mizin 80WP khi cỏ mọc lại được 1 - 3 lá đạt 39,9 tạ/ha, cao hơn so với đối chứng 22,4%.

Tóm lại, các công thức xử lý cỏ có hiệu quả trên giống lúa nếp cạn Khẩu Nua Trạng là CT5 (làm cỏ tay sau gieo 25 ngày và phun Mizin 80WP khi cỏ mọc lại được 1-3 lá), và CT2 (làm cỏ tay sau gieo 25 ngày + 45 ngày); CT3 (xử lý cỏ trước gieo 15 ngày bằng Lyphoxim và làm cỏ bằng tay sau 45 ngày gieo). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của IsmailaU et al. (2011) về ảnh hưởng của một số biện pháp phòng trừ cỏ dại cho lúa cạn ở Badeggi, Nigeria cho rằng các phương thức trừ cỏ dại đều có ý nghĩa đến sinh trưởng và phát triển của lúa cạn, phương thức trừ cỏ dại đạt hiệu quả nhất là kết hợp giữa xử lý thuốc trừ cỏ và làm cỏ bằng tay (công thức làm cỏ tay sau 25 ngày gieo lúa + phun thuốc trừ cỏ thảo dược Orizo

99


sau 45 ngày) là công thức phòng trừ cỏ dại được tác giả đưa ra khuyến cáo. Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy việc xử lý cỏ dại tại các công thức có sử dụng thuốc Lyphoxim và Mizin trước khi gieo hạt và sau khi gieo hạt là hoàn toàn không gây tổn thương cho cây lúa.

IV. KẾT LUẬNNghiên cứu 5 công thức trừ cỏ trong canh tác

giống lúa nếp cạn Khẩu Nua Trạng trên đất nương rẫy đã xác định được 3 công thức trừ cỏ có hiệu lực là: CT5 (Làm cỏ bằng tay sau gieo 25 ngày + Phun Mizin 80 WP sau khi cỏ mọc lại được 1 - 3 lá); CT2 (Làm cỏ tay sau gieo 25 ngày và 45 ngày); CT3 (Xử lý cỏ trước gieo 15 ngày bằng Lyphoxim và làm cỏ bằng tay sau gieo 45 ngày). Đây là những công thức sau khi xử lý hiệu lực trừ cỏ, số nhánh tối đa, số bông/khóm, năng suất thực thu của giống đạt kết quả tốt.

TÀI LIỆU THAM KHẢONguyễn Thị Tân, Nguyễn Hồng Sơn, Đinh Thị Bích,

Nguyễn Thái Phong, Nguyễn Đăng Lực, Trần Thị Thử và ctv., 2000. Kết quả điều tra và nghiên cứu phòng cỏ dại trên một số cây trồng cạn 1996 - 1999. Tuyển tập công trình nghiên cứu bảo vệ thực vật 1996 - 2000. NXB Nông nghiệp. Hà Nội, tr.194-205.

Gupta, P.C, O’Toole, J.C, 1986. Upland rice a global perspective. IRRI, Los Banos Philippines. pp 267 - 292.

Ismailal U, Kolo M. G. M and U. A, 2011. Gbanguba1 Efficacy and Profitability of Some Weed Control Practices in Upland Rice (Oryza sativa L.) at Badeggi, Nigeria. American Journal of Experimental Agriculture, 1(4): pp.174-186.

Ukwungwu, Abo M.N, M.E, 2004. Nigeria rice: In the science and technology vista. The Nigeria Rice Memorabilia, pp. 49.

Zhang, Zepu, 2001. Weed management in rice in China. Summary presented at FAO workshop on Echinochloa spp. Control, Beijing, China, 27th May 2000.

Study on weed control for cultivating Khau Nua Trang upland rice variety in Ha Giang Province

Dao Thi Thu Huong, Tran Van Dien, Duong Thi NguyenAbstractThe research was conducted to determine the best method of weed control applied to Khau Nua Trang uplandrice variety cultivated in Dao Duc commune, Vi Xuyen district, Ha Giang province. The experiment was designed with 5 treatments and 3 replications. The results showed that CT5 combining with weed remove by hand after 25 days of sowing and with spraying Mizin 80WP at 1 to 3-leave regrowing stage of weeds, CT2–weed remove by hand after 25 days and 45 days of sowing, and CT3 - combining with treating weeds by Lyphoxim 15 days before sowing and with weed remove by hand after 45 days of sowing, were effective methods of weed control. The yields of Khau Nua Trang variety at CT5, CT2 and CT3 reached 3.99 tons/ha, 3.91 tons/ha, and 3.89 tons/ha, respectively. CT4 (spraying Mizin 80WP at 1 to 3-leave regrowing stage of weeds) gained 3.68 tons/ha, and CT1 (weed remove by hand after 45 days of sowing) obtained 3.26 tons/ha.Key words: Upland rice, Khau Nua Trang variety, weed control

Ngày nhận bài: 11/6/2017Người phản biện: TS. Nguyễn Thị Nhung


1 Bộ môn Tài nguyên Nước, Khoa Môi trường và Tài nguyên thiên nhiên, Đại học Cần Thơ2

Ban quản lý Dự án Nam Vàm Nao, huyện Chợ Mới, tỉnh An Giang

ỨNG DỤNG MÔ HÌNH ĐA TÁC TỬ TRONG QUẢN LÝ NƯỚC MẶNPHỤC VỤ NÔNG NGHIỆP TẠI VÙNG NGỌT HÓA VEN BIỂN

ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONGTrần Thị Lệ Hằng1, Trương Thanh Tân1,

Nguyễn Xuân Thịnh2, Văn Phạm Đăng Trí1

TÓM TẮTNghiên cứu được thực hiện nhằm xây dựng các giải pháp thích ứng với điều kiện xâm nhập mặn và sự thay đổi

về lượng mưa trong tương lai đối với việc sản xuất lúa trong cánh đồng lớn; từ đó hỗ trợ công tác ra quyết định trong việc điều tiết nước đồng thời xác định phương pháp quản lý nước hiệu quả. Các số liệu thu thập được từ phương

100


I. ĐẶT VẤN ĐỀĐồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là một trong

những vùng sản xuất lương thực lớn nhất cả nước. Tuy nhiên, ĐBSCL đang chịu tác động từ nhiều mặt như: Thay đổi chế độ dòng chảy và lưu lượng nước, gia tăng xâm nhập mặn (cả về nồng độ và diện tích); mâu thuẫn sử dụng đất do sử dụng nước (nước ngọt và nước mặn) giữa trồng lúa và nuôi tôm (Sunada, 2009; Mainuddin et al., 2010; Lê Anh Tuấn, 2011; Mai Thị Hà và ctv., 2014; Trung N.H and Tri P.V.D, 2014) đã dẫn đến việc cung cấp nước cho các vùng sinh thái nông nghiệp khác nhau ở ĐBSCL trong tương lai có nhiều thay đổi so với hiện tại (Trung et al., 2012; Linh et al., 2013). Trong thời gian gần đây, nhiều dự án thủy lợi đã và đang được triển khai ở một số tỉnh ở ĐSBCL hướng tới mục tiêu kiểm soát lũ và ứng phó BĐKH, trong đó có quy hoạch các cánh đồng lớn (CĐL) đã cho thấy hiệu quả bước đầu trong sản xuất nông nghiệp (Chu Văn Cấp và Lê Xuân Tạo, 2013). Tuy nhiên, bên cạnh những lợi ích trong việc phát triển CĐL thì việc khắc phục một số

khó khăn như: (i) mâu thuẫn trong quản lý CĐL giữa nhà nước và người dân (như: điều tiết nước tưới, lịch xuống giống); và (ii) tác động của thời tiết, xâm nhập mặn (XNM) là các vấn đề cần được quan tâm. Một số mô hình thủy lực đã được phát triển nhằm mô phỏng động thái nguồn tài nguyên nước mặt ở ĐBSCL trong hiện tại và tương lai cũng như đánh giá ảnh hưởng của sự thay đổi của các yếu tố khí hậu và nguồn nước lên năng suất lúa (Ghyselinck, 2012; Lâm Mỹ Phụng và ctv., 2013; Vương Tuấn Huy và ctv., 2013). Tuy nhiên, công tác quản lý nước trong CĐL thực tế không chỉ chịu tác động bởi thời tiết, XNM và mà còn chịu ảnh hưởng bởi quyết định bởi các quan điểm và sự phối hợp giữa các bên tham gia trong bộ máy quản lý (Trương Thanh Tân và ctv., 2017); do đó, việc nghiên cứu sự tương tác giữa các bên liên quan trong việc quản lý nước tưới là cần thiết nhằm hỗ trợ ra quyết định trong việc điều tiết nước và xác định phương pháp quản lý nước hiệu quả cho chính quyền và người dân trong điều kiện hiện tại và tương lai.

pháp phỏng vấn nông hộ, cán bộ địa phương về (i) phương pháp điều tiết nước trong cánh đồng lớn; và, (ii) hành vi, vai trò, sự tương tác của các bên liên quan được dùng làm số liệu đầu vào cho mô hình đa tác tử, nhằm mô phỏng hành vi của các bên liên quan trong quản lý nước tưới ở hiện tại; từ đó, đề xuất các giải pháp thích ứng trong tương lai ứng với điều kiện tài nguyên nước thay đổi. Kết quả nghiên cứu cho thấy, phương pháp quản lý nước tưới hiện tại vẫn đảm bảo được nguồn nước cho sản xuất lúa ở hiện tại với thời gian xâm nhập mặn kéo dài từ 5 - 7 ngày. Tuy nhiên, với diễn biến xâm nhập mặn kéo dài từ 15 - 20 ngày thì việc xem xét thay đổi các hành vi như: thay đổi lịch xuống giống sớm hơn, mở rộng thể tích kênh nội đồng hoặc sử dụng giống lúa chịu mặn là cần thiết nhằm hạn chế ảnh hưởng bất lợi của xâm nhập mặn.

Từ khóa: Mô hình đa tác tử, xâm nhập mặn, cánh đồng lớn, đồng bằng ven biển

Hình 1. Khu vực nghiên cứu

Thị xã Ngã Năm là vùng quy hoạch sản xuất lúa tập trung thuộc tỉnh Sóc Trăng (Hình 1). Tuy nhiên, việc sản xuất lúa tại đây đang gặp nhiều bất lợi do ảnh hưởng thường xuyên của nước mặn xâm nhập

từ tuyến kênh chính Quản Lộ - Phụng Hiệp bởi việc mở cống lấy nước mặn nuôi tôm từ huyện Phước Long, tỉnh Bạc Liêu; do đó, các cơ chế quản lý nước phục vụ sản xuất nông nghiệp (đặc biệt là trồng

101


lúa) như: hệ thống thủy lợi (gồm 9 cống lớn) và các công trình phụ trợ đã được xây dựng và phát triển nhằm bảo vệ diện tích nông nghiệp sử dụng nước ngọt. Tuy nhiên, tình hình XNM ngày càng trở nên nghiêm trọng do ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như: (i) lưu lượng nước ngọt từ sông Hậu giảm, (ii) nước mặn xâm nhập không theo chu kì và, (iii) chất lượng công trình ngăn mặn suy giảm đã gây khó khăn cho việc quy hoạch sử dụng đất tại địa phương và hiệu quả của cơ chế quản lý nước của các bên liên quan (Hồng Minh Hoàng và ctv., 2015). Vì thế, việc xây dựng mô hình mô phỏng công tác quản lý nước và cân bằng nước trong CĐL cũng như xây dựng các giải pháp thích ứng với điều kiện động thái nguồn tài nguyên nước thay đổi là cần thiết nhằm hỗ trợ công tác ra quyết định trong việc điều tiết nước và xác định phương pháp quản lý nước hiệu quả.

II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Phương pháp thu thập số liệu

2.1.1. Số liệu sơ cấpPhỏng vấn trực tiếp các bên liên quan và người

dân tham gia sản xuất trong CĐL được sử dụng nhằm: (i) đánh giá tổng quan về khu vực nghiên cứu (như: thực trạng kênh cấp/thoát nước, đê, cống và trạm bơm trong vùng nghiên cứu); và, (ii) tìm hiểu phương pháp điều tiết nước, vai trò và sự tương tác của các bên liên quan trong CĐL ở thời điểm hiện tại. Các hộ canh tác trong CĐL được lựa chọn ngẫu nhiên (30 hộ) và các thông tin sau khi thu thập từ người dân được thống kê mô tả và so sánh với thông tin được thu tập từ ban quản lý CĐL nhằm kiểm tra độ tin cậy của thông tin thu thập được và mô hình hóa hành vi của các đối tượng tham gia vào hệ thống quản lý nước.

2.1.2. Số liệu thứ cấpCác số liệu thứ cấp về vùng nghiên cứu như: hệ

thống công trình thủy lợi, độ mặn, lượng mưa và lịch thời vụ được thu thập từ Phòng Kinh tế thị xã Ngã Năm và Trung tâm Khí tượng Thủy văn tỉnh Sóc Trăng giai đoạn 2015 - 2016 nhằm sử dụng làm số liệu đầu vào của mô hình mô phỏng đa tác tử.

2.2. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu sau khi thu thập được hệ thống hóa

để xây dựng mô hình đa tác tử. Mô hình đa tác tử (ABM) là một mô hình tin học đã được ứng dụng rộng rãi trên thế giới để mô phỏng các hệ thống phức tạp có sự tương tác qua lại giữa các tác tử ở nhiều mức độ khác nhau (Taillandier et al., 2012).

Trong nghiên cứu này, sự tương tác giữa các tác tử được hiểu là sự tương tác giữa các bên liên quan trong hệ thống quản lý nước ở CĐL. Số liệu sau khi thu thập được mô hình hóa dựa trên hướng đa tác tử trên phần mềm GAMA. Các bước xây dựng mô hình quản lý nước tưới trong CĐL được mô tả như hình 2.

Hình 2. Các bước phát triển mô hình đa tác tử

2.2.1. Xây dựng mô hình- Xác định hành vi của các đối tượng: Dù có nhiều

bên liên quan tham gia vào quá trình quản lý nước trong CĐL; tuy nhiên, nghiên cứu chỉ tập trung mô phỏng các đối tượng có vai trò quan trọng quyết định đến năng suất của CĐL là: trạm quản lý thủy nông (quan trắc độ mặn, đóng/mở cống chính), người dân và HTX&THT (lấy nước vào CĐL) (Trương Thanh Tân và ctv., 2017).

- Xây dựng phương pháp điều tiết nước: Trong thực tế tại khu vực nghiên cứu, hai nguồn nước chính cung cấp cho cây trồng là nước mưa (P) và nước tưới (nước mặt) (I); khi lượng mưa đã đủ cho cây trồng thì không cần cung cấp thêm nước tưới.

