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JULIANA DA ROCHA DOS SANTOS
Anaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de expressatildeo gecircnica e das
concentraccedilotildees de metaboacutelitos com a resposta ao tratamento
antitabagismo
Tese apresentada agrave Faculdade de Medicina da
Universidade de Satildeo Paulo para a obtenccedilatildeo do tiacutetulo
de Doutor em Ciecircncias
Programa de Ciecircncias Meacutedicas
Aacuterea de concentraccedilatildeo Distuacuterbios Geneacuteticos de
Desenvolvimento e Metabolismo
Orientador Prof Dr Paulo Caleb Juacutenior de Lima
Santos
Satildeo Paulo
2020
JULIANA DA ROCHA DOS SANTOS
Anaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de expressatildeo gecircnica e das
concentraccedilotildees de metaboacutelitos com a resposta ao tratamento
antitabagismo
Tese apresentada agrave Faculdade de Medicina da
Universidade de Satildeo Paulo para a obtenccedilatildeo do tiacutetulo
de Doutor em Ciecircncias
Programa de Ciecircncias Meacutedicas
Aacuterea de concentraccedilatildeo Distuacuterbios Geneacuteticos de
Desenvolvimento e Metabolismo
Orientador Prof Dr Paulo Caleb Juacutenior de Lima
Santos
(Versatildeo corrigida Resoluccedilatildeo CoPGr 601811 de 13 de outubro de 2011 A versatildeo original estaacute disponiacutevel na
Biblioteca da FMUSP)
Satildeo Paulo
2020
Dedicatoacuteria
Dedico esse trabalho primeiramente a Deus meu Pai querido que me guia e sempre
me concede ao que haacute de melhor
Aos meus pais Gedeatildeo e Deolinda ao meu marido Sidnei e aos irmatildeos e sobrinhos que
sempre me incentivaram e me apoiaram em todos os momentos
Agradecimentos
Ao meu orientador Dr Paulo Caleb
Obrigada Paulo por ter apostado e confiado em mim eu natildeo tenho palavras
para agradecer diante de tudo que vocecirc me ensinou Hoje me sinto mais confiante e
parte dessa confianccedila devo a vocecirc Obrigada por me ajudar a amadurecer e por ter
sido tatildeo compreensiacutevel em momentos difiacuteceis Te considero mais que um mentor vocecirc eacute
tambeacutem um grande amigo
Ao meu amigo mestrando Paulo Roberto
Muito obrigada por tudo Fico feliz que Deus meu deu a graccedila de ter vocecirc como
amigo A sua participaccedilatildeo foi essencial neste trabalho Obrigada por me ouvir e me
ajudar acredito que ainda faremos muitas coisas juntos
Aos Doutores Alexandre Pereira Jaqueline Issa Patriacutecia Gaya Tacircnia Ogawa
Abe e Regina
Obrigada pelas dicas instruccedilotildees correccedilotildees e pelo conhecimento
proporcionado Jaque Paty Tania e Regina esse estudo natildeo teria existido sem o
excelente trabalho que vocecircs executam no ambulatoacuterio do tabagismo Vocecircs foram
fundamentais
Aos meus amigos do laboratoacuterio de Geneacutetica e cardiologia molecular Leiliane
Emanuelle Mariana Faacutebinho Faacutebio Bruna Gabriela Venturini Pamela Tamiris
Kalliandra Michelle Sabrina Liacutegia Gabriele Darezzo Theacuteo Mauriacutecio Isabela Almir
Fernanda Karina Mariliza Renata Carmona Ana Piesco Ednalva e Andreacuteia e
Maacutercio
Agradeccedilo a instruccedilatildeo e auxiacutelio na parte teacutecnica desse trabalho e muito obrigada
pela amizade companhia conselhos brincadeiras e almoccedilos juntos
Aos doutores Eduardo Costa de Figueiredo Henrique Dipe Faria e Isarita
Martins do LATF (Unifal MG)
Obrigada pela colaboraccedilatildeo neste trabalho Obrigada por esse produto maravilhoso
desenvolvido no laboratoacuterio de vocecircs (o novo RAM) Tenho a certeza que seraacute de
grande aplicabilidade Obrigada pela mensuraccedilatildeo das amostras Henrique muito
obrigada pela paciecircncia em explicar o trabalho que vocecircs realizaram Muito obrigada
pelo tempo disponibilizado e pelos dados fornecidos
Ao Prof Dr Joseacute Eduardo Krieger e ao LGCM (FMUSP)
Obrigada por disponibilizar a infraestutura do laboratoacuterio equipamentos
materiais e reagentes para execuccedilatildeo deste trabalho
Aos membros titulares e suplentes da banca examinadora
Muito obrigada pelo aceite do convite e por todas as sugestotildees e contribuiccedilotildees
Agrave FAPESP agrave CAPES e agrave CNPQ
Agradeccedilo o apoio financeiro para a execuccedilatildeo desse trabalho
A Deus
Pai muito obrigada pelo Senhor ter me dado essa oportunidade maravilhosa O
Senhor sempre me preparou o melhor e creio que continuaraacute preparando Obrigada
por me dar forccedilas em todos os momentos Te amo
Agrave minha famiacutelia
Obrigada por toda compreensatildeo Obrigada pelo apoio e por terem acreditado
na minha capacidade Vocecircs satildeo uma becircnccedilatildeo e essenciais na minha vida Amo vocecircs
Ao meu marido Sidnei
Lindo te amo muito Obrigada por ter me incentivado Obrigada pelos chaacutes
chocolates e comindinhas que vocecirc sempre ia me trazendo enquanto eu estava
escrevendo este trabalho Obrigada por ter me ajudado nas tarefas domeacutesticas tambeacutem
para que eu pudesse ter tempo para me dedicar Obrigada por todo amor carinho e
cumplicidade Vocecirc eacute um marido excelente
ldquoPorque os meus pensamentos natildeo satildeo os vossos pensamentos nem os vossos
caminhos os meus caminhos diz o Senhor Porque assim como os ceacuteus satildeo mais
altos do que a terra assim satildeo os meus caminhos mais altos do que os vossos
caminhos e os meus pensamentos mais altos do que os vossos pensamentos rdquo
Isaiacuteas 5589
Esta tese estaacute de acordo com as seguintes normas em vigor no momento desta
publicaccedilatildeo
Referecircncias adaptado de International Committee of Medical Journals Editors
(Vancouver)
Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Medicina Divisatildeo de Biblioteca e
Documentaccedilatildeo Guia de apresentaccedilatildeo de dissertaccedilotildees teses e monografias Elaborado
por Anneliese Carneiro da Cunha Maria Julia de A L Freddi Maria F Crestana
Marinalva de Souza Aragatildeo Suely Campos Cardoso Valeacuteria Vilhena 3a ed Satildeo Paulo
Divisatildeo de Biblioteca e Documentaccedilatildeo 2011 Abreviaturas dos tiacutetulos dos perioacutedicos
de acordo com List of Journals Indexed in Index Medicus
SUMAacuteRIO
LISTA DE ABREVIATURAS SIacuteMBOLOS E SIGLAS
LISTA DE EQUACcedilOtildeES
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE QUADROS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
11 Nicotina farmacodinacircmica e farmacocineacutetica 3
12 Faacutermacos antitabagismo 5
121 Vareniclina 6
1211 Farmacodinacircmica 6
1212 Farmacocineacutetica 7
122 Bupropiona 9
1221 Farmacodinacircmica 9
1222 Farmacocineacutetica 10
13 Pesquisa de biomarcadores 11
131 Estudos farmacogeneacuteticos e de expressatildeo gecircnica para vareniclina e bupropiona 12
132 Mensuraccedilatildeo de nicotina bupropiona vareniclina e seus metaboacutelitos em amostras
bioloacutegicas 15
2 JUSTIFICATIVA 17
3 OBJETIVOS 19
4 METODOLOGIA 20
41 Casuiacutestica 20
42 Fluxo de procedimentos adotados no atendimento aos pacientes 23
43 Coleta e armazenamento das amostras dos pacientes tratados com vareniclina e
bupropiona 26
44 Nuacutemero amostral 27
45 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica para amostras de pacientes tratados com vareniclina 28
451 Concentraccedilatildeo purificaccedilatildeo e extraccedilatildeo de RNA 28
452 Siacutentese de cDNA 31
453 Ensaio de controle de qualidade das amostras para o ensaio de expressatildeo gecircnica 31
454 Ensaio de expressatildeo gecircnica 35
455 Anaacutelise dos dados de expressatildeo gecircnica 37
46 Mensuraccedilatildeo de bupropiona vareniclina e de seus metaboacutelitos por HPLC-MSMS 38
461 Materiais equipamentos e condiccedilotildees adotadas para a mensuraccedilatildeo dos analitos apoacutes
validaccedilatildeo do meacutetodo 38
462 Visatildeo geral do desenvolvimento da coluna e padronizaccedilatildeo da anaacutelise 41
463 Desenvolvimento da coluna RAM para a purificaccedilatildeo da amostra 43
464 Caracterizaccedilatildeo do novo RAM 46
4641 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA 46
4642 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas no soro 46
4643 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA em diferentes pHs 47
465 Paracircmetros espectromeacutetricos 47
466 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatograacutefico multidimensional 48
467 validaccedilatildeo analiacutetica 49
47 Anaacutelise estatiacutestica 49
5 RESULTADOS 51
51 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica 51
511 Dados cliacutenicos e demograacuteficos 51
512 Dados de expressatildeo gecircnica 53
513 Anaacutelise de associaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica entre os desfechos e os tempos de
tratamento 54
52 Mensuraccedilatildeo dos analitos 58
521 Caracterizaccedilatildeo da coluna teste exclusatildeo de proteiacutenas e interferentes da matriz 58
522 Otimizaccedilatildeo dos paracircmetros espectromeacutetricos 60
523 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatrograacutefico multidimensional 61
524 Validaccedilatildeo analiacutetica 64
525 Dados cliacutenicos e demograacuteficos dos pacientes submetidos a mensuraccedilatildeo dos analitos
69
526 Anaacutelise de associaccedilatildeo dos analitos com desfecho de tratamento 72
6 DISCUSSAtildeO 75
61 Para os dados da anaacutelise de expressatildeo gecircnica 75
62 Para os dados da mensuraccedilatildeo dos analitos 80
7 CONCLUSOtildeES 87
8 SUGESTOtildeES PARA ESTUDOS FUTUROS 88
9 REFEREcircNCIAS 89
APEcircNDICE ndash TCLE
ANEXO 1 ndash Aprovaccedilatildeo no Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa
ANEXO 2 ndash Teste de Fagerstroumlm para a dependecircncia agrave nicotina (versatildeo em Portuguecircs)
ANEXO 3 - Escore de consumo situacional Issa
ANEXO 4 - Desenho de estudo do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticos na
escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismordquo
ANEXO 5 -Pedido de depoacutesito de patente na Agecircncia de Inovaccedilatildeo e Empreendedorismo
da Universidade Federal de Alfenas-MG
LISTA DE ABREVIATURAS SIacuteMBOLOS E SIGLAS
API Ionizaccedilatildeo em pressatildeo atmosfeacuterica - Atmospheric pressure ionization
ACTB Gene que codifica a proteiacutena β actina
ANKK1 Gene codificador da proteiacutena quinase envolvida em vias de transduccedilatildeo de sinal
B2M Gene que codifica a microbulina subunidade β2
BC3 Tampatildeo de reaccedilao de transcriptase reversa
BR1 Tampatildeo de ressuspensatildeo
BR2 Tampatildeo de ligaccedilatildeo
BR3 Tampatildeo de lavagem 1
BR4 Tampatildeo de lavagem 2
BR5 Tampatildeo de eluiccedilatildeo
BRT Tubos PAXgene
BSA Albumina de soro bovino
[C14] Carbono 14 (isoacutetopo radioativo do carbono de massa atocircmica 14)
cDNA DNA complementar sintetizado a partir de uma moleacutecula de RNA
CHRNA3 Gene codificador do receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α3
CHRNA4 Gene codificador da subunidade α4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNA5 Gene codificador da subunidade α5 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNA6 Gene codificador da subunidade α6 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNA7 Gene codificador da subunidade α7 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNB2 Gene codificador da subunidade β2 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNB3 Gene codificador da subunidade β3 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNB4 Gene codificador da subunidade β4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNG Gene codificador do receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade δ
CNTs Nanotubos de carbono - Carbon nanotubes
COMT Gene codificador da enzima catecol-O-metiltransferase (metaboliza dopamina)
CS ndash SPE Extraccedilatildeo em fase soacutelida no modo column switching
CT Ciclo de linha de base ndash threshold cicle (nuacutemero de ciclo em que a amostra
amplificou)
CYP2B6 Gene codificador do receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade γ
CYP2B6 Gene codificador da isoenzima CYP2B6
Disco QC Disco para a realizaccedilatildeo do controle de qualidade de amostras que seratildeo utilizadas
para o ensaio de expressatildeo gecircnica
DN Dependecircncia agrave nicotina
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
DNAse Enzima que degrada moleacuteculas de DNA
dNTP Dinucleotiacutedeos dATP dCTP dGTP e dTTP
DRD1 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 1
DRD2 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 2
DRD3 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 3
DRD4 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 4
E Erro relativo
EDTA Aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico
Escore Issa Escore de consumo situacional Issa
ESI+ Ionizaccedilatildeo positiva por electrospray - positive Electrospray ionization
FDA Orgatildeo de controle de alimentos e medicamentos americano ndash Food and drug
administration
FTND Teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fargestroumlm test for nicotine
dependence
g Velocidade de rotaccedilatildeo em forccedila g a qual considera a aceleraccedilatildeo da gravidade
GDC Controle de contaminaccedilatildeo de DNA genocircmico do disco QC
GE Tampatildeo de degradaccedilatildeo de DNA genocircmico
HGDC Controle de contaminaccedilatildeo de DNA genocircmico do ensaio de expressatildeo gecircnica
HPLC Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia ndash High Performance Liquid
Cromatograph
HPLC-MSMS Cromatografica liacutequida de alta eficiecircncia seguida por espectrometria de massas
em tandem ndash High Performance Liquid Cromatograph fowed by tandem Mass
Spectrometric
HPRT1 Gene que codifica a enzima hipoxantina fosforribosiltransferase 1
HTR3A Gene codificador da subunidade 3A do receptor de serotonina
HTR3B Gene codificador da subunidade 3B do receptor de serotonina
KV Energia de colisatildeo em quilovolt
LC-MS Cromatografia liacutequida seguida de espectrometria de massas - Liquid
Cromatograph fowed by Mass Spectrometric
LD Limite de detecccedilatildeo
LLE Extraccedilatildeo liacutequido-liacutequido (com o uso de solvente)
LQ Limite de quantificaccedilatildeo
LogP Coeficiente de particcedilatildeo relaccedilatildeo das concentraccedilotildees da substacircncia em um solvente
orgacircnico e em aacutegua dado que ambos os solventes satildeo necessariamente imisciacuteveis
MCT Microtubos de 15 mL
MS Espectrometria de massas - Mass Spectrometric
MRM Muacuteltiplas transiccedilotildees de monitoramento de reaccedilatildeo - multiple reaction monitoring
MSMS Espectrometria de massas em tandem
mz Relaccedilatildeo massacarga dos analitos
nAChR(s) Receptor(es) acetilcoliacutenico (s) nicotiacutenico (s)
NMR Taxa de metabolizaccedilatildeo da nicotina ndash Nicotine metabolite ratio
NTC Controle negativo
NTR Controle de natildeo transcriccedilatildeo reversa
OCT2 Transportador catiocircnico orgacircnico
P2 Controle externo de RNA
PAF Programa de Assistecircncia ao Fumante
PBMC Ceacutelulas mononucleares de sangue perifeacuterico - Peripheral blood mononuclear cell
PCR Amplificaccedilatildeo em cadeia da polimerase
PIs Padrotildees internos
PK Enzima proteinase K
pKa Valor negativo do logaritmo da constante de dissociaccedilatildeo de um aacutecido
pKb Valor negativo do logaritmo da constante de dissociaccedilatildeo de uma base
PP Extraccedilatildeo por preciptaccedilatildeo de proteiacutenas
PPC Controle positivo de PCR
PRC Coluna de rotaccedilatildeo de RNA vermelho
PSC Coluna de rotaccedilatildeo do homogeneizador lilaacutes
PT Tubo de processamento
RAM Material de acesso restrito ndash restrict access material
Rcf Forccedila centriacutefuga relativa ndash Relative centrifugal force
RDD Tampatildeo de digestatildeo de DNA
RE3 Mix de transcriptase reversa
RNA Aacutecido ribonucleico
RNase Enzima ribonuclease a qual degrada as moleacuteculas de RNA
RNFD Soluccedilatildeo matildee de DNase
RNFW Aacutegua livre de RNase
RFLP Restriccedilatildeo enzimaacutetica - Restriction fragment length polymorphism
RP‐HPLC Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia em fase reversa ndash Reverse-Phase High
Performance Liquid Cromatograph
Rpm Rotaccedilatildeo por minuto
RSD Desvio padratildeo relativo
SLC6A3 Gene codificador da proteiacutena transportadora de dopamina
SLC22A2 Gene codificador da proteiacutena OCT2 transportadora de caacutetions orgacircnicos
(transporta vareniclina)
SNC Sistema nervoso central
SPE Extraccedilatildeo em fase soacutelida
Sty I Enzima de restriccedilatildeo proveniente da Salmonella Typhi
TAE Tampatildeo formado com Tris Acetato e EDTA
TRN Terapia de reposiccedilatildeo nicotiacutenica
UGT2B7 Gene codificador da enzima UGT2B7 a qual metaboliza a vareniclina
UPLC Cromatografica liacutequida de ultra eficiecircncia - Ultra Performance Liquid
Cromatograph
UV Detector ultravioleta
α3 Subunidade alfa 3 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α4 Subunidade alfa 4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α5 Subunidade alfa 5 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α6 Subunidade alfa 6 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α7 Subunidade alfa 7 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
β2 Subunidade beta 2 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
β4 Subunidade beta 4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
T-1 Visita inicial
T0 Visita de iniacutecio do tratamento (coleta realizada antes de comeccedilar o tratamento no
mesmo dia)
T2 Visita de 2 semanas apoacutes tratamento farmacoloacutegico
T4 Visita de 4 semanas apoacutes tratamento farmacoloacutegico
T12 Visita de 12 semanas apoacutes tratamento farmacoloacutegico
TFC Cromatografia liacutequida turbulenta - Turbulent flow-liquid chromatography
LISTA DE EQUACcedilOtildeES
∆CT= (CTamostra ndash a meacutedia de CThousekeeping genes) Normalizaccedilatildeo da expressatildeo
gecircnica dos genes alvo atraveacutes de valores de expressatildeo de genes fisioloacutegicos
2-∆CT Transformaccedilatildeo dos valores de ∆CT em escala logariacutetmica para a realizaccedilatildeo
dos testes de hipoacutetese
∆∆CT= (mediana de ∆CTgrupo teste ndash mediana de ∆CT grupo referecircncia) Foacutermula
utilizada para posterior caacutelculo de fold change Considera-se os dois grupos
envolvidos no teste de hipoacutetese
2-∆∆CT Transformaccedilatildeo dos dados de ∆∆CT em escala logariacutetmica Atraveacutes dessa
foacutermula se obteacutem o fold change (diferenccedila de expressatildeo entre dois grupos)
NMR=(trans-3-hidroxicotininacotinina) Taxa de metabolizaccedilatildeo da nicotina
NMRlt031=metabolizador lento NMRgt031 metabolizador normal ou raacutepido
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Analitos precursores fragmentos e energias de colisatildeo
otimizados
40
Tabela 2 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina selecionados para os ensaios de expressatildeo gecircnica
52
Tabela 3 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina submetidos aos ensaios de expressatildeo gecircnica de acordo
com o desfecho de tratamento
52
Tabela 4 - Valores de mediana de ∆CT dos genes de acordo com os
tempos de tratamento e grupos de desfecho
53
Tabela 5 - Fold change e anaacutelise de associaccedilatildeo entre os tempos de
tratamento e grupos de desfecho
54
Tabela 6 - Paracircmetros de validaccedilatildeo obtidos na determinaccedilatildeo de faacutermacos
antitabagismo em soro humano
68
Tabela 7 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos
69
Tabela 8 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de
acordo com o desfecho de tratamento
70
Tabela 9 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos
71
Tabela 10 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes
tratados com bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos
analitos de acordo com o desfecho de tratamento
71
Tabela 11 ndash Frequecircncia do desfecho de tratamento nos pacientes
submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com os
medicamentos antitabagismo
72
Tabela 12 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos
pacientes tratados com vareniclina
73
Tabela 13 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de
tratamento com vareniclina
73
Tabela 14 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos
pacientes tratados com bupropiona
74
Tabela 15 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de
tratamento com bupropiona
74
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Aacutereas estimuladas atraveacutes de vias dopamineacutergicas e
serotonineacutergicas e sistema de recompensa
2
Figura 2 - Receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico 4
Figura 3 - Via primaacuteria do metabolismo da nicotina 5
Figura 4 - Mecanismo de accedilatildeo da vareniclina 7
Figura 5 - Metabolismo da vareniclina em humanos 8
Figura 6 - Mecanismo de accedilatildeo da bupropiona 9
Figura 7 - Metabolismo da bupropiona em seus principais metaboacutelitos ativo 11
Figura 8 - Desenho do estudo 22
Figura 9 - Representaccedilatildeo do Rotor-Disc100 33
Figura 10 - Mapa do disco QC (representaccedilatildeo planilhada) 33
Figura 11 - Exemplo de ajuste de Threshold 34
Figura 12 - Mapa do disco do ensaio RT2 profiler PCR array (representaccedilatildeo
planilhada)
37
Figura 13 - Representaccedilatildeo da composiccedilatildeo da coluna extratora (Novo RAM) 45
Figura 14 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNA7 entre os tempos de
tratamento e desfecho
56
Figura 15 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNG entre os tempos de
tratamento e desfecho
57
Figura 16 - Heat map de expressatildeo gecircnica 58
Figura 17 ndash Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com soluccedilatildeo de
BSA
59
Figura 18 - Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com amostra de
soro diluiacuteda
59
Figura 19 - Influecircncia do pH na exclusatildeo de proteiacutenas 60
Figura 20 - Ilustraccedilatildeo do sistema de columm switching na configuraccedilatildeo de
backflush
62
Figura 21 - Cromatograma obtido de amostras de soro branco diluiacutedas em
aacutegua ultra pura
65
Figura 22 - Cromatograma obtido apoacutes anaacutelise de soro diluiacutedo e dopado com
os analitos no niacutevel meacutedio de calibraccedilatildeo e mais os padrotildees internos deuterados
65
Figura 23 - Cromatograma obtido atraveacutes da anaacutelise das amostras de soro dos
pacientes tratados com bupropiona
67
Figura 24 - Cromatograma obtido atraveacutes da analise de amostras de soro de
pacientes tratados com vareniclina
67
LISTA DE QUADROS
Quadro 1- Procedimentos do protocolo em relaccedilatildeo aos pacientes 25
Quadro 2 - Paracircmetros de qualidade do ensaio QC 34
Quadro 3 - Genes escolhidos para o ensaio de expressatildeo 36
Quadro 4 - Housekeeping genes 36
Quadro 5 - Propriedades fiacutesico-quiacutemicas dos analitos 42
Quadro 6 ndash Comparaccedilatildeo dos dados de validaccedilatildeo com outros estudos 85
RESUMO
Santos JR Anaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de expressatildeo gecircnica e das concentraccedilotildees
de metaboacutelitos com a resposta ao tratamento antitabagismo [tese] Satildeo Paulo
Faculdade de Medicina Universidade de Satildeo Paulo 2020
Introduccedilatildeo O tabagismo eacute considerado a maior causa de morbidade e mortalidade
evitaacutevel no mundo Estudos tecircm buscado a identificaccedilatildeo de preditores de resposta aos
tratamentos de cessaccedilatildeo tabaacutegica Os principais objetivos deste estudo foram analisar a
possiacutevel associaccedilatildeo da expressatildeo de genes alvo e das concentraccedilotildees de analitos
(faacutermacos antitabagismo nicotina e seus metaboacutelitos) com a resposta ao tratamento
Meacutetodos Foram incluiacutedos 105 pacientes fumantes que iniciariam o tratamento com
vareniclina (n=74) ou bupropiona (n=31) As anaacutelises de expressatildeo gecircnica foram
realizadas atraveacutes do ensaio customizado RTsup2 Profiler PCR Array com a inclusatildeo de 17
genes para a anaacutelise em ceacutelulas mononucleares de sangue perifeacuterico (PBMC) A
preparaccedilatildeo das amostras de soro para a mensuraccedilatildeo dos analitos foi realizada atraveacutes de
uma coluna extratora composta por nanotubos hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados
com a adiccedilatildeo de grupos hidrofiacutelicos (material de acesso restrito - RAM) desenvolvida
no LATF Unifal MG A mensuraccedilatildeo dos analitos foi realizada por cromatografia
liacutequida de alta eficiecircncia em modo column switching seguida de espectrometria de
massa em tandem (HPLC-MSMS) Os tempos para a coleta de amostras foram para as
anaacutelises de expressatildeo gecircnica (sangue total) antes de iniciar o tratamento (T0) duas e
quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento (T2 e T4 respectivamente) e para a
mensuraccedilatildeo dos analitos (soro) as amostras foram coletadas na T2 Resultados Para as
anaacutelises de expressatildeo gecircnica selecionamos 14 pacientes que obtiveram sucesso e 13
pacientes resistentes ao tratamento com vareniclina Foi considerado sucesso quando o
paciente alcanccedilava abstinecircncia ao tabaco ateacute a 4 ordf semana de tratamento e resistente
quando o paciente natildeo conseguia parar de fumar ateacute a 4ordf semana de tratamento Foi
observada diferenccedila significativa para a expressatildeo do gene CHRNA7 no grupo
resistente amostras dos tempos T2 e T4 apresentaram menor expressatildeo comparadas ao
tempo T0 (fold change 038 P=0007 fold change 067 P=0004 respectivamente)
Para a mensuraccedilatildeo dos analitos a coluna RAM desenvolvida mostrou alta capacidade
para a remoccedilatildeo de macromoleacuteculas e de anaacutelise conjunta dos diferentes analitos aleacutem
de poder ser reutilizada diversas vezes (cerca de 400 ciclos) Os pacientes do grupo
resistente tratados com ambos os faacutermacos apresentaram maior concentraccedilatildeo de
metaboacutelitos da nicotina na T2 No entanto natildeo houve associaccedilatildeo dos faacutermacos e seus
metaboacutelitos com desfecho de tratamento Conclusotildees Para as anaacutelises de expressatildeo
gecircnica este estudo exploratoacuterio mostrou um possiacutevel preditor de efetividade no
tratamento com vareniclina reafirmando a associaccedilatildeo da subunidade α7 para os
processos de dependecircncia agrave nicotina e tratamento antitabagismo Estes resultados
podem contribuir ao menos em parte para o desenvolvimento de uma terapia
individualizada Contudo estudos futuros satildeo necessaacuterios para o entendimento do papel
da subunidade α7 dos receptores acetilcoliacutenicos-nicotiacutenicos no tratamento com
vareniclina Para a mensuraccedilatildeo dos analitos o novo RAM sintetizado eacute um produto de
extremo valor cientiacutefico podendo apresentar diversas aplicaccedilotildees em anaacutelise de amostras
com matrizes complexas sem muita preparaccedilatildeo preacutevia Para a associaccedilatildeo das
concentraccedilotildees dos faacutermacos e seus metaboacutelitos com o desfecho de tratamento satildeo
necessaacuterios estudos com um maior nuacutemero amostral
Descritores Vareniclina Bupropiona Nicotina Abandono do haacutebito de fumar
Expressatildeo gecircnica Biomarcadores farmacoloacutegicos
ABSTRACT
Santos JR Association analysis of gene expression profiles and metabolite
concentrations with response for smoking cessation treatment [thesis] Satildeo Paulo
ldquoFaculdade de Medicina Universidade de Satildeo Paulordquo 2020
Introduction Smoking is considered the largest cause of preventable morbidity and
mortality in the worldwide Studies have sought to identify predictors of responses to
smoking cessation treatments The main objectives of this study were to analyze the
possible association of the expression of target genes and concentrations of analytes
(drugs for smoking cessation nicotine and their metabolites) with the response to
treatment Methods We included 105 smoker patients who would start treatment with
varenicline (n=74) or bupropion (n=31) Gene expression analysis was performed
through custom RTsup2 Profiler PCR array assay including 17 genes for analysis in
peripheral blood mononuclear cells (PBMC) Serum sample preparation for the
measurement of analytes was performed by an extraction column composed of hybrid
carbon and silica nanotubes modified with the addition of hydrophilic groups (restricted
access material - RAM) developed by LATF Unifal MG The measurement of analytes
was performed by high efficient liquid chromatography in column switching mode
followed by tandem mass spectrometry (HPLC-MSMS) Times for sample collection
were for gene expression analysis (total blood) before start of therapy (T0) two and
four weeks after start of treatment (T2 and T4 respectively) and for measurement of
analytes (serum) the samples were collected at T2 Results For gene expression
analysis we selected 14 patients who had success and 13 patients resistant to the
varenicline treatment Success was considered to be when a patient achieved tobacco
abstinence until the 4th week of treatment and resistant was when a patient had not
stopped smoking as of the 4th week of treatment We observed a significant difference
for CHRNA7 gene expression in the resistant group samples from T2 and T4 had lower
expression compared with T0 (fold change 038 P=0007 fold change 067 P=0004
respectively) For measurement of analytes the developed RAM column showed high
capacity to remove macromolecules and joint analyzes of different analytes besides
being able to be reuse manny times (about 400 cycles) Patients from resistant group of
the both drugs treatment had a higher concentration of nicotine metabolites in T2
However there was no association of drugs for smoking cessation and their metabolites
with outcome treatment Conclusions For gene expression analysis this exploratory
study showed a possible predictor of effectiveness in the treatment with varenicline
reaffirming the association of the α7 subunit for nicotine dependence and smoking
therapy processes These results may contribute at least in part to the development of
individualized therapy However further studies are needed to understand the role of the
α7 subunit of acetylcholinic-nicotinic receptors in varenicline treatment For the
measurement of analytes the new synthesized RAM is a product of extreme scientific
value being able of several applications in the analysis of samples with complex
matrices without much prior preparation For an association of drugs for smoking
cessation and their metabolites with outcome treatment studies with a larger sample
size are needed
Descriptors Varenicline Bupropion Nicotine Smoking cessation Gene expression
Biomarkers pharmacological
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
O tabagismo eacute considerado a maior causa de morbidade e mortalidade evitaacutevel
em todo o mundo 1 Doenccedilas cardiacuteacas cerebrovasculares cerca de um quinto de todos
os tipos de cacircnceres doenccedilas pulmonares como apneia e enfisema aleacutem de distuacuterbios
preacute-natais estatildeo associadas ao consumo do tabaco 2-5
Dados recentes da Vigitel mostraram que no conjunto das 27 capitais brasileiras
a frequecircncia de adultos fumantes foi de 93 com valores duas vezes maior no sexo
masculino (121) do que no feminino (69) As menores frequecircncias foram
encontradas na populaccedilatildeo de jovens adultos (antes dos 25 anos) e em pessoas de mais
de 65 anos As maiores frequecircncias foram encontradas entre homens em Porto Alegre
(173) Campo Grande e Satildeo Paulo (156) 6
A nicotina eacute o principal componente do tabaco causador de dependecircncia Esta
age nos receptores acetilcoliacutenicos-nicotiacutenicos (nAChRs) promovendo a liberaccedilatildeo de
diversos neurotransmissores e neuroreguladores tais como dopamina acetilcolina
epinefrina norepinefrina serotonina beta-endorfina vasopressina e GABA O principal
neurotransmissor estudado eacute a dopamina pois a nicotina promove aumento de seus
niacuteveis na regiatildeo mesocorticoliacutembica cerebral principalmente em um circuito conhecido
como ldquosistema de recompensardquo (aacuterea tegmental ventral nuacutecleo accumbens e coacutertex preacute-
frontal) gerando sensaccedilotildees de prazer e bem-estar 7-15
O processo de adiccedilatildeo agrave nicotina eacute complexo e nem todos os mecanismos estatildeo
elucidados Aleacutem da ativaccedilatildeo do sistema de recompensa haacute a formaccedilatildeo de memoacuterias
associativas do efeito hedocircnico com os ambientes e situaccedilotildees de disponibilidade e uso
do tabaco resultando em reforccedilo positivo apoacutes o fumante entrar em contato com fatores
relacionados ao seu consumo Este tipo de memoacuteria aprendida envolve a amigdala o
hipocampo o coacutertex preacute-frontal e o coacutertex parietal 15-17 Evidecircncias tambeacutem satildeo
2
consistentes com a hipoacutetese da ativaccedilatildeo do estriado dorsal o qual estaacute envolvido no
processamento de memoacuterias de formaccedilatildeo de haacutebito em processos motores o que
poderia automatizar o ato de fumar 15 18 (Figura 1)
O uso continuado do tabaco promove a desensibilizaccedilatildeo e adaptaccedilatildeo dos
nAChRs causando toleracircncia e diminuiccedilatildeo dos efeitos de recompensa naturais Como
resultado o indiviacuteduo experimenta fissura ansiedade humor deprimido e irritabilidade
na ausecircncia da nicotina Estes sintomas acabam promovendo um reforccedilo negativo para o
fumo e o nuacutemero de cigarros consumidos aumenta cada vez mais 14 15
Todos os fatores acima mencionados contribuem para o mecanismo de
dependecircncia agrave nicotina (DN) Os efeitos hedocircnicos estatildeo relacionados com o processo
de iniciaccedilatildeo do tabagismo enquanto os efeitos negativos da falta da nicotina estatildeo mais
associados agrave manutenccedilatildeo do fumo 15
Para os indiviacuteduos que desejam parar de fumar o tratamento farmacoloacutegico
antitabagismo eacute o que apresenta maior eficaacutecia na reduccedilatildeo da prevalecircncia de fumantes
19
Figura 1 - Aacutereas estimuladas atraveacutes de vias dopamineacutergicas e serotonineacutergicas e sistema de recompensa A
Principais vias ativadas na dependecircncia como a aacuterea tegmental ventral nuacutecleos accumbens e da rafe coacutertex-frontal
estriado susbstacircncia negra e hipocampo As setas em rosa indicam aacutereas estimuladas pelas vias serotonineacutergicas de
transmissatildeo e em azul pelas vias dopamineacutergicas gerando diversos comportamentos B Sistema de recompensa
(composto pela VTA nuacutecleo accumbeacutens e coacutertex preacute-frontal) A nicotina age nos nAChRs no SNC gerando uma
3
descarga de dopamina no sistema de recompensa Haacute uma adaptaccedilatildeo desses receptores com o fumo continuado
fazendo com que haja a necessidade de maior consumo de nicotina e o desenvolvimento da dependecircncia VTA= aacuterea
tegmental ventral SNC sistema nervoso central nAChR= receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico Fonte adaptado de
Habermann A Brain awareness week addiction and the brainrsquos reward system Sovereign Health Group 2016 e de
Koob amp Volkow 2009 14
11 Nicotina farmacodinacircmica e farmacocineacutetica
O fumo permite uma titulaccedilatildeo precisa da dose de nicotina por parte do fumante
Sua absorccedilatildeo eacute raacutepida chegando em cerca de 10 segundos em todo o sistema nervoso
central (SNC) onde se liga nos nAChRs 20 21 22
Os nAChRs satildeo receptores de canais iocircnicos compostos por cinco subunidades
que podem estar combinadas de diferentes formas (Figura 2) 20 Os subtipos desses
receptores mais abundantes no ceacuterebro humano satildeo os α4β2 α3β4 e α7 (homomeacuterico)
Os receptores compostos pelas subunidades α4β2 (o asterisco indica que outras
subunidades podem estar presentes) possuem um papel fundamental na DN O nocaute
da subunidade β2 em ratos resultou na eliminaccedilatildeo dos efeitos comportamentais da
nicotina 23 Quanto agrave subunidade α4 parece estar envolvida na sensibilidade agrave nicotina
o que pode impactar nos efeitos de recompensa dessensibilizaccedilatildeo e toleracircncia24 25 Os
receptores compostos pelas subunidades α3β4 acredita-se mediar os efeitos
cardiovasculares 26 Os nAChRs α7 homomeacuterico estatildeo envolvidos na velocidade de
sinapses em processos de aprendizagem e controle sensorial 27 28 Os receptores
compostos pelas subunidades α4β2lowast podem conter outras subunidades como por
exemplo α5 α6 eou β3 as quais podem modificar a sensibilidade e funccedilatildeo do receptor
21 29
Como um agonista desses receptores a nicotina promove a sua abertura
permitindo a entrada de soacutedio e caacutelcio despolarizando assim a membrana dos
neurocircnios Aleacutem da entrada de caacutelcio atraveacutes dos nAChRs haacute tambeacutem a abertura de
4
canais de caacutelcio voltagem dependentes fazendo com que as vesiacuteculas que armazenam
os neurotransmissores sejam liberadas 20 21 O resultado da ativaccedilatildeo dos nAChRs em
neurocircnios poacutes-sinaacutepticos eacute a liberaccedilatildeo de diversos neurotransmissores ativando vaacuterias
aacutereas como jaacute mencionado
Figura 2 - Receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico O receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico funciona como um
canal iocircnico transmembracircnico Sua composiccedilatildeo eacute pentacircmera ou seja eacute formada por 5 subunidades que
podem se combinar de diferentes formas As subunidades satildeo classificadas de acordo com diferenccedilas nos
domiacutenios da sua estrutura proteiacuteca A acetilcolina e a nicotina satildeo agonistas desses receptores fazendo
com que os mesmos sejam abertos Assim ocorre a entrada de soacutedio despolarizando a membrana
gerando o potencial de accedilatildeo ACh= acetilcolina Nicot= Nicotina Na+= soacutedio K+= potaacutessio α =
subunidade alfa β= subunidade beta δ= subunidade delta γ= subunidade gama Fonte adaptado de Rang
amp Dale Farmacologia 5 ed Elsevier 2012
Haacute oscilaccedilatildeo dos picos de nicotina entre um cigarro e outro mas as quantidades
se acumulam entre 6 e 9 horas em um fumo regular saturando os nAChR causando
desensibilizaccedilatildeo adaptaccedilatildeo toleracircncia sintomas de abstinecircncia na falta do fumo e DN
30
A nicotina eacute rapidamente e extensivamente metabolizada pelo fiacutegado atraveacutes da
isoenzima CYP2A6 (e em menor grau pelas isoenzimas CYP2B6 e CYP2E1) agrave nicotina
-iacuteon iacuteminio e apoacutes pela enzima aldeiacutedo oxidase agrave cotinina O tempo de meia vida da
nicotina eacute de aproximadamente 2 horas e da cotinina 16 horas Posteriormente a
5
cotinina eacute metabolizada em trans-3-hidroxicotinina quase que exclusivamente pela
CYP2A6 (outros isocircmeros da hidroxicotina representam menos de 2 da dose) 31 32
(Figura 3) Esta eacute a maior via de metabolizaccedilatildeo da nicotina (70 - 80 do metabolismo
da nicotina em todo o corpo) 33 no entanto haacute vias menores como por exemplo a
glucoronidaccedilatildeo que pode ser a maior determinante no clearence da nicotina em
indiviacuteduos com menor atividade da CYP2A6 31
Figura 3 - Via primaacuteria do metabolismo da nicotina A nicotina eacute
metabolizada marjoritaramente pela isoenzima CYP2A6 em nicotina-
iacuteon imiacutenio e atraveacutes da enzima aldeiacutedo oxidase eacute convertida em
cotinina A cotinina eacute posteriomente metabolizada em trans-3-
hidroxicotinina novamente pela isoenzima CYP2A6 Fonte adaptado
de Llaquet et al 2010 34
12 Faacutermacos antitabagismo
Os medicamentos de primeira escolha aprovados pela Agecircncia Nacional de
Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) incluem tratamentos com base na terapia de reposiccedilatildeo
nicotiacutenica (TRN) como adesivo goma e pastilha e tambeacutem satildeo utilizados vareniclina e
bupropiona Estes uacuteltimos possuem maior eficaacutecia terapecircutica na cessaccedilatildeo tabaacutegica 35 36
6
121 Vareniclina
1211 Farmacodinacircmica
A vareniclina eacute o faacutermaco mais recentemente utilizado para a interrupccedilatildeo do
tabagismo este foi desenvolvido especificamente para atuar nos nAChRs A sua
farmacodinacircmica estaacute mais associada agrave atuaccedilatildeo como um agonista parcial nos nAChRs
compostos pelas subunidades α4β2 37 os quais satildeo importantes alvos de accedilatildeo da
nicotina pois satildeo necessaacuterios e suficientes para a recompensa toleracircncia e
sensibilizaccedilatildeo 25 38 39 (Figura 4)
Estudos mostraram que em relaccedilatildeo agrave nicotina a vareniclina possui 15 vezes
maior afinidade pelas subunidades α4β2 e ativa em torno de 50 a liberaccedilatildeo de
dopamina no sistema mesocorticoliacutembico 37 O faacutermaco atua tambeacutem em outros
nAChR como nos nAChRs (α3β4) age fracamente nos receptores contendo a
subunidade α6 e em nAChRs (α3β2) aleacutem de exercer atividade agonista total nos
receptores α7 40
Quanto agraves reaccedilotildees adversas no uso do faacutermaco a naacuteusea eacute a mais comum (cerca
de 10 a 45 dos indiviacuteduos tratados) a qual muitas vezes leva agrave natildeo aderecircncia ao
tratatamento 41-43
7
Figura 4 - Mecanismo de accedilatildeo da vareniclina A Na ausecircncia da vareniclina a nicotina se liga aos
nAChRs aumentando a ativaccedilatildeo nesses receptores Aleacutem disso haacute o estiacutemulo endoacutegeno (promovido
pela acetilcolina) B A vareniclina eacute um agonista parcial de nAChR (α4β2) ou seja tambeacutem estimula
os nAChRs mas em menor niacutevel do que a nicotina e ao mesmo tempo eacute antagonista na presenccedila de
nicotina fazendo com que ela natildeo consiga se ligar ao receptor Fonte do autor baseado nas
informaccedilotildees de Kassem et al 2012 37
1212 Farmacocineacutetica
A vareniclina eacute rapidamente absorvida pelo trato intestinal com absorccedilatildeo gt90
logo apoacutes a administraccedilatildeo oral As concentraccedilotildees plasmaacuteticas maacuteximas satildeo alcanccediladas
no periacuteodo entre 3 e 4 horas 44 e o estado de equiliacutebrio da sua concentraccedilatildeo ocorre
dentro de 4 dias 37 44-46 O faacutermaco possui baixa ligaccedilatildeo com proteiacutenas plasmaacuteticas
sendo que de acordo com ensaios in vitro a fraccedilatildeo de vareniclina (100 ngmL) livre foi
de 797 47 A sua biodisponibilidade natildeo eacute afetada pelo tempo de administraccedilatildeo ou
ingestatildeo de alimentos 37 45 46 Aleacutem disso a vareniclina possui ampla distribuiccedilatildeo nos
tecidos sendo que o volume meacutedio de distribuiccedilatildeo aparente eacute de 415 litros
apresentando um coeficiente de variaccedilatildeo (CV) de 50 48
Na circulaccedilatildeo humana a vareniclina se encontra em quantidade marjoritaacuteria satildeo
tambeacutem encontrados os metaboacutelitos conjugados vareniclina N-carbomoil glucoroniacutedeo
8
N-formilvareniclina e oxovareniclina O tempo de meia vida da vareniclina eacute em torno
de 24 horas independente da dose administrada
A eliminaccedilatildeo do faacutermaco e metaboacutelitos se daacute principalmente pela urina (99) 49
A eliminaccedilatildeo renal exibe cineacutetica linear e a sua excreccedilatildeo ocorre pela filtraccedilatildeo
glomerular na qual estaacute associada agrave secreccedilatildeo tubular realizada pelo transportador
catiocircnico orgacircnico OCT2 O clearence estimado da vareniclina eacute de 88 a 155 mLmin
apoacutes administraccedilatildeo de dose uacutenica e 92 a 143 mLmin apoacutes doses repetidas A
depuraccedilatildeo de vareniclina eacute reduzida na presenccedila de doenccedila renal Na urina cerca de
90 do produto eliminado eacute encontrado como vareniclina em sua forma inalterada e
menos de 10 eacute encontrado na forma de 2 metaboacutelitos a hidroxivareniclina e a
vareniclina-N-carbomoil glucoroniacutedeo 37 49-51
Nenhum dos metaboacutelitos da vareniclina eacute acreditado ser farmacologicamente
ativo Aleacutem disso esses metaboacutelitos estatildeo presentes em concentraccedilotildees muito baixas 37
46-49 A Figura 5 mostra os metaboacutelitos provenientes da vareniclina
A formaccedilatildeo dos metaboacutelitos da vareniclina natildeo eacute catalisada pelo complexo
enzimaacutetico CYP450 Ensaios realizados com microssoma hepaacutetico humano mostraram
que a formaccedilatildeo do conjugado vareniclina N-carbomilglucoroniacutedeo eacute provavelmente
catalisado pela enzima UGT2B7 37 49
Figura 5 ndash Metabolismo da vareniclina em humanos Fonte adaptado de Obach et al 2006 49
9
122 Bupropiona
1221 Farmacodinacircmica
A bupropiona eacute um antidepressivo no entanto tem sido utilizado como faacutermaco
antitabagismo devido o seu potencial em diminuir o desejo de fumar (o qual foi
percebido durante o tramento de iacutendiviacuteduos fumantes) Como mecanismo de accedilatildeo a
bupropiona atua como um inibidor relativamente se
letivo da recaptaccedilatildeo de norepinefrina e dopamina com pequeno efeito na
recaptaccedilatildeo de serotonina (Figura 6) aleacutem de ser um antagonista de nAChR natildeo
competitivo Essas propriedades minimizam os sintomas de retirada da nicotina
aumentando a probabilidade do indiviacuteduo se abster do fumo 52
Insocircnia e boca seca satildeo as reaccedilotildees adversas mais comumente relatadas ao uso da
bupropiona (30-40 e 10 dos pacientes respectivamente) 53
Figura 6 - Mecanismo de accedilatildeo da bupropiona A Na ausecircncia da bupropiona neurotransmissores
como a noradrenalina serotonina e a dopamina satildeo recaptados endogenamente pela bomba de
recaptaccedilatildeo B Na presenccedila da bupropiona a qual eacute inibidora da bomba de recaptaccedilatildeo desses
neurotransmissores haacute a estimulaccedilatildeo do sistema de recompensa mais especificamente atraveacutes do
aumento da concentraccedilatildeo de dopamina Dessa forma o sistema continua sendo estimulado mas em
menor grau que a nicotina e as chances de abstinecircncia ao tabaco satildeo aumentadas Fonte do autor
baseado nas informaccedilotildees de Slemmer et al 2000 52
10
1222 Farmacocineacutetica
Conforme ensaios em voluntaacuterios sadios os picos maacuteximos de concentraccedilatildeo
plasmaacutetica de bupropiona satildeo alcanccedilados aproximadamente 3 horas apoacutes a sua
administraccedilatildeo oral O volume de distribuiccedilatildeo aparente eacute de aproximadamente 2000L e
a ligaccedilatildeo com proteiacutenas plasmaacuteticas eacute de 84 para a bupropiona e de 77 para a
hidroxibupropiona (o seu principal metaboacutelito ativo) 54
A bupropiona eacute metabolizada primariamente em uma seacuterie de metaboacutelitos ativos
como a hidroxibupropiona a threohidrobupropiona e a eritrohidrobupropiona (Figura
7) A CYP2B6 eacute a principal enzima que converte a bupropiona em hidroxibupropiona
em humanos No entanto a formaccedilatildeo de threohidrobupropiona e a
eritrohidrobupropiona que ocorre atraveacutes de reaccedilatildeo redutiva natildeo eacute mediada pela
CYP2B6 55 56 A eritroidrobupropiona natildeo pode ser mensurada no plasma apoacutes a
administraccedilatildeo de uma uacutenica dose de bupropiona Os metaboacutelitos ativos satildeo
posteriormente metabolizados em inativos e estes satildeo excretados na urina 54
Inibidores da CYP2B6 como por exemplo a ticlodipina um agente
antiplaquetaacuterio derivado da tienopiridina interagem com a bupropiona diminuindo a sua
hidroxilaccedilatildeo 57 58
Apoacutes a administraccedilatildeo crocircnica de doses de 150 a 300 mgdia a bupropiona e seus
metaboacutelitos assumem cineacutetica linear A bupropiona possui meia vida de 20 horas
aproximadamente e apresenta clearence meacutedio aparente correspondente a cerca de
200Lh A eliminaccedilatildeo da bupropiona ocorre principalmente atraveacutes da urina (87) e das
fezes (10) e eacute excretada em apenas 05 de forma inalterada nos mostrando um
extenso metabolismo 54
11
Figura 7 - Metabolismo da bupropiona em seus principais metaboacutelitos ativos A bupropiona eacute
extensamente metabolizada em hidroxibupropiona pela isoenzima CYP2B6 Os demais metaboacutelitos ativos
aatildeo metabolizados por outras enzimas Fonte adaptado de Hesse et al 2000 55
13 Pesquisa de biomarcadores
A variabilidade interindividual em resposta a faacutermacos antitabagismo sugere que
os tratamentos podem ser mais efetivos em subgrupos de fumantes 59-64 No contexto de
medicina personalizada diversos pesquisadores tecircm buscado a identificaccedilatildeo de
preditores de resposta aos tratamentos de cessaccedilatildeo tabaacutegica os quais geralmente estatildeo
envolvidos em aspectos farmacocineacuteticos e farmacodinacircmicos ou via de atuaccedilatildeo do
faacutermaco como por exemplo os fatores geneacuteticos o perfil de expressatildeo gecircnica de
proteiacutenas e de metaboacutelitos 65-68
Aleacutem de refletir a efetividade do tratamento estes biomarcadores tambeacutem
poderiam indicar a toxicidade ou a ocorrecircncia de efeitos adversos A combinaccedilatildeo
desses fatores com outras variaacuteveis individuais pode ser utilizada para adequar as
estrateacutegias preventivas e terapecircuticas 65-68
12
131 Estudos farmacogeneacuteticos e de expressatildeo gecircnica para vareniclina e
bupropiona
Diversos polimorfismos geneacuteticos tecircm sido associados com resposta agrave
vareniclina e agrave bupropiona 41 65 67-71
King et al 65 mostraram a associaccedilatildeo de polimorfismos de nucleotiacutedeos uacutenicos
(SNPs - single nucletide polimorfisms) nos genes CHRNA4 CHRNA5 CHRNA7
CHRNB2 (codificadores das subunidades α4 α5 α7 e β2 dos nAChRs
respectivamente) com abstinecircncia contiacutenua em resposta agrave vareniclina O mesmo
trabalho tambeacutem encontrou associaccedilatildeo dos polimorfismos nos genes CHRNA3
CHRNA5 CHRNB4 CHRNG (codificam as subunidades α3 α5 β4 e γ dos nAChR
respectivamente) Aleacutem disso os autores demonstraram a associaccedilatildeo de polimorfismos
nos genes HTR3A e HTR3B (codificadores dos receptores serotonineacutergicos) com a
frequecircncia de recaiacuteda no tratamento antitabagismo
Swan et al 41 verificaram a associaccedilatildeo de polimorfismos no gene CHRNB2 com
naacuteusea severa em pacientes tratados com vareniclina
Nosso grupo de pesquisadores encontrou a associaccedilatildeo do polimorfismo
rs10443196 no gene CHRNA4 e do polimorfismo 785AgtG no gene CYP2B6
(codificador da principal isoenzima metabolizadora da bupropiona) com uma maior taxa
de sucesso no tratamento com vareniclina e bupropiona respectivamente 67 68
O gene CYP2B6 eacute um dos alvos mais importantes de estudos farmacogeneacuteticos
no tratamento com bupropiona Diversos polimorfismos neste gene satildeo preditores de
metabolizaccedilatildeo lenta ou raacutepida os quais foram associados com as diferenccedilas de
concentraccedilotildees do faacutermaco e de seu principal metaboacutelito ativo hidroxibupropiona em
amostras bioloacutegicas Essas concentraccedilotildees tambeacutem se associaram agrave variabilidade na
resposta ao tratamento com bupropiona 72-74
13
Polimorfismos podem implicar em diversos mecanismos moleculares como por
exemplo alteraccedilatildeo constituiccedilatildeo ou conformaccedilatildeo de proteiacutenas mudanccedilas poacutes-
traducionais e a regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica gerando variabilidade interindividual
nos niacuteveis de RNA transcrito o que poderiam explicar as diferenccedilas de resposta aos
faacutermacos antitabagismo 72
O polimorfismo CHRNA4 (rs2236196) assim como diversos polimorfismos
presentes no gene CYP2B6 os quais foram associados agrave resposta ao tratamento com
vareniclina e bupropiona respectivamente foram tambeacutem associados a maiores e
menores niacuteveis de expressatildeo gecircnica 72-75 Tambeacutem vale salientar que assim como a
expressatildeo gecircnica pode afetar a resposta ao tratamento a expressatildeo gecircnica tambeacutem pode
ser alterada em resposta aos faacutermacos 76 Neste sentido Smith et al 76 mostraram que a
vareniclina pode afetar a expressatildeo gecircnica da enzima DNA metiltransferase-1 (DNMT)
que mostrou estar envolvida em mecanismos epigeneacuteticos em neurocircnios corticais
GABaeacutergicos os quais estatildeo relacionados a processos cognitivos em indiviacuteduos
esquizofrecircnicos fumantes
O tratamento crocircnico com vareniclina modificou a expressatildeo dos nAChRs em
ceacuterebros de camundongos O upregulation dos nAChRs (α4β2) pelo uso crocircnico da
vareniclina foi similar ao promovido ao uso crocircnico da nicotina Similar dowregulation
foi visto para os nAChRs (α6β2) A vareniclina aumentou significantemente ambos
nAChRs (α3β4) e α7 enquanto a nicotina teve menor efeito nestes siacutetios 77
Em estudos com pacientes voluntaacuterios a obtenccedilatildeo de amostras do sistema
nervoso central eacute inviaacutevel Como alternativa a esse problema estudos tecircm proposto a
anaacutelise de expressatildeo gecircnica em sangue perifeacuterico 78-80 Embora natildeo seja o tecido alvo da
farmacodinacircmica dos medicamentos antitabagismo o sangue possui muitas
similaridades a niacutevel transcricional com muacuteltiplas regiotildees cerebrais 81
14
Hennings et al 82 mostraram diferenccedilas no perfil de expressatildeo gecircnica em ceacutelulas
mononucleares de sangue perifeacuterico (PBMCs) de pacientes respondedores e natildeo
respondedores a tratamentos com antidepressivos e muitos dos genes diferentemente
expressos satildeo codificadores de receptores tambeacutem presentes no SNC
Ota et al 83 mostraram que os genes GABRR2 (codificador de receptor
GABAeacutergico) e CHRNA3 (codificador da subunidade α3 de nAChR) foram
diferentemente expressos em sangue perifeacuterico em resposta ao tratamento com
risperidona em pacientes com esquizofrenia
Em outro estudo Kordi-Tamandani et al 84 mostraram que os niacuteveis de
expressatildeo gecircnica de SLC6A3 em leucoacutecitos diferiram entre indiviacuteduos dependentes de
opioacuteides e voluntaacuterios saacutedios Este gene eacute codificador de uma importante proteiacutena
recaptadora de dopamina em neurocircnios chamada DAT
Wongsriraksa et al 85 mostraram a expressatildeo das subunidades α4 α5 α7 β1 e
β2 em um estudo de caracterizaccedilatildeo de nAChRs em amostras de PBMC de humanos
atraveacutes de nicotina radioligante sugerindo conter as subunidades α4β2 α4β2α5 eou α7
Por fim diversos estudos tecircm mostrado que os nAChRs satildeo importantes para processos
imunoloacutegicos 86-91
Estudos tecircm evidenciado a expressatildeo de receptores dopamineacutergicos em
leucoacutecitos humanos Embora a dopamina natildeo ultrapasse a barreira hematoencefaacutelica as
diferenccedilas nos niacuteveis de dopamina do sistema nervoso central poderiam alterar a
expressatildeo desses receptores em leucoacutecitos ainda durante a sua formaccedilatildeo via inervaccedilatildeo
da coluna espinal doenccedilas como Parkinson Alzheimer e adiccedilatildeo agraves substacircncias
psicoativas poderiam influenciar na expressatildeo desses receptores em sangue perifeacuterico 92
15
132 Mensuraccedilatildeo de nicotina bupropiona vareniclina e seus metaboacutelitos em
amostras bioloacutegicas
A nicotina possui um baixo tempo de meia-vida e a isoenzima CYP2A6 eacute
predominante responsaacutevel pelo metabolismo da nicotina em cotinina e trans-3-
hidroxicotinina (seus principais metaboacutelitos) 93 94 Estes e a nicotina satildeo marcadores de
exposiccedilatildeo ao tabaco e indicativo de fumo 95
A taxa de metabolizaccedilatildeo da nicotina (NMR) obtida pela relaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de trans-3-hidroxicotininacotinina tem sido associada com DN com
desfecho e com escolha farmacoloacutegica de tratamento antitabagismo 95 96 Os valores
contiacutenuos e categoacutericos de NMR (metabolizadores lentos vs normais e raacutepidos) se
mostraram estaacuteveis em fumantes independente da carga tabaacutegica 32 97 98
A bupropiona eacute um faacutermaco extensamente metabolizado e a principal isoenzima
envolvida em seu metabolismo eacute a CYP2B6 a qual medeia quase que exclusivamente o
processo de hidroxilaccedilatildeo desse faacutermaco formando o metaboacutelito hidroxibupropiona 55
Diversos estudos tecircm associado as concentraccedilotildees de bupropiona e de hidroxibupropiona
em amostras de soro plasma e urina com a resposta ao faacutermaco 73 74
Zhu et al 73 em um estudo cliacutenico duplo-cego e placebo controlado os
indiviacuteduos foram tratados com bupropiona ou placebo por 6 meses Na terceira semana
de tratamento foram colhidas amostras de plasma para mensuraccedilatildeo de bupropiona e seu
principal metaboacutelito ativo a hidroxibupropiona As concentraccedilotildees mais elevadas de
hidroxibupropiona resultaram em melhores resultados de cessaccedilatildeo do tabagismo
Laib et al 74 apresentaram que as concentraccedilotildees de hidroxibupropiona em soro
foram correlacionadas com as diferentes respostas agrave bupropiona em pacientes com
depressatildeo analisadas atraveacutes de uma escala de impressatildeo clinica global
16
Quanto agrave vareniclina este eacute um faacutermaco pouco metabolizado sendo que 5 a
10 da dose pode ser encontrada na forma metaboacutelitos (soro plasma e urina) 49 Os
metaboacutelitos de vareniclina jaacute identificados em humanos em estudos preacutevios satildeo
hidroxivareniclina vareniclina N-carbomoilglucoroniacutedeo oxovareniclina N-
glicosilvareniclina e N-formilvareniclina 47 49 99 Pouco se conhece sobre as enzimas
que metabolizam a vareniclina Obach et al 49 mostrou o envolvimento da enzima
UG2B7 com o processo de glucoronidaccedilatildeo do faacutermaco Ainda natildeo haacute estudos que
associam os metaboacutelitos de vareniclina com resultados de desfecho de tratamento
17
2 JUSTIFICATIVA
Considerando a elevada prevalecircncia do tabagismo e a dificuldade dos indiviacuteduos
fumantes em se abster do tabaco estudos que apontem uma terapecircutica farmacoloacutegica
mais efetiva podem contribuir enormemente para o processo de cessaccedilatildeo tabaacutegica
Neste cenaacuterio a anaacutelise da expressatildeo de genes de interesse e a mensuraccedilatildeo de analitos
podem ser ferramentas uacuteteis na identificaccedilatildeo de marcadores e de subgrupos de resposta
ao tratamento antitabagismo
Escolhemos a realizaccedilatildeo da mensuraccedilatildeo de analitos nas amostras de soro dos
pacientes tratados com ambos os faacutermacos antitabagismo (vareniclina e bupropiona) e
especialmente para os pacientes tratados com vareniclina foram realizadas anaacutelises de
expressatildeo gecircnica de ceacutelulas mononucleares provenientes de amostras de sangue
perifeacuterico (do inglecircs Peripheral Blood Mononuclear Cell - PBMC) O ensaio
customizado para as anaacutelises da expressatildeo de 17 genes foi um grande investimento
financeiro nesta pesquisa e portanto o priorizamos para analisar as amostras dos
pacientes tratados com vareniclina jaacute que eacute o faacutermaco mais novo eficaz e custoso no
tratamento antitabagismo
As anaacutelises de expressatildeo gecircnica em amostras de PBMC satildeo de grande valia pois
seria importante encontrar em amostras de tatildeo faacutecil obtenccedilatildeo como amostras de sangue
um marcador de resposta que poderia ter correlaccedilatildeo com a expressatildeo gecircnica do sistema
nervoso central
Identificar um possiacutevel marcador preditivo de sucesso na utilizaccedilatildeo de um
determinado faacutermaco no iniacutecio da sua administraccedilatildeo foi uma das investigaccedilotildees deste
protocolo Os resultados desse estudo exploratoacuterio podem ser uacuteteis no entendimento do
comportamento de expressatildeo dos genes escolhidos (mais comumente expressos no
18
SNC) em amostras de sangue e na elaboraccedilatildeo de pesquisas mais amplas para a
identificaccedilatildeo de biomarcadores de resposta ao tratamento antitabagismo
19
3 OBJETIVOS
31 Analisar a possiacutevel associaccedilatildeo da expressatildeo de genes de interesse em amostras de
sangue perifeacuterico com a resposta ao tratamento com vareniclina
32 Analisar a possiacutevel associaccedilatildeo das concentraccedilotildees de faacutermacos antibagismo nicotina
e seus metaboacutelitos com a resposta ao tratamento com vareniclina e bupropiona
20
4 METODOLOGIA
41 Casuiacutestica
Foi realizado um estudo de coorte prospectivo no qual foram incluiacutedos 105
pacientes homens e mulheres fumantes provenientes do Programa de Assistecircncia ao
Fumante (PAF) do Instituto do Coraccedilatildeo do Hospital das Cliacutenicas da Faculdade de
Medicina da Universidade de Satildeo Paulo (InCor) com idade ge 18 anos IMC ge 185 e lt
30 kgm2 e que iniciariam o tratamento com vareniclina (n=74 para a mensuraccedilatildeo dos
analitos destes n=27 para as anaacutelises de expressatildeo gecircnica) ou com bupropiona (n=31
para a mensuraccedilatildeo dos analitos) (Figura 8)
A inclusatildeo dos pacientes ocorreu atraveacutes do protocolo de pesquisa ldquoEficaacutecia do
uso de marcadores geneacuteticos na escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismordquo o
qual foi aprovado no processo de submissatildeo ao Comitecirc de Eacutetica Institucional (CAAE
60133816000000068) - SDC 434116007 (Anexo 4) O presente estudo foi aprovado
como subprojeto do anterior atraveacutes do parecer nordm 2118913 (Anexo 1) Os pacientes
foram informados do estudo e consentiram a sua participaccedilatildeo ao assinar o termo de
consentimento livre e esclarecido (Apecircndice)
Foram excluiacutedos do estudo os pacientes que possuiacutessem desordens hepaacutetica
renal e gastrointestinal que comprometessem o metabolismo e eliminaccedilatildeo dos faacutermacos
os pacientes que faziam uso de medicamentos indutores ou inibidores das enzimas do
citocromo P450 nas uacuteltimas 6 semanas os pacientes etilistas e usuaacuterios de droga os
pacientes com doenccedilas psiquiaacutetricas instaacuteveis as mulheres em risco de gravidez e os
pacientes com contra-indicaccedilatildeo ao tratamento com bupropiona ou vareniclina
mencionados acima
21
Os pacientes foram acompanhados pela equipe do PAF e o tratamento
farmacoloacutegico foi conduzido por 12 semanas Foram considerados os seguintes
desfechos no tratamento ldquosucessordquo se o paciente parasse de fumar ateacute a 4ordf semana de
tratamento (T4) e ldquoresistenterdquo se o paciente natildeo conseguisse parar de fumar ateacute a 4ordf
semana de tratamento
22
Bupropiona
n=31
Visita T-1 Visita T0
(iniacutecio da medicaccedilatildeo)
Visita T2 Visita T4
Desfecho
Vareniclina
n=74
RNA Basal Vareniclina
n= 27
RNA RNA
Mensuraccedilatildeo de analitos vs Desfecho (T2)
vareniclina nicotina cotinina e hidroxicotinina
Mensuraccedilatildeo de analitos vs Desfecho (T2)
bupropiona hidroxibupropiona nicotina cotinina e hidroxicotinina
Soro
Soro
Figura 8 - Desenho do estudo O nuacutemero amostral total do estudo foi de 105 pacientes Foram incluiacutedos 74 pacientes tratados com vareniclina e 31 pacientes tratados com bupropiona Esses foram
submetidos agrave coleta de amostras de sangue no periacuteodo de 2 semanas (T2) apoacutes o iniacutecio da terapecircutica Apoacutes foi realizada a mensuraccedilatildeo de analitos e a anaacutelise de associaccedilatildeo com os desfechos de
tratamento Aleacutem disso os pacientes tratados com vareniclina tambeacutem foram submetidos agrave coleta de amostras para a obtenccedilatildeo de RNA em trecircs distintos periacuteodos de tempo antes de iniciar a
terapecircutica (T0) 2 semanas (T2) e 4 semanas apoacutes iniciar a terapecircutica farmacocoloacutegica (T4) Amostras de 14 pacientes que obtiveram sucesso no tratamento e de 13 que obtiveram resistecircncia (n=27)
foram analisadas quanto agrave expressatildeo de 17 genes candidatos (52 amostras ao todo 9 resistentes do tempo T0 7 resistentes do T2 8 resistente do T4 9 sucessos do T0 8 sucessos do T2 e 11 sucessos
do T4 vide toacutepico 42 Nuacutemero amostral) Apoacutes foram realizadas as anaacutelises de associaccedilatildeo entre os niacuteveis dos transcritos e os desfechos e tempos de tratamento Os pacientes foram acompanhados por
12 semanas durante o tratamento farmacoloacutegico no entanto o desfecho foi definido na 4 ordf semana (T4) pois apoacutes esse periacuteodo o tratamento seria reavaliado e poderia haver mudanccedila na medicaccedilatildeo T-
1= visita inicial T0= antes do iniacutecio da terapecircutica T2= 2 semanas apoacutes o iacutenicio do tratamento T4= 4 semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento T12= 12 semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento Desfecho na
visita T4 = ldquosucessordquo se o paciente parasse de fumar ateacute a 4ordf semana de tratamento (T4) e ldquoresistenterdquo se o paciente natildeo conseguisse parar de fumar ateacute a 4ordf semana de tratamento Fonte do autor
Visita T12
Final do tratamento farmacoloacutegico
RNA vs Desfecho (T0 T2 e T4)
14 sucessos e 13 resistentes
CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2
CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3 DRD4
HTR3A HTR3B COMT e SLC6A3
23
42 Fluxo de procedimentos adotados no atendimento aos pacientes
O tratamento farmacoloacutegico antitabagismo possui a duraccedilatildeo de 3 meses (12
semanas) No estudo de ldquoEficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticosrdquo foram coletados
dados cliacutenicos em 7 visitas T-1 (visita inicial) T0 (visita de iniacutecio do tratamento) T2
T4 T6 T8 e T12 (2 4 6 8 e 12 semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico)
Neste projeto foram utilizados os tempos de visita dos pacientes nas consultas
para a realizaccedilatildeo da coleta de amostras Dessa forma foi facilitado o comparecimento
desses pacientes ao procedimento Os pacientes precisavam estar comprometidos em
administrar os medicamentos todos os dias no horaacuterio combinado e terem
disponibilidade de tempo para as coletas as quais natildeo necessariamente coincidiram
com o horaacuterio das consultas pois as coletas foram realizadas no mesmo horaacuterio de
tomada do medicamento para que as anaacutelises de todos os pacientes pudessem ser
comparaacuteveis
Na visita T-1 foi aplicado o TCLE do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores
geneacuteticosrdquo bem como o questionaacuterio para coletar informaccedilotildees cliacutenicas Aleacutem disso os
pacientes foram avaliados quanto agrave DN atraveacutes do teste de Fagerstroumlm para DN (FTND)
100 e do escore de consumo situacional Issa (escore Issa) 101 (Anexos 2 e 3
respectivamente) O escore Issa eacute utilizado pelo PAF para a reclassificaccedilatildeo como
moderados ou altamente dependentes os pacientes que obteacutem o escore de FTND abaixo
de 5 mas que no entanto possuem niacutevel de DN consideraacutevel em relaccedilatildeo aos efeitos
psicoativos da nicotina A reclassificaccedilatildeo ocorre quando os pacientes obtecircm escore Issa
ge3 Apoacutes os pacientes foram randomizados em dois braccedilos do estudo tratamento com
vareniclina ou tratamento baseado na farmacogeneacutetica Os pacientes realizaram coleta
de sangue com o objetivo de obtenccedilatildeo do DNA para o estudo ldquoEficaacutecia do uso de
marcadores geneacuteticosrdquo
24
Apoacutes a genotipagem das amostras e escolha da medicaccedilatildeo dos pacientes
(vareniclina ou conforme geneacutetica) foi realizada ligaccedilatildeo telefocircnica para o paciente
informando o medicamento que iria tomar Nesta mesma ligaccedilatildeo o paciente tambeacutem foi
convidado a participar do presente estudo e todas as informaccedilotildees quanto agrave necessidade
de tomar o medicamento antitabagismo sempre no mesmo horaacuterio quanto aos dias das
coletas bem como as informaccedilotildees de preparaccedilatildeo para os procedimentos foram
transmitidas aos pacientes
Para os pacientes que seriam tratados com vareniclina ainda foi importante levar
em consideraccedilatildeo o horaacuterio que o paciente costumava tomar cafeacute da manhatilde para entatildeo
decidir o horaacuterio de administraccedilatildeo do faacutermaco pois o mesmo precisava ser
administrado apoacutes refeiccedilatildeo generosa com o intuito de diminuir o risco de naacuteusea
As coletas foram padronizadas para serem realizadas agraves manhatildes no mesmo
horaacuterio que o paciente tomaria a primeira dose do dia do medicamento antitabaacutegico O
horaacuterio de coleta entre os pacientes foi fixado entre 7 e 10 horas da manhatilde para evitar
variaccedilatildeo circadiana interpacientes No entanto entre as coletas do mesmo paciente o
horaacuterio de coleta e de administraccedilatildeo do medicamento foi sempre o mesmo com
variaccedilatildeo natildeo superior agrave 1 hora (esta variaccedilatildeo foi registrada)
Os pacientes foram orientados a realizar jejum de 10 horas (sendo liberada a
ingestatildeo de aacutegua e outros medicamentos ateacute 1 hora antes da coleta) e trazer o
medicamento antitabaacutegico para tomar apoacutes o procedimento A dose diurna dos
medicamentos antitabagismo natildeo foi administrada antes da coleta para evitar efeitos
agudos nas anaacutelises O periacuteodo de jejum foi realizado para que a amostra tivesse menor
quantidade de interferentes possiacutevel e tambeacutem para natildeo promover efeitos agudos dos
alimentos na expressatildeo gecircnica Um dia antes de cada coleta foi realizada ligaccedilatildeo
telefocircnica ou envio de mensagem para os pacientes com o objetivo de lembraacute-los do
25
procedimento das orientaccedilotildees de preparo e confirmar o uso e o cumprimento do horaacuterio
de administraccedilatildeo do medicamento antitabagismo (essa confirmaccedilatildeo da adesatildeo foi
realizada para as coletas nas visitas T2 e T4 quando os pacientes jaacute haviam iniciado o
tratamento farmacoloacutegico)
Na visita T0 para os pacientes que iniciariam o tratamento com vareniclina foi
aplicado o TCLE do presente projeto e colheu-se uma amostra de sangue para a
obtenccedilatildeo do RNA ainda antes de iniciarem o tratamento Foram fornecidas aos
pacientes as orientaccedilotildees de como tomar o medicamento e informaccedilotildees para a proacutexima
coleta Os pacientes foram orientados agrave tomarem o medicamento neste mesmo dia ou no
dia seguinte
Na visita T2 foram coletadas amostras de soro dos pacientes tratados com
bupropiona e amostras de soro e RNA dos pacientes tratados com vareniclina
Na visita T4 foram coletadas amostras de RNA dos pacientes tratados com
vareniclina
No Quadro 1 abaixo estatildeo resumidos os procedimentos orientaccedilotildees e coletas de
amostras
Quadro 1 - Procedimentos do protocolo em relaccedilatildeo aos pacientes
T-1 Aplicaccedilatildeo do TCLE do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores
geneacuteticosrdquo
Aplicaccedilatildeo de questionaacuterios
Coleta de DNA
1 dia antes de T0 Ligaccedilatildeo para informar o medicamento que o paciente iria tomar
Convite para participar do presente estudo
Determinar com o paciente qual era o melhor horaacuterio para
26
administraccedilatildeo do medicamento antibagismo (neste mesmo horaacuterio
que foram realizadas todas as coletas)
Orientaccedilotildees para a coleta em T0
T0 Aplicaccedilatildeo do TCLE do presente estudo
Coleta de amostra de RNA (para os pacientes que seriam tratados
com vareniclina)
Orientaccedilotildees para iniciar o tratamento no mesmo dia ou dia
seguinte
1 dia antes de T2 Orientaccedilotildees para coleta em T2
Confirmaccedilatildeo se o paciente estava tomando o medicamento e no
horaacuterio combinado
T2 Aplicaccedilatildeo do TCLE do presente estudo para os pacientes tratados
com bupropiona
Coleta de soro para os pacientes tratados com bupropiona e coleta
de RNA e soro dos pacientes tratados com vareniclina
1 dia antes de T4 Orientaccedilotildees para coleta em T2
Confirmaccedilatildeo se o paciente estava tomando o medicamento e no
horaacuterio combinado
T4 Coleta de RNA dos pacientes tratados com vareniclina
43 Coleta e armazenamento das amostras dos pacientes tratados com vareniclina e
bupropiona
Os pacientes tratados com vareniclina foram submetidos agrave coleta de sangue para
a obtenccedilatildeo de RNA em 3 periacuteodos de tempo T0 (ainda antes de iniciar o tratamento T2
27
e T4 Para isto foram utilizados os tubos PAXgene Blood RNA Tubes BRT (Qiagen
USA) para a obtenccedilatildeo de RNA Apoacutes a coleta os tubos PAXgene foram encubados em
bancada por 2 horas agrave temperatura ambiente para garantir a lise completa das ceacutelulas
sanguiacuteneas e apoacutes os tubos foram armazenados a -20degC ateacute a extraccedilatildeo do RNA das
amostras
No periacuteodo T2 tambeacutem foram coletadas amostras para a obtenccedilatildeo do soro dos
pacientes tratados com vareniclina e bupropiona Neste periacuteodo as concentraccedilotildees dos
metaboacutelitos dos faacutermacos jaacute se encontravam em estado de equiliacutebrio Para isto foram
utilizados tubos sem aditivo (Vacuette Greiner Bio-one) Os tubos foram mantidos a
temperatura ambiente ateacute a formaccedilatildeo de coaacutegulo Apoacutes os tubos foram centrifugados a
4degC a 3000 rpm por 10 min para se obter amostras de soro As amostras foram entatildeo
aliquotadas em 4 criotubos de soro e armazenadas em freezer a -80ordmC ateacute o momento
das anaacutelises
44 Nuacutemero amostral
Quanto ao nuacutemero amostral para o ensaio de expressatildeo gecircnica dos 74 pacientes
tratados com vareniclina foram escolhidas amostras de 27 pacientes (14 do grupo
sucesso e 13 do grupo resistente) baseado em estudos anteriores 83 102 que seguiram
corretamente o jejum que realizaram a tomada do medicamento nos horaacuterios
combinados e compareceram em todos e tempos de coleta Sendo ao todo 81 amostras
devido aos de 3 tempos de tratamento (T0 T2 e T4)
No entanto algumas amostras natildeo apresentaram bons resultados para a anaacutelise
de expressatildeo gecircnica e realizamos o ensaio de expressatildeo para 60 amostras de diversos
tempos Oito amostras natildeo apresentaram resultados de amplificaccedilatildeo e finalizamos com
52 amostras ao todo (9 resistentes do tempo T0 7 resistentes do T2 8 resistentes do T4
28
9 sucessos do T0 8 sucessos do T2 e 11 sucessos do T4) provenientes de 14 pacientes
do grupo sucesso e 13 do grupo resistente Esse tamanho amostral para cada grupo de
anaacutelise eacute comparaacutevel agrave estudos anteriores 102
Quanto ao nuacutemero amostral para a mensuraccedilatildeo dos analitos houve a inclusatildeo de
74 pacientes tratados com vareniclina e 31 tratados com bupropiona Nuacutemero amostral
semelhante foi utilizado no estudo de Laib et al 74 Das 105 amostras 3 amostras dos
pacientes tratados com vareniclina e 1 de paciente tratado com bupropiona apresentaram
concentraccedilotildees abaixo do limite de quantificaccedilatildeo (LQ) e estas foram excluiacutedas das
anaacutelises de concentraccedilatildeo dos analitos ficando com nuacutemero amostral final de 71 para
vareniclina e 30 para bupropiona
45 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica para amostras de pacientes tratados com
vareniclina
451 Concentraccedilatildeo purificaccedilatildeo e extraccedilatildeo de RNA
O processo de purificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo do RNA foi realizado atraveacutes do
PAXgene Blood RNA Kit (Qiagen USA) Antes de iniciar o procedimento a
temperatura dos tubos PAXgene Blood tubes (BRT) (Qiagen USA) os quais estavam
armazenados em freezer -20degC foi estabilizada mantendo os tubos em temperatura
ambiente em torno de 4 horas ou over night
Para o processo de purificaccedilatildeo do RNA primeiramente realizou-se a
homogeneizaccedilatildeo do sangue total contido no tubo PAXgene Blood tubes (BRT) e a
centrifugaccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos por 10 min em 3000 rcf havendo a formaccedilatildeo de um
pellet e o sobrenadante foi desprezado Apoacutes foi realizada a lavagem do pellet
adicionando-se 4 mL de aacutegua livre de RNase (RNFW) mistura foi submetida ao voacutertex
ateacute a dissoluccedilatildeo visiacutevel do pellet e o conteuacutedo foi centrifugado por 10 minutos a 3000
29
rcf sendo descartado o sobrenadante O pellet foi ressuspendido com 350 μL de tampatildeo
de ressuspensatildeo (BR1) atraveacutes de voacutertex ateacute a sua dissoluccedilatildeo e transferido para o tubo
de microcentrifugaccedilatildeo (15 mL MCT) Foram adicionados no tubo MCT 300 μL de
tampatildeo de ligaccedilatildeo (BR2) e 40 μL de proteinase K (PK) a mistura foi submetida ao
voacutertex durante 5 segundos e incubada durante 10 minutos a 55degC com agitaccedilatildeo de 1400
rpm provocando dessa forma a digestatildeo de proteiacutenas
Apoacutes o processo de incubaccedilatildeo foram realizados diversos processos de remoccedilatildeo
de impurezas em colunas de rotaccedilatildeo O lisado foi transferido para a coluna de rotaccedilatildeo
do homogeneizador PAXgene (PSC lilaacutes) a qual foi colocada em um tubo de
processamento (PT) de 2 mL e centrifugado durante 3 minutos agrave velocidade de 16100
rcf dessa forma foi realizada a homogeneizaccedilatildeo do lisado de ceacutelulas e remoccedilatildeo dos
detritos celulares residuais Em seguida o sobrenadante da fraccedilatildeo residual foi
transferido para o tubo de microcentrifugaccedilatildeo (15 mL MCT) novo (sem interferir no
pellet) e foram adicionados 350 μL de etanol (96-100 grau de pureza PA) a mistura
foi submetida ao voacutertex e centrifugada por breves instantes (1-2 segundos 500-1000 x g)
para remover as gotas presentes no interior da tampa do tubo
Foram transferidos 700 μL de amostra para a coluna de rotaccedilatildeo de RNA
PAXgene (PRC vermelho) esta foi colocada e um tubo de processamento (PT) de 2
mL no qual foi centrifugado durante 1 minuto a 12000 rcf Apoacutes a coluna de rotaccedilatildeo
foi colocada em um tubo PT novo (o tubo PT utilizado anteriormente foi descartado) O
restante da amostra foi colocado na mesma coluna de rotaccedilatildeo PRC e o processo de
centrifugaccedilatildeo foi repetido por mais 2 vezes sempre transferindo a coluna para um tubo
de processamento novo Antes da uacuteltima centrifugaccedilatildeo foram adicionados 350 μL de
tampatildeo de lavagem 1 (BR3) na coluna PRC
30
Em seguida foram adicionados 10 μL de soluccedilatildeo-matildee de DNase I (RNFD) a 70
μL de tampatildeo de digestatildeo de DNA (RDD) em um tubo de microcentrifugaccedilatildeo de 15
mL (MCT) O conteuacutedo foi misturado suavemente e centrifugado durante breves
instantes para colher o liacutequido residual dos lados do tubo Apoacutes 80 μL dessa mistura
foram transferidos diretamente para a membrana da coluna PRC e esta foi incubada agrave
temperatura ambiente (20-30degC) durante 15 minutos
Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foram adicionados 350 μL de tampatildeo de lavagem
1 (BR3) para a membrana da coluna e esta foi centrifugada durante 1 min a 12000 rcf
Apoacutes a coluna PRC foi colocada em um tubo (PT) novo e foram adicionados 500 μL de
tampatildeo de lavagem 2 (BR4) na membrana da coluna A centrifugaccedilatildeo foi repetida o
tubo PT foi descartado e a coluna PRC foi colocada em um novo tubo PT A lavagem
com 500 uL de BR4 e a centrifugaccedilatildeo foi repetida novamente (poreacutem o tempo de
centrifugaccedilatildeo foi de 3 minutos) Apoacutes foi realizada uma centrifugaccedilatildeo adicional em um
tubo PT novo durante 1 minuto a 12000 rcf (sem adiccedilatildeo de tampatildeo)
A coluna de rotaccedilatildeo (PRC) foi colocada em tubo de 15 mL (MCT) Foram
adicionados diretamente na membrana da coluna 80 μL de tampatildeo de eluiccedilatildeo (BR5) a
qual foi encubada agrave temperatura ambiente por 5 minutos e centrifugada por 1 minuto a
12000 rcf para eluir o RNA
As amostras foram quantificadas atraveacutes de leitura em espectrofotocircmetro no
comprimento de onda 260 nm (utilizando como branco o tampatildeo BR5) e foram
armazenadas a -20ordmC ateacute o momento das anaacutelises Para avaliar a qualidade do RNA
gerado foi realizada uma eletroforese em gel de agarose para a verificaccedilatildeo da
integridade do RNA ribossomal
31
452 Siacutentese de cDNA
O processo de siacutentese de cDNA foi realizado atraveacutes do RT2 First Strand Kit
(Qiagen USA) Os reagentes do kit foram descongelados e centrifugados brevemente
(10-15 segundos)
Primeiramente foi preparada uma mix para a degradaccedilatildeo do DNA genocircmico
composta por 2microL de tampatildeo GE 800 ng de RNA e quantidade variaacutevel de aacutegua livre
de RNase ateacute o volume final de 10 μL ou 8 μL de RNA (para amostras com
concentraccedilotildees abaixo de 100 ngμL) sem a aacutegua livre de RNase A mistura foi incubada
a 42ordmC por 5 minutos Apoacutes a incubaccedilatildeo a mistura foi colocada imediatamente em gelo
durante pelo menos 1 min
Apoacutes foi preparada uma mix para a realizaccedilatildeo da transcriccedilatildeo reversa esta foi
composta por 4 microL tampatildeo 5x (BC3) 1 microL de controle P2 (controle externo de RNA) 2
microL de mix de transcriptase reversa (RE3) e 3 microL de aacutegua livre de Rnase Foram
adicionados 10 μL da mix preparada em cada tubo contendo a mix de eliminaccedilatildeo de
DNA genocircmico A mistura foi homogeneizada delicadamente com a pipeta e incubada a
42 degC durante exatamente 15 min em seguida a reaccedilatildeo foi interrompida por incubaccedilatildeo
a 95 degC durante 5 min Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foram adicionados a cada reaccedilatildeo
91 μL de aacutegua livre de RNase e a mistura foi homogeneizada atraveacutes de pipeta diversas
vezes O produto final foi armazenado a -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo em cadeia da
polimerase (PCR) em tempo real
453 Ensaio de controle de qualidade das amostras para o ensaio de expressatildeo
gecircnica
Todas as amostras de cDNA foram analisadas quanto sua qualidade pelo ensaio
de controle de qualidade (disco QC Qiagen) em disco de 100 poccedilos (representaccedilatildeo do
32
disco nas Figuras 9 e 10) atraveacutes do PCR em tempo real com equipamento Rotor Gene
6000 (Corbett) Cada disco QC tem a capacidade de analisar 12 amostras sendo
necessaacuterios 5 discos para analisar 60 amostras
O disco QC eacute composto por primers especiacuteficos para a amplificaccedilatildeo de 2
Housekeeping genes ndash ACTB e HPRT1 (genes constitutivos que satildeo necessaacuterios para a
manutenccedilatildeo baacutesica da funccedilatildeo celular e satildeo expressos em todas as ceacutelulas de um
organismo em condiccedilotildees normais e fisiopatoloacutegicas) e 6 controles 1 controle de
transcriccedilatildeo reversa (RTC) 1 controle positivo de PCR (PPC) 1 controle de
contaminaccedilatildeo com DNA genocircmico (GDC) 1 controle de natildeo transcriccedilatildeo reversa
(NTR) 1 PPC (sem amostra) e 1 controle negativo NTC (mapa na Figura 10)
Foram preparadas 12 mixes para cada uma das amostras de cDNA Sendo 92 μL
de aacutegua livre de RNase e 08 μL de cDNA essas quantidades foram multiplicadas por 6
para se ter sobra e distribuir em 5 poccedilos cada mix de amostra (poccedilos que continham
pares de primers para 2 housekeeping genes e 3 controles) Foram distribuiacutedos 10 μL de
mix e 10 μL de RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR Master Mix (Qiagen USA) em cada
poccedilo (linhas A a E) Essa master mix conteacutem corante fluorescente intercalante de DNA
Apoacutes foram preparadas 12 mixes uma para cada amostra matildee de RNA (diluiacutedo
1100) Foram utilizados 963 μL de aacutegua livre de RNase e 072 μL de RNA (1100)
essas quantidades foram multiplicadas por 3 para se ter sobra Foram pipetados 1037
μL de mix de RNA e 963 μL de RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR Master Mix em
cada poccedilo da linha F para a anaacutelise do controle de transcriccedilatildeo reversa NTR
Apoacutes foram preparadas mixes sem as amostras para os 2 uacuteltimos controles PPC
e NTC compostas por 10 μL de aacutegua e 10 μL de RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR
Master Mix (multiplicados por 24) para as linhas G e H
33
O disco foi submetido agrave seguinte programaccedilatildeo 1 ciclo de 10 minutos a 95degC
(temperatura de ativaccedilatildeo da Taq polimerase) e 40 ciclos de 15 segundos a 95degC e 30
segundos a 60degC (para a amplificaccedilatildeo e realizaccedilatildeo da captura dos dados de
fluorescecircncia) Atraveacutes do software real-time cycler (Qiagen USA) foi ajustada a linha
de base (Threshold) do graacutefico de amplificaccedilatildeo logariacutetimica do cDNA para dessa
forma remover ruiacutedos na anaacutelise e verificar em qual ciclo de PCR que cada amostra
amplificou (cicle threshold ndash CT) (Figura 11) Os valores de CT foram planilhados e
analisados conforme os paracircmetros de qualidade (Quadro 2)
Figura 9 - Representaccedilatildeo do Rotor-Disc 100 Refere-se a um disco de material plaacutestico contendo 100
poccedilos Este veio de faacutebrica personalizado com primers para os ensaios QC ou RT2 profiler PCR array As
amostras e mixes satildeo pipetadas em cada poccedilo O disco eacute posteriormente colocado em um anel metaacutelico
proacuteprio para o encaixe no equipamento Rotor-Gene Cada poccedilo eacute nomeado com uma letra e um nuacutemero
iniciando no A1 ateacute o H12 Os quatro uacuteltimos poccedilos natildeo satildeo nomeados e natildeo conteacutem ensaio (no entanto
preenchemos com mix para equilibrar o peso do disco) Fonte do autor
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB
B HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1
C RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC
D PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC
E GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC
F NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR
G PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC
H NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC
Figura 10 - Mapa do disco QC (representaccedilatildeo planilhada) Do A1 ao B12 housekeeping genes para 12
amostras C1 ao H12 controles Cada grupo de cor representa a colocaccedilatildeo de uma mix Do A1 ao E1 mix de
A1
C1
E1
G1
34
cDNA da amostra 1 do A2 ao E2 mix de cDNA da amostra 2 (assim por diante ateacute A12 e E12) Linha F controle
com RNA diluiacutedo (1100) Linhas G e H controles com aacutegua livre de RNase Fonte do autor
Figura 11 - Exemplo de ajuste de Threshold A linha de base (Threshold) eacute ajustada na fase linear do ciclo
de amplificaccedilatildeo Dessa forma eacute possiacutevel remover os ruiacutedos e se obter o ciclo em que cada amostra foi
amplificada na PCR (CT) Fonte do autor imagem do equipamento Rotor Genereg
Quadro 2 - Paracircmetros de qualidade do ensaio QC
Controles Teste Passa no teste Falha no teste
Controle de transcriccedilatildeo reversa CT RTC (linha B) ndash CTPPC (linha G) lt5 gt5
Controle positivo de PCR CT PPC (linha G)
CT PPC (linha D) - CT PPC (linha G)
14 plusmn 2
lt3
gt16
gt3
Controle de contaminaccedilatildeo de DNA genocircmico CT GDC (linha E) gt33 lt33
Controle de natildeo transcriccedilatildeo reversa CT NTR (linha F) ge 33 ou NA lt33
Controle negativo CT NTC (linha H) ge 33 ou NA lt33
10-02
10-04
10-06
10-08
10-10
10-12
10-14
10-16
10-18
10-20
10-22
10-24
10-26
10-28
5 10 15 20 25 30 35 40
Ciclos
Flu
ore
scecircn
cia
No
rmal
izad
a
Fase Linear
35
De 60 amostras analisadas 52 passaram no teste quanto aos criteacuterios de
qualidade e prosseguiram para a anaacutelise de expressatildeo gecircnica do painel de genes
escolhidos
454 Ensaio de expressatildeo gecircnica
O protocolo de expressatildeo foi realizado por PCR em tempo real atraveacutes do
equipamento Rotor Gene 6000 (Corbett) com ensaio customizado RTsup2 Profiler PCR
Array em disco com capacidade de 100 poccedilos (Rotor-Disc 100 Qiagen USA) Nos 100
poccedilos de cada disco estavam distribuiacutedos primers especiacuteficos para o ensaio de expressatildeo
de 17 genes (Figuras 9 e 12 e Quadro 3) (17 pares de primers para cada gene repetidos 4
vezes na placa pois foi possiacutevel a anaacutelise de 4 amostras de cDNA por disco) 4 pares de
primers para os Housekeeping genes B2M GAPDH HPRT1 e ACTB (Quadro 4) e 3
controles 1 controle de contaminaccedilatildeo com DNA genocircmico (HGDC) 1 controle de
transcriccedilatildeo reversa (RTC) e 1 controle positivo de PCR (PPC) Os 4 Housekeeping
genes e os 3 controles tambeacutem satildeo repetidos 4 vezes no disco (Figura 5) Para as
reaccedilotildees foi utilizada a RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR Master Mix (Qiagen USA)
Primeiramente foi preparada 4 mixes (uma para cada amostra de cDNA) para um
disco de 100 poccedilos composta por 275 μL de 2X RT2 SYBR Green ROX FAST
Mastermix 2262 microL de aacutegua livre de RNase e 488 microL de amostra de cDNA cada Em
cada um dos poccedilos do disco foram adicionados 20 μL da mix preparada (utilizando
mixes de diferentes amostras a cada 24 poccedilos) Apoacutes deste processo o disco foi selado
com o Rotor-Disc Heat Sealer (Qiagen USA) e colocado no equipamento Rotor-Gene
6000 (Corbett) O real-time foi programado para ciclagem de PCR nas seguintes
condiccedilotildees 1 ciclo a 95deg C com duraccedilatildeo de 10 minutos 40 ciclos a 95degC por 15
segundos e 60degC por 30 segundos
36
Quadro 3 - Genes escolhidos para o ensaio de expressatildeo
CHRNA3 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α3
CHRNA4 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α4
CHRNA5 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α5
CHRNA6 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α6
CHRNA7 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α7
CHRNB2 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade β2
CHRNB3 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade β3
CHRNB4 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade β4
CHRNG Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade γ
DRD1 Codifica o receptor de dopamina tipo 1
DRD2 Codifica o receptor de dopamina tipo 2
DRD3 Codifica o receptor de dopamina tipo 3
DRD4 Codifica o receptor de dopamina tipo 4
HTR3A Codifica o receptor 3A de serotonina
HTR3B Codifica o receptor 3B de serotonina
COMT Codifica a enzima catecol-O-metiltransferase (metaboliza dopamina)
SLC6A3 Codifica a proteiacutena DAT que promove a recaptaccedilatildeo de dopamina DAT
Quadro 4 - Housekeeping genes
B2M Codifica a microbulina subunidade β2
GAPDH Codifica a enzima gliceraldeiacutedo ndash 3 fosfato desidrogenase
HPRT1 Codifica a enzima hipoxantina fosforribosiltransferase 1
ACTB Codifica a β actina
37
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
B DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
C CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
D DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
E CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
F DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
G CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
H DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
Figura 12 - Mapa do disco do ensaio RT2 profiler PCR array (representaccedilatildeo planilhada) O disco conteacutem 100 poccedilos no
entanto apenas 96 poccedilos contecircm ensaios sendo que 4 poccedilos ficam vazios A1 ao B5 = genes escolhidos para anaacutelise de
expressatildeo Do B6 ao B9= Housekeeping genes Do B10 ao B12= controles C1 ao D12 E1 ao F12 e G1 ao H12= repeticcedilatildeo dos
ensaios permitindo a anaacutelise completa de 4 amostra Cada cor diferente (a cada 2 linhas) representam a anaacutelise de uma
amostra Fonte do autor
455 Anaacutelise dos dados de expressatildeo gecircnica
Para a anaacutelise de expressatildeo gecircnica foi utilizado o meacutetodo de 2-∆∆CT 103 Apoacutes o
teacutermino da corrida do ensaio de expressatildeo gecircnica atraveacutes do software real-time cycler
(Qiagen USA) foi ajustada a linha de base (threshold) no graacutefico de amplificaccedilatildeo em
escala logariacutetmica (Figura 11) Todos os discos (total de 13) foram analisados com o
mesmo valor de threshold (010869) para que os valores de CT de todas as amostras
fossem comparaacuteveis
Os dados de CT tambeacutem foram inseridos no programa SPSS para as anaacutelises
estatiacutesticas Os valores de CT foram normalizados atraveacutes da expressatildeo dos
housekeeping genes utilizando a seguinte foacutermula ∆CT= (CTamostra ndash a meacutedia de
CThousekeeping genes) Os valores de mediana de 2-∆CT (em escala logariacutetmica) de cada grupo
foram utilizados para os testes de hipoacutetese Apoacutes foram obtidos os valores de ∆∆CT
(mediana de ∆CTgrupo teste ndash mediana de ∆CT grupo referecircncia) e o fold change (aumento ou
diminuiccedilatildeo da expressatildeo dos genes em relaccedilatildeo ao grupo referecircncia) foi calculado
atraveacutes da foacutermula 2-∆∆CT
38
46 Mensuraccedilatildeo de bupropiona vareniclina e de seus metaboacutelitos por HPLC-
MSMS
461 Materiais equipamentos e condiccedilotildees adotadas para a mensuraccedilatildeo dos
analitos apoacutes validaccedilatildeo do meacutetodo
Padrotildees analiacuteticos e padrotildees internos (PIs) deuterados bupropiona
hidroxibupropiona vareniclina (Santa Cruzreg) vareniclina d4 (TRCreg) nicotina
(ChemCruzreg) cotinina (Sigma-Aldrichreg) hidroxicotinina (Torontoreg) e
hidroxibupropiona d6 nicotina d4 cotinina d3 hidroxicotinina d3 (Cerilliantreg)
Solventes orgacircnicos Metanol acetonitrila (JT Baker) e sais acetato de amocircnio
fosfato de soacutedio (Vetecreg) fosfato de soacutedio monobaacutesico (Proquimiosreg) fosfato
de amocircnio (Reagenreg) formiato de amocircnio (Sigma-Aldrichreg)
Equipamentos e acessoacuterios
o HPLC Shimadzureg (Kyoto Japatildeo) equipado com uma vaacutelvula comutadora
de 6 vias automaacutetica
o Auto-amostrador Shimadzureg (Kyoto Japatildeo)
o Vaacutelvula comutadora de 6 vias 11R-0016H (Valcoreg Houston TX USA)
o Espectrocircmetro de massas LCMS-8030 Shimadzureg (Kyoto Japatildeo)
o Analisador de massa triplo quadrupolo (Shimadzureg Kyoto Japatildeo)
o Coluna analiacutetica ACEreg C18 (100 mm x 21 mm x 3 microm comprimento
diacircmetro interno e tamanho de partiacutecula)
o Preacute-coluna ACEreg C18 (21mm x 3 microm diacircmetro tamanho de partiacutecula)
39
o Coluna de extraccedilatildeo coluna contendo aproximadamente 70 mg do novo
RAM
Software
o LabSolutionsreg para anaacutelise dos dados e programaccedilatildeo do meacutetodo no
HPLC-MSMS
Condiccedilotildees espectrometricas e cromatograacuteficas
o Temperatura da forno da coluna 40ordmC
o Temperatura da linha de dessolvataccedilatildeo 250ordmC
o Temperatura do bloco de aquecimento 400ordmC
o Fluxo do gaacutes de nebulizaccedilatildeo 20 ml min-1
o Fluxo de gaacutes para secagem 150 ml min-1
o Energias de colisatildeo precursores e fragmentos dos analitos (Tabela 1)
o Fase moacutevel de carregamento (liberada pela bomba A) Aacutegua ultra pura
em um fluxo de 04 mL min-1
o Fase moacutevel de eluiccedilatildeoseparaccedilatildeoionizaccedilatildeo (liberada pela bomba C)
metanol tampatildeo formiato de amocircnio 001 mol L-1 pH=42 (9010 vv)
em um fluxo de 04 mL min-1
o Fase moacutevel de limpeza (liberada pela bomba B) acetonitrila aacutegua ultra
pura isopropanol (751510 vvv) em um fluxo de 10 mL min -1
o Sistema de anaacutelise ULPC-MSMS no modo columns switching em
configuraccedilatildeo backflush modo de ionizaccedilatildeo positiva por electrospray
(ESI+)
40
Tempos
o Fase de carregamento e condionamento do sistema (vaacutelvula na posiccedilatildeo
1) 0 - 30 min
o Fase de eluiccedilatildeo (vaacutelvula na posiccedilatildeo 2) 03 min
o Fase de limpeza separaccedilatildeo e anaacutelise por MS (vaacutelvula na posiccedilatildeo 1) 67
min
o Recondiocionamento do sistema (vaacutelvula na posiccedilatildeo 1) 50 min
o Tempo total incluindo todos os processos 15 min
o
Tabela 1 - Analitos precursores fragmentos e energias de colisatildeo otimizados
Analitos Precursor (mz) Fragmentos (mz) Energia de colisatildeo
(KV)
Vareniclina 212 169 -23
183 -24
141 -43
Bupropiona 240 131 -28
139 -26
103 -39
Hidroxibupropiona 256 139 -29
131 -29
167 -29
Nicotina 163 117 -28
130 -22
77 -44
Cotinina 177 80 -24
98 -21
70 -34
Hidroxicotinina 193 80 -30
134 -19
118 -21
Fragmentos quantificados
41
462 Visatildeo geral do desenvolvimento da coluna e padronizaccedilatildeo da anaacutelise
Todos os padrotildees para as anaacutelises dos analitos foram adquiridos e armazenados
conforme recomendaccedilatildeo do fabricante ateacute o momento da padronizaccedilatildeo das anaacutelises As
anaacutelises foram realizadas atraveacutes da colaboraccedilatildeo com o Prof Dr Eduardo Costa de
Figueiredo Dr Henrique Dipe Faria e Prof Dra Isarita Martins do Laboratoacuterio de
Anaacutelises de Toxicantes e Faacutermacos ndash LATF da Faculdade de Ciecircncias Farmacecircuticas da
Universidade Federal de Alfenas (Unifal MG) A escolha de cada analito foi
determinada atraveacutes de sua importacircncia cliacutenica e tambeacutem devido agrave disponibilidade dos
padrotildees dos analitos no mercado Os analitos mensurados para as amostras provenientes
dos pacientes tratados com os faacutermacos antitabagismo foram bupropiona
hidroxibupropiona vareniclina nicotina cotinina e hidroxicotinina (os trecircs uacuteltimos satildeo
proveninentes do fumo) Foi realizado um levantamento das propriedades fiacutesico-
quiacutemicas dos metaboacutelitos conforme Quadro 5
Para a remoccedilatildeo das macromoleacuteculas (como proteiacutenas) presentes na matriz de
soro foi desenvolvida uma coluna extratora de acesso restrito a partir de nanotubos
hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados com ligaccedilotildees hidrofiacutelicas (novo RAM) O
material foi desenvolvido e caracterizado antes mesmo da padronizaccedilatildeo das condiccedilotildees
de anaacutelise nos equipamentos
Foram obtidas as condiccedilotildees espectomeacutetricas (modo de ionizaccedilatildeo e as condiccedilotildees
de sua fonte temperatura do bloco de calor fluxo de gaacutes nebulizador e fluxo do gaacutes
secante) e cromatograacuteficas (tempo de retenccedilatildeo e separaccedilatildeo e aacutereas obtidas dos picos de
cada analito) Apoacutes as condiccedilotildees foram otimizadas em sistema de cromatografia liacutequida
de alta eficiecircncia multidimensional seguida por espectrometria de massa (HPLC-
MSMS) O sistema multimensional constituiacutedo por vaacutelvulas comutadoras permite a
anaacutelise online e automatizada com configuraccedilatildeo via software As vaacutelvulas permitem
42
diferentes posiccedilotildees promovendo a ocorrecircncia de eventos distintos no sistema como a
concentraccedilatildeo dos analitos e remoccedilatildeo de macromoleacuteculas atraveacutes da coluna extratora
(posiccedilatildeo 1) a eluiccedilatildeo dos analitos da coluna extratora para a coluna analiacutetica (posiccedilatildeo 2)
e novamente na posiccedilatildeo 1 ocorre a eluiccedilatildeo dos analitos da coluna analiacutetica para o
espectrocircmetro de massas a limpeza da coluna extratora e o recondionamento do
sistema
Quadro 5 - Propriedades fiacutesico-quiacutemicas dos analitos
Bupropiona
Peso molecular 27620 gmol
Ponto de fusatildeo 243-246deg C
Solubilidade em aacutegua 00693 mgmL
pKa (aacutecido forte) 1829
pKa (mais forte baacutesico) 822
Aacuterea da superfiacutecie polar 291 Aring2
Log P 36
Hidroxibupropiona
Peso molecular 25574 gmol
Ponto de fusatildeo 121-123degC
Solubilidade em aacutegua 02 mgmL
pKa (aacutecido forte) 1479
pKa (mais forte baacutesico) 765
Aacuterea da superfiacutecie polar 4933 Aring2
Log P 222
Vareniclina
Peso molecular 21127 gmol
Pressatildeo de vapor 25degC
Solubilidade em aacutegua 877 x 10-2 gL
pKa1 182 pKa2 = 973
Aacuterea da superfiacutecie polar 378 Aring2
Log P 103
43
Nicotina
Peso molecular 16223 gmol
Pressatildeo de vapor 618 degC
Solubilidade em aacutegua 100 mM
pKa 85 pKb1 616 a 15degC e pKb2 1096
Aacuterea da superfiacutecie polar 378 Aring2
Log P 117
Cotinina
Peso molecular 176215 gmol
Solubilidade em aacutegua 10 x10-6 mgL a 25degC
Aacuterea da superfiacutecie polar 332 Åsup2
Log P 007
Hidroxicotinina
Peso molecular 192214 gmol
Aacuterea da superfiacutecie polar 53 Å2
ACDLog P -148
Fonte Banco de dados Pubchem e ChemSpider Obs Algumas informaccedilotildees referentes agraves
propriedades fiacutesico-quiacutemicas dos analitos ainda natildeo estatildeo disponiacuteveis na literatura pKa= valor
negativo do logaritmo da constante de dissociaccedilatildeo de um aacutecido pKb= valor negativo do logaritmo
da constante de dissociaccedilatildeo de uma base LogP= coeficiente de particcedilatildeo
463 Desenvolvimento da coluna RAM para a purificaccedilatildeo da amostra
As amostras de soro e plasma satildeo matrizes ricas em moleacuteculas que interferem na
mensuraccedilatildeo dos analitos como lipiacutedios e principalmente proteiacutenas Estas podem
obstruir colunas analiacuteticas e diminuir a concentraccedilatildeo dos analitos jaacute que muitos destes
estatildeo ligados a essas proteiacutenas Devido a esse fato geralmente eacute realizada uma
preparaccedilatildeo das amostras antes de sua mensuraccedilatildeo Essa preparaccedilatildeo envolve processos
como a extraccedilatildeo com o uso de solventes precipitaccedilatildeo entre outros os quais geram
custo de materiais aumento do tempo de trabalho e de erros 104 105 51 106 Dessa forma
44
diversos estudos vecircm tentando desenvolver meacutetodos que natildeo exijam tanta manipulaccedilatildeo
das amostras Os materiais de acesso restrito (RAMs) estatildeo sendo utilizados para a
menor preparaccedilatildeo da amostra e sua injeccedilatildeo direta Dentre os RAMs estatildeo os nanotubos
de carbono (CNTs) modificados 107-109 Nesta colaboraccedilatildeo foi desenvolvida a coluna
extratora composta por nanotubos hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados com a
adiccedilatildeo de grupos hidrofiacutelicos Esse material entrou com pedido de patente na Agecircncia
de Inovaccedilatildeo e Empreendedorismo da Universidade Federal de Alfenas-MG atraveacutes do
Processo 230870001282019-84 e portanto a sua composiccedilatildeo e os resultados de
alguns testes da sua caracterizaccedilatildeo seratildeo mantidos em sigilo (vide declaraccedilatildeo Anexo
5)
Diferentes RAMs foram sintetizados a partir de CNTs para que fosse obtido o
melhor desempenho na remoccedilatildeo de macromoleacuteculas e retenccedilatildeo dos analitos da amostra
Os CNTs utilizados foram compostos por paredes muacuteltiplas pois apresentam uma
elevada aacuterea superficial e consequentemente uma maior capacidade de adsorccedilatildeo Os
CNTs foram adquiridos comercialmente e inicialmente foram funcionalizados a partir
de reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo aacutecida com aacutecido niacutetrico como desenvolvido por Barbosa et al 109
Os CNTs oxidados foram utilizados em etapas de siacutentese posteriores
adicionando grupos quiacutemicos hidrofiacutelicos que fossem capazes de realizar a exclusatildeo de
proteiacutenas e permitir a adsorccedilatildeo dos analitos As reaccedilotildees de siacutentese posteriores foram
semelhantes as promovidas para a realizaccedilatildeo de revestimento externo de poliacutemeros
poliacutemeros biomimeacuteticos nanomagneacuteticos com e sem acesso restrito 107 110-112 poreacutem
foram utilizadas estrateacutegias e proporccedilotildees de reagentes distintas na tentativa de obter o
RAM mais eficiente Aleacutem disso tambeacutem foi priorizada a siacutentese mais simples e
reprodutiacutevel bem como o material que apresentar maior vida uacutetil Os diferentes
materiais sintetizados foram testados em relaccedilatildeo agrave exclusatildeo de proteiacutenas e adsorccedilatildeo dos
45
analitos e tambeacutem foram realizados testes de caracterizaccedilatildeo para determinar suas
propriedades fiacutesico-quiacutemicas e confirmar a estrutura originada
A anaacutelise termogravimeacutetrica foi realizada com a finalidade de determinar a
variaccedilatildeo de massa (ganho ou perda) do RAM em funccedilatildeo de emprego de temperatura
programada proporcionando informaccedilotildees importantes a respeito da estabilidade do
material e de sua composiccedilatildeo Outras teacutecnicas tambeacutem foram utilizadas com o objetivo
de obter dados relacionados agrave estrutura e composiccedilatildeo do novo RAM como o
infravermelho e anaacutelise elementar Anaacutelises de microscopias eletrocircnicas de varredura e
de transmissatildeo tambeacutem foram realizadas para a determinaccedilatildeo da composiccedilatildeo da
superfiacutecie externa e arranjo estrutural do material com as modificaccedilotildees realizadas
Apoacutes o teacutermino do preparo do novo RAM eles foram colocados dentro de uma
coluna (aproximadamente 70 mg) conforme (Figura 13) A coluna foi posteriormente
empregada no preparo de amostras online no sistema cromatograacutefico
Figura 13 ndash Representaccedilatildeo da composiccedilatildeo da coluna extratora (Novo RAM) O novo RAM formado
a partir de nanotubos hiacutedridos de carbono e siacutelica dotado de muacuteltiplas camadas e modificados com grupos
hidrofiacutelicos promovem a retenccedilatildeo de analitos e exclusatildeo de macromoleacuteculas como proteiacutenas O RAM foi
posteriormente empacotado em coluna para a utilizaccedilatildeo em sistema cromatograacutefico Fonte adaptado do
colaborador Dr Henrique Dipe de Faria Unifal-MG
46
464 Caracterizaccedilatildeo do novo RAM
4641 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA
Na ausecircncia da coluna extratora foi preparada primeiramente uma soluccedilatildeo
aquosa de albumina de soro bovino (BSA) em uma concentraccedilatildeo de 44 mgmL-1
(semelhante agrave concentraccedilatildeo de proteiacutenas presentes no plasma humano) Foram injetados
10 microl desta soluccedilatildeo em triplicata diretamente em sistema cromatograacutefico com detector
UV ajustado a 255 nm utilizando como fase moacutevel o tampatildeo formiato de amocircnio 10
mM pH=42 em um fluxo de 04 mL min-1 O sinal detectado foi de 100 BSA
Posteriormente a coluna preenchida com 70 mg do novo RAM foi inserida no sistema
cromatograacutefico entre o injetor e o detector A soluccedilatildeo de BSA foi analisada em triplicata
novamente no entanto com a presenccedila da coluna extratora desenvolvida (novo RAM)
A aacuterea do sinal obtido nesta segunda anaacutelise dividida pela aacuterea do sinal de 100 BSA
obtida na primeira anaacutelise foi correspondente agrave porcentagem de BSA excluiacuteda pela
coluna
4642 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas no soro
Para analisar a exclusatildeo total de macromoleacuteculas (como lipiacutedios proteiacutenas e
sacariacutedeos) agora nas amostras de soro foi utilizado procedimento semelhante Na
ausecircncia da coluna extratora injetou-se no sistema cromatograacutefico em triplicata 100 μL
de amostra de soro humano branco foram testados pools de soro puros e diluiacutedos 14 A
aacutegua ultra pura foi utilizada como fase moacutevel em um fluxo de 04 mL min-1 e o sinal
obtido foi relacionado a 100 dos interferentes Apoacutes a coluna extratora (o novo
RAM) foi adionado ao sistema e a amostra foi inserida novamente A divisatildeo entre a
aacuterea do pico na primeira anaacutelise pelo pico da segunda anaacutelise refere-se agrave porcentagem
de exclusatildeo de interferentes As condiccedilotildees cromatograacuteficas foram as mesmas do teste
com BSA
47
4643 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA em diferentes pHs
O teste de exclusatildeo de proteiacutenas tambeacutem foi realizado nas mesmas condiccedilotildees
cromatograacuteficas que a anaacutelise anterior utilizando soluccedilatildeo de BSA em triplicata no
entanto diferentes soluccedilotildees como fase moacutevel (variaccedilatildeo de pH de 22 a 70) foram
testadas pois o pH pode influenciar na ionizaccedilatildeo dos analitos dos grupos funcionais
presentes na superfiacutecie do novo RAM e na interaccedilatildeo entre eles o que pode resultar em
diferentes taxas de exclusatildeo de proteiacutenas Estas soluccedilotildees foram os tampotildees fosfato de
soacutedio 10 mM (pHs 22 e 26) formiato de amocircnio 10 mM (pHs 30 a 46) acetato de
amocircnio 5 mM (pHs 52 a 66) e fosfato de soacutedio 5mM (pH 70)
465 Paracircmetros espectromeacutetricos
Com a finalidade de se obter um meacutetodo de anaacutelise capaz de detectar e
quantificar menores niacuteveis possiacuteveis de concentraccedilatildeo dos analitos foram otimizados os
paracircmetros espectromeacutetricos fluxos dos gases secantes e nebulizador modo de
ionizaccedilatildeo temperaturas da linha de dessolvataccedilatildeo e de bloco de aquecimento e as
energias de colisotildees utilizadas para fragmentar os iacuteons precursores para originar os
fragmentos iocircnicos de cada analito Foram realizadas soluccedilotildees padrotildees de cada analito e
dos padrotildees internos (PIs) deuterados (vareniclina d-4 hidroxibupropiona d6 nicotina
d4 cotinina d3 e hidroxicotinina d3) na concentraccedilatildeo de 1 mg L-1 em metanol Cada
uma destas soluccedilotildees foram injetadas separadamente no sistema em um volume de 5 microL
A fase moacutevel utilizada foi constituiacuteda por metanol tampatildeo formiato de amocircnio 001
mol L-1 pH=42 (9010 vv) em um fluxo de 04 mL min-1 e o modo de ionizaccedilatildeo
positiva (ESI+) foi utilizado pois demonstrou ser mais eficiente para ionizar as
moleacuteculas analisadas Essa otimizaccedilatildeo foi obtida utilizando o software Labsolutionsreg
48
466 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatograacutefico multidimensional
Para esta otimizaccedilatildeo foi utilizado um HPLC de dotado de vaacutelvula comutadora
automaacutetica de 6 vias e um injetor automaacutetico de amostras o que permitiu a
automatizaccedilatildeo do processo Ainda o sistema cromatograacutefico foi acoplado a um
espectrocircmetro de massas em tandem (HPLC-MSMS) dotado de um analisador de
massa triplo quadrupolo o qual possui alta sensibilidade e seletividade Incorporou-se
neste sistema uma coluna extratora preenchida com o RAM desenvolvido
O forno foi mantido a 40ordmC e o detector UV operando em um comprimento de
onda de 255 nm A fim de padronizar a anaacutelise foram testadas colunas anaacuteliticas de
diversos tamanhos e composiccedilotildees e variadas proporccedilotildees de fases de moacuteveis
Atraveacutes da anaacutelise do cromatograma foram avaliados o tempo de retenccedilatildeo e
separaccedilatildeo e as aacutereas obtidas dos picos de cada analito O sistema foi utilizado no modo
columns switching na configuraccedilatildeo backflush e as condiccedilotildees da anaacutelise foram
otimizadas como os tempos de exclusatildeo de proteiacutenas de adsorccedilatildeo e eluiccedilatildeo dos
analitos de separaccedilatildeo cromatograacutefica de limpeza da coluna extratora e de
recondicionamento do sistema bem como a composiccedilatildeo das fases moacuteveis de
carregamento de eluiccedilatildeoseparaccedilatildeo e de limpeza
Para a otimizaccedilatildeo dos paracircmetros de anaacutelise foi utilizado um pool de amostras
de soro humano branco em sexplicata Este soro foi dopado com os analitos vareniclina
bupropiona hidroxibupropiona nicotina cotinina e hidroxicotinina em 3 concentraccedilotildees
01 100 e 1000 microg L -1 e com os PIs deuterados na concentraccedilatildeo de 500 microg L -1 Como
o soro eacute uma matriz com alta concentraccedilatildeo de interferentes foram testados pools de
soro branco dopados e injetados sem diluiccedilatildeo diretamente no sistema e diluiacutedos em aacutegua
ultra pura (11) e os perfis analiacuteticos foram entatildeo avaliados
49
467 validaccedilatildeo analiacutetica
Testes para a validaccedilatildeo da anaacutelise otimizada foram realizadas conforme
diretrizes do US Department of Health and Human Services e do Food and Drug
Administration (FDA) 2013 113 Os paracircmetros avaliados foram a seletividade limite
de detecccedilatildeo (LD) limite de quantificaccedilatildeo (LQ) linearidade estabilidade dos analitos
efeito residual e de matriz e recuperaccedilatildeo da extraccedilatildeo
Os ensaios foram realizados em seis repeticcedilotildees (n=6) exceto o ensaio de
recuperaccedilatildeo (n=3) e foi utilizado um pool de amostras de soro branco dopadas com cada
um dos analitos nas concentraccedilotildees de 5 10 20 50 75 100 μg L-1 para vareniclina 1 5
50 250 500 1000 μg L-1 para bupropiona 1 10 100 500 1000 2000 para
hidroxibupropiona 5 10 50 250 500 1000 μg L-1 para nicotina cotinina e
hidroxicotinina Os PIs deuterados foram utilizados na concentraccedilatildeo de 200 μg L-1
47 Anaacutelise estatiacutestica
Em relaccedilatildeo agraves caracteriacutesticas demograacuteficas as variaacuteveis contiacutenuas foram
apresentadas como meacutedia e desvio padratildeo e as categoacutericas como frequecircncias Os testes
Shapiro-Wilk e KolmogorovndashSmirnov foram realizados para verificar a normalidade da
distribuiccedilatildeo das variaacuteveis quantitativas e assim escolher testes parameacutetricos ou natildeo
parameacutetricos Foram realizados os testes Qui-quadrado Exato de Fisher t de Student ou
Mann-Whitney para as anaacutelises comparativas de caracteriacutesticas gerais entre os grupos
de desfecho dos pacientes tanto no ensaio de expressatildeo como de mensuraccedilatildeo dos
analitos Para as anaacutelises de expressatildeo gecircnica o meacutetodo 2-∆∆CT foi utilizado 103 Como os
dados de expressatildeo natildeo apresentaram distribuiccedilatildeo normal foi realizado o teste natildeo
parameacutetrico de Mann-Whitney para testar a hipoacutetese de diferenccedila (valores de 2-∆CT)
intra e entre os grupos de desfechos (sucesso e resistente e tempos de tratamento
50
farmacoloacutegico T0 T2 e T4) Os valores de ∆∆CT (mediana de ∆CTgrupo teste ndash mediana
de ∆CTgrupo referecircncia) foram obtidos para o caacutelculo do fold change O fold-change (2-∆∆CT)
foi calculado para verificar o aumento ou diminuiccedilatildeo de expressatildeo gecircnica entre os
grupos analisados O graacutefico heat map foi construiacutedo atraveacutes do software Gene-globe
(Qiagen USA) para verificar as diferenccedilas no perfil de expressatildeo dos genes estudados
de acordo com os tempos (T0 T2 e T4) e de acordo com a efetividade de tratamento
com vareniclina (sucesso e resistente) O teste de Manny-Whitney foi utilizado para
analisar os niacuteveis de concentraccedilotildees de vareniclina de bupropiona de nicotina e de seus
metaboacutelitos de acordo com os desfechos de tratamento (sucesso e resistente) pois natildeo
apresentaram distribuiccedilatildeo normal A taxa de metabolizaccedilatildeo de nicotina (NRM) foi
calculada pela seguinte foacutermula NMR= trans-3-hidroxicotininacotinina A
hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3- hidroxicotinina
para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros da hidroxicotinina satildeo
irrelevantes 31 32 Os pacientes foram classificados em metabolizadores lentos se
NMRlt031 e normais ou raacutepidos se NMRgt031 Todas as anaacutelises estatiacutesticas foram
realizadas utilizando o software SPSS (versatildeo 20 IBM New York NY) considerando
o niacutevel de significacircncia de P lt005
51
5 RESULTADOS
Este projeto incluiu 105 pacientes sendo 74 tratados com vareniclina e 31
com bupropiona Dos 74 pacientes tratados com vareniclina amostras de 27 pacientes
foram analisadas quanto agrave expressatildeo gecircnica (14 pacientes do grupo de desfecho sucesso
e 13 do grupo resistente) Sendo provenientes destes pacientes 52 amostras ao todo (de
diversos tempos) 9 resistentes do tempo T0 7 resistentes do T2 8 resistente do T4 9
sucessos do T0 8 sucessos do T2 e 11 sucessos do T4 (vide toacutepico 42 Nuacutemero
amostral)
Quanto a mensuraccedilatildeo dos analitos foi desenvolvida uma coluna extratora para a
purificaccedilatildeo da amostra agrave base de nanotubos hiacutedridos de carbono e siacutelica modificados
com a adiccedilatildeo de grupos hidrofiacutelicos (novo RAM) o meacutetodo HPLC-MSMS
multidimensional no modo column switching e na configuraccedilatildeo backflush foi
otimizado e validado Setenta e quatro pacientes tratados com vareniclina e 31 tratados
com bupropiona foram submetidos agrave anaacutelise Apenas 4 amostras das 105 apresentaram
valores abaixo do LQ (3 de pacientes tratados com vareniclina e 1 de paciente tratado
com bupropiona) e estas foram excluiacutedas das anaacutelises dos analitos (vide toacutepico 42
Nuacutemero amostral)
51 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica
511 Dados cliacutenicos e demograacuteficos
As Tabelas 2 e 3 mostram as caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes
selecionados para o ensaio de expressatildeo gecircnica do grupo total e por grupo de desfecho
respectivamente A variaacutevel idade apresentou diferenccedila significativa entre os grupos
resistente e sucesso
52
Tabela 2 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina selecionados para os ensaios de expressatildeo gecircnica (n=27)
Idade (anos) 50 plusmn 13
Gecircnero mulheres () 464
Etnia autodeclarada brancos () 740
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 271 plusmn 50
Cigarrosdia 17 plusmn 7
FTND 62 plusmn 20
FTND ge 6 () 607
Escore Issa ge 3 () 857
Hipertensatildeo () 179
Dislipidemia () 250
Diabetes melito tipo 2 () 107
Depressatildeo () 71
Ansiedade () 286
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash
Fagerstroumlm test for nicotine dependence (escala de 0 a 10
pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
Tabela 3 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina submetidos aos ensaios de expressatildeo gecircnica de acordo com o desfecho
de tratamento
Resistente (n=13) Sucesso (n=14) Valor de P
Idade (anos) 55 plusmn 11 45 plusmn 12 0045
Gecircnero mulheres () 538 357 045
Etnia autodeclarada brancos () 769 786 100
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 271 plusmn 46 273 plusmn 54 092
Cigarrosdia 20 plusmn 6 15 plusmn 6 006
FTND 63 plusmn 22 59 plusmn 19 058
FTND ge 6 () 538 643 070
Escore Issa ge 3 () 846 857 100
Hipertensatildeo () 231 71 033
Dislipidemia () 231 286 100
Diabetes melito tipo 2 () 231 00 010
Depressatildeo () 77 71 100
53
Ansiedade () 308 357 100
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fagerstroumlm test for nicotine
dependence (escala de 0 a 10 pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
512 Dados de expressatildeo gecircnica
Dos 17 genes escolhidos para testar com a resposta ao tratamento apenas 4
apresentaram valores de amplificaccedilatildeo aceitaacuteveis para uma interpretaccedilatildeo de qualidade
mais especificamente valores de CT lt 33 Os valores das expressotildees dos genes (CTs)
foram normalizados atraveacutes das meacutedias de CT dos housekeeping genes para cada
amostra obtendo-se os valores de ∆CT = (CTgene alvo ndash meacutedia CT housekeepings genes) A
Tabela 4 mostra os valores de mediana de ∆CT dos genes analisaacuteveis de acordo com os
tempos de tratamento e grupos de desfecho
Tabela 4 - Valores de mediana de ∆CT dos genes de acordo com os tempos de
tratamento e grupos de desfecho
∆CT = (CTgene alvo ndash meacutedia CThousekeepings genes) T0= Tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico
T2= Duas semanas apoacutes o iacutenicio do tratamento farmacoloacutegico T4= Quatro semanas apoacutes o iniacutecio do
tratamento farmacoloacutegico IC 95 = Intervalo de confianccedila de 95
Resistente T0 Resistente T2 Resistente T4
∆CT IC 95 ∆CT IC 95 ∆CT IC 95
CHRNA5 818 (732 ndash 870) 845 (748 ndash 887) 767 (727 ndash 905)
CHRNA7 662 (617 ndash 697) 802 (707 ndash 848) 719 (696 ndash 786)
CHRNG 620 (579 ndash 695) 647 (601 ndash 668) 663 (602 ndash 702)
COMT 467 (440ndash 501) 480 (443 ndash 503) 487 (452 ndash 524)
Sucesso T0 Sucesso T2 Sucesso T4
∆CT IC 95 ∆CT IC 95 ∆CT IC 95
CHRNA5 832 (738 ndash 917) 707 (653 ndash 896) 837 (754 ndash 882)
CHRNA7 726 (611 ndash 842) 704 (640 ndash 779) 738 (676 ndash 820)
CHRNG 682 (619 ndash 774) 683 (656 ndash 733) 659 (625 ndash 703)
COMT 488 (430 ndash 511) 458 (433 -515) 481 (448 ndash 516)
54
513 Anaacutelise de associaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica entre os desfechos e os tempos de
tratamento
A Tabela 5 mostra o fold change e anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos de
tempos de tratamento e grupos de desfecho Foi observada diferenccedila significativa para a
expressatildeo do gene CHRNA7 no grupo resistente amostras dos tempos T2 e T4
apresentaram menor expressatildeo comparadas com amostras do T0 (fold change 038
P=0007 fold change 067 P=0004 respectivamente) Para a expressatildeo do gene
CHRNG amostras do grupo sucesso mostraram menor expressatildeo comparadas com
amostras do grupo resistente no tempo T2 (fold change= 077 P=0006)
Tabela 5 - Fold change e anaacutelise de associaccedilatildeo entre os tempos de tratamento e
grupos de desfecho
Resistente T2 vs T0 Resistente T4 vs T0 Resistente T4 vs T2
Genes 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P
CHRNA5 083 (034 ndash 233) 057 142 (030 ndash 269) 095 172 (034 ndash 303) 089
CHRNA7 038 (020 ndash 093) 0007 067 (031 ndash 101) 0004 178 (058 ndash 287) 037
CHRNG 083 (054 ndash 192) 037 074 (043 ndash 190) 044 090 (050 ndash 158) 036
COMT 091 (065 ndash 149) 092 087 (056 ndash 140) 063 095 (057 ndash 142) 073
Sucesso T2 vs T0 Sucesso T4 vs T0 Sucesso T4 vs T2
Genes 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P
CHRNA5 238 (033 ndash 623) 037 097 (037 ndash 310) 061 041 (020 ndash 268) 069
CHRNA7 116 (031 ndash 406) 064 092 (023 ndash 316) 091 079 (029 ndash 204) 055
CHRNG 099 (045 ndash 227) 049 117 (056 ndash 281) 062 118 (072 ndash 211) 033
COMT 123 (055 ndash 172) 092 105 (055 ndash 155) 068 085 (056 ndash 159) 041
Sucesso vs resistente T0 Sucesso vs resistente T2 Sucesso vs resistente T4
Genes 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P
CHRNA5 091 (028 ndash 250) 075 260 (036 ndash 506) 047 062 (034 ndash 285) 085
CHRNA7 064 (021 ndash 182) 013 197 (061 ndash 423) 009 088 (042 ndash 214) 074
CHRNG 065 (026 ndash 169) 012 077 (040 ndash 109) 0006 103 (050 ndash 171) 079
55
T0= Tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico T2= Duas semanas apoacutes o iacutenicio do tratamento
farmacoloacutegico T4= Quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico 2-∆∆CT = Fold change (diferenccedila de
expressatildeo) P valor (anaacutelise de associaccedilatildeo entre as medianas de 2-∆CT dos grupos) IC 95 = Intervalo de confianccedila
de 95
As Figura 14 e 15 mostram graacuteficos de barras das diferenccedilas de expressatildeo dos
genes CHRNA7 e CHRNG entre os tempos de tratamento e desfecho respectivamente
O heat map (Figura 16) mostra que natildeo houve diferenciaccedilatildeo nos perfis de expressatildeo
gecircnica em uma anaacutelise conjunta dos genes de acordo com os desfechos e tempos de
tratamento
Devido agrave diferenccedila significativa nas meacutedias de idade entre os grupos sucesso e
resistente foi realizada regressatildeo linear multipla na anaacutelise de expressatildeo dos quatro
genes analisaacuteveis A regressatildeo foi ajustada por idade e tambeacutem gecircnero e cigarros por
dia No entanto os resultados de expressatildeo dos genes natildeo foram impactados por estas
covariaacuteveis
COMT 086 (061 ndash 164) 090 116 (061 ndash 162) 049 104 (064 ndash 169) 093
56
Figura 14 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNA7 entre os tempos de tratamento e desfecho A Anaacutelise intragrupo do
desfecho resistente B Anaacutelise intragrupo do desfecho sucesso T0= tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico T2= duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico T4= quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico P= 0007
(resistente T2 vs T0 fold change de 038) P=0004 (resistente T4 vs T0 fold change de 067) Valor de P (anaacuteliacutese de
associaccedilatildeo entre as medianas de 2-∆CT dos grupos em uma comparaccedilatildeo dois a dois) Fonte do autor
57
Figura 15 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNG entre os tempos de tratamento e desfecho A Anaacutelise intragrupo do
desfecho resistente B Anaacutelise intragrupo do desfecho sucesso T0= tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico T2= duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico T4= quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico P= 0006
(sucesso vs resistente T2 fold change de 077) Valor de P (anaacuteliacutese de associaccedilatildeo entre as medianas de 2-∆CT dos grupos em uma
comparaccedilatildeo dois a dois) Fonte do autor
58
Figura 16 - Heat map de expressatildeo gecircnica A figura mostra a magnitude de expressatildeo gecircnica entre os grupos A cor mais clara
(verde) nos indica menor expressatildeo e a cor mais escura (vermelho) indica maior expressatildeoT0= tempo inicial antes do tratamento
farmacoloacutegico T2= duas semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico T4= quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento
farmacoloacutegico Fonte do autor gerada pelo software Gene Globe QIAGENreg
52 Mensuraccedilatildeo dos analitos
521 Caracterizaccedilatildeo da coluna teste exclusatildeo de proteiacutenas e interferentes da
matriz
Em relaccedilatildeo ao teste de capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas o pico de BSA sem
e com a nova coluna extratora apresentou tempo de retenccedilatildeo semelhante no entando a
aacuterea da curva do BSA na presenccedila do novo RAM foi bem menor do que na sua
ausecircncia conforme a Figura 17 A reduccedilatildeo de proteiacutenas (da soluccedilatildeo de BSA) pela
coluna foi de aproximadamente 98 e nas amostras de pools soro diluiacutedas (14) a
remoccedilatildeo foi de 99 (Figura 18)
A Figura 19 mostra a influecircncia do pH (escala de de 22 a 70) na exclusatildeo de
proteiacutenas fato que estaacute diretamente relacionado com a estrutura fiacutesico-quiacutemica do
RAM Diferentes pHs influenciaram na taxa de exclusatildeo de proteiacutenas esse
comportamento pode ser explicado devido agrave interaccedilotildees eletrostaacuteticas do novo RAM
com as proteiacutenas Valores de pH menores que o do ponto isoeleacutetrico das proteiacutenas
59
podem promover a prevalecircncia de proteiacutenas carregadas positivamente enquanto que
valores de pH superiores podem promover proteiacutenas carregadas negativamente 114
Dessa forma acredita-se que o comportamento de exclusatildeo de proteiacutenas do novo
material eacute semelhante ao descrito em outros estudos 108 109 115 116
Figura 17 - Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com soluccedilatildeo de BSA Graacuteficos obtidos apoacutes injeccedilatildeo de 10 microL de uma soluccedilatildeo aquosa de BSA (44 mg mL-1) no
sistema sem coluna (A) e com coluna extratora (B) A - aacuterea do pico 10142590 B - aacuterea
do pico 9713614 Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF
Unifal-MG
Figura 18 - Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com amostra de soro
diluiacuteda Graacuteficos obtidos apoacutes injeccedilatildeo de 100 microL de soro diluiacutedo em aacutegua ultra pura
(14 vv) no sistema sem coluna (A) e com coluna extratora (B) A aacuterea do pico
53981550 B - aacuterea do pico 53552824 Fonte do autor e do colaborador DrHenrique
Dipe de Faria LATF Unifal-MG
60
Figura 19 - Influecircncia do pH na exclusatildeo de proteiacutenas Fonte do autor e do colaborador Dr
Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
522 Otimizaccedilatildeo dos paracircmetros espectromeacutetricos
No processo de otimizaccedilatildeo das condiccedilotildees espectromeacutetricas foi adotado o modo
de ionizaccedilatildeo positivo (ESI+) isto eacute a ionizaccedilatildeo promove a protonaccedilatildeo (adiccedilatildeo de H+)
dos analitos e de seus fragmentos As energias de colisatildeo ideais e as muacuteltiplas transiccedilotildees
de monitoramento de reaccedilatildeo (MRM) foram otimizadas para cada analito separadamente
vide valores de energia de colisatildeo e fragmentos obtidos jaacute mostrados na Tabela 1 (no
toacutepico 461) A presenccedila de 3 fragmentos de cada analito foi necessaacuteria para a
identicaccedilatildeo qualitativa e a quantificaccedilatildeo foi dependente da concentraccedilatildeo do fragmento
mais abundante
As seguintes temperaturas foram utilizadas 40ordmC para o forno da coluna 250ordmC
para a linha de dessolvataccedilatildeo e 400ordmC para o bloco de aquecimento Foram utilizadas as
taxas de 20 ml min-1 de fluxo de gaacutes de nebulizaccedilatildeo e 150 ml min-1 de fluxo de gaacutes
para a secagem
61
523 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatrograacutefico multidimensional
Quanto a composiccedilatildeo e proporccedilatildeo da fase moacutevel responsaacutevel pela eluiccedilatildeo
separaccedilatildeo e ionizaccedilatildeo dos analitos (fase moacutevel de eluiccedilatildeo) testes foram realizados com
os solventes orgacircnicos acetonitrila ou metanol combinados com o tampatildeo formiato de
amocircnio 10 mM em diferentes pHs com proporccedilotildees que variaram de 973 vv a 7525
vv (fase orgacircnica fase aquosa) Os solventes orgacircnicos utilizados satildeo menos viscosos
em relaccedilatildeo agrave aacutegua por isso fluem mais facilmente no sistema e por serem volaacuteteis
favorecem tambeacutem a ionizaccedilatildeo dos analitos e evaporaccedilatildeo do solvente A fase moacutevel que
apresentou melhores resultados foi a composiccedilatildeo de metanol formiato de amocircnio 001
mol L-1 pH 42 (9010 vv)
Variados tipos de colunas analiacuteticas foram testadas sendo elas A NSTreg (150
mm 46 mm e 5 microm) a ACEreg (150 mm x 46 mm x 5 microm) a Phenomenexreg (250 x 46
mm x 5 microm) e a Atlantis T3 e da Watersreg (100 mm x 21 mm x 3 microm) (comprimento x
diacircmetro interno x tamanho de partiacutecula) no entanto essas colunas aumentaram o
tempo de retenccedilatildeo dos analitos pioraram o perfil cromatograacutefico gerando picos largos e
fragmentados Portanto os testes foram realizados com uma nova coluna analiacutetica a
ACEreg C18 (100 mm x 21 mm x 3 microm comprimento diacircmetro interno e tamanho de
partiacutecula) com preacute-coluna ACEreg C18 (21mm x 3 microm diacircmetro tamanho de partiacutecula)
obtendo-se um menor tempo de anaacutelise (maior frequecircncia analiacutetica) e melhor perfil
cromatograacutefico (picos simeacutetricos) para os analitos
Trecircs volumes de injeccedilatildeo de amostra foram testados (5 10 e 100 microL) devido a
baixa concentraccedilatildeo dos analitos foi adotada a maior quantidade (100 μL) pois forneceu
melhores sinais analiacuteticos Tambeacutem foi avaliado o uso do pool de soro sem diluiccedilatildeo e
diluiacutedo (11 vv) os perfis cromatograacuteficos de ambos foram oacutetimos no entanto
62
escolheu-se trabalhar com a amostra diluiacuteda para diminuir a presenccedila de interferentes e
consequentemente diminuir efeito matriz e aumentar o tempo de durabilidade da coluna
analiacutetica
Jaacute obtidas as melhores condiccedilotildees espectromeacutetricas e cromatograacuteficas foi
otimizado o sistema columm switching na configuraccedilatildeo de backflush o qual apresenta
trecircs eventos como mostrado na Figura 20
Figura 20 - Ilustraccedilatildeo do sistema de columm switching na configuraccedilatildeo de backflush Na posiccedilatildeo 1
correspondente ao evento 1 ocorre exclusatildeo dos interferentes e adsorccedilatildeo dos analitos a coluna extratora Na
posiccedilatildeo 2 durante o evento 2 ocorre a eluiccedilatildeo dos analitos adsorvidos No retorno para a posiccedilatildeo 1
correspondente ao evento 3 ocorre limpeza da coluna extratora separaccedilatildeo e detecccedilatildeo dos analitos e por fim
o recondicionamento do sistema BA = bomba A BB = bomba B BC = bomba C MS = espectrocircmetro de
massas UV = detector UV e W = descarte Fonte Traduzido de (De Faria et al 2017)
Com as vaacutelvulas do sistema na posiccedilatildeo 1 (evento 1) a bomba A promoveu a
liberaccedilatildeo da fase moacutevel de carregamento (aacutegua ultra pura) em um fluxo de 04 mL min-1 O
tempo de 3 minutos foi o necessaacuterio para a adsorccedilatildeo dos analitos e sua preacute-concentraccedilatildeo
aleacutem da eliminaccedilatildeo de macromoleacuteculas A aacutegua mostrou ser um solvente oacutetimo como fase
moacutevel de carregamento aleacutem de ser um recurso barato e natildeo causar danos ao meio
ambiente De forma simultacircnea a fase moacutevel de eluiccedilatildeo fornecida pela bomba C passa
para a coluna analiacutetica de forma a condionaacute-la ainda na ausecircncia dos analitos Ambas as
bombas operaram com uma taxa de fluxo inicial de 04 mL min -1
63
Na posiccedilatildeo 2 da vaacutelvula (evento 2) a bomba C liberou a fase moacutevel de eluiccedilatildeo
(metanol formiato de amocircnio 001 mol L-1 pH 42 (9010 vv) em direccedilatildeo agrave coluna
analiacutetica em fluxo contraacuterio ao que a fase moacutevel de carregamento percorreu (backflush) A
velocidade do fluxo da bomba C foi aumentada para 08 mL min -1 e o tempo determinado
para esta etapa foi de 03 minutos o qual promoveu um oacutetimo perfil cromatograacutefico dos
analitos
No evento 3 as vaacutelvulas foram colocadas na posiccedilatildeo 1 novamente A fase moacutevel
de eluiccedilatildeo (vinda da bomba C) novamente com um fluxo de 04 mL min-1 passou pela
coluna analiacutetica promovendo a separaccedilatildeo dos analitos e sua chegada no detector de
massas De forma simultacircnea a bomba B em um fluxo de 10 mL min -1 liberou a fase
moacutevel de limpeza (acetonitrila aacutegua ultra pura isopropanol 751510 vvv) a qual
passou pela coluna extratora (RAM) promovendo a remoccedilatildeo de resiacuteduos proveniente da
anaacutelise anterior tornando-a pronta para a reutilizaccedilatildeo em uma nova anaacutelise A fase de
limpeza ocorreu no tempo de 33 a 10 min O recondionamento do sistema agraves condiccedilotildees
iniciais de anaacutelise ocorreu nos uacuteltimos 5 min em que a fase moacutevel de limpeza foi
substituiacuteda pela fase moacutevel de carregamento O tempo total para cada anaacutelise foi de 15
minutos
Para a avaliaccedilatildeo da capacidade da fase moacutevel de limpeza (acetonitrila aacutegua
ultra pura isopropanol 751510 vvv) pools de soro branco dopado na maior
concentraccedilatildeo foram injetados no sistema (com a posiccedilatildeo 1 das vaacutelvulas mantida) e apoacutes
a realizaccedilatildeo da fase de limpeza foram injetados pools de soro branco diluiacutedos (11 vv)
O experimento foi realizado em triplicata O cromatograma do soro branco natildeo
apresentou sinal analiacutetico no mesmo tempo de retenccedilatildeo dos analitos o que mostra que a
fase moacutevel de limpeza foi eficiente em seu propoacutesito evitando o chamado efeito
residual (carry-over) De Faria et al 110
64
524 Validaccedilatildeo analiacutetica
Para os testes de validaccedilatildeo foram utilizados pools de amostras de soro branco
dopadas com cada um dos analitos nas concentraccedilotildees conforme o toacutepico 467
concentraccedilotildees menores foram utilizadas no entanto essas natildeo apresentaram bons sinais
analiacuteticos precisatildeo e exatidatildeo Os resultados dos testes de validaccedilatildeo estatildeo demonstrados
na Tabela 6
O teste de linearidade foi expresso como coeficiente de determinaccedilatildeo (r2)
calculado a partir das curvas de calibraccedilatildeo intra-ensaio Para esse teste foram utilizados
os analitos em diferentes concentraccedilotildees em soro branco conforme jaacute citado as
repeticcedilotildees geraram 6 curvas de calibraccedilatildeo para cada analito Os intervalos lineares
foram baseados nos intervalos terapecircuticos 51 117 118
As mesmas concentraccedilotildees dos analitos em soro no ensaio de linearidade foram
utilizadas no ensaio dos LD e LQ Estes foram calculados atraveacutes das 6 curvas de
calibraccedilatildeo e foram definidos como 3 e 10 vezes a relaccedilatildeo sinalruiacutedo respectivamente
para o LD e LQ
Para avaliar a precisatildeo e a exatidatildeo intra e inter-ensaios foram realizados 6
repeticcedilotildees de concentraccedilotildees de calibraccedilatildeo dos analitos Os testes intra-ensaio foram
realizados no mesmo dia e os testes inter-ensaios foram realizados em dias diferentes A
exatidatildeo foi calculada atraveacutes do erro relatico (E) e a precisatildeo atraveacutes do desvio
padratildeo relativo (RSD)
No teste de seletividade foi avaliado se houve a presenccedila picos de interferentes
nos mesmos tempos de retenccedilatildeo dos analitos e dos PIs deuterados As Figuras 21 e 22
mostram os cromatogramas obtidos apoacutes a injeccedilatildeo de soro branco e de soro dopado com
os analitos respectivamente mostrando que natildeo houve a presenccedila de interferentes nos
tempos de retenccedilatildeo dos analitos e PIs deuterados
65
Figura 21 - Cromatograma obtido de amostras de soro branco diluiacutedas em aacutegua ultra pura
Volume de injeccedilatildeo = 100 microL A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz 240rarr mz 131) C-
Hidroxibup (mz 256rarr mz 238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz 80) F-
Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G- Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr mz
244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz 134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz 196rarr
mz 80) Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
Figura 22 - Cromatograma obtido apoacutes anaacutelise de soro diluiacutedo e dopado com os analitos no niacutevel
meacutedio de calibraccedilatildeo e mais os padrotildees internos deuterados A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz
240rarr mz 131) C- Hidroxibup (mz 256rarr mz 238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz
80) F- Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G- Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr
mz 244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz 134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz 196rarr
mz 80) Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
Foram realizados os testes de estabilidade de bancada longo prazo e de
congelamento e descongelamento Para a anaacutelise de estabilidade de bancada soluccedilotildees de
soro dopada com os analitos foram analisadas imediatamente apoacutes a sua preparaccedilatildeo e
apoacutes 4 e 24 horas verificando assim a estabilidade da amostra a curto prazo Para uma
66
anaacutelise a longo prazo as amostras foram armazenadas a -20degC por 30 dias e apoacutes foram
avaliadas Quanto anaacutelises de congelamento e descongelamento foram realizados 3
ciclos de congelamento -20degC e posterior descongelamento e as amostras foram
avaliadas
O ensaio de recuperaccedilatildeo da extraccedilatildeo foi realizado em triplicata A anaacutelise
avaliou a recuperaccedilatildeo relativa comparando-se a extraccedilatildeo dos analitos a partir da matriz
de soro com a de aacutegua atraveacutes da passagem da amostra pela coluna de extraccedilatildeo (RAM)
A recuperaccedilatildeo relativa se daacute pela relaccedilatildeo das concentraccedilotildees nas duas matrizes
(concentraccedilatildeo no soro concentraccedilatildeo na aacutegua) x 100
O efeito residual (carry-over) foi avaliado injetando-se uma amostra de soro
branco antes de uma amostra de soro dopado na maior concentraccedilatildeo e apoacutes foi injetada
novamente uma amostra de soro branco foram inferior a 20 daqueles obtidos no LQ
Para avaliar o efeito matriz foram comparados os resultados da anaacutelise das
amostras de soro dopadas com os analitos em diferentes concentraccedilotildees em matrizes
diferentes (aacutegua e soro) O resultado para ser aceito precisava ser inferior a 15
Posteriormente foi realizada a mensuraccedilatildeo dos analitos em amostras reais de
soro provenientes de pacientes submetidos ao tratamento antitabagismo com doses
conforme bula As Figuras 23 e 24 mostram os cromatogramas de amostras de pacientes
submetidos ao tratamento com bupropiona e vareniclina respectivamente No momento
da coleta das amostras os pacientes estavam fumando e aleacutem de apresentarem os