Đặc điểm, hành vi củacác đối tượng

Dữ liệu khônggian, thủy văn

Sơ đồ hóa đặcđiểm và hành vi

các đối tượng

Phát triển mô hìnhABM

Hiệu chỉnhvà kiểm định

Phát triển kịch bản

Phương pháp quản lýnước tưới phù hợp

Mô phỏngABM

Phương pháp điềutiết nước tưới của

người dân

Số liệu đầu vào

Chưaphù hợp

Phù hợp

102


Nguồn nước mất đi khỏi khu vực do các nguồn thất thoát chính là chảy tràn (R) một phần thấm sâu xuống đất (DP) và một phần bốc thoát hơi nước (ET) (Lê Anh Tuấn, 2005); do đó, phương trình cân

bằng nước sử dụng trong mô hình được rút gọn theo CT1 và được mô tả ở bảng 1.

I = (ET + DP) _ P (CT1)

Bảng 1. Mô tả các thông số trong mô hình cân bằng nước

- Mô tả hệ thống: Hành động của nhóm đối tượng liên quan mô phỏng trong mô hình đa tác tử được mô tả ở hình 3. Đầu vào của mô hình là ngay_xuong_giong (ngày xuống giống của HTX&THT), và các giá trị ban đầu là độ mặn, lượng mưa và giá trị ETo. Hành động muc_nuoc_hien_tai (mực nước ban đầu) được khởi chạy, đánh dấu ngày đầu tiên trong quá trình sản xuất lúa.

[1] Khi mực nước trong CĐL thay đổi (gây ra bởi các yếu tố trong phương trình cân bằng nước) trong khoảng giá trị [Hmin ; Hmax] thì muc_nuoc_hien_tai vẫn chạy đến khi nào đến ngày thu hoạch (ngay_thu_hoach) và kết thúc.

[2] Khi muc_nuoc_hien_tai [Hmin ; Hmax]:- Nếu mực nước trong CĐL Hmax: bom_nuoc_ra

(bơm nước ra) khởi chạy sẽ làm giảm mực nước trong CĐL đến khi muc_nuoc_hien_tai Hmax thì dừng lại. Quay về [1].

- Nếu mực nước CĐL Hmax HTX&THT sẽ xem xét trạng thái của cống (việc đóng/mở cống do trạm quản lý thủy nông thị xã Ngã Năm quyết định):

+ Nếu cống mở (trạng thái cống: trang_thai_cong = true): thực hiện bom_nuoc_vao (bơm nước vào) và kiểm tra trang_thai_cong ở mỗi bước lặp tới khi muc_nuoc_hien_tai = [Hmin ; Hmax] hoặc trang_thai_cong = false thì dừng lại. Quay về [1].

+ Nếu cống đóng (trang_thai_cong = false; độ mặn trên kênh >= 2,00 g/l): Nước tại kênh trữ (kenh_thu) trong CĐL sẽ được dùng để tưới cho lúa. Mực nước trong kênh trữ được giả định là giảm không đáng kể so với mực nước trong CĐL. Nếu mực nước trong kênh trữ > 0 thì người dân tiếp tục bom_nuoc_vao, đến khi mực nước trong CĐL = [Hmin ; Hmax] hoặc mực nước trong kênh trữ < 0 hoặc cống mở thì dừng lại. Quay về [1].

Hình 3. Sơ đồ mô tả phương pháp tưới và hành động của người dân

2.2.2. Hiệu chỉnh và kiểm tra độ tin cậy mô hìnhNghiên cứu hiệu chỉnh mô hình dựa trên hệ số

ETo trong khoảng [2,00; 7,00] mm/ngày (mỗi bước nhảy là 0,5 mm); theo đó số liệu mực nước trong CĐL được xuất ra từ mô hình sẽ so sánh với dữ liệu mực nước đo đạc từ thực tế; hệ số tương quan r2 là cơ sở để lựa chọn hệ số ETo phù hợp. Độ tin cậy trong mô hình được xác định thông qua: (i) thời gian bơm nước; (ii) khoảng cách giữa 2 lần bơm nước; và, (iii) mực nước trong đồng ruộng tại các giai đoạn sinh trưởng của cây lúa.

2.3. Xây dựng kịch bản và các giải pháp thích ứngCác kịch bản được xây dựng và xem xét nhằm

tìm ra phương pháp điều tiết nước tưới hiệu quả cho CĐL (dựa trên việc thay đổi hành vi của các tác tử)

Thông số Mô tả Giá trị Tham khảoI Lượng nước cần được bổ sung hằng ngàyET = Kc ˟ EToKcETo

Bốc thoát hơiHệ số cây trồngBốc thoát hơi tham chiếu

1,12 - 1,632,00 - 7,00 m/ngày

TCVN 8641:2011Hồng Minh Hoàng và ctv., 2014

DP Thấm sâu vào đất 1,00 mm/ngày Hồng Minh Hoàng và ctv., 2014P Lượng mưa Trung tâm khí tượng thủy văn Sóc Trăng

Bắt đầu

Nhập dữ liệuSet giá trị ban đầu

{cycle: 1 day}

Kết thúc {when step= ngay_thu_hoach}

muc_nuoc_hien_tai{sep unit <- 1 day;

do 1 step until:ngay_thu_hoach}

Hmin <=muc_nuoc_hien_tai

<= Hmax

bom_nuoc_ra {step unit<- 1 day; unit:

muc_nuoc_hien_tai <=Hmax}

muc_nuoc_hien_tai>= Hmax

trang_thai_cong= true

muc_nuoc {he_thong_kenhtype=‘kenh_tru’; do

muc_nuoc step unit: 1 day}

muc_nuoc{he_thong_kenhtype=‘kenh_tru’}

> 0

Yes Yes

Yes

Yes

No

No

No

No

bom_nuoc_vao { step unit <- 1day; until: muc_nuoc_hien_tai

>= Hmin}

103


ứng với tình trạng nguồn nước tưới bị ảnh hưởng bởi XNM liên tục nhiều ngày hơn sao với trình trạng

XNM hiện tại. Các giải pháp thích ứng được xây dựng và xem xét thể hiện ở bảng 2.

Bảng 2. Các kịch bản thích ứng với XNM

Bảng 3. Mực nước cần điều tiết theo từng giai đoạn phát triển của cây lúa

STT Tên giải pháp Mô tả

1 Thay đổi phương pháp tưới

Theo FAO (2004), thực tế nhu cầu nước theo kinh nghiệm của người dân thường cao hơn so với nhu cầu thực của cây trồng; do đó, nghiên cứu áp dụng một số phương pháp tưới khác nhằm tiết kiệm nguồn tài nguyên nước ở tương lai (Phương pháp tưới theo lớp nước yêu cầu trong từng giai đoạn phát triển của cây lúa theo TCVN 8641:2011).

2 Thay đổi lịch thời vụ Xác định lịch thời vụ phù hợp tương ứng với các kịch bản thay đổi nguồn nước cấp trong tương lai để sử dụng nguồn nước tưới hiệu quả.

3 Dự báo sớm XNM và trữ nước

Trong tương lai các đợt XNM sẽ kéo dài hơn, do vậy kịch bản được xây dựng bổ sung hành vi của các bên liên quan trong công tác dự báo XNM và khả năng bơm trữ nước chủ động trước các đợt XNM.

4 Sử dụng giống lúa chịu mặn

Nghiên cứu xem xét thay đổi giống lúa thuần chịu mặn cao (3-6 g/l hoặc 10 g/l) có thời gian sinh trưởng bằng với giống lúa hiện tại.

2.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 4/2015 đến

tháng 4/2016, vào thời điểm canh tác vụ Hè Thu (2015) và vụ Đông Xuân (2015 - 2016) tại thị xã Ngã Năm tỉnh Sóc Trăng.


3.1. Phương pháp tưới của người dân và hệ thống quản lý nước tưới

3.1.1. Phương pháp tưới của người dânKết quả khảo sát cho thấy, phương pháp quản

lý nước tưới được người dân sử dụng trong hai vụ Đông Xuân và Hè Thu là như nhau, tùy thuộc vào điều kiện thời tiết (lượng mưa và nhiệt độ) và XNM mà lượng nước cung cấp, thời điểm cung cấp và số lần cung cấp khác nhau nhằm duy trì mực nước trên ruộng ổn định trong khoảng [Hmax; Hmin] ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau của cây lúa (Bảng 3). Qua khảo sát cho thấy có 98% giống lúa được người dân trong cánh đồng mẫu sử dụng là giống RVT, 4347 hay 5451 với thời gian sinh trưởng tối đa là 100 ngày.

3.1.2. Vận hành hệ thốngBốc thoát hơi nước tham chiếu ETo được xác

định dựa trên sự tương quan giữa kết quả mô phỏng mực nước vụ Đông Xuân 2015 - 2016 với số liệu thực đo tại khu vực CĐL trong quá trình canh tác (Hình 4). Kết quả cho thấy ứng với hệ số ETo = 5 mm/ngày (so sánh trong khoảng từ 2,00 - 7,00 mm/ngày, mỗi bước nhảy là 0,5 mm) thì hệ số tương quan R2 đạt giá trị cao nhất là 0,89. Do đó, mô hình sử dụng giá trị

ETo = 5 mm/ngày để kiểm tra độ tin cậy và xây dựng kịch bản quản lý nước tưới (Hình 4).

Kết quả kiểm định về số lần bơm nước vào và bơm nước ra (bảng 4) tại CĐL cho thấy: Số lần bơm nước vào CĐL trong từng giai đoạn phát triển của cây lúa và khoảng cách giữa các lần bơm nước so với thực tế có sự chệnh lệch; nguyên nhân chênh lệch này có thể giải thích do việc đơn giản hóa các thông số trong mô hình cân bằng nước và điều kiện chủ

Giai đoạn Thời gian(ngày thứ)

Mực nước lớn nhất (Hmax) cm

Mực nước nhỏ nhất (Hmin) cm

Khoảng cách giữa 2 lần bơm

Gieo hạt 1 - 67 - 10

15

00

Không bơm5 – 6 ngày

Mạ 11 - 25 10 5 5 – 6 ngàyĐẻ nhánh 25 - 44 10 5 5 – 6 ngàyLàm đòng 45 - 64 10 5 5 – 6 ngàyTrổTrổ đến thu hoạch

65 - 9091 - 100

100

50

5 – 6 ngàyKhông bơm

104


quan của người dân trong quá trình bơm nước. Tuy nhiên, sự chênh lệch này là có thể chấp nhận được, mực nước trên ruộng được duy trì trong khoảng

[Hmax; Hmin] ở từng giai đoạn; vì thế, sự vận hành hệ thống giữa các bên liên quan đã xây dựng trong mô hình là phù hợp.

00.030.060.090.12

1 11 21 31 41 51 61 71 81 91

Mực

nướ

c (m

)

Ngày thứ Mô phỏng Thực đo

R² = 0.89

0

0.03

0.06

0.09

0.12

0 0.05 0.1 0.15

Mực

nướ

c tr

ong

ruộn

g (m

)

Ngày thứ

Hình 4. Kết quả mô phỏng và thực đo mực nước trong ruộng vụ Đông Xuân 2015

Hình 5. Điều tiết nước trong vụ Đông Xuân 2015 - 2016

Hình 6. Điều tiết nước tưới trong vụ Hè Thu 2015

Bảng 4. Thông số kiểm tra độ tin cậy của mô hình vụ Đông Xuân 2015

Ghi chú: HT: vụ Hè Thu; ĐX: vụ Đông Xuân; TĐ: Thực đo; MP: Mô phỏng

Kết quả mô phỏng vụ Đông Xuân (hình 5) và Hè Thu (hình 6) cho thấy mực nước trên ruộng luôn được đảm bảo duy trì trong ngưỡng quy định của người dân. Đối với vụ Hè Thu, do XNM năm 2015 không đồng thời kéo dài liên tục (mỗi đợt chỉ kéo dài 4 đến 7 ngày với độ mặn trên 2 g/l) nên người dân vẫn có thể bơm nước trong những thời điểm cần thiết. Thêm vào đó, với lượng mưa bổ sung trong giai đoạn vụ Hè Thu nên hạn chế được số lần bơm nước vào ruộng so với vụ Đông Xuân. Tuy nhiên, số lần tiêu nước tăng lên do mưa lớn trong giai đoạn này; đặc biệt, với cách bố trí lịch thời vụ như hiện tại, khoảng thời gian giữa và cuối vụ thường có mưa lớn có thể ảnh hưởng đến năng suất và hoạt động thu hoạch của người dân.

3.2. Kịch bản tương lai và các giải pháp thích ứng

3.2.1. Kịch bản thay đổi động thái nguồn tài nguyên nước

Trong điều kiện các đợt XNM liên tục kéo dài

hơn trong tương lai và lượng mưa thay đổi theo kết quả dự báo cho năm 2020, mực nước trong CĐL sẽ không duy trì được trong giới hạn Hmin - Hmax vào giai đoạn đầu và nửa cuối vụ Hè Thu, đặc biệt là khi XNM kéo dài 15 đến 20 ngày (Hình 7). Vì thế,

VụSố lần

bơm ra - vào

Khoảng cách trung bình giữa

2 lần bơm (ngày)

TĐ MP TĐ MP

HT 2014 3 - 0 3 - 0 5 - 6 5 - 7

ĐX 2014 - 2015 1 - 9 2 - 9 5 - 6 5 - 7

HT 2015 3 - 0 3 - 0 5 - 6 5 - 6

ĐX 2015 - 2016 0 - 8 1 - 9 5 - 6 5 - 6

0

2

4

6

8

0

0.03

0.06

0.09

0.12

1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81 86 91 96 101

Ngày thứ Thời

gia

n bơ

m n

ước

(ngà

y)

Mực

nướ

c tr

ong

ruộn

g (m

)

Mực nước trong ruộng Hmax

Hmin

Thời gian bơm vào Thời gian bơm ra

012345

00.030.060.090.120.150.18

1 8 15 22 29 36 43 50 57 64 71 78 85 92 99

Thời

gia

n bơ

m

nước

(ngà

y)

Mực

nướ

c tr

ong

ruộn

g (m

)

Ngày thứ

Mực nước trong ruộng Hmax

Hmin

Thời gian bơm vào Thời gian bơm ra

105


nếu các bên liên quan vẫn giữ nguyên phương pháp quản lý như hiện tại thì hoạt động hoạt động điều tiết nước cho sản xuất của CĐL có thể gặp khó khăn,

nhất là giai đoạn gần cuối vụ Hè Thu dẫn đến chiều cao và số lượng nhánh có thể bị giảm gây ảnh hưởng đến năng suất (Doorenbos et al., 1979).