analitos provenientes dos faacutermacos tambeacutem mostraram a presenccedila de analitos
provenientes da nicotina
67
Figura 23 - Cromatograma obtido atraveacutes da anaacutelise das amostras de soro dos pacientes
tratados com bupropiona (150 mg 2xdia) Os pacientes estavam fumando em torno de 10
cigarrosdia no dia da coleta A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz 240rarr mz 131) C-
hidroxibup (mz 256rarr mz 238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz 80) F-
Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G- Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr mz
244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz 134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz
196rarr mz 80) Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
Figura 24 - Cromatograma obtido atraveacutes da analise de amostras de soro de pacientes tratados
com vareniclina (10 mg 2xdia) Os pacientes fumavam em torno de 10 cigarrosdia no dia da
coleta A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz 240rarr mz 131) C- hidroxibup (mz 256rarr mz
238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz 80) F- Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G-
Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr mz 244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz
134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz 196rarr mz 80) Fonte do autor e do
colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
68
Tabela 6 - Paracircmetros de validaccedilatildeo obtidos na determinaccedilatildeo de faacutermacos antitabagismo em soro humano
Meacutedia plusmn Desvio padratildeo (n=6) amenor bmeacutedio e calto niacutevel de calibraccedilatildeo 1Estabilidade de bancada (4 a 24 horas) Precisatildeo RSD = [Desvio padratildeomeacutedia] x 100 E = [(Meacutedia experimental da
concentraccedilatildeo Concentraccedilatildeo nominal) x 100] ndash 100 2Efeito matriz E= [(Meacutedia da concentraccedilatildeo experimental no solventeMeacutedia experimental da concentraccedilatildeo no soro) x 100] ndash 100
Paracircmetros de validaccedilatildeo Vareniclina Bupropiona Hidroxibupropiona Nicotina Cotinina Hidroxicotinina
Intervalo linear (microg L-1) 5-100 1-1000 1-2000 5-1000 5-1000 5-1000
r2 ( n=6) 09952 09998 09998 09997 09998 09999
Decliacutenio (α) ( n=6) 00196plusmn 00095 00045plusmn00059 00051plusmn00057 00087plusmn00012 00073plusmn00048 00075plusmn00074
Intercepto ( n=6) -00316plusmn00004 -00022plusmn00020 00230plusmn00025 -00046plusmn00065 00767plusmn00012 01918plusmn00013
Tempo de retenccedilatildeo (min) 521 501 485 497 446 441
LD (microg L-1) 25 07 06 19 24 37
LQ (microg L-1) 50 10 10 50 50 50
Precisatildeo intra-ensaio RSD ( n=6) 93a
30a
100c
153a
37b
21c
140a
06b
06c
90a
26b
11c
117a
34b
61c
128a
138b
92c
Precisatildeo inter-ensaio RSD ( n=18 trecircs dias) 185a
115b
66c
82a
27b
20c
109a
17b
10c
83a
27b
14c
158a
41b
31c
161a
44b
92c
Acuraacutecia intra-ensaio E ( n=6) 196a
54b
-30c
-55a
-24b
-11c
-65a
19b
-04c
158a
09b
-26c
-87a
47b
-24c
71a
18b
05c
Acuraacutecia inter-ensaio E ( n=18 trecircs dias) 82a
-16b
035c
41a
-01b
-01c
-87a
27b
-20c
146a
40b
018c
-120a
25b
-110c
58a
-35b
30c
Recuperaccedilatildeo da extraccedilatildeo ( n=3) 883a
1104b
1014c
1101a
1009b
1028c
945a
1094b
1078c
1098a
1088b
1146c
941a
1093b
1116c
1167a
1112b
1141c
Estabilidade1 E
( n=6)
98a
11b
-50c
71a
-32b
-38c
140a
-16b
-79c
40a
-79b
-110c
-132a
-94b
-32c
86a
125b
-54c
Efeito matriz2 E
( n=6)
-117a
104b
14c
101a
09b
28c
-55a
94b
78c
98a
88b
146c
-59a
93b
116c
167a
112b
141c
69
525 Dados cliacutenicos e demograacuteficos dos pacientes submetidos a mensuraccedilatildeo dos
analitos
As Tabelas 7 a 10 mostram as caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos
pacientes submetidos agraves anaacutelises de concentraccedilatildeo dos analitos
As Tabelas 7 e 8 referem-se aos pacientes tratados com vareniclina sendo
considerado o grupo total e os grupos de desfecho respectivamente Os pacientes do
grupo resistente agrave vareniclina fumavam um maior nuacutemero de cigarrosdia (antes do
tratamento) em comparaccedilatildeo com os pacientes que obtiveram sucesso (21 vs 17
cigarrosdia P= 005)
As Tabelas 9 e 10 referem-se aos pacientes tratados com bupropiona no grupo
total e de acordo com desfecho respectivamente O grupo resistente ao tratamento com
bupropiona apresentou maior frequecircncia de pacientes com alta DN (atraveacutes dos escores
FTND e Issa categorizados) e de pacientes que fumavam no dia da coleta em
comparaccedilatildeo ao grupo sucesso (FTNDge6= 833 vs 429 P= 005 Escore Issage3=
1000 vs 429 P= 0001 fumo no dia da coleta= 1000 vs 429 P= 0001
respectivamente)
Tabela 7 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos (n= 74)
Idade (anos) 51 plusmn 12
Gecircnero mulheres () 500
Etnia autodeclarada brancos () 730
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 263 plusmn 49
10 1 4 1
7 1 3 1
8 1 3 1
9 1 3 1
8 1 4 1
5 0 3 1
8 1 4 1
8 1 4 1
7 1 4 1
7 1 3 1
9 1 3 1
7 1 4 1
Cigarrosdia inicial 19 plusmn 10
Fumo no dia da coleta () 919
FTND 62 plusmn 23
FTND ge 6 () 644
70
Escore Issa ge 3 () 851
Hipertensatildeo () 311
Dislipidemia () 392
Diabetes melito tipo 2 () 95
Depressatildeo () 135
Ansiedade () 176
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash
Fagerstroumlm test for nicotine dependence (escala de 0 a 10 pontos)
Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala de 0 a 4
pontos)
Tabela 8 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com o
desfecho de tratamento
Resistente (n=41) Sucesso (n=33) P valor
Idade (anos) 53 plusmn 11 49 plusmn 13 023
Gecircnero mulheres () 561 424 024
Etnia autodeclarada brancos () 683 788 031
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 270 plusmn 40 255 plusmn 58 028
Cigarrosdia 21 plusmn 11 17 plusmn 7 005
Fumo no dia da coleta () 976 848 008
FTND 65 plusmn 22 57 plusmn 23 019
FTND ge 6 () 659 625 077
Escore Issa ge 3 () 829 879 075
Hipertensatildeo () 390 212 010
Dislipidemia () 341 455 032
Diabetes melito tipo 2 () 73 121 069
Depressatildeo () 122 152 071
Ansiedade () 146 212 046
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fagerstroumlm test for nicotine
dependence (escala de 0 a 10 pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
71
Tabela 9 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos (n= 31)
Idade (anos) 52 plusmn 11
Gecircnero mulheres () 71
Etnia autodeclarada brancos () 931
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 258 plusmn 57
Cigarrosdia inicial 21 plusmn 7
Fumo no dia da coleta () 871
FTND 68 plusmn 21
FTND ge 6 () 742
Escore Issa ge 3 () 871
Hipertensatildeo () 226
Dislipidemia () 323
Diabetes melito tipo 2 () 32
Depressatildeo () 65
Ansiedade () 194
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash
Fagerstroumlm test for nicotine dependence (escala de 0 a 10
pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
Tabela 10 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com
o desfecho de tratamento
Resistente (n=24) Sucesso (n=7) Valor de P
Idade (anos) 53 plusmn 11 50 plusmn 11 054
Gecircnero mulheres () 708 714 100
Etnia autodeclarada brancos () 957 833 038
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 252 plusmn 61 278 plusmn 35 015
Cigarrosdia 21 plusmn 7 23 plusmn 7 071
Fumo no dia da coleta () 1000 429 0001
FTND 73 plusmn 15 54 plusmn 32 011
FTND ge 6 () 833 429 005
Escore Issa ge 3 () 1000 429 0001
Hipertensatildeo () 292 00 016
72
Dislipidemia () 375 143 038
Diabetes melito tipo 2 () 42 00 100
Depressatildeo () 83 00 100
Ansiedade () 250 00 029
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fagerstroumlm test for nicotine
dependence (escala de 0 a 10 pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
526 Anaacutelise de associaccedilatildeo dos analitos com desfecho de tratamento
A Tabela 11 mostra a frequecircncia do desfecho de tratamento de acordo com os
medicamentos antitabagismo pacientes estes cujas amostras de soro foram submetidas agrave
mensuraccedilatildeo dos analitos
Tabela 11 ndash Frequecircncia do desfecho de tratamento nos pacientes submetidos agraves
anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com os medicamentos
antitabagismo
Medicamento Resistente () Sucesso ()
Vareniclina (n=74) 544 446
Bupropiona (n=31) 774 226
As Tabelas de 12 a 15 mostram as concentraccedilotildees dos analitos nas amostras de
soro dos pacientes tratados com vareniclina e bupropiona no grupo total e de acordo
com o desfecho de tratamento
Os pacientes do grupo resistente tanto os pacientes tratados com vareniclina
(Tabela 13) quanto com bupropiona (Tabela 15) apresentaram concentraccedilatildeo
significativamente maior de cotinina e hidroxicotinina do que os grupos sucesso
(tratamento com vareniclina cotinina= 1182 vs 706 μgL P= 0009 hidroxicotinina=
845 vs 516 μgL P= 002 Tratamento com bupropiona cotinina= 1346 vs 160 μgL
P= 0005 hidroxicotinina= 972 vs 374 μgL P= 0004) No entanto quanto ao NMR
natildeo houve diferenccedila entre os desfechos de tratamento de ambos os faacutermacos Aleacutem
73
disso somente o grupo de pacientes tratados com vareniclina continha pacientes com
NMRlt031 (metabolizadores lentos para nicotina) e ainda sua frequecircncia foi baixa
(100 e 43 para os grupos de desfecho resistente e sucesso respectivamente)
Tabela 12 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos pacientes tratados
com vareniclina
Vareniclina μgL n=71 83 (81 ndash 95)
Nicotina μgL n=31 75 (76 ndash 112)
Cotinina μgL n=65 1007 (923 ndash 1225)
Hidroxicotinina μgL n=65 681 (638 ndash 874)
NMR n=63 069 (067 ndash 102)
NMR lt031 () n=63 79
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de
95) NMR=trans-3-hidroxicotininacotinina NMR lt031=
metabolizador lento NMR ge031= metabolizador normal e raacutepido A
hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo
trans-3- hidroxicotinina para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade
de outros isocircmeros satildeo irrelevantes
Tabela 13 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de tratamento
com vareniclina
Resistente Sucesso P
valor Vareniclina μgL n=71 84 (78 ndash 99) 83 (77 ndash 97) 096
Nicotina μgL n=31 83 (74 ndash 127) 70 (59 ndash 105) 032
Cotinina μgL n=65 1182 (1012 ndash 1426)
111114143ndash
1421426)
706 (643 ndash 1037) 0009
Hidroxicotinina μgL n=65 845 (702 ndash 1032) 516 (434 ndash 721) 002
NMR n=63 074 (062 ndash 107) 061 (055 ndash 113) 064
NMR lt031 () n=63 100 43 064
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de 95) NMR=trans-3-
hidroxicotininacotinina NMR lt031= metabolizador lento NMR ge031= metabolizador normal e
raacutepido A hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3- hidroxicotinina
para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros satildeo irrelevantes
74
Tabela 14 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos pacientes tratados
com bupropiona
Bupropiona μgL n=30 369 (332 ndash 493)
Hidroxibupropiona μgL n=23 7368 (5860 ndash 7824)
Nicotina μgL n=13 71 (62 ndash 109)
Cotinina μgL n=27 1159 (971 ndash 1648)
Hidroxicotinina μgL n=28 931 (838 ndash 1387)
NMR n=27 090 (074 ndash 149)
NMR lt031 () n=27 0
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de 95) NMR=
trans-3-hidroxicotininacotinina NMR lt031= metabolizador lento NMR
ge031= metabolizador normal e raacutepido Natildeo houve pacientes com NRM lt031 A
hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3-
hidroxicotinina para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros
satildeo irrelevantes
Tabela 15 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de tratamento
com bupropiona
Resistente Sucesso P
valor Bupropiona μgL n=30 372 (331 ndash 533) 300 (214 ndash 481) 048
Hidroxibupropiona μgL n=23 7795 (6078 ndash 8308) 5128 (2957 ndash 8195) 012
Nicotina μgL n=13 71 (62 ndash 109) - -
Cotinina μgL n=27 1346 (1097 ndash 1784) 160 (-195 ndash 712) 0005
Hidroxicotinina μgL n=28 972 (929 ndash 1520) 374 (33 ndash 847) 0004
NMR n=27 084 (076 ndash 109) 132 (-371 ndash 884) 014
NMR lt031 () n=27 0 0 -
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de 95) NMR= trans-3-
hidroxicotininacotinina NMR lt031= metabolizador lento NMR ge031= metabolizador normal e raacutepido
No grupo sucesso somente 1 paciente apresentou concentraccedilatildeo de nicotina Natildeo houve pacientes com NRM
lt031 A hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3- hidroxicotinina para o
caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros satildeo irrelevantes
75
6 DISCUSSAtildeO
61 Para os dados da anaacutelise de expressatildeo gecircnica
O presente estudo cliacutenico e exploratoacuterio identificou resultados significativos para
expressatildeo dos genes CHRNA7 e CHRNG de acordo com os tempos de coleta e o
desfecho de tratamento com vareniclina Amostras do grupo resistente nos tempos T2 e
T4 isto eacute jaacute com o uso da vareniclina apresentaram menores niacuteveis de expressatildeo
gecircnica do CHRNA7 comparado agraves amostras do T0 (antes de iniciar o tratamento
farmacoloacutegico) Estes resultados sugerem que o downregulation de α7 pode ter sido
responsaacutevel pela natildeo cessaccedilatildeo do fumo nos indiviacuteduos do grupo resistente o que natildeo foi
observado nas amostras do grupo sucesso
O gene CHRNA7 codifica a subunidade α7 dos nAChRs Esta possui grande
importacircncia estaacute presente em diversos tecidos e possui associaccedilatildeo consistente em
vaacuterios estudos com o processo de dependecircncia agrave nicotina processos cognitivos e
imunoloacutegicos 119-124 Estudos tambeacutem mostraram que haacute um locus contendo duplicaccedilatildeo
do gene CHRNA7 truncada composta pelos exons 5-10 do gene CHRNA7 precidida de
4 exons uacutenicos e uma deleccedilatildeo de dois pares de bases no eacutexon 6 o qual nomearam como
CHRNFAN7 A maioria dos indiviacuteduos possui uma ou duas coacutepias deste gene e satildeo
raros os casos em que esta coacutepia natildeo estaacute presente 125 126
No ceacuterebro de ratos Sprague-Dawley Ryan e Loiacono 119 detectaram niacuteveis de
α7 transcritos em diversos locais como na substacircncia negra compacta (SNpc) na
substacircncia negra reticular (SNpr) na aacuterea tegmental ventral (VTA) no coacutertex e no
hipocampo Os ratos submetidos ao tratamento crocircnico com nicotina mostraram maiores
niacuteveis de mRNA da subunidade α7 em SNpc SNpr e VTA em comparaccedilatildeo ao grupo
controle A VTA faz parte do sistema de recompensa mesoliacutembico o qual eacute muito
estudado nos processos de ND 12 15 No presente estudo (em amostras de PBMC) o
76
grupo de pacientes resistentes tambeacutem apresentou maior expressatildeo de α7 no momento
em que somente a nicotina estava presente no fumo crocircnico Ao introduzir a vareniclina
as expressotildees foram diminuiacutedas nos tempos T2 e T4 provavelmente devido ao
antagonismo competitivo da vareniclina com a nicotina no receptor
Benhammou et al 127 realizaram um estudo com amostras de ceacuterebro post mortem
de fumantes e com amostras de sangue de voluntaacuterios fumantes e natildeo fumantes Atraveacutes
do uso de nicotina radiomarcada nas amostras de ceacuterebro mostraram que os siacutetios de
ligaccedilatildeo agrave nicotina foram aumentados proporcionamente conforme o nuacutemero de cigarros
por dia O mesmo estudo ao analizar a expressatildeo gecircnica e proteiacutenas em linfoacutecitos e
ceacutelulas polimorfonucleares para um subconjunto de subunidades de receptores
nicotiacutenicos essas ceacutelulas assim como no tecido cerebral exibiram maiores nuacutemeros de
siacutetios de ligaccedilatildeo de alta afinidade agrave nicotina em fumantes em comparaccedilatildeo com natildeo
fumantes
A vareniclina em estudos funcionais mostrou ter atividade agonista total nos
receptores α7 40 Em um estudo realizou-se o tratamento crocircnico com vareniclina eou
nicotina em camundongos (10 dias) os niacuteveis das drogas no ceacuterebro e no plasma e a
toleracircncia e a expressatildeo de 4 subtipos de nAChR apoacutes dose aguda de nicotina foram
checados usando autoradiografia O upregulation de receptores α4β2 devido ao
tratamento crocircnico com vareniclina foi similar ao promovido pela nicotina e tambeacutem
ocorreu dowregulation de α6β2 assim como ocorreu com o uso de nicotina A
vareniclina aumentou significantemente os siacutetios de α3β4 e α7 enquanto a nicotina teve
menor efeito nestes siacutetios A combinaccedilatildeo da nicotina com a vareniclina foi similar agrave
vareniclina sozinha para os siacutetios de α3β4 enquanto para o siacutetio de α7 a combinaccedilatildeo
promoveu upregulation em menos regiotildees cerebrais em comparaccedilatildeo com a vareniclina
em monoterapia 77
77
No presente estudo os pacientes do grupo resistente apresentaram efeito
semelhante associado ao uso combinado de vareniclina e nicotina (devido ao fumo) os
niacuteveis de expressatildeo de CHRNA7 natildeo foram mantidos como nos pacientes que obtiveram
sucesso no tratamento No entanto o grupo sucesso soacute estava utilizando a vareniclina na
ausecircncia de nicotina entre os tempos T2 e T4 o que sugere que esse dowregulation
pode ocorrer em subgrupo de resposta
Diversos estudos mostraram diferenccedilas na expressatildeo gecircnica de a7 em
amostras de pacientes com diagnoacutesticos psiquiaacutetricos em comparaccedilatildeo com indiviacuteduos
sadios 102 128-134
Kunii et al 128 mostraram diferenccedila na expressatildeo de a7 em coacutertex preacute-frontal
dorsolateral post mortem de pacientes com depressatildeo ansiedade e transtorno bipolar e
inuacutemeros estudos mostraram menores niacuteveis de expressatildeo de α7 em pacientes com
esquizofrenia 102 129-134
Estudos de indiviacuteduos com esquizofrenia satildeo oacutetimos modelos para o
entendimento da importacircncia do receptor a7 em processos cognitivos em ND e em
como esses mecanismos estatildeo intimamente relacionados Diversos estudos mostraram
que haacute uma maior prevalecircncia de tabagismo em indiviacuteduos com esquizofrenia
comparados agrave populaccedilatildeo geral 135 136
Mexal el al 102 realizaram um estudo com amostras de ceacuterebro post mortem
provenientes de indiviacuteduos de 4 grupos distintos controle natildeo fumante controle
fumante pacientes com esquizofrenia natildeo fumantes e pacientes com esquizofrenia
fumantes O estudo realizou ensaio de expressatildeo de mRNA e de proteiacutena atraveacutes de
PCR quantitativo em tempo real e western blot As sondas da PCR foram desenhadas
para amplificar o gene completo CHRNA7 e sua coacutepia duplicada o CHRFAM7A Natildeo
fumantes com esquizofrecircnia apresentaram expressatildeo reduzida de mRNA e de proteiacutena
78
em relaccedilatildeo aos pacientes com esquizofrenia fumantes Natildeo fumantes com esquizofrenia
apresentaram menor expressatildeo em relaccedilatildeo ao controle natildeo fumante mas essa diferenccedila
foi estatisticamente significativa apenas no niacutevel do mRNA Outros estudos post
mortem cerebral mostraram menor expressatildeo dos receptores nicotiacutenicos no coacutertex e no
hipocampo de indiviacuteduos com esquizofrecircnia comparado aos controles saudaacuteveis 129-134
O CHRFAM7A assim como o CHRNA7 eacute polimoacuterfico e variantes neste gene
foram associadas agrave patologia auditoacuteria em casos de esquizofrenia Processos
diferenciados nos mecanismos de transcriccedilatildeo podem contribuir para um funcionamento
anormal de a7 como variaccedilotildees em promotor splicing alternativo eou desequiliacutebrio de
ligaccedilatildeo com o SNP do gene de neuroregulina -1 (gene que codifica moleacutecula de adesatildeo
celular envolvida em processos de neuroplasticidade sinaacuteptica) Estes processos podem
estar envonvidos em endofenoacutetipos da doenccedila 122 126 137-144
A nicotina parece melhorar a audiccedilatildeo em indiviacuteduos com deacuteficit auditoacuterio na
esquizofrenia associado ao α7 permitindo uma melhor filtragem dos estiacutemulos
auditivos estranhos A nicotina melhora a cogniccedilatildeo na esquizofrenia e agentes
alternativos que ativam o receptor nicotiacutenico foram testados e esses compostos
melhoraram a atenccedilatildeo a memoacuteria de trabalho e os sintomas negativos em um estudo
complementar de pacientes natildeo fumantes com esquizofrenia 145
Os estudos citados nos mostram grandes evidecircncias da associaccedilatildeo do α7 com
ND processos cognitivos e de resposta agrave vareniclina Esses achados podem explicar
nossos resultados em relaccedilatildeo agrave diminuiccedilatildeo da expressatildeo de 7 no grupo de pacientes
resistentes ao tratamento Os pacientes do grupo sucesso mantiveram os niacuteveis de
expressatildeo gecircnica em resposta agrave vareniclina jaacute no grupo resistente houve um
dowregulation Sugerimos que essa diminuiccedilatildeo pode ter sido a responsaacutevel ao menos
em parte pelos indiviacuteduos natildeo terem conseguido deixar de fumar A nicotina pode estar
79
compensando um deacuteficit de α7 que os indiviacuteduos resistentes podem apresentar No
entanto natildeo sabemos como seria a expressatildeo de α7 nestes indiviacuteduos na ausecircncia do
fumo
Quanto ao gene CHNRG natildeo haacute muitos resultados na literatura Este codifica
a subunidade γ dos receptores nicotiacutenicos A maioria dos estudos aponta associaccedilatildeo da
subunidade com distuacuterbios esqueleacutetico-musculares 146-149
No entanto King et al 65 encontraram a associaccedilatildeo de polimorfismos neste
gene com nausea no tratamento com vareniclina E Keskitalo-Vuokko 150 et al
encontraram associaccedilatildeo de SNPs em loci do cluster de genes CHRNGCHRND (genes
muitos proacuteximos o uacuteltimo codifica a subunidade delta dos nAChRs) com o niacutevel de
cotinina Saccone et al 151 encontraram a associaccedilatildeo de 4 loci no cluster
CHRNDCHRNG com ND Em outro estudo variantes nos genes CHRNDCHRNG
mostraram associaccedilatildeo modesta com o risco de ND em amostras de afro-americanos 152
Em um estudo o qual foi utilizado um modelo de esquizofrenia em ratos no
grupo de animais tratados com clozapina foi encontrado downregulation do Chrng no
nuacutecleo accumbens Neste mesmo estudo Santoro et al natildeo conseguiram formular uma
hipoacutetese para o achado devido ao lack de informaccedilotildees na literatura com o foco em ND
ou performance cognitiva 153
Haacute algumas limitaccedilotildees no estudo Primeira o ensaio da anaacutelise de expressatildeo
gecircnica foi realizado com amostras de sangue perifeacuterico e natildeo no SNC o que poderia nos
mostrar uma relaccedilatildeo mais clara e direta do faacutermaco com a via de resposta No entanto a
obtenccedilatildeo desta amostra eacute inviaacutevel Em contrapartida estudos jaacute demonstraram que haacute
similaridade entre a expressatildeo gecircnica de ceacutelulas do SNC e de ceacutelulas de sangue
perifeacuterico para alguns destes genes de receptores nicotiacutenicos 102 Segunda natildeo foi
realizado ensaio de expressatildeo gecircnica para amostras de indiviacuteduos natildeo fumantes o que
80
poderia fornecer mais paracircmetros de comparaccedilatildeo com os grupos resistente e sucesso
Terceira natildeo conseguimos qualidade necessaacuteria nas anaacutelises de genes potencialmente
importantes
62 Para os dados da mensuraccedilatildeo dos analitos
Um dos maiores desafios em anaacutelises de amostras bioloacutegicas eacute eliminar os
interferentes de sua matriz sem alterar substancialmente as quantidades dos analitos
presentes A matriz de amostras de soro e plasma satildeo complexas e envolve a presenccedila
de inuacutemeras macromoleacuteculas como lipiacutedios e proteiacutenas que obstruem colunas anaacuteliticas
diminuem o tempo de duraccedilatildeo de equipamentos e inviabilizam a interpretaccedilatildeo dos
dados devido a imensos picos e ruiacutedos formados nos cromatogramas e espectros de
massa Inumeros trabalhos executam uma preparaccedilatildeo preacutevia das amostras que envolve
processos como a extraccedilatildeo com uso de solventes preciptaccedilatildeo de proteiacutenas entre outros
os quais podem promover uma baixa recuperaccedilatildeo dos analitos tempo prolongado de
bancada e gasto de materiais 51 104-106
Devido agrave esse fato inuacutemeros estudos propuseram o uso de materiais de acesso
restrito (RAMs) para a purificaccedilatildeo da amostra sem tanto manuseio dentre eles estatildeo os
nanotubos de carbono (CNTs) modificados 109 110 114-116
O presente estudo desenvolveu uma coluna extratora composta por nanotubos
hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados quimicamente com a adiccedilatildeo de grupos
hidrofiacuteficos Essa coluna permitiu uma oacutetima exclusatildeo de macromoleacuteculas (98) A
aacutegua ultra pura foi o suficiente para ser utilizada como fase moacutevel de carregamento o
que eacute sustentaacutevel aleacutem de natildeo causar danos ao meio ambiente e o uacutenico preparo da
amostra foi uma diluiacuteccedilatildeo 11 tambeacutem em aacutegua O novo RAM desenvolvido foi
81
encaminhado para pedido de patente (Anexo 5) e portanto os processos para o seu
desenvolvimento foram mantidos em sigilo
Os CNTs possuem uma grande aacuterea superfiacutecial e oacutetima estabilidade em anaacutelise
de compostos no entanto o material natildeo promove a remoccedilatildeo de proteiacutenas com
eficiecircncia 110 115 Os poros dos CNTs formam uma barreira fiacutesica excluindo ou
permitindo a entrada de moleacuteculas por tamanho e os grupos hidrofiacutelicos adicionados ao
RAM desenvolvido natildeo permitem a ligaccedilatildeo de proteiacutenas de forma irreversiacutevel
formando uma barreira fiacutesico-quiacutemica Os demais CNTs natildeo modificados disponiacuteveis
natildeo promovem a exclusatildeo de macromoleacuteculas com tanta efetividade quanto o material
desenvolvido aleacutem disso o novo RAM apoacutes limpeza pode ser reutilizado cerca de 400
vezes (valor calculado durante os experimentos com amostras controle)
Quanto a otimizaccedilatildeo do meacutetodo de mensuraccedilatildeo a anaacutelise multidimensional
atraveacutes de equipamentos conectados por vaacutelvulas comutadoras promoveu a realizaccedilatildeo
da extraccedilatildeo eluiccedilatildeo anaacutelise limpeza e recondicionamento do sistema automaacuteticamente
A anaacutelise completa de uma amostra foi realizada em apenas 15 minutos O sistema
permitiu a mensuraccedilatildeo conjunta de diversos analitos com caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas
diferentes de uma mesma amostra mostrando bons sinais analiacuteticos e perfis
cromatograacuteficos
Quanto aos dados de validaccedilatildeo o meacutetodo permitiu uma oacutetima recuperaccedilatildeo dos
analitos com valores proacuteximos a 100 semelhante a outros estudos 104 117 154 155 A
maior dificuldade encontrada neste estudo foi a configuraccedilatildeo de paracircmetros
espectromeacutetricos e cromatograacuteficos que pudessem obter o maacuteximo de recuperaccedilatildeo e o
menor LQ possiacutevel para a anaacutelise de vareniclina ainda em um contexto de anaacutelise
multianalito
82
A dose posoloacutegica da vareniclina eacute muito baixa (1mg 2 vezes ao dia a partir do
8deg dia de tratamento) em comparaccedilatildeo com a da bupropiona (150 mg 2 vezes ao dia a
partir do 8deg dia de tratamento) dessa forma as concentraccedilotildees plasmaacuteticas de
vareniclina satildeo muito baixas Apesar do valor de LQ obtido (5 μg L-1) estar entre as
meacutedias plasmaacuteticas de intervalo terapecircutico (40 -70 μg L-1 de vareniclina em plasma e
soro) 51 118 ao mensurar amostras de pacientes em um cenaacuterio real de tratamento de 74
pacientes apenas 3 amostras apresentaram concentraccedilatildeo plasmaacutetica de vareniclina
abaixo do limite de quantificaccedilatildeo
Quanto a recuperaccedilatildeo do analito da matriz a vareniclina tambeacutem mostrou menor
taxa (883) em relaccedilatildeo aos outros analitos (valores proacuteximos ao 100) no entanto
essa taxa de recuperaccedilatildeo eacute considerada alta e foi semelhante ao estudo de Dobrinas et al
156 o qual realizou a extraccedilatildeo da amostra atraveacutes de coluna extratora de fase soacutelida
(SPE) disponiacutevel no mercado e a mensuraccedilatildeo tambeacutem foi realizada em um contexto
multianalito E ainda a recuperaccedilatildeo de vareniclina no presente estudo foi maior do que
a obtida pelo trabalho de Al-Haj et al 105 o qual realizou a preparaccedilatildeo preacutevia da amostra
por extraccedilatildeo liacutequido-liacutequido (LLE) e a mensuraccedilatildeo foi realizada para somente um
analito (4759 - 4872) e obteve recuperaccedilatildeo semelhante ao estudo de os qual
tambeacutem realizou a anaacutelise de vareniclina em um cenaacuterio multianalito (830 ndash 920)
Para nicotina e cotinina os valores de LQ obtidos no presente estudo (50 μg L-1)
se assemelham aos obtidos nos estudos de Abdallah et al 104 (70 μg L-1 para cotinina)
Onoue et al 157 (50 μg L-1 para nicotina e cotinina) Petersen et al 117 (50 μg L-1) Para
bupropiona e hidroxibupropiona o meacutetodo proposto eacute capaz de mensurar pequenas
quantidades do faacutermaco e de seu metaboacutelito (LQ 10 μg L-1 para ambos) quantidades
menores do que os LQs obtidos nos estudos de 158 (55 para bupropiona e 60 μgL para
83
hidroxibupropiona) e de 155 (100 μg L-1 para hidroxibupropiona) apesar das
concentraccedilotildees de metaboacutelitos em estado de equiliacutebrio em pacientes tratados com doses
terapecircuticas do faacutermaco serem bem maiores (45 ndash 75 μg L-1 e de 500 ndash 1500 μg L-1)
respectivamente para bupropiona e hidroxibupropiona 118
O Quadro 6 mostra os paracircmetros analiacuteticos do presente estudo comparados com
outros estudos presentes na literatura
Quanto agraves mensuraccedilotildees das amostras dos pacientes natildeo encontramos associaccedilatildeo
dos faacutermacos e seus metaboacutelitos com desfecho de tratamento Esse fato poderia ser
explicado pelo pequeno nuacutemero amostral do presente estudo
Encontramos diferenccedila significativa entre os grupos resistente e sucesso ao
tratamento quanto aos paracircmetros relacionados ao fumo e agrave DN Os pacientes do grupo
resistente tratados com vareniclina (ainda antes do iniacutecio do tratamento) fumavam um
maior nuacutemero de cigarrosdia em comparaccedilatildeo com os pacientes que obtiveram sucesso
O grupo resistente ao tratamento com bupropiona apresentou maior frequecircncia de
pacientes com alta DN (antes do tratamento) e de pacientes que fumavam no dia da
coleta em comparaccedilatildeo ao grupo sucesso Os dados tambeacutem mostraram que os pacientes
resistentes tratados com ambos os faacutermacos no dia da coleta apresentaram maiores
concentraccedilotildees dos metaboacutelitos da nicotina Esses dados podem indicar maior exposiccedilatildeo
ao fumo e maior DN podendo implicar na resposta ao tratamento antitabagismo
Haacute algumas limitaccedilotildees nesse estudo Primeira os pacientes natildeo fizeram exames
de funccedilatildeo hepaacutetica antes da inclusatildeo no entudo no entanto a presenccedila de comorbidades
hepaacuteticas foram questionadas Segunda natildeo podemos obter total rigor nos horaacuterios de
tomada dos medicamentos por parte dos pacientes no entanto os pacientes foram
84
orientados agrave tomar o medicamento sempre no mesmo horaacuterio e foram questionados
quanto ao cumprimento do protocolo Terceira o nuacutemero amostral para a anaacutelise dos
analitos e de NRM em estudos de associaccedilatildeo com desfecho de tratamento eacute considerado
modesto e consequentemente pode ter implicado nos resultados de natildeo associaccedilatildeo
85
Quadro 6 ndash Comparaccedilatildeo dos dados de validaccedilatildeo com outros estudos
Analitos Purificaccedilatildeo da
amostraextraccedilatildeo Meacutetodo Amostra Intervalo Linear (μg L-1) Recuperaccedilatildeo () LD μg L-1 LQ μg L-1 Referecircncia
Vareniclina
Bupropiona
Hidroxibupropiona
Nicotina
Cotinina
Hidroxicotinina
CS ndash SPE (novo
RAM) HPLC-MSMS Soro humano
50 ndash 1000
10 ndash 10000
10 ndash 20000
50 ndash 10000
50 ndash 10000
50 ndash 10000
883
1101
945
1098
941
1167
25
07
06
19
24
37
50
10
10
50
50
50
Presente
estudo
Nicotitna
Cotinina LLE (LCndashMSMS) Soro humano
03 ndash 525
70 ndash15000
978 ndash 1114
973 ndash1156 -
03
70
Abdalla et al 104
Bupropiona
Hidroxibupropiona PP + SPE online TFCndashMSMS) Soro humano 50 ndash 10000
1580
1160
13
45
55
60
Petrides et
al 158
Vareniclina LLE HPLCndashMSMS
(API) Plasma humano 01ndash100 4759 - 4872 005 01
Al-Haj et al 105
Vareniclina LLE HPLC-
APIMSMS
Plasma
Urina
01 - 500
10 ndash 5000 - -
lt01
100
Faessel et al 51
Nicotina
cotinina
trans-3 ndash
hidroxicotinina
vareniclina
SPE (Oasis MCX 10
mg 96-well extraction
plate)
UPLCndashMSMS
Soro humano
100 ndash 5000
100 ndash 5000
100 - 5000
100 ndash 2500
860 ndash 940
700 ndash 870
490 ndash 540
830 ndash 920
-
20
10
20
10
Dobrinas et
al 156
86
Nicotina
Cotinina Centrifugaccedilatildeo
Diluiccedilatildeo
isotoacutepica estaacutevel
ndash UPLC-
MSMS
Urina 50 ndash 350000 968ndash1051
943ndash992
07
04
17
11
Kuhn et al 154
Nicotina e Cotinina LLE PP SPE
(UPLC-
MSMS)
Sangue urina e
outros tecidos de
rato
100 ndash 6000 (plasma)
80 (nicotina e
cotininacom
precipitaccedilatildeo)
25 50 Onoue et al
157
Cotinina LL SPE (coluna
Zorbaxs XDB C8) HPLCUV Soro e urina 50 ndash 5000 978 ndash 102 018 50
Petersen et
al 117
hidroxibupropiona PP + SPE online RP‐HPLCUV Plasma humano 1000 - 25000 6118 1000 1000
Scherf-
Clavel et al 155
CS ndash SPE= Extraccedilatildeo em fase soacutelida no modo column switching LLE= extraccedilatildeo liacutequido-liacutequido PP=precipitaccedilatildeo de proteiacutenas SPE=extraccedilatildeo em fase soacutelida HPLC= cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia
UPLC=cromatografia liacutequida de ultra eficiecircncia RP‐HPLC=Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia em fase reversa TFC=Cromatografia liacutequida turbulenta API=ionizaccedilatildeo em pressatildeo atmosfeacutericaUV=
detector ultravioleta MSMS= espectometria de massas em tandem
87
7 CONCLUSOtildeES
Para a anaacutelise da expressatildeo gecircnica este estudo exploratoacuterio mostra a associaccedilatildeo
das subunidades α7 e γ com a efetividade do tratamento com vareniclina Estes
resultados poderiam contribuir ao menos em parte para o desenvolvimento de uma
terapecircutica individualizada
Para a mensuraccedilatildeo de analitos o novo RAM sintetizado eacute um produto de
extremo valor cientiacutefico podendo apresentar diversas aplicaccedilotildees em anaacutelise de amostras
de matrizes complexas sem muita preparaccedilatildeo preacutevia Para a associaccedilatildeo das
concentraccedilotildees dos faacutermacos e seus metaboacutelitos com o desfecho de tratamento satildeo
necessaacuterios estudos com um maior nuacutemero amostral
88
8 SUGESTOtildeES PARA ESTUDOS FUTUROS
Sugerimos estudos que promovam maior entendimento das subunidades α7 e γ
dos nAChRs nos processos de dependecircncia agrave nicotina e no tratamento com vareniclina
Sugerimos tambeacutem estudos de investigaccedilatildeo para novas aplicabilidades do novo RAM
desenvolvido
89
9 REFEREcircNCIAS
1 WHO Tobacco WHO Media Centre 2015
2 Oliveira AF Valente JG Leite IC [Aspects of tobacco attributable mortality
systematic review] Rev Saude Publica 200842(2)335-345
3 Koshiaris C Aveyard P Oke J Ryan R Szatkowski L Stevens R Farley A
Smoking cessation and survival in lung upper aero-digestive tract and bladder
cancer cohort study Br J Cancer 2017117(8)1224-1232
4 Leppanen T Toyras J Mervaala E Penzel T Kulkas A Severity of individual
obstruction events increases with age in patients with obstructive sleep apnea
Sleep Med 20173732-37
5 Cerda J Bambs C Vera C Infant morbidity and mortality attributable to
prenatal smoking in Chile Rev Panam Salud Publica 201741e106
6 Vigitel Brasil - Vigilacircncia de fatores de risco e proteccedilatildeo para doenccedilas crocircnicas
por inqueacuterito telefocircnico Estimativas sobre frequecircncia e distribuiccedilatildeo
sociodemograacutefica de fatores de risco e proteccedilatildeo para doenccedilas crocircnicas nas
capitais dos 26 estados brasileiros e no Distrito Federal em 2018 Brasiacutelia 2019
7 Rosemberg J Nicotina Droga Universal Instituto Nacional de Cacircncer
(wwwincagovbr) 2004
8 Kirchenchtein C Chatkin JM Dependecircncia da Nicotina In Diretrizes para
Cessaccedilatildeo do Tabagismo Jornal Brasileiro de Pneumologia Brasiacutelia DF 2004
9 Fagerstoumlm K Uma breve apresentaccedilatildeo da neurofarmacologia e fisiologia da
dependecircncia agrave nicotina In Gigliotti AP Presman S (Eds) Atualizaccedilatildeo no
Tratamento do Tabagismo ABP Sauacutede 2006
10 Gigliotti A Lemos T Quais satildeo os mecanismos da dependecircncia de nicotina
In Manual de Condutas e Praacuteticas em Tabagismo Sociedade Brasileira de
Pneumologia e Tisiologia 2012
11 Divisatildeo de Controle do Tabagismo Coordenaccedilatildeo de Accedilotildees Estrateacutegicas
Instituto Nacional de Cacircncer Silva AG Ministeacuterio da Sauacutede Protocolo cliacutenico
e diretrizes terapecircuticas dependecircncia agrave nicotina 2013
12 Schultz W Multiple reward signals in the brain Nat Rev Neurosci
20001(3)199-207
13 Stolerman IP Jarvis MJ The scientific case that nicotine is addictive
Psychopharmacology (Berl) 1995117(1)2-10 discussion 14-20
90
14 Koob GF Volkow ND Neurocircuitry of addiction Neuropsychopharmacology
200935(1)217-238
15 Martin-Soelch C Neuroadaptive changes associated with smoking structural
and functional neural changes in nicotine dependence Brain Sci 20133(1)159-
176
16 Boening JA Neurobiology of an addiction memory J Neural Transm (Vienna)
2001108(6)755-765
17 Robbins TW Everitt BJ Limbic-striatal memory systems and drug addiction
Neurobiol Learn Mem 200278(3)625-636
18 Everitt BJ Belin D Economidou D Pelloux Y Dalley JW Robbins TW
Review Neural mechanisms underlying the vulnerability to develop compulsive
drug-seeking habits and addiction Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci
2008363(1507)3125-3135
19 Fuentes RM Notkola IL Shemeikka S Tuomilehto J Nissinen A Familial
aggregation of blood pressure a population-based family study in eastern
Finland J Hum Hypertens 200014(7)441-445
20 Gotti C Zoli M Clementi F Brain nicotinic acetylcholine receptors native
subtypes and their relevance Trends Pharmacol Sci 200627(9)482-491
21 Benowitz NL Pharmacology of nicotine addiction smoking-induced disease
and therapeutics Annu Rev Pharmacol Toxicol 20094957-71
22 Benowitz NL Clinical pharmacology of inhaled drugs of abuse implications in
understanding nicotine dependence NIDA Res Monogr 19909912-29
23 Picciotto MR Zoli M Rimondini R Lena C Marubio LM Pich EM Fuxe K
Changeux JP Acetylcholine receptors containing the beta2 subunit are involved
in the reinforcing properties of nicotine Nature 1998391(6663)173-177
24 Maskos U Molles BE Pons S Besson M Guiard BP Guilloux JP Evrard A
Cazala P Cormier A Mameli-Engvall M Dufour N Cloez-Tayarani I
Bemelmans AP Mallet J Gardier AM David V Faure P Granon S Changeux
JP Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of
nicotinic receptors Nature 2005436(7047)103-107
25 Tapper AR McKinney SL Nashmi R Schwarz J Deshpande P Labarca C
Whiteaker P Marks MJ Collins AC Lester HA Nicotine activation of alpha4
receptors sufficient for reward tolerance and sensitization Science
2004306(5698)1029-1032
26 Aberger K Chitravanshi VC Sapru HN Cardiovascular responses to
microinjections of nicotine into the caudal ventrolateral medulla of the rat Brain
Res 2001892(1)138-146
91
27 Levin ED Bettegowda C Blosser J Gordon J AR-R17779 and alpha7
nicotinic agonist improves learning and memory in rats Behav Pharmacol
199910(6-7)675-680
28 Hajos M Hurst RS Hoffmann WE Krause M Wall TM Higdon NR Groppi
VE The selective alpha7 nicotinic acetylcholine receptor agonist PNU-282987
[N-[(3R)-1-Azabicyclo[222]oct-3-yl]-4-chlorobenzamide hydrochloride]
enhances GABAergic synaptic activity in brain slices and restores auditory
gating deficits in anesthetized rats J Pharmacol Exp Ther 2005312(3)1213-
1222
29 Salas R Orr-Urtreger A Broide RS Beaudet A Paylor R De Biasi M The
nicotinic acetylcholine receptor subunit alpha 5 mediates short-term effects of
nicotine in vivo Mol Pharmacol 200363(5)1059-1066
30 Henningfield JE Stapleton JM Benowitz NL Grayson RF London ED Higher
levels of nicotine in arterial than in venous blood after cigarette smoking Drug
Alcohol Depend 199333(1)23-29
31 Hukkanen J Jacob P 3rd Benowitz NL Metabolism and disposition kinetics of
nicotine Pharmacol Rev 200557(1)79-115
32 Dempsey D Tutka P Jacob P 3rd Allen F Schoedel K Tyndale RF Benowitz
NL Nicotine metabolite ratio as an index of cytochrome P450 2A6 metabolic
activity Clin Pharmacol Ther 200476(1)64-72
33 Allenby CE Boylan KA Lerman C Falcone M Precision Medicine for
Tobacco Dependence Development and Validation of the Nicotine Metabolite
Ratio J Neuroimmune Pharmacol 201611(3)471-483
34 Llaquet H Pichini S Joya X Papaseit E Vall O Klein J Garcia-Algar O
Biological matrices for the evaluation of exposure to environmental tobacco
smoke during prenatal life and childhood Anal Bioanal Chem 2010396(1)379-
399
35 Reichert J AA Gonccedilalves CMC Godoy I Chatkin JM Sales MPU et al
Diretrizes da Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisologia Diretrizes para
cessaccedilatildeo do tabagismo ndash 2008 J Bras Pneumol 200834(10)845-880
36 Fiore MC Jaeacuten C R Baker TB Treating tobacco use and dependence 2008
update Clinical Practice Guideline In services USDohah ed Public Health
Service Rockville (md) 2008
37 Kassem MG Al Hossaini AM Varenicline Profiles Drug Subst Excip Relat
Methodol 201237389-411
38 Zoli M Lena C Picciotto MR Changeux JP Identification of four classes of
brain nicotinic receptors using beta2 mutant mice J Neurosci
199818(12)4461-4472
92
39 Hogg RC Raggenbass M Bertrand D Nicotinic acetylcholine receptors from
structure to brain function Rev Physiol Biochem Pharmacol 20031471-46
40 Mihalak KB Carroll FI Luetje CW Varenicline is a partial agonist at
alpha4beta2 and a full agonist at alpha7 neuronal nicotinic receptors Mol
Pharmacol 200670(3)801-805
41 Swan GE Javitz HS Jack LM Wessel J Michel M Hinds DA Stokowksi RP
McClure JB Catz SL Richards J Zbikowski SM Deprey M McAfee T Conti
DV Bergen AW Varenicline for smoking cessation nausea severity and
variation in nicotinic receptor genes Pharmacogenomics J 201212(4)349-358
42 Kaur K Kaushal S Chopra SC Varenicline for smoking cessation A review of
the literature Curr Ther Res Clin Exp 200970(1)35-54
43 Catz SL Jack LM McClure JB Javitz HS Deprey M Zbikowski SM McAfee
T Richards J Swan GE Adherence to varenicline in the COMPASS smoking
cessation intervention trial Nicotine Tob Res 201113(5)361-368
44 Faessel HM Burstein AH Troutman MD Willavize SA Rohrbacher KD Clark
DJ Lack of a pharmacokinetic interaction between a new smoking cessation
therapy varenicline and digoxin in adult smokers Eur J Clin Pharmacol
200864(11)1101-1109
45 Mohanasundaram UM Chitkara R Krishna G Smoking cessation therapy with
varenicline Int J Chron Obstruct Pulmon Dis 20083(2)239-251
46 Faessel HM Smith BJ Gibbs MA Gobey JS Clark DJ Burstein AH Single-
dose pharmacokinetics of varenicline a selective nicotinic receptor partial
agonist in healthy smokers and nonsmokers J Clin Pharmacol 200646(9)991-
998
47 Faessel HM Obach RS Rollema H Ravva P Williams KE Burstein AH A
review of the clinical pharmacokinetics and pharmacodynamics of varenicline
for smoking cessation Clin Pharmacokinet 201049(12)799-816
48 Ravva P Gastonguay MR Tensfeldt TG Faessel HM Population
pharmacokinetic analysis of varenicline in adult smokers Br J Clin Pharmacol
200968(5)669-681
49 Obach RS Reed-Hagen AE Krueger SS Obach BJ OConnell TN Zandi KS
Miller S Coe JW Metabolism and disposition of varenicline a selective
alpha4beta2 acetylcholine receptor partial agonist in vivo and in vitro Drug
Metab Dispos 200634(1)121-130
50 Feng B Obach RS Burstein AH Clark DJ de Morais SM Faessel HM Effect
of human renal cationic transporter inhibition on the pharmacokinetics of
varenicline a new therapy for smoking cessation an in vitro-in vivo study Clin
Pharmacol Ther 200883(4)567-576
93
51 Faessel HM Gibbs MA Clark DJ Rohrbacher K Stolar M Burstein AH
Multiple-dose pharmacokinetics of the selective nicotinic receptor partial
agonist varenicline in healthy smokers J Clin Pharmacol 200646(12)1439-
1448
52 Slemmer JE Martin BR Damaj MI Bupropion is a nicotinic antagonist J
Pharmacol Exp Ther 2000295(1)321-327
53 Hughes JR Stead LF Lancaster T Antidepressants for smoking cessation
Cochrane Database Syst Rev 2007(1)CD000031
54 Goodnick PJ Pharmacokinetics of second generation antidepressants
bupropion Psychopharmacol Bull 199127(4)513-519
55 Hesse LM Venkatakrishnan K Court MH von Moltke LL Duan SX Shader
RI Greenblatt DJ CYP2B6 mediates the in vitro hydroxylation of bupropion
potential drug interactions with other antidepressants Drug Metab Dispos
200028(10)1176-1183
56 Faucette SR Hawke RL Lecluyse EL Shord SS Yan B Laethem RM Lindley
CM Validation of bupropion hydroxylation as a selective marker of human
cytochrome P450 2B6 catalytic activity Drug Metab Dispos 200028(10)1222-
1230
57 Walsky RL Astuccio AV Obach RS Evaluation of 227 drugs for in vitro
inhibition of cytochrome P450 2B6 J Clin Pharmacol 200646(12)1426-1438
58 Walsky RL Obach RS A comparison of 2-phenyl-2-(1-piperidinyl)propane
(ppp) 111-phosphinothioylidynetrisaziridine (thioTEPA) clopidogrel and
ticlopidine as selective inactivators of human cytochrome P450 2B6 Drug
Metab Dispos 200735(11)2053-2059
59 Quaak M van Schooten FJ van Schayck CP Pharmacogenetics of smoking
how far to the clinic Pharmacogenomics 201415(6)723-726
60 Swan GE Lessov-Schlaggar CN Tobacco addiction and pharmacogenetics of
nicotine metabolism J Neurogenet 200923(3)262-271
61 Tomaz PRX Kajita MS Santos JR Scholz J Abe TO Gaya PV Krieger JE
Pereira AC Santos P Cytochrome P450 2A6 and 2B6 polymorphisms and
smoking cessation success in patients treated with varenicline Eur J Clin
Pharmacol201975(11)1541-1545
62 Tomaz PRX Santos JR Scholz J Abe TO Gaya PV Negrao AB Krieger JE
Pereira AC Santos P Cholinergic receptor nicotinic alpha 5 subunit
polymorphisms are associated with smoking cessation success in women BMC
Med Genet201819(1)55
94
63 Scholz J Santos PC Buzo CG Lopes NH Abe TO Gaya PV Pierri H Amorim
C Pereira AC Effects of aging on the effectiveness of smoking cessation
medication Oncotarget 20167(21)30032-30036
64 Issa JS Santos PC Vieira LP Abe TO Kuperszmidt CS Nakasato M Cardoso
E Amorim C Pereira AC Smoking cessation and weight gain in patients with
cardiovascular disease or risk factor Int J Cardiol 2014172(2)485-487
65 King DP Paciga S Pickering E Benowitz NL Bierut LJ Conti DV Kaprio J
Lerman C Park PW Smoking cessation pharmacogenetics analysis of
varenicline and bupropion in placebo-controlled clinical trials
Neuropsychopharmacology 201237(3)641-650
66 Saccone NL Baurley JW Bergen AW David SP Elliott HR Foreman MG
Kaprio J Piasecki TM Relton CL Zawertailo L Bierut LJ Tyndale RF Chen
LS The Value of Biosamples in Smoking Cessation Trials A Review of
Genetic Metabolomic and Epigenetic Findings Nicotine Tob Res
201820(4)403-413
67 Rocha Santos J Tomaz PR Issa JS Abe TO Krieger JE Pereira AC Santos
PC CHRNA4 rs1044396 is associated with smoking cessation in varenicline
therapy Front Genet 2015646
68 Tomaz PR Santos JR Issa JS Abe TO Gaya PV Krieger JE Pereira AC
Santos PC CYP2B6 rs2279343 polymorphism is associated with smoking
cessation success in bupropion therapy Eur J Clin Pharmacol 2015
71(9)1067-73
69 David SP Brown RA Papandonatos GD Kahler CW Lloyd-Richardson EE
Munafo MR Shields PG Lerman C Strong D McCaffery J Niaura R
Pharmacogenetic clinical trial of sustained-release bupropion for smoking
cessation Nicotine Tob Res 20079(8)821-833
70 Lerman C Shields PG Wileyto EP Audrain J Pinto A Hawk L Krishnan S
Niaura R Epstein L Pharmacogenetic investigation of smoking cessation
treatment Pharmacogenetics 200212(8)627-634
71 Han DH Joe KH Na C Lee YS Effect of genetic polymorphisms on smoking
cessation a trial of bupropion in Korean male smokers Psychiatr Genet
200818(1)11-16
72 Zanger UM Klein K Pharmacogenetics of cytochrome P450 2B6 (CYP2B6)
advances on polymorphisms mechanisms and clinical relevance Front Genet
2013424
73 Zhu AZ Cox LS Nollen N Faseru B Okuyemi KS Ahluwalia JS Benowitz
NL Tyndale RF CYP2B6 and bupropions smoking-cessation pharmacology
the role of hydroxybupropion Clin Pharmacol Ther 201292(6)771-777
95
74 Laib AK Brunen S Pfeifer P Vincent P Hiemke C Serum concentrations of
hydroxybupropion for dose optimization of depressed patients treated with
bupropion Ther Drug Monit 201436(4)473-479
75 Hutchison KE Allen DL Filbey FM Jepson C Lerman C Benowitz NL Stitzel
J Bryan A McGeary J Haughey HM CHRNA4 and tobacco dependence from
gene regulation to treatment outcome Arch Gen Psychiatry 200764(9)1078-
1086
76 Smith RC Zhubi A Maloku E Sershen H Lajtha A Davis JM Costa E
Guidotti A Varenicline treatment decreases DNMT1 mRNA expression in
lymphocytes of schizophrenic patients who are cigarette smokers Schizophr
Res 2010119(1-3)269-270
77 Marks MJ ONeill HC Wynalda-Camozzi KM Ortiz NC Simmons EE Short
CA Butt CM McIntosh JM Grady SR Chronic treatment with varenicline
changes expression of four nAChR binding sites in mice Neuropharmacology
201599142-155
78 Middleton FA Pato CN Gentile KL McGann L Brown AM Trauzzi M Diab
H Morley CP Medeiros H Macedo A Azevedo MH Pato MT Gene
expression analysis of peripheral blood leukocytes from discordant sib-pairs
with schizophrenia and bipolar disorder reveals points of convergence between
genetic and functional genomic approaches Am J Med Genet B Neuropsychiatr
Genet 2005136B(1)12-25
79 Takahashi M Hayashi H Watanabe Y Sawamura K Fukui N Watanabe J
Kitajima T Yamanouchi Y Iwata N Mizukami K Hori T Shimoda K Ujike H
Ozaki N Iijima K Takemura K Aoshima H Someya T Diagnostic
classification of schizophrenia by neural network analysis of blood-based gene
expression signatures Schizophr Res 2010119(1-3)210-218
80 Lee J Goh LK Chen G Verma S Tan CH Lee TS Analysis of blood-based
gene expression signature in first-episode psychosis Psychiatry Res
2012200(1)52-54
81 Sullivan PF Fan C Perou CM Evaluating the comparability of gene expression
in blood and brain Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet
2006141B(3)261-268
82 Hennings JM Uhr M Klengel T Weber P Putz B Touma C Czamara D Ising
M Holsboer F Lucae S RNA expression profiling in depressed patients
suggests retinoid-related orphan receptor alpha as a biomarker for antidepressant
response Transl Psychiatry 20155e538
83 Ota VK Noto C Gadelha A Santoro ML Silva PN Melaragno MI Smith Mde
A Cordeiro Q Bressan RA Belangero SI Neurotransmitter receptor and
regulatory gene expression in peripheral blood of Brazilian drug-naive first-
96
episode psychosis patients before and after antipsychotic treatment Psychiatry
Res2013210(3)1290-1292
84 Kordi-Tamandani DM Tajoddini S Salimi F Promoter Methylation and BDNF
and DAT1 Gene Expression Profiles in Patients with Drug Addiction
Pathobiology 201582(2)94-99
85 Wongsriraksa A Parsons ME Whelan CJ Characterisation of nicotine receptors
on human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) Inflamm Res
200958(1)38-44
86 Kawashima K Fujii T Expression of non-neuronal acetylcholine in
lymphocytes and its contribution to the regulation of immune function Front
Biosci 200492063-2085
87 St-Pierre S Jiang W Roy P Champigny C LeBlanc E Morley BJ Hao J
Simard AR Nicotinic Acetylcholine Receptors Modulate Bone Marrow-Derived
Pro-Inflammatory Monocyte Production and Survival PLoS One
201611(2)e0150230
88 Zdanowski R Krzyzowska M Ujazdowska D Lewicka A Lewicki S Role of
alpha7 nicotinic receptor in the immune system and intracellular signaling
pathways Cent Eur J Immunol 201540(3)373-379
89 Baez-Pagan CA Delgado-Velez M Lasalde-Dominicci JA Activation of the
Macrophage alpha7 Nicotinic Acetylcholine Receptor and Control of
Inflammation J Neuroimmune Pharmacol 201510(3)468-476
90 Kalkman HO Feuerbach D Modulatory effects of alpha7 nAChRs on the
immune system and its relevance for CNS disorders Cell Mol Life Sci
201673(13)2511-2530
91 Zakrzewicz A Richter K Agne A Wilker S Siebers K Fink B Krasteva-Christ
G Althaus M Padberg W Hone AJ McIntosh JM Grau V Canonical and
Novel Non-Canonical Cholinergic Agonists Inhibit ATP-Induced Release of
Monocytic Interleukin-1beta via Different Combinations of Nicotinic
Acetylcholine Receptor Subunits alpha7 alpha9 and alpha10 Front Cell
Neurosci201711189
92 Arreola R Alvarez-Herrera S Perez-Sanchez G Becerril-Villanueva E Cruz-
Fuentes C Flores-Gutierrez EO Garces-Alvarez ME de la Cruz-Aguilera DL
Medina-Rivero E Hurtado-Alvarado G Quintero-Fabian S Pavon L
Immunomodulatory Effects Mediated by Dopamine J Immunol
Res20163160486
93 Nakajima M Yamamoto T Nunoya K Yokoi T Nagashima K Inoue K Funae
Y Shimada N Kamataki T Kuroiwa Y Role of human cytochrome P4502A6 in
C-oxidation of nicotine Drug Metab Dispos 199624(11)1212-1217
97
94 Messina ES Tyndale RF Sellers EM A major role for CYP2A6 in nicotine C-
oxidation by human liver microsomes J Pharmacol Exp Ther
1997282(3)1608-1614
95 Chen A Krebs NM Zhu J Muscat JE Nicotine metabolite ratio predicts
smoking topography The Pennsylvania Adult Smoking Study Drug Alcohol
Depend201819089-93
96 Shahab L BL McNeill Tyndale RF Does the nicotine metabolite ratio
moderate smoking cessation treatment outcomes in real-world settings A
prospective study Addiction 2019114(2)304-314 doi 101111add14450
97 Lea RA Dickson S Benowitz NL Within-subject variation of the salivary
3HCCOT ratio in regular daily smokers prospects for estimating CYP2A6
enzyme activity in large-scale surveys of nicotine metabolic rate J Anal Toxicol
200630(6)386-389
98 Mooney ME Li ZZ Murphy SE Pentel PR Le C Hatsukami DK Stability of
the nicotine metabolite ratio in ad libitum and reducing smokers Cancer
Epidemiol Biomarkers Prev 200817(6)1396-1400
99 Piestansky J Marakova K Veizerova L Galba J Mikus P On-line column
coupled isotachophoresis-capillary zone electrophoresis hyphenated with
tandem mass spectrometry in drug analysis varenicline and its metabolite in
human urine Anal Chim Acta 201482684-93
100 Fagerstrom KO Heatherton TF Kozlowski LT Nicotine addiction and its
assessment Ear Nose Throat J 199069(11)763-765
101 Issa JS A new nicotine dependence score and a new scale assessing patient
comfort during smoking cessation treatment J Bras Pneumol 201238(6)761-
765
102 Mexal S Berger R Logel J Ross RG Freedman R Leonard S Differential
regulation of alpha7 nicotinic receptor gene (CHRNA7) expression in
schizophrenic smokers J Mol Neurosci 201040(1-2)185-195
103 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-
time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods
200125(4)402-408
104 Abdallah IA Hammell DC Stinchcomb AL Hassan HE A fully validated LC-
MSMS method for simultaneous determination of nicotine and its metabolite
cotinine in human serum and its application to a pharmacokinetic study after
using nicotine transdermal delivery systems with standard heat application in
adult smokers J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2016102067-
77
98
105 Al-Haj A Alawi M Arafat T Hourani MK Method development validation
and bioequivalence of varenicline in human plasma by liquid chromatography
tandem mass spectrometry J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci
2013931134-139
106 Hegstad S Stray-Pedersen A Olsen L Vege A Rognum TO Morland J
Christophersen AS Determination of cotinine in pericardial fluid and whole
blood by liquid chromatography-tandem mass spectrometry J Anal Toxicol
200933(4)218-222
107 Santos MG Moraes Gde O Nakamura MG dos Santos-Neto AJ Figueiredo
EC Restricted access molecularly imprinted polymers obtained by bovine serum
albumin andor hydrophilic monomers external layers a comparison related to
physical and chemical properties Analyst 2015140(22)7768-7775
108 de Lima MM Vieira AC Martins I Boralli VB Borges KB Figueiredo EC
On-line restricted access molecularly imprinted solid phase extraction of
ivermectin in meat samples followed by HPLC-UV analysis Food Chem
2015197(Pt A)7-13
109 Barbosa AF Barbosa VM Bettini J Luccas PO Figueiredo EC Restricted
access carbon nanotubes for direct extraction of cadmium from human serum
samples followed by atomic absorption spectrometry analysis Talanta
2016131213-220
110 de Faria HD Abrao LC Santos MG Barbosa AF Figueiredo EC New
advances in restricted access materials for sample preparation A review Anal
Chim Acta 201795943-65
111 FRANQUI L S et al Synthesis and characterization of a magnetic molecularly
imprinted polymer for the selective extraction of nicotine and cotinine from
urine samples followed by GC-MS analysis Anal Methods 2015 7(21) 9237ndash
9244 2015
112 Santos MG Tavares IM Barbosa AF Bettini J Figueiredo EC Analysis of
tricyclic antidepressants in human plasma using online-restricted access
molecularly imprinted solid phase extraction followed by direct mass
spectrometry identificationquantification Talanta 20171638-16
113 US Department of Health and Human Services Food and Drug Administration
(FDA) Center for Drug Evaluation and Research (CDER)Center for Veterinary
Medicine (CVM) Guidance for IndustryBioanalytical method validation
Biopharmaceutics 2013
114 GOMES Raphael A B et al Evaluation of the pH influence on protein
exclusion by restricted access carbono nanotubes coated with bovine serum
albumin Journal Of Materials Science 2016 51(16)7407-7414
99
115 de Faria HD Rosa MA Silveira AT Figueiredo EC Direct extraction of
tetracyclines from bovine milk using restricted access carbon nanotubes in a
column switching liquid chromatography system Food Chem 201722598-106
116 de Faria HD Bueno CT Krieger JE Krieger EM Pereira AC Santos P
Figueiredo EC Online extraction of antihypertensive drugs and their metabolites
from untreated human serum samples using restricted access carbon nanotubes
in a column switching liquid chromatography system J Chromatogr A
2017152841-52
117 Petersen GO Leite CE Chatkin JM Thiesen FV Cotinine as a biomarker of
tobacco exposure development of a HPLC method and comparison of matrices
J Sep Sci 201033(4-5)516-521
118 Brunen S Vincent PD Baumann P Hiemke C Havemann-Reinecke U
Therapeutic drug monitoring for drugs used in the treatment of substance-related
disorders literature review using a therapeutic drug monitoring appropriateness
rating scale Ther Drug Monit 201133(5)561-572
119 Ryan RE Loiacono RE Nicotine regulates alpha7 nicotinic receptor subunit
mRNA implications for nicotine dependence Neuroreport 200112(3)569-
572
120 Cameli C Bacchelli E De Paola M Giucastro G Cifiello S Collo G Cainazzo
MM Pini LA Maestrini E Zoli M Genetic variation in CHRNA7 and
CHRFAM7A is associated with nicotine dependence and response to varenicline
treatment Eur J Hum Genet 201826(12)1824-1831
121 Wallace TL Bertrand D Importance of the nicotinic acetylcholine receptor
system in the prefrontal cortex Biochem Pharmacol 201385(12)1713-1720
122 Dempster EL Toulopoulou T McDonald C Bramon E Walshe M Wickham H
Sham PC Murray RM Collier DA Episodic memory performance predicted by
the 2bp deletion in exon 6 of the alpha 7-like nicotinic receptor subunit gene
Am J Psychiatry 2006163(10)1832-1834
123 Enioutina EY Myers EJ Tvrdik P Hoidal JR Rogers SW Gahring LC The
nicotinic receptor Alpha7 impacts the mouse lung response to LPS through
multiple mechanisms PLoS One 201510(3)e0121128
124 Sinkus ML Graw S Freedman R Ross RG Lester HA Leonard S The human
CHRNA7 and CHRFAM7A genes A review of the genetics regulation and
function Neuropharmacology 201596(Pt B)274-288
125 Gault J Robinson M Berger R Drebing C Logel J Hopkins J Moore T Jacobs
S Meriwether J Choi MJ Kim EJ Walton K Buiting K Davis A Breese C
Freedman R Leonard S Genomic organization and partial duplication of the
human alpha7 neuronal nicotinic acetylcholine receptor gene (CHRNA7)
Genomics 199852(2)173-185
100
126 Riley B Williamson M Collier D Wilkie H Makoff A A 3-Mb map of a large
Segmental duplication overlapping the alpha7-nicotinic acetylcholine receptor
gene (CHRNA7) at human 15q13-q14 Genomics 200279(2)197-209
127 Benhammou K Lee M Strook M Sullivan B Logel J Raschen K Gotti C
Leonard S [(3)H]Nicotine binding in peripheral blood cells of smokers is
correlated with the number of cigarettes smoked per day Neuropharmacology
200039(13)2818-2829
128 Kunii Y Zhang W Xu Q Hyde TM McFadden W Shin JH Deep-Soboslay A
Ye T Li C Kleinman JE Wang KH Lipska BK CHRNA7 and CHRFAM7A
mRNAs co-localized and their expression levels altered in the postmortem
dorsolateral prefrontal cortex in major psychiatric disorders Am J Psychiatry
2015172(11)1122-1130
129 Breese CR Lee MJ Adams CE Sullivan B Logel J Gillen KM Marks MJ
Collins AC Leonard S Abnormal regulation of high affinity nicotinic receptors
in subjects with schizophrenia Neuropsychopharmacology 200023(4)351-
364
130 Freedman R Hall M Adler LE Leonard S Evidence in postmortem brain tissue
for decreased numbers of hippocampal nicotinic receptors in schizophrenia Biol
Psychiatry 199538(1)22-33
131 Guan ZZ Zhang X Blennow K Nordberg A Decreased protein level of
nicotinic receptor alpha7 subunit in the frontal cortex from schizophrenic brain
Neuroreport 199910(8)1779-1782
132 Martin-Ruiz CM Haroutunian VH Long P Young AH Davis KL Perry EK
Court JA Dementia rating and nicotinic receptor expression in the prefrontal
cortex in schizophrenia Biol Psychiatry 200354(11)1222-1233
133 Marutle A Zhang X Court J Piggott M Johnson M Perry R Perry E
Nordberg A Laminar distribution of nicotinic receptor subtypes in cortical
regions in schizophrenia J Chem Neuroanat 200122(1-2)115-126
134 Leonard S Breese C Adams C Benhammou K Gault J Stevens K Lee M
Adler L Olincy A Ross R Freedman R Smoking and schizophrenia abnormal
nicotinic receptor expression Eur J Pharmacol 2000393(1-3)237-242
135 Kumari V Postma P Nicotine use in schizophrenia the self medication
hypotheses Neurosci Biobehav Rev 200529(6)1021-1034
136 de Leon J Diaz FJ A meta-analysis of worldwide studies demonstrates an
association between schizophrenia and tobacco smoking behaviors Schizophr
Res 200576(2-3)135-157
101
137 Flomen RH Collier DA Osborne S Munro J Breen G St Clair D Makoff AJ
Association study of CHRFAM7A copy number and 2 bp deletion
polymorphisms with schizophrenia and bipolar affective disorder Am J Med
Genet B Neuropsychiatr Genet 2006141B(6)571-575
138 Gault J Hopkins J Berger R Drebing C Logel J Walton C Short M Vianzon
R Olincy A Ross RG Adler LE Freedman R Leonard S Comparison of
polymorphisms in the alpha7 nicotinic receptor gene and its partial duplication
in schizophrenic and control subjects Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet
2003123B(1)39-49
139 Perl O Strous RD Dranikov A Chen R Fuchs S Low levels of alpha7-
nicotinic acetylcholine receptor mRNA on peripheral blood lymphocytes in
schizophrenia and its association with illness severity Neuropsychobiology
200653(2)88-93
140 Raux G Bonnet-Brilhault F Louchart S Houy E Gantier R Levillain D Allio
G Haouzir S Petit M Martinez M Frebourg T Thibaut F Campion D The -2
bp deletion in exon 6 of the alpha 7-like nicotinic receptor subunit gene is a risk
factor for the P50 sensory gating deficit Mol Psychiatry 20027(9)1006-1011
141 Leonard S Gault J Hopkins J Logel J Vianzon R Short M Drebing C Berger
R Venn D Sirota P Zerbe G Olincy A Ross RG Adler LE Freedman R
Association of promoter variants in the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor
subunit gene with an inhibitory deficit found in schizophrenia Arch Gen
Psychiatry 200259(12)1085-1096
142 Mathew SV Law AJ Lipska BK Davila-Garcia MI Zamora ED Mitkus SN
Vakkalanka R Straub RE Weinberger DR Kleinman JE Hyde TM Alpha7
nicotinic acetylcholine receptor mRNA expression and binding in postmortem
human brain are associated with genetic variation in neuregulin 1 Hum Mol
Genet 200716(23)2921-2932
143 Severance EG Yolken RH Novel alpha7 nicotinic receptor isoforms and
deficient cholinergic transcription in schizophrenia Genes Brain Behav
20087(1)37-45
144 Severance EG Dickerson FB Stallings CR Origoni AE Sullens A Monson
ET Yolken RH Differentiating nicotine- versus schizophrenia-associated
decreases of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor transcript CHRFAM7A
in peripheral blood lymphocytes J Neural Transm (Vienna) 2009116(2)213-
220
145 Olincy A Freedman R Nicotinic mechanisms in the treatment of psychotic
disorders a focus on the alpha7 nicotinic receptor Handb Exp Pharmacol
2012 (213)211-232
146 Kariminejad A Almadani N Khoshaeen A Olsson B Moslemi AR Tajsharghi
H Truncating CHRNG mutations associated with interfamilial variability of the
102
severity of the Escobar variant of multiple pterygium syndrome BMC
Genet201617(1)71
147 Liu Y Wang L Yang YK Liang Y Zhang TJ Liang N Yang LM Li SJ Shan
D Wu QQ Prenatal diagnosis of fetal skeletal dysplasia using targeted next-
generation sequencing an analysis of 30 cases Diagn Pathol 201914(1)76
148 Natera-de Benito D Topf A Vilchez JJ Gonzalez-Quereda L Dominguez-
Carral J Diaz-Manera J Ortez C Bestue M Gallano P Dusl M Abicht A
Muller JS Senderek J Garcia-Ribes A Muelas N Evangelista T Azuma Y
McMacken G Paipa Merchan A Rodriguez Cruz PM Camacho A Jimenez E
Miranda-Herrero MC Santana-Artiles A Garcia-Campos O Dominguez-Rubio
R Olive M Colomer J Beeson D Lochmuller H Nascimento A Molecular
characterization of congenital myasthenic syndromes in Spain Neuromuscul
Disord 201727(12)1087-1098
149 Seo J Choi IH Lee JS Yoo Y Kim NK Choi M Ko JM Shin YB Rare cases
of congenital arthrogryposis multiplex caused by novel recurrent CHRNG
mutations J Hum Genet 201560(4)213-215
150 Keskitalo-Vuokko K Pitkaniemi J Broms U Heliovaara M Aromaa A Perola
M Ripatti S Salminen O Salomaa V Loukola A Kaprio J Associations of
nicotine intake measures with CHRN genes in Finnish smokers Nicotine Tob
Res201113(8)686-690
151 Saccone NL Saccone SF Hinrichs AL Stitzel JA Duan W Pergadia ML
Agrawal A Breslau N Grucza RA Hatsukami D Johnson EO Madden PA
Swan GE Wang JC Goate AM Rice JP Bierut LJ Multiple distinct risk loci
for nicotine dependence identified by dense coverage of the complete family of
nicotinic receptor subunit (CHRN) genes Am J Med Genet B Neuropsychiatr
Genet 2009150B(4)453-466
152 Saccone NL Schwantes-An TH Wang JC Grucza RA Breslau N Hatsukami
D Johnson EO Rice JP Goate AM Bierut LJ Multiple cholinergic nicotinic
receptor genes affect nicotine dependence risk in African and European
Americans Genes Brain Behav 20109(7)741-750
153 Santoro ML Ota VK Stilhano RS Silva PN Santos CM Diana MC Gadelha
A Bressan RA Melaragno MI Han SW Abilio VC Belangero SI Effect of
antipsychotic drugs on gene expression in the prefrontal cortex and nucleus
accumbens in the spontaneously hypertensive rat (SHR) Schizophr Res
2014157(1-3)163-168
154 Kuhn J Vollmer T Martin C Hendig D Knabbe C Fast and sample cleanup-
free measurement of nicotine and cotinine by stable isotope dilution ultra-
performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry J Pharm
Biomed Anal 201267-68137-143
103
155 Scherf-Clavel M Wahl O Menke A Unterecker S Determination of
hydroxybupropion in human serum for routine therapeutic drug monitoring in
psychiatry A tool for dose-individualization in treatment with bupropion
Biomed Chromatogr 201933(10)e4609
156 Dobrinas M Choong E Noetzli M Cornuz J Ansermot N Eap CB
Quantification of nicotine cotinine trans-3-hydroxycotinine and varenicline in
human plasma by a sensitive and specific UPLC-tandem mass-spectrometry
procedure for a clinical study on smoking cessation J Chromatogr B Analyt
Technol Biomed Life Sci 2011879(30)3574-3582
157 Onoue S Yamamoto N Seto Y Yamada S Pharmacokinetic study of nicotine
and its metabolite cotinine to clarify possible association between smoking and
voiding dysfunction in rats using UPLCESI-MS Drug Metab Pharmacokinet
201126(4)416-422
158 Petrides AK Moskowitz J Johnson-Davis KL Jannetto PJ Langman LJ Clarke
W Marzinke MA The development and validation of a turbulent flow-liquid
chromatography-tandem mass spectrometric method for the simultaneous
quantification of citalopram sertraline bupropion and hydroxybupropion in
serum Clin Biochem 201447(15)73-79
Rubrica participante Rubrica pesquisador
APEcircNDICE - TCLE
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
HOSPITAL DAS CLIacuteNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SAtildeO
PAULO-HCFMUSP
Registro das explicaccedilotildees do pesquisador ao paciente ou seu representante legal sobre a pesquisa consignando
Vocecirc estaacute sendo convidado (a) a participar de um projeto de pesquisa Este projeto tem
como objetivos principais para os indiviacuteduos fumantes submetidos aos tratamentos
farmacoloacutegicos antitabagismo associar o efeito das caracteriacutesticas geneacuteticas (DNA ou RNA) e do
metabolismo (concentraccedilatildeo dos produtos de metabolismo dos medicamentos no sangue) com a
eficiecircncia do tratamento antitabagismo O objetivo do estudo eacute saber por que algumas pessoas
respondem bem aos medicamentos antitabagismo enquanto outras pessoas natildeo respondem e
consequentemente natildeo conseguem parar de fumar Para isto precisaremos de amostras de
sangue cuja quantidade eacute comumente solicitada em exames laboratoriais de rotina (2 tubos a
cada visita = 20mL) Precisaremos tambeacutem do seu consentimento para que dados de seu
prontuaacuterio meacutedico sejam consultados Para os pacientes que utilizaratildeo o medicamento
bupropiona precisaremos de amostras de sangue na primeira consulta (visita T-1) e duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento medicamentoso (visita T2) Para os pacientes que utilizaratildeo
o medicamento vareniclina precisaremos de uma amostra de sangue na primeira consulta (visita
T-1) na segunda consulta ndash ainda antes de iniciar o tratamento com medicamento (visita T0) duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento medicamentoso (visita T2) e quatro semanas apoacutes o iniacutecio