3.2.2. Kịch bản thay đổi phương pháp tướiViệc thay đổi phương pháp tưới theo TCVN

8641-2011 có thể giúp giảm lượng nước cần bơm vào ruộng trong một mùa vụ và tiết kiệm chi phí; tuy nhiên, phương pháp này chưa giải quyết được vấn đề thiếu nước cho CĐL trong điều kiện các kịch bản thời gian XNM (hình 8) bởi lượng nước trữ trên ruộng trong một thời đoạn (khoảng mực nước Hmin – Hmax) ít hơn so với phương pháp tưới đang được áp dụng nên cần số lần bơm nước vào ruộng nhiều hơn. Bên cạnh đó, do mực Hmin thấp nên trong thời gian không bơm được nước dẫn đến mực nước trên ruộng giảm xuống thấp hơn so với phương pháp của người dân; do đó, giải pháp này không phù hợp trong điều kiện nguồn tài nguyên nước thay đổi theo các kịch bản đề ra. Nghiên cứu đã đề xuất 2 giải pháp, đó là:

Giải pháp 1 - Tận dụng lượng mưa. Điều tiết nước theo phương pháp được khuyến cáo của TCVN 8641-2011; tuy nhiên, trong trường hợp có mưa, thay vì bơm nước ra khỏi ruộng ngay khi mực nước lớn hơn giá trị Hmax thì vẫn giữ nguyên mực nước trên ruộng nếu không vượt quá khoảng chịu ngập tối ưu (10 cm) (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008) giúp kéo dài thời gian sử dụng nước và hạn chế số lần không bơm được nước vào ruộng do XNM.

Giải pháp 2 - Kết hợp phương pháp của người dân và TCVN 8641-2011. Sử dụng ngưỡng giá trị Hmin theo TCVN 8641-2011 và sử dụng giá trị Hmax theo phương pháp của người dân nhằm tận dụng lượng mưa, tăng lượng nước trữ trên ruộng và kéo dài thời gian giữa 2 lần bơm (Hình 10).

Hình 7. Điều tiết nước trong vụ Hè Thu ứng với kịch bản thay đổi XNM

-0.06-0.03

00.030.060.090.120.150.18

1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81 86 91 96 101Mực

nướ

c tr

ong

ruộn

g (m

)

Ngày thứ

10 ngày

15 ngày

20 ngày

Hmax

Hmin

Hình 8. Thay đổi phương pháp tưới trong điều kiện động thái nguồn tài nguyên nước thay đổi

-0.06-0.03

00.030.060.090.120.15

1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81 86 91 96 101Mực

nướ

c tr

ong

ruộn

g (m

)

Ngày thứ

10 ngày

15 ngày

20 ngày

Hmax

Hmin

Hình 9. Điều tiết nước theo giải pháp 1

-0.06-0.03

00.030.060.090.12

1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81 86 91 96 101

Mực

nướ

c tr

ong

ruộn

g (m

)

Ngày thứ

10 ngày

15 ngày

20 ngày

Hmax

Hmin

Hình 10. Điều tiết nước theo giải pháp 2 -0.06-0.03

00.030.060.090.120.15

1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81 86 91 96 101Mực

nướ

c tr

ong

ruộn

g (m

)

10 ngày

15 ngày

20 ngày

Hmax

Hmin

106


Kết quả cho thấy, cả hai giải pháp 1 và 2 có thể đảm bảo lượng nước cung cấp cho CĐL trong trường hợp mặn liên tục 10 ngày và 15 ngày và tránh được đợt XNM ở giai đoạn đầu vụ. Tuy nhiên, với giải pháp 1, bởi việc tận dụng được lượng nước mưa đầu vụ trong thời gian XNM nên mực nước trên ruộng được duy trì cao hơn giải pháp 2; do đó tiết kiệm được lượng nước bơm vào và thời gian bơm (Hình 11).

Hình 11. Tổng lượng nước cần bơm và tổng thời gian bơm của giải pháp 1 và 2

(trường hợp XNM liên tục 20 ngày)

3.2.3. Thay đổi lịch thời vụVới kịch bản XNM liên tục kéo dài trong 10

ngày (hình 12): Nếu dịch chuyển lịch thời vụ sớm hơn 10, 15 ngày hay trễ 15 ngày có thể tránh được các đợt XNM vào thời điểm bơm nước nên vẫn duy trì được mực nước trên ruộng trong giới hạn [Hmin; Hmax]. Nếu dịch chuyển lịch thời vụ sớm hơn 30 ngày, trong một số khoảng thời gian đầu vụ CĐL có thể không duy trì được mực nước trong giới hạn do XNM. Đối với lịch thời vụ trễ hơn 15 ngày có thể tránh được các đợt XNM và đảm bảo cung cấp đủ lượng nước yêu cầu cho sản xuất; tuy nhiên, các đợt mưa lớn kéo dài (mực nước trên ruộng đạt xấp xỉ 20 cm) vào khoảng thời gian cuối vụ có thể gây đổ ngã, ngập úng làm ảnh hưởng đến năng suất (Vương Tuấn Huy và ctv., 2011). Do vậy, trong điều kiện XNM kéo dài liên tục thành các đợt trong 10 ngày và 15 ngày như các kịch bản đề ra, việc dịch chuyển lịch thời vụ sớm hơn 15 ngày có thể đảm bảo được nguồn nước và hạn chế tác động của điều kiện thời tiết bất lợi vào cuối vụ.

14

15

16

17

18

19

700

750

800

850

Giải pháp 1 Giải pháp 2

Tổng

thời

gia

n bơ

m (n

gày)

Tổng

lượn

g nư

ớc (x

1000

m3)

Tổng lượng nước

Tổng thời gian bơm vào và ra

Với kịch bản XNM liên tục kéo dài trong 15 (hình 13) và 20 ngày (hình 14) cho thấy: việc dịch chuyển lịch thời vụ sớm hơn 10, 15 ngày hoặc trễ hơn 30 ngày vẫn có thời đoạn không bơm được nước do trùng với các đợt xuất hiện XNM. Đối với lịch thời vụ trễ hơn 15 ngày có thể tránh được các đợt XNM và đảm bảo cung cấp đủ lượng nước yêu cầu cho sản xuất; tuy nhiên, các đợt mưa lớn kéo dài vào khoảng thời gian cuối vụ có thể gây ngập úng, đổ ngã; do đó, HTX&THT có thể xem xét đến việc lựa chọn một trong hai giải pháp dịch chuyển lịch thời vụ sớm hơn 15 ngày hoặc trễ hơn 15 ngày và có giải pháp kèm theo nhằm hạn chế các tác động tiêu cực có thể xảy ra (như bơm trữ nước trước các đợt

XNM hoặc thường xuyên theo dõi diễn biến XNM trên kênh chính).

3.2.4. Dự báo sớm, bơm trữ nước và sử dụng giống lúa chịu mặn

Kết quả phỏng vấn các bên liên quan cho thấy trong điều kiện hiện tại XNM ở địa phương chưa gây thiếu nước cho sản xuất của CĐL; tuy nhiên, XNM tăng trong tương lai có thể gây thiếu nước do XNM, do đó việc dự báo sớm và bơm trữ nước cần được xem xét. Kết quả tính toán của mô hình cho thấy lượng nước cần thiết cho CĐL sử dụng trong khoảng thời gian từ 6 - 7 ngày trung bình vào khoảng 190,000 m3

(417 hecta và độ cao mực nước trong ruộng 10 cm, trong điều kiện không có mưa). Ngoài ra, thể tích nước tối đa có thể trữ trong hệ thống kênh của CĐL

Hình 12. Thay đổi lịch thời vụ trong điều kiện XNM liên tục 10 ngày

-0.06-0.03

00.030.060.090.120.150.18

1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81 86 91 96 101

Mự

c nư

ớc tr

ong

ruộn

g (m

)

Ngày thứ Sớm 10 ngày Sớm 15 ngày Sớm 30 ngày Trễ 15 ngày Hmax Hmin

107


Hình 14. Mực nước theo kịch bản thay đổi lịch thời vụ trong điều kiện XNM liên tục 20 ngày

Hình 13. Mực nước theo kịch bản thay đổi lịch thời vụ với XNM liên tục 15 ngày

-0.06-0.03

00.030.060.090.120.150.18

1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81 86 91 96 101

Mức

nướ

c tr

ong

ruộn

g (m

)

Ngày thứ

Sớm 10 ngày Sớm 15 ngày Sớm 30 ngày Trễ 15 ngày Hmax Hmin

-0.06-0.03

00.030.060.090.120.150.180.21

1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81 86 91 96 101

Mực

nướ

c tr

ong

ruộn

g (m

)

Ngày thứ

Sớm 10 ngày Sớm 15 ngày Sớm 30 ngày

là khoảng 56,648 m3, tương ứng có thể cung cấp cho sản xuất trong 2 ngày; vì thế, nếu công tác dự báo XNM được thực hiện trước các đợt XNM 3 ngày, người dân có thể bơm trữ nước với tổng lượng nước trữ trên ruộng và kênh là 473,648 m3 (trường hợp không có XNM); với lượng nước này có thể sử dụng được trong 8 - 9 ngày (không có mưa bổ sung). Do XNM chịu sự chi phối trực tiếp từ việc mở cống lấy nước mặn phục vụ nuôi tôm ở tỉnh Bạc Liêu; do đó, việc nắm lịch mở cống và quan trắc độ mặn từ xa thì công tác dự báo XNM khi đến địa bàn huyện là hoàn toàn có thể thực hiện được với độ tin cậy cao. Thêm vào đó, việc tăng thể tích kênh trữ lên 2 lần thông qua nạo vét kênh nội đồng đã bị bồi lắng hoặc nâng số lượng kênh kênh nội đồng; từ đó, làm tăng tổng thể tích nước trữ trên ruộng và kênh là 530,296 m3, tương ứng với 11 - 12 ngày.

Sử dụng giống lúa chịu mặn: Việc nghiên cứu

giống lúa chống chịu mặn đã được phát triển tại ĐBSCL (Hoa et al., 2012). Các giống lúa chịu mặn được sử dụng là giống lúa thơm dài ngày (từ 100 đến 115 ngày) có thể chịu mặn từ 2 - 4 g/l và trong 3 đến 4 ngày và sẽ chết dần nếu thời gian XNM lâu hoặc độ mặn cao hơn; do đó, nếu sử dụng giống lúa dài ngày có thể chịu được mặn từ 2 - 4 g/l trong vòng 7 ngày (tuy nhiên sẽ không thể bơm nước vào ruộng nếu ruộng bị khô, nứt nẻ do nhiễm phèn). Kết quả mô phỏng cho thấy, với việc mở rộng thể tích kênh trữ 2 - 3 lần và sử dụng giống lúa chịu mặn > 3 g/l thì CĐL có thể thích ứng được với điều kiện XNM kéo dài liên tục trong 15 ngày hoặc 20 ngày (Hình 15), giả sử rằng mực nước trong kênh trữ thay đổi không đáng kể bới sự cân bằng giữa các yếu tố liên quan trong mô hình cân bằng nước. Tuy nhiên, việc sử dụng giống lúa chịu mặn dài ngày cũng cần được xem xét bởi những thiệt hại do mưa lớn vào cuối vụ gây ra.

Hình 15. Mực nước ứng với các đợt XNM liên tục và mở rộng kênh trữ 2 đến 3 lần

00.020.040.060.08

0.10.120.140.160.18

1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81 86 91 96 101

Mự

c nư

ớc tr

ong

ruộn

g (m

)

Ngày thứ 10 ngày 15 ngày 20 ngày Hmax Hmin

108



4.1 Kết luậnTrong điều kiện hiện tại, phương pháp quản lý

nước tưới đang được áp dụng cho vùng nghiên cứu là phù hợp, đảm bảo được nguồn nước cho sản xuất trong khoảng thời gian XNM khoảng 5 - 7 ngày. Bên cạnh đó, việc áp dụng phương pháp tưới tiết kiệm nước có thể giúp tiết kiệm được hơn 4% lượng nước cần bơm trong 1 mùa vụ, giúp hạn chế chi phí vận hành trạm bơm so với phương pháp tưới hiện tại đang được áp dụng. Tuy nhiên, với diễn biến XNM kéo dài từ 15 - 20 ngày và diễn biến lượng mưa ở tương lai đã được dự báo thì việc xem xét thay đổi các hành vi như: thay đổi lịch xuống giống sớm hơn, mở rộng thể tích kênh nội đồng (kênh trữ nước) 2 - 3 lần và xem xét sử dụng giống lúa chịu mặn là cần thiết nhằm hạn chế ảnh hưởng bất lợi của XNM, đặt biệt là trong vụ Hè Thu từ tháng 5 đến tháng 8 dương lịch.

4.2 Kiến nghịDo giới hạn của đề tài tập trung vào việc mô

phỏng hành vi của các bên liên quan trong công tác quản lý nước tưới cho sản xuất của vùng nghiên cứu nên việc mô phỏng cân bằng nước trên đồng ruộng mới được xây dựng ở cấp độ cơ bản; vì thế, việc mô phỏng cân bằng nước ở mức độ chi tiết hơn là cần thiết nhằm nâng cao độ tin cậy của mô hình.

LỜI CẢM ƠNNhóm tác giả xin chân thành cám ơn Công ty

TNHH Nhà máy bia Heineken Việt Nam đã tài trợ kinh phí thực hiện nghiên cứu này.

TÀI LIỆU THAM KHẢOChu Văn Cấp và Lê Xuân Tạo, 2013. Cánh đồng mẫu lớn

ở Đồng bằng sông Cửu Long - mô hình sản xuất hiệu quả. Tạp chí Cộng sản - chuyên đề cơ sở, 79: 41-45.

Mai Thị Hà, Văn Phạm Đăng Trí và Nguyễn Hiếu Trung, 2014. Đánh giá sự thay đổi hệ thống canh tác trên cơ sở tài nguyên nước mặt vùng đồng bằng sông Cửu Long: nghiên cứu cụ thể trong điều kiện huyện Ngã Năm, tỉnh Sóc Trăng. Tạp chí Khoa học, Đại học Cần Thơ, 31: 90-98.

Hồng Minh Hoàng, Văn Phạm Đăng Trí và Nguyễn Hiếu Trung, 2015. So sánh lượng nước và số lần tưới của các kỹ thuật tưới nước cho cây lúa : áp dụng mô hình hệ thống stella. Tạp chí khoa học, Trường Đại học Cần Thơ, Phần A Khoa học Tự nhiên và Môi trường, 40: 50-61.

Vương Tuấn Huy, Văn Phạm Đăng Trí và Phạm Thanh Vũ, 2013. Ứng dụng mô hình Aquacrop mô phỏng năng suất lúa trong điều kiện các yếu tố khí hậu thay đổi tại vùng Bắc quốc lộ 1A, tỉnh Bạc Liêu. Tạp chí Nông nghiệp và PTNT, 13: 48-51.