do tratamento medicamentoso (visita T4) Os desconfortos mais comuns que podem ocorrer com
sua participaccedilatildeo neste estudo satildeo os mesmos de uma coleta de sangue no braccedilo por exemplo
leve dor no local da punccedilatildeo e eventualmente hematoma local Este sangue seraacute encaminhado
ao Laboratoacuterio de Geneacutetica e Cardiologia Molecular do Instituto do Coraccedilatildeo onde seraacute
armazenado somente para a pesquisa Sua participaccedilatildeo eacute totalmente voluntaacuteria Apoacutes ler
entender e esclarecer suas duacutevidas vocecirc assinaraacute 2 vias de igual teor desse documento (termo de
consentimento Livre e Esclarecido) Ainda vocecirc poderaacute solicitar o seu desligamento deste projeto
a qualquer momento bastando para tal entrar em contato os pesquisadores no tel (11) 2661-5592
ou 2661-5995 Em qualquer etapa do estudo vocecirc teraacute acesso aos profissionais responsaacuteveis
pela pesquisa para esclarecimento de eventuais duacutevidas O pesquisador responsaacutevel eacute a Dra
Jaqueline Scholz que pode ser encontrada no endereccedilo Av Dr Eneacuteas de Carvalho Aguiar 44
Instituto do Coraccedilatildeo Bloco 2 andar 1 Programa Ambulatorial de Tratamento Tabagismo
INCOR-HCFMUSP telefone (11) 2661-5592 Se vocecirc tiver alguma consideraccedilatildeo ou duacutevida sobre
a eacutetica da pesquisa entre em contato com o Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa (CEP) ndash Rua Oviacutedio
Pires de Campos 225 ndash 5ordm andar ndash tel (11) 2661-7585 FAX (011) 2661-7585 ndash e-mail
Rubrica participante Rubrica pesquisador
cappesqadmhcfmuspbr Poderaacute tambeacutem solicitar a destruiccedilatildeo das amostras que estaratildeo
armazenadas no mesmo laboratoacuterio
As informaccedilotildees obtidas seratildeo analisadas em conjunto com outros pacientes natildeo sendo
divulgada a identificaccedilatildeo de nenhum paciente Natildeo haveraacute nenhuma despesa por parte do
participante Tambeacutem natildeo haacute compensaccedilatildeo financeira relacionada agrave sua participaccedilatildeo
Benefiacutecio direto para o participante eacute a possibilidade de parar de fumar e ser bem monitorado
durante todo o processo de 12 semanas
Estas informaccedilotildees poderatildeo auxiliar na elaboraccedilatildeo de programas eficazes para o uso
da informaccedilatildeo das caracteriacutesticas individuais em usuaacuterios de medicamentos antitabagismo
Acredito ter sido suficientemente informado a respeito das informaccedilotildees que li ou que
foram lidas para mim descrevendo o estudo ldquoAnaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de
expressatildeo gecircnica dos genoacutetipos preditores de metabolizaccedilatildeo e das concentraccedilotildees de
metaboacutelitos com a resposta ao tratamento antitabagismordquo Eu discuti com o Dra Jaqueline
Scholz com a Juliana da Rocha dos Santos eou Paulo Roberto Xavier Tomaz sobre a minha
decisatildeo em participar nesse estudo Ficaram claros para mim quais satildeo os propoacutesitos do
estudo os procedimentos a serem realizados seus desconfortos e riscos as garantias de
confidencialidade e de esclarecimentos permanentes Concordo voluntariamente em participar
deste estudo e poderei retirar o meu consentimento a qualquer momento antes ou durante o
mesmo sem penalidades ou prejuiacutezo ou perda de qualquer benefiacutecio que eu possa ter
adquirido ou no meu atendimento neste Serviccedilo
_____________________________________________________________________________________
Assinatura do pacienterepresentante legal Data
____________________________________________________________________________
Assinatura da testemunha Data
para casos de pacientes menores de 18 anos analfabetos semi-analfabetos ou portadores de deficiecircncia auditiva ou visual
(Somente para o responsaacutevel do projeto)
Declaro que obtive de forma apropriada e voluntaacuteria o Consentimento Livre e Esclarecido deste
paciente ou representante legal para a participaccedilatildeo neste estudo
____________________________________________________________________________
Assinatura do pesquisador Data
Rubrica participante Rubrica pesquisador
DADOS DE IDENTIFICACcedilAtildeO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSAacuteVEL LEGAL
1NOME
DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nordm SEXO M F
DATA NASCIMENTO
ENDERECcedilO NordmAPTO
BAIRROCIDADE
ESTADOCEPTELEFONE()
2RESPONSAacuteVEL LEGAL
NATUREZA (grau de parentesco tutor curador etc)
DOCUMENTO DE IDENTIDADE SEXO M F
DATA DE NASCIMENTOENDERECcedilO
Nordm APTO
BAIRROCIDADE ESTADOCEPTELEFONE() ___________________________________________________________________________________________________________________________
DADOS SOBRE A PESQUISA
1 TIacuteTULO DO SUBPROJETO DE PESQUISA ldquoAnaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de expressatildeo gecircnica dos genoacutetipos
preditores de metabolizaccedilatildeo e das concentraccedilotildees de metaboacutelitos com a resposta ao tratamento antitabagismordquo
PESQUISADOR RESPONSAacuteVEL Dr Jaqueline Scholz
CARGOFUNCcedilAtildeO Meacutedico Assistente Meacutedico Pesquisador ndash InCor ndash HCFMUSP CRM SP nordm 60179
UNIDADE DO HCFMUSP Programa Ambulatorial de Tratamento Tabagismo InCor-HCFMUSP
PESQUISADOR EXECUTANTE Juliana da Rocha dos Santos CRF SP nordm 62776
CARGOFUNCcedilAtildeO POacuteS-GRADUANDAndash InCor ndash HCFMUSP
UNIDADE DO HC-FMUSP Laboratoacuterio de Geneacutetica e Cardiologia Molecular InCor-HCFMUSP
3 AVALIACcedilAtildeO DO RISCO DA PESQUISA
RISCO MIacuteNIMO RISCO MEacuteDIO
RISCO BAIXO x RISCO MAIOR
4 DURACcedilAtildeO DA PESQUISA 4 anos
ANEXO 1 ndash Aprovaccedilatildeo no Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa
ANEXO 2 - Teste de Fagerstroumlm para a dependecircncia agrave nicotina (versatildeo em Portuguecircs)
Fonte Pietrobon RC Barbisan JN Manfroi WC Utilizaccedilatildeo do teste de dependecircncia agrave nicotina de
Fagerstroumlm como um instrumento de medida do grau de dependecircncia Versatildeo em Portuguecircs Rev HCPA
200727(3)31-6
ANEXO 3 - Escore de consumo situacional Issa
Fonte Issa J S Um novo escore para dependecircncia a nicotina e uma nova escala de conforto do paciente durante
o tratamento do tabagismo J Bras Pneumol 38(6) 761-5
ANEXO 4 ndash Desenho de estudo do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticos na escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismordquo
Desenho do estudo Seraacute randomizado em dois braccedilos um nuacutemero amostral total de 300 pacientes No braccedilo da esquerda 150 pacientes seratildeo tratados com base em teste geneacutetico para os
polimorfismos CYP2B6 (rs2279343) e CHRNA4 (rs1044396) No braccedilo da direita 150 pacientes faratildeo o tratamento tradicional com vareniclina (o faacutermaco de maior efetividade no tratamento
antitabagismo) Em um estudo anterior nosso grupo de pesquisadores 5152 mostrou maior sucesso terapecircutico nos pacientes portadores dos genoacutetipos AA para o gene CYP2B6 nos pacientes
tratados com bupropiona e nos portadores dos genoacutetipos CT e TT para o gene CHRNA4 nos pacientes tratados com vareniclina A escolha do tratamento no braccedilo farmacogeneacutetico prioriza o
tratamento mais barato (bupropiona) dessa forma primeiramente eacute analisado o genoacutetipo para o rs2279343 se o paciente apresentar o genoacutetipo AA o mesmo eacute tratado com bupropiona se ele tiver
o genoacutetipo AG ou GG eacute analisado o genoacutetipo para o polimorfismo rs1044396 Se o paciente apresentar o genoacutetipo CT ou TT para o rs1044396 ele eacute tratado com vareniclina se ele apresentar o
genoacutetipo CC (natildeo favoraacutevel a nenhum dos faacutermacos) ele eacute tratado com vareniclina e bupropiona em uso concomitante Seraacute comparado o custo-efetividade do tratamento baseado em
farmacogeneacutetica em relaccedilatildeo ao tratamento com vareniclina Os pacientes satildeo acompanhados por 12 semanas durante o tratamento farmacoloacutegico visita inicial (T-1) antes do iniacutecio da terapecircutica
(T0) 2 4 6 8 e 12 semanas apoacutes o tratamento (T2 T4 T6 T8 T12) Obs Os pacientes que natildeo conseguirem parar de fumar ateacute a 4 ordf semana de tratamento em monoterapia eacute adicionada a
segunda medicaccedilatildeo Fonte Eficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticos na escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismo InCor-HCFMUSP Projeto de doutorado da Dra Patriacutecia Viviane Gaya
sob a orientaccedilatildeo da Dr Jaqueline R Scholz desenvolvido a partir dos resultados dos estudos da nossa equipe de pesquisadores Rocha Santos et al 2015 67 e Tomaz et al 2015 68
ANEXO 5 ndash Pedido de depoacutesito de patente na Agecircncia de Inovaccedilatildeo e Empreendedorismo da
Universidade Federal de Alfenas-MG
JULIANA DA ROCHA DOS SANTOS
Anaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de expressatildeo gecircnica e das
concentraccedilotildees de metaboacutelitos com a resposta ao tratamento
antitabagismo
Tese apresentada agrave Faculdade de Medicina da
Universidade de Satildeo Paulo para a obtenccedilatildeo do tiacutetulo
de Doutor em Ciecircncias
Programa de Ciecircncias Meacutedicas
Aacuterea de concentraccedilatildeo Distuacuterbios Geneacuteticos de
Desenvolvimento e Metabolismo
Orientador Prof Dr Paulo Caleb Juacutenior de Lima
Santos
(Versatildeo corrigida Resoluccedilatildeo CoPGr 601811 de 13 de outubro de 2011 A versatildeo original estaacute disponiacutevel na
Biblioteca da FMUSP)
Satildeo Paulo
2020
Dedicatoacuteria
Dedico esse trabalho primeiramente a Deus meu Pai querido que me guia e sempre
me concede ao que haacute de melhor
Aos meus pais Gedeatildeo e Deolinda ao meu marido Sidnei e aos irmatildeos e sobrinhos que
sempre me incentivaram e me apoiaram em todos os momentos
Agradecimentos
Ao meu orientador Dr Paulo Caleb
Obrigada Paulo por ter apostado e confiado em mim eu natildeo tenho palavras
para agradecer diante de tudo que vocecirc me ensinou Hoje me sinto mais confiante e
parte dessa confianccedila devo a vocecirc Obrigada por me ajudar a amadurecer e por ter
sido tatildeo compreensiacutevel em momentos difiacuteceis Te considero mais que um mentor vocecirc eacute
tambeacutem um grande amigo
Ao meu amigo mestrando Paulo Roberto
Muito obrigada por tudo Fico feliz que Deus meu deu a graccedila de ter vocecirc como
amigo A sua participaccedilatildeo foi essencial neste trabalho Obrigada por me ouvir e me
ajudar acredito que ainda faremos muitas coisas juntos
Aos Doutores Alexandre Pereira Jaqueline Issa Patriacutecia Gaya Tacircnia Ogawa
Abe e Regina
Obrigada pelas dicas instruccedilotildees correccedilotildees e pelo conhecimento
proporcionado Jaque Paty Tania e Regina esse estudo natildeo teria existido sem o
excelente trabalho que vocecircs executam no ambulatoacuterio do tabagismo Vocecircs foram
fundamentais
Aos meus amigos do laboratoacuterio de Geneacutetica e cardiologia molecular Leiliane
Emanuelle Mariana Faacutebinho Faacutebio Bruna Gabriela Venturini Pamela Tamiris
Kalliandra Michelle Sabrina Liacutegia Gabriele Darezzo Theacuteo Mauriacutecio Isabela Almir
Fernanda Karina Mariliza Renata Carmona Ana Piesco Ednalva e Andreacuteia e
Maacutercio
Agradeccedilo a instruccedilatildeo e auxiacutelio na parte teacutecnica desse trabalho e muito obrigada
pela amizade companhia conselhos brincadeiras e almoccedilos juntos
Aos doutores Eduardo Costa de Figueiredo Henrique Dipe Faria e Isarita
Martins do LATF (Unifal MG)
Obrigada pela colaboraccedilatildeo neste trabalho Obrigada por esse produto maravilhoso
desenvolvido no laboratoacuterio de vocecircs (o novo RAM) Tenho a certeza que seraacute de
grande aplicabilidade Obrigada pela mensuraccedilatildeo das amostras Henrique muito
obrigada pela paciecircncia em explicar o trabalho que vocecircs realizaram Muito obrigada
pelo tempo disponibilizado e pelos dados fornecidos
Ao Prof Dr Joseacute Eduardo Krieger e ao LGCM (FMUSP)
Obrigada por disponibilizar a infraestutura do laboratoacuterio equipamentos
materiais e reagentes para execuccedilatildeo deste trabalho
Aos membros titulares e suplentes da banca examinadora
Muito obrigada pelo aceite do convite e por todas as sugestotildees e contribuiccedilotildees
Agrave FAPESP agrave CAPES e agrave CNPQ
Agradeccedilo o apoio financeiro para a execuccedilatildeo desse trabalho
A Deus
Pai muito obrigada pelo Senhor ter me dado essa oportunidade maravilhosa O
Senhor sempre me preparou o melhor e creio que continuaraacute preparando Obrigada
por me dar forccedilas em todos os momentos Te amo
Agrave minha famiacutelia
Obrigada por toda compreensatildeo Obrigada pelo apoio e por terem acreditado
na minha capacidade Vocecircs satildeo uma becircnccedilatildeo e essenciais na minha vida Amo vocecircs
Ao meu marido Sidnei
Lindo te amo muito Obrigada por ter me incentivado Obrigada pelos chaacutes
chocolates e comindinhas que vocecirc sempre ia me trazendo enquanto eu estava
escrevendo este trabalho Obrigada por ter me ajudado nas tarefas domeacutesticas tambeacutem
para que eu pudesse ter tempo para me dedicar Obrigada por todo amor carinho e
cumplicidade Vocecirc eacute um marido excelente
ldquoPorque os meus pensamentos natildeo satildeo os vossos pensamentos nem os vossos
caminhos os meus caminhos diz o Senhor Porque assim como os ceacuteus satildeo mais
altos do que a terra assim satildeo os meus caminhos mais altos do que os vossos
caminhos e os meus pensamentos mais altos do que os vossos pensamentos rdquo
Isaiacuteas 5589
Esta tese estaacute de acordo com as seguintes normas em vigor no momento desta
publicaccedilatildeo
Referecircncias adaptado de International Committee of Medical Journals Editors
(Vancouver)
Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Medicina Divisatildeo de Biblioteca e
Documentaccedilatildeo Guia de apresentaccedilatildeo de dissertaccedilotildees teses e monografias Elaborado
por Anneliese Carneiro da Cunha Maria Julia de A L Freddi Maria F Crestana
Marinalva de Souza Aragatildeo Suely Campos Cardoso Valeacuteria Vilhena 3a ed Satildeo Paulo
Divisatildeo de Biblioteca e Documentaccedilatildeo 2011 Abreviaturas dos tiacutetulos dos perioacutedicos
de acordo com List of Journals Indexed in Index Medicus
SUMAacuteRIO
LISTA DE ABREVIATURAS SIacuteMBOLOS E SIGLAS
LISTA DE EQUACcedilOtildeES
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE QUADROS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
11 Nicotina farmacodinacircmica e farmacocineacutetica 3
12 Faacutermacos antitabagismo 5
121 Vareniclina 6
1211 Farmacodinacircmica 6
1212 Farmacocineacutetica 7
122 Bupropiona 9
1221 Farmacodinacircmica 9
1222 Farmacocineacutetica 10
13 Pesquisa de biomarcadores 11
131 Estudos farmacogeneacuteticos e de expressatildeo gecircnica para vareniclina e bupropiona 12
132 Mensuraccedilatildeo de nicotina bupropiona vareniclina e seus metaboacutelitos em amostras
bioloacutegicas 15
2 JUSTIFICATIVA 17
3 OBJETIVOS 19
4 METODOLOGIA 20
41 Casuiacutestica 20
42 Fluxo de procedimentos adotados no atendimento aos pacientes 23
43 Coleta e armazenamento das amostras dos pacientes tratados com vareniclina e
bupropiona 26
44 Nuacutemero amostral 27
45 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica para amostras de pacientes tratados com vareniclina 28
451 Concentraccedilatildeo purificaccedilatildeo e extraccedilatildeo de RNA 28
452 Siacutentese de cDNA 31
453 Ensaio de controle de qualidade das amostras para o ensaio de expressatildeo gecircnica 31
454 Ensaio de expressatildeo gecircnica 35
455 Anaacutelise dos dados de expressatildeo gecircnica 37
46 Mensuraccedilatildeo de bupropiona vareniclina e de seus metaboacutelitos por HPLC-MSMS 38
461 Materiais equipamentos e condiccedilotildees adotadas para a mensuraccedilatildeo dos analitos apoacutes
validaccedilatildeo do meacutetodo 38
462 Visatildeo geral do desenvolvimento da coluna e padronizaccedilatildeo da anaacutelise 41
463 Desenvolvimento da coluna RAM para a purificaccedilatildeo da amostra 43
464 Caracterizaccedilatildeo do novo RAM 46
4641 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA 46
4642 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas no soro 46
4643 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA em diferentes pHs 47
465 Paracircmetros espectromeacutetricos 47
466 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatograacutefico multidimensional 48
467 validaccedilatildeo analiacutetica 49
47 Anaacutelise estatiacutestica 49
5 RESULTADOS 51
51 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica 51
511 Dados cliacutenicos e demograacuteficos 51
512 Dados de expressatildeo gecircnica 53
513 Anaacutelise de associaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica entre os desfechos e os tempos de
tratamento 54
52 Mensuraccedilatildeo dos analitos 58
521 Caracterizaccedilatildeo da coluna teste exclusatildeo de proteiacutenas e interferentes da matriz 58
522 Otimizaccedilatildeo dos paracircmetros espectromeacutetricos 60
523 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatrograacutefico multidimensional 61
524 Validaccedilatildeo analiacutetica 64
525 Dados cliacutenicos e demograacuteficos dos pacientes submetidos a mensuraccedilatildeo dos analitos
69
526 Anaacutelise de associaccedilatildeo dos analitos com desfecho de tratamento 72
6 DISCUSSAtildeO 75
61 Para os dados da anaacutelise de expressatildeo gecircnica 75
62 Para os dados da mensuraccedilatildeo dos analitos 80
7 CONCLUSOtildeES 87
8 SUGESTOtildeES PARA ESTUDOS FUTUROS 88
9 REFEREcircNCIAS 89
APEcircNDICE ndash TCLE
ANEXO 1 ndash Aprovaccedilatildeo no Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa
ANEXO 2 ndash Teste de Fagerstroumlm para a dependecircncia agrave nicotina (versatildeo em Portuguecircs)
ANEXO 3 - Escore de consumo situacional Issa
ANEXO 4 - Desenho de estudo do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticos na
escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismordquo
ANEXO 5 -Pedido de depoacutesito de patente na Agecircncia de Inovaccedilatildeo e Empreendedorismo
da Universidade Federal de Alfenas-MG
LISTA DE ABREVIATURAS SIacuteMBOLOS E SIGLAS
API Ionizaccedilatildeo em pressatildeo atmosfeacuterica - Atmospheric pressure ionization
ACTB Gene que codifica a proteiacutena β actina
ANKK1 Gene codificador da proteiacutena quinase envolvida em vias de transduccedilatildeo de sinal
B2M Gene que codifica a microbulina subunidade β2
BC3 Tampatildeo de reaccedilao de transcriptase reversa
BR1 Tampatildeo de ressuspensatildeo
BR2 Tampatildeo de ligaccedilatildeo
BR3 Tampatildeo de lavagem 1
BR4 Tampatildeo de lavagem 2
BR5 Tampatildeo de eluiccedilatildeo
BRT Tubos PAXgene
BSA Albumina de soro bovino
[C14] Carbono 14 (isoacutetopo radioativo do carbono de massa atocircmica 14)
cDNA DNA complementar sintetizado a partir de uma moleacutecula de RNA
CHRNA3 Gene codificador do receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α3
CHRNA4 Gene codificador da subunidade α4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNA5 Gene codificador da subunidade α5 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNA6 Gene codificador da subunidade α6 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNA7 Gene codificador da subunidade α7 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNB2 Gene codificador da subunidade β2 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNB3 Gene codificador da subunidade β3 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNB4 Gene codificador da subunidade β4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNG Gene codificador do receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade δ
CNTs Nanotubos de carbono - Carbon nanotubes
COMT Gene codificador da enzima catecol-O-metiltransferase (metaboliza dopamina)
CS ndash SPE Extraccedilatildeo em fase soacutelida no modo column switching
CT Ciclo de linha de base ndash threshold cicle (nuacutemero de ciclo em que a amostra
amplificou)
CYP2B6 Gene codificador do receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade γ
CYP2B6 Gene codificador da isoenzima CYP2B6
Disco QC Disco para a realizaccedilatildeo do controle de qualidade de amostras que seratildeo utilizadas
para o ensaio de expressatildeo gecircnica
DN Dependecircncia agrave nicotina
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
DNAse Enzima que degrada moleacuteculas de DNA
dNTP Dinucleotiacutedeos dATP dCTP dGTP e dTTP
DRD1 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 1
DRD2 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 2
DRD3 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 3
DRD4 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 4
E Erro relativo
EDTA Aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico
Escore Issa Escore de consumo situacional Issa
ESI+ Ionizaccedilatildeo positiva por electrospray - positive Electrospray ionization
FDA Orgatildeo de controle de alimentos e medicamentos americano ndash Food and drug
administration
FTND Teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fargestroumlm test for nicotine
dependence
g Velocidade de rotaccedilatildeo em forccedila g a qual considera a aceleraccedilatildeo da gravidade
GDC Controle de contaminaccedilatildeo de DNA genocircmico do disco QC
GE Tampatildeo de degradaccedilatildeo de DNA genocircmico
HGDC Controle de contaminaccedilatildeo de DNA genocircmico do ensaio de expressatildeo gecircnica
HPLC Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia ndash High Performance Liquid
Cromatograph
HPLC-MSMS Cromatografica liacutequida de alta eficiecircncia seguida por espectrometria de massas
em tandem ndash High Performance Liquid Cromatograph fowed by tandem Mass
Spectrometric
HPRT1 Gene que codifica a enzima hipoxantina fosforribosiltransferase 1
HTR3A Gene codificador da subunidade 3A do receptor de serotonina
HTR3B Gene codificador da subunidade 3B do receptor de serotonina
KV Energia de colisatildeo em quilovolt
LC-MS Cromatografia liacutequida seguida de espectrometria de massas - Liquid
Cromatograph fowed by Mass Spectrometric
LD Limite de detecccedilatildeo
LLE Extraccedilatildeo liacutequido-liacutequido (com o uso de solvente)
LQ Limite de quantificaccedilatildeo
LogP Coeficiente de particcedilatildeo relaccedilatildeo das concentraccedilotildees da substacircncia em um solvente
orgacircnico e em aacutegua dado que ambos os solventes satildeo necessariamente imisciacuteveis
MCT Microtubos de 15 mL
MS Espectrometria de massas - Mass Spectrometric
MRM Muacuteltiplas transiccedilotildees de monitoramento de reaccedilatildeo - multiple reaction monitoring
MSMS Espectrometria de massas em tandem
mz Relaccedilatildeo massacarga dos analitos
nAChR(s) Receptor(es) acetilcoliacutenico (s) nicotiacutenico (s)
NMR Taxa de metabolizaccedilatildeo da nicotina ndash Nicotine metabolite ratio
NTC Controle negativo
NTR Controle de natildeo transcriccedilatildeo reversa
OCT2 Transportador catiocircnico orgacircnico
P2 Controle externo de RNA
PAF Programa de Assistecircncia ao Fumante
PBMC Ceacutelulas mononucleares de sangue perifeacuterico - Peripheral blood mononuclear cell
PCR Amplificaccedilatildeo em cadeia da polimerase
PIs Padrotildees internos
PK Enzima proteinase K
pKa Valor negativo do logaritmo da constante de dissociaccedilatildeo de um aacutecido
pKb Valor negativo do logaritmo da constante de dissociaccedilatildeo de uma base
PP Extraccedilatildeo por preciptaccedilatildeo de proteiacutenas
PPC Controle positivo de PCR
PRC Coluna de rotaccedilatildeo de RNA vermelho
PSC Coluna de rotaccedilatildeo do homogeneizador lilaacutes
PT Tubo de processamento
RAM Material de acesso restrito ndash restrict access material
Rcf Forccedila centriacutefuga relativa ndash Relative centrifugal force
RDD Tampatildeo de digestatildeo de DNA
RE3 Mix de transcriptase reversa
RNA Aacutecido ribonucleico
RNase Enzima ribonuclease a qual degrada as moleacuteculas de RNA
RNFD Soluccedilatildeo matildee de DNase
RNFW Aacutegua livre de RNase
RFLP Restriccedilatildeo enzimaacutetica - Restriction fragment length polymorphism
RP‐HPLC Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia em fase reversa ndash Reverse-Phase High
Performance Liquid Cromatograph
Rpm Rotaccedilatildeo por minuto
RSD Desvio padratildeo relativo
SLC6A3 Gene codificador da proteiacutena transportadora de dopamina
SLC22A2 Gene codificador da proteiacutena OCT2 transportadora de caacutetions orgacircnicos
(transporta vareniclina)
SNC Sistema nervoso central
SPE Extraccedilatildeo em fase soacutelida
Sty I Enzima de restriccedilatildeo proveniente da Salmonella Typhi
TAE Tampatildeo formado com Tris Acetato e EDTA
TRN Terapia de reposiccedilatildeo nicotiacutenica
UGT2B7 Gene codificador da enzima UGT2B7 a qual metaboliza a vareniclina
UPLC Cromatografica liacutequida de ultra eficiecircncia - Ultra Performance Liquid
Cromatograph
UV Detector ultravioleta
α3 Subunidade alfa 3 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α4 Subunidade alfa 4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α5 Subunidade alfa 5 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α6 Subunidade alfa 6 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α7 Subunidade alfa 7 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
β2 Subunidade beta 2 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
β4 Subunidade beta 4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
T-1 Visita inicial
T0 Visita de iniacutecio do tratamento (coleta realizada antes de comeccedilar o tratamento no
mesmo dia)
T2 Visita de 2 semanas apoacutes tratamento farmacoloacutegico
T4 Visita de 4 semanas apoacutes tratamento farmacoloacutegico
T12 Visita de 12 semanas apoacutes tratamento farmacoloacutegico
TFC Cromatografia liacutequida turbulenta - Turbulent flow-liquid chromatography
LISTA DE EQUACcedilOtildeES
∆CT= (CTamostra ndash a meacutedia de CThousekeeping genes) Normalizaccedilatildeo da expressatildeo
gecircnica dos genes alvo atraveacutes de valores de expressatildeo de genes fisioloacutegicos
2-∆CT Transformaccedilatildeo dos valores de ∆CT em escala logariacutetmica para a realizaccedilatildeo
dos testes de hipoacutetese
∆∆CT= (mediana de ∆CTgrupo teste ndash mediana de ∆CT grupo referecircncia) Foacutermula
utilizada para posterior caacutelculo de fold change Considera-se os dois grupos
envolvidos no teste de hipoacutetese
2-∆∆CT Transformaccedilatildeo dos dados de ∆∆CT em escala logariacutetmica Atraveacutes dessa
foacutermula se obteacutem o fold change (diferenccedila de expressatildeo entre dois grupos)
NMR=(trans-3-hidroxicotininacotinina) Taxa de metabolizaccedilatildeo da nicotina
NMRlt031=metabolizador lento NMRgt031 metabolizador normal ou raacutepido
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Analitos precursores fragmentos e energias de colisatildeo
otimizados
40
Tabela 2 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina selecionados para os ensaios de expressatildeo gecircnica
52
Tabela 3 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina submetidos aos ensaios de expressatildeo gecircnica de acordo
com o desfecho de tratamento
52
Tabela 4 - Valores de mediana de ∆CT dos genes de acordo com os
tempos de tratamento e grupos de desfecho
53
Tabela 5 - Fold change e anaacutelise de associaccedilatildeo entre os tempos de
tratamento e grupos de desfecho
54
Tabela 6 - Paracircmetros de validaccedilatildeo obtidos na determinaccedilatildeo de faacutermacos
antitabagismo em soro humano
68
Tabela 7 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos
69
Tabela 8 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de
acordo com o desfecho de tratamento
70
Tabela 9 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos
71
Tabela 10 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes
tratados com bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos
analitos de acordo com o desfecho de tratamento
71
Tabela 11 ndash Frequecircncia do desfecho de tratamento nos pacientes
submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com os
medicamentos antitabagismo
72
Tabela 12 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos
pacientes tratados com vareniclina
73
Tabela 13 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de
tratamento com vareniclina
73
Tabela 14 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos
pacientes tratados com bupropiona
74
Tabela 15 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de
tratamento com bupropiona
74
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Aacutereas estimuladas atraveacutes de vias dopamineacutergicas e
serotonineacutergicas e sistema de recompensa
2
Figura 2 - Receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico 4
Figura 3 - Via primaacuteria do metabolismo da nicotina 5
Figura 4 - Mecanismo de accedilatildeo da vareniclina 7
Figura 5 - Metabolismo da vareniclina em humanos 8
Figura 6 - Mecanismo de accedilatildeo da bupropiona 9
Figura 7 - Metabolismo da bupropiona em seus principais metaboacutelitos ativo 11
Figura 8 - Desenho do estudo 22
Figura 9 - Representaccedilatildeo do Rotor-Disc100 33
Figura 10 - Mapa do disco QC (representaccedilatildeo planilhada) 33
Figura 11 - Exemplo de ajuste de Threshold 34
Figura 12 - Mapa do disco do ensaio RT2 profiler PCR array (representaccedilatildeo
planilhada)
37
Figura 13 - Representaccedilatildeo da composiccedilatildeo da coluna extratora (Novo RAM) 45
Figura 14 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNA7 entre os tempos de
tratamento e desfecho
56
Figura 15 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNG entre os tempos de
tratamento e desfecho
57
Figura 16 - Heat map de expressatildeo gecircnica 58
Figura 17 ndash Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com soluccedilatildeo de
BSA
59
Figura 18 - Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com amostra de
soro diluiacuteda
59
Figura 19 - Influecircncia do pH na exclusatildeo de proteiacutenas 60
Figura 20 - Ilustraccedilatildeo do sistema de columm switching na configuraccedilatildeo de
backflush
62
Figura 21 - Cromatograma obtido de amostras de soro branco diluiacutedas em
aacutegua ultra pura
65
Figura 22 - Cromatograma obtido apoacutes anaacutelise de soro diluiacutedo e dopado com
os analitos no niacutevel meacutedio de calibraccedilatildeo e mais os padrotildees internos deuterados
65
Figura 23 - Cromatograma obtido atraveacutes da anaacutelise das amostras de soro dos
pacientes tratados com bupropiona
67
Figura 24 - Cromatograma obtido atraveacutes da analise de amostras de soro de
pacientes tratados com vareniclina
67
LISTA DE QUADROS
Quadro 1- Procedimentos do protocolo em relaccedilatildeo aos pacientes 25
Quadro 2 - Paracircmetros de qualidade do ensaio QC 34
Quadro 3 - Genes escolhidos para o ensaio de expressatildeo 36
Quadro 4 - Housekeeping genes 36
Quadro 5 - Propriedades fiacutesico-quiacutemicas dos analitos 42
Quadro 6 ndash Comparaccedilatildeo dos dados de validaccedilatildeo com outros estudos 85
RESUMO
Santos JR Anaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de expressatildeo gecircnica e das concentraccedilotildees
de metaboacutelitos com a resposta ao tratamento antitabagismo [tese] Satildeo Paulo
Faculdade de Medicina Universidade de Satildeo Paulo 2020
Introduccedilatildeo O tabagismo eacute considerado a maior causa de morbidade e mortalidade
evitaacutevel no mundo Estudos tecircm buscado a identificaccedilatildeo de preditores de resposta aos
tratamentos de cessaccedilatildeo tabaacutegica Os principais objetivos deste estudo foram analisar a
possiacutevel associaccedilatildeo da expressatildeo de genes alvo e das concentraccedilotildees de analitos
(faacutermacos antitabagismo nicotina e seus metaboacutelitos) com a resposta ao tratamento
Meacutetodos Foram incluiacutedos 105 pacientes fumantes que iniciariam o tratamento com
vareniclina (n=74) ou bupropiona (n=31) As anaacutelises de expressatildeo gecircnica foram
realizadas atraveacutes do ensaio customizado RTsup2 Profiler PCR Array com a inclusatildeo de 17
genes para a anaacutelise em ceacutelulas mononucleares de sangue perifeacuterico (PBMC) A
preparaccedilatildeo das amostras de soro para a mensuraccedilatildeo dos analitos foi realizada atraveacutes de
uma coluna extratora composta por nanotubos hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados
com a adiccedilatildeo de grupos hidrofiacutelicos (material de acesso restrito - RAM) desenvolvida
no LATF Unifal MG A mensuraccedilatildeo dos analitos foi realizada por cromatografia
liacutequida de alta eficiecircncia em modo column switching seguida de espectrometria de
massa em tandem (HPLC-MSMS) Os tempos para a coleta de amostras foram para as
anaacutelises de expressatildeo gecircnica (sangue total) antes de iniciar o tratamento (T0) duas e
quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento (T2 e T4 respectivamente) e para a
mensuraccedilatildeo dos analitos (soro) as amostras foram coletadas na T2 Resultados Para as
anaacutelises de expressatildeo gecircnica selecionamos 14 pacientes que obtiveram sucesso e 13
pacientes resistentes ao tratamento com vareniclina Foi considerado sucesso quando o
paciente alcanccedilava abstinecircncia ao tabaco ateacute a 4 ordf semana de tratamento e resistente
quando o paciente natildeo conseguia parar de fumar ateacute a 4ordf semana de tratamento Foi
observada diferenccedila significativa para a expressatildeo do gene CHRNA7 no grupo
resistente amostras dos tempos T2 e T4 apresentaram menor expressatildeo comparadas ao
tempo T0 (fold change 038 P=0007 fold change 067 P=0004 respectivamente)
Para a mensuraccedilatildeo dos analitos a coluna RAM desenvolvida mostrou alta capacidade
para a remoccedilatildeo de macromoleacuteculas e de anaacutelise conjunta dos diferentes analitos aleacutem
de poder ser reutilizada diversas vezes (cerca de 400 ciclos) Os pacientes do grupo
resistente tratados com ambos os faacutermacos apresentaram maior concentraccedilatildeo de
metaboacutelitos da nicotina na T2 No entanto natildeo houve associaccedilatildeo dos faacutermacos e seus
metaboacutelitos com desfecho de tratamento Conclusotildees Para as anaacutelises de expressatildeo
gecircnica este estudo exploratoacuterio mostrou um possiacutevel preditor de efetividade no
tratamento com vareniclina reafirmando a associaccedilatildeo da subunidade α7 para os
processos de dependecircncia agrave nicotina e tratamento antitabagismo Estes resultados
podem contribuir ao menos em parte para o desenvolvimento de uma terapia
individualizada Contudo estudos futuros satildeo necessaacuterios para o entendimento do papel
da subunidade α7 dos receptores acetilcoliacutenicos-nicotiacutenicos no tratamento com
vareniclina Para a mensuraccedilatildeo dos analitos o novo RAM sintetizado eacute um produto de
extremo valor cientiacutefico podendo apresentar diversas aplicaccedilotildees em anaacutelise de amostras
com matrizes complexas sem muita preparaccedilatildeo preacutevia Para a associaccedilatildeo das
concentraccedilotildees dos faacutermacos e seus metaboacutelitos com o desfecho de tratamento satildeo
necessaacuterios estudos com um maior nuacutemero amostral
Descritores Vareniclina Bupropiona Nicotina Abandono do haacutebito de fumar
Expressatildeo gecircnica Biomarcadores farmacoloacutegicos
ABSTRACT
Santos JR Association analysis of gene expression profiles and metabolite
concentrations with response for smoking cessation treatment [thesis] Satildeo Paulo
ldquoFaculdade de Medicina Universidade de Satildeo Paulordquo 2020
Introduction Smoking is considered the largest cause of preventable morbidity and
mortality in the worldwide Studies have sought to identify predictors of responses to
smoking cessation treatments The main objectives of this study were to analyze the
possible association of the expression of target genes and concentrations of analytes
(drugs for smoking cessation nicotine and their metabolites) with the response to
treatment Methods We included 105 smoker patients who would start treatment with
varenicline (n=74) or bupropion (n=31) Gene expression analysis was performed
through custom RTsup2 Profiler PCR array assay including 17 genes for analysis in
peripheral blood mononuclear cells (PBMC) Serum sample preparation for the
measurement of analytes was performed by an extraction column composed of hybrid
carbon and silica nanotubes modified with the addition of hydrophilic groups (restricted
access material - RAM) developed by LATF Unifal MG The measurement of analytes
was performed by high efficient liquid chromatography in column switching mode
followed by tandem mass spectrometry (HPLC-MSMS) Times for sample collection
were for gene expression analysis (total blood) before start of therapy (T0) two and
four weeks after start of treatment (T2 and T4 respectively) and for measurement of
analytes (serum) the samples were collected at T2 Results For gene expression
analysis we selected 14 patients who had success and 13 patients resistant to the
varenicline treatment Success was considered to be when a patient achieved tobacco
abstinence until the 4th week of treatment and resistant was when a patient had not
stopped smoking as of the 4th week of treatment We observed a significant difference
for CHRNA7 gene expression in the resistant group samples from T2 and T4 had lower
expression compared with T0 (fold change 038 P=0007 fold change 067 P=0004
respectively) For measurement of analytes the developed RAM column showed high
capacity to remove macromolecules and joint analyzes of different analytes besides
being able to be reuse manny times (about 400 cycles) Patients from resistant group of
the both drugs treatment had a higher concentration of nicotine metabolites in T2
However there was no association of drugs for smoking cessation and their metabolites
with outcome treatment Conclusions For gene expression analysis this exploratory
study showed a possible predictor of effectiveness in the treatment with varenicline
reaffirming the association of the α7 subunit for nicotine dependence and smoking
therapy processes These results may contribute at least in part to the development of
individualized therapy However further studies are needed to understand the role of the
α7 subunit of acetylcholinic-nicotinic receptors in varenicline treatment For the
measurement of analytes the new synthesized RAM is a product of extreme scientific
value being able of several applications in the analysis of samples with complex
matrices without much prior preparation For an association of drugs for smoking
cessation and their metabolites with outcome treatment studies with a larger sample
size are needed
Descriptors Varenicline Bupropion Nicotine Smoking cessation Gene expression
Biomarkers pharmacological
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
O tabagismo eacute considerado a maior causa de morbidade e mortalidade evitaacutevel
em todo o mundo 1 Doenccedilas cardiacuteacas cerebrovasculares cerca de um quinto de todos
os tipos de cacircnceres doenccedilas pulmonares como apneia e enfisema aleacutem de distuacuterbios
preacute-natais estatildeo associadas ao consumo do tabaco 2-5
Dados recentes da Vigitel mostraram que no conjunto das 27 capitais brasileiras
a frequecircncia de adultos fumantes foi de 93 com valores duas vezes maior no sexo
masculino (121) do que no feminino (69) As menores frequecircncias foram
encontradas na populaccedilatildeo de jovens adultos (antes dos 25 anos) e em pessoas de mais
de 65 anos As maiores frequecircncias foram encontradas entre homens em Porto Alegre
(173) Campo Grande e Satildeo Paulo (156) 6
A nicotina eacute o principal componente do tabaco causador de dependecircncia Esta
age nos receptores acetilcoliacutenicos-nicotiacutenicos (nAChRs) promovendo a liberaccedilatildeo de
diversos neurotransmissores e neuroreguladores tais como dopamina acetilcolina
epinefrina norepinefrina serotonina beta-endorfina vasopressina e GABA O principal
neurotransmissor estudado eacute a dopamina pois a nicotina promove aumento de seus
niacuteveis na regiatildeo mesocorticoliacutembica cerebral principalmente em um circuito conhecido
como ldquosistema de recompensardquo (aacuterea tegmental ventral nuacutecleo accumbens e coacutertex preacute-
frontal) gerando sensaccedilotildees de prazer e bem-estar 7-15
O processo de adiccedilatildeo agrave nicotina eacute complexo e nem todos os mecanismos estatildeo
elucidados Aleacutem da ativaccedilatildeo do sistema de recompensa haacute a formaccedilatildeo de memoacuterias
associativas do efeito hedocircnico com os ambientes e situaccedilotildees de disponibilidade e uso
do tabaco resultando em reforccedilo positivo apoacutes o fumante entrar em contato com fatores
relacionados ao seu consumo Este tipo de memoacuteria aprendida envolve a amigdala o
hipocampo o coacutertex preacute-frontal e o coacutertex parietal 15-17 Evidecircncias tambeacutem satildeo
2
consistentes com a hipoacutetese da ativaccedilatildeo do estriado dorsal o qual estaacute envolvido no
processamento de memoacuterias de formaccedilatildeo de haacutebito em processos motores o que
poderia automatizar o ato de fumar 15 18 (Figura 1)
O uso continuado do tabaco promove a desensibilizaccedilatildeo e adaptaccedilatildeo dos
nAChRs causando toleracircncia e diminuiccedilatildeo dos efeitos de recompensa naturais Como
resultado o indiviacuteduo experimenta fissura ansiedade humor deprimido e irritabilidade
na ausecircncia da nicotina Estes sintomas acabam promovendo um reforccedilo negativo para o
fumo e o nuacutemero de cigarros consumidos aumenta cada vez mais 14 15
Todos os fatores acima mencionados contribuem para o mecanismo de
dependecircncia agrave nicotina (DN) Os efeitos hedocircnicos estatildeo relacionados com o processo
de iniciaccedilatildeo do tabagismo enquanto os efeitos negativos da falta da nicotina estatildeo mais
associados agrave manutenccedilatildeo do fumo 15
Para os indiviacuteduos que desejam parar de fumar o tratamento farmacoloacutegico
antitabagismo eacute o que apresenta maior eficaacutecia na reduccedilatildeo da prevalecircncia de fumantes
19
Figura 1 - Aacutereas estimuladas atraveacutes de vias dopamineacutergicas e serotonineacutergicas e sistema de recompensa A
Principais vias ativadas na dependecircncia como a aacuterea tegmental ventral nuacutecleos accumbens e da rafe coacutertex-frontal
estriado susbstacircncia negra e hipocampo As setas em rosa indicam aacutereas estimuladas pelas vias serotonineacutergicas de
transmissatildeo e em azul pelas vias dopamineacutergicas gerando diversos comportamentos B Sistema de recompensa
(composto pela VTA nuacutecleo accumbeacutens e coacutertex preacute-frontal) A nicotina age nos nAChRs no SNC gerando uma
3
descarga de dopamina no sistema de recompensa Haacute uma adaptaccedilatildeo desses receptores com o fumo continuado
fazendo com que haja a necessidade de maior consumo de nicotina e o desenvolvimento da dependecircncia VTA= aacuterea
tegmental ventral SNC sistema nervoso central nAChR= receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico Fonte adaptado de
Habermann A Brain awareness week addiction and the brainrsquos reward system Sovereign Health Group 2016 e de
Koob amp Volkow 2009 14
11 Nicotina farmacodinacircmica e farmacocineacutetica
O fumo permite uma titulaccedilatildeo precisa da dose de nicotina por parte do fumante
Sua absorccedilatildeo eacute raacutepida chegando em cerca de 10 segundos em todo o sistema nervoso
central (SNC) onde se liga nos nAChRs 20 21 22
Os nAChRs satildeo receptores de canais iocircnicos compostos por cinco subunidades
que podem estar combinadas de diferentes formas (Figura 2) 20 Os subtipos desses
receptores mais abundantes no ceacuterebro humano satildeo os α4β2 α3β4 e α7 (homomeacuterico)
Os receptores compostos pelas subunidades α4β2 (o asterisco indica que outras
subunidades podem estar presentes) possuem um papel fundamental na DN O nocaute
da subunidade β2 em ratos resultou na eliminaccedilatildeo dos efeitos comportamentais da
nicotina 23 Quanto agrave subunidade α4 parece estar envolvida na sensibilidade agrave nicotina
o que pode impactar nos efeitos de recompensa dessensibilizaccedilatildeo e toleracircncia24 25 Os
receptores compostos pelas subunidades α3β4 acredita-se mediar os efeitos
cardiovasculares 26 Os nAChRs α7 homomeacuterico estatildeo envolvidos na velocidade de
sinapses em processos de aprendizagem e controle sensorial 27 28 Os receptores
compostos pelas subunidades α4β2lowast podem conter outras subunidades como por
exemplo α5 α6 eou β3 as quais podem modificar a sensibilidade e funccedilatildeo do receptor
21 29
Como um agonista desses receptores a nicotina promove a sua abertura
permitindo a entrada de soacutedio e caacutelcio despolarizando assim a membrana dos
neurocircnios Aleacutem da entrada de caacutelcio atraveacutes dos nAChRs haacute tambeacutem a abertura de
4
canais de caacutelcio voltagem dependentes fazendo com que as vesiacuteculas que armazenam
os neurotransmissores sejam liberadas 20 21 O resultado da ativaccedilatildeo dos nAChRs em
neurocircnios poacutes-sinaacutepticos eacute a liberaccedilatildeo de diversos neurotransmissores ativando vaacuterias
aacutereas como jaacute mencionado
Figura 2 - Receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico O receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico funciona como um
canal iocircnico transmembracircnico Sua composiccedilatildeo eacute pentacircmera ou seja eacute formada por 5 subunidades que
podem se combinar de diferentes formas As subunidades satildeo classificadas de acordo com diferenccedilas nos
domiacutenios da sua estrutura proteiacuteca A acetilcolina e a nicotina satildeo agonistas desses receptores fazendo
com que os mesmos sejam abertos Assim ocorre a entrada de soacutedio despolarizando a membrana
gerando o potencial de accedilatildeo ACh= acetilcolina Nicot= Nicotina Na+= soacutedio K+= potaacutessio α =
subunidade alfa β= subunidade beta δ= subunidade delta γ= subunidade gama Fonte adaptado de Rang
amp Dale Farmacologia 5 ed Elsevier 2012
Haacute oscilaccedilatildeo dos picos de nicotina entre um cigarro e outro mas as quantidades
se acumulam entre 6 e 9 horas em um fumo regular saturando os nAChR causando
desensibilizaccedilatildeo adaptaccedilatildeo toleracircncia sintomas de abstinecircncia na falta do fumo e DN
30
A nicotina eacute rapidamente e extensivamente metabolizada pelo fiacutegado atraveacutes da
isoenzima CYP2A6 (e em menor grau pelas isoenzimas CYP2B6 e CYP2E1) agrave nicotina
-iacuteon iacuteminio e apoacutes pela enzima aldeiacutedo oxidase agrave cotinina O tempo de meia vida da
nicotina eacute de aproximadamente 2 horas e da cotinina 16 horas Posteriormente a
5
cotinina eacute metabolizada em trans-3-hidroxicotinina quase que exclusivamente pela
CYP2A6 (outros isocircmeros da hidroxicotina representam menos de 2 da dose) 31 32
(Figura 3) Esta eacute a maior via de metabolizaccedilatildeo da nicotina (70 - 80 do metabolismo
da nicotina em todo o corpo) 33 no entanto haacute vias menores como por exemplo a
glucoronidaccedilatildeo que pode ser a maior determinante no clearence da nicotina em
indiviacuteduos com menor atividade da CYP2A6 31
Figura 3 - Via primaacuteria do metabolismo da nicotina A nicotina eacute
metabolizada marjoritaramente pela isoenzima CYP2A6 em nicotina-
iacuteon imiacutenio e atraveacutes da enzima aldeiacutedo oxidase eacute convertida em
cotinina A cotinina eacute posteriomente metabolizada em trans-3-
hidroxicotinina novamente pela isoenzima CYP2A6 Fonte adaptado
de Llaquet et al 2010 34
12 Faacutermacos antitabagismo
Os medicamentos de primeira escolha aprovados pela Agecircncia Nacional de
Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) incluem tratamentos com base na terapia de reposiccedilatildeo
nicotiacutenica (TRN) como adesivo goma e pastilha e tambeacutem satildeo utilizados vareniclina e
bupropiona Estes uacuteltimos possuem maior eficaacutecia terapecircutica na cessaccedilatildeo tabaacutegica 35 36
6
121 Vareniclina
1211 Farmacodinacircmica
A vareniclina eacute o faacutermaco mais recentemente utilizado para a interrupccedilatildeo do
tabagismo este foi desenvolvido especificamente para atuar nos nAChRs A sua
farmacodinacircmica estaacute mais associada agrave atuaccedilatildeo como um agonista parcial nos nAChRs
compostos pelas subunidades α4β2 37 os quais satildeo importantes alvos de accedilatildeo da
nicotina pois satildeo necessaacuterios e suficientes para a recompensa toleracircncia e
sensibilizaccedilatildeo 25 38 39 (Figura 4)
Estudos mostraram que em relaccedilatildeo agrave nicotina a vareniclina possui 15 vezes
maior afinidade pelas subunidades α4β2 e ativa em torno de 50 a liberaccedilatildeo de
dopamina no sistema mesocorticoliacutembico 37 O faacutermaco atua tambeacutem em outros
nAChR como nos nAChRs (α3β4) age fracamente nos receptores contendo a
subunidade α6 e em nAChRs (α3β2) aleacutem de exercer atividade agonista total nos
receptores α7 40
Quanto agraves reaccedilotildees adversas no uso do faacutermaco a naacuteusea eacute a mais comum (cerca
de 10 a 45 dos indiviacuteduos tratados) a qual muitas vezes leva agrave natildeo aderecircncia ao
tratatamento 41-43
7
Figura 4 - Mecanismo de accedilatildeo da vareniclina A Na ausecircncia da vareniclina a nicotina se liga aos
nAChRs aumentando a ativaccedilatildeo nesses receptores Aleacutem disso haacute o estiacutemulo endoacutegeno (promovido
pela acetilcolina) B A vareniclina eacute um agonista parcial de nAChR (α4β2) ou seja tambeacutem estimula
os nAChRs mas em menor niacutevel do que a nicotina e ao mesmo tempo eacute antagonista na presenccedila de
nicotina fazendo com que ela natildeo consiga se ligar ao receptor Fonte do autor baseado nas
informaccedilotildees de Kassem et al 2012 37
1212 Farmacocineacutetica
A vareniclina eacute rapidamente absorvida pelo trato intestinal com absorccedilatildeo gt90
logo apoacutes a administraccedilatildeo oral As concentraccedilotildees plasmaacuteticas maacuteximas satildeo alcanccediladas
no periacuteodo entre 3 e 4 horas 44 e o estado de equiliacutebrio da sua concentraccedilatildeo ocorre
dentro de 4 dias 37 44-46 O faacutermaco possui baixa ligaccedilatildeo com proteiacutenas plasmaacuteticas
sendo que de acordo com ensaios in vitro a fraccedilatildeo de vareniclina (100 ngmL) livre foi
de 797 47 A sua biodisponibilidade natildeo eacute afetada pelo tempo de administraccedilatildeo ou
ingestatildeo de alimentos 37 45 46 Aleacutem disso a vareniclina possui ampla distribuiccedilatildeo nos
tecidos sendo que o volume meacutedio de distribuiccedilatildeo aparente eacute de 415 litros
apresentando um coeficiente de variaccedilatildeo (CV) de 50 48
Na circulaccedilatildeo humana a vareniclina se encontra em quantidade marjoritaacuteria satildeo
tambeacutem encontrados os metaboacutelitos conjugados vareniclina N-carbomoil glucoroniacutedeo
8
N-formilvareniclina e oxovareniclina O tempo de meia vida da vareniclina eacute em torno
de 24 horas independente da dose administrada
A eliminaccedilatildeo do faacutermaco e metaboacutelitos se daacute principalmente pela urina (99) 49
A eliminaccedilatildeo renal exibe cineacutetica linear e a sua excreccedilatildeo ocorre pela filtraccedilatildeo
glomerular na qual estaacute associada agrave secreccedilatildeo tubular realizada pelo transportador
catiocircnico orgacircnico OCT2 O clearence estimado da vareniclina eacute de 88 a 155 mLmin
apoacutes administraccedilatildeo de dose uacutenica e 92 a 143 mLmin apoacutes doses repetidas A
depuraccedilatildeo de vareniclina eacute reduzida na presenccedila de doenccedila renal Na urina cerca de
90 do produto eliminado eacute encontrado como vareniclina em sua forma inalterada e
menos de 10 eacute encontrado na forma de 2 metaboacutelitos a hidroxivareniclina e a
vareniclina-N-carbomoil glucoroniacutedeo 37 49-51
Nenhum dos metaboacutelitos da vareniclina eacute acreditado ser farmacologicamente
ativo Aleacutem disso esses metaboacutelitos estatildeo presentes em concentraccedilotildees muito baixas 37
46-49 A Figura 5 mostra os metaboacutelitos provenientes da vareniclina
A formaccedilatildeo dos metaboacutelitos da vareniclina natildeo eacute catalisada pelo complexo
enzimaacutetico CYP450 Ensaios realizados com microssoma hepaacutetico humano mostraram
que a formaccedilatildeo do conjugado vareniclina N-carbomilglucoroniacutedeo eacute provavelmente
catalisado pela enzima UGT2B7 37 49
Figura 5 ndash Metabolismo da vareniclina em humanos Fonte adaptado de Obach et al 2006 49
9
122 Bupropiona
1221 Farmacodinacircmica
A bupropiona eacute um antidepressivo no entanto tem sido utilizado como faacutermaco
antitabagismo devido o seu potencial em diminuir o desejo de fumar (o qual foi
percebido durante o tramento de iacutendiviacuteduos fumantes) Como mecanismo de accedilatildeo a
bupropiona atua como um inibidor relativamente se
letivo da recaptaccedilatildeo de norepinefrina e dopamina com pequeno efeito na
recaptaccedilatildeo de serotonina (Figura 6) aleacutem de ser um antagonista de nAChR natildeo
competitivo Essas propriedades minimizam os sintomas de retirada da nicotina
aumentando a probabilidade do indiviacuteduo se abster do fumo 52
Insocircnia e boca seca satildeo as reaccedilotildees adversas mais comumente relatadas ao uso da
bupropiona (30-40 e 10 dos pacientes respectivamente) 53
Figura 6 - Mecanismo de accedilatildeo da bupropiona A Na ausecircncia da bupropiona neurotransmissores
como a noradrenalina serotonina e a dopamina satildeo recaptados endogenamente pela bomba de
recaptaccedilatildeo B Na presenccedila da bupropiona a qual eacute inibidora da bomba de recaptaccedilatildeo desses
neurotransmissores haacute a estimulaccedilatildeo do sistema de recompensa mais especificamente atraveacutes do
aumento da concentraccedilatildeo de dopamina Dessa forma o sistema continua sendo estimulado mas em
menor grau que a nicotina e as chances de abstinecircncia ao tabaco satildeo aumentadas Fonte do autor
baseado nas informaccedilotildees de Slemmer et al 2000 52
10
1222 Farmacocineacutetica
Conforme ensaios em voluntaacuterios sadios os picos maacuteximos de concentraccedilatildeo
plasmaacutetica de bupropiona satildeo alcanccedilados aproximadamente 3 horas apoacutes a sua
administraccedilatildeo oral O volume de distribuiccedilatildeo aparente eacute de aproximadamente 2000L e
a ligaccedilatildeo com proteiacutenas plasmaacuteticas eacute de 84 para a bupropiona e de 77 para a
hidroxibupropiona (o seu principal metaboacutelito ativo) 54
A bupropiona eacute metabolizada primariamente em uma seacuterie de metaboacutelitos ativos
como a hidroxibupropiona a threohidrobupropiona e a eritrohidrobupropiona (Figura
7) A CYP2B6 eacute a principal enzima que converte a bupropiona em hidroxibupropiona
em humanos No entanto a formaccedilatildeo de threohidrobupropiona e a
eritrohidrobupropiona que ocorre atraveacutes de reaccedilatildeo redutiva natildeo eacute mediada pela
CYP2B6 55 56 A eritroidrobupropiona natildeo pode ser mensurada no plasma apoacutes a
administraccedilatildeo de uma uacutenica dose de bupropiona Os metaboacutelitos ativos satildeo
posteriormente metabolizados em inativos e estes satildeo excretados na urina 54
Inibidores da CYP2B6 como por exemplo a ticlodipina um agente
antiplaquetaacuterio derivado da tienopiridina interagem com a bupropiona diminuindo a sua
hidroxilaccedilatildeo 57 58
Apoacutes a administraccedilatildeo crocircnica de doses de 150 a 300 mgdia a bupropiona e seus
metaboacutelitos assumem cineacutetica linear A bupropiona possui meia vida de 20 horas
aproximadamente e apresenta clearence meacutedio aparente correspondente a cerca de
200Lh A eliminaccedilatildeo da bupropiona ocorre principalmente atraveacutes da urina (87) e das
fezes (10) e eacute excretada em apenas 05 de forma inalterada nos mostrando um
extenso metabolismo 54
11
Figura 7 - Metabolismo da bupropiona em seus principais metaboacutelitos ativos A bupropiona eacute
extensamente metabolizada em hidroxibupropiona pela isoenzima CYP2B6 Os demais metaboacutelitos ativos
aatildeo metabolizados por outras enzimas Fonte adaptado de Hesse et al 2000 55
13 Pesquisa de biomarcadores
A variabilidade interindividual em resposta a faacutermacos antitabagismo sugere que
os tratamentos podem ser mais efetivos em subgrupos de fumantes 59-64 No contexto de
medicina personalizada diversos pesquisadores tecircm buscado a identificaccedilatildeo de
preditores de resposta aos tratamentos de cessaccedilatildeo tabaacutegica os quais geralmente estatildeo
envolvidos em aspectos farmacocineacuteticos e farmacodinacircmicos ou via de atuaccedilatildeo do
faacutermaco como por exemplo os fatores geneacuteticos o perfil de expressatildeo gecircnica de
proteiacutenas e de metaboacutelitos 65-68
Aleacutem de refletir a efetividade do tratamento estes biomarcadores tambeacutem
poderiam indicar a toxicidade ou a ocorrecircncia de efeitos adversos A combinaccedilatildeo
desses fatores com outras variaacuteveis individuais pode ser utilizada para adequar as
estrateacutegias preventivas e terapecircuticas 65-68
12
131 Estudos farmacogeneacuteticos e de expressatildeo gecircnica para vareniclina e
bupropiona
Diversos polimorfismos geneacuteticos tecircm sido associados com resposta agrave
vareniclina e agrave bupropiona 41 65 67-71
King et al 65 mostraram a associaccedilatildeo de polimorfismos de nucleotiacutedeos uacutenicos
(SNPs - single nucletide polimorfisms) nos genes CHRNA4 CHRNA5 CHRNA7
CHRNB2 (codificadores das subunidades α4 α5 α7 e β2 dos nAChRs
respectivamente) com abstinecircncia contiacutenua em resposta agrave vareniclina O mesmo
trabalho tambeacutem encontrou associaccedilatildeo dos polimorfismos nos genes CHRNA3
CHRNA5 CHRNB4 CHRNG (codificam as subunidades α3 α5 β4 e γ dos nAChR
respectivamente) Aleacutem disso os autores demonstraram a associaccedilatildeo de polimorfismos
nos genes HTR3A e HTR3B (codificadores dos receptores serotonineacutergicos) com a
frequecircncia de recaiacuteda no tratamento antitabagismo
Swan et al 41 verificaram a associaccedilatildeo de polimorfismos no gene CHRNB2 com
naacuteusea severa em pacientes tratados com vareniclina
Nosso grupo de pesquisadores encontrou a associaccedilatildeo do polimorfismo
rs10443196 no gene CHRNA4 e do polimorfismo 785AgtG no gene CYP2B6
(codificador da principal isoenzima metabolizadora da bupropiona) com uma maior taxa
de sucesso no tratamento com vareniclina e bupropiona respectivamente 67 68
O gene CYP2B6 eacute um dos alvos mais importantes de estudos farmacogeneacuteticos
no tratamento com bupropiona Diversos polimorfismos neste gene satildeo preditores de
metabolizaccedilatildeo lenta ou raacutepida os quais foram associados com as diferenccedilas de
concentraccedilotildees do faacutermaco e de seu principal metaboacutelito ativo hidroxibupropiona em
amostras bioloacutegicas Essas concentraccedilotildees tambeacutem se associaram agrave variabilidade na
resposta ao tratamento com bupropiona 72-74
13
Polimorfismos podem implicar em diversos mecanismos moleculares como por
exemplo alteraccedilatildeo constituiccedilatildeo ou conformaccedilatildeo de proteiacutenas mudanccedilas poacutes-
traducionais e a regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica gerando variabilidade interindividual
nos niacuteveis de RNA transcrito o que poderiam explicar as diferenccedilas de resposta aos
faacutermacos antitabagismo 72
O polimorfismo CHRNA4 (rs2236196) assim como diversos polimorfismos
presentes no gene CYP2B6 os quais foram associados agrave resposta ao tratamento com
vareniclina e bupropiona respectivamente foram tambeacutem associados a maiores e
menores niacuteveis de expressatildeo gecircnica 72-75 Tambeacutem vale salientar que assim como a
expressatildeo gecircnica pode afetar a resposta ao tratamento a expressatildeo gecircnica tambeacutem pode
ser alterada em resposta aos faacutermacos 76 Neste sentido Smith et al 76 mostraram que a
vareniclina pode afetar a expressatildeo gecircnica da enzima DNA metiltransferase-1 (DNMT)
que mostrou estar envolvida em mecanismos epigeneacuteticos em neurocircnios corticais
GABaeacutergicos os quais estatildeo relacionados a processos cognitivos em indiviacuteduos
esquizofrecircnicos fumantes
O tratamento crocircnico com vareniclina modificou a expressatildeo dos nAChRs em
ceacuterebros de camundongos O upregulation dos nAChRs (α4β2) pelo uso crocircnico da
vareniclina foi similar ao promovido ao uso crocircnico da nicotina Similar dowregulation
foi visto para os nAChRs (α6β2) A vareniclina aumentou significantemente ambos
nAChRs (α3β4) e α7 enquanto a nicotina teve menor efeito nestes siacutetios 77
Em estudos com pacientes voluntaacuterios a obtenccedilatildeo de amostras do sistema
nervoso central eacute inviaacutevel Como alternativa a esse problema estudos tecircm proposto a
anaacutelise de expressatildeo gecircnica em sangue perifeacuterico 78-80 Embora natildeo seja o tecido alvo da
farmacodinacircmica dos medicamentos antitabagismo o sangue possui muitas
similaridades a niacutevel transcricional com muacuteltiplas regiotildees cerebrais 81
14
Hennings et al 82 mostraram diferenccedilas no perfil de expressatildeo gecircnica em ceacutelulas
mononucleares de sangue perifeacuterico (PBMCs) de pacientes respondedores e natildeo
respondedores a tratamentos com antidepressivos e muitos dos genes diferentemente
expressos satildeo codificadores de receptores tambeacutem presentes no SNC
Ota et al 83 mostraram que os genes GABRR2 (codificador de receptor
GABAeacutergico) e CHRNA3 (codificador da subunidade α3 de nAChR) foram
diferentemente expressos em sangue perifeacuterico em resposta ao tratamento com
risperidona em pacientes com esquizofrenia
Em outro estudo Kordi-Tamandani et al 84 mostraram que os niacuteveis de
expressatildeo gecircnica de SLC6A3 em leucoacutecitos diferiram entre indiviacuteduos dependentes de
opioacuteides e voluntaacuterios saacutedios Este gene eacute codificador de uma importante proteiacutena
recaptadora de dopamina em neurocircnios chamada DAT
Wongsriraksa et al 85 mostraram a expressatildeo das subunidades α4 α5 α7 β1 e
β2 em um estudo de caracterizaccedilatildeo de nAChRs em amostras de PBMC de humanos
atraveacutes de nicotina radioligante sugerindo conter as subunidades α4β2 α4β2α5 eou α7
Por fim diversos estudos tecircm mostrado que os nAChRs satildeo importantes para processos
imunoloacutegicos 86-91
Estudos tecircm evidenciado a expressatildeo de receptores dopamineacutergicos em
leucoacutecitos humanos Embora a dopamina natildeo ultrapasse a barreira hematoencefaacutelica as
diferenccedilas nos niacuteveis de dopamina do sistema nervoso central poderiam alterar a
expressatildeo desses receptores em leucoacutecitos ainda durante a sua formaccedilatildeo via inervaccedilatildeo
da coluna espinal doenccedilas como Parkinson Alzheimer e adiccedilatildeo agraves substacircncias
psicoativas poderiam influenciar na expressatildeo desses receptores em sangue perifeacuterico 92
15
132 Mensuraccedilatildeo de nicotina bupropiona vareniclina e seus metaboacutelitos em
amostras bioloacutegicas
A nicotina possui um baixo tempo de meia-vida e a isoenzima CYP2A6 eacute
predominante responsaacutevel pelo metabolismo da nicotina em cotinina e trans-3-
hidroxicotinina (seus principais metaboacutelitos) 93 94 Estes e a nicotina satildeo marcadores de
exposiccedilatildeo ao tabaco e indicativo de fumo 95
A taxa de metabolizaccedilatildeo da nicotina (NMR) obtida pela relaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de trans-3-hidroxicotininacotinina tem sido associada com DN com
desfecho e com escolha farmacoloacutegica de tratamento antitabagismo 95 96 Os valores
contiacutenuos e categoacutericos de NMR (metabolizadores lentos vs normais e raacutepidos) se
mostraram estaacuteveis em fumantes independente da carga tabaacutegica 32 97 98
A bupropiona eacute um faacutermaco extensamente metabolizado e a principal isoenzima
envolvida em seu metabolismo eacute a CYP2B6 a qual medeia quase que exclusivamente o
processo de hidroxilaccedilatildeo desse faacutermaco formando o metaboacutelito hidroxibupropiona 55
Diversos estudos tecircm associado as concentraccedilotildees de bupropiona e de hidroxibupropiona
em amostras de soro plasma e urina com a resposta ao faacutermaco 73 74
Zhu et al 73 em um estudo cliacutenico duplo-cego e placebo controlado os
indiviacuteduos foram tratados com bupropiona ou placebo por 6 meses Na terceira semana
de tratamento foram colhidas amostras de plasma para mensuraccedilatildeo de bupropiona e seu
principal metaboacutelito ativo a hidroxibupropiona As concentraccedilotildees mais elevadas de
hidroxibupropiona resultaram em melhores resultados de cessaccedilatildeo do tabagismo
Laib et al 74 apresentaram que as concentraccedilotildees de hidroxibupropiona em soro
foram correlacionadas com as diferentes respostas agrave bupropiona em pacientes com
depressatildeo analisadas atraveacutes de uma escala de impressatildeo clinica global
16
Quanto agrave vareniclina este eacute um faacutermaco pouco metabolizado sendo que 5 a
10 da dose pode ser encontrada na forma metaboacutelitos (soro plasma e urina) 49 Os
metaboacutelitos de vareniclina jaacute identificados em humanos em estudos preacutevios satildeo
hidroxivareniclina vareniclina N-carbomoilglucoroniacutedeo oxovareniclina N-
glicosilvareniclina e N-formilvareniclina 47 49 99 Pouco se conhece sobre as enzimas
que metabolizam a vareniclina Obach et al 49 mostrou o envolvimento da enzima
UG2B7 com o processo de glucoronidaccedilatildeo do faacutermaco Ainda natildeo haacute estudos que
associam os metaboacutelitos de vareniclina com resultados de desfecho de tratamento
17
2 JUSTIFICATIVA
Considerando a elevada prevalecircncia do tabagismo e a dificuldade dos indiviacuteduos
fumantes em se abster do tabaco estudos que apontem uma terapecircutica farmacoloacutegica
mais efetiva podem contribuir enormemente para o processo de cessaccedilatildeo tabaacutegica
Neste cenaacuterio a anaacutelise da expressatildeo de genes de interesse e a mensuraccedilatildeo de analitos
podem ser ferramentas uacuteteis na identificaccedilatildeo de marcadores e de subgrupos de resposta
ao tratamento antitabagismo
Escolhemos a realizaccedilatildeo da mensuraccedilatildeo de analitos nas amostras de soro dos
pacientes tratados com ambos os faacutermacos antitabagismo (vareniclina e bupropiona) e
especialmente para os pacientes tratados com vareniclina foram realizadas anaacutelises de
expressatildeo gecircnica de ceacutelulas mononucleares provenientes de amostras de sangue
perifeacuterico (do inglecircs Peripheral Blood Mononuclear Cell - PBMC) O ensaio
customizado para as anaacutelises da expressatildeo de 17 genes foi um grande investimento
financeiro nesta pesquisa e portanto o priorizamos para analisar as amostras dos
pacientes tratados com vareniclina jaacute que eacute o faacutermaco mais novo eficaz e custoso no
tratamento antitabagismo
As anaacutelises de expressatildeo gecircnica em amostras de PBMC satildeo de grande valia pois
seria importante encontrar em amostras de tatildeo faacutecil obtenccedilatildeo como amostras de sangue
um marcador de resposta que poderia ter correlaccedilatildeo com a expressatildeo gecircnica do sistema
nervoso central
Identificar um possiacutevel marcador preditivo de sucesso na utilizaccedilatildeo de um
determinado faacutermaco no iniacutecio da sua administraccedilatildeo foi uma das investigaccedilotildees deste
protocolo Os resultados desse estudo exploratoacuterio podem ser uacuteteis no entendimento do
comportamento de expressatildeo dos genes escolhidos (mais comumente expressos no
18
SNC) em amostras de sangue e na elaboraccedilatildeo de pesquisas mais amplas para a
identificaccedilatildeo de biomarcadores de resposta ao tratamento antitabagismo
19
3 OBJETIVOS
31 Analisar a possiacutevel associaccedilatildeo da expressatildeo de genes de interesse em amostras de
sangue perifeacuterico com a resposta ao tratamento com vareniclina
32 Analisar a possiacutevel associaccedilatildeo das concentraccedilotildees de faacutermacos antibagismo nicotina
e seus metaboacutelitos com a resposta ao tratamento com vareniclina e bupropiona
20
4 METODOLOGIA
41 Casuiacutestica
Foi realizado um estudo de coorte prospectivo no qual foram incluiacutedos 105
pacientes homens e mulheres fumantes provenientes do Programa de Assistecircncia ao
Fumante (PAF) do Instituto do Coraccedilatildeo do Hospital das Cliacutenicas da Faculdade de
Medicina da Universidade de Satildeo Paulo (InCor) com idade ge 18 anos IMC ge 185 e lt
30 kgm2 e que iniciariam o tratamento com vareniclina (n=74 para a mensuraccedilatildeo dos
analitos destes n=27 para as anaacutelises de expressatildeo gecircnica) ou com bupropiona (n=31
para a mensuraccedilatildeo dos analitos) (Figura 8)
A inclusatildeo dos pacientes ocorreu atraveacutes do protocolo de pesquisa ldquoEficaacutecia do
uso de marcadores geneacuteticos na escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismordquo o
qual foi aprovado no processo de submissatildeo ao Comitecirc de Eacutetica Institucional (CAAE
60133816000000068) - SDC 434116007 (Anexo 4) O presente estudo foi aprovado
como subprojeto do anterior atraveacutes do parecer nordm 2118913 (Anexo 1) Os pacientes
foram informados do estudo e consentiram a sua participaccedilatildeo ao assinar o termo de
consentimento livre e esclarecido (Apecircndice)
Foram excluiacutedos do estudo os pacientes que possuiacutessem desordens hepaacutetica
renal e gastrointestinal que comprometessem o metabolismo e eliminaccedilatildeo dos faacutermacos
os pacientes que faziam uso de medicamentos indutores ou inibidores das enzimas do
citocromo P450 nas uacuteltimas 6 semanas os pacientes etilistas e usuaacuterios de droga os
pacientes com doenccedilas psiquiaacutetricas instaacuteveis as mulheres em risco de gravidez e os