Lâm Mỹ Phụng, Văn Phạm Đăng Trí và Trần Quốc Đạt, 2013. Ứng dụng mô hình toán thủy lực một chiều đánh giá và dự báo tình hình xâm nhập mặn trên hệ thống sông chính trên địa bàn tỉnh Trà Vinh. Tạp chí Khoa học, Đại học Cần Thơ, 25: 68-75.

Trương Thanh Tân, Trần Thị Lệ Hăng, Nguyễn Xuân Thịnh và Trần Văn Triển, 2017. Xu hướng thay đổi sử dụng đất nông nghiệp tại khu vực ngọt hóa vùng ven biển đồng bằng sông Cửu Long. Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 1(74): 71-76.

Lê Anh Tuấn, 2005. Nhu cầu nước và nhu cầu tưới cho cây trồng. Hệ thống tưới tiêu: p17-40.

Lê Anh Tuấn, 2011. Phương pháp lồng ghép biến đổi khí hậu vào kế hoạch phát triển kinh tế - xã hội địa phương. Nhà xuất bản Nông nghiệp.

Doorenbos, J., and A.H. Kassam, 1979. Yield response to water. p. 193. In Yield response to water.

Ghyselinck, T., 2012. Temporal changes of physical soil properties under different land use systems and land managements of alluvial soil in the Mekong Delta, Vietnam.

Linh, V.T.P., V.P.D. Tri, N.H. Trung, V.Q. Thanh, and N.T. Tuu, 2013. Assessing hydrological and land use dynamics in the Mekong Delta, Vietnam. J. Sci. Can Tho Univ. - Part A Nat. Sci. Technol. Environ. 27: 87-94.

Mainuddin, M., C.T. Hoanh, K. Jirayoot, A.S. Halls, M. Kirby, G. Lacombe, and V. Srinetr, 2010. Adaptation Options to Reduce the Vulnerability of Mekong Water Resources, Food Security and the Environment to Impacts of Development and Climate Change. CSIRO Water a Heal. Ctry. Natl. Res. Flagsh.

Sunada, K., 2009. Study on Asian River Basin, CREST Asian River Basins: Water Policy Study Team.

Taillandier, P., D. Vo, E. Amouroux, and H. Varagnat, 2012. GAMA: A Simulation Platform That Integrates Geographical Information Data , Agent-Based Modeling and Multi-scale Control. Springer-Verlag Berlin Heidelb.: 242-258.

Trung, N.H. and V.P.D. Tri, 2014. Possible Impacts of Seawater Intrusion and Strategies for Water Management in Coastal Areas in the Vietnamese Mekong Delta in the Context of Climate Changein Coastal Disasters and Climate Change in Vietnam (ND Thao, H Takagi, and M Esteban, Eds.). Elsevier Inc.

109


1 Viện Thổ nhưỡng Nông hóa

TÍNH CHẤT ĐẤT NÔNG NGHIỆP TỈNH QUẢNG NAMPhạm Đức Thụ1, Hoàng Trọng Quý1, Đinh Văn Hà1

TÓM TẮTKết quả nghiên cứu đánh giá số lượng và chất lượng đất nông nghiệp ở tỷ lệ bản đồ 1/100.000 theo hệ phân loại

đất của FAO-UNESCO-WRB (2006) đã chỉ ra rằng: Đất nông nghiệp tỉnh Quảng Nam được chia thành 07 Nhóm đất, 18 Đơn vị đất, 36 Đơn vị đất phụ. Phần lớn các loại có tầng đất khá dày. Các nhóm đất có thành phần cơ giới biến động từ cát, cát pha đến thịt nặng pha sét; dung trọng trung bình, từ 1,11 - 1,42 g/cm3; độ xốp tầng đất mặt trên 50%. Phản ứng đất từ chua đến ít chua; pHKCl từ 3,9 - 4,5. CEC và tổng cation kiềm trao đổi trong đất từ trung bình tới thấp, tương ứng 8,0 - 15,0 meq/100 g đất và 1,15 - 10,50 meq/100 g đất. Độ no bazơ khoảng 30 - 50%, các đất phù sa có đặc tính ít chua (Eutri- Haplic Fluvisols) và đất đen cao hơn, khoảng 50 - 80%. Hàm lượng OC và đạm trung bình đến cao ở các nhóm đất phù sa, đất đen, đất dốc tụ; các nhóm đất khác ở mức nghèo. Lân tổng số ở mức thấp đến trung bình thấp, chỉ đạt 0,05 - 0,09% P2O5 và lân dễ tiêu nhỏ hơn 8,0 mg P2O5/100 g đất, trừ nhóm đất đen ở mức khá. Kali tổng số và dễ tiêu cũng đều ở mức thấp đến trung bình thấp; kali tổng số từ 0,08 - 0,89% K2O và kali dễ tiêu thường nhỏ hơn 10,0 mg K2O/100 g đất; đối với nhóm đất phù sa và đất tầng mỏng hàm lượng kali khá hơn.

Từ khóa: Tính chất đất, đất nông nghiệp, Quảng Nam, phân loại đất

Trung, N.H., V.P.D. Tri, and V.T.P. Linh, 2012. Agro-ecological zones in the Vietnamese Mekong Delta: The present conditions and changes under

threats of climate change. The 4th International Conference on Vietnam Studies. Vietnam Acad. Soc. Sci. Collab. with Natl. Univ, Vietnam.

Application of agent-based modeling in surface water management for rice cultivationat the freshening areas of the Vietnamese Mekong Delta Coastal Plain

Tran Thi Le Hang, Truong Thanh Tan, Nguyen Xuan Thinh, Van Pham Dang Tri

AbstractThis study was carried out to propose adaptive solutions for rice cultivation under the conditions of salinity intrusion and precipitation changes to support decision-making in water regulation and management effectively. Local irriagation management and farmer interviews (including (i) methods of water regulation in large-scale farms; and, (ii) the behaviors, roles and interaction of stakeholders) were used as input data for a developed agent-based modeling to simulate stakeholder’s behaviors in water management and propose adaptive solutions in the event of water resources in the future. In fact, in the context of the study area, the current local irrigation management approaches still maintained adequate water supply with saltwater persist for 5 to 7 days. However, with the occurrence of salinity intrusion from 15 to 20 days and the precipitation change in the future, the consideration of changing behaviors such as changing crop calendar (shifting to 15 days sooner), expanding canal cross section in fields and considering the use of salt-tolerant rice varieties are necessary to restrict the adverse effects of saline intrusion.Key words: Agent-based modeling, salinity intrusion, large-scale fields, coastal plain

Ngày nhận bài: 8/6/2017Người phản biện: PGS.TS. Hoàng Thái Đại


I. ĐẶT VẤN ĐỀQuảng Nam là tỉnh thuộc vùng Duyên hải Nam

Trung bộ, có tổng diện tích tự nhiên là 1.043.837 ha, trong đó 72% là đồi núi. Theo số liệu Niên giám Thống kê năm 2015, đất nông nghiệp của tỉnh có khoảng 880.689,5 ha và khoảng 150.000 ha đất chưa sử dụng, điều này chứng tỏ tiềm năng về nông nghiệp của tỉnh là khá lớn (Cục Thống kê tỉnh

Quảng Nam, 2015). Với xu hướng chuyển dịch kinh tế, các câu hỏi đặt ra cho các nhà quản lý là: Làm thế nào để tiếp tục duy trì và phát triển ổn định sản xuất nông nghiệp với quỹ đất hạn chế? Chuyển đổi cơ cấu cây trồng nông nghiệp thế nào là phù hợp ở từng vùng đất khác nhau? Để phục vụ công nghiệp hóa và đô thị hóa, vùng đất nào nên chuyển đổi và vùng nào nên sử dụng cho mục đích nông

110


nghiệp? Phương pháp canh tác thế nào là phù hợp để vừa khai thác tiềm năng vừa giảm hạn chế của tài nguyên đất?... Để trả lời được những câu hỏi này, trước hết cần thiết phải hiểu rõ tiềm năng và hạn chế của tài nguyên đất đai tạo cơ sở khoa học cho những giải pháp quản lý tài nguyên đất đai một cách toàn diện và chuyển đổi cơ cấu cây trồng phù hợp đối với nhiều diện tích đang sản xuất kém hiệu quả như các vùng đất bị thoái hóa, hạn hán, phèn hóa, nhiễm mặn cục bộ trên địa bàn tỉnh.

Cho đến nay cơ sở dữ liệu khoa học về chất lượng đất đai của tỉnh Quảng Nam vẫn chưa hoàn thiện. Mặc dù đã có khá nhiều nghiên cứu về đất tại Quảng Nam, nhưng đa số các tài liệu này đã cũ, chưa được đồng bộ hóa với nhau, hầu như không thể liên kết với nhau trong quá trình sử dụng. Mặt khác, các bản đồ thổ nhưỡng được xây dựng từ trước đến nay thường được xây dựng theo hệ phân loại đất của Việt Nam, chưa được chi tiết hóa và định lượng như hệ phân loại đất của FAO-UNESCO-WRB (FAO, 1991). Vì vậy, việc điều tra bổ sung, chỉnh lý, xây dựng bản đồ thổ nhưỡng đất nông nghiệp tỉnh Quảng Nam theo hệ phân loại đất của FAO-UNESCO-WRB sẽ giải quyết được triệt để các vấn đề còn tồn tại từ trước đến nay về nguồn tài nguyên đất của tỉnh. Bài báo này trình bày kết quả tổng hợp đánh giá của nhóm nghiên cứu về đặc điểm đất nông nghiệp tỉnh Quảng Nam.


2.1. Vật liệu nghiên cứuCác phẫu diện đất và mẫu đất phân tích dùng để

nghiên cứu được thu thập trên diện tích 880.689,5 ha đất nông nghiệp tỉnh Quảng Nam (Theo Biểu 04/TKĐĐ 2014).

2.2. Phương pháp nghiên cứu- Đào, mô tả phẫu diện, lấy mẫu đất phân tích

theo phương pháp của FAO/ISRIC và Tiêu chuẩn Quốc gia (TCVN 9487:2012). Tổng số phẫu diện thu thập là 2.200 phẫu diện, trong đó 250 phẫu diện chính và 1.950 phẫu diện phụ. Ngoài ra, còn thu thập thêm 630 mẫu đất nông hóa phục vụ đánh giá độ phì nhiêu tầng mặt đất.

- Phân tích mẫu đất theo Tiêu chuẩn Quốc gia (TCVN) và theo Sổ tay phân tích của Viện Thổ nhưỡng Nông hóa (Viện Thổ nhưỡng Nông hóa, 1998). Các chỉ tiêu phân tích gồm: Dung trọng; tỷ trọng; thành phần cấp hạt; cacbon hữu cơ (OC); đạm, lân, kali tổng số; lân, kali dễ tiêu; Al3+, H+, pHKCl, Ca++, Mg++, Na+, CEC, BS, tổng số muối tan và lưu huỳnh tổng số.

- Phân loại đất: Áp dụng hệ phân loại của FAO-UNESCO-WRB 2006.

- Xây dựng bản đồ đất: Áp dụng Tiêu chuẩn Quốc gia (TCVN 9487:2012) về Quy trình điều tra, thành lập bản đồ đất tỷ lệ trung bình và lớn và ứng dụng Hệ thống Thông tin địa lý (GIS) để xây dựng bản đồ.

- Xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel.


3.1. Kết quả phân loại và xây dựng bản đồ đất tỉnh Quảng Nam

Trên cơ sở điều tra, phân loại đất, đất nông nghiệp tỉnh Quảng Nam được chia thành 07 nhóm đất chính, 18 đơn vị đất, 36 đơn vị đất phụ, được thể hiện trong bảng 1.

3.2. Đặc điểm phát sinh, hình thành và phân bố đất nông nghiệp tỉnh Quảng Nam

Đặc điểm phát sinh, hình thành đất tại Quảng Nam được chia thành 3 kiểu chính:

- Kiểu 1: Gồm những nhóm đất Leptosols, Nitisols, Acrisols. Đây là những loại đất hình thành tại chỗ trên nhiều dạng địa hình khác nhau từ dạng đồi thấp đến địa hình núi cao, thường chịu tác động mạnh mẽ của quá trình rửa trôi bề mặt. Mẫu chất khá đa dạng, tuy nhiên có một vài nhóm đất có mẫu chất đặc trưng như nhóm đất Nâu tím (Nitisols) phát triển trên phiến thạch sét; Đất xám giàu mùn trên núi cao hình thành trong điều kiện nhiệt đới ẩm, nhiệt độ nhỏ hơn 15OC trên mẫu chất axít (hoặc nghèo kiềm) như: Granít, gơnai... và mẫu chất khác như: Đá cát, đá vôi... trên các đỉnh núi cao.

- Kiểu 2: Luvisols, Regosols là những nhóm đất hình thành do quá trình tích lũy các sản phẩm dốc tụ. Nhóm đất Luvisols được hình thành từ các sản phẩm dốc tụ của các loại đá mẹ giàu kiềm, đặc biệt là đá vôi, tại các nơi có địa hình thấp, dưới chân các sườn dốc hoặc hình thành ngay tại sườn dốc thoải (0 - 8O). Nhóm đất Dốc tụ (Regosols) được hình thành do những sản phẩm xói mòn từ đồi núi đổ xuống theo dòng chảy được tích tụ lại; phân bố tại các thung lũng, vùng ven chân đồi hoặc lưng sườn đồi, núi thoải.

- Kiểu 3: Gồm nhóm đất Fluvisols, Arenosols hình thành trên trầm tích phù sa. Nhóm đất phù sa hình thành do sự bồi đắp phù sa của các con sông, suối lớn chảy qua địa bàn như sông Thu Bồn, Vu Gia... phân bố thành vùng dọc theo các con sông. Riêng các đất phù sa có tầng phèn hoặc phù sa bị nhiễm mặn và đất cát biển là hỗn hợp của các trầm tích sông - biển, nơi có sự ảnh hưởng qua lại giữa nước phù sa ngọt và nước thủy triều mặn. Đất cát tại

111


Bảng 1. Bảng phân loại đất và diện tích các loại đất nông nghiệp tỉnh Quảng Nam (ha)

Ký hiệu Tên đất FAO-UNESCO-WRB Tên đất Việt Nam Diện tích %

DTĐT%

DTTNLP 1. Leptosols Đất tầng mỏng 3.087,8 0,35 0,29 LPli 1.1. Lithic Leptosols Đất tầng mỏng có tầng đá cứng 500,0 0,06 0,05

LPli.dy 1. Dystri- Lithic Leptosol Đất tầng mỏng có tầng đá cứng, chua 500,0 0,06 0,05

LPskh 1.2. Hyperskeletic Leptosols Đất tầng mỏng nhiều sỏi sạn 53,6 0,01 0,01

LPskh.dy 2. Dystri- Hyperskeletic Leptosol Đất tầng mỏng nhiều sỏi sạn, chua 53,6 0,01 0,01

LPha 1.3. Haplic Leptosols Đất tầng mỏng điển hình 2.534,2 0,29 0,24 LPha.sk 3. Skeleti- Haplic Leptosol Đất tầng mỏng điển hình, sỏi sạn 2.534,2 0,29 0,24 FL 2. Fluvisols Đất phù sa 43.704,7 4,96 4,13 FLsz 2.4. Salic Fluvisols Đất phù sa nhiễm mặn 6.236,8 0,71 0,59

FLsz.tit 4. Protothioni- Salic Fluvisol Đất phù sa nhiễm mặn, có tầng phèn tiềm tàng 566,1 0,06 0,05

FLsz.ar 5. Areni- Salic Fluvisol Đất phù sa nhiễm mặn, cơ giới nhẹ 5.670,7 0,64 0,54 FLgl 2.5. Gleyic Fluvisols Đất phù sa glây 5.867,6 0,67 0,55 FLgl.dy 6. Dystri- Gleyic Fluvisol Đất phù sa glây, chua 5.867,6 0,67 0,55 FLha 2.6. Haplic Fluvisols Đất phù sa điển hình 31.600,3 3,59 2,99

FLha.tit 7. Thioni- Haplic Fluvisol Đất phù sa điển hình, có tầng phèn tiềm tàng 2.274,4 0,26 0,22

FLha.dy 8. Dystri- Haplic Fluvisol Đất phù sa điển hình, chua 7.229,0 0,82 0,68 FLha.eu 9. Eutri- Haplic Fluvisol Đất phù sa điển hình, ít chua 14.461,1 1,64 1,37 FLha.ar 10. Areni- Haplic Fluvisol Đất phù sa điển hình, cơ giới nhẹ 7.289,9 0,83 0,69

FLha.sl 11. Silti- Haplic Fluvisol Đất phù sa điển hình, cơ giới trung bình 346,1 0,04 0,03

NT 3. Nitisols Đất nâu tím 18.697,2 2,12 1,77 NTha 3.7. Haplic Nitisols Đất nâu tím điển hình 18.697,2 2,12 1,77 NTha.dy 12. Dystri- Haplic Nitisol Đất nâu tím điển hình, chua 18.697,2 2,12 1,77 AC 4. Acrisols Đất xám 778.419,1 88,39 73,61 ACvt 4.8. Vetic Acrisols Đất xám nghèo bazơ 73.954,5 8,40 6,99 ACvt.sk 13. Skeleti- Vetic Acrisol Đất xám nghèo bazơ, sỏi sạn 60.853,9 6,91 5,75 ACvt.ar 14. Areni- Vetic Acrisol Đất xám nghèo bazơ, cơ giới nhẹ 13.100,6 1,49 1,24 ACpt 4.9. Plinthic Acrisols Đất xám có tầng loang lổ 14.034,2 1,59 1,33

ACpt.ar 15. Areni- Plinthic Acrisol Đất xám có tầng loang lổ, cơ giới nhẹ 14.034,2 1,59 1,33

ACst 4.10. Stagnic Acrisols Đất xám đọng nước 8.878,7 1,01 0,84

Quảng Nam có hai loại với hai nguồn gốc khác nhau: (i) Đất cát nội địa: Hình thành do những sản

phẩm xói mòn từ đồi núi đổ xuống theo dòng chảy được tích tụ lại; phân bố dưới dạng các đồng bằng ven sông, suối.

(ii) Đất cát biển: Được hình thành trong thời kỳ Đệ tứ cho đến những thời gian hiện đại, là sản phẩm của hai quá trình: Nâng cao khu vực bờ và bồi tụ tạo lập đồng bằng.

112


Ký hiệu Tên đất FAO-UNESCO-WRB Tên đất Việt Nam Diện tích %

DTĐT%

DTTN

ACst.dyh 16. Hyperdystri- Stagnic Acrisol Đất xám đọng nước, rất chua 6.257,5 0,71 0,59

ACst.sk 17. Skeleti- Stagnic Acrisol Đất xám đọng nước, sỏi sạn 434,0 0,05 0,04 ACst.ar 18. Areni- Stagnic Acrisol Đất xám đọng nước, cơ giới nhẹ 2.187,2 0,25 0,21 ACha 4.11. Haplic Acrisols Đất xám điển hình 681.551,7 77,39 64,45 ACha.fr 19. Ferri- Haplic Acrisol Đất xám điển hình, kết von 25.190,3 2,86 2,38 ACha.hu 20. Humi- Haplic Acrisol Đất xám điển hình, giàu mùn 101.716,8 11,55 9,62

ACha.dyh 21. Hyperdystri- Haplic Acrisol Đất xám điển hình, rất chua 15.446,1 1,75 1,46

ACha.pf 22. Profondi- Haplic Acrisol Đất xám điển hình, cơ giới đồng nhất 44.595,3 5,06 4,22

ACha.sk 23. Skeleti- Haplic Acrisol Đất xám điển hình, sỏi sạn 136.989,4 15,55 12,95 ACha.ar 24. Areni- Haplic Acrisol Đất xám điển hình, cơ giới nhẹ 297.839,4 33,82 28,17 ACha.cr 25. Chromi- Haplic Acrisol Đất xám điển hình, sáng màu 59.774,4 6,79 5,65 LV 5. Luvisols Đất đen 3.546,2 0,40 0,34 LVha 5.12. Haplic Luvisols Đất đen điển hình 3.546,2 0,40 0,34 LVha.sk 26. Skeleti- Haplic Luvisol Đất đen điển hình, sỏi sạn 3.546,2 0,40 0,34 AR 6. Arenosols Đất cát 16.960,4 1,93 1,60 ARns 6.13. Endosalic Arenosols Đất cát có tầng nhiễm mặn sâu 58,7 0,01 0,01

ARns.pr 27. Proti- Endosalic Areno-sol

Đất cát có tầng nhiễm mặn sâu, không xuất hiện tầng chuẩn đoán 58,7 0,01 0,01

ARng 6.14. Endogleyic Arenosols Đất cát glây sâu 719,6 0,08 0,07

ARng.dy 28. Dystri- Endogleyic Arenosol Đất cát glây sâu, chua 719,6 0,08 0,07

ARha 6.15. Haplic Arenosols Đất cát điển hình 16.182,1 1,84 1,53 ARha.dy 29. Dystri- Haplic Arenosol Đất cát điển hình, chua 16.182,1 1,84 1,53 RG 7. Regosols Đất dốc tụ 16.274,0 1,85 1,54 RGlp 7.16. Leptic Regosols Đất dốc tụ tầng đá nông 127,5 0,01 0,01 RGlp.dy 30. Dystri- Leptic Regosol Đất dốc tụ tầng đá nông, chua 127,5 0,01 0,01 RGst 7.17. Stagnic Regosols Đất dốc tụ đọng nước 10.357,1 1,18 0,98 RGst.hu 31. Humi- Stagnic Regosol Đất dốc tụ đọng nước, giàu mùn 206,0 0,02 0,02 RGst.dy 32. Dystri- Stagnic Regosol Đất dốc tụ đọng nước, chua 7.985,0 0,91 0,76 RGst.sk 33. Skeleti- Stagnic Regosol Đất dốc tụ đọng nước, sỏi sạn 2.132,2 0,24 0,20 RGst.ar 34. Areni- Stagnic Regosol Đất dốc tụ đọng nước, cơ giới nhẹ 33,9 0,00 0,00 RGha 7.18. Haplic Regosols Đất dốc tụ điển hình 5.789,4 0,66 0,55 RGha.dy 35. Dystri- Haplic Regosol Đất dốc tụ điển hình, chua 2.034,8 0,23 0,19 RGha.sk 36. Skeleti- Haplic Regosol Đất dốc tụ điển hình, sỏi sạn 3.754,6 0,43 0,36 Tổng diện tích điều tra (DTĐT)/Đất nông nghiệp 880.689,5 100,00 83,28 Tổng diện tích không điều tra 176.784,9 16,72 Tổng diện tích tự nhiên (DTTN) 1.057.474,4 100,00

Bảng 1. Bảng phân loại đất và diện tích các loại đất nông nghiệp tỉnh Quảng Nam (ha) (Tiếp)

113


3.3. Tính chất lý, hóa học của các nhóm đất

3.3.1. Nhóm đất tầng mỏng (Leptosols - LP)Đất tầng mỏng có diện tích 3.087,8 ha, chiếm

0,35% diện tích điều tra; xuất hiện nhiều tại huyện Nam Trà My. Đất có nhiều sỏi sạn và đá lẫn (>70%); thành phần cơ giới là thịt pha sét và cát. Đất khá chặt, dung trọng trên 1,35 g/cm3. Độ xốp 48 - 51%. Đất chua, pHKCl từ 3,5 - 4,1. Dung tích hấp thu trung bình thấp, khoảng 10,1 - 14,5 meq/100 g đất. Hàm lượng các bon hữu cơ tầng mặt ở mức trung bình, khoảng 1,5% OC. Đạm tổng số cũng đạt mức trung bình ở tầng mặt (0,13 - 0,16% N) và giảm đi rõ rệt ở các tầng đất sâu hơn (khoảng 0,06 - 0,08% N). Lân tổng số trung bình, khoảng 0,09 - 0,14% P2O5, tuy nhiên lân dễ tiêu trong đất thấp, thường < 5,0 mg P2O5/100 g đất. Kali tổng và dễ tiêu trong đất đều ở mức thấp, lần lượt nhỏ hơn 1,0% K2O và 10 mg K2O/100 g đất, ngoại trừ tầng mặt có kali dễ tiêu khoảng 10,0 - 15,0 mg/100 g đất.

3.3.2. Nhóm đất phù sa (Fluvisols - FL)Đất phù sa có diện tích 43.704,7 ha, chiếm 4,96%

diện tích điều tra, phân bố thành các vùng dọc theo các con sông, có ở tất cả các huyện trong tỉnh, tập trung nhiều nhất tại Thị xã Điện Bàn, các huyện Đại Lộc và Thăng Bình. Phần lớn đất có tầng dày trên 100 cm. Thành phần cơ giới biến động lớn, từ thịt, thịt pha sét và cát đến thịt pha sét. Đất hơi chặt, dung trọng khoảng 1,23 - 1,42 g/cm3. Độ xốp tầng mặt đạt trên 50%. Đất có pHKCl từ 3,5 - 5,2, đối với đất phù sa có tầng đất mặt bị nhiễm mặn thường có pH cao hơn hẳn các đất phù sa còn lại. Tổng các cation kiềm trao đổi trung bình thấp, từ 3,24 - 3,50 meq/100 g đất (Đất phù sa ít chua có tổng các cation trao đổi cao hơn so với các đất phù sa khác, lên tới 5,0 - 6,0 meq/100 g đất). Dung tích hấp thu chỉ đạt mức trung bình thấp, từ 11,8 - 12,3 meq/100 g đất; ngoại trừ Đất phù sa có tầng phèn tiềm tàng và Đất phù sa nhiễm mặn có dung tích hấp thu ở mức trung bình đến khá, khoảng 15,0 - 25,0 meq/100 g đất. Các bon hữu cơ tổng số (OC%) trung bình, từ 0,8 - 1,1% OC (tầng mặt có thể lên tới 2,0% OC). Đối với Đất phù sa glây và Đất phù sa có tầng phèn tiềm tàng, OC cao hơn so với đất phù sa khác khoảng 1,5 - 2,0 lần. Đạm tổng số trung bình, từ 0,08 - 0,15% N và có xu hướng giảm dần theo độ sâu tầng đất. Lân tổng số ở mức trung bình, khoảng 0,08 - 0,11% P2O5 (một số mẫu tầng mặt đạt mức giàu có thể tới 0,41% P2O5). Tuy nhiên, lân dễ tiêu trong đất ở mức thấp, phần lớn nhỏ hơn 5,0 mg P2O5/100 g đất. Tương tự, kali tổng số cũng ở mức trung bình (1,00 - 1,25% K2O) còn kali dễ tiêu ở mức thấp, phần lớn nhỏ hơn 10,0 mg K2O/100 g đất (trừ một vài mẫu tầng mặt của đất

phù sa điển hình, ít chua có kali dễ tiêu đạt mức 18,1 mg K2O/100 g đất). Độ no bazơ khoảng 30 - 50%, các đất phù sa có đặc tính ít chua cao hơn, khoảng 50 - 80%.

3.3.3. Nhóm đất nâu tím (Nitisols - NT)Đất nâu tím có diện tích 18.697,2 ha, chiếm

2,12% diện tích điều tra, phân bố chủ yếu tại các huyện Tây Giang, Đông Giang và Đại Lộc. Đất có tầng dày thường trên 100 cm; thành phần cơ giới từ trung bình đến nặng. Dung trọng khoảng 1,20 - 1,33 g/cm3. Độ xốp đạt khoảng 48 - 50 %. Đất có phản ứng chua vừa; pHKCl khoảng 4,0 - 4,5. CEC trong đất trung bình thấp, khoảng 9,55 - 12,28 meq/100 g đất. Độ no bazơ trung bình, khoảng 45 - 50 %. Hàm lượng cacbon hữu cơ tầng mặt đạt mức trung bình, từ 1,2 - 1,4 % OC. Đạm tổng số đạt thấp đến trung bình, từ 0,09 - 0,15 % N. Lân tổng số trung bình, trong khoảng 0,06 - 0,08 % P2O5; lân dễ tiêu trung bình, từ 5,47 - 9,74 mg P2O5/100 g đất. Kali tổng số trung bình, trong khoảng 1,10 - 1,50 % K2O, song kali dễ tiêu lại ở mức thấp đến rất thấp, thường dưới 5,5 mg K2O/100 g đất.

3.3.4. Nhóm đất xám (Acrisols - AC)Đất xám có diện tích 778.419,1 ha; chiếm 88,39%

diện tích đất điều tra; xuất hiện tại hầu hết các huyện trong tỉnh Quảng Nam. Đất có tầng dày từ 70 - 100 cm; tỷ lệ đá lẫn khá nhiều đối với Đất xám nghèo bazơ và Đất xám điển hình (từ 20 - 40%); Đất xám đọng nước tỷ lệ đá lẫn ít hơn (< 10%). Đất có thành phần cơ giới từ thịt pha cát, limon đến thịt pha sét. Đất hơi chặt, dung trọng trung bình, từ 1,25 - 1,40 g/cm3. Độ xốp tầng đất mặt khoảng 50 - 52%. Đất có pHKCl đạt từ 3,5 - 4,9. Tổng các cation kiềm trao đổi ở mức thấp tới trung bình thấp, khoảng 2,6 - 2,9 meq/100 g đất. CEC từ trung bình đến thấp, khoảng 8,5 - 14,5 meq/100 g đất. Hàm lượng cacbon hữu cơ ở mức trung bình thấp, từ 0,95 - 1,34% OC, ở tầng mặt cao hơn, đặc biệt là trong Đất xám điển hình, giàu mùn. Đạm tổng số trung bình thấp, khoảng 0,09 - 0,12% N (tầng mặt ở mức 0,15 - 0,18 %N). Lân tổng số trung bình, khoảng 0,06 - 0,09 % P2O5, lân dễ tiêu khá nghèo, thường < 5,0 mg P2O5/100 g đất. Kali tổng số và dễ tiêu đều ở mức thấp, lần lượt từ 0,11 - 0,83% K2O và 5,5 - 12,5 mg K2O/100 g đất.