pacientes com contra-indicaccedilatildeo ao tratamento com bupropiona ou vareniclina
mencionados acima
21
Os pacientes foram acompanhados pela equipe do PAF e o tratamento
farmacoloacutegico foi conduzido por 12 semanas Foram considerados os seguintes
desfechos no tratamento ldquosucessordquo se o paciente parasse de fumar ateacute a 4ordf semana de
tratamento (T4) e ldquoresistenterdquo se o paciente natildeo conseguisse parar de fumar ateacute a 4ordf
semana de tratamento
22
Bupropiona
n=31
Visita T-1 Visita T0
(iniacutecio da medicaccedilatildeo)
Visita T2 Visita T4
Desfecho
Vareniclina
n=74
RNA Basal Vareniclina
n= 27
RNA RNA
Mensuraccedilatildeo de analitos vs Desfecho (T2)
vareniclina nicotina cotinina e hidroxicotinina
Mensuraccedilatildeo de analitos vs Desfecho (T2)
bupropiona hidroxibupropiona nicotina cotinina e hidroxicotinina
Soro
Soro
Figura 8 - Desenho do estudo O nuacutemero amostral total do estudo foi de 105 pacientes Foram incluiacutedos 74 pacientes tratados com vareniclina e 31 pacientes tratados com bupropiona Esses foram
submetidos agrave coleta de amostras de sangue no periacuteodo de 2 semanas (T2) apoacutes o iniacutecio da terapecircutica Apoacutes foi realizada a mensuraccedilatildeo de analitos e a anaacutelise de associaccedilatildeo com os desfechos de
tratamento Aleacutem disso os pacientes tratados com vareniclina tambeacutem foram submetidos agrave coleta de amostras para a obtenccedilatildeo de RNA em trecircs distintos periacuteodos de tempo antes de iniciar a
terapecircutica (T0) 2 semanas (T2) e 4 semanas apoacutes iniciar a terapecircutica farmacocoloacutegica (T4) Amostras de 14 pacientes que obtiveram sucesso no tratamento e de 13 que obtiveram resistecircncia (n=27)
foram analisadas quanto agrave expressatildeo de 17 genes candidatos (52 amostras ao todo 9 resistentes do tempo T0 7 resistentes do T2 8 resistente do T4 9 sucessos do T0 8 sucessos do T2 e 11 sucessos
do T4 vide toacutepico 42 Nuacutemero amostral) Apoacutes foram realizadas as anaacutelises de associaccedilatildeo entre os niacuteveis dos transcritos e os desfechos e tempos de tratamento Os pacientes foram acompanhados por
12 semanas durante o tratamento farmacoloacutegico no entanto o desfecho foi definido na 4 ordf semana (T4) pois apoacutes esse periacuteodo o tratamento seria reavaliado e poderia haver mudanccedila na medicaccedilatildeo T-
1= visita inicial T0= antes do iniacutecio da terapecircutica T2= 2 semanas apoacutes o iacutenicio do tratamento T4= 4 semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento T12= 12 semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento Desfecho na
visita T4 = ldquosucessordquo se o paciente parasse de fumar ateacute a 4ordf semana de tratamento (T4) e ldquoresistenterdquo se o paciente natildeo conseguisse parar de fumar ateacute a 4ordf semana de tratamento Fonte do autor
Visita T12
Final do tratamento farmacoloacutegico
RNA vs Desfecho (T0 T2 e T4)
14 sucessos e 13 resistentes
CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2
CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3 DRD4
HTR3A HTR3B COMT e SLC6A3
23
42 Fluxo de procedimentos adotados no atendimento aos pacientes
O tratamento farmacoloacutegico antitabagismo possui a duraccedilatildeo de 3 meses (12
semanas) No estudo de ldquoEficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticosrdquo foram coletados
dados cliacutenicos em 7 visitas T-1 (visita inicial) T0 (visita de iniacutecio do tratamento) T2
T4 T6 T8 e T12 (2 4 6 8 e 12 semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico)
Neste projeto foram utilizados os tempos de visita dos pacientes nas consultas
para a realizaccedilatildeo da coleta de amostras Dessa forma foi facilitado o comparecimento
desses pacientes ao procedimento Os pacientes precisavam estar comprometidos em
administrar os medicamentos todos os dias no horaacuterio combinado e terem
disponibilidade de tempo para as coletas as quais natildeo necessariamente coincidiram
com o horaacuterio das consultas pois as coletas foram realizadas no mesmo horaacuterio de
tomada do medicamento para que as anaacutelises de todos os pacientes pudessem ser
comparaacuteveis
Na visita T-1 foi aplicado o TCLE do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores
geneacuteticosrdquo bem como o questionaacuterio para coletar informaccedilotildees cliacutenicas Aleacutem disso os
pacientes foram avaliados quanto agrave DN atraveacutes do teste de Fagerstroumlm para DN (FTND)
100 e do escore de consumo situacional Issa (escore Issa) 101 (Anexos 2 e 3
respectivamente) O escore Issa eacute utilizado pelo PAF para a reclassificaccedilatildeo como
moderados ou altamente dependentes os pacientes que obteacutem o escore de FTND abaixo
de 5 mas que no entanto possuem niacutevel de DN consideraacutevel em relaccedilatildeo aos efeitos
psicoativos da nicotina A reclassificaccedilatildeo ocorre quando os pacientes obtecircm escore Issa
ge3 Apoacutes os pacientes foram randomizados em dois braccedilos do estudo tratamento com
vareniclina ou tratamento baseado na farmacogeneacutetica Os pacientes realizaram coleta
de sangue com o objetivo de obtenccedilatildeo do DNA para o estudo ldquoEficaacutecia do uso de
marcadores geneacuteticosrdquo
24
Apoacutes a genotipagem das amostras e escolha da medicaccedilatildeo dos pacientes
(vareniclina ou conforme geneacutetica) foi realizada ligaccedilatildeo telefocircnica para o paciente
informando o medicamento que iria tomar Nesta mesma ligaccedilatildeo o paciente tambeacutem foi
convidado a participar do presente estudo e todas as informaccedilotildees quanto agrave necessidade
de tomar o medicamento antitabagismo sempre no mesmo horaacuterio quanto aos dias das
coletas bem como as informaccedilotildees de preparaccedilatildeo para os procedimentos foram
transmitidas aos pacientes
Para os pacientes que seriam tratados com vareniclina ainda foi importante levar
em consideraccedilatildeo o horaacuterio que o paciente costumava tomar cafeacute da manhatilde para entatildeo
decidir o horaacuterio de administraccedilatildeo do faacutermaco pois o mesmo precisava ser
administrado apoacutes refeiccedilatildeo generosa com o intuito de diminuir o risco de naacuteusea
As coletas foram padronizadas para serem realizadas agraves manhatildes no mesmo
horaacuterio que o paciente tomaria a primeira dose do dia do medicamento antitabaacutegico O
horaacuterio de coleta entre os pacientes foi fixado entre 7 e 10 horas da manhatilde para evitar
variaccedilatildeo circadiana interpacientes No entanto entre as coletas do mesmo paciente o
horaacuterio de coleta e de administraccedilatildeo do medicamento foi sempre o mesmo com
variaccedilatildeo natildeo superior agrave 1 hora (esta variaccedilatildeo foi registrada)
Os pacientes foram orientados a realizar jejum de 10 horas (sendo liberada a
ingestatildeo de aacutegua e outros medicamentos ateacute 1 hora antes da coleta) e trazer o
medicamento antitabaacutegico para tomar apoacutes o procedimento A dose diurna dos
medicamentos antitabagismo natildeo foi administrada antes da coleta para evitar efeitos
agudos nas anaacutelises O periacuteodo de jejum foi realizado para que a amostra tivesse menor
quantidade de interferentes possiacutevel e tambeacutem para natildeo promover efeitos agudos dos
alimentos na expressatildeo gecircnica Um dia antes de cada coleta foi realizada ligaccedilatildeo
telefocircnica ou envio de mensagem para os pacientes com o objetivo de lembraacute-los do
25
procedimento das orientaccedilotildees de preparo e confirmar o uso e o cumprimento do horaacuterio
de administraccedilatildeo do medicamento antitabagismo (essa confirmaccedilatildeo da adesatildeo foi
realizada para as coletas nas visitas T2 e T4 quando os pacientes jaacute haviam iniciado o
tratamento farmacoloacutegico)
Na visita T0 para os pacientes que iniciariam o tratamento com vareniclina foi
aplicado o TCLE do presente projeto e colheu-se uma amostra de sangue para a
obtenccedilatildeo do RNA ainda antes de iniciarem o tratamento Foram fornecidas aos
pacientes as orientaccedilotildees de como tomar o medicamento e informaccedilotildees para a proacutexima
coleta Os pacientes foram orientados agrave tomarem o medicamento neste mesmo dia ou no
dia seguinte
Na visita T2 foram coletadas amostras de soro dos pacientes tratados com
bupropiona e amostras de soro e RNA dos pacientes tratados com vareniclina
Na visita T4 foram coletadas amostras de RNA dos pacientes tratados com
vareniclina
No Quadro 1 abaixo estatildeo resumidos os procedimentos orientaccedilotildees e coletas de
amostras
Quadro 1 - Procedimentos do protocolo em relaccedilatildeo aos pacientes
T-1 Aplicaccedilatildeo do TCLE do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores
geneacuteticosrdquo
Aplicaccedilatildeo de questionaacuterios
Coleta de DNA
1 dia antes de T0 Ligaccedilatildeo para informar o medicamento que o paciente iria tomar
Convite para participar do presente estudo
Determinar com o paciente qual era o melhor horaacuterio para
26
administraccedilatildeo do medicamento antibagismo (neste mesmo horaacuterio
que foram realizadas todas as coletas)
Orientaccedilotildees para a coleta em T0
T0 Aplicaccedilatildeo do TCLE do presente estudo
Coleta de amostra de RNA (para os pacientes que seriam tratados
com vareniclina)
Orientaccedilotildees para iniciar o tratamento no mesmo dia ou dia
seguinte
1 dia antes de T2 Orientaccedilotildees para coleta em T2
Confirmaccedilatildeo se o paciente estava tomando o medicamento e no
horaacuterio combinado
T2 Aplicaccedilatildeo do TCLE do presente estudo para os pacientes tratados
com bupropiona
Coleta de soro para os pacientes tratados com bupropiona e coleta
de RNA e soro dos pacientes tratados com vareniclina
1 dia antes de T4 Orientaccedilotildees para coleta em T2
Confirmaccedilatildeo se o paciente estava tomando o medicamento e no
horaacuterio combinado
T4 Coleta de RNA dos pacientes tratados com vareniclina
43 Coleta e armazenamento das amostras dos pacientes tratados com vareniclina e
bupropiona
Os pacientes tratados com vareniclina foram submetidos agrave coleta de sangue para
a obtenccedilatildeo de RNA em 3 periacuteodos de tempo T0 (ainda antes de iniciar o tratamento T2
27
e T4 Para isto foram utilizados os tubos PAXgene Blood RNA Tubes BRT (Qiagen
USA) para a obtenccedilatildeo de RNA Apoacutes a coleta os tubos PAXgene foram encubados em
bancada por 2 horas agrave temperatura ambiente para garantir a lise completa das ceacutelulas
sanguiacuteneas e apoacutes os tubos foram armazenados a -20degC ateacute a extraccedilatildeo do RNA das
amostras
No periacuteodo T2 tambeacutem foram coletadas amostras para a obtenccedilatildeo do soro dos
pacientes tratados com vareniclina e bupropiona Neste periacuteodo as concentraccedilotildees dos
metaboacutelitos dos faacutermacos jaacute se encontravam em estado de equiliacutebrio Para isto foram
utilizados tubos sem aditivo (Vacuette Greiner Bio-one) Os tubos foram mantidos a
temperatura ambiente ateacute a formaccedilatildeo de coaacutegulo Apoacutes os tubos foram centrifugados a
4degC a 3000 rpm por 10 min para se obter amostras de soro As amostras foram entatildeo
aliquotadas em 4 criotubos de soro e armazenadas em freezer a -80ordmC ateacute o momento
das anaacutelises
44 Nuacutemero amostral
Quanto ao nuacutemero amostral para o ensaio de expressatildeo gecircnica dos 74 pacientes
tratados com vareniclina foram escolhidas amostras de 27 pacientes (14 do grupo
sucesso e 13 do grupo resistente) baseado em estudos anteriores 83 102 que seguiram
corretamente o jejum que realizaram a tomada do medicamento nos horaacuterios
combinados e compareceram em todos e tempos de coleta Sendo ao todo 81 amostras
devido aos de 3 tempos de tratamento (T0 T2 e T4)
No entanto algumas amostras natildeo apresentaram bons resultados para a anaacutelise
de expressatildeo gecircnica e realizamos o ensaio de expressatildeo para 60 amostras de diversos
tempos Oito amostras natildeo apresentaram resultados de amplificaccedilatildeo e finalizamos com
52 amostras ao todo (9 resistentes do tempo T0 7 resistentes do T2 8 resistentes do T4
28
9 sucessos do T0 8 sucessos do T2 e 11 sucessos do T4) provenientes de 14 pacientes
do grupo sucesso e 13 do grupo resistente Esse tamanho amostral para cada grupo de
anaacutelise eacute comparaacutevel agrave estudos anteriores 102
Quanto ao nuacutemero amostral para a mensuraccedilatildeo dos analitos houve a inclusatildeo de
74 pacientes tratados com vareniclina e 31 tratados com bupropiona Nuacutemero amostral
semelhante foi utilizado no estudo de Laib et al 74 Das 105 amostras 3 amostras dos
pacientes tratados com vareniclina e 1 de paciente tratado com bupropiona apresentaram
concentraccedilotildees abaixo do limite de quantificaccedilatildeo (LQ) e estas foram excluiacutedas das
anaacutelises de concentraccedilatildeo dos analitos ficando com nuacutemero amostral final de 71 para
vareniclina e 30 para bupropiona
45 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica para amostras de pacientes tratados com
vareniclina
451 Concentraccedilatildeo purificaccedilatildeo e extraccedilatildeo de RNA
O processo de purificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo do RNA foi realizado atraveacutes do
PAXgene Blood RNA Kit (Qiagen USA) Antes de iniciar o procedimento a
temperatura dos tubos PAXgene Blood tubes (BRT) (Qiagen USA) os quais estavam
armazenados em freezer -20degC foi estabilizada mantendo os tubos em temperatura
ambiente em torno de 4 horas ou over night
Para o processo de purificaccedilatildeo do RNA primeiramente realizou-se a
homogeneizaccedilatildeo do sangue total contido no tubo PAXgene Blood tubes (BRT) e a
centrifugaccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos por 10 min em 3000 rcf havendo a formaccedilatildeo de um
pellet e o sobrenadante foi desprezado Apoacutes foi realizada a lavagem do pellet
adicionando-se 4 mL de aacutegua livre de RNase (RNFW) mistura foi submetida ao voacutertex
ateacute a dissoluccedilatildeo visiacutevel do pellet e o conteuacutedo foi centrifugado por 10 minutos a 3000
29
rcf sendo descartado o sobrenadante O pellet foi ressuspendido com 350 μL de tampatildeo
de ressuspensatildeo (BR1) atraveacutes de voacutertex ateacute a sua dissoluccedilatildeo e transferido para o tubo
de microcentrifugaccedilatildeo (15 mL MCT) Foram adicionados no tubo MCT 300 μL de
tampatildeo de ligaccedilatildeo (BR2) e 40 μL de proteinase K (PK) a mistura foi submetida ao
voacutertex durante 5 segundos e incubada durante 10 minutos a 55degC com agitaccedilatildeo de 1400
rpm provocando dessa forma a digestatildeo de proteiacutenas
Apoacutes o processo de incubaccedilatildeo foram realizados diversos processos de remoccedilatildeo
de impurezas em colunas de rotaccedilatildeo O lisado foi transferido para a coluna de rotaccedilatildeo
do homogeneizador PAXgene (PSC lilaacutes) a qual foi colocada em um tubo de
processamento (PT) de 2 mL e centrifugado durante 3 minutos agrave velocidade de 16100
rcf dessa forma foi realizada a homogeneizaccedilatildeo do lisado de ceacutelulas e remoccedilatildeo dos
detritos celulares residuais Em seguida o sobrenadante da fraccedilatildeo residual foi
transferido para o tubo de microcentrifugaccedilatildeo (15 mL MCT) novo (sem interferir no
pellet) e foram adicionados 350 μL de etanol (96-100 grau de pureza PA) a mistura
foi submetida ao voacutertex e centrifugada por breves instantes (1-2 segundos 500-1000 x g)
para remover as gotas presentes no interior da tampa do tubo
Foram transferidos 700 μL de amostra para a coluna de rotaccedilatildeo de RNA
PAXgene (PRC vermelho) esta foi colocada e um tubo de processamento (PT) de 2
mL no qual foi centrifugado durante 1 minuto a 12000 rcf Apoacutes a coluna de rotaccedilatildeo
foi colocada em um tubo PT novo (o tubo PT utilizado anteriormente foi descartado) O
restante da amostra foi colocado na mesma coluna de rotaccedilatildeo PRC e o processo de
centrifugaccedilatildeo foi repetido por mais 2 vezes sempre transferindo a coluna para um tubo
de processamento novo Antes da uacuteltima centrifugaccedilatildeo foram adicionados 350 μL de
tampatildeo de lavagem 1 (BR3) na coluna PRC
30
Em seguida foram adicionados 10 μL de soluccedilatildeo-matildee de DNase I (RNFD) a 70
μL de tampatildeo de digestatildeo de DNA (RDD) em um tubo de microcentrifugaccedilatildeo de 15
mL (MCT) O conteuacutedo foi misturado suavemente e centrifugado durante breves
instantes para colher o liacutequido residual dos lados do tubo Apoacutes 80 μL dessa mistura
foram transferidos diretamente para a membrana da coluna PRC e esta foi incubada agrave
temperatura ambiente (20-30degC) durante 15 minutos
Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foram adicionados 350 μL de tampatildeo de lavagem
1 (BR3) para a membrana da coluna e esta foi centrifugada durante 1 min a 12000 rcf
Apoacutes a coluna PRC foi colocada em um tubo (PT) novo e foram adicionados 500 μL de
tampatildeo de lavagem 2 (BR4) na membrana da coluna A centrifugaccedilatildeo foi repetida o
tubo PT foi descartado e a coluna PRC foi colocada em um novo tubo PT A lavagem
com 500 uL de BR4 e a centrifugaccedilatildeo foi repetida novamente (poreacutem o tempo de
centrifugaccedilatildeo foi de 3 minutos) Apoacutes foi realizada uma centrifugaccedilatildeo adicional em um
tubo PT novo durante 1 minuto a 12000 rcf (sem adiccedilatildeo de tampatildeo)
A coluna de rotaccedilatildeo (PRC) foi colocada em tubo de 15 mL (MCT) Foram
adicionados diretamente na membrana da coluna 80 μL de tampatildeo de eluiccedilatildeo (BR5) a
qual foi encubada agrave temperatura ambiente por 5 minutos e centrifugada por 1 minuto a
12000 rcf para eluir o RNA
As amostras foram quantificadas atraveacutes de leitura em espectrofotocircmetro no
comprimento de onda 260 nm (utilizando como branco o tampatildeo BR5) e foram
armazenadas a -20ordmC ateacute o momento das anaacutelises Para avaliar a qualidade do RNA
gerado foi realizada uma eletroforese em gel de agarose para a verificaccedilatildeo da
integridade do RNA ribossomal
31
452 Siacutentese de cDNA
O processo de siacutentese de cDNA foi realizado atraveacutes do RT2 First Strand Kit
(Qiagen USA) Os reagentes do kit foram descongelados e centrifugados brevemente
(10-15 segundos)
Primeiramente foi preparada uma mix para a degradaccedilatildeo do DNA genocircmico
composta por 2microL de tampatildeo GE 800 ng de RNA e quantidade variaacutevel de aacutegua livre
de RNase ateacute o volume final de 10 μL ou 8 μL de RNA (para amostras com
concentraccedilotildees abaixo de 100 ngμL) sem a aacutegua livre de RNase A mistura foi incubada
a 42ordmC por 5 minutos Apoacutes a incubaccedilatildeo a mistura foi colocada imediatamente em gelo
durante pelo menos 1 min
Apoacutes foi preparada uma mix para a realizaccedilatildeo da transcriccedilatildeo reversa esta foi
composta por 4 microL tampatildeo 5x (BC3) 1 microL de controle P2 (controle externo de RNA) 2
microL de mix de transcriptase reversa (RE3) e 3 microL de aacutegua livre de Rnase Foram
adicionados 10 μL da mix preparada em cada tubo contendo a mix de eliminaccedilatildeo de
DNA genocircmico A mistura foi homogeneizada delicadamente com a pipeta e incubada a
42 degC durante exatamente 15 min em seguida a reaccedilatildeo foi interrompida por incubaccedilatildeo
a 95 degC durante 5 min Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foram adicionados a cada reaccedilatildeo
91 μL de aacutegua livre de RNase e a mistura foi homogeneizada atraveacutes de pipeta diversas
vezes O produto final foi armazenado a -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo em cadeia da
polimerase (PCR) em tempo real
453 Ensaio de controle de qualidade das amostras para o ensaio de expressatildeo
gecircnica
Todas as amostras de cDNA foram analisadas quanto sua qualidade pelo ensaio
de controle de qualidade (disco QC Qiagen) em disco de 100 poccedilos (representaccedilatildeo do
32
disco nas Figuras 9 e 10) atraveacutes do PCR em tempo real com equipamento Rotor Gene
6000 (Corbett) Cada disco QC tem a capacidade de analisar 12 amostras sendo
necessaacuterios 5 discos para analisar 60 amostras
O disco QC eacute composto por primers especiacuteficos para a amplificaccedilatildeo de 2
Housekeeping genes ndash ACTB e HPRT1 (genes constitutivos que satildeo necessaacuterios para a
manutenccedilatildeo baacutesica da funccedilatildeo celular e satildeo expressos em todas as ceacutelulas de um
organismo em condiccedilotildees normais e fisiopatoloacutegicas) e 6 controles 1 controle de
transcriccedilatildeo reversa (RTC) 1 controle positivo de PCR (PPC) 1 controle de
contaminaccedilatildeo com DNA genocircmico (GDC) 1 controle de natildeo transcriccedilatildeo reversa
(NTR) 1 PPC (sem amostra) e 1 controle negativo NTC (mapa na Figura 10)
Foram preparadas 12 mixes para cada uma das amostras de cDNA Sendo 92 μL
de aacutegua livre de RNase e 08 μL de cDNA essas quantidades foram multiplicadas por 6
para se ter sobra e distribuir em 5 poccedilos cada mix de amostra (poccedilos que continham
pares de primers para 2 housekeeping genes e 3 controles) Foram distribuiacutedos 10 μL de
mix e 10 μL de RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR Master Mix (Qiagen USA) em cada
poccedilo (linhas A a E) Essa master mix conteacutem corante fluorescente intercalante de DNA
Apoacutes foram preparadas 12 mixes uma para cada amostra matildee de RNA (diluiacutedo
1100) Foram utilizados 963 μL de aacutegua livre de RNase e 072 μL de RNA (1100)
essas quantidades foram multiplicadas por 3 para se ter sobra Foram pipetados 1037
μL de mix de RNA e 963 μL de RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR Master Mix em
cada poccedilo da linha F para a anaacutelise do controle de transcriccedilatildeo reversa NTR
Apoacutes foram preparadas mixes sem as amostras para os 2 uacuteltimos controles PPC
e NTC compostas por 10 μL de aacutegua e 10 μL de RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR
Master Mix (multiplicados por 24) para as linhas G e H
33
O disco foi submetido agrave seguinte programaccedilatildeo 1 ciclo de 10 minutos a 95degC
(temperatura de ativaccedilatildeo da Taq polimerase) e 40 ciclos de 15 segundos a 95degC e 30
segundos a 60degC (para a amplificaccedilatildeo e realizaccedilatildeo da captura dos dados de
fluorescecircncia) Atraveacutes do software real-time cycler (Qiagen USA) foi ajustada a linha
de base (Threshold) do graacutefico de amplificaccedilatildeo logariacutetimica do cDNA para dessa
forma remover ruiacutedos na anaacutelise e verificar em qual ciclo de PCR que cada amostra
amplificou (cicle threshold ndash CT) (Figura 11) Os valores de CT foram planilhados e
analisados conforme os paracircmetros de qualidade (Quadro 2)
Figura 9 - Representaccedilatildeo do Rotor-Disc 100 Refere-se a um disco de material plaacutestico contendo 100
poccedilos Este veio de faacutebrica personalizado com primers para os ensaios QC ou RT2 profiler PCR array As
amostras e mixes satildeo pipetadas em cada poccedilo O disco eacute posteriormente colocado em um anel metaacutelico
proacuteprio para o encaixe no equipamento Rotor-Gene Cada poccedilo eacute nomeado com uma letra e um nuacutemero
iniciando no A1 ateacute o H12 Os quatro uacuteltimos poccedilos natildeo satildeo nomeados e natildeo conteacutem ensaio (no entanto
preenchemos com mix para equilibrar o peso do disco) Fonte do autor
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB
B HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1
C RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC
D PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC
E GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC
F NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR
G PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC
H NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC
Figura 10 - Mapa do disco QC (representaccedilatildeo planilhada) Do A1 ao B12 housekeeping genes para 12
amostras C1 ao H12 controles Cada grupo de cor representa a colocaccedilatildeo de uma mix Do A1 ao E1 mix de
A1
C1
E1
G1
34
cDNA da amostra 1 do A2 ao E2 mix de cDNA da amostra 2 (assim por diante ateacute A12 e E12) Linha F controle
com RNA diluiacutedo (1100) Linhas G e H controles com aacutegua livre de RNase Fonte do autor
Figura 11 - Exemplo de ajuste de Threshold A linha de base (Threshold) eacute ajustada na fase linear do ciclo
de amplificaccedilatildeo Dessa forma eacute possiacutevel remover os ruiacutedos e se obter o ciclo em que cada amostra foi
amplificada na PCR (CT) Fonte do autor imagem do equipamento Rotor Genereg
Quadro 2 - Paracircmetros de qualidade do ensaio QC
Controles Teste Passa no teste Falha no teste
Controle de transcriccedilatildeo reversa CT RTC (linha B) ndash CTPPC (linha G) lt5 gt5
Controle positivo de PCR CT PPC (linha G)
CT PPC (linha D) - CT PPC (linha G)
14 plusmn 2
lt3
gt16
gt3
Controle de contaminaccedilatildeo de DNA genocircmico CT GDC (linha E) gt33 lt33
Controle de natildeo transcriccedilatildeo reversa CT NTR (linha F) ge 33 ou NA lt33
Controle negativo CT NTC (linha H) ge 33 ou NA lt33
10-02
10-04
10-06
10-08
10-10
10-12
10-14
10-16
10-18
10-20
10-22
10-24
10-26
10-28
5 10 15 20 25 30 35 40
Ciclos
Flu
ore
scecircn
cia
No
rmal
izad
a
Fase Linear
35
De 60 amostras analisadas 52 passaram no teste quanto aos criteacuterios de
qualidade e prosseguiram para a anaacutelise de expressatildeo gecircnica do painel de genes
escolhidos
454 Ensaio de expressatildeo gecircnica
O protocolo de expressatildeo foi realizado por PCR em tempo real atraveacutes do
equipamento Rotor Gene 6000 (Corbett) com ensaio customizado RTsup2 Profiler PCR
Array em disco com capacidade de 100 poccedilos (Rotor-Disc 100 Qiagen USA) Nos 100
poccedilos de cada disco estavam distribuiacutedos primers especiacuteficos para o ensaio de expressatildeo
de 17 genes (Figuras 9 e 12 e Quadro 3) (17 pares de primers para cada gene repetidos 4
vezes na placa pois foi possiacutevel a anaacutelise de 4 amostras de cDNA por disco) 4 pares de
primers para os Housekeeping genes B2M GAPDH HPRT1 e ACTB (Quadro 4) e 3
controles 1 controle de contaminaccedilatildeo com DNA genocircmico (HGDC) 1 controle de
transcriccedilatildeo reversa (RTC) e 1 controle positivo de PCR (PPC) Os 4 Housekeeping
genes e os 3 controles tambeacutem satildeo repetidos 4 vezes no disco (Figura 5) Para as
reaccedilotildees foi utilizada a RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR Master Mix (Qiagen USA)
Primeiramente foi preparada 4 mixes (uma para cada amostra de cDNA) para um
disco de 100 poccedilos composta por 275 μL de 2X RT2 SYBR Green ROX FAST
Mastermix 2262 microL de aacutegua livre de RNase e 488 microL de amostra de cDNA cada Em
cada um dos poccedilos do disco foram adicionados 20 μL da mix preparada (utilizando
mixes de diferentes amostras a cada 24 poccedilos) Apoacutes deste processo o disco foi selado
com o Rotor-Disc Heat Sealer (Qiagen USA) e colocado no equipamento Rotor-Gene
6000 (Corbett) O real-time foi programado para ciclagem de PCR nas seguintes
condiccedilotildees 1 ciclo a 95deg C com duraccedilatildeo de 10 minutos 40 ciclos a 95degC por 15
segundos e 60degC por 30 segundos
36
Quadro 3 - Genes escolhidos para o ensaio de expressatildeo
CHRNA3 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α3
CHRNA4 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α4
CHRNA5 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α5
CHRNA6 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α6
CHRNA7 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α7
CHRNB2 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade β2
CHRNB3 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade β3
CHRNB4 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade β4
CHRNG Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade γ
DRD1 Codifica o receptor de dopamina tipo 1
DRD2 Codifica o receptor de dopamina tipo 2
DRD3 Codifica o receptor de dopamina tipo 3
DRD4 Codifica o receptor de dopamina tipo 4
HTR3A Codifica o receptor 3A de serotonina
HTR3B Codifica o receptor 3B de serotonina
COMT Codifica a enzima catecol-O-metiltransferase (metaboliza dopamina)
SLC6A3 Codifica a proteiacutena DAT que promove a recaptaccedilatildeo de dopamina DAT
Quadro 4 - Housekeeping genes
B2M Codifica a microbulina subunidade β2
GAPDH Codifica a enzima gliceraldeiacutedo ndash 3 fosfato desidrogenase
HPRT1 Codifica a enzima hipoxantina fosforribosiltransferase 1
ACTB Codifica a β actina
37
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
B DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
C CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
D DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
E CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
F DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
G CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
H DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
Figura 12 - Mapa do disco do ensaio RT2 profiler PCR array (representaccedilatildeo planilhada) O disco conteacutem 100 poccedilos no
entanto apenas 96 poccedilos contecircm ensaios sendo que 4 poccedilos ficam vazios A1 ao B5 = genes escolhidos para anaacutelise de
expressatildeo Do B6 ao B9= Housekeeping genes Do B10 ao B12= controles C1 ao D12 E1 ao F12 e G1 ao H12= repeticcedilatildeo dos
ensaios permitindo a anaacutelise completa de 4 amostra Cada cor diferente (a cada 2 linhas) representam a anaacutelise de uma
amostra Fonte do autor
455 Anaacutelise dos dados de expressatildeo gecircnica
Para a anaacutelise de expressatildeo gecircnica foi utilizado o meacutetodo de 2-∆∆CT 103 Apoacutes o
teacutermino da corrida do ensaio de expressatildeo gecircnica atraveacutes do software real-time cycler
(Qiagen USA) foi ajustada a linha de base (threshold) no graacutefico de amplificaccedilatildeo em
escala logariacutetmica (Figura 11) Todos os discos (total de 13) foram analisados com o
mesmo valor de threshold (010869) para que os valores de CT de todas as amostras
fossem comparaacuteveis
Os dados de CT tambeacutem foram inseridos no programa SPSS para as anaacutelises
estatiacutesticas Os valores de CT foram normalizados atraveacutes da expressatildeo dos
housekeeping genes utilizando a seguinte foacutermula ∆CT= (CTamostra ndash a meacutedia de
CThousekeeping genes) Os valores de mediana de 2-∆CT (em escala logariacutetmica) de cada grupo
foram utilizados para os testes de hipoacutetese Apoacutes foram obtidos os valores de ∆∆CT
(mediana de ∆CTgrupo teste ndash mediana de ∆CT grupo referecircncia) e o fold change (aumento ou
diminuiccedilatildeo da expressatildeo dos genes em relaccedilatildeo ao grupo referecircncia) foi calculado
atraveacutes da foacutermula 2-∆∆CT
38
46 Mensuraccedilatildeo de bupropiona vareniclina e de seus metaboacutelitos por HPLC-
MSMS
461 Materiais equipamentos e condiccedilotildees adotadas para a mensuraccedilatildeo dos
analitos apoacutes validaccedilatildeo do meacutetodo
Padrotildees analiacuteticos e padrotildees internos (PIs) deuterados bupropiona
hidroxibupropiona vareniclina (Santa Cruzreg) vareniclina d4 (TRCreg) nicotina
(ChemCruzreg) cotinina (Sigma-Aldrichreg) hidroxicotinina (Torontoreg) e
hidroxibupropiona d6 nicotina d4 cotinina d3 hidroxicotinina d3 (Cerilliantreg)
Solventes orgacircnicos Metanol acetonitrila (JT Baker) e sais acetato de amocircnio
fosfato de soacutedio (Vetecreg) fosfato de soacutedio monobaacutesico (Proquimiosreg) fosfato
de amocircnio (Reagenreg) formiato de amocircnio (Sigma-Aldrichreg)
Equipamentos e acessoacuterios
o HPLC Shimadzureg (Kyoto Japatildeo) equipado com uma vaacutelvula comutadora
de 6 vias automaacutetica
o Auto-amostrador Shimadzureg (Kyoto Japatildeo)
o Vaacutelvula comutadora de 6 vias 11R-0016H (Valcoreg Houston TX USA)
o Espectrocircmetro de massas LCMS-8030 Shimadzureg (Kyoto Japatildeo)
o Analisador de massa triplo quadrupolo (Shimadzureg Kyoto Japatildeo)
o Coluna analiacutetica ACEreg C18 (100 mm x 21 mm x 3 microm comprimento
diacircmetro interno e tamanho de partiacutecula)
o Preacute-coluna ACEreg C18 (21mm x 3 microm diacircmetro tamanho de partiacutecula)
39
o Coluna de extraccedilatildeo coluna contendo aproximadamente 70 mg do novo
RAM
Software
o LabSolutionsreg para anaacutelise dos dados e programaccedilatildeo do meacutetodo no
HPLC-MSMS
Condiccedilotildees espectrometricas e cromatograacuteficas
o Temperatura da forno da coluna 40ordmC
o Temperatura da linha de dessolvataccedilatildeo 250ordmC
o Temperatura do bloco de aquecimento 400ordmC
o Fluxo do gaacutes de nebulizaccedilatildeo 20 ml min-1
o Fluxo de gaacutes para secagem 150 ml min-1
o Energias de colisatildeo precursores e fragmentos dos analitos (Tabela 1)
o Fase moacutevel de carregamento (liberada pela bomba A) Aacutegua ultra pura
em um fluxo de 04 mL min-1
o Fase moacutevel de eluiccedilatildeoseparaccedilatildeoionizaccedilatildeo (liberada pela bomba C)
metanol tampatildeo formiato de amocircnio 001 mol L-1 pH=42 (9010 vv)
em um fluxo de 04 mL min-1
o Fase moacutevel de limpeza (liberada pela bomba B) acetonitrila aacutegua ultra
pura isopropanol (751510 vvv) em um fluxo de 10 mL min -1
o Sistema de anaacutelise ULPC-MSMS no modo columns switching em
configuraccedilatildeo backflush modo de ionizaccedilatildeo positiva por electrospray
(ESI+)
40
Tempos
o Fase de carregamento e condionamento do sistema (vaacutelvula na posiccedilatildeo
1) 0 - 30 min
o Fase de eluiccedilatildeo (vaacutelvula na posiccedilatildeo 2) 03 min
o Fase de limpeza separaccedilatildeo e anaacutelise por MS (vaacutelvula na posiccedilatildeo 1) 67
min
o Recondiocionamento do sistema (vaacutelvula na posiccedilatildeo 1) 50 min
o Tempo total incluindo todos os processos 15 min
o
Tabela 1 - Analitos precursores fragmentos e energias de colisatildeo otimizados
Analitos Precursor (mz) Fragmentos (mz) Energia de colisatildeo
(KV)
Vareniclina 212 169 -23
183 -24
141 -43
Bupropiona 240 131 -28
139 -26
103 -39
Hidroxibupropiona 256 139 -29
131 -29
167 -29
Nicotina 163 117 -28
130 -22
77 -44
Cotinina 177 80 -24
98 -21
70 -34
Hidroxicotinina 193 80 -30
134 -19
118 -21
Fragmentos quantificados
41
462 Visatildeo geral do desenvolvimento da coluna e padronizaccedilatildeo da anaacutelise
Todos os padrotildees para as anaacutelises dos analitos foram adquiridos e armazenados
conforme recomendaccedilatildeo do fabricante ateacute o momento da padronizaccedilatildeo das anaacutelises As
anaacutelises foram realizadas atraveacutes da colaboraccedilatildeo com o Prof Dr Eduardo Costa de
Figueiredo Dr Henrique Dipe Faria e Prof Dra Isarita Martins do Laboratoacuterio de
Anaacutelises de Toxicantes e Faacutermacos ndash LATF da Faculdade de Ciecircncias Farmacecircuticas da
Universidade Federal de Alfenas (Unifal MG) A escolha de cada analito foi
determinada atraveacutes de sua importacircncia cliacutenica e tambeacutem devido agrave disponibilidade dos
padrotildees dos analitos no mercado Os analitos mensurados para as amostras provenientes
dos pacientes tratados com os faacutermacos antitabagismo foram bupropiona
hidroxibupropiona vareniclina nicotina cotinina e hidroxicotinina (os trecircs uacuteltimos satildeo
proveninentes do fumo) Foi realizado um levantamento das propriedades fiacutesico-
quiacutemicas dos metaboacutelitos conforme Quadro 5
Para a remoccedilatildeo das macromoleacuteculas (como proteiacutenas) presentes na matriz de
soro foi desenvolvida uma coluna extratora de acesso restrito a partir de nanotubos
hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados com ligaccedilotildees hidrofiacutelicas (novo RAM) O
material foi desenvolvido e caracterizado antes mesmo da padronizaccedilatildeo das condiccedilotildees
de anaacutelise nos equipamentos
Foram obtidas as condiccedilotildees espectomeacutetricas (modo de ionizaccedilatildeo e as condiccedilotildees
de sua fonte temperatura do bloco de calor fluxo de gaacutes nebulizador e fluxo do gaacutes
secante) e cromatograacuteficas (tempo de retenccedilatildeo e separaccedilatildeo e aacutereas obtidas dos picos de
cada analito) Apoacutes as condiccedilotildees foram otimizadas em sistema de cromatografia liacutequida
de alta eficiecircncia multidimensional seguida por espectrometria de massa (HPLC-
MSMS) O sistema multimensional constituiacutedo por vaacutelvulas comutadoras permite a
anaacutelise online e automatizada com configuraccedilatildeo via software As vaacutelvulas permitem
42
diferentes posiccedilotildees promovendo a ocorrecircncia de eventos distintos no sistema como a
concentraccedilatildeo dos analitos e remoccedilatildeo de macromoleacuteculas atraveacutes da coluna extratora
(posiccedilatildeo 1) a eluiccedilatildeo dos analitos da coluna extratora para a coluna analiacutetica (posiccedilatildeo 2)
e novamente na posiccedilatildeo 1 ocorre a eluiccedilatildeo dos analitos da coluna analiacutetica para o
espectrocircmetro de massas a limpeza da coluna extratora e o recondionamento do
sistema
Quadro 5 - Propriedades fiacutesico-quiacutemicas dos analitos
Bupropiona
Peso molecular 27620 gmol
Ponto de fusatildeo 243-246deg C
Solubilidade em aacutegua 00693 mgmL
pKa (aacutecido forte) 1829
pKa (mais forte baacutesico) 822
Aacuterea da superfiacutecie polar 291 Aring2
Log P 36
Hidroxibupropiona
Peso molecular 25574 gmol
Ponto de fusatildeo 121-123degC
Solubilidade em aacutegua 02 mgmL
pKa (aacutecido forte) 1479
pKa (mais forte baacutesico) 765
Aacuterea da superfiacutecie polar 4933 Aring2
Log P 222
Vareniclina
Peso molecular 21127 gmol
Pressatildeo de vapor 25degC
Solubilidade em aacutegua 877 x 10-2 gL
pKa1 182 pKa2 = 973
Aacuterea da superfiacutecie polar 378 Aring2
Log P 103
43
Nicotina
Peso molecular 16223 gmol
Pressatildeo de vapor 618 degC
Solubilidade em aacutegua 100 mM
pKa 85 pKb1 616 a 15degC e pKb2 1096
Aacuterea da superfiacutecie polar 378 Aring2
Log P 117
Cotinina
Peso molecular 176215 gmol
Solubilidade em aacutegua 10 x10-6 mgL a 25degC
Aacuterea da superfiacutecie polar 332 Åsup2
Log P 007
Hidroxicotinina
Peso molecular 192214 gmol
Aacuterea da superfiacutecie polar 53 Å2
ACDLog P -148
Fonte Banco de dados Pubchem e ChemSpider Obs Algumas informaccedilotildees referentes agraves
propriedades fiacutesico-quiacutemicas dos analitos ainda natildeo estatildeo disponiacuteveis na literatura pKa= valor
negativo do logaritmo da constante de dissociaccedilatildeo de um aacutecido pKb= valor negativo do logaritmo
da constante de dissociaccedilatildeo de uma base LogP= coeficiente de particcedilatildeo
463 Desenvolvimento da coluna RAM para a purificaccedilatildeo da amostra
As amostras de soro e plasma satildeo matrizes ricas em moleacuteculas que interferem na
mensuraccedilatildeo dos analitos como lipiacutedios e principalmente proteiacutenas Estas podem
obstruir colunas analiacuteticas e diminuir a concentraccedilatildeo dos analitos jaacute que muitos destes
estatildeo ligados a essas proteiacutenas Devido a esse fato geralmente eacute realizada uma
preparaccedilatildeo das amostras antes de sua mensuraccedilatildeo Essa preparaccedilatildeo envolve processos
como a extraccedilatildeo com o uso de solventes precipitaccedilatildeo entre outros os quais geram
custo de materiais aumento do tempo de trabalho e de erros 104 105 51 106 Dessa forma
44
diversos estudos vecircm tentando desenvolver meacutetodos que natildeo exijam tanta manipulaccedilatildeo
das amostras Os materiais de acesso restrito (RAMs) estatildeo sendo utilizados para a
menor preparaccedilatildeo da amostra e sua injeccedilatildeo direta Dentre os RAMs estatildeo os nanotubos
de carbono (CNTs) modificados 107-109 Nesta colaboraccedilatildeo foi desenvolvida a coluna
extratora composta por nanotubos hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados com a
adiccedilatildeo de grupos hidrofiacutelicos Esse material entrou com pedido de patente na Agecircncia
de Inovaccedilatildeo e Empreendedorismo da Universidade Federal de Alfenas-MG atraveacutes do
Processo 230870001282019-84 e portanto a sua composiccedilatildeo e os resultados de
alguns testes da sua caracterizaccedilatildeo seratildeo mantidos em sigilo (vide declaraccedilatildeo Anexo
5)
Diferentes RAMs foram sintetizados a partir de CNTs para que fosse obtido o
melhor desempenho na remoccedilatildeo de macromoleacuteculas e retenccedilatildeo dos analitos da amostra
Os CNTs utilizados foram compostos por paredes muacuteltiplas pois apresentam uma
elevada aacuterea superficial e consequentemente uma maior capacidade de adsorccedilatildeo Os
CNTs foram adquiridos comercialmente e inicialmente foram funcionalizados a partir
de reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo aacutecida com aacutecido niacutetrico como desenvolvido por Barbosa et al 109
Os CNTs oxidados foram utilizados em etapas de siacutentese posteriores
adicionando grupos quiacutemicos hidrofiacutelicos que fossem capazes de realizar a exclusatildeo de
proteiacutenas e permitir a adsorccedilatildeo dos analitos As reaccedilotildees de siacutentese posteriores foram
semelhantes as promovidas para a realizaccedilatildeo de revestimento externo de poliacutemeros
poliacutemeros biomimeacuteticos nanomagneacuteticos com e sem acesso restrito 107 110-112 poreacutem
foram utilizadas estrateacutegias e proporccedilotildees de reagentes distintas na tentativa de obter o
RAM mais eficiente Aleacutem disso tambeacutem foi priorizada a siacutentese mais simples e
reprodutiacutevel bem como o material que apresentar maior vida uacutetil Os diferentes
materiais sintetizados foram testados em relaccedilatildeo agrave exclusatildeo de proteiacutenas e adsorccedilatildeo dos
45
analitos e tambeacutem foram realizados testes de caracterizaccedilatildeo para determinar suas
propriedades fiacutesico-quiacutemicas e confirmar a estrutura originada
A anaacutelise termogravimeacutetrica foi realizada com a finalidade de determinar a
variaccedilatildeo de massa (ganho ou perda) do RAM em funccedilatildeo de emprego de temperatura
programada proporcionando informaccedilotildees importantes a respeito da estabilidade do
material e de sua composiccedilatildeo Outras teacutecnicas tambeacutem foram utilizadas com o objetivo
de obter dados relacionados agrave estrutura e composiccedilatildeo do novo RAM como o
infravermelho e anaacutelise elementar Anaacutelises de microscopias eletrocircnicas de varredura e
de transmissatildeo tambeacutem foram realizadas para a determinaccedilatildeo da composiccedilatildeo da
superfiacutecie externa e arranjo estrutural do material com as modificaccedilotildees realizadas
Apoacutes o teacutermino do preparo do novo RAM eles foram colocados dentro de uma
coluna (aproximadamente 70 mg) conforme (Figura 13) A coluna foi posteriormente
empregada no preparo de amostras online no sistema cromatograacutefico
Figura 13 ndash Representaccedilatildeo da composiccedilatildeo da coluna extratora (Novo RAM) O novo RAM formado
a partir de nanotubos hiacutedridos de carbono e siacutelica dotado de muacuteltiplas camadas e modificados com grupos
hidrofiacutelicos promovem a retenccedilatildeo de analitos e exclusatildeo de macromoleacuteculas como proteiacutenas O RAM foi
posteriormente empacotado em coluna para a utilizaccedilatildeo em sistema cromatograacutefico Fonte adaptado do
colaborador Dr Henrique Dipe de Faria Unifal-MG
46
464 Caracterizaccedilatildeo do novo RAM
4641 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA
Na ausecircncia da coluna extratora foi preparada primeiramente uma soluccedilatildeo
aquosa de albumina de soro bovino (BSA) em uma concentraccedilatildeo de 44 mgmL-1
(semelhante agrave concentraccedilatildeo de proteiacutenas presentes no plasma humano) Foram injetados
10 microl desta soluccedilatildeo em triplicata diretamente em sistema cromatograacutefico com detector
UV ajustado a 255 nm utilizando como fase moacutevel o tampatildeo formiato de amocircnio 10
mM pH=42 em um fluxo de 04 mL min-1 O sinal detectado foi de 100 BSA
Posteriormente a coluna preenchida com 70 mg do novo RAM foi inserida no sistema
cromatograacutefico entre o injetor e o detector A soluccedilatildeo de BSA foi analisada em triplicata
novamente no entanto com a presenccedila da coluna extratora desenvolvida (novo RAM)
A aacuterea do sinal obtido nesta segunda anaacutelise dividida pela aacuterea do sinal de 100 BSA
obtida na primeira anaacutelise foi correspondente agrave porcentagem de BSA excluiacuteda pela
coluna
4642 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas no soro
Para analisar a exclusatildeo total de macromoleacuteculas (como lipiacutedios proteiacutenas e
sacariacutedeos) agora nas amostras de soro foi utilizado procedimento semelhante Na
ausecircncia da coluna extratora injetou-se no sistema cromatograacutefico em triplicata 100 μL
de amostra de soro humano branco foram testados pools de soro puros e diluiacutedos 14 A
aacutegua ultra pura foi utilizada como fase moacutevel em um fluxo de 04 mL min-1 e o sinal
obtido foi relacionado a 100 dos interferentes Apoacutes a coluna extratora (o novo
RAM) foi adionado ao sistema e a amostra foi inserida novamente A divisatildeo entre a
aacuterea do pico na primeira anaacutelise pelo pico da segunda anaacutelise refere-se agrave porcentagem
de exclusatildeo de interferentes As condiccedilotildees cromatograacuteficas foram as mesmas do teste
com BSA
47
4643 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA em diferentes pHs
O teste de exclusatildeo de proteiacutenas tambeacutem foi realizado nas mesmas condiccedilotildees
cromatograacuteficas que a anaacutelise anterior utilizando soluccedilatildeo de BSA em triplicata no
entanto diferentes soluccedilotildees como fase moacutevel (variaccedilatildeo de pH de 22 a 70) foram
testadas pois o pH pode influenciar na ionizaccedilatildeo dos analitos dos grupos funcionais
presentes na superfiacutecie do novo RAM e na interaccedilatildeo entre eles o que pode resultar em
diferentes taxas de exclusatildeo de proteiacutenas Estas soluccedilotildees foram os tampotildees fosfato de
soacutedio 10 mM (pHs 22 e 26) formiato de amocircnio 10 mM (pHs 30 a 46) acetato de
amocircnio 5 mM (pHs 52 a 66) e fosfato de soacutedio 5mM (pH 70)
465 Paracircmetros espectromeacutetricos
Com a finalidade de se obter um meacutetodo de anaacutelise capaz de detectar e
quantificar menores niacuteveis possiacuteveis de concentraccedilatildeo dos analitos foram otimizados os
paracircmetros espectromeacutetricos fluxos dos gases secantes e nebulizador modo de
ionizaccedilatildeo temperaturas da linha de dessolvataccedilatildeo e de bloco de aquecimento e as
energias de colisotildees utilizadas para fragmentar os iacuteons precursores para originar os
fragmentos iocircnicos de cada analito Foram realizadas soluccedilotildees padrotildees de cada analito e
dos padrotildees internos (PIs) deuterados (vareniclina d-4 hidroxibupropiona d6 nicotina
d4 cotinina d3 e hidroxicotinina d3) na concentraccedilatildeo de 1 mg L-1 em metanol Cada
uma destas soluccedilotildees foram injetadas separadamente no sistema em um volume de 5 microL
A fase moacutevel utilizada foi constituiacuteda por metanol tampatildeo formiato de amocircnio 001
mol L-1 pH=42 (9010 vv) em um fluxo de 04 mL min-1 e o modo de ionizaccedilatildeo
positiva (ESI+) foi utilizado pois demonstrou ser mais eficiente para ionizar as
moleacuteculas analisadas Essa otimizaccedilatildeo foi obtida utilizando o software Labsolutionsreg
48
466 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatograacutefico multidimensional
Para esta otimizaccedilatildeo foi utilizado um HPLC de dotado de vaacutelvula comutadora
automaacutetica de 6 vias e um injetor automaacutetico de amostras o que permitiu a
automatizaccedilatildeo do processo Ainda o sistema cromatograacutefico foi acoplado a um
espectrocircmetro de massas em tandem (HPLC-MSMS) dotado de um analisador de
massa triplo quadrupolo o qual possui alta sensibilidade e seletividade Incorporou-se
neste sistema uma coluna extratora preenchida com o RAM desenvolvido
O forno foi mantido a 40ordmC e o detector UV operando em um comprimento de
onda de 255 nm A fim de padronizar a anaacutelise foram testadas colunas anaacuteliticas de
diversos tamanhos e composiccedilotildees e variadas proporccedilotildees de fases de moacuteveis
Atraveacutes da anaacutelise do cromatograma foram avaliados o tempo de retenccedilatildeo e
separaccedilatildeo e as aacutereas obtidas dos picos de cada analito O sistema foi utilizado no modo
columns switching na configuraccedilatildeo backflush e as condiccedilotildees da anaacutelise foram
otimizadas como os tempos de exclusatildeo de proteiacutenas de adsorccedilatildeo e eluiccedilatildeo dos
analitos de separaccedilatildeo cromatograacutefica de limpeza da coluna extratora e de
recondicionamento do sistema bem como a composiccedilatildeo das fases moacuteveis de
carregamento de eluiccedilatildeoseparaccedilatildeo e de limpeza
Para a otimizaccedilatildeo dos paracircmetros de anaacutelise foi utilizado um pool de amostras
de soro humano branco em sexplicata Este soro foi dopado com os analitos vareniclina
bupropiona hidroxibupropiona nicotina cotinina e hidroxicotinina em 3 concentraccedilotildees
01 100 e 1000 microg L -1 e com os PIs deuterados na concentraccedilatildeo de 500 microg L -1 Como
o soro eacute uma matriz com alta concentraccedilatildeo de interferentes foram testados pools de
soro branco dopados e injetados sem diluiccedilatildeo diretamente no sistema e diluiacutedos em aacutegua
ultra pura (11) e os perfis analiacuteticos foram entatildeo avaliados
49
467 validaccedilatildeo analiacutetica
Testes para a validaccedilatildeo da anaacutelise otimizada foram realizadas conforme
diretrizes do US Department of Health and Human Services e do Food and Drug
Administration (FDA) 2013 113 Os paracircmetros avaliados foram a seletividade limite
de detecccedilatildeo (LD) limite de quantificaccedilatildeo (LQ) linearidade estabilidade dos analitos
efeito residual e de matriz e recuperaccedilatildeo da extraccedilatildeo
Os ensaios foram realizados em seis repeticcedilotildees (n=6) exceto o ensaio de
recuperaccedilatildeo (n=3) e foi utilizado um pool de amostras de soro branco dopadas com cada
um dos analitos nas concentraccedilotildees de 5 10 20 50 75 100 μg L-1 para vareniclina 1 5
50 250 500 1000 μg L-1 para bupropiona 1 10 100 500 1000 2000 para
hidroxibupropiona 5 10 50 250 500 1000 μg L-1 para nicotina cotinina e
hidroxicotinina Os PIs deuterados foram utilizados na concentraccedilatildeo de 200 μg L-1
47 Anaacutelise estatiacutestica
Em relaccedilatildeo agraves caracteriacutesticas demograacuteficas as variaacuteveis contiacutenuas foram
apresentadas como meacutedia e desvio padratildeo e as categoacutericas como frequecircncias Os testes
Shapiro-Wilk e KolmogorovndashSmirnov foram realizados para verificar a normalidade da
distribuiccedilatildeo das variaacuteveis quantitativas e assim escolher testes parameacutetricos ou natildeo
parameacutetricos Foram realizados os testes Qui-quadrado Exato de Fisher t de Student ou
Mann-Whitney para as anaacutelises comparativas de caracteriacutesticas gerais entre os grupos
de desfecho dos pacientes tanto no ensaio de expressatildeo como de mensuraccedilatildeo dos
analitos Para as anaacutelises de expressatildeo gecircnica o meacutetodo 2-∆∆CT foi utilizado 103 Como os
dados de expressatildeo natildeo apresentaram distribuiccedilatildeo normal foi realizado o teste natildeo
parameacutetrico de Mann-Whitney para testar a hipoacutetese de diferenccedila (valores de 2-∆CT)
intra e entre os grupos de desfechos (sucesso e resistente e tempos de tratamento
50
farmacoloacutegico T0 T2 e T4) Os valores de ∆∆CT (mediana de ∆CTgrupo teste ndash mediana
de ∆CTgrupo referecircncia) foram obtidos para o caacutelculo do fold change O fold-change (2-∆∆CT)
foi calculado para verificar o aumento ou diminuiccedilatildeo de expressatildeo gecircnica entre os
grupos analisados O graacutefico heat map foi construiacutedo atraveacutes do software Gene-globe
(Qiagen USA) para verificar as diferenccedilas no perfil de expressatildeo dos genes estudados
de acordo com os tempos (T0 T2 e T4) e de acordo com a efetividade de tratamento
com vareniclina (sucesso e resistente) O teste de Manny-Whitney foi utilizado para
analisar os niacuteveis de concentraccedilotildees de vareniclina de bupropiona de nicotina e de seus
metaboacutelitos de acordo com os desfechos de tratamento (sucesso e resistente) pois natildeo
apresentaram distribuiccedilatildeo normal A taxa de metabolizaccedilatildeo de nicotina (NRM) foi
calculada pela seguinte foacutermula NMR= trans-3-hidroxicotininacotinina A
hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3- hidroxicotinina
para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros da hidroxicotinina satildeo
irrelevantes 31 32 Os pacientes foram classificados em metabolizadores lentos se
NMRlt031 e normais ou raacutepidos se NMRgt031 Todas as anaacutelises estatiacutesticas foram
realizadas utilizando o software SPSS (versatildeo 20 IBM New York NY) considerando
o niacutevel de significacircncia de P lt005
51
5 RESULTADOS
Este projeto incluiu 105 pacientes sendo 74 tratados com vareniclina e 31
com bupropiona Dos 74 pacientes tratados com vareniclina amostras de 27 pacientes
foram analisadas quanto agrave expressatildeo gecircnica (14 pacientes do grupo de desfecho sucesso
e 13 do grupo resistente) Sendo provenientes destes pacientes 52 amostras ao todo (de
diversos tempos) 9 resistentes do tempo T0 7 resistentes do T2 8 resistente do T4 9
sucessos do T0 8 sucessos do T2 e 11 sucessos do T4 (vide toacutepico 42 Nuacutemero
amostral)
Quanto a mensuraccedilatildeo dos analitos foi desenvolvida uma coluna extratora para a
purificaccedilatildeo da amostra agrave base de nanotubos hiacutedridos de carbono e siacutelica modificados
com a adiccedilatildeo de grupos hidrofiacutelicos (novo RAM) o meacutetodo HPLC-MSMS
multidimensional no modo column switching e na configuraccedilatildeo backflush foi
otimizado e validado Setenta e quatro pacientes tratados com vareniclina e 31 tratados
com bupropiona foram submetidos agrave anaacutelise Apenas 4 amostras das 105 apresentaram
valores abaixo do LQ (3 de pacientes tratados com vareniclina e 1 de paciente tratado
com bupropiona) e estas foram excluiacutedas das anaacutelises dos analitos (vide toacutepico 42
Nuacutemero amostral)
51 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica
511 Dados cliacutenicos e demograacuteficos
As Tabelas 2 e 3 mostram as caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes
selecionados para o ensaio de expressatildeo gecircnica do grupo total e por grupo de desfecho
respectivamente A variaacutevel idade apresentou diferenccedila significativa entre os grupos
resistente e sucesso
52
Tabela 2 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina selecionados para os ensaios de expressatildeo gecircnica (n=27)
Idade (anos) 50 plusmn 13
Gecircnero mulheres () 464
Etnia autodeclarada brancos () 740
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 271 plusmn 50
Cigarrosdia 17 plusmn 7
FTND 62 plusmn 20
FTND ge 6 () 607
Escore Issa ge 3 () 857
Hipertensatildeo () 179
Dislipidemia () 250
Diabetes melito tipo 2 () 107
Depressatildeo () 71
Ansiedade () 286
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash
Fagerstroumlm test for nicotine dependence (escala de 0 a 10
pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
Tabela 3 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina submetidos aos ensaios de expressatildeo gecircnica de acordo com o desfecho
de tratamento
Resistente (n=13) Sucesso (n=14) Valor de P
Idade (anos) 55 plusmn 11 45 plusmn 12 0045
Gecircnero mulheres () 538 357 045
Etnia autodeclarada brancos () 769 786 100
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 271 plusmn 46 273 plusmn 54 092
Cigarrosdia 20 plusmn 6 15 plusmn 6 006
FTND 63 plusmn 22 59 plusmn 19 058
FTND ge 6 () 538 643 070
Escore Issa ge 3 () 846 857 100
Hipertensatildeo () 231 71 033
Dislipidemia () 231 286 100
Diabetes melito tipo 2 () 231 00 010
Depressatildeo () 77 71 100
53
Ansiedade () 308 357 100
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fagerstroumlm test for nicotine
dependence (escala de 0 a 10 pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
512 Dados de expressatildeo gecircnica
Dos 17 genes escolhidos para testar com a resposta ao tratamento apenas 4
apresentaram valores de amplificaccedilatildeo aceitaacuteveis para uma interpretaccedilatildeo de qualidade
mais especificamente valores de CT lt 33 Os valores das expressotildees dos genes (CTs)
foram normalizados atraveacutes das meacutedias de CT dos housekeeping genes para cada
amostra obtendo-se os valores de ∆CT = (CTgene alvo ndash meacutedia CT housekeepings genes) A
Tabela 4 mostra os valores de mediana de ∆CT dos genes analisaacuteveis de acordo com os
tempos de tratamento e grupos de desfecho
Tabela 4 - Valores de mediana de ∆CT dos genes de acordo com os tempos de
tratamento e grupos de desfecho
∆CT = (CTgene alvo ndash meacutedia CThousekeepings genes) T0= Tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico
T2= Duas semanas apoacutes o iacutenicio do tratamento farmacoloacutegico T4= Quatro semanas apoacutes o iniacutecio do
tratamento farmacoloacutegico IC 95 = Intervalo de confianccedila de 95
Resistente T0 Resistente T2 Resistente T4
∆CT IC 95 ∆CT IC 95 ∆CT IC 95
CHRNA5 818 (732 ndash 870) 845 (748 ndash 887) 767 (727 ndash 905)
CHRNA7 662 (617 ndash 697) 802 (707 ndash 848) 719 (696 ndash 786)
CHRNG 620 (579 ndash 695) 647 (601 ndash 668) 663 (602 ndash 702)
COMT 467 (440ndash 501) 480 (443 ndash 503) 487 (452 ndash 524)
Sucesso T0 Sucesso T2 Sucesso T4
∆CT IC 95 ∆CT IC 95 ∆CT IC 95
CHRNA5 832 (738 ndash 917) 707 (653 ndash 896) 837 (754 ndash 882)
CHRNA7 726 (611 ndash 842) 704 (640 ndash 779) 738 (676 ndash 820)
CHRNG 682 (619 ndash 774) 683 (656 ndash 733) 659 (625 ndash 703)
COMT 488 (430 ndash 511) 458 (433 -515) 481 (448 ndash 516)
54
513 Anaacutelise de associaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica entre os desfechos e os tempos de
tratamento
A Tabela 5 mostra o fold change e anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos de
tempos de tratamento e grupos de desfecho Foi observada diferenccedila significativa para a
expressatildeo do gene CHRNA7 no grupo resistente amostras dos tempos T2 e T4
apresentaram menor expressatildeo comparadas com amostras do T0 (fold change 038
P=0007 fold change 067 P=0004 respectivamente) Para a expressatildeo do gene
CHRNG amostras do grupo sucesso mostraram menor expressatildeo comparadas com
amostras do grupo resistente no tempo T2 (fold change= 077 P=0006)
Tabela 5 - Fold change e anaacutelise de associaccedilatildeo entre os tempos de tratamento e
grupos de desfecho
Resistente T2 vs T0 Resistente T4 vs T0 Resistente T4 vs T2
Genes 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P
CHRNA5 083 (034 ndash 233) 057 142 (030 ndash 269) 095 172 (034 ndash 303) 089
CHRNA7 038 (020 ndash 093) 0007 067 (031 ndash 101) 0004 178 (058 ndash 287) 037
CHRNG 083 (054 ndash 192) 037 074 (043 ndash 190) 044 090 (050 ndash 158) 036
COMT 091 (065 ndash 149) 092 087 (056 ndash 140) 063 095 (057 ndash 142) 073
Sucesso T2 vs T0 Sucesso T4 vs T0 Sucesso T4 vs T2
Genes 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P
CHRNA5 238 (033 ndash 623) 037 097 (037 ndash 310) 061 041 (020 ndash 268) 069
CHRNA7 116 (031 ndash 406) 064 092 (023 ndash 316) 091 079 (029 ndash 204) 055
CHRNG 099 (045 ndash 227) 049 117 (056 ndash 281) 062 118 (072 ndash 211) 033
COMT 123 (055 ndash 172) 092 105 (055 ndash 155) 068 085 (056 ndash 159) 041
Sucesso vs resistente T0 Sucesso vs resistente T2 Sucesso vs resistente T4
Genes 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P
CHRNA5 091 (028 ndash 250) 075 260 (036 ndash 506) 047 062 (034 ndash 285) 085
CHRNA7 064 (021 ndash 182) 013 197 (061 ndash 423) 009 088 (042 ndash 214) 074
CHRNG 065 (026 ndash 169) 012 077 (040 ndash 109) 0006 103 (050 ndash 171) 079
55
T0= Tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico T2= Duas semanas apoacutes o iacutenicio do tratamento
farmacoloacutegico T4= Quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico 2-∆∆CT = Fold change (diferenccedila de
expressatildeo) P valor (anaacutelise de associaccedilatildeo entre as medianas de 2-∆CT dos grupos) IC 95 = Intervalo de confianccedila
de 95
As Figura 14 e 15 mostram graacuteficos de barras das diferenccedilas de expressatildeo dos
genes CHRNA7 e CHRNG entre os tempos de tratamento e desfecho respectivamente
O heat map (Figura 16) mostra que natildeo houve diferenciaccedilatildeo nos perfis de expressatildeo
gecircnica em uma anaacutelise conjunta dos genes de acordo com os desfechos e tempos de
tratamento
Devido agrave diferenccedila significativa nas meacutedias de idade entre os grupos sucesso e
resistente foi realizada regressatildeo linear multipla na anaacutelise de expressatildeo dos quatro
genes analisaacuteveis A regressatildeo foi ajustada por idade e tambeacutem gecircnero e cigarros por
dia No entanto os resultados de expressatildeo dos genes natildeo foram impactados por estas
covariaacuteveis
COMT 086 (061 ndash 164) 090 116 (061 ndash 162) 049 104 (064 ndash 169) 093
56
Figura 14 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNA7 entre os tempos de tratamento e desfecho A Anaacutelise intragrupo do
desfecho resistente B Anaacutelise intragrupo do desfecho sucesso T0= tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico T2= duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico T4= quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico P= 0007
(resistente T2 vs T0 fold change de 038) P=0004 (resistente T4 vs T0 fold change de 067) Valor de P (anaacuteliacutese de
associaccedilatildeo entre as medianas de 2-∆CT dos grupos em uma comparaccedilatildeo dois a dois) Fonte do autor
57
Figura 15 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNG entre os tempos de tratamento e desfecho A Anaacutelise intragrupo do
desfecho resistente B Anaacutelise intragrupo do desfecho sucesso T0= tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico T2= duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico T4= quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico P= 0006
(sucesso vs resistente T2 fold change de 077) Valor de P (anaacuteliacutese de associaccedilatildeo entre as medianas de 2-∆CT dos grupos em uma
comparaccedilatildeo dois a dois) Fonte do autor
58
Figura 16 - Heat map de expressatildeo gecircnica A figura mostra a magnitude de expressatildeo gecircnica entre os grupos A cor mais clara
(verde) nos indica menor expressatildeo e a cor mais escura (vermelho) indica maior expressatildeoT0= tempo inicial antes do tratamento
farmacoloacutegico T2= duas semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico T4= quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento
farmacoloacutegico Fonte do autor gerada pelo software Gene Globe QIAGENreg
52 Mensuraccedilatildeo dos analitos
521 Caracterizaccedilatildeo da coluna teste exclusatildeo de proteiacutenas e interferentes da
matriz
Em relaccedilatildeo ao teste de capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas o pico de BSA sem
e com a nova coluna extratora apresentou tempo de retenccedilatildeo semelhante no entando a
aacuterea da curva do BSA na presenccedila do novo RAM foi bem menor do que na sua
ausecircncia conforme a Figura 17 A reduccedilatildeo de proteiacutenas (da soluccedilatildeo de BSA) pela
coluna foi de aproximadamente 98 e nas amostras de pools soro diluiacutedas (14) a
remoccedilatildeo foi de 99 (Figura 18)
A Figura 19 mostra a influecircncia do pH (escala de de 22 a 70) na exclusatildeo de
proteiacutenas fato que estaacute diretamente relacionado com a estrutura fiacutesico-quiacutemica do
RAM Diferentes pHs influenciaram na taxa de exclusatildeo de proteiacutenas esse
comportamento pode ser explicado devido agrave interaccedilotildees eletrostaacuteticas do novo RAM
com as proteiacutenas Valores de pH menores que o do ponto isoeleacutetrico das proteiacutenas
59
podem promover a prevalecircncia de proteiacutenas carregadas positivamente enquanto que
valores de pH superiores podem promover proteiacutenas carregadas negativamente 114
Dessa forma acredita-se que o comportamento de exclusatildeo de proteiacutenas do novo
material eacute semelhante ao descrito em outros estudos 108 109 115 116
Figura 17 - Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com soluccedilatildeo de BSA Graacuteficos obtidos apoacutes injeccedilatildeo de 10 microL de uma soluccedilatildeo aquosa de BSA (44 mg mL-1) no
sistema sem coluna (A) e com coluna extratora (B) A - aacuterea do pico 10142590 B - aacuterea
do pico 9713614 Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF
Unifal-MG
Figura 18 - Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com amostra de soro
diluiacuteda Graacuteficos obtidos apoacutes injeccedilatildeo de 100 microL de soro diluiacutedo em aacutegua ultra pura
(14 vv) no sistema sem coluna (A) e com coluna extratora (B) A aacuterea do pico
53981550 B - aacuterea do pico 53552824 Fonte do autor e do colaborador DrHenrique
Dipe de Faria LATF Unifal-MG
60
Figura 19 - Influecircncia do pH na exclusatildeo de proteiacutenas Fonte do autor e do colaborador Dr
Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
522 Otimizaccedilatildeo dos paracircmetros espectromeacutetricos
No processo de otimizaccedilatildeo das condiccedilotildees espectromeacutetricas foi adotado o modo
de ionizaccedilatildeo positivo (ESI+) isto eacute a ionizaccedilatildeo promove a protonaccedilatildeo (adiccedilatildeo de H+)
dos analitos e de seus fragmentos As energias de colisatildeo ideais e as muacuteltiplas transiccedilotildees
de monitoramento de reaccedilatildeo (MRM) foram otimizadas para cada analito separadamente
vide valores de energia de colisatildeo e fragmentos obtidos jaacute mostrados na Tabela 1 (no
toacutepico 461) A presenccedila de 3 fragmentos de cada analito foi necessaacuteria para a
identicaccedilatildeo qualitativa e a quantificaccedilatildeo foi dependente da concentraccedilatildeo do fragmento
mais abundante
As seguintes temperaturas foram utilizadas 40ordmC para o forno da coluna 250ordmC
para a linha de dessolvataccedilatildeo e 400ordmC para o bloco de aquecimento Foram utilizadas as
taxas de 20 ml min-1 de fluxo de gaacutes de nebulizaccedilatildeo e 150 ml min-1 de fluxo de gaacutes
para a secagem
61
523 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatrograacutefico multidimensional
Quanto a composiccedilatildeo e proporccedilatildeo da fase moacutevel responsaacutevel pela eluiccedilatildeo
separaccedilatildeo e ionizaccedilatildeo dos analitos (fase moacutevel de eluiccedilatildeo) testes foram realizados com
os solventes orgacircnicos acetonitrila ou metanol combinados com o tampatildeo formiato de
amocircnio 10 mM em diferentes pHs com proporccedilotildees que variaram de 973 vv a 7525
vv (fase orgacircnica fase aquosa) Os solventes orgacircnicos utilizados satildeo menos viscosos
em relaccedilatildeo agrave aacutegua por isso fluem mais facilmente no sistema e por serem volaacuteteis
favorecem tambeacutem a ionizaccedilatildeo dos analitos e evaporaccedilatildeo do solvente A fase moacutevel que
apresentou melhores resultados foi a composiccedilatildeo de metanol formiato de amocircnio 001
mol L-1 pH 42 (9010 vv)
Variados tipos de colunas analiacuteticas foram testadas sendo elas A NSTreg (150
mm 46 mm e 5 microm) a ACEreg (150 mm x 46 mm x 5 microm) a Phenomenexreg (250 x 46
mm x 5 microm) e a Atlantis T3 e da Watersreg (100 mm x 21 mm x 3 microm) (comprimento x
diacircmetro interno x tamanho de partiacutecula) no entanto essas colunas aumentaram o
tempo de retenccedilatildeo dos analitos pioraram o perfil cromatograacutefico gerando picos largos e
fragmentados Portanto os testes foram realizados com uma nova coluna analiacutetica a
ACEreg C18 (100 mm x 21 mm x 3 microm comprimento diacircmetro interno e tamanho de
partiacutecula) com preacute-coluna ACEreg C18 (21mm x 3 microm diacircmetro tamanho de partiacutecula)
obtendo-se um menor tempo de anaacutelise (maior frequecircncia analiacutetica) e melhor perfil
cromatograacutefico (picos simeacutetricos) para os analitos
Trecircs volumes de injeccedilatildeo de amostra foram testados (5 10 e 100 microL) devido a
baixa concentraccedilatildeo dos analitos foi adotada a maior quantidade (100 μL) pois forneceu
melhores sinais analiacuteticos Tambeacutem foi avaliado o uso do pool de soro sem diluiccedilatildeo e
diluiacutedo (11 vv) os perfis cromatograacuteficos de ambos foram oacutetimos no entanto
62
escolheu-se trabalhar com a amostra diluiacuteda para diminuir a presenccedila de interferentes e
consequentemente diminuir efeito matriz e aumentar o tempo de durabilidade da coluna
analiacutetica
Jaacute obtidas as melhores condiccedilotildees espectromeacutetricas e cromatograacuteficas foi
otimizado o sistema columm switching na configuraccedilatildeo de backflush o qual apresenta
trecircs eventos como mostrado na Figura 20
Figura 20 - Ilustraccedilatildeo do sistema de columm switching na configuraccedilatildeo de backflush Na posiccedilatildeo 1
correspondente ao evento 1 ocorre exclusatildeo dos interferentes e adsorccedilatildeo dos analitos a coluna extratora Na
posiccedilatildeo 2 durante o evento 2 ocorre a eluiccedilatildeo dos analitos adsorvidos No retorno para a posiccedilatildeo 1
correspondente ao evento 3 ocorre limpeza da coluna extratora separaccedilatildeo e detecccedilatildeo dos analitos e por fim
o recondicionamento do sistema BA = bomba A BB = bomba B BC = bomba C MS = espectrocircmetro de
massas UV = detector UV e W = descarte Fonte Traduzido de (De Faria et al 2017)
Com as vaacutelvulas do sistema na posiccedilatildeo 1 (evento 1) a bomba A promoveu a