3.3.5. Nhóm đất đen (Luvisols - LV)Đất đen có diện tích 3.546,2 ha, chiếm 0,40 %

diện tích đất điều tra; chỉ gặp tại các huyện Nam Giang và Phước Sơn. Đất có tỷ lệ đá lẫn khá nhiều, từ 20 - 30%; thành phần cơ giới từ thịt pha sét và cát đến thịt pha sét. Đất khá chặt, dung trọng từ 1,22 - 1,41 g/cm3; độ xốp tầng đất mặt khoảng 50,0 - 53,0%. Đất có pHKCl từ 4,9 - 5,4. Tổng các cation

114


kiềm trao đổi ở mức rất cao, trong khoảng 8,5 - 10,5 meq/100 g đất. Dung tích hấp thu cao, từ 18,5 - 25,5 meq/100 g đất. Hàm lượng cácbon hữu cơ cao, từ 0,88 - 1,56 % OC (tầng mặt thường cao hơn khoảng 1,5 - 2 lần). Hàm lượng đạm tổng số ở mức trung bình đến cao, từ 0,10 - 0,18% N (tầng đất mặt khá cao từ 0,18 - 0,25% N). Lân tổng số cao, dao động từ 0,12 - 0,16% P2O5. Tuy nhiên, lân dễ tiêu lại ở mức trung bình thấp, khoảng 3,0 - 5,0 mg P2O5/100 g đất. Kali tổng số và dễ tiêu đều ở mức thấp, thường < 1,0 % K2O và < 10,0 mg K2O/100 g đất. Ngoại trừ một số tầng đất mặt có hàm lượng kali dễ tiêu ở mức trung bình, từ 10,5 - 15,5 mg K2O/100 g đất. Độ no bazơ khoảng 50 - 80%.

3.3.6. Nhóm đất cát (Arenosols - AR)Đất cát có diện tích 16.960,4 ha; chiếm 1,93% diện

tích đất điều tra; Nhóm đất này xuất hiện chủ yếu tại các huyện Thăng Bình, Núi Thành, TX. Điện Bàn và rải rác ở các huyện khác trong tỉnh. Đất có tầng dày từ 80 - 100 cm, tỷ lệ đá lẫn và cát thô cao (từ 25 - 35%); thành phần cơ giới nhẹ. Đất có dung trọng khoảng 1,30 - 1,40 g/cm3; độ xốp tầng mặt đạt trên 50%. Đất có pHKCl từ 4,1 - 4,6. Độ chua tiềm tàng thấp, từ 3,0 - 3,8 meq/100 g đất. Dung tích hấp thu thấp, từ 2,3 - 11,5 meq/100 g đất. Độ no bazơ khá, từ 20 - 60%. Đất cát có hàm lượng cacbon hữu cơ nghèo 0,16 - 1,17% OC. Đạm tổng số nghèo từ 0,05 - 0,07% N. Lân tổng số và kali tổng số rất thấp, tương ứng từ 0,03 - 0,04% P2O5 và 0,11 - 0,85% K2O. Lân dễ tiêu và kali dễ tiêu nghèo, tương ứng từ 0,27 - 1,07 mg P2O5/100 g đất và 2,0 - 4,5 mg K2O/100 g đất.

3.3.7. Nhóm đất dốc tụ (Regosols - RG)Nhóm đất dốc tụ có diện tích 16.274,0 ha; chiếm

1,85% diện tích điều tra; xuất hiện ở tất cả các huyện trong tỉnh. Đất có tầng dày từ 80 - 100 cm, tỷ lệ đá lẫn và cát thô cao (từ 15 - 28%); thành phần cơ giới từ cát pha thịt đến thịt. Dung trọng trung bình, từ 1,25 - 1,35 g/cm3. Độ xốp tầng mặt đạt trên 50%. Đất khá tơi xốp ở tầng mặt, các tầng dưới đất chặt hơn. Đất có pHKCl từ 4,0 - 4,4. Tổng các cation kiềm trao đổi thấp, phần lớn nhỏ hơn 5,5 meq/100 g đất. Dung tích hấp thu ở mức trung bình đến thấp, khoảng 8,50 - 13,5 meq/100 g đất. Hàm lượng cácbon hữu cơ tổng số trung bình thấp, từ 0,90 - 1,25% OC. Đạm tổng số cũng ở mức trung bình thấp, trong khoảng 0,08 - 0,15% N. Lân tổng số ở mức trung bình, từ 0,05 - 0,11 % P2O5, tuy nhiên lân dễ tiêu lại khá thấp, thường nhỏ hơn 5,0 mg P2O5/100 g đất. Hàm lượng kali tổng số ở mức trung bình (từ 1,0 - 1,16% K2O) và kali dễ tiêu ở mức thấp, nhỏ hơn 10,0 mg K2O/100 g đất.


4.1. Kết luậnVề số lượng, đất nông nghiệp tỉnh Quảng Nam

theo hệ phân loại FAO-UNESCO-WRB (2006) bao gồm 07 nhóm đất, 18 đơn vị đất và 36 đơn vị đất phụ, với diện tích mỗi nhóm đất như sau: đất tầng mỏng có 3.087,8 ha; đất phù sa có 43.704,7 ha; đất nâu tím có 18.697,2 ha; đất xám có 778.419,1 ha; đất đen có 3.546,2 ha; đất cát có 16.960,4 ha và đất dốc tụ có 16.274,0 ha.

Về chất lượng đất, phần lớn các nhóm đất có tầng đất khá dày; thành phần cơ giới biến động từ cát, cát pha đến thịt nặng pha sét; dung trọng trung bình; phản ứng đất từ chua đến ít chua; tổng cation kiềm trao đổi trung bình đến rất thấp; OC và đạm trung bình đến cao ở các nhóm đất phù sa, đất đỏ, đất đen, đất dốc tụ, các nhóm đất khác ở mức nghèo; lân tổng số ở mức thấp đến trung bình thấp; kali tổng số và dễ tiêu đều ở mức thấp đến trung bình thấp, đối với nhóm đất phù sa và đất tầng mỏng hàm lượng kali khá hơn.

Trong 07 nhóm đất của tỉnh Quảng Nam, có 02 nhóm đất thuận lợi hơn cho sản xuất nông nghiệp là đất phù sa và đất đen. Nhóm đất xám cũng là nhóm đất có khả năng sử dụng đa dạng cho sản xuất nông nghiệp. Đất tầng mỏng cần đặc biệt quan tâm bảo vệ. Đất cát và đất dốc tụ cần được sử dụng hợp lý cho cây trồng.

4.2. Kiến nghịQuảng Nam có tài nguyên đất đai phong phú, đa

đạng và có nét đặc thù; tài nguyên này cần được sử dụng hợp lý, đúng mục đích, phù hợp với môi trường sinh thái và điều kiện tự nhiên, kinh tế - xã hội của tỉnh. Tuy nhiên, tài nguyên đất của Quảng Nam đã và đang chịu tác động của nhiều yếu tố tiêu cực như: Rửa trôi, xói mòn, lũ quét, thiếu nước và khô hạn vào mùa khô… Do đó, để sử dụng bền vững nguồn tài nguyên này cần phải quan tâm đến các giải pháp tổng hợp và đồng bộ về bảo vệ, cải tạo, nâng cao độ phì nhiêu và khả năng sản xuất của đất.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Cục Thống kê tỉnh Quảng Nam, 2015. Niên giám thống

kê tỉnh Quảng Nam 2015. Tiêu chuẩn Quốc gia (TCVN 9487:2012). Quy trình

điều tra, lập bản đồ đất tỷ lệ trung bình và lớn. Bộ Khoa học và Công nghệ công bố, 2012.

Viện Thổ nhưỡng Nông hóa, 1998. Sổ tay phân tích đất, nước, phân bón, cây trồng. NXB Nông nghiệp. Hà Nội.

115


FAO, 1991. Guidelines for Distinguishing Soil Subunits in the FAO/UNESCO/ISRIC. Rev. Legend. World Soil Resources Report (Annex 1). 3rd Draft. Rome.

FAO, 2006. World Reference Base for Soil Resources, World Soil Resources Reports No. 103, Rome.

Properties of agricultural soil in Quang Nam provincePham Duc Thu, Hoang Trong Quy, Dinh Van Ha

AbstractThe results of studying agricultural soil quantity and quality of Quang Nam province at soil map scale of 1:100,000 following FAO-UNESCO-WRB classification system (2006) show that the studied soil in this area is divided into 07 groups, 18 units, 36 subunits. These soil types are thick in soil depth. Soil texture varies from sandy to loamy clay; bulk density is medium, from 1.11 to 1.42 g/cm3; the porosity in surface layer is over 50%, suitable for cultivation; soils reaction is from acidic to slightly acidic, pHKCl is from 3.9 to 4.5; CEC is medium to low, approximately from 8.0 to 15.0 meq/100 g of soil; total exchangeable base cations is from medium to low, about 1.15 - 10.50 meq/100 g of soil; base saturation oscillates from 30 to 50%, higher in Eutri- Haplic Fluvisols, Luvisols (from 50 - 80%); OC and total nitrogen contents are medium to high in Fluvisols, Luvisols, Regosols and a part of Leptosols, and low in others; total and available phosphorus are low to lowly medium, from 0.05% to 0.09% P2O5 and less than 8.0 mg P2O5/100 g of soil, except in Luvisols, of which these contents reaches quite high amount; both of total and available potassium contents are in low to lowly medium, about 0.08 - 0.89% K2O and less than 10.0 mg K2O/100 g of soil, respectively, except in Fluvisols and Leptosols which have higher amount of these contents.Key words: Soil properties, agricultural soil, Quang Nam, soil classification

Ngày nhận bài: 20/5/2017Người phản biện: PGS.TS. Hồ Quang Đức


1 Trung tâm Nghiên cứu Đất, Phân bón và Môi trường Phía Nam - Viện Thổ nhưỡng Nông hóa

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT ĐẤT CHỌN LỌC VÙNG TRỒNG BƯỞI TÂN TRIỀU, HUYỆN VĨNH CỬU, TỈNH ĐỒNG NAI

Lê Minh Châu1, Nguyễn Bích Thu1

TÓM TẮTVùng đất Tân Triều là nơi trồng bưởi đặc sản danh tiếng ở huyện Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai. Với mục tiêu đánh

giá chất lượng đất vùng bưởi Tân Triều, 70 mẫu đất trồng được thu thập tại các 5 xã của Huyện Vĩnh Cửu, trên tổng diện tích 678 ha và tiến hành phân tích đánh giá. Kết quả phân tích cho thấy đất trồng bưởi Tân Triều có thành phần cơ giới từ thịt trung bình đến thịt nặng, đất chua với pHH2O ở tầng canh tác từ 4,4 - 5,2; pHKCl từ 3,9 - 4,0; dung tích hấp thu CEC của đất từ mức trung bình đến cao (11,86 - 17,60 meq/100g). Đất trồng bưởi Tân Triều giàu cation Ca2+ và Mg 2+ trao đổi; lân dễ tiêu và kali dễ tiêu của đất từ mức trung bình đến giàu. Thành phần vi lượng đối với đất trồng bưởi Tân Triều tương đối giàu, nhất là hàm lượng mangan (0,63 - 1,23%), kẽm (24,84 - 47,6 mg/kg đất) và sắt cao (1,10 - 1,54%).

Từ khoá: Tính chất đất, bưởi, Tân Triều, chất lượng

I. ĐẶT VẤN ĐỀBưởi Tân Triều đã từ lâu nổi tiếng thơm ngon,

ngọt, vị đặc trưng và đã được Trung tâm Nghiên cứu Cây ăn quả miền Đông Nam bộ đánh giá về chất lượng, nhưng chưa tạo ưu thế cạnh tranh bền vững trên thị trường so với những sản phẩm danh tiếng khác. Với mục tiêu xây dựng thương hiệu và quản lý vùng bưởi Tân Triều, chính quyền tỉnh Đồng Nai và huyện Vĩnh Cửu đã từng bước xây dựng thương hiệu đối với sản phẩm bưởi Tân Triều. Trước đây, vùng Tân Triều có trên 20 giống bưởi, trong đó có

một số giống bưởi chất lượng cao được ưa chuộng như: Đường Lá Cam, Đường Da Láng, Ổi, Đường Núm, Thanh Trà, Thanh Dây, Xiêm… nhưng hiện nay chỉ còn một vài giống chủ lực (Đường Lá Cam và Ổi) trên diện tích khoảng 900 ha (Bùi Xuân Khôi, 2003). Năm 2012, bưởi Tân Triều đã được Cục Sở hữu trí tuệ cấp chứng nhận “chỉ dẫn địa lý”. Vì vậy, việc duy trì chất lượng bưởi Tân Triều, cũng như phát triển giá trị hàng hóa của giống bưởi này là rất cần thiết (Nguyễn Thị Huệ, Nguyễn Bích Thu, Lê Minh Châu, 2011).

116


Để duy trì và nâng cao chất lượng quả bưởi, việc tìm hiểu các tính chất đất là rất cần thiết, là cơ sở khoa học giúp cho việc xây dựng chế độ quản lý dinh dưỡng và bón phân phù hợp cho cây bưởi. Bài báo này trình bày kết quả điều tra, đánh giá một số tính chất hóa học đất vùng trồng bưởi Tân Triều, huyện Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai.


2.1. Vật liệu nghiên cứuĐất trồng bưởi trên 2 nhóm đất chính: Đất phù

sa và đất xám; được phân thành 9 đơn vị phân loại phụ. Bưởi Tân Triều được trồng chủ yếu trên 5 đơn vị bao gồm: Đất phù sa chua, kết von sâu; đất phù sa chua, đọng nước; đất phù sa điển hình, cơ giới trung bình; đất phù sa điển hình, ít chua; đất xám cơ giới nhẹ, nghèo bazơ. Thành phần sét pha limon, thịt pha limon, thịt pha sét và thịt pha sét limon. Tỷ lệ thành phần cấp hạt thích hợp cho đất trồng bưởi: cát từ 12 - 30%, thịt từ 38 - 55% và sét từ 26 - 38%.