liberaccedilatildeo da fase moacutevel de carregamento (aacutegua ultra pura) em um fluxo de 04 mL min-1 O
tempo de 3 minutos foi o necessaacuterio para a adsorccedilatildeo dos analitos e sua preacute-concentraccedilatildeo
aleacutem da eliminaccedilatildeo de macromoleacuteculas A aacutegua mostrou ser um solvente oacutetimo como fase
moacutevel de carregamento aleacutem de ser um recurso barato e natildeo causar danos ao meio
ambiente De forma simultacircnea a fase moacutevel de eluiccedilatildeo fornecida pela bomba C passa
para a coluna analiacutetica de forma a condionaacute-la ainda na ausecircncia dos analitos Ambas as
bombas operaram com uma taxa de fluxo inicial de 04 mL min -1
63
Na posiccedilatildeo 2 da vaacutelvula (evento 2) a bomba C liberou a fase moacutevel de eluiccedilatildeo
(metanol formiato de amocircnio 001 mol L-1 pH 42 (9010 vv) em direccedilatildeo agrave coluna
analiacutetica em fluxo contraacuterio ao que a fase moacutevel de carregamento percorreu (backflush) A
velocidade do fluxo da bomba C foi aumentada para 08 mL min -1 e o tempo determinado
para esta etapa foi de 03 minutos o qual promoveu um oacutetimo perfil cromatograacutefico dos
analitos
No evento 3 as vaacutelvulas foram colocadas na posiccedilatildeo 1 novamente A fase moacutevel
de eluiccedilatildeo (vinda da bomba C) novamente com um fluxo de 04 mL min-1 passou pela
coluna analiacutetica promovendo a separaccedilatildeo dos analitos e sua chegada no detector de
massas De forma simultacircnea a bomba B em um fluxo de 10 mL min -1 liberou a fase
moacutevel de limpeza (acetonitrila aacutegua ultra pura isopropanol 751510 vvv) a qual
passou pela coluna extratora (RAM) promovendo a remoccedilatildeo de resiacuteduos proveniente da
anaacutelise anterior tornando-a pronta para a reutilizaccedilatildeo em uma nova anaacutelise A fase de
limpeza ocorreu no tempo de 33 a 10 min O recondionamento do sistema agraves condiccedilotildees
iniciais de anaacutelise ocorreu nos uacuteltimos 5 min em que a fase moacutevel de limpeza foi
substituiacuteda pela fase moacutevel de carregamento O tempo total para cada anaacutelise foi de 15
minutos
Para a avaliaccedilatildeo da capacidade da fase moacutevel de limpeza (acetonitrila aacutegua
ultra pura isopropanol 751510 vvv) pools de soro branco dopado na maior
concentraccedilatildeo foram injetados no sistema (com a posiccedilatildeo 1 das vaacutelvulas mantida) e apoacutes
a realizaccedilatildeo da fase de limpeza foram injetados pools de soro branco diluiacutedos (11 vv)
O experimento foi realizado em triplicata O cromatograma do soro branco natildeo
apresentou sinal analiacutetico no mesmo tempo de retenccedilatildeo dos analitos o que mostra que a
fase moacutevel de limpeza foi eficiente em seu propoacutesito evitando o chamado efeito
residual (carry-over) De Faria et al 110
64
524 Validaccedilatildeo analiacutetica
Para os testes de validaccedilatildeo foram utilizados pools de amostras de soro branco
dopadas com cada um dos analitos nas concentraccedilotildees conforme o toacutepico 467
concentraccedilotildees menores foram utilizadas no entanto essas natildeo apresentaram bons sinais
analiacuteticos precisatildeo e exatidatildeo Os resultados dos testes de validaccedilatildeo estatildeo demonstrados
na Tabela 6
O teste de linearidade foi expresso como coeficiente de determinaccedilatildeo (r2)
calculado a partir das curvas de calibraccedilatildeo intra-ensaio Para esse teste foram utilizados
os analitos em diferentes concentraccedilotildees em soro branco conforme jaacute citado as
repeticcedilotildees geraram 6 curvas de calibraccedilatildeo para cada analito Os intervalos lineares
foram baseados nos intervalos terapecircuticos 51 117 118
As mesmas concentraccedilotildees dos analitos em soro no ensaio de linearidade foram
utilizadas no ensaio dos LD e LQ Estes foram calculados atraveacutes das 6 curvas de
calibraccedilatildeo e foram definidos como 3 e 10 vezes a relaccedilatildeo sinalruiacutedo respectivamente
para o LD e LQ
Para avaliar a precisatildeo e a exatidatildeo intra e inter-ensaios foram realizados 6
repeticcedilotildees de concentraccedilotildees de calibraccedilatildeo dos analitos Os testes intra-ensaio foram
realizados no mesmo dia e os testes inter-ensaios foram realizados em dias diferentes A
exatidatildeo foi calculada atraveacutes do erro relatico (E) e a precisatildeo atraveacutes do desvio
padratildeo relativo (RSD)
No teste de seletividade foi avaliado se houve a presenccedila picos de interferentes
nos mesmos tempos de retenccedilatildeo dos analitos e dos PIs deuterados As Figuras 21 e 22
mostram os cromatogramas obtidos apoacutes a injeccedilatildeo de soro branco e de soro dopado com
os analitos respectivamente mostrando que natildeo houve a presenccedila de interferentes nos
tempos de retenccedilatildeo dos analitos e PIs deuterados
65
Figura 21 - Cromatograma obtido de amostras de soro branco diluiacutedas em aacutegua ultra pura
Volume de injeccedilatildeo = 100 microL A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz 240rarr mz 131) C-
Hidroxibup (mz 256rarr mz 238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz 80) F-
Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G- Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr mz
244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz 134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz 196rarr
mz 80) Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
Figura 22 - Cromatograma obtido apoacutes anaacutelise de soro diluiacutedo e dopado com os analitos no niacutevel
meacutedio de calibraccedilatildeo e mais os padrotildees internos deuterados A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz
240rarr mz 131) C- Hidroxibup (mz 256rarr mz 238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz
80) F- Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G- Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr
mz 244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz 134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz 196rarr
mz 80) Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
Foram realizados os testes de estabilidade de bancada longo prazo e de
congelamento e descongelamento Para a anaacutelise de estabilidade de bancada soluccedilotildees de
soro dopada com os analitos foram analisadas imediatamente apoacutes a sua preparaccedilatildeo e
apoacutes 4 e 24 horas verificando assim a estabilidade da amostra a curto prazo Para uma
66
anaacutelise a longo prazo as amostras foram armazenadas a -20degC por 30 dias e apoacutes foram
avaliadas Quanto anaacutelises de congelamento e descongelamento foram realizados 3
ciclos de congelamento -20degC e posterior descongelamento e as amostras foram
avaliadas
O ensaio de recuperaccedilatildeo da extraccedilatildeo foi realizado em triplicata A anaacutelise
avaliou a recuperaccedilatildeo relativa comparando-se a extraccedilatildeo dos analitos a partir da matriz
de soro com a de aacutegua atraveacutes da passagem da amostra pela coluna de extraccedilatildeo (RAM)
A recuperaccedilatildeo relativa se daacute pela relaccedilatildeo das concentraccedilotildees nas duas matrizes
(concentraccedilatildeo no soro concentraccedilatildeo na aacutegua) x 100
O efeito residual (carry-over) foi avaliado injetando-se uma amostra de soro
branco antes de uma amostra de soro dopado na maior concentraccedilatildeo e apoacutes foi injetada
novamente uma amostra de soro branco foram inferior a 20 daqueles obtidos no LQ
Para avaliar o efeito matriz foram comparados os resultados da anaacutelise das
amostras de soro dopadas com os analitos em diferentes concentraccedilotildees em matrizes
diferentes (aacutegua e soro) O resultado para ser aceito precisava ser inferior a 15
Posteriormente foi realizada a mensuraccedilatildeo dos analitos em amostras reais de
soro provenientes de pacientes submetidos ao tratamento antitabagismo com doses
conforme bula As Figuras 23 e 24 mostram os cromatogramas de amostras de pacientes
submetidos ao tratamento com bupropiona e vareniclina respectivamente No momento
da coleta das amostras os pacientes estavam fumando e aleacutem de apresentarem os
analitos provenientes dos faacutermacos tambeacutem mostraram a presenccedila de analitos
provenientes da nicotina
67
Figura 23 - Cromatograma obtido atraveacutes da anaacutelise das amostras de soro dos pacientes
tratados com bupropiona (150 mg 2xdia) Os pacientes estavam fumando em torno de 10
cigarrosdia no dia da coleta A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz 240rarr mz 131) C-
hidroxibup (mz 256rarr mz 238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz 80) F-
Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G- Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr mz
244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz 134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz
196rarr mz 80) Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
Figura 24 - Cromatograma obtido atraveacutes da analise de amostras de soro de pacientes tratados
com vareniclina (10 mg 2xdia) Os pacientes fumavam em torno de 10 cigarrosdia no dia da
coleta A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz 240rarr mz 131) C- hidroxibup (mz 256rarr mz
238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz 80) F- Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G-
Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr mz 244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz
134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz 196rarr mz 80) Fonte do autor e do
colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
68
Tabela 6 - Paracircmetros de validaccedilatildeo obtidos na determinaccedilatildeo de faacutermacos antitabagismo em soro humano
Meacutedia plusmn Desvio padratildeo (n=6) amenor bmeacutedio e calto niacutevel de calibraccedilatildeo 1Estabilidade de bancada (4 a 24 horas) Precisatildeo RSD = [Desvio padratildeomeacutedia] x 100 E = [(Meacutedia experimental da
concentraccedilatildeo Concentraccedilatildeo nominal) x 100] ndash 100 2Efeito matriz E= [(Meacutedia da concentraccedilatildeo experimental no solventeMeacutedia experimental da concentraccedilatildeo no soro) x 100] ndash 100
Paracircmetros de validaccedilatildeo Vareniclina Bupropiona Hidroxibupropiona Nicotina Cotinina Hidroxicotinina
Intervalo linear (microg L-1) 5-100 1-1000 1-2000 5-1000 5-1000 5-1000
r2 ( n=6) 09952 09998 09998 09997 09998 09999
Decliacutenio (α) ( n=6) 00196plusmn 00095 00045plusmn00059 00051plusmn00057 00087plusmn00012 00073plusmn00048 00075plusmn00074
Intercepto ( n=6) -00316plusmn00004 -00022plusmn00020 00230plusmn00025 -00046plusmn00065 00767plusmn00012 01918plusmn00013
Tempo de retenccedilatildeo (min) 521 501 485 497 446 441
LD (microg L-1) 25 07 06 19 24 37
LQ (microg L-1) 50 10 10 50 50 50
Precisatildeo intra-ensaio RSD ( n=6) 93a
30a
100c
153a
37b
21c
140a
06b
06c
90a
26b
11c
117a
34b
61c
128a
138b
92c
Precisatildeo inter-ensaio RSD ( n=18 trecircs dias) 185a
115b
66c
82a
27b
20c
109a
17b
10c
83a
27b
14c
158a
41b
31c
161a
44b
92c
Acuraacutecia intra-ensaio E ( n=6) 196a
54b
-30c
-55a
-24b
-11c
-65a
19b
-04c
158a
09b
-26c
-87a
47b
-24c
71a
18b
05c
Acuraacutecia inter-ensaio E ( n=18 trecircs dias) 82a
-16b
035c
41a
-01b
-01c
-87a
27b
-20c
146a
40b
018c
-120a
25b
-110c
58a
-35b
30c
Recuperaccedilatildeo da extraccedilatildeo ( n=3) 883a
1104b
1014c
1101a
1009b
1028c
945a
1094b
1078c
1098a
1088b
1146c
941a
1093b
1116c
1167a
1112b
1141c
Estabilidade1 E
( n=6)
98a
11b
-50c
71a
-32b
-38c
140a
-16b
-79c
40a
-79b
-110c
-132a
-94b
-32c
86a
125b
-54c
Efeito matriz2 E
( n=6)
-117a
104b
14c
101a
09b
28c
-55a
94b
78c
98a
88b
146c
-59a
93b
116c
167a
112b
141c
69
525 Dados cliacutenicos e demograacuteficos dos pacientes submetidos a mensuraccedilatildeo dos
analitos
As Tabelas 7 a 10 mostram as caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos
pacientes submetidos agraves anaacutelises de concentraccedilatildeo dos analitos
As Tabelas 7 e 8 referem-se aos pacientes tratados com vareniclina sendo
considerado o grupo total e os grupos de desfecho respectivamente Os pacientes do
grupo resistente agrave vareniclina fumavam um maior nuacutemero de cigarrosdia (antes do
tratamento) em comparaccedilatildeo com os pacientes que obtiveram sucesso (21 vs 17
cigarrosdia P= 005)
As Tabelas 9 e 10 referem-se aos pacientes tratados com bupropiona no grupo
total e de acordo com desfecho respectivamente O grupo resistente ao tratamento com
bupropiona apresentou maior frequecircncia de pacientes com alta DN (atraveacutes dos escores
FTND e Issa categorizados) e de pacientes que fumavam no dia da coleta em
comparaccedilatildeo ao grupo sucesso (FTNDge6= 833 vs 429 P= 005 Escore Issage3=
1000 vs 429 P= 0001 fumo no dia da coleta= 1000 vs 429 P= 0001
respectivamente)
Tabela 7 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos (n= 74)
Idade (anos) 51 plusmn 12
Gecircnero mulheres () 500
Etnia autodeclarada brancos () 730
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 263 plusmn 49
10 1 4 1
7 1 3 1
8 1 3 1
9 1 3 1
8 1 4 1
5 0 3 1
8 1 4 1
8 1 4 1
7 1 4 1
7 1 3 1
9 1 3 1
7 1 4 1
Cigarrosdia inicial 19 plusmn 10
Fumo no dia da coleta () 919
FTND 62 plusmn 23
FTND ge 6 () 644
70
Escore Issa ge 3 () 851
Hipertensatildeo () 311
Dislipidemia () 392
Diabetes melito tipo 2 () 95
Depressatildeo () 135
Ansiedade () 176
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash
Fagerstroumlm test for nicotine dependence (escala de 0 a 10 pontos)
Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala de 0 a 4
pontos)
Tabela 8 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com o
desfecho de tratamento
Resistente (n=41) Sucesso (n=33) P valor
Idade (anos) 53 plusmn 11 49 plusmn 13 023
Gecircnero mulheres () 561 424 024
Etnia autodeclarada brancos () 683 788 031
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 270 plusmn 40 255 plusmn 58 028
Cigarrosdia 21 plusmn 11 17 plusmn 7 005
Fumo no dia da coleta () 976 848 008
FTND 65 plusmn 22 57 plusmn 23 019
FTND ge 6 () 659 625 077
Escore Issa ge 3 () 829 879 075
Hipertensatildeo () 390 212 010
Dislipidemia () 341 455 032
Diabetes melito tipo 2 () 73 121 069
Depressatildeo () 122 152 071
Ansiedade () 146 212 046
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fagerstroumlm test for nicotine
dependence (escala de 0 a 10 pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
71
Tabela 9 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos (n= 31)
Idade (anos) 52 plusmn 11
Gecircnero mulheres () 71
Etnia autodeclarada brancos () 931
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 258 plusmn 57
Cigarrosdia inicial 21 plusmn 7
Fumo no dia da coleta () 871
FTND 68 plusmn 21
FTND ge 6 () 742
Escore Issa ge 3 () 871
Hipertensatildeo () 226
Dislipidemia () 323
Diabetes melito tipo 2 () 32
Depressatildeo () 65
Ansiedade () 194
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash
Fagerstroumlm test for nicotine dependence (escala de 0 a 10
pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
Tabela 10 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com
o desfecho de tratamento
Resistente (n=24) Sucesso (n=7) Valor de P
Idade (anos) 53 plusmn 11 50 plusmn 11 054
Gecircnero mulheres () 708 714 100
Etnia autodeclarada brancos () 957 833 038
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 252 plusmn 61 278 plusmn 35 015
Cigarrosdia 21 plusmn 7 23 plusmn 7 071
Fumo no dia da coleta () 1000 429 0001
FTND 73 plusmn 15 54 plusmn 32 011
FTND ge 6 () 833 429 005
Escore Issa ge 3 () 1000 429 0001
Hipertensatildeo () 292 00 016
72
Dislipidemia () 375 143 038
Diabetes melito tipo 2 () 42 00 100
Depressatildeo () 83 00 100
Ansiedade () 250 00 029
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fagerstroumlm test for nicotine
dependence (escala de 0 a 10 pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
526 Anaacutelise de associaccedilatildeo dos analitos com desfecho de tratamento
A Tabela 11 mostra a frequecircncia do desfecho de tratamento de acordo com os
medicamentos antitabagismo pacientes estes cujas amostras de soro foram submetidas agrave
mensuraccedilatildeo dos analitos
Tabela 11 ndash Frequecircncia do desfecho de tratamento nos pacientes submetidos agraves
anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com os medicamentos
antitabagismo
Medicamento Resistente () Sucesso ()
Vareniclina (n=74) 544 446
Bupropiona (n=31) 774 226
As Tabelas de 12 a 15 mostram as concentraccedilotildees dos analitos nas amostras de
soro dos pacientes tratados com vareniclina e bupropiona no grupo total e de acordo
com o desfecho de tratamento
Os pacientes do grupo resistente tanto os pacientes tratados com vareniclina
(Tabela 13) quanto com bupropiona (Tabela 15) apresentaram concentraccedilatildeo
significativamente maior de cotinina e hidroxicotinina do que os grupos sucesso
(tratamento com vareniclina cotinina= 1182 vs 706 μgL P= 0009 hidroxicotinina=
845 vs 516 μgL P= 002 Tratamento com bupropiona cotinina= 1346 vs 160 μgL
P= 0005 hidroxicotinina= 972 vs 374 μgL P= 0004) No entanto quanto ao NMR
natildeo houve diferenccedila entre os desfechos de tratamento de ambos os faacutermacos Aleacutem
73
disso somente o grupo de pacientes tratados com vareniclina continha pacientes com
NMRlt031 (metabolizadores lentos para nicotina) e ainda sua frequecircncia foi baixa
(100 e 43 para os grupos de desfecho resistente e sucesso respectivamente)
Tabela 12 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos pacientes tratados
com vareniclina
Vareniclina μgL n=71 83 (81 ndash 95)
Nicotina μgL n=31 75 (76 ndash 112)
Cotinina μgL n=65 1007 (923 ndash 1225)
Hidroxicotinina μgL n=65 681 (638 ndash 874)
NMR n=63 069 (067 ndash 102)
NMR lt031 () n=63 79
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de
95) NMR=trans-3-hidroxicotininacotinina NMR lt031=
metabolizador lento NMR ge031= metabolizador normal e raacutepido A
hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo
trans-3- hidroxicotinina para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade
de outros isocircmeros satildeo irrelevantes
Tabela 13 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de tratamento
com vareniclina
Resistente Sucesso P
valor Vareniclina μgL n=71 84 (78 ndash 99) 83 (77 ndash 97) 096
Nicotina μgL n=31 83 (74 ndash 127) 70 (59 ndash 105) 032
Cotinina μgL n=65 1182 (1012 ndash 1426)
111114143ndash
1421426)
706 (643 ndash 1037) 0009
Hidroxicotinina μgL n=65 845 (702 ndash 1032) 516 (434 ndash 721) 002
NMR n=63 074 (062 ndash 107) 061 (055 ndash 113) 064
NMR lt031 () n=63 100 43 064
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de 95) NMR=trans-3-
hidroxicotininacotinina NMR lt031= metabolizador lento NMR ge031= metabolizador normal e
raacutepido A hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3- hidroxicotinina
para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros satildeo irrelevantes
74
Tabela 14 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos pacientes tratados
com bupropiona
Bupropiona μgL n=30 369 (332 ndash 493)
Hidroxibupropiona μgL n=23 7368 (5860 ndash 7824)
Nicotina μgL n=13 71 (62 ndash 109)
Cotinina μgL n=27 1159 (971 ndash 1648)
Hidroxicotinina μgL n=28 931 (838 ndash 1387)
NMR n=27 090 (074 ndash 149)
NMR lt031 () n=27 0
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de 95) NMR=
trans-3-hidroxicotininacotinina NMR lt031= metabolizador lento NMR
ge031= metabolizador normal e raacutepido Natildeo houve pacientes com NRM lt031 A
hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3-
hidroxicotinina para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros
satildeo irrelevantes
Tabela 15 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de tratamento
com bupropiona
Resistente Sucesso P
valor Bupropiona μgL n=30 372 (331 ndash 533) 300 (214 ndash 481) 048
Hidroxibupropiona μgL n=23 7795 (6078 ndash 8308) 5128 (2957 ndash 8195) 012
Nicotina μgL n=13 71 (62 ndash 109) - -
Cotinina μgL n=27 1346 (1097 ndash 1784) 160 (-195 ndash 712) 0005
Hidroxicotinina μgL n=28 972 (929 ndash 1520) 374 (33 ndash 847) 0004
NMR n=27 084 (076 ndash 109) 132 (-371 ndash 884) 014
NMR lt031 () n=27 0 0 -
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de 95) NMR= trans-3-
hidroxicotininacotinina NMR lt031= metabolizador lento NMR ge031= metabolizador normal e raacutepido
No grupo sucesso somente 1 paciente apresentou concentraccedilatildeo de nicotina Natildeo houve pacientes com NRM
lt031 A hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3- hidroxicotinina para o
caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros satildeo irrelevantes
75
6 DISCUSSAtildeO
61 Para os dados da anaacutelise de expressatildeo gecircnica
O presente estudo cliacutenico e exploratoacuterio identificou resultados significativos para
expressatildeo dos genes CHRNA7 e CHRNG de acordo com os tempos de coleta e o
desfecho de tratamento com vareniclina Amostras do grupo resistente nos tempos T2 e
T4 isto eacute jaacute com o uso da vareniclina apresentaram menores niacuteveis de expressatildeo
gecircnica do CHRNA7 comparado agraves amostras do T0 (antes de iniciar o tratamento
farmacoloacutegico) Estes resultados sugerem que o downregulation de α7 pode ter sido
responsaacutevel pela natildeo cessaccedilatildeo do fumo nos indiviacuteduos do grupo resistente o que natildeo foi
observado nas amostras do grupo sucesso
O gene CHRNA7 codifica a subunidade α7 dos nAChRs Esta possui grande
importacircncia estaacute presente em diversos tecidos e possui associaccedilatildeo consistente em
vaacuterios estudos com o processo de dependecircncia agrave nicotina processos cognitivos e
imunoloacutegicos 119-124 Estudos tambeacutem mostraram que haacute um locus contendo duplicaccedilatildeo
do gene CHRNA7 truncada composta pelos exons 5-10 do gene CHRNA7 precidida de
4 exons uacutenicos e uma deleccedilatildeo de dois pares de bases no eacutexon 6 o qual nomearam como
CHRNFAN7 A maioria dos indiviacuteduos possui uma ou duas coacutepias deste gene e satildeo
raros os casos em que esta coacutepia natildeo estaacute presente 125 126
No ceacuterebro de ratos Sprague-Dawley Ryan e Loiacono 119 detectaram niacuteveis de
α7 transcritos em diversos locais como na substacircncia negra compacta (SNpc) na
substacircncia negra reticular (SNpr) na aacuterea tegmental ventral (VTA) no coacutertex e no
hipocampo Os ratos submetidos ao tratamento crocircnico com nicotina mostraram maiores
niacuteveis de mRNA da subunidade α7 em SNpc SNpr e VTA em comparaccedilatildeo ao grupo
controle A VTA faz parte do sistema de recompensa mesoliacutembico o qual eacute muito
estudado nos processos de ND 12 15 No presente estudo (em amostras de PBMC) o
76
grupo de pacientes resistentes tambeacutem apresentou maior expressatildeo de α7 no momento
em que somente a nicotina estava presente no fumo crocircnico Ao introduzir a vareniclina
as expressotildees foram diminuiacutedas nos tempos T2 e T4 provavelmente devido ao
antagonismo competitivo da vareniclina com a nicotina no receptor
Benhammou et al 127 realizaram um estudo com amostras de ceacuterebro post mortem
de fumantes e com amostras de sangue de voluntaacuterios fumantes e natildeo fumantes Atraveacutes
do uso de nicotina radiomarcada nas amostras de ceacuterebro mostraram que os siacutetios de
ligaccedilatildeo agrave nicotina foram aumentados proporcionamente conforme o nuacutemero de cigarros
por dia O mesmo estudo ao analizar a expressatildeo gecircnica e proteiacutenas em linfoacutecitos e
ceacutelulas polimorfonucleares para um subconjunto de subunidades de receptores
nicotiacutenicos essas ceacutelulas assim como no tecido cerebral exibiram maiores nuacutemeros de
siacutetios de ligaccedilatildeo de alta afinidade agrave nicotina em fumantes em comparaccedilatildeo com natildeo
fumantes
A vareniclina em estudos funcionais mostrou ter atividade agonista total nos
receptores α7 40 Em um estudo realizou-se o tratamento crocircnico com vareniclina eou
nicotina em camundongos (10 dias) os niacuteveis das drogas no ceacuterebro e no plasma e a
toleracircncia e a expressatildeo de 4 subtipos de nAChR apoacutes dose aguda de nicotina foram
checados usando autoradiografia O upregulation de receptores α4β2 devido ao
tratamento crocircnico com vareniclina foi similar ao promovido pela nicotina e tambeacutem
ocorreu dowregulation de α6β2 assim como ocorreu com o uso de nicotina A
vareniclina aumentou significantemente os siacutetios de α3β4 e α7 enquanto a nicotina teve
menor efeito nestes siacutetios A combinaccedilatildeo da nicotina com a vareniclina foi similar agrave
vareniclina sozinha para os siacutetios de α3β4 enquanto para o siacutetio de α7 a combinaccedilatildeo
promoveu upregulation em menos regiotildees cerebrais em comparaccedilatildeo com a vareniclina
em monoterapia 77
77
No presente estudo os pacientes do grupo resistente apresentaram efeito
semelhante associado ao uso combinado de vareniclina e nicotina (devido ao fumo) os
niacuteveis de expressatildeo de CHRNA7 natildeo foram mantidos como nos pacientes que obtiveram
sucesso no tratamento No entanto o grupo sucesso soacute estava utilizando a vareniclina na
ausecircncia de nicotina entre os tempos T2 e T4 o que sugere que esse dowregulation
pode ocorrer em subgrupo de resposta
Diversos estudos mostraram diferenccedilas na expressatildeo gecircnica de a7 em
amostras de pacientes com diagnoacutesticos psiquiaacutetricos em comparaccedilatildeo com indiviacuteduos
sadios 102 128-134
Kunii et al 128 mostraram diferenccedila na expressatildeo de a7 em coacutertex preacute-frontal
dorsolateral post mortem de pacientes com depressatildeo ansiedade e transtorno bipolar e
inuacutemeros estudos mostraram menores niacuteveis de expressatildeo de α7 em pacientes com
esquizofrenia 102 129-134
Estudos de indiviacuteduos com esquizofrenia satildeo oacutetimos modelos para o
entendimento da importacircncia do receptor a7 em processos cognitivos em ND e em
como esses mecanismos estatildeo intimamente relacionados Diversos estudos mostraram
que haacute uma maior prevalecircncia de tabagismo em indiviacuteduos com esquizofrenia
comparados agrave populaccedilatildeo geral 135 136
Mexal el al 102 realizaram um estudo com amostras de ceacuterebro post mortem
provenientes de indiviacuteduos de 4 grupos distintos controle natildeo fumante controle
fumante pacientes com esquizofrenia natildeo fumantes e pacientes com esquizofrenia
fumantes O estudo realizou ensaio de expressatildeo de mRNA e de proteiacutena atraveacutes de
PCR quantitativo em tempo real e western blot As sondas da PCR foram desenhadas
para amplificar o gene completo CHRNA7 e sua coacutepia duplicada o CHRFAM7A Natildeo
fumantes com esquizofrecircnia apresentaram expressatildeo reduzida de mRNA e de proteiacutena
78
em relaccedilatildeo aos pacientes com esquizofrenia fumantes Natildeo fumantes com esquizofrenia
apresentaram menor expressatildeo em relaccedilatildeo ao controle natildeo fumante mas essa diferenccedila
foi estatisticamente significativa apenas no niacutevel do mRNA Outros estudos post
mortem cerebral mostraram menor expressatildeo dos receptores nicotiacutenicos no coacutertex e no
hipocampo de indiviacuteduos com esquizofrecircnia comparado aos controles saudaacuteveis 129-134
O CHRFAM7A assim como o CHRNA7 eacute polimoacuterfico e variantes neste gene
foram associadas agrave patologia auditoacuteria em casos de esquizofrenia Processos
diferenciados nos mecanismos de transcriccedilatildeo podem contribuir para um funcionamento
anormal de a7 como variaccedilotildees em promotor splicing alternativo eou desequiliacutebrio de
ligaccedilatildeo com o SNP do gene de neuroregulina -1 (gene que codifica moleacutecula de adesatildeo
celular envolvida em processos de neuroplasticidade sinaacuteptica) Estes processos podem
estar envonvidos em endofenoacutetipos da doenccedila 122 126 137-144
A nicotina parece melhorar a audiccedilatildeo em indiviacuteduos com deacuteficit auditoacuterio na
esquizofrenia associado ao α7 permitindo uma melhor filtragem dos estiacutemulos
auditivos estranhos A nicotina melhora a cogniccedilatildeo na esquizofrenia e agentes
alternativos que ativam o receptor nicotiacutenico foram testados e esses compostos
melhoraram a atenccedilatildeo a memoacuteria de trabalho e os sintomas negativos em um estudo
complementar de pacientes natildeo fumantes com esquizofrenia 145
Os estudos citados nos mostram grandes evidecircncias da associaccedilatildeo do α7 com
ND processos cognitivos e de resposta agrave vareniclina Esses achados podem explicar
nossos resultados em relaccedilatildeo agrave diminuiccedilatildeo da expressatildeo de 7 no grupo de pacientes
resistentes ao tratamento Os pacientes do grupo sucesso mantiveram os niacuteveis de
expressatildeo gecircnica em resposta agrave vareniclina jaacute no grupo resistente houve um
dowregulation Sugerimos que essa diminuiccedilatildeo pode ter sido a responsaacutevel ao menos
em parte pelos indiviacuteduos natildeo terem conseguido deixar de fumar A nicotina pode estar
79
compensando um deacuteficit de α7 que os indiviacuteduos resistentes podem apresentar No
entanto natildeo sabemos como seria a expressatildeo de α7 nestes indiviacuteduos na ausecircncia do
fumo
Quanto ao gene CHNRG natildeo haacute muitos resultados na literatura Este codifica
a subunidade γ dos receptores nicotiacutenicos A maioria dos estudos aponta associaccedilatildeo da
subunidade com distuacuterbios esqueleacutetico-musculares 146-149
No entanto King et al 65 encontraram a associaccedilatildeo de polimorfismos neste
gene com nausea no tratamento com vareniclina E Keskitalo-Vuokko 150 et al
encontraram associaccedilatildeo de SNPs em loci do cluster de genes CHRNGCHRND (genes
muitos proacuteximos o uacuteltimo codifica a subunidade delta dos nAChRs) com o niacutevel de
cotinina Saccone et al 151 encontraram a associaccedilatildeo de 4 loci no cluster
CHRNDCHRNG com ND Em outro estudo variantes nos genes CHRNDCHRNG
mostraram associaccedilatildeo modesta com o risco de ND em amostras de afro-americanos 152
Em um estudo o qual foi utilizado um modelo de esquizofrenia em ratos no
grupo de animais tratados com clozapina foi encontrado downregulation do Chrng no
nuacutecleo accumbens Neste mesmo estudo Santoro et al natildeo conseguiram formular uma
hipoacutetese para o achado devido ao lack de informaccedilotildees na literatura com o foco em ND
ou performance cognitiva 153
Haacute algumas limitaccedilotildees no estudo Primeira o ensaio da anaacutelise de expressatildeo
gecircnica foi realizado com amostras de sangue perifeacuterico e natildeo no SNC o que poderia nos
mostrar uma relaccedilatildeo mais clara e direta do faacutermaco com a via de resposta No entanto a
obtenccedilatildeo desta amostra eacute inviaacutevel Em contrapartida estudos jaacute demonstraram que haacute
similaridade entre a expressatildeo gecircnica de ceacutelulas do SNC e de ceacutelulas de sangue
perifeacuterico para alguns destes genes de receptores nicotiacutenicos 102 Segunda natildeo foi
realizado ensaio de expressatildeo gecircnica para amostras de indiviacuteduos natildeo fumantes o que
80
poderia fornecer mais paracircmetros de comparaccedilatildeo com os grupos resistente e sucesso
Terceira natildeo conseguimos qualidade necessaacuteria nas anaacutelises de genes potencialmente
importantes
62 Para os dados da mensuraccedilatildeo dos analitos
Um dos maiores desafios em anaacutelises de amostras bioloacutegicas eacute eliminar os
interferentes de sua matriz sem alterar substancialmente as quantidades dos analitos
presentes A matriz de amostras de soro e plasma satildeo complexas e envolve a presenccedila
de inuacutemeras macromoleacuteculas como lipiacutedios e proteiacutenas que obstruem colunas anaacuteliticas
diminuem o tempo de duraccedilatildeo de equipamentos e inviabilizam a interpretaccedilatildeo dos
dados devido a imensos picos e ruiacutedos formados nos cromatogramas e espectros de
massa Inumeros trabalhos executam uma preparaccedilatildeo preacutevia das amostras que envolve
processos como a extraccedilatildeo com uso de solventes preciptaccedilatildeo de proteiacutenas entre outros
os quais podem promover uma baixa recuperaccedilatildeo dos analitos tempo prolongado de
bancada e gasto de materiais 51 104-106
Devido agrave esse fato inuacutemeros estudos propuseram o uso de materiais de acesso
restrito (RAMs) para a purificaccedilatildeo da amostra sem tanto manuseio dentre eles estatildeo os
nanotubos de carbono (CNTs) modificados 109 110 114-116
O presente estudo desenvolveu uma coluna extratora composta por nanotubos
hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados quimicamente com a adiccedilatildeo de grupos
hidrofiacuteficos Essa coluna permitiu uma oacutetima exclusatildeo de macromoleacuteculas (98) A
aacutegua ultra pura foi o suficiente para ser utilizada como fase moacutevel de carregamento o
que eacute sustentaacutevel aleacutem de natildeo causar danos ao meio ambiente e o uacutenico preparo da
amostra foi uma diluiacuteccedilatildeo 11 tambeacutem em aacutegua O novo RAM desenvolvido foi
81
encaminhado para pedido de patente (Anexo 5) e portanto os processos para o seu
desenvolvimento foram mantidos em sigilo
Os CNTs possuem uma grande aacuterea superfiacutecial e oacutetima estabilidade em anaacutelise
de compostos no entanto o material natildeo promove a remoccedilatildeo de proteiacutenas com
eficiecircncia 110 115 Os poros dos CNTs formam uma barreira fiacutesica excluindo ou
permitindo a entrada de moleacuteculas por tamanho e os grupos hidrofiacutelicos adicionados ao
RAM desenvolvido natildeo permitem a ligaccedilatildeo de proteiacutenas de forma irreversiacutevel
formando uma barreira fiacutesico-quiacutemica Os demais CNTs natildeo modificados disponiacuteveis
natildeo promovem a exclusatildeo de macromoleacuteculas com tanta efetividade quanto o material
desenvolvido aleacutem disso o novo RAM apoacutes limpeza pode ser reutilizado cerca de 400
vezes (valor calculado durante os experimentos com amostras controle)
Quanto a otimizaccedilatildeo do meacutetodo de mensuraccedilatildeo a anaacutelise multidimensional
atraveacutes de equipamentos conectados por vaacutelvulas comutadoras promoveu a realizaccedilatildeo
da extraccedilatildeo eluiccedilatildeo anaacutelise limpeza e recondicionamento do sistema automaacuteticamente
A anaacutelise completa de uma amostra foi realizada em apenas 15 minutos O sistema
permitiu a mensuraccedilatildeo conjunta de diversos analitos com caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas
diferentes de uma mesma amostra mostrando bons sinais analiacuteticos e perfis
cromatograacuteficos
Quanto aos dados de validaccedilatildeo o meacutetodo permitiu uma oacutetima recuperaccedilatildeo dos
analitos com valores proacuteximos a 100 semelhante a outros estudos 104 117 154 155 A
maior dificuldade encontrada neste estudo foi a configuraccedilatildeo de paracircmetros
espectromeacutetricos e cromatograacuteficos que pudessem obter o maacuteximo de recuperaccedilatildeo e o
menor LQ possiacutevel para a anaacutelise de vareniclina ainda em um contexto de anaacutelise
multianalito
82
A dose posoloacutegica da vareniclina eacute muito baixa (1mg 2 vezes ao dia a partir do
8deg dia de tratamento) em comparaccedilatildeo com a da bupropiona (150 mg 2 vezes ao dia a
partir do 8deg dia de tratamento) dessa forma as concentraccedilotildees plasmaacuteticas de
vareniclina satildeo muito baixas Apesar do valor de LQ obtido (5 μg L-1) estar entre as
meacutedias plasmaacuteticas de intervalo terapecircutico (40 -70 μg L-1 de vareniclina em plasma e
soro) 51 118 ao mensurar amostras de pacientes em um cenaacuterio real de tratamento de 74
pacientes apenas 3 amostras apresentaram concentraccedilatildeo plasmaacutetica de vareniclina
abaixo do limite de quantificaccedilatildeo
Quanto a recuperaccedilatildeo do analito da matriz a vareniclina tambeacutem mostrou menor
taxa (883) em relaccedilatildeo aos outros analitos (valores proacuteximos ao 100) no entanto
essa taxa de recuperaccedilatildeo eacute considerada alta e foi semelhante ao estudo de Dobrinas et al
156 o qual realizou a extraccedilatildeo da amostra atraveacutes de coluna extratora de fase soacutelida
(SPE) disponiacutevel no mercado e a mensuraccedilatildeo tambeacutem foi realizada em um contexto
multianalito E ainda a recuperaccedilatildeo de vareniclina no presente estudo foi maior do que
a obtida pelo trabalho de Al-Haj et al 105 o qual realizou a preparaccedilatildeo preacutevia da amostra
por extraccedilatildeo liacutequido-liacutequido (LLE) e a mensuraccedilatildeo foi realizada para somente um
analito (4759 - 4872) e obteve recuperaccedilatildeo semelhante ao estudo de os qual
tambeacutem realizou a anaacutelise de vareniclina em um cenaacuterio multianalito (830 ndash 920)
Para nicotina e cotinina os valores de LQ obtidos no presente estudo (50 μg L-1)
se assemelham aos obtidos nos estudos de Abdallah et al 104 (70 μg L-1 para cotinina)
Onoue et al 157 (50 μg L-1 para nicotina e cotinina) Petersen et al 117 (50 μg L-1) Para
bupropiona e hidroxibupropiona o meacutetodo proposto eacute capaz de mensurar pequenas
quantidades do faacutermaco e de seu metaboacutelito (LQ 10 μg L-1 para ambos) quantidades
menores do que os LQs obtidos nos estudos de 158 (55 para bupropiona e 60 μgL para
83
hidroxibupropiona) e de 155 (100 μg L-1 para hidroxibupropiona) apesar das
concentraccedilotildees de metaboacutelitos em estado de equiliacutebrio em pacientes tratados com doses
terapecircuticas do faacutermaco serem bem maiores (45 ndash 75 μg L-1 e de 500 ndash 1500 μg L-1)
respectivamente para bupropiona e hidroxibupropiona 118
O Quadro 6 mostra os paracircmetros analiacuteticos do presente estudo comparados com
outros estudos presentes na literatura
Quanto agraves mensuraccedilotildees das amostras dos pacientes natildeo encontramos associaccedilatildeo
dos faacutermacos e seus metaboacutelitos com desfecho de tratamento Esse fato poderia ser
explicado pelo pequeno nuacutemero amostral do presente estudo
Encontramos diferenccedila significativa entre os grupos resistente e sucesso ao
tratamento quanto aos paracircmetros relacionados ao fumo e agrave DN Os pacientes do grupo
resistente tratados com vareniclina (ainda antes do iniacutecio do tratamento) fumavam um
maior nuacutemero de cigarrosdia em comparaccedilatildeo com os pacientes que obtiveram sucesso
O grupo resistente ao tratamento com bupropiona apresentou maior frequecircncia de
pacientes com alta DN (antes do tratamento) e de pacientes que fumavam no dia da
coleta em comparaccedilatildeo ao grupo sucesso Os dados tambeacutem mostraram que os pacientes
resistentes tratados com ambos os faacutermacos no dia da coleta apresentaram maiores
concentraccedilotildees dos metaboacutelitos da nicotina Esses dados podem indicar maior exposiccedilatildeo
ao fumo e maior DN podendo implicar na resposta ao tratamento antitabagismo
Haacute algumas limitaccedilotildees nesse estudo Primeira os pacientes natildeo fizeram exames
de funccedilatildeo hepaacutetica antes da inclusatildeo no entudo no entanto a presenccedila de comorbidades
hepaacuteticas foram questionadas Segunda natildeo podemos obter total rigor nos horaacuterios de
tomada dos medicamentos por parte dos pacientes no entanto os pacientes foram
84
orientados agrave tomar o medicamento sempre no mesmo horaacuterio e foram questionados
quanto ao cumprimento do protocolo Terceira o nuacutemero amostral para a anaacutelise dos
analitos e de NRM em estudos de associaccedilatildeo com desfecho de tratamento eacute considerado
modesto e consequentemente pode ter implicado nos resultados de natildeo associaccedilatildeo
85
Quadro 6 ndash Comparaccedilatildeo dos dados de validaccedilatildeo com outros estudos
Analitos Purificaccedilatildeo da
amostraextraccedilatildeo Meacutetodo Amostra Intervalo Linear (μg L-1) Recuperaccedilatildeo () LD μg L-1 LQ μg L-1 Referecircncia
Vareniclina
Bupropiona
Hidroxibupropiona
Nicotina
Cotinina
Hidroxicotinina
CS ndash SPE (novo
RAM) HPLC-MSMS Soro humano
50 ndash 1000
10 ndash 10000
10 ndash 20000
50 ndash 10000
50 ndash 10000
50 ndash 10000
883
1101
945
1098
941
1167
25
07
06
19
24
37
50
10
10
50
50
50
Presente
estudo
Nicotitna
Cotinina LLE (LCndashMSMS) Soro humano
03 ndash 525
70 ndash15000
978 ndash 1114
973 ndash1156 -
03
70
Abdalla et al 104
Bupropiona
Hidroxibupropiona PP + SPE online TFCndashMSMS) Soro humano 50 ndash 10000
1580
1160
13
45
55
60
Petrides et
al 158
Vareniclina LLE HPLCndashMSMS
(API) Plasma humano 01ndash100 4759 - 4872 005 01
Al-Haj et al 105
Vareniclina LLE HPLC-
APIMSMS
Plasma
Urina
01 - 500
10 ndash 5000 - -
lt01
100
Faessel et al 51
Nicotina
cotinina
trans-3 ndash
hidroxicotinina
vareniclina
SPE (Oasis MCX 10
mg 96-well extraction
plate)
UPLCndashMSMS
Soro humano
100 ndash 5000
100 ndash 5000
100 - 5000
100 ndash 2500
860 ndash 940
700 ndash 870
490 ndash 540
830 ndash 920
-
20
10
20
10
Dobrinas et
al 156
86
Nicotina
Cotinina Centrifugaccedilatildeo
Diluiccedilatildeo
isotoacutepica estaacutevel
ndash UPLC-
MSMS
Urina 50 ndash 350000 968ndash1051
943ndash992
07
04
17
11
Kuhn et al 154
Nicotina e Cotinina LLE PP SPE
(UPLC-
MSMS)
Sangue urina e
outros tecidos de
rato
100 ndash 6000 (plasma)
80 (nicotina e
cotininacom
precipitaccedilatildeo)
25 50 Onoue et al
157
Cotinina LL SPE (coluna
Zorbaxs XDB C8) HPLCUV Soro e urina 50 ndash 5000 978 ndash 102 018 50
Petersen et
al 117
hidroxibupropiona PP + SPE online RP‐HPLCUV Plasma humano 1000 - 25000 6118 1000 1000
Scherf-
Clavel et al 155
CS ndash SPE= Extraccedilatildeo em fase soacutelida no modo column switching LLE= extraccedilatildeo liacutequido-liacutequido PP=precipitaccedilatildeo de proteiacutenas SPE=extraccedilatildeo em fase soacutelida HPLC= cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia
UPLC=cromatografia liacutequida de ultra eficiecircncia RP‐HPLC=Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia em fase reversa TFC=Cromatografia liacutequida turbulenta API=ionizaccedilatildeo em pressatildeo atmosfeacutericaUV=
detector ultravioleta MSMS= espectometria de massas em tandem
87
7 CONCLUSOtildeES
Para a anaacutelise da expressatildeo gecircnica este estudo exploratoacuterio mostra a associaccedilatildeo
das subunidades α7 e γ com a efetividade do tratamento com vareniclina Estes
resultados poderiam contribuir ao menos em parte para o desenvolvimento de uma
terapecircutica individualizada
Para a mensuraccedilatildeo de analitos o novo RAM sintetizado eacute um produto de
extremo valor cientiacutefico podendo apresentar diversas aplicaccedilotildees em anaacutelise de amostras
de matrizes complexas sem muita preparaccedilatildeo preacutevia Para a associaccedilatildeo das
concentraccedilotildees dos faacutermacos e seus metaboacutelitos com o desfecho de tratamento satildeo
necessaacuterios estudos com um maior nuacutemero amostral
88
8 SUGESTOtildeES PARA ESTUDOS FUTUROS
Sugerimos estudos que promovam maior entendimento das subunidades α7 e γ
dos nAChRs nos processos de dependecircncia agrave nicotina e no tratamento com vareniclina
Sugerimos tambeacutem estudos de investigaccedilatildeo para novas aplicabilidades do novo RAM
desenvolvido
89
9 REFEREcircNCIAS
1 WHO Tobacco WHO Media Centre 2015
2 Oliveira AF Valente JG Leite IC [Aspects of tobacco attributable mortality
systematic review] Rev Saude Publica 200842(2)335-345
3 Koshiaris C Aveyard P Oke J Ryan R Szatkowski L Stevens R Farley A
Smoking cessation and survival in lung upper aero-digestive tract and bladder
cancer cohort study Br J Cancer 2017117(8)1224-1232
4 Leppanen T Toyras J Mervaala E Penzel T Kulkas A Severity of individual
obstruction events increases with age in patients with obstructive sleep apnea
Sleep Med 20173732-37
5 Cerda J Bambs C Vera C Infant morbidity and mortality attributable to
prenatal smoking in Chile Rev Panam Salud Publica 201741e106
6 Vigitel Brasil - Vigilacircncia de fatores de risco e proteccedilatildeo para doenccedilas crocircnicas
por inqueacuterito telefocircnico Estimativas sobre frequecircncia e distribuiccedilatildeo
sociodemograacutefica de fatores de risco e proteccedilatildeo para doenccedilas crocircnicas nas
capitais dos 26 estados brasileiros e no Distrito Federal em 2018 Brasiacutelia 2019
7 Rosemberg J Nicotina Droga Universal Instituto Nacional de Cacircncer
(wwwincagovbr) 2004
8 Kirchenchtein C Chatkin JM Dependecircncia da Nicotina In Diretrizes para
Cessaccedilatildeo do Tabagismo Jornal Brasileiro de Pneumologia Brasiacutelia DF 2004
9 Fagerstoumlm K Uma breve apresentaccedilatildeo da neurofarmacologia e fisiologia da
dependecircncia agrave nicotina In Gigliotti AP Presman S (Eds) Atualizaccedilatildeo no
Tratamento do Tabagismo ABP Sauacutede 2006
10 Gigliotti A Lemos T Quais satildeo os mecanismos da dependecircncia de nicotina
In Manual de Condutas e Praacuteticas em Tabagismo Sociedade Brasileira de
Pneumologia e Tisiologia 2012
11 Divisatildeo de Controle do Tabagismo Coordenaccedilatildeo de Accedilotildees Estrateacutegicas
Instituto Nacional de Cacircncer Silva AG Ministeacuterio da Sauacutede Protocolo cliacutenico
e diretrizes terapecircuticas dependecircncia agrave nicotina 2013
12 Schultz W Multiple reward signals in the brain Nat Rev Neurosci
20001(3)199-207
13 Stolerman IP Jarvis MJ The scientific case that nicotine is addictive
Psychopharmacology (Berl) 1995117(1)2-10 discussion 14-20
90
14 Koob GF Volkow ND Neurocircuitry of addiction Neuropsychopharmacology
200935(1)217-238
15 Martin-Soelch C Neuroadaptive changes associated with smoking structural
and functional neural changes in nicotine dependence Brain Sci 20133(1)159-
176
16 Boening JA Neurobiology of an addiction memory J Neural Transm (Vienna)
2001108(6)755-765
17 Robbins TW Everitt BJ Limbic-striatal memory systems and drug addiction
Neurobiol Learn Mem 200278(3)625-636
18 Everitt BJ Belin D Economidou D Pelloux Y Dalley JW Robbins TW
Review Neural mechanisms underlying the vulnerability to develop compulsive
drug-seeking habits and addiction Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci
2008363(1507)3125-3135
19 Fuentes RM Notkola IL Shemeikka S Tuomilehto J Nissinen A Familial
aggregation of blood pressure a population-based family study in eastern
Finland J Hum Hypertens 200014(7)441-445
20 Gotti C Zoli M Clementi F Brain nicotinic acetylcholine receptors native
subtypes and their relevance Trends Pharmacol Sci 200627(9)482-491
21 Benowitz NL Pharmacology of nicotine addiction smoking-induced disease
and therapeutics Annu Rev Pharmacol Toxicol 20094957-71
22 Benowitz NL Clinical pharmacology of inhaled drugs of abuse implications in
understanding nicotine dependence NIDA Res Monogr 19909912-29
23 Picciotto MR Zoli M Rimondini R Lena C Marubio LM Pich EM Fuxe K
Changeux JP Acetylcholine receptors containing the beta2 subunit are involved
in the reinforcing properties of nicotine Nature 1998391(6663)173-177
24 Maskos U Molles BE Pons S Besson M Guiard BP Guilloux JP Evrard A
Cazala P Cormier A Mameli-Engvall M Dufour N Cloez-Tayarani I
Bemelmans AP Mallet J Gardier AM David V Faure P Granon S Changeux
JP Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of
nicotinic receptors Nature 2005436(7047)103-107
25 Tapper AR McKinney SL Nashmi R Schwarz J Deshpande P Labarca C
Whiteaker P Marks MJ Collins AC Lester HA Nicotine activation of alpha4
receptors sufficient for reward tolerance and sensitization Science
2004306(5698)1029-1032
26 Aberger K Chitravanshi VC Sapru HN Cardiovascular responses to
microinjections of nicotine into the caudal ventrolateral medulla of the rat Brain
Res 2001892(1)138-146
91
27 Levin ED Bettegowda C Blosser J Gordon J AR-R17779 and alpha7
nicotinic agonist improves learning and memory in rats Behav Pharmacol
199910(6-7)675-680
28 Hajos M Hurst RS Hoffmann WE Krause M Wall TM Higdon NR Groppi
VE The selective alpha7 nicotinic acetylcholine receptor agonist PNU-282987
[N-[(3R)-1-Azabicyclo[222]oct-3-yl]-4-chlorobenzamide hydrochloride]
enhances GABAergic synaptic activity in brain slices and restores auditory
gating deficits in anesthetized rats J Pharmacol Exp Ther 2005312(3)1213-
1222
29 Salas R Orr-Urtreger A Broide RS Beaudet A Paylor R De Biasi M The
nicotinic acetylcholine receptor subunit alpha 5 mediates short-term effects of
nicotine in vivo Mol Pharmacol 200363(5)1059-1066
30 Henningfield JE Stapleton JM Benowitz NL Grayson RF London ED Higher
levels of nicotine in arterial than in venous blood after cigarette smoking Drug
Alcohol Depend 199333(1)23-29
31 Hukkanen J Jacob P 3rd Benowitz NL Metabolism and disposition kinetics of
nicotine Pharmacol Rev 200557(1)79-115
32 Dempsey D Tutka P Jacob P 3rd Allen F Schoedel K Tyndale RF Benowitz
NL Nicotine metabolite ratio as an index of cytochrome P450 2A6 metabolic
activity Clin Pharmacol Ther 200476(1)64-72
33 Allenby CE Boylan KA Lerman C Falcone M Precision Medicine for
Tobacco Dependence Development and Validation of the Nicotine Metabolite
Ratio J Neuroimmune Pharmacol 201611(3)471-483
34 Llaquet H Pichini S Joya X Papaseit E Vall O Klein J Garcia-Algar O
Biological matrices for the evaluation of exposure to environmental tobacco
smoke during prenatal life and childhood Anal Bioanal Chem 2010396(1)379-
399
35 Reichert J AA Gonccedilalves CMC Godoy I Chatkin JM Sales MPU et al
Diretrizes da Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisologia Diretrizes para
cessaccedilatildeo do tabagismo ndash 2008 J Bras Pneumol 200834(10)845-880
36 Fiore MC Jaeacuten C R Baker TB Treating tobacco use and dependence 2008
update Clinical Practice Guideline In services USDohah ed Public Health
Service Rockville (md) 2008
37 Kassem MG Al Hossaini AM Varenicline Profiles Drug Subst Excip Relat
Methodol 201237389-411
38 Zoli M Lena C Picciotto MR Changeux JP Identification of four classes of
brain nicotinic receptors using beta2 mutant mice J Neurosci
199818(12)4461-4472
92
39 Hogg RC Raggenbass M Bertrand D Nicotinic acetylcholine receptors from
structure to brain function Rev Physiol Biochem Pharmacol 20031471-46
40 Mihalak KB Carroll FI Luetje CW Varenicline is a partial agonist at
alpha4beta2 and a full agonist at alpha7 neuronal nicotinic receptors Mol
Pharmacol 200670(3)801-805
41 Swan GE Javitz HS Jack LM Wessel J Michel M Hinds DA Stokowksi RP
McClure JB Catz SL Richards J Zbikowski SM Deprey M McAfee T Conti
DV Bergen AW Varenicline for smoking cessation nausea severity and
variation in nicotinic receptor genes Pharmacogenomics J 201212(4)349-358
42 Kaur K Kaushal S Chopra SC Varenicline for smoking cessation A review of
the literature Curr Ther Res Clin Exp 200970(1)35-54
43 Catz SL Jack LM McClure JB Javitz HS Deprey M Zbikowski SM McAfee
T Richards J Swan GE Adherence to varenicline in the COMPASS smoking
cessation intervention trial Nicotine Tob Res 201113(5)361-368
44 Faessel HM Burstein AH Troutman MD Willavize SA Rohrbacher KD Clark
DJ Lack of a pharmacokinetic interaction between a new smoking cessation
therapy varenicline and digoxin in adult smokers Eur J Clin Pharmacol
200864(11)1101-1109
45 Mohanasundaram UM Chitkara R Krishna G Smoking cessation therapy with
varenicline Int J Chron Obstruct Pulmon Dis 20083(2)239-251
46 Faessel HM Smith BJ Gibbs MA Gobey JS Clark DJ Burstein AH Single-
dose pharmacokinetics of varenicline a selective nicotinic receptor partial
agonist in healthy smokers and nonsmokers J Clin Pharmacol 200646(9)991-
998
47 Faessel HM Obach RS Rollema H Ravva P Williams KE Burstein AH A
review of the clinical pharmacokinetics and pharmacodynamics of varenicline
for smoking cessation Clin Pharmacokinet 201049(12)799-816
48 Ravva P Gastonguay MR Tensfeldt TG Faessel HM Population
pharmacokinetic analysis of varenicline in adult smokers Br J Clin Pharmacol
200968(5)669-681
49 Obach RS Reed-Hagen AE Krueger SS Obach BJ OConnell TN Zandi KS
Miller S Coe JW Metabolism and disposition of varenicline a selective
alpha4beta2 acetylcholine receptor partial agonist in vivo and in vitro Drug
Metab Dispos 200634(1)121-130
50 Feng B Obach RS Burstein AH Clark DJ de Morais SM Faessel HM Effect
of human renal cationic transporter inhibition on the pharmacokinetics of
varenicline a new therapy for smoking cessation an in vitro-in vivo study Clin
Pharmacol Ther 200883(4)567-576
93
51 Faessel HM Gibbs MA Clark DJ Rohrbacher K Stolar M Burstein AH
Multiple-dose pharmacokinetics of the selective nicotinic receptor partial
agonist varenicline in healthy smokers J Clin Pharmacol 200646(12)1439-
1448
52 Slemmer JE Martin BR Damaj MI Bupropion is a nicotinic antagonist J
Pharmacol Exp Ther 2000295(1)321-327
53 Hughes JR Stead LF Lancaster T Antidepressants for smoking cessation
Cochrane Database Syst Rev 2007(1)CD000031
54 Goodnick PJ Pharmacokinetics of second generation antidepressants
bupropion Psychopharmacol Bull 199127(4)513-519
55 Hesse LM Venkatakrishnan K Court MH von Moltke LL Duan SX Shader
RI Greenblatt DJ CYP2B6 mediates the in vitro hydroxylation of bupropion
potential drug interactions with other antidepressants Drug Metab Dispos
200028(10)1176-1183
56 Faucette SR Hawke RL Lecluyse EL Shord SS Yan B Laethem RM Lindley
CM Validation of bupropion hydroxylation as a selective marker of human
cytochrome P450 2B6 catalytic activity Drug Metab Dispos 200028(10)1222-
1230
57 Walsky RL Astuccio AV Obach RS Evaluation of 227 drugs for in vitro
inhibition of cytochrome P450 2B6 J Clin Pharmacol 200646(12)1426-1438
58 Walsky RL Obach RS A comparison of 2-phenyl-2-(1-piperidinyl)propane
(ppp) 111-phosphinothioylidynetrisaziridine (thioTEPA) clopidogrel and
ticlopidine as selective inactivators of human cytochrome P450 2B6 Drug
Metab Dispos 200735(11)2053-2059
59 Quaak M van Schooten FJ van Schayck CP Pharmacogenetics of smoking
how far to the clinic Pharmacogenomics 201415(6)723-726
60 Swan GE Lessov-Schlaggar CN Tobacco addiction and pharmacogenetics of
nicotine metabolism J Neurogenet 200923(3)262-271
61 Tomaz PRX Kajita MS Santos JR Scholz J Abe TO Gaya PV Krieger JE
Pereira AC Santos P Cytochrome P450 2A6 and 2B6 polymorphisms and
smoking cessation success in patients treated with varenicline Eur J Clin
Pharmacol201975(11)1541-1545
62 Tomaz PRX Santos JR Scholz J Abe TO Gaya PV Negrao AB Krieger JE
Pereira AC Santos P Cholinergic receptor nicotinic alpha 5 subunit
polymorphisms are associated with smoking cessation success in women BMC
Med Genet201819(1)55
94
63 Scholz J Santos PC Buzo CG Lopes NH Abe TO Gaya PV Pierri H Amorim
C Pereira AC Effects of aging on the effectiveness of smoking cessation
medication Oncotarget 20167(21)30032-30036
64 Issa JS Santos PC Vieira LP Abe TO Kuperszmidt CS Nakasato M Cardoso
E Amorim C Pereira AC Smoking cessation and weight gain in patients with
cardiovascular disease or risk factor Int J Cardiol 2014172(2)485-487
65 King DP Paciga S Pickering E Benowitz NL Bierut LJ Conti DV Kaprio J
Lerman C Park PW Smoking cessation pharmacogenetics analysis of
varenicline and bupropion in placebo-controlled clinical trials
Neuropsychopharmacology 201237(3)641-650
66 Saccone NL Baurley JW Bergen AW David SP Elliott HR Foreman MG
Kaprio J Piasecki TM Relton CL Zawertailo L Bierut LJ Tyndale RF Chen
LS The Value of Biosamples in Smoking Cessation Trials A Review of
Genetic Metabolomic and Epigenetic Findings Nicotine Tob Res
201820(4)403-413
67 Rocha Santos J Tomaz PR Issa JS Abe TO Krieger JE Pereira AC Santos
PC CHRNA4 rs1044396 is associated with smoking cessation in varenicline
therapy Front Genet 2015646
68 Tomaz PR Santos JR Issa JS Abe TO Gaya PV Krieger JE Pereira AC
Santos PC CYP2B6 rs2279343 polymorphism is associated with smoking
cessation success in bupropion therapy Eur J Clin Pharmacol 2015
71(9)1067-73
69 David SP Brown RA Papandonatos GD Kahler CW Lloyd-Richardson EE
Munafo MR Shields PG Lerman C Strong D McCaffery J Niaura R
Pharmacogenetic clinical trial of sustained-release bupropion for smoking
cessation Nicotine Tob Res 20079(8)821-833
70 Lerman C Shields PG Wileyto EP Audrain J Pinto A Hawk L Krishnan S
Niaura R Epstein L Pharmacogenetic investigation of smoking cessation
treatment Pharmacogenetics 200212(8)627-634
71 Han DH Joe KH Na C Lee YS Effect of genetic polymorphisms on smoking
cessation a trial of bupropion in Korean male smokers Psychiatr Genet
200818(1)11-16
72 Zanger UM Klein K Pharmacogenetics of cytochrome P450 2B6 (CYP2B6)
advances on polymorphisms mechanisms and clinical relevance Front Genet
2013424
73 Zhu AZ Cox LS Nollen N Faseru B Okuyemi KS Ahluwalia JS Benowitz
NL Tyndale RF CYP2B6 and bupropions smoking-cessation pharmacology
the role of hydroxybupropion Clin Pharmacol Ther 201292(6)771-777
95
74 Laib AK Brunen S Pfeifer P Vincent P Hiemke C Serum concentrations of
hydroxybupropion for dose optimization of depressed patients treated with
bupropion Ther Drug Monit 201436(4)473-479
75 Hutchison KE Allen DL Filbey FM Jepson C Lerman C Benowitz NL Stitzel
J Bryan A McGeary J Haughey HM CHRNA4 and tobacco dependence from
gene regulation to treatment outcome Arch Gen Psychiatry 200764(9)1078-
1086
76 Smith RC Zhubi A Maloku E Sershen H Lajtha A Davis JM Costa E
Guidotti A Varenicline treatment decreases DNMT1 mRNA expression in
lymphocytes of schizophrenic patients who are cigarette smokers Schizophr
Res 2010119(1-3)269-270
77 Marks MJ ONeill HC Wynalda-Camozzi KM Ortiz NC Simmons EE Short
CA Butt CM McIntosh JM Grady SR Chronic treatment with varenicline
changes expression of four nAChR binding sites in mice Neuropharmacology
201599142-155
78 Middleton FA Pato CN Gentile KL McGann L Brown AM Trauzzi M Diab
H Morley CP Medeiros H Macedo A Azevedo MH Pato MT Gene
expression analysis of peripheral blood leukocytes from discordant sib-pairs
with schizophrenia and bipolar disorder reveals points of convergence between
genetic and functional genomic approaches Am J Med Genet B Neuropsychiatr
Genet 2005136B(1)12-25
79 Takahashi M Hayashi H Watanabe Y Sawamura K Fukui N Watanabe J
Kitajima T Yamanouchi Y Iwata N Mizukami K Hori T Shimoda K Ujike H
Ozaki N Iijima K Takemura K Aoshima H Someya T Diagnostic
classification of schizophrenia by neural network analysis of blood-based gene
expression signatures Schizophr Res 2010119(1-3)210-218
80 Lee J Goh LK Chen G Verma S Tan CH Lee TS Analysis of blood-based
gene expression signature in first-episode psychosis Psychiatry Res
2012200(1)52-54
81 Sullivan PF Fan C Perou CM Evaluating the comparability of gene expression
in blood and brain Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet
2006141B(3)261-268
82 Hennings JM Uhr M Klengel T Weber P Putz B Touma C Czamara D Ising
M Holsboer F Lucae S RNA expression profiling in depressed patients
suggests retinoid-related orphan receptor alpha as a biomarker for antidepressant
response Transl Psychiatry 20155e538
83 Ota VK Noto C Gadelha A Santoro ML Silva PN Melaragno MI Smith Mde
A Cordeiro Q Bressan RA Belangero SI Neurotransmitter receptor and
regulatory gene expression in peripheral blood of Brazilian drug-naive first-
96
episode psychosis patients before and after antipsychotic treatment Psychiatry
Res2013210(3)1290-1292
84 Kordi-Tamandani DM Tajoddini S Salimi F Promoter Methylation and BDNF
and DAT1 Gene Expression Profiles in Patients with Drug Addiction
Pathobiology 201582(2)94-99
85 Wongsriraksa A Parsons ME Whelan CJ Characterisation of nicotine receptors
on human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) Inflamm Res
200958(1)38-44
86 Kawashima K Fujii T Expression of non-neuronal acetylcholine in
lymphocytes and its contribution to the regulation of immune function Front
Biosci 200492063-2085
87 St-Pierre S Jiang W Roy P Champigny C LeBlanc E Morley BJ Hao J
Simard AR Nicotinic Acetylcholine Receptors Modulate Bone Marrow-Derived
Pro-Inflammatory Monocyte Production and Survival PLoS One
201611(2)e0150230
88 Zdanowski R Krzyzowska M Ujazdowska D Lewicka A Lewicki S Role of
alpha7 nicotinic receptor in the immune system and intracellular signaling
pathways Cent Eur J Immunol 201540(3)373-379
89 Baez-Pagan CA Delgado-Velez M Lasalde-Dominicci JA Activation of the
Macrophage alpha7 Nicotinic Acetylcholine Receptor and Control of
Inflammation J Neuroimmune Pharmacol 201510(3)468-476
90 Kalkman HO Feuerbach D Modulatory effects of alpha7 nAChRs on the
immune system and its relevance for CNS disorders Cell Mol Life Sci
201673(13)2511-2530
91 Zakrzewicz A Richter K Agne A Wilker S Siebers K Fink B Krasteva-Christ
G Althaus M Padberg W Hone AJ McIntosh JM Grau V Canonical and
Novel Non-Canonical Cholinergic Agonists Inhibit ATP-Induced Release of
Monocytic Interleukin-1beta via Different Combinations of Nicotinic
Acetylcholine Receptor Subunits alpha7 alpha9 and alpha10 Front Cell
Neurosci201711189
92 Arreola R Alvarez-Herrera S Perez-Sanchez G Becerril-Villanueva E Cruz-
Fuentes C Flores-Gutierrez EO Garces-Alvarez ME de la Cruz-Aguilera DL
Medina-Rivero E Hurtado-Alvarado G Quintero-Fabian S Pavon L
Immunomodulatory Effects Mediated by Dopamine J Immunol
Res20163160486
93 Nakajima M Yamamoto T Nunoya K Yokoi T Nagashima K Inoue K Funae
Y Shimada N Kamataki T Kuroiwa Y Role of human cytochrome P4502A6 in
C-oxidation of nicotine Drug Metab Dispos 199624(11)1212-1217
97
94 Messina ES Tyndale RF Sellers EM A major role for CYP2A6 in nicotine C-
oxidation by human liver microsomes J Pharmacol Exp Ther
1997282(3)1608-1614
95 Chen A Krebs NM Zhu J Muscat JE Nicotine metabolite ratio predicts
smoking topography The Pennsylvania Adult Smoking Study Drug Alcohol
Depend201819089-93
96 Shahab L BL McNeill Tyndale RF Does the nicotine metabolite ratio
moderate smoking cessation treatment outcomes in real-world settings A
prospective study Addiction 2019114(2)304-314 doi 101111add14450
97 Lea RA Dickson S Benowitz NL Within-subject variation of the salivary
3HCCOT ratio in regular daily smokers prospects for estimating CYP2A6
enzyme activity in large-scale surveys of nicotine metabolic rate J Anal Toxicol
200630(6)386-389
98 Mooney ME Li ZZ Murphy SE Pentel PR Le C Hatsukami DK Stability of
the nicotine metabolite ratio in ad libitum and reducing smokers Cancer
Epidemiol Biomarkers Prev 200817(6)1396-1400
99 Piestansky J Marakova K Veizerova L Galba J Mikus P On-line column
coupled isotachophoresis-capillary zone electrophoresis hyphenated with
tandem mass spectrometry in drug analysis varenicline and its metabolite in
human urine Anal Chim Acta 201482684-93
100 Fagerstrom KO Heatherton TF Kozlowski LT Nicotine addiction and its
assessment Ear Nose Throat J 199069(11)763-765
101 Issa JS A new nicotine dependence score and a new scale assessing patient
comfort during smoking cessation treatment J Bras Pneumol 201238(6)761-
765
102 Mexal S Berger R Logel J Ross RG Freedman R Leonard S Differential
regulation of alpha7 nicotinic receptor gene (CHRNA7) expression in
schizophrenic smokers J Mol Neurosci 201040(1-2)185-195
103 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-
time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods
200125(4)402-408
104 Abdallah IA Hammell DC Stinchcomb AL Hassan HE A fully validated LC-
MSMS method for simultaneous determination of nicotine and its metabolite
cotinine in human serum and its application to a pharmacokinetic study after
using nicotine transdermal delivery systems with standard heat application in
adult smokers J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2016102067-
77
98
105 Al-Haj A Alawi M Arafat T Hourani MK Method development validation
and bioequivalence of varenicline in human plasma by liquid chromatography
tandem mass spectrometry J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci
2013931134-139
106 Hegstad S Stray-Pedersen A Olsen L Vege A Rognum TO Morland J
Christophersen AS Determination of cotinine in pericardial fluid and whole
blood by liquid chromatography-tandem mass spectrometry J Anal Toxicol
200933(4)218-222
107 Santos MG Moraes Gde O Nakamura MG dos Santos-Neto AJ Figueiredo
EC Restricted access molecularly imprinted polymers obtained by bovine serum
albumin andor hydrophilic monomers external layers a comparison related to
physical and chemical properties Analyst 2015140(22)7768-7775
108 de Lima MM Vieira AC Martins I Boralli VB Borges KB Figueiredo EC
On-line restricted access molecularly imprinted solid phase extraction of
ivermectin in meat samples followed by HPLC-UV analysis Food Chem
2015197(Pt A)7-13
109 Barbosa AF Barbosa VM Bettini J Luccas PO Figueiredo EC Restricted
access carbon nanotubes for direct extraction of cadmium from human serum
samples followed by atomic absorption spectrometry analysis Talanta
2016131213-220
110 de Faria HD Abrao LC Santos MG Barbosa AF Figueiredo EC New
advances in restricted access materials for sample preparation A review Anal
Chim Acta 201795943-65
111 FRANQUI L S et al Synthesis and characterization of a magnetic molecularly
imprinted polymer for the selective extraction of nicotine and cotinine from
urine samples followed by GC-MS analysis Anal Methods 2015 7(21) 9237ndash
9244 2015
112 Santos MG Tavares IM Barbosa AF Bettini J Figueiredo EC Analysis of
tricyclic antidepressants in human plasma using online-restricted access
molecularly imprinted solid phase extraction followed by direct mass
spectrometry identificationquantification Talanta 20171638-16
113 US Department of Health and Human Services Food and Drug Administration
(FDA) Center for Drug Evaluation and Research (CDER)Center for Veterinary
Medicine (CVM) Guidance for IndustryBioanalytical method validation
Biopharmaceutics 2013
114 GOMES Raphael A B et al Evaluation of the pH influence on protein
exclusion by restricted access carbono nanotubes coated with bovine serum
albumin Journal Of Materials Science 2016 51(16)7407-7414
99
115 de Faria HD Rosa MA Silveira AT Figueiredo EC Direct extraction of
tetracyclines from bovine milk using restricted access carbon nanotubes in a
column switching liquid chromatography system Food Chem 201722598-106
116 de Faria HD Bueno CT Krieger JE Krieger EM Pereira AC Santos P
Figueiredo EC Online extraction of antihypertensive drugs and their metabolites
from untreated human serum samples using restricted access carbon nanotubes
in a column switching liquid chromatography system J Chromatogr A
2017152841-52
117 Petersen GO Leite CE Chatkin JM Thiesen FV Cotinine as a biomarker of
tobacco exposure development of a HPLC method and comparison of matrices
J Sep Sci 201033(4-5)516-521
118 Brunen S Vincent PD Baumann P Hiemke C Havemann-Reinecke U
Therapeutic drug monitoring for drugs used in the treatment of substance-related
disorders literature review using a therapeutic drug monitoring appropriateness
rating scale Ther Drug Monit 201133(5)561-572
119 Ryan RE Loiacono RE Nicotine regulates alpha7 nicotinic receptor subunit
mRNA implications for nicotine dependence Neuroreport 200112(3)569-
572
120 Cameli C Bacchelli E De Paola M Giucastro G Cifiello S Collo G Cainazzo
MM Pini LA Maestrini E Zoli M Genetic variation in CHRNA7 and
CHRFAM7A is associated with nicotine dependence and response to varenicline
treatment Eur J Hum Genet 201826(12)1824-1831
121 Wallace TL Bertrand D Importance of the nicotinic acetylcholine receptor
system in the prefrontal cortex Biochem Pharmacol 201385(12)1713-1720
122 Dempster EL Toulopoulou T McDonald C Bramon E Walshe M Wickham H
Sham PC Murray RM Collier DA Episodic memory performance predicted by
the 2bp deletion in exon 6 of the alpha 7-like nicotinic receptor subunit gene
Am J Psychiatry 2006163(10)1832-1834
123 Enioutina EY Myers EJ Tvrdik P Hoidal JR Rogers SW Gahring LC The
nicotinic receptor Alpha7 impacts the mouse lung response to LPS through
multiple mechanisms PLoS One 201510(3)e0121128
124 Sinkus ML Graw S Freedman R Ross RG Lester HA Leonard S The human
CHRNA7 and CHRFAM7A genes A review of the genetics regulation and
function Neuropharmacology 201596(Pt B)274-288
125 Gault J Robinson M Berger R Drebing C Logel J Hopkins J Moore T Jacobs
S Meriwether J Choi MJ Kim EJ Walton K Buiting K Davis A Breese C
Freedman R Leonard S Genomic organization and partial duplication of the
human alpha7 neuronal nicotinic acetylcholine receptor gene (CHRNA7)
Genomics 199852(2)173-185
100
126 Riley B Williamson M Collier D Wilkie H Makoff A A 3-Mb map of a large
Segmental duplication overlapping the alpha7-nicotinic acetylcholine receptor
gene (CHRNA7) at human 15q13-q14 Genomics 200279(2)197-209
127 Benhammou K Lee M Strook M Sullivan B Logel J Raschen K Gotti C
Leonard S [(3)H]Nicotine binding in peripheral blood cells of smokers is
correlated with the number of cigarettes smoked per day Neuropharmacology
200039(13)2818-2829
128 Kunii Y Zhang W Xu Q Hyde TM McFadden W Shin JH Deep-Soboslay A
Ye T Li C Kleinman JE Wang KH Lipska BK CHRNA7 and CHRFAM7A
mRNAs co-localized and their expression levels altered in the postmortem
dorsolateral prefrontal cortex in major psychiatric disorders Am J Psychiatry
2015172(11)1122-1130
129 Breese CR Lee MJ Adams CE Sullivan B Logel J Gillen KM Marks MJ
Collins AC Leonard S Abnormal regulation of high affinity nicotinic receptors
in subjects with schizophrenia Neuropsychopharmacology 200023(4)351-
364
130 Freedman R Hall M Adler LE Leonard S Evidence in postmortem brain tissue
for decreased numbers of hippocampal nicotinic receptors in schizophrenia Biol
Psychiatry 199538(1)22-33
131 Guan ZZ Zhang X Blennow K Nordberg A Decreased protein level of
nicotinic receptor alpha7 subunit in the frontal cortex from schizophrenic brain
Neuroreport 199910(8)1779-1782
132 Martin-Ruiz CM Haroutunian VH Long P Young AH Davis KL Perry EK
Court JA Dementia rating and nicotinic receptor expression in the prefrontal
cortex in schizophrenia Biol Psychiatry 200354(11)1222-1233
133 Marutle A Zhang X Court J Piggott M Johnson M Perry R Perry E
Nordberg A Laminar distribution of nicotinic receptor subtypes in cortical
regions in schizophrenia J Chem Neuroanat 200122(1-2)115-126
134 Leonard S Breese C Adams C Benhammou K Gault J Stevens K Lee M
Adler L Olincy A Ross R Freedman R Smoking and schizophrenia abnormal
nicotinic receptor expression Eur J Pharmacol 2000393(1-3)237-242
135 Kumari V Postma P Nicotine use in schizophrenia the self medication
hypotheses Neurosci Biobehav Rev 200529(6)1021-1034
136 de Leon J Diaz FJ A meta-analysis of worldwide studies demonstrates an
association between schizophrenia and tobacco smoking behaviors Schizophr
Res 200576(2-3)135-157
101
137 Flomen RH Collier DA Osborne S Munro J Breen G St Clair D Makoff AJ
Association study of CHRFAM7A copy number and 2 bp deletion
polymorphisms with schizophrenia and bipolar affective disorder Am J Med
Genet B Neuropsychiatr Genet 2006141B(6)571-575
138 Gault J Hopkins J Berger R Drebing C Logel J Walton C Short M Vianzon
R Olincy A Ross RG Adler LE Freedman R Leonard S Comparison of
polymorphisms in the alpha7 nicotinic receptor gene and its partial duplication
in schizophrenic and control subjects Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet
2003123B(1)39-49
139 Perl O Strous RD Dranikov A Chen R Fuchs S Low levels of alpha7-
nicotinic acetylcholine receptor mRNA on peripheral blood lymphocytes in
schizophrenia and its association with illness severity Neuropsychobiology
200653(2)88-93
140 Raux G Bonnet-Brilhault F Louchart S Houy E Gantier R Levillain D Allio
G Haouzir S Petit M Martinez M Frebourg T Thibaut F Campion D The -2
bp deletion in exon 6 of the alpha 7-like nicotinic receptor subunit gene is a risk
factor for the P50 sensory gating deficit Mol Psychiatry 20027(9)1006-1011
141 Leonard S Gault J Hopkins J Logel J Vianzon R Short M Drebing C Berger
R Venn D Sirota P Zerbe G Olincy A Ross RG Adler LE Freedman R
Association of promoter variants in the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor
subunit gene with an inhibitory deficit found in schizophrenia Arch Gen
Psychiatry 200259(12)1085-1096
142 Mathew SV Law AJ Lipska BK Davila-Garcia MI Zamora ED Mitkus SN
Vakkalanka R Straub RE Weinberger DR Kleinman JE Hyde TM Alpha7
nicotinic acetylcholine receptor mRNA expression and binding in postmortem
human brain are associated with genetic variation in neuregulin 1 Hum Mol
Genet 200716(23)2921-2932
143 Severance EG Yolken RH Novel alpha7 nicotinic receptor isoforms and
deficient cholinergic transcription in schizophrenia Genes Brain Behav
20087(1)37-45
144 Severance EG Dickerson FB Stallings CR Origoni AE Sullens A Monson
ET Yolken RH Differentiating nicotine- versus schizophrenia-associated
decreases of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor transcript CHRFAM7A
in peripheral blood lymphocytes J Neural Transm (Vienna) 2009116(2)213-
220
145 Olincy A Freedman R Nicotinic mechanisms in the treatment of psychotic
disorders a focus on the alpha7 nicotinic receptor Handb Exp Pharmacol
2012 (213)211-232
146 Kariminejad A Almadani N Khoshaeen A Olsson B Moslemi AR Tajsharghi
H Truncating CHRNG mutations associated with interfamilial variability of the
102
severity of the Escobar variant of multiple pterygium syndrome BMC
Genet201617(1)71
147 Liu Y Wang L Yang YK Liang Y Zhang TJ Liang N Yang LM Li SJ Shan
D Wu QQ Prenatal diagnosis of fetal skeletal dysplasia using targeted next-
generation sequencing an analysis of 30 cases Diagn Pathol 201914(1)76
148 Natera-de Benito D Topf A Vilchez JJ Gonzalez-Quereda L Dominguez-
Carral J Diaz-Manera J Ortez C Bestue M Gallano P Dusl M Abicht A
Muller JS Senderek J Garcia-Ribes A Muelas N Evangelista T Azuma Y
McMacken G Paipa Merchan A Rodriguez Cruz PM Camacho A Jimenez E
Miranda-Herrero MC Santana-Artiles A Garcia-Campos O Dominguez-Rubio
R Olive M Colomer J Beeson D Lochmuller H Nascimento A Molecular
characterization of congenital myasthenic syndromes in Spain Neuromuscul
Disord 201727(12)1087-1098
149 Seo J Choi IH Lee JS Yoo Y Kim NK Choi M Ko JM Shin YB Rare cases
of congenital arthrogryposis multiplex caused by novel recurrent CHRNG
mutations J Hum Genet 201560(4)213-215
150 Keskitalo-Vuokko K Pitkaniemi J Broms U Heliovaara M Aromaa A Perola
M Ripatti S Salminen O Salomaa V Loukola A Kaprio J Associations of
nicotine intake measures with CHRN genes in Finnish smokers Nicotine Tob
Res201113(8)686-690
151 Saccone NL Saccone SF Hinrichs AL Stitzel JA Duan W Pergadia ML
Agrawal A Breslau N Grucza RA Hatsukami D Johnson EO Madden PA
Swan GE Wang JC Goate AM Rice JP Bierut LJ Multiple distinct risk loci
for nicotine dependence identified by dense coverage of the complete family of
nicotinic receptor subunit (CHRN) genes Am J Med Genet B Neuropsychiatr
Genet 2009150B(4)453-466
152 Saccone NL Schwantes-An TH Wang JC Grucza RA Breslau N Hatsukami
D Johnson EO Rice JP Goate AM Bierut LJ Multiple cholinergic nicotinic
receptor genes affect nicotine dependence risk in African and European
Americans Genes Brain Behav 20109(7)741-750
153 Santoro ML Ota VK Stilhano RS Silva PN Santos CM Diana MC Gadelha
A Bressan RA Melaragno MI Han SW Abilio VC Belangero SI Effect of
antipsychotic drugs on gene expression in the prefrontal cortex and nucleus
accumbens in the spontaneously hypertensive rat (SHR) Schizophr Res
2014157(1-3)163-168
154 Kuhn J Vollmer T Martin C Hendig D Knabbe C Fast and sample cleanup-
free measurement of nicotine and cotinine by stable isotope dilution ultra-
performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry J Pharm
Biomed Anal 201267-68137-143
103
155 Scherf-Clavel M Wahl O Menke A Unterecker S Determination of
hydroxybupropion in human serum for routine therapeutic drug monitoring in
psychiatry A tool for dose-individualization in treatment with bupropion
Biomed Chromatogr 201933(10)e4609
156 Dobrinas M Choong E Noetzli M Cornuz J Ansermot N Eap CB
Quantification of nicotine cotinine trans-3-hydroxycotinine and varenicline in
human plasma by a sensitive and specific UPLC-tandem mass-spectrometry
procedure for a clinical study on smoking cessation J Chromatogr B Analyt
Technol Biomed Life Sci 2011879(30)3574-3582
157 Onoue S Yamamoto N Seto Y Yamada S Pharmacokinetic study of nicotine
and its metabolite cotinine to clarify possible association between smoking and
voiding dysfunction in rats using UPLCESI-MS Drug Metab Pharmacokinet
201126(4)416-422
158 Petrides AK Moskowitz J Johnson-Davis KL Jannetto PJ Langman LJ Clarke
W Marzinke MA The development and validation of a turbulent flow-liquid
chromatography-tandem mass spectrometric method for the simultaneous
quantification of citalopram sertraline bupropion and hydroxybupropion in
serum Clin Biochem 201447(15)73-79
Rubrica participante Rubrica pesquisador
APEcircNDICE - TCLE
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
HOSPITAL DAS CLIacuteNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SAtildeO
PAULO-HCFMUSP
Registro das explicaccedilotildees do pesquisador ao paciente ou seu representante legal sobre a pesquisa consignando
Vocecirc estaacute sendo convidado (a) a participar de um projeto de pesquisa Este projeto tem
como objetivos principais para os indiviacuteduos fumantes submetidos aos tratamentos
farmacoloacutegicos antitabagismo associar o efeito das caracteriacutesticas geneacuteticas (DNA ou RNA) e do
metabolismo (concentraccedilatildeo dos produtos de metabolismo dos medicamentos no sangue) com a
eficiecircncia do tratamento antitabagismo O objetivo do estudo eacute saber por que algumas pessoas
respondem bem aos medicamentos antitabagismo enquanto outras pessoas natildeo respondem e
consequentemente natildeo conseguem parar de fumar Para isto precisaremos de amostras de
sangue cuja quantidade eacute comumente solicitada em exames laboratoriais de rotina (2 tubos a
cada visita = 20mL) Precisaremos tambeacutem do seu consentimento para que dados de seu
prontuaacuterio meacutedico sejam consultados Para os pacientes que utilizaratildeo o medicamento
bupropiona precisaremos de amostras de sangue na primeira consulta (visita T-1) e duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento medicamentoso (visita T2) Para os pacientes que utilizaratildeo
o medicamento vareniclina precisaremos de uma amostra de sangue na primeira consulta (visita
T-1) na segunda consulta ndash ainda antes de iniciar o tratamento com medicamento (visita T0) duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento medicamentoso (visita T2) e quatro semanas apoacutes o iniacutecio
do tratamento medicamentoso (visita T4) Os desconfortos mais comuns que podem ocorrer com
sua participaccedilatildeo neste estudo satildeo os mesmos de uma coleta de sangue no braccedilo por exemplo
leve dor no local da punccedilatildeo e eventualmente hematoma local Este sangue seraacute encaminhado
ao Laboratoacuterio de Geneacutetica e Cardiologia Molecular do Instituto do Coraccedilatildeo onde seraacute
armazenado somente para a pesquisa Sua participaccedilatildeo eacute totalmente voluntaacuteria Apoacutes ler
entender e esclarecer suas duacutevidas vocecirc assinaraacute 2 vias de igual teor desse documento (termo de
consentimento Livre e Esclarecido) Ainda vocecirc poderaacute solicitar o seu desligamento deste projeto
a qualquer momento bastando para tal entrar em contato os pesquisadores no tel (11) 2661-5592
ou 2661-5995 Em qualquer etapa do estudo vocecirc teraacute acesso aos profissionais responsaacuteveis
pela pesquisa para esclarecimento de eventuais duacutevidas O pesquisador responsaacutevel eacute a Dra
Jaqueline Scholz que pode ser encontrada no endereccedilo Av Dr Eneacuteas de Carvalho Aguiar 44
Instituto do Coraccedilatildeo Bloco 2 andar 1 Programa Ambulatorial de Tratamento Tabagismo
INCOR-HCFMUSP telefone (11) 2661-5592 Se vocecirc tiver alguma consideraccedilatildeo ou duacutevida sobre
a eacutetica da pesquisa entre em contato com o Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa (CEP) ndash Rua Oviacutedio
Pires de Campos 225 ndash 5ordm andar ndash tel (11) 2661-7585 FAX (011) 2661-7585 ndash e-mail
Rubrica participante Rubrica pesquisador
cappesqadmhcfmuspbr Poderaacute tambeacutem solicitar a destruiccedilatildeo das amostras que estaratildeo
armazenadas no mesmo laboratoacuterio
As informaccedilotildees obtidas seratildeo analisadas em conjunto com outros pacientes natildeo sendo
divulgada a identificaccedilatildeo de nenhum paciente Natildeo haveraacute nenhuma despesa por parte do
participante Tambeacutem natildeo haacute compensaccedilatildeo financeira relacionada agrave sua participaccedilatildeo
Benefiacutecio direto para o participante eacute a possibilidade de parar de fumar e ser bem monitorado
durante todo o processo de 12 semanas
Estas informaccedilotildees poderatildeo auxiliar na elaboraccedilatildeo de programas eficazes para o uso
da informaccedilatildeo das caracteriacutesticas individuais em usuaacuterios de medicamentos antitabagismo
Acredito ter sido suficientemente informado a respeito das informaccedilotildees que li ou que
foram lidas para mim descrevendo o estudo ldquoAnaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de
expressatildeo gecircnica dos genoacutetipos preditores de metabolizaccedilatildeo e das concentraccedilotildees de
metaboacutelitos com a resposta ao tratamento antitabagismordquo Eu discuti com o Dra Jaqueline
Scholz com a Juliana da Rocha dos Santos eou Paulo Roberto Xavier Tomaz sobre a minha
decisatildeo em participar nesse estudo Ficaram claros para mim quais satildeo os propoacutesitos do
estudo os procedimentos a serem realizados seus desconfortos e riscos as garantias de
confidencialidade e de esclarecimentos permanentes Concordo voluntariamente em participar
deste estudo e poderei retirar o meu consentimento a qualquer momento antes ou durante o
mesmo sem penalidades ou prejuiacutezo ou perda de qualquer benefiacutecio que eu possa ter
adquirido ou no meu atendimento neste Serviccedilo
_____________________________________________________________________________________
Assinatura do pacienterepresentante legal Data
____________________________________________________________________________
Assinatura da testemunha Data
para casos de pacientes menores de 18 anos analfabetos semi-analfabetos ou portadores de deficiecircncia auditiva ou visual
(Somente para o responsaacutevel do projeto)
Declaro que obtive de forma apropriada e voluntaacuteria o Consentimento Livre e Esclarecido deste
paciente ou representante legal para a participaccedilatildeo neste estudo
____________________________________________________________________________
Assinatura do pesquisador Data
Rubrica participante Rubrica pesquisador
DADOS DE IDENTIFICACcedilAtildeO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSAacuteVEL LEGAL
1NOME
DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nordm SEXO M F
DATA NASCIMENTO
ENDERECcedilO NordmAPTO
BAIRROCIDADE
ESTADOCEPTELEFONE()
2RESPONSAacuteVEL LEGAL
NATUREZA (grau de parentesco tutor curador etc)
DOCUMENTO DE IDENTIDADE SEXO M F
DATA DE NASCIMENTOENDERECcedilO
Nordm APTO
BAIRROCIDADE ESTADOCEPTELEFONE() ___________________________________________________________________________________________________________________________
DADOS SOBRE A PESQUISA
1 TIacuteTULO DO SUBPROJETO DE PESQUISA ldquoAnaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de expressatildeo gecircnica dos genoacutetipos
preditores de metabolizaccedilatildeo e das concentraccedilotildees de metaboacutelitos com a resposta ao tratamento antitabagismordquo
PESQUISADOR RESPONSAacuteVEL Dr Jaqueline Scholz
CARGOFUNCcedilAtildeO Meacutedico Assistente Meacutedico Pesquisador ndash InCor ndash HCFMUSP CRM SP nordm 60179
UNIDADE DO HCFMUSP Programa Ambulatorial de Tratamento Tabagismo InCor-HCFMUSP
PESQUISADOR EXECUTANTE Juliana da Rocha dos Santos CRF SP nordm 62776
CARGOFUNCcedilAtildeO POacuteS-GRADUANDAndash InCor ndash HCFMUSP
UNIDADE DO HC-FMUSP Laboratoacuterio de Geneacutetica e Cardiologia Molecular InCor-HCFMUSP
3 AVALIACcedilAtildeO DO RISCO DA PESQUISA
RISCO MIacuteNIMO RISCO MEacuteDIO
RISCO BAIXO x RISCO MAIOR
4 DURACcedilAtildeO DA PESQUISA 4 anos
ANEXO 1 ndash Aprovaccedilatildeo no Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa
ANEXO 2 - Teste de Fagerstroumlm para a dependecircncia agrave nicotina (versatildeo em Portuguecircs)
Fonte Pietrobon RC Barbisan JN Manfroi WC Utilizaccedilatildeo do teste de dependecircncia agrave nicotina de
Fagerstroumlm como um instrumento de medida do grau de dependecircncia Versatildeo em Portuguecircs Rev HCPA
200727(3)31-6
ANEXO 3 - Escore de consumo situacional Issa
Fonte Issa J S Um novo escore para dependecircncia a nicotina e uma nova escala de conforto do paciente durante
o tratamento do tabagismo J Bras Pneumol 38(6) 761-5
ANEXO 4 ndash Desenho de estudo do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticos na escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismordquo
Desenho do estudo Seraacute randomizado em dois braccedilos um nuacutemero amostral total de 300 pacientes No braccedilo da esquerda 150 pacientes seratildeo tratados com base em teste geneacutetico para os
polimorfismos CYP2B6 (rs2279343) e CHRNA4 (rs1044396) No braccedilo da direita 150 pacientes faratildeo o tratamento tradicional com vareniclina (o faacutermaco de maior efetividade no tratamento
antitabagismo) Em um estudo anterior nosso grupo de pesquisadores 5152 mostrou maior sucesso terapecircutico nos pacientes portadores dos genoacutetipos AA para o gene CYP2B6 nos pacientes
tratados com bupropiona e nos portadores dos genoacutetipos CT e TT para o gene CHRNA4 nos pacientes tratados com vareniclina A escolha do tratamento no braccedilo farmacogeneacutetico prioriza o
tratamento mais barato (bupropiona) dessa forma primeiramente eacute analisado o genoacutetipo para o rs2279343 se o paciente apresentar o genoacutetipo AA o mesmo eacute tratado com bupropiona se ele tiver
o genoacutetipo AG ou GG eacute analisado o genoacutetipo para o polimorfismo rs1044396 Se o paciente apresentar o genoacutetipo CT ou TT para o rs1044396 ele eacute tratado com vareniclina se ele apresentar o
genoacutetipo CC (natildeo favoraacutevel a nenhum dos faacutermacos) ele eacute tratado com vareniclina e bupropiona em uso concomitante Seraacute comparado o custo-efetividade do tratamento baseado em
farmacogeneacutetica em relaccedilatildeo ao tratamento com vareniclina Os pacientes satildeo acompanhados por 12 semanas durante o tratamento farmacoloacutegico visita inicial (T-1) antes do iniacutecio da terapecircutica
(T0) 2 4 6 8 e 12 semanas apoacutes o tratamento (T2 T4 T6 T8 T12) Obs Os pacientes que natildeo conseguirem parar de fumar ateacute a 4 ordf semana de tratamento em monoterapia eacute adicionada a
segunda medicaccedilatildeo Fonte Eficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticos na escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismo InCor-HCFMUSP Projeto de doutorado da Dra Patriacutecia Viviane Gaya
sob a orientaccedilatildeo da Dr Jaqueline R Scholz desenvolvido a partir dos resultados dos estudos da nossa equipe de pesquisadores Rocha Santos et al 2015 67 e Tomaz et al 2015 68
ANEXO 5 ndash Pedido de depoacutesito de patente na Agecircncia de Inovaccedilatildeo e Empreendedorismo da
Universidade Federal de Alfenas-MG
Dedicatoacuteria
Dedico esse trabalho primeiramente a Deus meu Pai querido que me guia e sempre
me concede ao que haacute de melhor
Aos meus pais Gedeatildeo e Deolinda ao meu marido Sidnei e aos irmatildeos e sobrinhos que
sempre me incentivaram e me apoiaram em todos os momentos
Agradecimentos
Ao meu orientador Dr Paulo Caleb
Obrigada Paulo por ter apostado e confiado em mim eu natildeo tenho palavras
para agradecer diante de tudo que vocecirc me ensinou Hoje me sinto mais confiante e
parte dessa confianccedila devo a vocecirc Obrigada por me ajudar a amadurecer e por ter
sido tatildeo compreensiacutevel em momentos difiacuteceis Te considero mais que um mentor vocecirc eacute
tambeacutem um grande amigo
Ao meu amigo mestrando Paulo Roberto
Muito obrigada por tudo Fico feliz que Deus meu deu a graccedila de ter vocecirc como
amigo A sua participaccedilatildeo foi essencial neste trabalho Obrigada por me ouvir e me
ajudar acredito que ainda faremos muitas coisas juntos
Aos Doutores Alexandre Pereira Jaqueline Issa Patriacutecia Gaya Tacircnia Ogawa
Abe e Regina
Obrigada pelas dicas instruccedilotildees correccedilotildees e pelo conhecimento
proporcionado Jaque Paty Tania e Regina esse estudo natildeo teria existido sem o
excelente trabalho que vocecircs executam no ambulatoacuterio do tabagismo Vocecircs foram
fundamentais
Aos meus amigos do laboratoacuterio de Geneacutetica e cardiologia molecular Leiliane
Emanuelle Mariana Faacutebinho Faacutebio Bruna Gabriela Venturini Pamela Tamiris
Kalliandra Michelle Sabrina Liacutegia Gabriele Darezzo Theacuteo Mauriacutecio Isabela Almir
Fernanda Karina Mariliza Renata Carmona Ana Piesco Ednalva e Andreacuteia e
Maacutercio
Agradeccedilo a instruccedilatildeo e auxiacutelio na parte teacutecnica desse trabalho e muito obrigada
pela amizade companhia conselhos brincadeiras e almoccedilos juntos
Aos doutores Eduardo Costa de Figueiredo Henrique Dipe Faria e Isarita
Martins do LATF (Unifal MG)
Obrigada pela colaboraccedilatildeo neste trabalho Obrigada por esse produto maravilhoso
desenvolvido no laboratoacuterio de vocecircs (o novo RAM) Tenho a certeza que seraacute de
grande aplicabilidade Obrigada pela mensuraccedilatildeo das amostras Henrique muito
obrigada pela paciecircncia em explicar o trabalho que vocecircs realizaram Muito obrigada
pelo tempo disponibilizado e pelos dados fornecidos
Ao Prof Dr Joseacute Eduardo Krieger e ao LGCM (FMUSP)
Obrigada por disponibilizar a infraestutura do laboratoacuterio equipamentos
materiais e reagentes para execuccedilatildeo deste trabalho
Aos membros titulares e suplentes da banca examinadora
Muito obrigada pelo aceite do convite e por todas as sugestotildees e contribuiccedilotildees
Agrave FAPESP agrave CAPES e agrave CNPQ
Agradeccedilo o apoio financeiro para a execuccedilatildeo desse trabalho
A Deus
Pai muito obrigada pelo Senhor ter me dado essa oportunidade maravilhosa O
Senhor sempre me preparou o melhor e creio que continuaraacute preparando Obrigada
por me dar forccedilas em todos os momentos Te amo
Agrave minha famiacutelia
Obrigada por toda compreensatildeo Obrigada pelo apoio e por terem acreditado
na minha capacidade Vocecircs satildeo uma becircnccedilatildeo e essenciais na minha vida Amo vocecircs
Ao meu marido Sidnei
Lindo te amo muito Obrigada por ter me incentivado Obrigada pelos chaacutes
chocolates e comindinhas que vocecirc sempre ia me trazendo enquanto eu estava
escrevendo este trabalho Obrigada por ter me ajudado nas tarefas domeacutesticas tambeacutem
para que eu pudesse ter tempo para me dedicar Obrigada por todo amor carinho e
cumplicidade Vocecirc eacute um marido excelente
ldquoPorque os meus pensamentos natildeo satildeo os vossos pensamentos nem os vossos
caminhos os meus caminhos diz o Senhor Porque assim como os ceacuteus satildeo mais
altos do que a terra assim satildeo os meus caminhos mais altos do que os vossos
caminhos e os meus pensamentos mais altos do que os vossos pensamentos rdquo
Isaiacuteas 5589
Esta tese estaacute de acordo com as seguintes normas em vigor no momento desta
publicaccedilatildeo
Referecircncias adaptado de International Committee of Medical Journals Editors
(Vancouver)
Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Medicina Divisatildeo de Biblioteca e
Documentaccedilatildeo Guia de apresentaccedilatildeo de dissertaccedilotildees teses e monografias Elaborado
por Anneliese Carneiro da Cunha Maria Julia de A L Freddi Maria F Crestana
Marinalva de Souza Aragatildeo Suely Campos Cardoso Valeacuteria Vilhena 3a ed Satildeo Paulo
Divisatildeo de Biblioteca e Documentaccedilatildeo 2011 Abreviaturas dos tiacutetulos dos perioacutedicos
de acordo com List of Journals Indexed in Index Medicus
SUMAacuteRIO
LISTA DE ABREVIATURAS SIacuteMBOLOS E SIGLAS
LISTA DE EQUACcedilOtildeES
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE QUADROS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
11 Nicotina farmacodinacircmica e farmacocineacutetica 3
12 Faacutermacos antitabagismo 5
121 Vareniclina 6
1211 Farmacodinacircmica 6
1212 Farmacocineacutetica 7
122 Bupropiona 9
1221 Farmacodinacircmica 9
1222 Farmacocineacutetica 10
13 Pesquisa de biomarcadores 11
131 Estudos farmacogeneacuteticos e de expressatildeo gecircnica para vareniclina e bupropiona 12
132 Mensuraccedilatildeo de nicotina bupropiona vareniclina e seus metaboacutelitos em amostras
bioloacutegicas 15
2 JUSTIFICATIVA 17
3 OBJETIVOS 19
4 METODOLOGIA 20
41 Casuiacutestica 20
42 Fluxo de procedimentos adotados no atendimento aos pacientes 23
43 Coleta e armazenamento das amostras dos pacientes tratados com vareniclina e
bupropiona 26
44 Nuacutemero amostral 27
45 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica para amostras de pacientes tratados com vareniclina 28
451 Concentraccedilatildeo purificaccedilatildeo e extraccedilatildeo de RNA 28
452 Siacutentese de cDNA 31
453 Ensaio de controle de qualidade das amostras para o ensaio de expressatildeo gecircnica 31
454 Ensaio de expressatildeo gecircnica 35
455 Anaacutelise dos dados de expressatildeo gecircnica 37
46 Mensuraccedilatildeo de bupropiona vareniclina e de seus metaboacutelitos por HPLC-MSMS 38
461 Materiais equipamentos e condiccedilotildees adotadas para a mensuraccedilatildeo dos analitos apoacutes
validaccedilatildeo do meacutetodo 38
462 Visatildeo geral do desenvolvimento da coluna e padronizaccedilatildeo da anaacutelise 41
463 Desenvolvimento da coluna RAM para a purificaccedilatildeo da amostra 43
464 Caracterizaccedilatildeo do novo RAM 46
4641 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA 46
4642 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas no soro 46
4643 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA em diferentes pHs 47
465 Paracircmetros espectromeacutetricos 47
466 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatograacutefico multidimensional 48
467 validaccedilatildeo analiacutetica 49
47 Anaacutelise estatiacutestica 49
5 RESULTADOS 51
51 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica 51
511 Dados cliacutenicos e demograacuteficos 51
512 Dados de expressatildeo gecircnica 53
513 Anaacutelise de associaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica entre os desfechos e os tempos de
tratamento 54
52 Mensuraccedilatildeo dos analitos 58
521 Caracterizaccedilatildeo da coluna teste exclusatildeo de proteiacutenas e interferentes da matriz 58
522 Otimizaccedilatildeo dos paracircmetros espectromeacutetricos 60
523 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatrograacutefico multidimensional 61
524 Validaccedilatildeo analiacutetica 64
525 Dados cliacutenicos e demograacuteficos dos pacientes submetidos a mensuraccedilatildeo dos analitos
69
526 Anaacutelise de associaccedilatildeo dos analitos com desfecho de tratamento 72
6 DISCUSSAtildeO 75
61 Para os dados da anaacutelise de expressatildeo gecircnica 75
62 Para os dados da mensuraccedilatildeo dos analitos 80
7 CONCLUSOtildeES 87
8 SUGESTOtildeES PARA ESTUDOS FUTUROS 88
9 REFEREcircNCIAS 89
APEcircNDICE ndash TCLE
ANEXO 1 ndash Aprovaccedilatildeo no Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa
ANEXO 2 ndash Teste de Fagerstroumlm para a dependecircncia agrave nicotina (versatildeo em Portuguecircs)
ANEXO 3 - Escore de consumo situacional Issa
ANEXO 4 - Desenho de estudo do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticos na
escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismordquo
ANEXO 5 -Pedido de depoacutesito de patente na Agecircncia de Inovaccedilatildeo e Empreendedorismo
da Universidade Federal de Alfenas-MG
LISTA DE ABREVIATURAS SIacuteMBOLOS E SIGLAS
API Ionizaccedilatildeo em pressatildeo atmosfeacuterica - Atmospheric pressure ionization
ACTB Gene que codifica a proteiacutena β actina
ANKK1 Gene codificador da proteiacutena quinase envolvida em vias de transduccedilatildeo de sinal
B2M Gene que codifica a microbulina subunidade β2
BC3 Tampatildeo de reaccedilao de transcriptase reversa
BR1 Tampatildeo de ressuspensatildeo
BR2 Tampatildeo de ligaccedilatildeo
BR3 Tampatildeo de lavagem 1
BR4 Tampatildeo de lavagem 2
BR5 Tampatildeo de eluiccedilatildeo
BRT Tubos PAXgene
BSA Albumina de soro bovino
[C14] Carbono 14 (isoacutetopo radioativo do carbono de massa atocircmica 14)
cDNA DNA complementar sintetizado a partir de uma moleacutecula de RNA
CHRNA3 Gene codificador do receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α3
CHRNA4 Gene codificador da subunidade α4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNA5 Gene codificador da subunidade α5 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNA6 Gene codificador da subunidade α6 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNA7 Gene codificador da subunidade α7 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNB2 Gene codificador da subunidade β2 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNB3 Gene codificador da subunidade β3 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNB4 Gene codificador da subunidade β4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNG Gene codificador do receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade δ
CNTs Nanotubos de carbono - Carbon nanotubes
COMT Gene codificador da enzima catecol-O-metiltransferase (metaboliza dopamina)
CS ndash SPE Extraccedilatildeo em fase soacutelida no modo column switching
CT Ciclo de linha de base ndash threshold cicle (nuacutemero de ciclo em que a amostra
amplificou)
CYP2B6 Gene codificador do receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade γ
CYP2B6 Gene codificador da isoenzima CYP2B6
Disco QC Disco para a realizaccedilatildeo do controle de qualidade de amostras que seratildeo utilizadas
para o ensaio de expressatildeo gecircnica
DN Dependecircncia agrave nicotina
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
DNAse Enzima que degrada moleacuteculas de DNA
dNTP Dinucleotiacutedeos dATP dCTP dGTP e dTTP
DRD1 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 1
DRD2 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 2
DRD3 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 3
DRD4 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 4
E Erro relativo
EDTA Aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico
Escore Issa Escore de consumo situacional Issa
ESI+ Ionizaccedilatildeo positiva por electrospray - positive Electrospray ionization
FDA Orgatildeo de controle de alimentos e medicamentos americano ndash Food and drug
administration
FTND Teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fargestroumlm test for nicotine
dependence
g Velocidade de rotaccedilatildeo em forccedila g a qual considera a aceleraccedilatildeo da gravidade
GDC Controle de contaminaccedilatildeo de DNA genocircmico do disco QC
GE Tampatildeo de degradaccedilatildeo de DNA genocircmico
HGDC Controle de contaminaccedilatildeo de DNA genocircmico do ensaio de expressatildeo gecircnica
HPLC Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia ndash High Performance Liquid
Cromatograph
HPLC-MSMS Cromatografica liacutequida de alta eficiecircncia seguida por espectrometria de massas
em tandem ndash High Performance Liquid Cromatograph fowed by tandem Mass
Spectrometric
HPRT1 Gene que codifica a enzima hipoxantina fosforribosiltransferase 1
HTR3A Gene codificador da subunidade 3A do receptor de serotonina
HTR3B Gene codificador da subunidade 3B do receptor de serotonina
KV Energia de colisatildeo em quilovolt
LC-MS Cromatografia liacutequida seguida de espectrometria de massas - Liquid
Cromatograph fowed by Mass Spectrometric
LD Limite de detecccedilatildeo
LLE Extraccedilatildeo liacutequido-liacutequido (com o uso de solvente)
LQ Limite de quantificaccedilatildeo
LogP Coeficiente de particcedilatildeo relaccedilatildeo das concentraccedilotildees da substacircncia em um solvente
orgacircnico e em aacutegua dado que ambos os solventes satildeo necessariamente imisciacuteveis
MCT Microtubos de 15 mL
MS Espectrometria de massas - Mass Spectrometric
MRM Muacuteltiplas transiccedilotildees de monitoramento de reaccedilatildeo - multiple reaction monitoring
MSMS Espectrometria de massas em tandem
mz Relaccedilatildeo massacarga dos analitos
nAChR(s) Receptor(es) acetilcoliacutenico (s) nicotiacutenico (s)
NMR Taxa de metabolizaccedilatildeo da nicotina ndash Nicotine metabolite ratio
NTC Controle negativo
NTR Controle de natildeo transcriccedilatildeo reversa
OCT2 Transportador catiocircnico orgacircnico
P2 Controle externo de RNA
PAF Programa de Assistecircncia ao Fumante
PBMC Ceacutelulas mononucleares de sangue perifeacuterico - Peripheral blood mononuclear cell
PCR Amplificaccedilatildeo em cadeia da polimerase
PIs Padrotildees internos
PK Enzima proteinase K
pKa Valor negativo do logaritmo da constante de dissociaccedilatildeo de um aacutecido
pKb Valor negativo do logaritmo da constante de dissociaccedilatildeo de uma base
PP Extraccedilatildeo por preciptaccedilatildeo de proteiacutenas
PPC Controle positivo de PCR
PRC Coluna de rotaccedilatildeo de RNA vermelho
PSC Coluna de rotaccedilatildeo do homogeneizador lilaacutes
PT Tubo de processamento
RAM Material de acesso restrito ndash restrict access material
Rcf Forccedila centriacutefuga relativa ndash Relative centrifugal force
RDD Tampatildeo de digestatildeo de DNA
RE3 Mix de transcriptase reversa
RNA Aacutecido ribonucleico
RNase Enzima ribonuclease a qual degrada as moleacuteculas de RNA
RNFD Soluccedilatildeo matildee de DNase
RNFW Aacutegua livre de RNase
RFLP Restriccedilatildeo enzimaacutetica - Restriction fragment length polymorphism
RP‐HPLC Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia em fase reversa ndash Reverse-Phase High
Performance Liquid Cromatograph
Rpm Rotaccedilatildeo por minuto
RSD Desvio padratildeo relativo
SLC6A3 Gene codificador da proteiacutena transportadora de dopamina
SLC22A2 Gene codificador da proteiacutena OCT2 transportadora de caacutetions orgacircnicos
(transporta vareniclina)
SNC Sistema nervoso central
SPE Extraccedilatildeo em fase soacutelida
Sty I Enzima de restriccedilatildeo proveniente da Salmonella Typhi
TAE Tampatildeo formado com Tris Acetato e EDTA
TRN Terapia de reposiccedilatildeo nicotiacutenica
UGT2B7 Gene codificador da enzima UGT2B7 a qual metaboliza a vareniclina
UPLC Cromatografica liacutequida de ultra eficiecircncia - Ultra Performance Liquid
Cromatograph
UV Detector ultravioleta
α3 Subunidade alfa 3 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α4 Subunidade alfa 4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α5 Subunidade alfa 5 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α6 Subunidade alfa 6 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α7 Subunidade alfa 7 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
β2 Subunidade beta 2 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
β4 Subunidade beta 4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
T-1 Visita inicial
T0 Visita de iniacutecio do tratamento (coleta realizada antes de comeccedilar o tratamento no
mesmo dia)
T2 Visita de 2 semanas apoacutes tratamento farmacoloacutegico
T4 Visita de 4 semanas apoacutes tratamento farmacoloacutegico
T12 Visita de 12 semanas apoacutes tratamento farmacoloacutegico
TFC Cromatografia liacutequida turbulenta - Turbulent flow-liquid chromatography
LISTA DE EQUACcedilOtildeES
∆CT= (CTamostra ndash a meacutedia de CThousekeeping genes) Normalizaccedilatildeo da expressatildeo
gecircnica dos genes alvo atraveacutes de valores de expressatildeo de genes fisioloacutegicos
2-∆CT Transformaccedilatildeo dos valores de ∆CT em escala logariacutetmica para a realizaccedilatildeo
dos testes de hipoacutetese
∆∆CT= (mediana de ∆CTgrupo teste ndash mediana de ∆CT grupo referecircncia) Foacutermula
utilizada para posterior caacutelculo de fold change Considera-se os dois grupos
envolvidos no teste de hipoacutetese
2-∆∆CT Transformaccedilatildeo dos dados de ∆∆CT em escala logariacutetmica Atraveacutes dessa
foacutermula se obteacutem o fold change (diferenccedila de expressatildeo entre dois grupos)
NMR=(trans-3-hidroxicotininacotinina) Taxa de metabolizaccedilatildeo da nicotina
NMRlt031=metabolizador lento NMRgt031 metabolizador normal ou raacutepido
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Analitos precursores fragmentos e energias de colisatildeo
otimizados
40
Tabela 2 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina selecionados para os ensaios de expressatildeo gecircnica
52
Tabela 3 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina submetidos aos ensaios de expressatildeo gecircnica de acordo
com o desfecho de tratamento
52
Tabela 4 - Valores de mediana de ∆CT dos genes de acordo com os
tempos de tratamento e grupos de desfecho
53
Tabela 5 - Fold change e anaacutelise de associaccedilatildeo entre os tempos de
tratamento e grupos de desfecho
54
Tabela 6 - Paracircmetros de validaccedilatildeo obtidos na determinaccedilatildeo de faacutermacos
antitabagismo em soro humano
68
Tabela 7 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos
69
Tabela 8 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de
acordo com o desfecho de tratamento
70
Tabela 9 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos
71
Tabela 10 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes
tratados com bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos
analitos de acordo com o desfecho de tratamento
71
Tabela 11 ndash Frequecircncia do desfecho de tratamento nos pacientes
submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com os
medicamentos antitabagismo
72
Tabela 12 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos
pacientes tratados com vareniclina
73
Tabela 13 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de
tratamento com vareniclina
73
Tabela 14 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos
pacientes tratados com bupropiona
74
Tabela 15 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de
tratamento com bupropiona
74
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Aacutereas estimuladas atraveacutes de vias dopamineacutergicas e
serotonineacutergicas e sistema de recompensa
2
Figura 2 - Receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico 4
Figura 3 - Via primaacuteria do metabolismo da nicotina 5
Figura 4 - Mecanismo de accedilatildeo da vareniclina 7
Figura 5 - Metabolismo da vareniclina em humanos 8
Figura 6 - Mecanismo de accedilatildeo da bupropiona 9
Figura 7 - Metabolismo da bupropiona em seus principais metaboacutelitos ativo 11
Figura 8 - Desenho do estudo 22
Figura 9 - Representaccedilatildeo do Rotor-Disc100 33
Figura 10 - Mapa do disco QC (representaccedilatildeo planilhada) 33
Figura 11 - Exemplo de ajuste de Threshold 34
Figura 12 - Mapa do disco do ensaio RT2 profiler PCR array (representaccedilatildeo
planilhada)
37
Figura 13 - Representaccedilatildeo da composiccedilatildeo da coluna extratora (Novo RAM) 45
Figura 14 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNA7 entre os tempos de
tratamento e desfecho
56
Figura 15 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNG entre os tempos de
tratamento e desfecho
57
Figura 16 - Heat map de expressatildeo gecircnica 58
Figura 17 ndash Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com soluccedilatildeo de
BSA
59
Figura 18 - Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com amostra de
soro diluiacuteda
59
Figura 19 - Influecircncia do pH na exclusatildeo de proteiacutenas 60
Figura 20 - Ilustraccedilatildeo do sistema de columm switching na configuraccedilatildeo de
backflush
62
Figura 21 - Cromatograma obtido de amostras de soro branco diluiacutedas em
aacutegua ultra pura
65
Figura 22 - Cromatograma obtido apoacutes anaacutelise de soro diluiacutedo e dopado com
os analitos no niacutevel meacutedio de calibraccedilatildeo e mais os padrotildees internos deuterados
65
Figura 23 - Cromatograma obtido atraveacutes da anaacutelise das amostras de soro dos
pacientes tratados com bupropiona
67
Figura 24 - Cromatograma obtido atraveacutes da analise de amostras de soro de
pacientes tratados com vareniclina
67
LISTA DE QUADROS
Quadro 1- Procedimentos do protocolo em relaccedilatildeo aos pacientes 25
Quadro 2 - Paracircmetros de qualidade do ensaio QC 34
Quadro 3 - Genes escolhidos para o ensaio de expressatildeo 36
Quadro 4 - Housekeeping genes 36
Quadro 5 - Propriedades fiacutesico-quiacutemicas dos analitos 42
Quadro 6 ndash Comparaccedilatildeo dos dados de validaccedilatildeo com outros estudos 85
RESUMO
Santos JR Anaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de expressatildeo gecircnica e das concentraccedilotildees
de metaboacutelitos com a resposta ao tratamento antitabagismo [tese] Satildeo Paulo
Faculdade de Medicina Universidade de Satildeo Paulo 2020
Introduccedilatildeo O tabagismo eacute considerado a maior causa de morbidade e mortalidade
evitaacutevel no mundo Estudos tecircm buscado a identificaccedilatildeo de preditores de resposta aos
tratamentos de cessaccedilatildeo tabaacutegica Os principais objetivos deste estudo foram analisar a
possiacutevel associaccedilatildeo da expressatildeo de genes alvo e das concentraccedilotildees de analitos
(faacutermacos antitabagismo nicotina e seus metaboacutelitos) com a resposta ao tratamento
Meacutetodos Foram incluiacutedos 105 pacientes fumantes que iniciariam o tratamento com
vareniclina (n=74) ou bupropiona (n=31) As anaacutelises de expressatildeo gecircnica foram
realizadas atraveacutes do ensaio customizado RTsup2 Profiler PCR Array com a inclusatildeo de 17
genes para a anaacutelise em ceacutelulas mononucleares de sangue perifeacuterico (PBMC) A
preparaccedilatildeo das amostras de soro para a mensuraccedilatildeo dos analitos foi realizada atraveacutes de
uma coluna extratora composta por nanotubos hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados
com a adiccedilatildeo de grupos hidrofiacutelicos (material de acesso restrito - RAM) desenvolvida
no LATF Unifal MG A mensuraccedilatildeo dos analitos foi realizada por cromatografia
liacutequida de alta eficiecircncia em modo column switching seguida de espectrometria de
massa em tandem (HPLC-MSMS) Os tempos para a coleta de amostras foram para as
anaacutelises de expressatildeo gecircnica (sangue total) antes de iniciar o tratamento (T0) duas e
quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento (T2 e T4 respectivamente) e para a
mensuraccedilatildeo dos analitos (soro) as amostras foram coletadas na T2 Resultados Para as
anaacutelises de expressatildeo gecircnica selecionamos 14 pacientes que obtiveram sucesso e 13
pacientes resistentes ao tratamento com vareniclina Foi considerado sucesso quando o
paciente alcanccedilava abstinecircncia ao tabaco ateacute a 4 ordf semana de tratamento e resistente
quando o paciente natildeo conseguia parar de fumar ateacute a 4ordf semana de tratamento Foi
observada diferenccedila significativa para a expressatildeo do gene CHRNA7 no grupo
resistente amostras dos tempos T2 e T4 apresentaram menor expressatildeo comparadas ao
tempo T0 (fold change 038 P=0007 fold change 067 P=0004 respectivamente)
Para a mensuraccedilatildeo dos analitos a coluna RAM desenvolvida mostrou alta capacidade
para a remoccedilatildeo de macromoleacuteculas e de anaacutelise conjunta dos diferentes analitos aleacutem
de poder ser reutilizada diversas vezes (cerca de 400 ciclos) Os pacientes do grupo
resistente tratados com ambos os faacutermacos apresentaram maior concentraccedilatildeo de
metaboacutelitos da nicotina na T2 No entanto natildeo houve associaccedilatildeo dos faacutermacos e seus
metaboacutelitos com desfecho de tratamento Conclusotildees Para as anaacutelises de expressatildeo
gecircnica este estudo exploratoacuterio mostrou um possiacutevel preditor de efetividade no
tratamento com vareniclina reafirmando a associaccedilatildeo da subunidade α7 para os
processos de dependecircncia agrave nicotina e tratamento antitabagismo Estes resultados
podem contribuir ao menos em parte para o desenvolvimento de uma terapia
individualizada Contudo estudos futuros satildeo necessaacuterios para o entendimento do papel
da subunidade α7 dos receptores acetilcoliacutenicos-nicotiacutenicos no tratamento com
vareniclina Para a mensuraccedilatildeo dos analitos o novo RAM sintetizado eacute um produto de
extremo valor cientiacutefico podendo apresentar diversas aplicaccedilotildees em anaacutelise de amostras
com matrizes complexas sem muita preparaccedilatildeo preacutevia Para a associaccedilatildeo das
concentraccedilotildees dos faacutermacos e seus metaboacutelitos com o desfecho de tratamento satildeo
necessaacuterios estudos com um maior nuacutemero amostral
Descritores Vareniclina Bupropiona Nicotina Abandono do haacutebito de fumar
Expressatildeo gecircnica Biomarcadores farmacoloacutegicos
ABSTRACT
Santos JR Association analysis of gene expression profiles and metabolite
concentrations with response for smoking cessation treatment [thesis] Satildeo Paulo
ldquoFaculdade de Medicina Universidade de Satildeo Paulordquo 2020
Introduction Smoking is considered the largest cause of preventable morbidity and
mortality in the worldwide Studies have sought to identify predictors of responses to
smoking cessation treatments The main objectives of this study were to analyze the
possible association of the expression of target genes and concentrations of analytes
(drugs for smoking cessation nicotine and their metabolites) with the response to
treatment Methods We included 105 smoker patients who would start treatment with
varenicline (n=74) or bupropion (n=31) Gene expression analysis was performed
through custom RTsup2 Profiler PCR array assay including 17 genes for analysis in
peripheral blood mononuclear cells (PBMC) Serum sample preparation for the
measurement of analytes was performed by an extraction column composed of hybrid
carbon and silica nanotubes modified with the addition of hydrophilic groups (restricted
access material - RAM) developed by LATF Unifal MG The measurement of analytes
was performed by high efficient liquid chromatography in column switching mode
followed by tandem mass spectrometry (HPLC-MSMS) Times for sample collection
were for gene expression analysis (total blood) before start of therapy (T0) two and
four weeks after start of treatment (T2 and T4 respectively) and for measurement of
analytes (serum) the samples were collected at T2 Results For gene expression
analysis we selected 14 patients who had success and 13 patients resistant to the
varenicline treatment Success was considered to be when a patient achieved tobacco
abstinence until the 4th week of treatment and resistant was when a patient had not
stopped smoking as of the 4th week of treatment We observed a significant difference
for CHRNA7 gene expression in the resistant group samples from T2 and T4 had lower
expression compared with T0 (fold change 038 P=0007 fold change 067 P=0004
respectively) For measurement of analytes the developed RAM column showed high
capacity to remove macromolecules and joint analyzes of different analytes besides
being able to be reuse manny times (about 400 cycles) Patients from resistant group of
the both drugs treatment had a higher concentration of nicotine metabolites in T2
However there was no association of drugs for smoking cessation and their metabolites
with outcome treatment Conclusions For gene expression analysis this exploratory
study showed a possible predictor of effectiveness in the treatment with varenicline
reaffirming the association of the α7 subunit for nicotine dependence and smoking
therapy processes These results may contribute at least in part to the development of
individualized therapy However further studies are needed to understand the role of the
α7 subunit of acetylcholinic-nicotinic receptors in varenicline treatment For the
measurement of analytes the new synthesized RAM is a product of extreme scientific
value being able of several applications in the analysis of samples with complex
matrices without much prior preparation For an association of drugs for smoking
cessation and their metabolites with outcome treatment studies with a larger sample
size are needed
Descriptors Varenicline Bupropion Nicotine Smoking cessation Gene expression
Biomarkers pharmacological
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
O tabagismo eacute considerado a maior causa de morbidade e mortalidade evitaacutevel
em todo o mundo 1 Doenccedilas cardiacuteacas cerebrovasculares cerca de um quinto de todos
os tipos de cacircnceres doenccedilas pulmonares como apneia e enfisema aleacutem de distuacuterbios
preacute-natais estatildeo associadas ao consumo do tabaco 2-5
Dados recentes da Vigitel mostraram que no conjunto das 27 capitais brasileiras
a frequecircncia de adultos fumantes foi de 93 com valores duas vezes maior no sexo
masculino (121) do que no feminino (69) As menores frequecircncias foram
encontradas na populaccedilatildeo de jovens adultos (antes dos 25 anos) e em pessoas de mais
de 65 anos As maiores frequecircncias foram encontradas entre homens em Porto Alegre
(173) Campo Grande e Satildeo Paulo (156) 6
A nicotina eacute o principal componente do tabaco causador de dependecircncia Esta
age nos receptores acetilcoliacutenicos-nicotiacutenicos (nAChRs) promovendo a liberaccedilatildeo de
diversos neurotransmissores e neuroreguladores tais como dopamina acetilcolina
epinefrina norepinefrina serotonina beta-endorfina vasopressina e GABA O principal
neurotransmissor estudado eacute a dopamina pois a nicotina promove aumento de seus
niacuteveis na regiatildeo mesocorticoliacutembica cerebral principalmente em um circuito conhecido
como ldquosistema de recompensardquo (aacuterea tegmental ventral nuacutecleo accumbens e coacutertex preacute-
frontal) gerando sensaccedilotildees de prazer e bem-estar 7-15
O processo de adiccedilatildeo agrave nicotina eacute complexo e nem todos os mecanismos estatildeo
elucidados Aleacutem da ativaccedilatildeo do sistema de recompensa haacute a formaccedilatildeo de memoacuterias
associativas do efeito hedocircnico com os ambientes e situaccedilotildees de disponibilidade e uso
do tabaco resultando em reforccedilo positivo apoacutes o fumante entrar em contato com fatores
relacionados ao seu consumo Este tipo de memoacuteria aprendida envolve a amigdala o
hipocampo o coacutertex preacute-frontal e o coacutertex parietal 15-17 Evidecircncias tambeacutem satildeo
2
consistentes com a hipoacutetese da ativaccedilatildeo do estriado dorsal o qual estaacute envolvido no
processamento de memoacuterias de formaccedilatildeo de haacutebito em processos motores o que
poderia automatizar o ato de fumar 15 18 (Figura 1)
O uso continuado do tabaco promove a desensibilizaccedilatildeo e adaptaccedilatildeo dos
nAChRs causando toleracircncia e diminuiccedilatildeo dos efeitos de recompensa naturais Como
resultado o indiviacuteduo experimenta fissura ansiedade humor deprimido e irritabilidade
na ausecircncia da nicotina Estes sintomas acabam promovendo um reforccedilo negativo para o
fumo e o nuacutemero de cigarros consumidos aumenta cada vez mais 14 15
Todos os fatores acima mencionados contribuem para o mecanismo de
dependecircncia agrave nicotina (DN) Os efeitos hedocircnicos estatildeo relacionados com o processo
de iniciaccedilatildeo do tabagismo enquanto os efeitos negativos da falta da nicotina estatildeo mais
associados agrave manutenccedilatildeo do fumo 15
Para os indiviacuteduos que desejam parar de fumar o tratamento farmacoloacutegico
antitabagismo eacute o que apresenta maior eficaacutecia na reduccedilatildeo da prevalecircncia de fumantes
19
Figura 1 - Aacutereas estimuladas atraveacutes de vias dopamineacutergicas e serotonineacutergicas e sistema de recompensa A
Principais vias ativadas na dependecircncia como a aacuterea tegmental ventral nuacutecleos accumbens e da rafe coacutertex-frontal
estriado susbstacircncia negra e hipocampo As setas em rosa indicam aacutereas estimuladas pelas vias serotonineacutergicas de
transmissatildeo e em azul pelas vias dopamineacutergicas gerando diversos comportamentos B Sistema de recompensa
(composto pela VTA nuacutecleo accumbeacutens e coacutertex preacute-frontal) A nicotina age nos nAChRs no SNC gerando uma
3
descarga de dopamina no sistema de recompensa Haacute uma adaptaccedilatildeo desses receptores com o fumo continuado
fazendo com que haja a necessidade de maior consumo de nicotina e o desenvolvimento da dependecircncia VTA= aacuterea
tegmental ventral SNC sistema nervoso central nAChR= receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico Fonte adaptado de
Habermann A Brain awareness week addiction and the brainrsquos reward system Sovereign Health Group 2016 e de
Koob amp Volkow 2009 14
11 Nicotina farmacodinacircmica e farmacocineacutetica
O fumo permite uma titulaccedilatildeo precisa da dose de nicotina por parte do fumante
Sua absorccedilatildeo eacute raacutepida chegando em cerca de 10 segundos em todo o sistema nervoso
central (SNC) onde se liga nos nAChRs 20 21 22
Os nAChRs satildeo receptores de canais iocircnicos compostos por cinco subunidades
que podem estar combinadas de diferentes formas (Figura 2) 20 Os subtipos desses
receptores mais abundantes no ceacuterebro humano satildeo os α4β2 α3β4 e α7 (homomeacuterico)
Os receptores compostos pelas subunidades α4β2 (o asterisco indica que outras
subunidades podem estar presentes) possuem um papel fundamental na DN O nocaute
da subunidade β2 em ratos resultou na eliminaccedilatildeo dos efeitos comportamentais da
nicotina 23 Quanto agrave subunidade α4 parece estar envolvida na sensibilidade agrave nicotina
o que pode impactar nos efeitos de recompensa dessensibilizaccedilatildeo e toleracircncia24 25 Os
receptores compostos pelas subunidades α3β4 acredita-se mediar os efeitos
cardiovasculares 26 Os nAChRs α7 homomeacuterico estatildeo envolvidos na velocidade de
sinapses em processos de aprendizagem e controle sensorial 27 28 Os receptores
compostos pelas subunidades α4β2lowast podem conter outras subunidades como por
exemplo α5 α6 eou β3 as quais podem modificar a sensibilidade e funccedilatildeo do receptor
21 29
Como um agonista desses receptores a nicotina promove a sua abertura
permitindo a entrada de soacutedio e caacutelcio despolarizando assim a membrana dos
neurocircnios Aleacutem da entrada de caacutelcio atraveacutes dos nAChRs haacute tambeacutem a abertura de
4
canais de caacutelcio voltagem dependentes fazendo com que as vesiacuteculas que armazenam
os neurotransmissores sejam liberadas 20 21 O resultado da ativaccedilatildeo dos nAChRs em
neurocircnios poacutes-sinaacutepticos eacute a liberaccedilatildeo de diversos neurotransmissores ativando vaacuterias
aacutereas como jaacute mencionado
Figura 2 - Receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico O receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico funciona como um
canal iocircnico transmembracircnico Sua composiccedilatildeo eacute pentacircmera ou seja eacute formada por 5 subunidades que
podem se combinar de diferentes formas As subunidades satildeo classificadas de acordo com diferenccedilas nos
domiacutenios da sua estrutura proteiacuteca A acetilcolina e a nicotina satildeo agonistas desses receptores fazendo
com que os mesmos sejam abertos Assim ocorre a entrada de soacutedio despolarizando a membrana
gerando o potencial de accedilatildeo ACh= acetilcolina Nicot= Nicotina Na+= soacutedio K+= potaacutessio α =
subunidade alfa β= subunidade beta δ= subunidade delta γ= subunidade gama Fonte adaptado de Rang
amp Dale Farmacologia 5 ed Elsevier 2012
Haacute oscilaccedilatildeo dos picos de nicotina entre um cigarro e outro mas as quantidades
se acumulam entre 6 e 9 horas em um fumo regular saturando os nAChR causando
desensibilizaccedilatildeo adaptaccedilatildeo toleracircncia sintomas de abstinecircncia na falta do fumo e DN
30
A nicotina eacute rapidamente e extensivamente metabolizada pelo fiacutegado atraveacutes da
isoenzima CYP2A6 (e em menor grau pelas isoenzimas CYP2B6 e CYP2E1) agrave nicotina
-iacuteon iacuteminio e apoacutes pela enzima aldeiacutedo oxidase agrave cotinina O tempo de meia vida da
nicotina eacute de aproximadamente 2 horas e da cotinina 16 horas Posteriormente a
5
cotinina eacute metabolizada em trans-3-hidroxicotinina quase que exclusivamente pela
CYP2A6 (outros isocircmeros da hidroxicotina representam menos de 2 da dose) 31 32
(Figura 3) Esta eacute a maior via de metabolizaccedilatildeo da nicotina (70 - 80 do metabolismo
da nicotina em todo o corpo) 33 no entanto haacute vias menores como por exemplo a
glucoronidaccedilatildeo que pode ser a maior determinante no clearence da nicotina em
indiviacuteduos com menor atividade da CYP2A6 31
Figura 3 - Via primaacuteria do metabolismo da nicotina A nicotina eacute
metabolizada marjoritaramente pela isoenzima CYP2A6 em nicotina-
iacuteon imiacutenio e atraveacutes da enzima aldeiacutedo oxidase eacute convertida em
cotinina A cotinina eacute posteriomente metabolizada em trans-3-
hidroxicotinina novamente pela isoenzima CYP2A6 Fonte adaptado
de Llaquet et al 2010 34
12 Faacutermacos antitabagismo
Os medicamentos de primeira escolha aprovados pela Agecircncia Nacional de
Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) incluem tratamentos com base na terapia de reposiccedilatildeo
nicotiacutenica (TRN) como adesivo goma e pastilha e tambeacutem satildeo utilizados vareniclina e
bupropiona Estes uacuteltimos possuem maior eficaacutecia terapecircutica na cessaccedilatildeo tabaacutegica 35 36
6
121 Vareniclina
1211 Farmacodinacircmica
A vareniclina eacute o faacutermaco mais recentemente utilizado para a interrupccedilatildeo do
tabagismo este foi desenvolvido especificamente para atuar nos nAChRs A sua
farmacodinacircmica estaacute mais associada agrave atuaccedilatildeo como um agonista parcial nos nAChRs
compostos pelas subunidades α4β2 37 os quais satildeo importantes alvos de accedilatildeo da
nicotina pois satildeo necessaacuterios e suficientes para a recompensa toleracircncia e
sensibilizaccedilatildeo 25 38 39 (Figura 4)
Estudos mostraram que em relaccedilatildeo agrave nicotina a vareniclina possui 15 vezes
maior afinidade pelas subunidades α4β2 e ativa em torno de 50 a liberaccedilatildeo de
dopamina no sistema mesocorticoliacutembico 37 O faacutermaco atua tambeacutem em outros
nAChR como nos nAChRs (α3β4) age fracamente nos receptores contendo a
subunidade α6 e em nAChRs (α3β2) aleacutem de exercer atividade agonista total nos
receptores α7 40
Quanto agraves reaccedilotildees adversas no uso do faacutermaco a naacuteusea eacute a mais comum (cerca
de 10 a 45 dos indiviacuteduos tratados) a qual muitas vezes leva agrave natildeo aderecircncia ao
tratatamento 41-43
7
Figura 4 - Mecanismo de accedilatildeo da vareniclina A Na ausecircncia da vareniclina a nicotina se liga aos
nAChRs aumentando a ativaccedilatildeo nesses receptores Aleacutem disso haacute o estiacutemulo endoacutegeno (promovido
pela acetilcolina) B A vareniclina eacute um agonista parcial de nAChR (α4β2) ou seja tambeacutem estimula
os nAChRs mas em menor niacutevel do que a nicotina e ao mesmo tempo eacute antagonista na presenccedila de
nicotina fazendo com que ela natildeo consiga se ligar ao receptor Fonte do autor baseado nas
informaccedilotildees de Kassem et al 2012 37
1212 Farmacocineacutetica
A vareniclina eacute rapidamente absorvida pelo trato intestinal com absorccedilatildeo gt90
logo apoacutes a administraccedilatildeo oral As concentraccedilotildees plasmaacuteticas maacuteximas satildeo alcanccediladas
no periacuteodo entre 3 e 4 horas 44 e o estado de equiliacutebrio da sua concentraccedilatildeo ocorre
dentro de 4 dias 37 44-46 O faacutermaco possui baixa ligaccedilatildeo com proteiacutenas plasmaacuteticas
sendo que de acordo com ensaios in vitro a fraccedilatildeo de vareniclina (100 ngmL) livre foi
de 797 47 A sua biodisponibilidade natildeo eacute afetada pelo tempo de administraccedilatildeo ou
ingestatildeo de alimentos 37 45 46 Aleacutem disso a vareniclina possui ampla distribuiccedilatildeo nos
tecidos sendo que o volume meacutedio de distribuiccedilatildeo aparente eacute de 415 litros
apresentando um coeficiente de variaccedilatildeo (CV) de 50 48
Na circulaccedilatildeo humana a vareniclina se encontra em quantidade marjoritaacuteria satildeo
tambeacutem encontrados os metaboacutelitos conjugados vareniclina N-carbomoil glucoroniacutedeo
8
N-formilvareniclina e oxovareniclina O tempo de meia vida da vareniclina eacute em torno
de 24 horas independente da dose administrada
A eliminaccedilatildeo do faacutermaco e metaboacutelitos se daacute principalmente pela urina (99) 49
A eliminaccedilatildeo renal exibe cineacutetica linear e a sua excreccedilatildeo ocorre pela filtraccedilatildeo
glomerular na qual estaacute associada agrave secreccedilatildeo tubular realizada pelo transportador
catiocircnico orgacircnico OCT2 O clearence estimado da vareniclina eacute de 88 a 155 mLmin
apoacutes administraccedilatildeo de dose uacutenica e 92 a 143 mLmin apoacutes doses repetidas A
depuraccedilatildeo de vareniclina eacute reduzida na presenccedila de doenccedila renal Na urina cerca de
90 do produto eliminado eacute encontrado como vareniclina em sua forma inalterada e
menos de 10 eacute encontrado na forma de 2 metaboacutelitos a hidroxivareniclina e a
vareniclina-N-carbomoil glucoroniacutedeo 37 49-51
Nenhum dos metaboacutelitos da vareniclina eacute acreditado ser farmacologicamente
ativo Aleacutem disso esses metaboacutelitos estatildeo presentes em concentraccedilotildees muito baixas 37
46-49 A Figura 5 mostra os metaboacutelitos provenientes da vareniclina
A formaccedilatildeo dos metaboacutelitos da vareniclina natildeo eacute catalisada pelo complexo
enzimaacutetico CYP450 Ensaios realizados com microssoma hepaacutetico humano mostraram
que a formaccedilatildeo do conjugado vareniclina N-carbomilglucoroniacutedeo eacute provavelmente
catalisado pela enzima UGT2B7 37 49
Figura 5 ndash Metabolismo da vareniclina em humanos Fonte adaptado de Obach et al 2006 49
9
122 Bupropiona
1221 Farmacodinacircmica
A bupropiona eacute um antidepressivo no entanto tem sido utilizado como faacutermaco
antitabagismo devido o seu potencial em diminuir o desejo de fumar (o qual foi
percebido durante o tramento de iacutendiviacuteduos fumantes) Como mecanismo de accedilatildeo a
bupropiona atua como um inibidor relativamente se
letivo da recaptaccedilatildeo de norepinefrina e dopamina com pequeno efeito na
recaptaccedilatildeo de serotonina (Figura 6) aleacutem de ser um antagonista de nAChR natildeo
competitivo Essas propriedades minimizam os sintomas de retirada da nicotina
aumentando a probabilidade do indiviacuteduo se abster do fumo 52
Insocircnia e boca seca satildeo as reaccedilotildees adversas mais comumente relatadas ao uso da
bupropiona (30-40 e 10 dos pacientes respectivamente) 53
Figura 6 - Mecanismo de accedilatildeo da bupropiona A Na ausecircncia da bupropiona neurotransmissores
como a noradrenalina serotonina e a dopamina satildeo recaptados endogenamente pela bomba de
recaptaccedilatildeo B Na presenccedila da bupropiona a qual eacute inibidora da bomba de recaptaccedilatildeo desses
neurotransmissores haacute a estimulaccedilatildeo do sistema de recompensa mais especificamente atraveacutes do
aumento da concentraccedilatildeo de dopamina Dessa forma o sistema continua sendo estimulado mas em
menor grau que a nicotina e as chances de abstinecircncia ao tabaco satildeo aumentadas Fonte do autor
baseado nas informaccedilotildees de Slemmer et al 2000 52
10
1222 Farmacocineacutetica
Conforme ensaios em voluntaacuterios sadios os picos maacuteximos de concentraccedilatildeo
plasmaacutetica de bupropiona satildeo alcanccedilados aproximadamente 3 horas apoacutes a sua
administraccedilatildeo oral O volume de distribuiccedilatildeo aparente eacute de aproximadamente 2000L e
a ligaccedilatildeo com proteiacutenas plasmaacuteticas eacute de 84 para a bupropiona e de 77 para a
hidroxibupropiona (o seu principal metaboacutelito ativo) 54
A bupropiona eacute metabolizada primariamente em uma seacuterie de metaboacutelitos ativos
como a hidroxibupropiona a threohidrobupropiona e a eritrohidrobupropiona (Figura
7) A CYP2B6 eacute a principal enzima que converte a bupropiona em hidroxibupropiona
em humanos No entanto a formaccedilatildeo de threohidrobupropiona e a
eritrohidrobupropiona que ocorre atraveacutes de reaccedilatildeo redutiva natildeo eacute mediada pela
CYP2B6 55 56 A eritroidrobupropiona natildeo pode ser mensurada no plasma apoacutes a
administraccedilatildeo de uma uacutenica dose de bupropiona Os metaboacutelitos ativos satildeo
posteriormente metabolizados em inativos e estes satildeo excretados na urina 54
Inibidores da CYP2B6 como por exemplo a ticlodipina um agente
antiplaquetaacuterio derivado da tienopiridina interagem com a bupropiona diminuindo a sua
hidroxilaccedilatildeo 57 58
Apoacutes a administraccedilatildeo crocircnica de doses de 150 a 300 mgdia a bupropiona e seus
metaboacutelitos assumem cineacutetica linear A bupropiona possui meia vida de 20 horas
aproximadamente e apresenta clearence meacutedio aparente correspondente a cerca de
200Lh A eliminaccedilatildeo da bupropiona ocorre principalmente atraveacutes da urina (87) e das
fezes (10) e eacute excretada em apenas 05 de forma inalterada nos mostrando um
extenso metabolismo 54
11
Figura 7 - Metabolismo da bupropiona em seus principais metaboacutelitos ativos A bupropiona eacute
extensamente metabolizada em hidroxibupropiona pela isoenzima CYP2B6 Os demais metaboacutelitos ativos
aatildeo metabolizados por outras enzimas Fonte adaptado de Hesse et al 2000 55
13 Pesquisa de biomarcadores
A variabilidade interindividual em resposta a faacutermacos antitabagismo sugere que
os tratamentos podem ser mais efetivos em subgrupos de fumantes 59-64 No contexto de
medicina personalizada diversos pesquisadores tecircm buscado a identificaccedilatildeo de
preditores de resposta aos tratamentos de cessaccedilatildeo tabaacutegica os quais geralmente estatildeo
envolvidos em aspectos farmacocineacuteticos e farmacodinacircmicos ou via de atuaccedilatildeo do
faacutermaco como por exemplo os fatores geneacuteticos o perfil de expressatildeo gecircnica de
proteiacutenas e de metaboacutelitos 65-68
Aleacutem de refletir a efetividade do tratamento estes biomarcadores tambeacutem
poderiam indicar a toxicidade ou a ocorrecircncia de efeitos adversos A combinaccedilatildeo
desses fatores com outras variaacuteveis individuais pode ser utilizada para adequar as
estrateacutegias preventivas e terapecircuticas 65-68
12
131 Estudos farmacogeneacuteticos e de expressatildeo gecircnica para vareniclina e
bupropiona
Diversos polimorfismos geneacuteticos tecircm sido associados com resposta agrave
vareniclina e agrave bupropiona 41 65 67-71
King et al 65 mostraram a associaccedilatildeo de polimorfismos de nucleotiacutedeos uacutenicos
(SNPs - single nucletide polimorfisms) nos genes CHRNA4 CHRNA5 CHRNA7
CHRNB2 (codificadores das subunidades α4 α5 α7 e β2 dos nAChRs
respectivamente) com abstinecircncia contiacutenua em resposta agrave vareniclina O mesmo
trabalho tambeacutem encontrou associaccedilatildeo dos polimorfismos nos genes CHRNA3
CHRNA5 CHRNB4 CHRNG (codificam as subunidades α3 α5 β4 e γ dos nAChR
respectivamente) Aleacutem disso os autores demonstraram a associaccedilatildeo de polimorfismos
nos genes HTR3A e HTR3B (codificadores dos receptores serotonineacutergicos) com a
frequecircncia de recaiacuteda no tratamento antitabagismo
Swan et al 41 verificaram a associaccedilatildeo de polimorfismos no gene CHRNB2 com
naacuteusea severa em pacientes tratados com vareniclina
Nosso grupo de pesquisadores encontrou a associaccedilatildeo do polimorfismo
rs10443196 no gene CHRNA4 e do polimorfismo 785AgtG no gene CYP2B6
(codificador da principal isoenzima metabolizadora da bupropiona) com uma maior taxa
de sucesso no tratamento com vareniclina e bupropiona respectivamente 67 68
O gene CYP2B6 eacute um dos alvos mais importantes de estudos farmacogeneacuteticos
no tratamento com bupropiona Diversos polimorfismos neste gene satildeo preditores de
metabolizaccedilatildeo lenta ou raacutepida os quais foram associados com as diferenccedilas de
concentraccedilotildees do faacutermaco e de seu principal metaboacutelito ativo hidroxibupropiona em
amostras bioloacutegicas Essas concentraccedilotildees tambeacutem se associaram agrave variabilidade na
resposta ao tratamento com bupropiona 72-74
13
Polimorfismos podem implicar em diversos mecanismos moleculares como por
exemplo alteraccedilatildeo constituiccedilatildeo ou conformaccedilatildeo de proteiacutenas mudanccedilas poacutes-
traducionais e a regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica gerando variabilidade interindividual
nos niacuteveis de RNA transcrito o que poderiam explicar as diferenccedilas de resposta aos
faacutermacos antitabagismo 72
O polimorfismo CHRNA4 (rs2236196) assim como diversos polimorfismos
presentes no gene CYP2B6 os quais foram associados agrave resposta ao tratamento com
vareniclina e bupropiona respectivamente foram tambeacutem associados a maiores e
menores niacuteveis de expressatildeo gecircnica 72-75 Tambeacutem vale salientar que assim como a
expressatildeo gecircnica pode afetar a resposta ao tratamento a expressatildeo gecircnica tambeacutem pode
ser alterada em resposta aos faacutermacos 76 Neste sentido Smith et al 76 mostraram que a
vareniclina pode afetar a expressatildeo gecircnica da enzima DNA metiltransferase-1 (DNMT)
que mostrou estar envolvida em mecanismos epigeneacuteticos em neurocircnios corticais
GABaeacutergicos os quais estatildeo relacionados a processos cognitivos em indiviacuteduos
esquizofrecircnicos fumantes
O tratamento crocircnico com vareniclina modificou a expressatildeo dos nAChRs em
ceacuterebros de camundongos O upregulation dos nAChRs (α4β2) pelo uso crocircnico da
vareniclina foi similar ao promovido ao uso crocircnico da nicotina Similar dowregulation
foi visto para os nAChRs (α6β2) A vareniclina aumentou significantemente ambos
nAChRs (α3β4) e α7 enquanto a nicotina teve menor efeito nestes siacutetios 77
Em estudos com pacientes voluntaacuterios a obtenccedilatildeo de amostras do sistema
nervoso central eacute inviaacutevel Como alternativa a esse problema estudos tecircm proposto a
anaacutelise de expressatildeo gecircnica em sangue perifeacuterico 78-80 Embora natildeo seja o tecido alvo da
farmacodinacircmica dos medicamentos antitabagismo o sangue possui muitas
similaridades a niacutevel transcricional com muacuteltiplas regiotildees cerebrais 81
14
Hennings et al 82 mostraram diferenccedilas no perfil de expressatildeo gecircnica em ceacutelulas
mononucleares de sangue perifeacuterico (PBMCs) de pacientes respondedores e natildeo
respondedores a tratamentos com antidepressivos e muitos dos genes diferentemente
expressos satildeo codificadores de receptores tambeacutem presentes no SNC
Ota et al 83 mostraram que os genes GABRR2 (codificador de receptor
GABAeacutergico) e CHRNA3 (codificador da subunidade α3 de nAChR) foram
diferentemente expressos em sangue perifeacuterico em resposta ao tratamento com
risperidona em pacientes com esquizofrenia
Em outro estudo Kordi-Tamandani et al 84 mostraram que os niacuteveis de
expressatildeo gecircnica de SLC6A3 em leucoacutecitos diferiram entre indiviacuteduos dependentes de
opioacuteides e voluntaacuterios saacutedios Este gene eacute codificador de uma importante proteiacutena
recaptadora de dopamina em neurocircnios chamada DAT
Wongsriraksa et al 85 mostraram a expressatildeo das subunidades α4 α5 α7 β1 e
β2 em um estudo de caracterizaccedilatildeo de nAChRs em amostras de PBMC de humanos
atraveacutes de nicotina radioligante sugerindo conter as subunidades α4β2 α4β2α5 eou α7