Thu thập 70 mẫu đất tại trồng bưởi Tân Triều, cụ thể tại các xã Bình Hòa (16 mẫu), Tân Bình (32 mẫu), Bình Lợi (10 mẫu), Thiện Tân (6 mẫu) và Tân An (6 mẫu) đã nhiều năm, đang cho quả và chuẩn bị thu hoạch. Mẫu đất được lấy ở tầng đất mặt (đến độ sâu 60 cm). Các điểm lấy mẫu được định vị vi trí tọa độ để quản lý dữ liệu bằng GIS.

2.2. Chỉ tiêu và phương pháp phân tíchĐất cung cấp dinh dưỡng và những chất thiết yếu

cho quá trình hình thành và phát triển của cây bưởi. Để đánh giá chất lượng đất trồng bưởi vùng Tân Triều và xác định tương quan mối quan hệ giữa tính chất đất vùng trồng bưởi với chất lượng quả bưởi. Các chỉ tiêu cần thiết phân tích gồm: thành phần cấp hạt (cát, thịt, sét), pHH2O, pHKCl, EC, OC, N tổng số, P2O5 tổng số và dễ tiêu, K2O tổng số và dễ tiêu, Ca2+, Mg2+, Al3+, B, Fe, Mn, Cu, Zn.

Phương pháp phân tích: Thành phần cấp hạt (TCVN 8567:2010); độ chua (TCVN 4403:2010); cacbon hữu cơ (TCVN 4050:1985); dinh dưỡng đa lượng tổng số: N (TCVN 6498:1995), P2O5 (TCVN 4052:1985), K2O (TCVN 8660:2011); lân dễ tiêu P2O5dt (TCVN 5256:1990), K2Odt (10TCN 372-99); Ca2+, Mg2+ (TCVN 8569:2010), CEC (TCVN 8568:2010) và một số vi lượng Mn, Fe, Cu, Zn (TCVN 8246:2009), B (TCVN 7131:2002).

Số liệu phân tích được đánh giá bằng phương pháp kiểm định giả thuyết (t-hai mẫu) và thống kê để tìm khoảng tin cậy, giá trị xác suất đặc trưng đất trồng bưởi Tân Triều (Tô Cẩm Tú, 1992; Nguyễn Văn Tuấn, 2007).

2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứuThời gian thu thập mẫu và phân tích năm 2010.Địa điểm nghiên cứu tại vùng trồng bưởi Tân

Triều thuộc 5 xã Tân Bình, Bình Lợi, Thiện Tân, Tân An và Bình Hòa thuộc huyện Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai.


3.1. Tính chất đất trồng bưởi Tân TriềuKết quả phân tích 70 mẫu đất cho thấy những đặc

trưng cơ bản của chất lượng đất vùng trồng bưởi Tân Triều, đây là cơ sở quan trọng cho việc xác định tính đặc thù của vùng đất này, cũng như có thể có những biện pháp tác động nhằm nâng cao năng suất và ổn định chất lượng bưởi Tân Triều này.

Thành phần cơ giới là thông số phản ánh hàm lượng các cấp hạt đất. Thông số này có liên quan đến rất nhiều tính chất vật lý và hóa học đất như khả năng giữ ẩm và động thái ẩm, khả năng giữ nhiệt, khí và động thái nhiệt, khí, dung tích hấp thu và điều tiết dinh dưỡng trong đất. Đây là thông số không thể thiếu trong nghiên cứu tính chất và các quá trình thổ nhưỡng của đất. Do đặc điểm địa hình tương đối dốc và nghiên về phía Tây Nam, dòng chảy mang phù sa sông từ thượng nguồn đổ về tích tụ tạo nên các vùng bãi bồi có thành phần cơ giới nặng hơn và tầng mặt có pha cát hạt mịn đến độ sâu 50 cm (Vũ Cao Thái, Phạm Quang Khánh và ctv., 1995). Đất trồng bưởi đường Lá Cam và bưởi Ổi có thành phần cơ giới trung bình đến nặng, chủ yếu là sét pha limon, thịt pha limon, thịt pha sét và thịt pha sét limon. Kết quả thành phần cấp hạt đất trồng bưởi Tân Triều ở tầng canh tác (bảng 1) cho thấy): Đối với tỉ lệ sét, ngưỡng xác định có giá trị dao động từ 12,67 - 29,53%; Đối với tỉ lệ thịt, giá trị dao động từ 38,29 - 55,05%; Đối với tỉ lệ sét, tầng đất có giá trị từ 26,71 - 37,76%.

Độ chua của đất (thông qua trị số pH) phản ánh trạng thái của dung dịch đất. Độ chua trao đổi được xác định bởi hai thông số H+ và Al3+, các ion này có thể tồn tại ở ngoài dung dịch hay trên bề mặt keo đất. Khi tồn tại ở ngoài dung dịch, chúng có thể ảnh hưởng trực tiếp tới rễ cây và vi sinh vật đất. Độ chua là một thước đo quan trọng về trạng thái hóa lý của đất và là một trong các chỉ tiêu xác định độ phì của đất. Trị số pH của đất trồng bưởi Tân Triều tương đối thấp. pHH2O ở tầng canh tác có giá trị trung bình được xác định từ 4,4 - 5,2; pHKCl ở tầng canh tác có giá trị xác định từ 3,9 - 4,6.

Độ dẫn điện của đất liên quan đến sự có mặt của các cation trong dịch đất. Các cation thường xuất hiện là Na+, K+, Ca2+, Mg2+ và 2 anion Cl-, SO4

2-, ngoài ra có một ít NO3

-, CO32- , HCO3

-, PO43-… Độ

117


Bảng 1. Tính chất chung về đất trồng bưởi Tân Triều

Chỉ tiêu n (số mẫu) GTNN GTLN Trung

bìnhĐộ lệch chuẩn

Ngưỡng dưới

Ngưỡng dưới

Cát, % 70 9,34 45,31 21,10 8,43 12,67 29,53Thịt, % 70 22,25 60,32 46,67 8,38 38,29 55,05Sét, % 70 19,90 41,57 32,23 5,52 26,71 37,76pH H2O 70 4,12 5,74 4,80 0,40 4,40 5,20pH KCl 70 3,77 5,22 4,28 0,35 3,93 4,63

EC, µS/cm2 70 19,35 233,00 80,29 50,33 29,96 130,62Ca++, meq/100g 70 1,40 6,20 3,53 1,37 2,16 4,91Mg++,meq/100g 70 0,00 4,30 1,54 0,84 0,70 2,38Al3+, meq/100g 70 0,00 1,82 0,37 0,48 0,00 0,85CEC, meq/100g 70 11,00 22,75 14,73 2,87 11,86 17,60P2O5dt, mg/100g 70 3,00 57,00 25,32 14,38 10,95 39,70K2Odt,mg/100g 70 0,32 113,90 13,95 24,18 0,32 38,14

OC, % 70 0,33 1,54 0,97 0,29 0,68 1,26N, % 70 0,07 0,56 0,11 0,08 0,04 0,19

P2O5, % 70 0,03 0,33 0,11 0,07 0,04 0,18K2O,% 70 0,07 0,16 0,11 0,03 0,09 0,14

Bo, mg/kg 70 4,00 11,00 7,14 1,57 5,57 8,71Mn,% 70 0,29 1,45 0,93 0,30 0,63 1,23Fe,% 70 0,92 1,76 1,32 0,22 1,10 1,54

Cu, mg/kg 70 12,42 42,75 20,32 5,15 15,17 25,47Zn, mg/kg 70 9,42 66,16 36,22 11,38 24,84 47,60

dẫn điện EC trong các mẫu nghiên cứu đất trồng bưởi có giá trị dưới 400 mS/cm chứng tỏ đất trồng không bị nhiễm mặn (thang đo theo Dever và Kadry, 1960). Kết quả đánh giá: không có sự khác biệt độ dẫn điện giữa tầng 1 và tầng 2 (p = 0,519). Giá trị trung bình ở tầng 1 thấp hơn và ít dao động hơn so với tầng 2. Giá trị đặc trưng độ dẫn điện dao động từ 29,96 - 130,62 mS/cm.

Canxi (Ca) và Magie (Mg) là hai nguyên tố kim loại kiềm thổ quan trọng nhất. Ngoài việc tham gia hình thành đặc trưng lý hóa tính quan trọng của đất, chúng còn là những nguyên tố dinh dưỡng quan

trọng sau N, P, K. Cation trao đổi Ca2+ và Mg2+ có giá trị từ thấp đến cao theo thang đánh giá; trên 54% số mẫu được đánh giá trung bình và 20% mẫu ở mức cao. Kết quả xác định: giá trị Ca2+ và Mg2+ trao đổi ở tầng 1 và tầng 2 không có sự sai khác giữa tầng 1 và tầng 2 vì hệ số xác xuất p đều lớn hơn mức ý nghĩa (p=0,05). Giá trị trung bình cộng của các cation không chênh lệch nhiều giữa tầng 1 và tầng 2. Khoảng giá trị được xác định như sau: Đối với Ca2+, giá trị tầng canh tác dao động từ 2,16 - 4,91 meq/100 g; Đối với Mg2+, giá trị tầng canh tác dao động từ 0,70 – 2,38 meq/100 g;

Hàm lượng nhôm (Al) trao đổi trong tầng 1 và tầng 2 thấp (nhỏ hơn 5 meq/100 g). Bằng phương pháp phân tích kiểm định, giá trị Al trao đổi không có sự sai khác giữa tầng 1 và tầng 2. Trị số trung bình ở tầng 1 thấp, khoảng 0,23 meq/100g. Ngoài ra, giá trị Al trao đổi ở tầng 1 có độ lệch chuẩn thấp hơn và có sự ổn định hơn so với tầng 2. Kết quả đặc thù của hàm lượng Al trao đổi ở tầng trao đổi có giá trị từ 0 - 0,85 meq/100 g.

Dung lượng cation trao đổi (CEC) là khả năng hấp thu cation của phức hệ keo đất. Lượng và chất của CEC là một chỉ tiêu quan trọng về độ phì nhiêu của đất phản ánh khả năng chứa và điều hòa dinh dưỡng có liên quan đến việc tính toán phương pháp

bón phân hợp lý. Giá trị CEC trong các mẫu đất canh tác trồng bưởi dao động từ trung bình đến cao. CEC ở tầng 1 và tầng 2 có không sự khác biệt (hệ số p lớn hơn mức ý nghĩa). Trị số trung bình ở tầng 1 và tầng 2 chênh lệch không nhiều và khoảng dao động gần nhau. Tuy nhiên, độ lệch chuẩn ở tầng 2 thấp hơn, thể hiện mức ổn định hơn nhưng không đáng kể. CEC có giá trị từ 11,86 - 17,60 meq/100 g.

Cacbon hữu cơ (OC) trong đất giữ vai trò to lớn trong việc duy trì và nâng cao độ phì nhiêu thực tế của đất, điều tiết dinh dưỡng, chế độ nước, chế độ nhiệt... trong môi trường đất. Có thể nói OC tham gia hầu hết vào các quá trình trao đổi vật chất của đất: vật lý, hóa học, sinh học đất. Hàm lượng OC quyết định

118


nhiều chỉ tiêu độ phì khác như đạm, lân, dung tích hấp thu (CEC), độ no bazơ (BS)... Do đó, OC có ảnh hưởng rất lớn tới khả năng sinh trưởng và phát triển của cây trồng. Trong nghiên cứu ảnh hưởng của tính chất đất tới chất lượng bưởi, OC là một trong số các chỉ tiêu được đặc biệt quan tâm. Theo thang đánh giá của FAO - UNESCO, đất nghiên cứu ở đây có giá trị OC từ thấp đến cao. Kết quả cho thấy hàm lượng OC giữa tầng 1 và tầng 2 có sự sai khác rõ rệt. Trị trung bình của tầng 1 lớn hơn so với tầng 2 và khoảng dao động từ giá trị nhỏ nhất và giá trị lớn nhất cũng khác nhau: 0, 49 - 2,25% (tầng 1) và 0,18 - 1,25% (tầng 2). Độ lệch chuẩn của tầng 2 thấp (hơn ½ giá trị tầng 1), chứng tỏ mức độ ổn định hàm lượng OC. Giá trị đặc thù OC được xác định 0,68 - 1,62%.

Đạm (N) là chất dinh dưỡng đa lượng không thể thiếu đối với cây trồng và có mối quan hệ trong tất cả các quá trình phát triển của cây. N là thành phần chủ yếu của protein thực vật cũng như diệp lục tố. N có tác dụng rõ ràng trong kích hoạt cây phát triển và khỏe mạnh. Hàm lượng N trong đất trồng bưởi có giá trị thấp, phân bố từ mức nghèo đến trung bình. Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng N tổng số giữa tầng 1 và tầng 2 tương đối gần nhau (0,11%). Tuy nhiên, khoảng dao động giữa các giá trị thấp nhất và giá trị lớn nhất khác nhau; tầng 1 có giá trị từ 0,07 - 0,17%; tầng 2 có giá trị 0,06 - 0,98%. Bên cạnh đó, độ lệch chuẩn ở tầng 1 cũng thấp hơn nhiều so với tầng 2, thể hiện mức độ ổn định ở tầng này cao. Tuy nhiên, hàm lượng này phân bố ở tầng 1 và tầng 2 đều không có sự sai khác. Giá trị đặc thù hàm lượng N trong đất trồng bưởi dao động từ 0,04 - 0,19% .

Photpho (P) có tác dụng rất quan trọng trong dinh dưỡng của thực vật, đặc biệt là đối với sự phát triển của rễ và hạt. Nhu cầu P của cây ít hơn so với N nhưng vẫn là yếu tố dinh dưỡng cần thiết cho cây trồng do quyết định khả năng hình thành mầm hoa và phát triển bộ rễ. Theo tài liệu về đất Việt Nam (Hội Khoa học Đất Việt Nam, 2000), hàm lượng P dễ tiêu và P tổng số ở khu vực nghiên cứu được đánh giá từ mức độ trung bình đến giàu. Hàm lân dễ tiêu và tổng số không có sự sai khác giữa tầng 1 và tầng 2. Đối với P dễ tiêu, giá trị trung bình ở tầng 1 cao hơn tầng 2 với khoảng dao động từ giá trị nhỏ nhất đến giá trị lớn nhất cũng hẹp hơn. Do đó, độ lệch chuẩn ở tầng 1 thấp hơn thể hiện mức độ ổn định cao hơn. Khoảng giá trị đặc trưng dao động từ 10,95 - 39,70 mg P2O5/100 g đất. Đối với P tổng số, giá trị trung bình ở tầng 1 và tầng 2 gần bằng nhau nhưng khoảng dao động giữa giá trị thấp và cao nhất của tầng 2 rộng hơn. Do đó, độ lệch chuẩn của tầng 2 biến động nhiều hơn tầng 1 nhưng giá trị này chênh nhau không lớn. Khoảng giá trị đặc trưng dao động từ từ 0,04 - 0,18% P2O5.

Kali (K) là nguyên tố tác động tới chất lượng nông sản do tham gia vào thành phần enzym quyết định khả năng vận chuyển đường đến quả. Hàm lượng K trong đất phụ thuộc vào keo khoáng và hàm lượng sét. Hàm lượng K dễ tiêu trong đất trồng bưởi được đánh giá từ mức thấp đến cao. Trong khi đó, K tổng số dao động từ mức thấp đến trung bình: 49% số mẫu thuộc trung bình, còn lại có hàm lượng thấp. Đối với K dễ tiêu, giá trị trung bình ở tầng 1 cao hơn gấp 3 lần so với tầng 2 và khoảng chênh lệch từ nhỏ nhất đến cao nhất ở tầng 1 rộng hơn. Do đó, độ lệch chuẩn ở tầng 1 lớn hơn, thể hiện mức độ phân tán dữ liệu mẫu rõ rệt. Bằng phương pháp kiểm định thống kê t hai mẫu, giá trị hàm lượng giữa tầng 1 và tầng 2 có sự sai khác rõ rệt. Ngưỡng giá trị đặc thù ở tầng canh tác dao động từ 6,28 - 38,14 mg K2O/100 g đất. Tương tự đối với kali tổng số, trị trung bình giữa 2 tầng không chênh lệch nhiều và giá trị dao động từ nhỏ nhất đến cao nhất không khác biệt nhiều. Do đó, độ lệch chuẩn giữa chúng gần như bằng nhau và có giá trị rất nhỏ, thể hiện sự ổn định, tập trung của dữ liệu mẫu. Giá trị hàm lượng phân bố ở 2 tầng không có sự khác biệt đáng kể. giá trị đặc thù ở tầng canh tác từ 0,09 - 0,14% K2O.

Bo (B) là nguyên tố tác động tới khả năng chống rụng trái, làm tăng chất lượng trái trong thực vật. B ảnh hưởng đến hoạt động của một số enzym nhất định, tăng khả năng thấm ở màng và do đó làm cho việc vận chuyển hydrat cacbon được dễ dàng. Hàm lượng B trong mẫu đất phân tích có hàm lượng thấp. Giá trị trung bình ở tầng 1 cao hơn so với tầng 2 nhưng chênh lệch không lớn. Khoảng dao động giữa giá trị nhỏ nhất và cao nhất tương đối gần nhau. Trong bảng, độ lệch chuẩn tầng 1 thấp hơn so với tầng 2, chứng tỏ mức độ ổn định giá trị mẫu ở tầng này cao. Hàm lượng B phân bố trong cả hai tầng không có sự sai khác về mặt ý nghĩa thống kê. Ngoài ra, giá trị hàm lượng B còn được phân tích toàn bộ dữ liệu mẫu để xác định đặc thù của yếu tố này. Tần số mẫu xuất hiện ở tầng canh tác khoảng 73%. Kết quả xác định giá trị dao động từ 5,57 - 8,71 mg B/kg đất.

Mangan (Mn) được biết đến như một chất oxy hóa của thực vật. Thiếu Mn lá có thể xuất hiện những đốm xám hoặc vàng thẫm ở chung quanh rìa lá. Cũng giống như Fe, triệu chứng thiếu Mn thường xảy ra trên vùng đất đá vôi vì Mn bị kết tủa ở đất có pH lớn hơn 5. Đối với mẫu phân tích trên đất trồng bưởi, hàm lượng Mn cao, giúp cho việc kích thích enzym và sinh lý cây trồng, tăng cường khả năng quang hợp… Hàm lượng Mn ở tầng 1 là 0,98% cao hơn so với tầng 2 (0,88%), chênh nhau 0,1%. Khoảng dao động giữa giá trị nhỏ nhất và giá trị lớn nhất ở tầng 1 rộng hơn ở tầng 2 nên độ lệch chuẩn ở tầng này cao hơn. Tuy nhiên, giá trị hơn nhau không

119


nhiều nhưng thể hiện mức độ ổn định của tầng 2 cao hơn tầng 1. Xét về mặt thống kê, hàm lượng Mn phân bố ở tầng 1 và tầng 2 không có sự khác biệt nhau. Giá trị đặc thù hàm lượng Mn trên đất trồng bưởi dao động từ 0,63 - 1,23%.

Mặc dù sắt (Fe) không có trong thành phần diệp lục tố, nhưng nó hỗ trợ cho quá trình thành lập diệp lục tố. Fe là thành phần chủ yếu của nhiều enzym và đóng vai trò chủ yếu trong sự chuyển hóa axit nucleic, ảnh hưởng đến sự chuyển hóa RNA hoặc hạt diệp lục. Fe trong mẫu phân tích được lấy tại các khu vực trồng có giá trị cao, đến 1,96% ở tầng 1 và 2,29% (tầng 2). Hàm lượng sắt ở tầng 1 thấp hơn tầng 2 và khoảng dao động giữa chúng cũng khác nhau. Độ lệch chuẩn ở tầng 2 nhỏ hơn tầng 1 nhưng giá trị chênh lệch không lớn, nhưng cũng thể hiện mức độ ổn định của tầng 2 cao hơn. Giá trị này phân bố ở 2 tầng có sự sai khác và có ý nghĩa thống kê. Kết quả phân tích thống kê thấy rằng, cách xác định ngưỡng

và tính toán tần suất với giá trị xuất hiện phân bố ở tầng canh tác đạt trên 65% số mẫu khảo sát. Giá trị đặc thù hàm lượng sắt dao động từ 1,10 - 1,54%.

Đồng (Cu) là nguyên tố vi lượng trong đất rất cần thiết cây trồng, nhất là cây bưởi. Thiếu Cu cũng dễ xảy ra ở cây thuộc họ cam chanh, thiếu Cu dẫn đến hiện tượng chết rễ non, đôi khi cháy bìa lá cùng với hiện tượng tạo nhiều mầm nhưng không mạnh, hiện tượng tiết nhựa, xì mủ cây cũng xảy ra. Giá trị trung bình ở tầng 1 và tầng 2 chênh lệch nhau gần 10 mg Cu/kg đất. Khoảng dao động giữa giá trị nhỏ nhất và giá trị lớn nhất ở tầng 1 dao động rộng hơn so với tầng 2. Mặt khác, độ lệch chuẩn của tầng 1 cao hơn 3 lần so với tầng 2 thể hiện mức độ ổn định ở tầng 2 cao hơn, tương đương với sự phân bố dữ liệu ở tầng 1 bị biến động và phân tán. Giá trị phân bố giữa 2 tầng sai khác nhau rõ rệt và có ý nghĩa thống kê. Giá trị đặc thù hàm lượng Cu được xác định dao động từ 15,17 - 25,47%.

Bảng 2. Một số tính chất đất trồng của giống bưởi Đường Lá Cam và bưởi ỔiGiống bưởi Bưởi Đường Lá Cam Bưởi Ổi

Giá trị Ngưỡng dưới Ngưỡng trên Ngưỡng dưới Ngưỡng trên

Loại đất

- Đất phù sa chua, kết von sâu (FLdy.fr2)- Đất phù sa chua, đọng nước (FLdy.aq)- Đất phù sa điển hình, cơ giới trung bình (FLha.sl)- Đất phù sa điển hình, ít chua (FLha.eu)- Đất xám cơ giới nhẹ, nghèo bazơ (ACar.vt)

- Đất phù sa chua, kết von sâu (FLdy.fr2)- Đất phù sa chua, đọng nước (FLdy.aq)- Đất phù sa điển hình, cơ giới trung bình (FLha.sl)- Đất phù sa điển hình, ít chua (FLha.eu)

Thành phần cơ giới Đơn vị tính Sét pha limon, thịt pha limon,

thịt pha sét và thịt pha sét limonThịt pha sét, thịt pha limon,

thịt pha sét limonCát % 12,67 29,53 13,36 25,95 Thịt % 38,29 55,05 47,30 53,20 Sét % 26,71 37,76 24,95 35,23 pH H2O 4,40 5,20 4,36 5,02 pH KCl 3,93 4,63 3,88 4,72 EC mS/cm2 29,96 130,62 55,14 95,99 Ca 2+ meq/100g 2,16 4,91 2,72 5,22 Mg 2+ meq/100g 0,70 2,38 0,94 1,86 Al 3+ meq/100g - 0,85 - 1,02 CEC meq/100g 11,86 17,60 11,26 17,74 P2O5 dt mg/100g 10,95 39,70 17,32 42,68 K2Odt mg/100g 6,28 38,14 6,28 52,96 OC % 0,68 1,26 0,87 1,25 N % 0,04 0,19 0,04 0,11 P2O5ts % 0,04 0,18 0,09 0,17 K2Ots % 0,09 0,14 0,10 0,15 B mg/kg 5,57 8,71 6,63 8,94 Mn % 0,63 1,23 0,59 1,13 Fe % 1,10 1,54 1,30 1,54 Cu mg/kg 15,17 25,47 17,16 22,55 Zn mg/kg 24,84 47,60 36,02 50,06

120


Kẽm (Zn) là nguyên tố vi lượng liên quan đến sự tổng hợp sinh học của axit indole axetic và protein, giúp cho việc sử dụng lân và đạm trong cây. Đất vùng trồng bưởi tương đối giàu Zn. Bằng phân tích kiểm định t hai mẫu, trị trung bình của tầng 1 khoảng 38,39 mg/kg, cao hơn so với tầng 2 khoảng 4 mg Zn/kg đất. Khoảng dao động giữa giá trị nhỏ nhất và giá trị lớn nhất ở tầng 1 rộng hơn tầng 2. Do đó, độ lệch chuẩn ở tầng 1 cao hơn so với tầng 2, điều đó thể hiện giá trị biến động mạnh ở tầng đất mặt hơn tầng dưới sâu. Sự phân bố các trị số trong hai tầng được xem xét không có sai khác về mặt thống kê. Kết quả đặc trưng dao động từ 24,84 - 47,6 mg Zn/kg đất.

3.2. Đặc thù về tính chất đất giữa bưởi Đường Lá Cam và bưởi Ổi

Bưởi Đường Lá Cam và bưởi Ổi là những giống bưởi thuộc bưởi Tân Triều. Trong nghiên cứu này, kết quả phân tích cũng phân loại và đánh giá tính đặc thù về đất trồng của 2 giống bưởi này (Bảng 2).

Hầu hết các tính chất đất trồng của hai giống bưởi này là tương tự như nhau, sự khác biệt là không đáng kể và không có ý nghĩa khi xử lý thống kê.


4.1. Kết luậnĐất trồng bưởi ở Tân Triều chủ yếu trên 2 nhóm

đất chính là đất phù sa và đất xám. Loại đất thích hợp cho đất trồng bưởi với chất lượng quả cao được ưu tiên nhất trên loại đất phù sa điển hình (đất phù sa điển hình, cơ giới trung bình và đất phù sa điển hình, ít chua) và một phần trên đất xám cơ giới nhẹ, nghèo bazơ.

Chất lượng đường Lá Cam và bưởi Ổi được quyết định chủ yếu bởi các tính chất đất như: độ chua, cacbon hữu cơ tổng số, đạm tổng số, lân tổng số, kali tổng số, Bo và Mn. Sự khác biệt không đáng kể về

loại đất và tính chất của 2 loại bưởi (Ổi và Đường Lá Cam).

Đất vùng trồng bưởi Tân Triều có đặc trưng riêng nếu so sánh với đất ở khu vực khác như đồng bằng sông Cửu Long do bị chi phối bởi phù sa hệ thống sông Đồng Nai, tiểu vùng khí hậu khu vực và điều kiện địa chất, phần lớn hệ trầm tích Đệ Tứ phân bố vùng địa hình tương đối thấp.

4.2. Đề nghịĐể duy trì và nâng cao chất lượng quả bưởi, thì

cần phải có những nghiên cứu chi tiết hơn về ảnh hưởng của các tính chất đất đến năng suất và chất lượng quả, qua đó xác định được chế độ dinh dưỡng thích hợp cho từng giống bưởi thuộc bưởi Tân Triều.

TÀI LIỆU THAM KHẢOHội Khoa học Đất Việt Nam, 2000. Đất Việt Nam. Nhà

xuất bản Nông nghiệp. Hà Nội. Nguyễn Thị Huệ, Nguyễn Bích Thu, Lê Minh Châu,

2011. Xác lập quyền chỉ dẫn địa lý cho sản phẩm bưởi Tân Triều, huyện Vĩnh Cửu, Đồng Nai. Báo cáo kết quả dự án.

Bùi Xuân Khôi, 2003. Nghiên cứu tuyển chọn giống bưởi có triển vọng và biện pháp thâm canh nâng cao hiệu qủa vườn bưởi Biên Hòa - Đồng Nai. Báo cáo của Trung tâm Nghiên cứu Cây ăn quả miền Đông Nam bộ.

Vũ Cao Thái, Phạm Quang Khánh và nnk, 1995. Đánh giá khả năng đất đai và đề xuất sử dụng đất tỉnh Đồng Nai. Trung tâm Nghiên cứu Chuyển giao kỹ thuật Đất Phân, Phân viện Quy hoạch và thiết kế nông nghiệp miền Nam.

Tô Cẩm Tú, 1992. Phân tích số liệu nhiều chiều. Giáo trình cao học nông nghiệp. NXB Nông nghiệp. Hà Nội.

Nguyễn Văn Tuấn, 2007. Phân tích số liệu và tạo biểu đồ bằng R. NXB Khoa học và Kỹ thuật. Hà Nội.

Study on soil properties of grapefruit growing areas in Tan Trieu, Vinh Cuu district, Dong Nai province

Le Minh Chau, Nguyen Bich ThuAbstractTan Trieu is an area growing a well-known grapefruit of Vinh Cuu district, Dong Nai province. To investigate the specific characteristics of the soil properties for grapefruit cultivation in this area, 70 soil samples from the communes of Binh Hoa, Tan Binh, Binh Loi, Thien Tan and Tan An were collected and analyzed. The analyzed data showed that soils where grapefruits are grown had the texture from medium to heavy, very acidic with pH H2O from 4.5 to 5.2 and pH KCl from 3.9 to 4.6; high CEC and exchangeable cations; phosphorus and potassium content from medium to high (10-40 mg P2O5/100 g soil; 6-38 mg K2O/100 g soil); micronutrients content were quite high, especially content of manganese, zinc and iron (0.6-1.3% Mn; 24-48 mg Zn/kg soil; and 1.1-1.6% Fe).Key words: Soil properties, Tan Trieu grapefruit, quality

Ngày nhận bài: 11/5/2017Người phản biện: PGS.TS. Phạm Quang Hà