Por fim diversos estudos tecircm mostrado que os nAChRs satildeo importantes para processos
imunoloacutegicos 86-91
Estudos tecircm evidenciado a expressatildeo de receptores dopamineacutergicos em
leucoacutecitos humanos Embora a dopamina natildeo ultrapasse a barreira hematoencefaacutelica as
diferenccedilas nos niacuteveis de dopamina do sistema nervoso central poderiam alterar a
expressatildeo desses receptores em leucoacutecitos ainda durante a sua formaccedilatildeo via inervaccedilatildeo
da coluna espinal doenccedilas como Parkinson Alzheimer e adiccedilatildeo agraves substacircncias
psicoativas poderiam influenciar na expressatildeo desses receptores em sangue perifeacuterico 92
15
132 Mensuraccedilatildeo de nicotina bupropiona vareniclina e seus metaboacutelitos em
amostras bioloacutegicas
A nicotina possui um baixo tempo de meia-vida e a isoenzima CYP2A6 eacute
predominante responsaacutevel pelo metabolismo da nicotina em cotinina e trans-3-
hidroxicotinina (seus principais metaboacutelitos) 93 94 Estes e a nicotina satildeo marcadores de
exposiccedilatildeo ao tabaco e indicativo de fumo 95
A taxa de metabolizaccedilatildeo da nicotina (NMR) obtida pela relaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de trans-3-hidroxicotininacotinina tem sido associada com DN com
desfecho e com escolha farmacoloacutegica de tratamento antitabagismo 95 96 Os valores
contiacutenuos e categoacutericos de NMR (metabolizadores lentos vs normais e raacutepidos) se
mostraram estaacuteveis em fumantes independente da carga tabaacutegica 32 97 98
A bupropiona eacute um faacutermaco extensamente metabolizado e a principal isoenzima
envolvida em seu metabolismo eacute a CYP2B6 a qual medeia quase que exclusivamente o
processo de hidroxilaccedilatildeo desse faacutermaco formando o metaboacutelito hidroxibupropiona 55
Diversos estudos tecircm associado as concentraccedilotildees de bupropiona e de hidroxibupropiona
em amostras de soro plasma e urina com a resposta ao faacutermaco 73 74
Zhu et al 73 em um estudo cliacutenico duplo-cego e placebo controlado os
indiviacuteduos foram tratados com bupropiona ou placebo por 6 meses Na terceira semana
de tratamento foram colhidas amostras de plasma para mensuraccedilatildeo de bupropiona e seu
principal metaboacutelito ativo a hidroxibupropiona As concentraccedilotildees mais elevadas de
hidroxibupropiona resultaram em melhores resultados de cessaccedilatildeo do tabagismo
Laib et al 74 apresentaram que as concentraccedilotildees de hidroxibupropiona em soro
foram correlacionadas com as diferentes respostas agrave bupropiona em pacientes com
depressatildeo analisadas atraveacutes de uma escala de impressatildeo clinica global
16
Quanto agrave vareniclina este eacute um faacutermaco pouco metabolizado sendo que 5 a
10 da dose pode ser encontrada na forma metaboacutelitos (soro plasma e urina) 49 Os
metaboacutelitos de vareniclina jaacute identificados em humanos em estudos preacutevios satildeo
hidroxivareniclina vareniclina N-carbomoilglucoroniacutedeo oxovareniclina N-
glicosilvareniclina e N-formilvareniclina 47 49 99 Pouco se conhece sobre as enzimas
que metabolizam a vareniclina Obach et al 49 mostrou o envolvimento da enzima
UG2B7 com o processo de glucoronidaccedilatildeo do faacutermaco Ainda natildeo haacute estudos que
associam os metaboacutelitos de vareniclina com resultados de desfecho de tratamento
17
2 JUSTIFICATIVA
Considerando a elevada prevalecircncia do tabagismo e a dificuldade dos indiviacuteduos
fumantes em se abster do tabaco estudos que apontem uma terapecircutica farmacoloacutegica
mais efetiva podem contribuir enormemente para o processo de cessaccedilatildeo tabaacutegica
Neste cenaacuterio a anaacutelise da expressatildeo de genes de interesse e a mensuraccedilatildeo de analitos
podem ser ferramentas uacuteteis na identificaccedilatildeo de marcadores e de subgrupos de resposta
ao tratamento antitabagismo
Escolhemos a realizaccedilatildeo da mensuraccedilatildeo de analitos nas amostras de soro dos
pacientes tratados com ambos os faacutermacos antitabagismo (vareniclina e bupropiona) e
especialmente para os pacientes tratados com vareniclina foram realizadas anaacutelises de
expressatildeo gecircnica de ceacutelulas mononucleares provenientes de amostras de sangue
perifeacuterico (do inglecircs Peripheral Blood Mononuclear Cell - PBMC) O ensaio
customizado para as anaacutelises da expressatildeo de 17 genes foi um grande investimento
financeiro nesta pesquisa e portanto o priorizamos para analisar as amostras dos
pacientes tratados com vareniclina jaacute que eacute o faacutermaco mais novo eficaz e custoso no
tratamento antitabagismo
As anaacutelises de expressatildeo gecircnica em amostras de PBMC satildeo de grande valia pois
seria importante encontrar em amostras de tatildeo faacutecil obtenccedilatildeo como amostras de sangue
um marcador de resposta que poderia ter correlaccedilatildeo com a expressatildeo gecircnica do sistema
nervoso central
Identificar um possiacutevel marcador preditivo de sucesso na utilizaccedilatildeo de um
determinado faacutermaco no iniacutecio da sua administraccedilatildeo foi uma das investigaccedilotildees deste
protocolo Os resultados desse estudo exploratoacuterio podem ser uacuteteis no entendimento do
comportamento de expressatildeo dos genes escolhidos (mais comumente expressos no
18
SNC) em amostras de sangue e na elaboraccedilatildeo de pesquisas mais amplas para a
identificaccedilatildeo de biomarcadores de resposta ao tratamento antitabagismo
19
3 OBJETIVOS
31 Analisar a possiacutevel associaccedilatildeo da expressatildeo de genes de interesse em amostras de
sangue perifeacuterico com a resposta ao tratamento com vareniclina
32 Analisar a possiacutevel associaccedilatildeo das concentraccedilotildees de faacutermacos antibagismo nicotina
e seus metaboacutelitos com a resposta ao tratamento com vareniclina e bupropiona
20
4 METODOLOGIA
41 Casuiacutestica
Foi realizado um estudo de coorte prospectivo no qual foram incluiacutedos 105
pacientes homens e mulheres fumantes provenientes do Programa de Assistecircncia ao
Fumante (PAF) do Instituto do Coraccedilatildeo do Hospital das Cliacutenicas da Faculdade de
Medicina da Universidade de Satildeo Paulo (InCor) com idade ge 18 anos IMC ge 185 e lt
30 kgm2 e que iniciariam o tratamento com vareniclina (n=74 para a mensuraccedilatildeo dos
analitos destes n=27 para as anaacutelises de expressatildeo gecircnica) ou com bupropiona (n=31
para a mensuraccedilatildeo dos analitos) (Figura 8)
A inclusatildeo dos pacientes ocorreu atraveacutes do protocolo de pesquisa ldquoEficaacutecia do
uso de marcadores geneacuteticos na escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismordquo o
qual foi aprovado no processo de submissatildeo ao Comitecirc de Eacutetica Institucional (CAAE
60133816000000068) - SDC 434116007 (Anexo 4) O presente estudo foi aprovado
como subprojeto do anterior atraveacutes do parecer nordm 2118913 (Anexo 1) Os pacientes
foram informados do estudo e consentiram a sua participaccedilatildeo ao assinar o termo de
consentimento livre e esclarecido (Apecircndice)
Foram excluiacutedos do estudo os pacientes que possuiacutessem desordens hepaacutetica
renal e gastrointestinal que comprometessem o metabolismo e eliminaccedilatildeo dos faacutermacos
os pacientes que faziam uso de medicamentos indutores ou inibidores das enzimas do
citocromo P450 nas uacuteltimas 6 semanas os pacientes etilistas e usuaacuterios de droga os
pacientes com doenccedilas psiquiaacutetricas instaacuteveis as mulheres em risco de gravidez e os
pacientes com contra-indicaccedilatildeo ao tratamento com bupropiona ou vareniclina
mencionados acima
21
Os pacientes foram acompanhados pela equipe do PAF e o tratamento
farmacoloacutegico foi conduzido por 12 semanas Foram considerados os seguintes
desfechos no tratamento ldquosucessordquo se o paciente parasse de fumar ateacute a 4ordf semana de
tratamento (T4) e ldquoresistenterdquo se o paciente natildeo conseguisse parar de fumar ateacute a 4ordf
semana de tratamento
22
Bupropiona
n=31
Visita T-1 Visita T0
(iniacutecio da medicaccedilatildeo)
Visita T2 Visita T4
Desfecho
Vareniclina
n=74
RNA Basal Vareniclina
n= 27
RNA RNA
Mensuraccedilatildeo de analitos vs Desfecho (T2)
vareniclina nicotina cotinina e hidroxicotinina
Mensuraccedilatildeo de analitos vs Desfecho (T2)
bupropiona hidroxibupropiona nicotina cotinina e hidroxicotinina
Soro
Soro
Figura 8 - Desenho do estudo O nuacutemero amostral total do estudo foi de 105 pacientes Foram incluiacutedos 74 pacientes tratados com vareniclina e 31 pacientes tratados com bupropiona Esses foram
submetidos agrave coleta de amostras de sangue no periacuteodo de 2 semanas (T2) apoacutes o iniacutecio da terapecircutica Apoacutes foi realizada a mensuraccedilatildeo de analitos e a anaacutelise de associaccedilatildeo com os desfechos de
tratamento Aleacutem disso os pacientes tratados com vareniclina tambeacutem foram submetidos agrave coleta de amostras para a obtenccedilatildeo de RNA em trecircs distintos periacuteodos de tempo antes de iniciar a
terapecircutica (T0) 2 semanas (T2) e 4 semanas apoacutes iniciar a terapecircutica farmacocoloacutegica (T4) Amostras de 14 pacientes que obtiveram sucesso no tratamento e de 13 que obtiveram resistecircncia (n=27)
foram analisadas quanto agrave expressatildeo de 17 genes candidatos (52 amostras ao todo 9 resistentes do tempo T0 7 resistentes do T2 8 resistente do T4 9 sucessos do T0 8 sucessos do T2 e 11 sucessos
do T4 vide toacutepico 42 Nuacutemero amostral) Apoacutes foram realizadas as anaacutelises de associaccedilatildeo entre os niacuteveis dos transcritos e os desfechos e tempos de tratamento Os pacientes foram acompanhados por
12 semanas durante o tratamento farmacoloacutegico no entanto o desfecho foi definido na 4 ordf semana (T4) pois apoacutes esse periacuteodo o tratamento seria reavaliado e poderia haver mudanccedila na medicaccedilatildeo T-
1= visita inicial T0= antes do iniacutecio da terapecircutica T2= 2 semanas apoacutes o iacutenicio do tratamento T4= 4 semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento T12= 12 semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento Desfecho na
visita T4 = ldquosucessordquo se o paciente parasse de fumar ateacute a 4ordf semana de tratamento (T4) e ldquoresistenterdquo se o paciente natildeo conseguisse parar de fumar ateacute a 4ordf semana de tratamento Fonte do autor
Visita T12
Final do tratamento farmacoloacutegico
RNA vs Desfecho (T0 T2 e T4)
14 sucessos e 13 resistentes
CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2
CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3 DRD4
HTR3A HTR3B COMT e SLC6A3
23
42 Fluxo de procedimentos adotados no atendimento aos pacientes
O tratamento farmacoloacutegico antitabagismo possui a duraccedilatildeo de 3 meses (12
semanas) No estudo de ldquoEficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticosrdquo foram coletados
dados cliacutenicos em 7 visitas T-1 (visita inicial) T0 (visita de iniacutecio do tratamento) T2
T4 T6 T8 e T12 (2 4 6 8 e 12 semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico)
Neste projeto foram utilizados os tempos de visita dos pacientes nas consultas
para a realizaccedilatildeo da coleta de amostras Dessa forma foi facilitado o comparecimento
desses pacientes ao procedimento Os pacientes precisavam estar comprometidos em
administrar os medicamentos todos os dias no horaacuterio combinado e terem
disponibilidade de tempo para as coletas as quais natildeo necessariamente coincidiram
com o horaacuterio das consultas pois as coletas foram realizadas no mesmo horaacuterio de
tomada do medicamento para que as anaacutelises de todos os pacientes pudessem ser
comparaacuteveis
Na visita T-1 foi aplicado o TCLE do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores
geneacuteticosrdquo bem como o questionaacuterio para coletar informaccedilotildees cliacutenicas Aleacutem disso os
pacientes foram avaliados quanto agrave DN atraveacutes do teste de Fagerstroumlm para DN (FTND)
100 e do escore de consumo situacional Issa (escore Issa) 101 (Anexos 2 e 3
respectivamente) O escore Issa eacute utilizado pelo PAF para a reclassificaccedilatildeo como
moderados ou altamente dependentes os pacientes que obteacutem o escore de FTND abaixo
de 5 mas que no entanto possuem niacutevel de DN consideraacutevel em relaccedilatildeo aos efeitos
psicoativos da nicotina A reclassificaccedilatildeo ocorre quando os pacientes obtecircm escore Issa
ge3 Apoacutes os pacientes foram randomizados em dois braccedilos do estudo tratamento com
vareniclina ou tratamento baseado na farmacogeneacutetica Os pacientes realizaram coleta
de sangue com o objetivo de obtenccedilatildeo do DNA para o estudo ldquoEficaacutecia do uso de
marcadores geneacuteticosrdquo
24
Apoacutes a genotipagem das amostras e escolha da medicaccedilatildeo dos pacientes
(vareniclina ou conforme geneacutetica) foi realizada ligaccedilatildeo telefocircnica para o paciente
informando o medicamento que iria tomar Nesta mesma ligaccedilatildeo o paciente tambeacutem foi
convidado a participar do presente estudo e todas as informaccedilotildees quanto agrave necessidade
de tomar o medicamento antitabagismo sempre no mesmo horaacuterio quanto aos dias das
coletas bem como as informaccedilotildees de preparaccedilatildeo para os procedimentos foram
transmitidas aos pacientes
Para os pacientes que seriam tratados com vareniclina ainda foi importante levar
em consideraccedilatildeo o horaacuterio que o paciente costumava tomar cafeacute da manhatilde para entatildeo
decidir o horaacuterio de administraccedilatildeo do faacutermaco pois o mesmo precisava ser
administrado apoacutes refeiccedilatildeo generosa com o intuito de diminuir o risco de naacuteusea
As coletas foram padronizadas para serem realizadas agraves manhatildes no mesmo
horaacuterio que o paciente tomaria a primeira dose do dia do medicamento antitabaacutegico O
horaacuterio de coleta entre os pacientes foi fixado entre 7 e 10 horas da manhatilde para evitar
variaccedilatildeo circadiana interpacientes No entanto entre as coletas do mesmo paciente o
horaacuterio de coleta e de administraccedilatildeo do medicamento foi sempre o mesmo com
variaccedilatildeo natildeo superior agrave 1 hora (esta variaccedilatildeo foi registrada)
Os pacientes foram orientados a realizar jejum de 10 horas (sendo liberada a
ingestatildeo de aacutegua e outros medicamentos ateacute 1 hora antes da coleta) e trazer o
medicamento antitabaacutegico para tomar apoacutes o procedimento A dose diurna dos
medicamentos antitabagismo natildeo foi administrada antes da coleta para evitar efeitos
agudos nas anaacutelises O periacuteodo de jejum foi realizado para que a amostra tivesse menor
quantidade de interferentes possiacutevel e tambeacutem para natildeo promover efeitos agudos dos
alimentos na expressatildeo gecircnica Um dia antes de cada coleta foi realizada ligaccedilatildeo
telefocircnica ou envio de mensagem para os pacientes com o objetivo de lembraacute-los do
25
procedimento das orientaccedilotildees de preparo e confirmar o uso e o cumprimento do horaacuterio
de administraccedilatildeo do medicamento antitabagismo (essa confirmaccedilatildeo da adesatildeo foi
realizada para as coletas nas visitas T2 e T4 quando os pacientes jaacute haviam iniciado o
tratamento farmacoloacutegico)
Na visita T0 para os pacientes que iniciariam o tratamento com vareniclina foi
aplicado o TCLE do presente projeto e colheu-se uma amostra de sangue para a
obtenccedilatildeo do RNA ainda antes de iniciarem o tratamento Foram fornecidas aos
pacientes as orientaccedilotildees de como tomar o medicamento e informaccedilotildees para a proacutexima
coleta Os pacientes foram orientados agrave tomarem o medicamento neste mesmo dia ou no
dia seguinte
Na visita T2 foram coletadas amostras de soro dos pacientes tratados com
bupropiona e amostras de soro e RNA dos pacientes tratados com vareniclina
Na visita T4 foram coletadas amostras de RNA dos pacientes tratados com
vareniclina
No Quadro 1 abaixo estatildeo resumidos os procedimentos orientaccedilotildees e coletas de
amostras
Quadro 1 - Procedimentos do protocolo em relaccedilatildeo aos pacientes
T-1 Aplicaccedilatildeo do TCLE do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores
geneacuteticosrdquo
Aplicaccedilatildeo de questionaacuterios
Coleta de DNA
1 dia antes de T0 Ligaccedilatildeo para informar o medicamento que o paciente iria tomar
Convite para participar do presente estudo
Determinar com o paciente qual era o melhor horaacuterio para
26
administraccedilatildeo do medicamento antibagismo (neste mesmo horaacuterio
que foram realizadas todas as coletas)
Orientaccedilotildees para a coleta em T0
T0 Aplicaccedilatildeo do TCLE do presente estudo
Coleta de amostra de RNA (para os pacientes que seriam tratados
com vareniclina)
Orientaccedilotildees para iniciar o tratamento no mesmo dia ou dia
seguinte
1 dia antes de T2 Orientaccedilotildees para coleta em T2
Confirmaccedilatildeo se o paciente estava tomando o medicamento e no
horaacuterio combinado
T2 Aplicaccedilatildeo do TCLE do presente estudo para os pacientes tratados
com bupropiona
Coleta de soro para os pacientes tratados com bupropiona e coleta
de RNA e soro dos pacientes tratados com vareniclina
1 dia antes de T4 Orientaccedilotildees para coleta em T2
Confirmaccedilatildeo se o paciente estava tomando o medicamento e no
horaacuterio combinado
T4 Coleta de RNA dos pacientes tratados com vareniclina
43 Coleta e armazenamento das amostras dos pacientes tratados com vareniclina e
bupropiona
Os pacientes tratados com vareniclina foram submetidos agrave coleta de sangue para
a obtenccedilatildeo de RNA em 3 periacuteodos de tempo T0 (ainda antes de iniciar o tratamento T2
27
e T4 Para isto foram utilizados os tubos PAXgene Blood RNA Tubes BRT (Qiagen
USA) para a obtenccedilatildeo de RNA Apoacutes a coleta os tubos PAXgene foram encubados em
bancada por 2 horas agrave temperatura ambiente para garantir a lise completa das ceacutelulas
sanguiacuteneas e apoacutes os tubos foram armazenados a -20degC ateacute a extraccedilatildeo do RNA das
amostras
No periacuteodo T2 tambeacutem foram coletadas amostras para a obtenccedilatildeo do soro dos
pacientes tratados com vareniclina e bupropiona Neste periacuteodo as concentraccedilotildees dos
metaboacutelitos dos faacutermacos jaacute se encontravam em estado de equiliacutebrio Para isto foram
utilizados tubos sem aditivo (Vacuette Greiner Bio-one) Os tubos foram mantidos a
temperatura ambiente ateacute a formaccedilatildeo de coaacutegulo Apoacutes os tubos foram centrifugados a
4degC a 3000 rpm por 10 min para se obter amostras de soro As amostras foram entatildeo
aliquotadas em 4 criotubos de soro e armazenadas em freezer a -80ordmC ateacute o momento
das anaacutelises
44 Nuacutemero amostral
Quanto ao nuacutemero amostral para o ensaio de expressatildeo gecircnica dos 74 pacientes
tratados com vareniclina foram escolhidas amostras de 27 pacientes (14 do grupo
sucesso e 13 do grupo resistente) baseado em estudos anteriores 83 102 que seguiram
corretamente o jejum que realizaram a tomada do medicamento nos horaacuterios
combinados e compareceram em todos e tempos de coleta Sendo ao todo 81 amostras
devido aos de 3 tempos de tratamento (T0 T2 e T4)
No entanto algumas amostras natildeo apresentaram bons resultados para a anaacutelise
de expressatildeo gecircnica e realizamos o ensaio de expressatildeo para 60 amostras de diversos
tempos Oito amostras natildeo apresentaram resultados de amplificaccedilatildeo e finalizamos com
52 amostras ao todo (9 resistentes do tempo T0 7 resistentes do T2 8 resistentes do T4
28
9 sucessos do T0 8 sucessos do T2 e 11 sucessos do T4) provenientes de 14 pacientes
do grupo sucesso e 13 do grupo resistente Esse tamanho amostral para cada grupo de
anaacutelise eacute comparaacutevel agrave estudos anteriores 102
Quanto ao nuacutemero amostral para a mensuraccedilatildeo dos analitos houve a inclusatildeo de
74 pacientes tratados com vareniclina e 31 tratados com bupropiona Nuacutemero amostral
semelhante foi utilizado no estudo de Laib et al 74 Das 105 amostras 3 amostras dos
pacientes tratados com vareniclina e 1 de paciente tratado com bupropiona apresentaram
concentraccedilotildees abaixo do limite de quantificaccedilatildeo (LQ) e estas foram excluiacutedas das
anaacutelises de concentraccedilatildeo dos analitos ficando com nuacutemero amostral final de 71 para
vareniclina e 30 para bupropiona
45 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica para amostras de pacientes tratados com
vareniclina
451 Concentraccedilatildeo purificaccedilatildeo e extraccedilatildeo de RNA
O processo de purificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo do RNA foi realizado atraveacutes do
PAXgene Blood RNA Kit (Qiagen USA) Antes de iniciar o procedimento a
temperatura dos tubos PAXgene Blood tubes (BRT) (Qiagen USA) os quais estavam
armazenados em freezer -20degC foi estabilizada mantendo os tubos em temperatura
ambiente em torno de 4 horas ou over night
Para o processo de purificaccedilatildeo do RNA primeiramente realizou-se a
homogeneizaccedilatildeo do sangue total contido no tubo PAXgene Blood tubes (BRT) e a
centrifugaccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos por 10 min em 3000 rcf havendo a formaccedilatildeo de um
pellet e o sobrenadante foi desprezado Apoacutes foi realizada a lavagem do pellet
adicionando-se 4 mL de aacutegua livre de RNase (RNFW) mistura foi submetida ao voacutertex
ateacute a dissoluccedilatildeo visiacutevel do pellet e o conteuacutedo foi centrifugado por 10 minutos a 3000
29
rcf sendo descartado o sobrenadante O pellet foi ressuspendido com 350 μL de tampatildeo
de ressuspensatildeo (BR1) atraveacutes de voacutertex ateacute a sua dissoluccedilatildeo e transferido para o tubo
de microcentrifugaccedilatildeo (15 mL MCT) Foram adicionados no tubo MCT 300 μL de
tampatildeo de ligaccedilatildeo (BR2) e 40 μL de proteinase K (PK) a mistura foi submetida ao
voacutertex durante 5 segundos e incubada durante 10 minutos a 55degC com agitaccedilatildeo de 1400
rpm provocando dessa forma a digestatildeo de proteiacutenas
Apoacutes o processo de incubaccedilatildeo foram realizados diversos processos de remoccedilatildeo
de impurezas em colunas de rotaccedilatildeo O lisado foi transferido para a coluna de rotaccedilatildeo
do homogeneizador PAXgene (PSC lilaacutes) a qual foi colocada em um tubo de
processamento (PT) de 2 mL e centrifugado durante 3 minutos agrave velocidade de 16100
rcf dessa forma foi realizada a homogeneizaccedilatildeo do lisado de ceacutelulas e remoccedilatildeo dos
detritos celulares residuais Em seguida o sobrenadante da fraccedilatildeo residual foi
transferido para o tubo de microcentrifugaccedilatildeo (15 mL MCT) novo (sem interferir no
pellet) e foram adicionados 350 μL de etanol (96-100 grau de pureza PA) a mistura
foi submetida ao voacutertex e centrifugada por breves instantes (1-2 segundos 500-1000 x g)
para remover as gotas presentes no interior da tampa do tubo
Foram transferidos 700 μL de amostra para a coluna de rotaccedilatildeo de RNA
PAXgene (PRC vermelho) esta foi colocada e um tubo de processamento (PT) de 2
mL no qual foi centrifugado durante 1 minuto a 12000 rcf Apoacutes a coluna de rotaccedilatildeo
foi colocada em um tubo PT novo (o tubo PT utilizado anteriormente foi descartado) O
restante da amostra foi colocado na mesma coluna de rotaccedilatildeo PRC e o processo de
centrifugaccedilatildeo foi repetido por mais 2 vezes sempre transferindo a coluna para um tubo
de processamento novo Antes da uacuteltima centrifugaccedilatildeo foram adicionados 350 μL de
tampatildeo de lavagem 1 (BR3) na coluna PRC
30
Em seguida foram adicionados 10 μL de soluccedilatildeo-matildee de DNase I (RNFD) a 70
μL de tampatildeo de digestatildeo de DNA (RDD) em um tubo de microcentrifugaccedilatildeo de 15
mL (MCT) O conteuacutedo foi misturado suavemente e centrifugado durante breves
instantes para colher o liacutequido residual dos lados do tubo Apoacutes 80 μL dessa mistura
foram transferidos diretamente para a membrana da coluna PRC e esta foi incubada agrave
temperatura ambiente (20-30degC) durante 15 minutos
Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foram adicionados 350 μL de tampatildeo de lavagem
1 (BR3) para a membrana da coluna e esta foi centrifugada durante 1 min a 12000 rcf
Apoacutes a coluna PRC foi colocada em um tubo (PT) novo e foram adicionados 500 μL de
tampatildeo de lavagem 2 (BR4) na membrana da coluna A centrifugaccedilatildeo foi repetida o
tubo PT foi descartado e a coluna PRC foi colocada em um novo tubo PT A lavagem
com 500 uL de BR4 e a centrifugaccedilatildeo foi repetida novamente (poreacutem o tempo de
centrifugaccedilatildeo foi de 3 minutos) Apoacutes foi realizada uma centrifugaccedilatildeo adicional em um
tubo PT novo durante 1 minuto a 12000 rcf (sem adiccedilatildeo de tampatildeo)
A coluna de rotaccedilatildeo (PRC) foi colocada em tubo de 15 mL (MCT) Foram
adicionados diretamente na membrana da coluna 80 μL de tampatildeo de eluiccedilatildeo (BR5) a
qual foi encubada agrave temperatura ambiente por 5 minutos e centrifugada por 1 minuto a
12000 rcf para eluir o RNA
As amostras foram quantificadas atraveacutes de leitura em espectrofotocircmetro no
comprimento de onda 260 nm (utilizando como branco o tampatildeo BR5) e foram
armazenadas a -20ordmC ateacute o momento das anaacutelises Para avaliar a qualidade do RNA
gerado foi realizada uma eletroforese em gel de agarose para a verificaccedilatildeo da
integridade do RNA ribossomal
31
452 Siacutentese de cDNA
O processo de siacutentese de cDNA foi realizado atraveacutes do RT2 First Strand Kit
(Qiagen USA) Os reagentes do kit foram descongelados e centrifugados brevemente
(10-15 segundos)
Primeiramente foi preparada uma mix para a degradaccedilatildeo do DNA genocircmico
composta por 2microL de tampatildeo GE 800 ng de RNA e quantidade variaacutevel de aacutegua livre
de RNase ateacute o volume final de 10 μL ou 8 μL de RNA (para amostras com
concentraccedilotildees abaixo de 100 ngμL) sem a aacutegua livre de RNase A mistura foi incubada
a 42ordmC por 5 minutos Apoacutes a incubaccedilatildeo a mistura foi colocada imediatamente em gelo
durante pelo menos 1 min
Apoacutes foi preparada uma mix para a realizaccedilatildeo da transcriccedilatildeo reversa esta foi
composta por 4 microL tampatildeo 5x (BC3) 1 microL de controle P2 (controle externo de RNA) 2
microL de mix de transcriptase reversa (RE3) e 3 microL de aacutegua livre de Rnase Foram
adicionados 10 μL da mix preparada em cada tubo contendo a mix de eliminaccedilatildeo de
DNA genocircmico A mistura foi homogeneizada delicadamente com a pipeta e incubada a
42 degC durante exatamente 15 min em seguida a reaccedilatildeo foi interrompida por incubaccedilatildeo
a 95 degC durante 5 min Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foram adicionados a cada reaccedilatildeo
91 μL de aacutegua livre de RNase e a mistura foi homogeneizada atraveacutes de pipeta diversas
vezes O produto final foi armazenado a -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo em cadeia da
polimerase (PCR) em tempo real
453 Ensaio de controle de qualidade das amostras para o ensaio de expressatildeo
gecircnica
Todas as amostras de cDNA foram analisadas quanto sua qualidade pelo ensaio
de controle de qualidade (disco QC Qiagen) em disco de 100 poccedilos (representaccedilatildeo do
32
disco nas Figuras 9 e 10) atraveacutes do PCR em tempo real com equipamento Rotor Gene
6000 (Corbett) Cada disco QC tem a capacidade de analisar 12 amostras sendo
necessaacuterios 5 discos para analisar 60 amostras
O disco QC eacute composto por primers especiacuteficos para a amplificaccedilatildeo de 2
Housekeeping genes ndash ACTB e HPRT1 (genes constitutivos que satildeo necessaacuterios para a
manutenccedilatildeo baacutesica da funccedilatildeo celular e satildeo expressos em todas as ceacutelulas de um
organismo em condiccedilotildees normais e fisiopatoloacutegicas) e 6 controles 1 controle de
transcriccedilatildeo reversa (RTC) 1 controle positivo de PCR (PPC) 1 controle de
contaminaccedilatildeo com DNA genocircmico (GDC) 1 controle de natildeo transcriccedilatildeo reversa
(NTR) 1 PPC (sem amostra) e 1 controle negativo NTC (mapa na Figura 10)
Foram preparadas 12 mixes para cada uma das amostras de cDNA Sendo 92 μL
de aacutegua livre de RNase e 08 μL de cDNA essas quantidades foram multiplicadas por 6
para se ter sobra e distribuir em 5 poccedilos cada mix de amostra (poccedilos que continham
pares de primers para 2 housekeeping genes e 3 controles) Foram distribuiacutedos 10 μL de
mix e 10 μL de RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR Master Mix (Qiagen USA) em cada
poccedilo (linhas A a E) Essa master mix conteacutem corante fluorescente intercalante de DNA
Apoacutes foram preparadas 12 mixes uma para cada amostra matildee de RNA (diluiacutedo
1100) Foram utilizados 963 μL de aacutegua livre de RNase e 072 μL de RNA (1100)
essas quantidades foram multiplicadas por 3 para se ter sobra Foram pipetados 1037
μL de mix de RNA e 963 μL de RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR Master Mix em
cada poccedilo da linha F para a anaacutelise do controle de transcriccedilatildeo reversa NTR
Apoacutes foram preparadas mixes sem as amostras para os 2 uacuteltimos controles PPC
e NTC compostas por 10 μL de aacutegua e 10 μL de RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR
Master Mix (multiplicados por 24) para as linhas G e H
33
O disco foi submetido agrave seguinte programaccedilatildeo 1 ciclo de 10 minutos a 95degC
(temperatura de ativaccedilatildeo da Taq polimerase) e 40 ciclos de 15 segundos a 95degC e 30
segundos a 60degC (para a amplificaccedilatildeo e realizaccedilatildeo da captura dos dados de
fluorescecircncia) Atraveacutes do software real-time cycler (Qiagen USA) foi ajustada a linha
de base (Threshold) do graacutefico de amplificaccedilatildeo logariacutetimica do cDNA para dessa
forma remover ruiacutedos na anaacutelise e verificar em qual ciclo de PCR que cada amostra
amplificou (cicle threshold ndash CT) (Figura 11) Os valores de CT foram planilhados e
analisados conforme os paracircmetros de qualidade (Quadro 2)
Figura 9 - Representaccedilatildeo do Rotor-Disc 100 Refere-se a um disco de material plaacutestico contendo 100
poccedilos Este veio de faacutebrica personalizado com primers para os ensaios QC ou RT2 profiler PCR array As
amostras e mixes satildeo pipetadas em cada poccedilo O disco eacute posteriormente colocado em um anel metaacutelico
proacuteprio para o encaixe no equipamento Rotor-Gene Cada poccedilo eacute nomeado com uma letra e um nuacutemero
iniciando no A1 ateacute o H12 Os quatro uacuteltimos poccedilos natildeo satildeo nomeados e natildeo conteacutem ensaio (no entanto
preenchemos com mix para equilibrar o peso do disco) Fonte do autor
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB
B HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1
C RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC
D PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC
E GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC
F NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR
G PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC
H NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC
Figura 10 - Mapa do disco QC (representaccedilatildeo planilhada) Do A1 ao B12 housekeeping genes para 12
amostras C1 ao H12 controles Cada grupo de cor representa a colocaccedilatildeo de uma mix Do A1 ao E1 mix de
A1
C1
E1
G1
34
cDNA da amostra 1 do A2 ao E2 mix de cDNA da amostra 2 (assim por diante ateacute A12 e E12) Linha F controle
com RNA diluiacutedo (1100) Linhas G e H controles com aacutegua livre de RNase Fonte do autor
Figura 11 - Exemplo de ajuste de Threshold A linha de base (Threshold) eacute ajustada na fase linear do ciclo
de amplificaccedilatildeo Dessa forma eacute possiacutevel remover os ruiacutedos e se obter o ciclo em que cada amostra foi
amplificada na PCR (CT) Fonte do autor imagem do equipamento Rotor Genereg
Quadro 2 - Paracircmetros de qualidade do ensaio QC
Controles Teste Passa no teste Falha no teste
Controle de transcriccedilatildeo reversa CT RTC (linha B) ndash CTPPC (linha G) lt5 gt5
Controle positivo de PCR CT PPC (linha G)
CT PPC (linha D) - CT PPC (linha G)
14 plusmn 2
lt3
gt16
gt3
Controle de contaminaccedilatildeo de DNA genocircmico CT GDC (linha E) gt33 lt33
Controle de natildeo transcriccedilatildeo reversa CT NTR (linha F) ge 33 ou NA lt33
Controle negativo CT NTC (linha H) ge 33 ou NA lt33
10-02
10-04
10-06
10-08
10-10
10-12
10-14
10-16
10-18
10-20
10-22
10-24
10-26
10-28
5 10 15 20 25 30 35 40
Ciclos
Flu
ore
scecircn
cia
No
rmal
izad
a
Fase Linear
35
De 60 amostras analisadas 52 passaram no teste quanto aos criteacuterios de
qualidade e prosseguiram para a anaacutelise de expressatildeo gecircnica do painel de genes
escolhidos
454 Ensaio de expressatildeo gecircnica
O protocolo de expressatildeo foi realizado por PCR em tempo real atraveacutes do
equipamento Rotor Gene 6000 (Corbett) com ensaio customizado RTsup2 Profiler PCR
Array em disco com capacidade de 100 poccedilos (Rotor-Disc 100 Qiagen USA) Nos 100
poccedilos de cada disco estavam distribuiacutedos primers especiacuteficos para o ensaio de expressatildeo
de 17 genes (Figuras 9 e 12 e Quadro 3) (17 pares de primers para cada gene repetidos 4
vezes na placa pois foi possiacutevel a anaacutelise de 4 amostras de cDNA por disco) 4 pares de
primers para os Housekeeping genes B2M GAPDH HPRT1 e ACTB (Quadro 4) e 3
controles 1 controle de contaminaccedilatildeo com DNA genocircmico (HGDC) 1 controle de
transcriccedilatildeo reversa (RTC) e 1 controle positivo de PCR (PPC) Os 4 Housekeeping
genes e os 3 controles tambeacutem satildeo repetidos 4 vezes no disco (Figura 5) Para as
reaccedilotildees foi utilizada a RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR Master Mix (Qiagen USA)
Primeiramente foi preparada 4 mixes (uma para cada amostra de cDNA) para um
disco de 100 poccedilos composta por 275 μL de 2X RT2 SYBR Green ROX FAST
Mastermix 2262 microL de aacutegua livre de RNase e 488 microL de amostra de cDNA cada Em
cada um dos poccedilos do disco foram adicionados 20 μL da mix preparada (utilizando
mixes de diferentes amostras a cada 24 poccedilos) Apoacutes deste processo o disco foi selado
com o Rotor-Disc Heat Sealer (Qiagen USA) e colocado no equipamento Rotor-Gene
6000 (Corbett) O real-time foi programado para ciclagem de PCR nas seguintes
condiccedilotildees 1 ciclo a 95deg C com duraccedilatildeo de 10 minutos 40 ciclos a 95degC por 15
segundos e 60degC por 30 segundos
36
Quadro 3 - Genes escolhidos para o ensaio de expressatildeo
CHRNA3 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α3
CHRNA4 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α4
CHRNA5 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α5
CHRNA6 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α6
CHRNA7 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α7
CHRNB2 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade β2
CHRNB3 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade β3
CHRNB4 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade β4
CHRNG Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade γ
DRD1 Codifica o receptor de dopamina tipo 1
DRD2 Codifica o receptor de dopamina tipo 2
DRD3 Codifica o receptor de dopamina tipo 3
DRD4 Codifica o receptor de dopamina tipo 4
HTR3A Codifica o receptor 3A de serotonina
HTR3B Codifica o receptor 3B de serotonina
COMT Codifica a enzima catecol-O-metiltransferase (metaboliza dopamina)
SLC6A3 Codifica a proteiacutena DAT que promove a recaptaccedilatildeo de dopamina DAT
Quadro 4 - Housekeeping genes
B2M Codifica a microbulina subunidade β2
GAPDH Codifica a enzima gliceraldeiacutedo ndash 3 fosfato desidrogenase
HPRT1 Codifica a enzima hipoxantina fosforribosiltransferase 1
ACTB Codifica a β actina
37
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
B DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
C CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
D DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
E CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
F DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
G CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
H DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
Figura 12 - Mapa do disco do ensaio RT2 profiler PCR array (representaccedilatildeo planilhada) O disco conteacutem 100 poccedilos no
entanto apenas 96 poccedilos contecircm ensaios sendo que 4 poccedilos ficam vazios A1 ao B5 = genes escolhidos para anaacutelise de
expressatildeo Do B6 ao B9= Housekeeping genes Do B10 ao B12= controles C1 ao D12 E1 ao F12 e G1 ao H12= repeticcedilatildeo dos
ensaios permitindo a anaacutelise completa de 4 amostra Cada cor diferente (a cada 2 linhas) representam a anaacutelise de uma
amostra Fonte do autor
455 Anaacutelise dos dados de expressatildeo gecircnica
Para a anaacutelise de expressatildeo gecircnica foi utilizado o meacutetodo de 2-∆∆CT 103 Apoacutes o
teacutermino da corrida do ensaio de expressatildeo gecircnica atraveacutes do software real-time cycler
(Qiagen USA) foi ajustada a linha de base (threshold) no graacutefico de amplificaccedilatildeo em
escala logariacutetmica (Figura 11) Todos os discos (total de 13) foram analisados com o
mesmo valor de threshold (010869) para que os valores de CT de todas as amostras
fossem comparaacuteveis
Os dados de CT tambeacutem foram inseridos no programa SPSS para as anaacutelises
estatiacutesticas Os valores de CT foram normalizados atraveacutes da expressatildeo dos
housekeeping genes utilizando a seguinte foacutermula ∆CT= (CTamostra ndash a meacutedia de
CThousekeeping genes) Os valores de mediana de 2-∆CT (em escala logariacutetmica) de cada grupo
foram utilizados para os testes de hipoacutetese Apoacutes foram obtidos os valores de ∆∆CT
(mediana de ∆CTgrupo teste ndash mediana de ∆CT grupo referecircncia) e o fold change (aumento ou
diminuiccedilatildeo da expressatildeo dos genes em relaccedilatildeo ao grupo referecircncia) foi calculado
atraveacutes da foacutermula 2-∆∆CT
38
46 Mensuraccedilatildeo de bupropiona vareniclina e de seus metaboacutelitos por HPLC-
MSMS
461 Materiais equipamentos e condiccedilotildees adotadas para a mensuraccedilatildeo dos
analitos apoacutes validaccedilatildeo do meacutetodo
Padrotildees analiacuteticos e padrotildees internos (PIs) deuterados bupropiona
hidroxibupropiona vareniclina (Santa Cruzreg) vareniclina d4 (TRCreg) nicotina
(ChemCruzreg) cotinina (Sigma-Aldrichreg) hidroxicotinina (Torontoreg) e
hidroxibupropiona d6 nicotina d4 cotinina d3 hidroxicotinina d3 (Cerilliantreg)
Solventes orgacircnicos Metanol acetonitrila (JT Baker) e sais acetato de amocircnio
fosfato de soacutedio (Vetecreg) fosfato de soacutedio monobaacutesico (Proquimiosreg) fosfato
de amocircnio (Reagenreg) formiato de amocircnio (Sigma-Aldrichreg)
Equipamentos e acessoacuterios
o HPLC Shimadzureg (Kyoto Japatildeo) equipado com uma vaacutelvula comutadora
de 6 vias automaacutetica
o Auto-amostrador Shimadzureg (Kyoto Japatildeo)
o Vaacutelvula comutadora de 6 vias 11R-0016H (Valcoreg Houston TX USA)
o Espectrocircmetro de massas LCMS-8030 Shimadzureg (Kyoto Japatildeo)
o Analisador de massa triplo quadrupolo (Shimadzureg Kyoto Japatildeo)
o Coluna analiacutetica ACEreg C18 (100 mm x 21 mm x 3 microm comprimento
diacircmetro interno e tamanho de partiacutecula)
o Preacute-coluna ACEreg C18 (21mm x 3 microm diacircmetro tamanho de partiacutecula)
39
o Coluna de extraccedilatildeo coluna contendo aproximadamente 70 mg do novo
RAM
Software
o LabSolutionsreg para anaacutelise dos dados e programaccedilatildeo do meacutetodo no
HPLC-MSMS
Condiccedilotildees espectrometricas e cromatograacuteficas
o Temperatura da forno da coluna 40ordmC
o Temperatura da linha de dessolvataccedilatildeo 250ordmC
o Temperatura do bloco de aquecimento 400ordmC
o Fluxo do gaacutes de nebulizaccedilatildeo 20 ml min-1
o Fluxo de gaacutes para secagem 150 ml min-1
o Energias de colisatildeo precursores e fragmentos dos analitos (Tabela 1)
o Fase moacutevel de carregamento (liberada pela bomba A) Aacutegua ultra pura
em um fluxo de 04 mL min-1
o Fase moacutevel de eluiccedilatildeoseparaccedilatildeoionizaccedilatildeo (liberada pela bomba C)
metanol tampatildeo formiato de amocircnio 001 mol L-1 pH=42 (9010 vv)
em um fluxo de 04 mL min-1
o Fase moacutevel de limpeza (liberada pela bomba B) acetonitrila aacutegua ultra
pura isopropanol (751510 vvv) em um fluxo de 10 mL min -1
o Sistema de anaacutelise ULPC-MSMS no modo columns switching em
configuraccedilatildeo backflush modo de ionizaccedilatildeo positiva por electrospray
(ESI+)
40
Tempos
o Fase de carregamento e condionamento do sistema (vaacutelvula na posiccedilatildeo
1) 0 - 30 min
o Fase de eluiccedilatildeo (vaacutelvula na posiccedilatildeo 2) 03 min
o Fase de limpeza separaccedilatildeo e anaacutelise por MS (vaacutelvula na posiccedilatildeo 1) 67
min
o Recondiocionamento do sistema (vaacutelvula na posiccedilatildeo 1) 50 min
o Tempo total incluindo todos os processos 15 min
o
Tabela 1 - Analitos precursores fragmentos e energias de colisatildeo otimizados
Analitos Precursor (mz) Fragmentos (mz) Energia de colisatildeo
(KV)
Vareniclina 212 169 -23
183 -24
141 -43
Bupropiona 240 131 -28
139 -26
103 -39
Hidroxibupropiona 256 139 -29
131 -29
167 -29
Nicotina 163 117 -28
130 -22
77 -44
Cotinina 177 80 -24
98 -21
70 -34
Hidroxicotinina 193 80 -30
134 -19
118 -21
Fragmentos quantificados
41
462 Visatildeo geral do desenvolvimento da coluna e padronizaccedilatildeo da anaacutelise
Todos os padrotildees para as anaacutelises dos analitos foram adquiridos e armazenados
conforme recomendaccedilatildeo do fabricante ateacute o momento da padronizaccedilatildeo das anaacutelises As
anaacutelises foram realizadas atraveacutes da colaboraccedilatildeo com o Prof Dr Eduardo Costa de
Figueiredo Dr Henrique Dipe Faria e Prof Dra Isarita Martins do Laboratoacuterio de
Anaacutelises de Toxicantes e Faacutermacos ndash LATF da Faculdade de Ciecircncias Farmacecircuticas da
Universidade Federal de Alfenas (Unifal MG) A escolha de cada analito foi
determinada atraveacutes de sua importacircncia cliacutenica e tambeacutem devido agrave disponibilidade dos
padrotildees dos analitos no mercado Os analitos mensurados para as amostras provenientes
dos pacientes tratados com os faacutermacos antitabagismo foram bupropiona
hidroxibupropiona vareniclina nicotina cotinina e hidroxicotinina (os trecircs uacuteltimos satildeo
proveninentes do fumo) Foi realizado um levantamento das propriedades fiacutesico-
quiacutemicas dos metaboacutelitos conforme Quadro 5
Para a remoccedilatildeo das macromoleacuteculas (como proteiacutenas) presentes na matriz de
soro foi desenvolvida uma coluna extratora de acesso restrito a partir de nanotubos
hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados com ligaccedilotildees hidrofiacutelicas (novo RAM) O
material foi desenvolvido e caracterizado antes mesmo da padronizaccedilatildeo das condiccedilotildees
de anaacutelise nos equipamentos
Foram obtidas as condiccedilotildees espectomeacutetricas (modo de ionizaccedilatildeo e as condiccedilotildees
de sua fonte temperatura do bloco de calor fluxo de gaacutes nebulizador e fluxo do gaacutes
secante) e cromatograacuteficas (tempo de retenccedilatildeo e separaccedilatildeo e aacutereas obtidas dos picos de
cada analito) Apoacutes as condiccedilotildees foram otimizadas em sistema de cromatografia liacutequida
de alta eficiecircncia multidimensional seguida por espectrometria de massa (HPLC-
MSMS) O sistema multimensional constituiacutedo por vaacutelvulas comutadoras permite a
anaacutelise online e automatizada com configuraccedilatildeo via software As vaacutelvulas permitem
42
diferentes posiccedilotildees promovendo a ocorrecircncia de eventos distintos no sistema como a
concentraccedilatildeo dos analitos e remoccedilatildeo de macromoleacuteculas atraveacutes da coluna extratora
(posiccedilatildeo 1) a eluiccedilatildeo dos analitos da coluna extratora para a coluna analiacutetica (posiccedilatildeo 2)
e novamente na posiccedilatildeo 1 ocorre a eluiccedilatildeo dos analitos da coluna analiacutetica para o
espectrocircmetro de massas a limpeza da coluna extratora e o recondionamento do
sistema
Quadro 5 - Propriedades fiacutesico-quiacutemicas dos analitos
Bupropiona
Peso molecular 27620 gmol
Ponto de fusatildeo 243-246deg C
Solubilidade em aacutegua 00693 mgmL
pKa (aacutecido forte) 1829
pKa (mais forte baacutesico) 822
Aacuterea da superfiacutecie polar 291 Aring2
Log P 36
Hidroxibupropiona
Peso molecular 25574 gmol
Ponto de fusatildeo 121-123degC
Solubilidade em aacutegua 02 mgmL
pKa (aacutecido forte) 1479
pKa (mais forte baacutesico) 765
Aacuterea da superfiacutecie polar 4933 Aring2
Log P 222
Vareniclina
Peso molecular 21127 gmol
Pressatildeo de vapor 25degC
Solubilidade em aacutegua 877 x 10-2 gL
pKa1 182 pKa2 = 973
Aacuterea da superfiacutecie polar 378 Aring2
Log P 103
43
Nicotina
Peso molecular 16223 gmol
Pressatildeo de vapor 618 degC
Solubilidade em aacutegua 100 mM
pKa 85 pKb1 616 a 15degC e pKb2 1096
Aacuterea da superfiacutecie polar 378 Aring2
Log P 117
Cotinina
Peso molecular 176215 gmol
Solubilidade em aacutegua 10 x10-6 mgL a 25degC
Aacuterea da superfiacutecie polar 332 Åsup2
Log P 007
Hidroxicotinina
Peso molecular 192214 gmol
Aacuterea da superfiacutecie polar 53 Å2
ACDLog P -148
Fonte Banco de dados Pubchem e ChemSpider Obs Algumas informaccedilotildees referentes agraves
propriedades fiacutesico-quiacutemicas dos analitos ainda natildeo estatildeo disponiacuteveis na literatura pKa= valor
negativo do logaritmo da constante de dissociaccedilatildeo de um aacutecido pKb= valor negativo do logaritmo
da constante de dissociaccedilatildeo de uma base LogP= coeficiente de particcedilatildeo
463 Desenvolvimento da coluna RAM para a purificaccedilatildeo da amostra
As amostras de soro e plasma satildeo matrizes ricas em moleacuteculas que interferem na
mensuraccedilatildeo dos analitos como lipiacutedios e principalmente proteiacutenas Estas podem
obstruir colunas analiacuteticas e diminuir a concentraccedilatildeo dos analitos jaacute que muitos destes
estatildeo ligados a essas proteiacutenas Devido a esse fato geralmente eacute realizada uma
preparaccedilatildeo das amostras antes de sua mensuraccedilatildeo Essa preparaccedilatildeo envolve processos
como a extraccedilatildeo com o uso de solventes precipitaccedilatildeo entre outros os quais geram
custo de materiais aumento do tempo de trabalho e de erros 104 105 51 106 Dessa forma
44
diversos estudos vecircm tentando desenvolver meacutetodos que natildeo exijam tanta manipulaccedilatildeo
das amostras Os materiais de acesso restrito (RAMs) estatildeo sendo utilizados para a
menor preparaccedilatildeo da amostra e sua injeccedilatildeo direta Dentre os RAMs estatildeo os nanotubos
de carbono (CNTs) modificados 107-109 Nesta colaboraccedilatildeo foi desenvolvida a coluna
extratora composta por nanotubos hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados com a
adiccedilatildeo de grupos hidrofiacutelicos Esse material entrou com pedido de patente na Agecircncia
de Inovaccedilatildeo e Empreendedorismo da Universidade Federal de Alfenas-MG atraveacutes do
Processo 230870001282019-84 e portanto a sua composiccedilatildeo e os resultados de
alguns testes da sua caracterizaccedilatildeo seratildeo mantidos em sigilo (vide declaraccedilatildeo Anexo
5)
Diferentes RAMs foram sintetizados a partir de CNTs para que fosse obtido o
melhor desempenho na remoccedilatildeo de macromoleacuteculas e retenccedilatildeo dos analitos da amostra
Os CNTs utilizados foram compostos por paredes muacuteltiplas pois apresentam uma
elevada aacuterea superficial e consequentemente uma maior capacidade de adsorccedilatildeo Os
CNTs foram adquiridos comercialmente e inicialmente foram funcionalizados a partir
de reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo aacutecida com aacutecido niacutetrico como desenvolvido por Barbosa et al 109
Os CNTs oxidados foram utilizados em etapas de siacutentese posteriores
adicionando grupos quiacutemicos hidrofiacutelicos que fossem capazes de realizar a exclusatildeo de
proteiacutenas e permitir a adsorccedilatildeo dos analitos As reaccedilotildees de siacutentese posteriores foram
semelhantes as promovidas para a realizaccedilatildeo de revestimento externo de poliacutemeros
poliacutemeros biomimeacuteticos nanomagneacuteticos com e sem acesso restrito 107 110-112 poreacutem
foram utilizadas estrateacutegias e proporccedilotildees de reagentes distintas na tentativa de obter o
RAM mais eficiente Aleacutem disso tambeacutem foi priorizada a siacutentese mais simples e
reprodutiacutevel bem como o material que apresentar maior vida uacutetil Os diferentes
materiais sintetizados foram testados em relaccedilatildeo agrave exclusatildeo de proteiacutenas e adsorccedilatildeo dos
45
analitos e tambeacutem foram realizados testes de caracterizaccedilatildeo para determinar suas
propriedades fiacutesico-quiacutemicas e confirmar a estrutura originada
A anaacutelise termogravimeacutetrica foi realizada com a finalidade de determinar a
variaccedilatildeo de massa (ganho ou perda) do RAM em funccedilatildeo de emprego de temperatura
programada proporcionando informaccedilotildees importantes a respeito da estabilidade do
material e de sua composiccedilatildeo Outras teacutecnicas tambeacutem foram utilizadas com o objetivo
de obter dados relacionados agrave estrutura e composiccedilatildeo do novo RAM como o
infravermelho e anaacutelise elementar Anaacutelises de microscopias eletrocircnicas de varredura e
de transmissatildeo tambeacutem foram realizadas para a determinaccedilatildeo da composiccedilatildeo da
superfiacutecie externa e arranjo estrutural do material com as modificaccedilotildees realizadas
Apoacutes o teacutermino do preparo do novo RAM eles foram colocados dentro de uma
coluna (aproximadamente 70 mg) conforme (Figura 13) A coluna foi posteriormente
empregada no preparo de amostras online no sistema cromatograacutefico
Figura 13 ndash Representaccedilatildeo da composiccedilatildeo da coluna extratora (Novo RAM) O novo RAM formado
a partir de nanotubos hiacutedridos de carbono e siacutelica dotado de muacuteltiplas camadas e modificados com grupos
hidrofiacutelicos promovem a retenccedilatildeo de analitos e exclusatildeo de macromoleacuteculas como proteiacutenas O RAM foi
posteriormente empacotado em coluna para a utilizaccedilatildeo em sistema cromatograacutefico Fonte adaptado do
colaborador Dr Henrique Dipe de Faria Unifal-MG
46
464 Caracterizaccedilatildeo do novo RAM
4641 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA
Na ausecircncia da coluna extratora foi preparada primeiramente uma soluccedilatildeo
aquosa de albumina de soro bovino (BSA) em uma concentraccedilatildeo de 44 mgmL-1
(semelhante agrave concentraccedilatildeo de proteiacutenas presentes no plasma humano) Foram injetados
10 microl desta soluccedilatildeo em triplicata diretamente em sistema cromatograacutefico com detector
UV ajustado a 255 nm utilizando como fase moacutevel o tampatildeo formiato de amocircnio 10
mM pH=42 em um fluxo de 04 mL min-1 O sinal detectado foi de 100 BSA
Posteriormente a coluna preenchida com 70 mg do novo RAM foi inserida no sistema
cromatograacutefico entre o injetor e o detector A soluccedilatildeo de BSA foi analisada em triplicata
novamente no entanto com a presenccedila da coluna extratora desenvolvida (novo RAM)
A aacuterea do sinal obtido nesta segunda anaacutelise dividida pela aacuterea do sinal de 100 BSA
obtida na primeira anaacutelise foi correspondente agrave porcentagem de BSA excluiacuteda pela
coluna
4642 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas no soro
Para analisar a exclusatildeo total de macromoleacuteculas (como lipiacutedios proteiacutenas e
sacariacutedeos) agora nas amostras de soro foi utilizado procedimento semelhante Na
ausecircncia da coluna extratora injetou-se no sistema cromatograacutefico em triplicata 100 μL
de amostra de soro humano branco foram testados pools de soro puros e diluiacutedos 14 A
aacutegua ultra pura foi utilizada como fase moacutevel em um fluxo de 04 mL min-1 e o sinal
obtido foi relacionado a 100 dos interferentes Apoacutes a coluna extratora (o novo
RAM) foi adionado ao sistema e a amostra foi inserida novamente A divisatildeo entre a
aacuterea do pico na primeira anaacutelise pelo pico da segunda anaacutelise refere-se agrave porcentagem
de exclusatildeo de interferentes As condiccedilotildees cromatograacuteficas foram as mesmas do teste
com BSA
47
4643 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA em diferentes pHs
O teste de exclusatildeo de proteiacutenas tambeacutem foi realizado nas mesmas condiccedilotildees
cromatograacuteficas que a anaacutelise anterior utilizando soluccedilatildeo de BSA em triplicata no
entanto diferentes soluccedilotildees como fase moacutevel (variaccedilatildeo de pH de 22 a 70) foram
testadas pois o pH pode influenciar na ionizaccedilatildeo dos analitos dos grupos funcionais
presentes na superfiacutecie do novo RAM e na interaccedilatildeo entre eles o que pode resultar em
diferentes taxas de exclusatildeo de proteiacutenas Estas soluccedilotildees foram os tampotildees fosfato de
soacutedio 10 mM (pHs 22 e 26) formiato de amocircnio 10 mM (pHs 30 a 46) acetato de
amocircnio 5 mM (pHs 52 a 66) e fosfato de soacutedio 5mM (pH 70)
465 Paracircmetros espectromeacutetricos
Com a finalidade de se obter um meacutetodo de anaacutelise capaz de detectar e
quantificar menores niacuteveis possiacuteveis de concentraccedilatildeo dos analitos foram otimizados os
paracircmetros espectromeacutetricos fluxos dos gases secantes e nebulizador modo de
ionizaccedilatildeo temperaturas da linha de dessolvataccedilatildeo e de bloco de aquecimento e as
energias de colisotildees utilizadas para fragmentar os iacuteons precursores para originar os
fragmentos iocircnicos de cada analito Foram realizadas soluccedilotildees padrotildees de cada analito e
dos padrotildees internos (PIs) deuterados (vareniclina d-4 hidroxibupropiona d6 nicotina
d4 cotinina d3 e hidroxicotinina d3) na concentraccedilatildeo de 1 mg L-1 em metanol Cada
uma destas soluccedilotildees foram injetadas separadamente no sistema em um volume de 5 microL
A fase moacutevel utilizada foi constituiacuteda por metanol tampatildeo formiato de amocircnio 001
mol L-1 pH=42 (9010 vv) em um fluxo de 04 mL min-1 e o modo de ionizaccedilatildeo
positiva (ESI+) foi utilizado pois demonstrou ser mais eficiente para ionizar as
moleacuteculas analisadas Essa otimizaccedilatildeo foi obtida utilizando o software Labsolutionsreg
48
466 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatograacutefico multidimensional
Para esta otimizaccedilatildeo foi utilizado um HPLC de dotado de vaacutelvula comutadora
automaacutetica de 6 vias e um injetor automaacutetico de amostras o que permitiu a
automatizaccedilatildeo do processo Ainda o sistema cromatograacutefico foi acoplado a um
espectrocircmetro de massas em tandem (HPLC-MSMS) dotado de um analisador de
massa triplo quadrupolo o qual possui alta sensibilidade e seletividade Incorporou-se
neste sistema uma coluna extratora preenchida com o RAM desenvolvido
O forno foi mantido a 40ordmC e o detector UV operando em um comprimento de
onda de 255 nm A fim de padronizar a anaacutelise foram testadas colunas anaacuteliticas de
diversos tamanhos e composiccedilotildees e variadas proporccedilotildees de fases de moacuteveis
Atraveacutes da anaacutelise do cromatograma foram avaliados o tempo de retenccedilatildeo e
separaccedilatildeo e as aacutereas obtidas dos picos de cada analito O sistema foi utilizado no modo
columns switching na configuraccedilatildeo backflush e as condiccedilotildees da anaacutelise foram
otimizadas como os tempos de exclusatildeo de proteiacutenas de adsorccedilatildeo e eluiccedilatildeo dos
analitos de separaccedilatildeo cromatograacutefica de limpeza da coluna extratora e de
recondicionamento do sistema bem como a composiccedilatildeo das fases moacuteveis de
carregamento de eluiccedilatildeoseparaccedilatildeo e de limpeza
Para a otimizaccedilatildeo dos paracircmetros de anaacutelise foi utilizado um pool de amostras
de soro humano branco em sexplicata Este soro foi dopado com os analitos vareniclina
bupropiona hidroxibupropiona nicotina cotinina e hidroxicotinina em 3 concentraccedilotildees
01 100 e 1000 microg L -1 e com os PIs deuterados na concentraccedilatildeo de 500 microg L -1 Como
o soro eacute uma matriz com alta concentraccedilatildeo de interferentes foram testados pools de
soro branco dopados e injetados sem diluiccedilatildeo diretamente no sistema e diluiacutedos em aacutegua
ultra pura (11) e os perfis analiacuteticos foram entatildeo avaliados
49
467 validaccedilatildeo analiacutetica
Testes para a validaccedilatildeo da anaacutelise otimizada foram realizadas conforme
diretrizes do US Department of Health and Human Services e do Food and Drug
Administration (FDA) 2013 113 Os paracircmetros avaliados foram a seletividade limite
de detecccedilatildeo (LD) limite de quantificaccedilatildeo (LQ) linearidade estabilidade dos analitos
efeito residual e de matriz e recuperaccedilatildeo da extraccedilatildeo
Os ensaios foram realizados em seis repeticcedilotildees (n=6) exceto o ensaio de
recuperaccedilatildeo (n=3) e foi utilizado um pool de amostras de soro branco dopadas com cada
um dos analitos nas concentraccedilotildees de 5 10 20 50 75 100 μg L-1 para vareniclina 1 5
50 250 500 1000 μg L-1 para bupropiona 1 10 100 500 1000 2000 para
hidroxibupropiona 5 10 50 250 500 1000 μg L-1 para nicotina cotinina e
hidroxicotinina Os PIs deuterados foram utilizados na concentraccedilatildeo de 200 μg L-1
47 Anaacutelise estatiacutestica
Em relaccedilatildeo agraves caracteriacutesticas demograacuteficas as variaacuteveis contiacutenuas foram
apresentadas como meacutedia e desvio padratildeo e as categoacutericas como frequecircncias Os testes
Shapiro-Wilk e KolmogorovndashSmirnov foram realizados para verificar a normalidade da
distribuiccedilatildeo das variaacuteveis quantitativas e assim escolher testes parameacutetricos ou natildeo
parameacutetricos Foram realizados os testes Qui-quadrado Exato de Fisher t de Student ou
Mann-Whitney para as anaacutelises comparativas de caracteriacutesticas gerais entre os grupos
de desfecho dos pacientes tanto no ensaio de expressatildeo como de mensuraccedilatildeo dos
analitos Para as anaacutelises de expressatildeo gecircnica o meacutetodo 2-∆∆CT foi utilizado 103 Como os
dados de expressatildeo natildeo apresentaram distribuiccedilatildeo normal foi realizado o teste natildeo
parameacutetrico de Mann-Whitney para testar a hipoacutetese de diferenccedila (valores de 2-∆CT)
intra e entre os grupos de desfechos (sucesso e resistente e tempos de tratamento
50
farmacoloacutegico T0 T2 e T4) Os valores de ∆∆CT (mediana de ∆CTgrupo teste ndash mediana
de ∆CTgrupo referecircncia) foram obtidos para o caacutelculo do fold change O fold-change (2-∆∆CT)
foi calculado para verificar o aumento ou diminuiccedilatildeo de expressatildeo gecircnica entre os
grupos analisados O graacutefico heat map foi construiacutedo atraveacutes do software Gene-globe
(Qiagen USA) para verificar as diferenccedilas no perfil de expressatildeo dos genes estudados
de acordo com os tempos (T0 T2 e T4) e de acordo com a efetividade de tratamento
com vareniclina (sucesso e resistente) O teste de Manny-Whitney foi utilizado para
analisar os niacuteveis de concentraccedilotildees de vareniclina de bupropiona de nicotina e de seus
metaboacutelitos de acordo com os desfechos de tratamento (sucesso e resistente) pois natildeo
apresentaram distribuiccedilatildeo normal A taxa de metabolizaccedilatildeo de nicotina (NRM) foi
calculada pela seguinte foacutermula NMR= trans-3-hidroxicotininacotinina A
hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3- hidroxicotinina
para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros da hidroxicotinina satildeo
irrelevantes 31 32 Os pacientes foram classificados em metabolizadores lentos se
NMRlt031 e normais ou raacutepidos se NMRgt031 Todas as anaacutelises estatiacutesticas foram
realizadas utilizando o software SPSS (versatildeo 20 IBM New York NY) considerando
o niacutevel de significacircncia de P lt005
51
5 RESULTADOS
Este projeto incluiu 105 pacientes sendo 74 tratados com vareniclina e 31
com bupropiona Dos 74 pacientes tratados com vareniclina amostras de 27 pacientes
foram analisadas quanto agrave expressatildeo gecircnica (14 pacientes do grupo de desfecho sucesso
e 13 do grupo resistente) Sendo provenientes destes pacientes 52 amostras ao todo (de
diversos tempos) 9 resistentes do tempo T0 7 resistentes do T2 8 resistente do T4 9
sucessos do T0 8 sucessos do T2 e 11 sucessos do T4 (vide toacutepico 42 Nuacutemero
amostral)
Quanto a mensuraccedilatildeo dos analitos foi desenvolvida uma coluna extratora para a
purificaccedilatildeo da amostra agrave base de nanotubos hiacutedridos de carbono e siacutelica modificados
com a adiccedilatildeo de grupos hidrofiacutelicos (novo RAM) o meacutetodo HPLC-MSMS
multidimensional no modo column switching e na configuraccedilatildeo backflush foi
otimizado e validado Setenta e quatro pacientes tratados com vareniclina e 31 tratados
com bupropiona foram submetidos agrave anaacutelise Apenas 4 amostras das 105 apresentaram
valores abaixo do LQ (3 de pacientes tratados com vareniclina e 1 de paciente tratado
com bupropiona) e estas foram excluiacutedas das anaacutelises dos analitos (vide toacutepico 42
Nuacutemero amostral)
51 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica
511 Dados cliacutenicos e demograacuteficos
As Tabelas 2 e 3 mostram as caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes
selecionados para o ensaio de expressatildeo gecircnica do grupo total e por grupo de desfecho
respectivamente A variaacutevel idade apresentou diferenccedila significativa entre os grupos
resistente e sucesso
52
Tabela 2 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina selecionados para os ensaios de expressatildeo gecircnica (n=27)
Idade (anos) 50 plusmn 13
Gecircnero mulheres () 464
Etnia autodeclarada brancos () 740
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 271 plusmn 50
Cigarrosdia 17 plusmn 7
FTND 62 plusmn 20
FTND ge 6 () 607
Escore Issa ge 3 () 857
Hipertensatildeo () 179
Dislipidemia () 250
Diabetes melito tipo 2 () 107
Depressatildeo () 71
Ansiedade () 286
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash
Fagerstroumlm test for nicotine dependence (escala de 0 a 10
pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
Tabela 3 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina submetidos aos ensaios de expressatildeo gecircnica de acordo com o desfecho
de tratamento
Resistente (n=13) Sucesso (n=14) Valor de P
Idade (anos) 55 plusmn 11 45 plusmn 12 0045
Gecircnero mulheres () 538 357 045
Etnia autodeclarada brancos () 769 786 100
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 271 plusmn 46 273 plusmn 54 092
Cigarrosdia 20 plusmn 6 15 plusmn 6 006
FTND 63 plusmn 22 59 plusmn 19 058
FTND ge 6 () 538 643 070
Escore Issa ge 3 () 846 857 100
Hipertensatildeo () 231 71 033
Dislipidemia () 231 286 100
Diabetes melito tipo 2 () 231 00 010
Depressatildeo () 77 71 100
53
Ansiedade () 308 357 100
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fagerstroumlm test for nicotine
dependence (escala de 0 a 10 pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
512 Dados de expressatildeo gecircnica
Dos 17 genes escolhidos para testar com a resposta ao tratamento apenas 4
apresentaram valores de amplificaccedilatildeo aceitaacuteveis para uma interpretaccedilatildeo de qualidade
mais especificamente valores de CT lt 33 Os valores das expressotildees dos genes (CTs)
foram normalizados atraveacutes das meacutedias de CT dos housekeeping genes para cada
amostra obtendo-se os valores de ∆CT = (CTgene alvo ndash meacutedia CT housekeepings genes) A
Tabela 4 mostra os valores de mediana de ∆CT dos genes analisaacuteveis de acordo com os
tempos de tratamento e grupos de desfecho
Tabela 4 - Valores de mediana de ∆CT dos genes de acordo com os tempos de
tratamento e grupos de desfecho
∆CT = (CTgene alvo ndash meacutedia CThousekeepings genes) T0= Tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico
T2= Duas semanas apoacutes o iacutenicio do tratamento farmacoloacutegico T4= Quatro semanas apoacutes o iniacutecio do
tratamento farmacoloacutegico IC 95 = Intervalo de confianccedila de 95
Resistente T0 Resistente T2 Resistente T4
∆CT IC 95 ∆CT IC 95 ∆CT IC 95
CHRNA5 818 (732 ndash 870) 845 (748 ndash 887) 767 (727 ndash 905)
CHRNA7 662 (617 ndash 697) 802 (707 ndash 848) 719 (696 ndash 786)
CHRNG 620 (579 ndash 695) 647 (601 ndash 668) 663 (602 ndash 702)
COMT 467 (440ndash 501) 480 (443 ndash 503) 487 (452 ndash 524)
Sucesso T0 Sucesso T2 Sucesso T4
∆CT IC 95 ∆CT IC 95 ∆CT IC 95
CHRNA5 832 (738 ndash 917) 707 (653 ndash 896) 837 (754 ndash 882)
CHRNA7 726 (611 ndash 842) 704 (640 ndash 779) 738 (676 ndash 820)
CHRNG 682 (619 ndash 774) 683 (656 ndash 733) 659 (625 ndash 703)
COMT 488 (430 ndash 511) 458 (433 -515) 481 (448 ndash 516)
54
513 Anaacutelise de associaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica entre os desfechos e os tempos de
tratamento
A Tabela 5 mostra o fold change e anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos de
tempos de tratamento e grupos de desfecho Foi observada diferenccedila significativa para a
expressatildeo do gene CHRNA7 no grupo resistente amostras dos tempos T2 e T4
apresentaram menor expressatildeo comparadas com amostras do T0 (fold change 038
P=0007 fold change 067 P=0004 respectivamente) Para a expressatildeo do gene
CHRNG amostras do grupo sucesso mostraram menor expressatildeo comparadas com
amostras do grupo resistente no tempo T2 (fold change= 077 P=0006)
Tabela 5 - Fold change e anaacutelise de associaccedilatildeo entre os tempos de tratamento e
grupos de desfecho
Resistente T2 vs T0 Resistente T4 vs T0 Resistente T4 vs T2
Genes 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P
CHRNA5 083 (034 ndash 233) 057 142 (030 ndash 269) 095 172 (034 ndash 303) 089
CHRNA7 038 (020 ndash 093) 0007 067 (031 ndash 101) 0004 178 (058 ndash 287) 037
CHRNG 083 (054 ndash 192) 037 074 (043 ndash 190) 044 090 (050 ndash 158) 036
COMT 091 (065 ndash 149) 092 087 (056 ndash 140) 063 095 (057 ndash 142) 073
Sucesso T2 vs T0 Sucesso T4 vs T0 Sucesso T4 vs T2
Genes 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P
CHRNA5 238 (033 ndash 623) 037 097 (037 ndash 310) 061 041 (020 ndash 268) 069
CHRNA7 116 (031 ndash 406) 064 092 (023 ndash 316) 091 079 (029 ndash 204) 055
CHRNG 099 (045 ndash 227) 049 117 (056 ndash 281) 062 118 (072 ndash 211) 033
COMT 123 (055 ndash 172) 092 105 (055 ndash 155) 068 085 (056 ndash 159) 041
Sucesso vs resistente T0 Sucesso vs resistente T2 Sucesso vs resistente T4
Genes 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P
CHRNA5 091 (028 ndash 250) 075 260 (036 ndash 506) 047 062 (034 ndash 285) 085
CHRNA7 064 (021 ndash 182) 013 197 (061 ndash 423) 009 088 (042 ndash 214) 074
CHRNG 065 (026 ndash 169) 012 077 (040 ndash 109) 0006 103 (050 ndash 171) 079
55
T0= Tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico T2= Duas semanas apoacutes o iacutenicio do tratamento
farmacoloacutegico T4= Quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico 2-∆∆CT = Fold change (diferenccedila de
expressatildeo) P valor (anaacutelise de associaccedilatildeo entre as medianas de 2-∆CT dos grupos) IC 95 = Intervalo de confianccedila
de 95
As Figura 14 e 15 mostram graacuteficos de barras das diferenccedilas de expressatildeo dos
genes CHRNA7 e CHRNG entre os tempos de tratamento e desfecho respectivamente
O heat map (Figura 16) mostra que natildeo houve diferenciaccedilatildeo nos perfis de expressatildeo
gecircnica em uma anaacutelise conjunta dos genes de acordo com os desfechos e tempos de
tratamento
Devido agrave diferenccedila significativa nas meacutedias de idade entre os grupos sucesso e
resistente foi realizada regressatildeo linear multipla na anaacutelise de expressatildeo dos quatro
genes analisaacuteveis A regressatildeo foi ajustada por idade e tambeacutem gecircnero e cigarros por
dia No entanto os resultados de expressatildeo dos genes natildeo foram impactados por estas
covariaacuteveis
COMT 086 (061 ndash 164) 090 116 (061 ndash 162) 049 104 (064 ndash 169) 093
56
Figura 14 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNA7 entre os tempos de tratamento e desfecho A Anaacutelise intragrupo do
desfecho resistente B Anaacutelise intragrupo do desfecho sucesso T0= tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico T2= duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico T4= quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico P= 0007
(resistente T2 vs T0 fold change de 038) P=0004 (resistente T4 vs T0 fold change de 067) Valor de P (anaacuteliacutese de
associaccedilatildeo entre as medianas de 2-∆CT dos grupos em uma comparaccedilatildeo dois a dois) Fonte do autor
57
Figura 15 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNG entre os tempos de tratamento e desfecho A Anaacutelise intragrupo do
desfecho resistente B Anaacutelise intragrupo do desfecho sucesso T0= tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico T2= duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico T4= quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico P= 0006
(sucesso vs resistente T2 fold change de 077) Valor de P (anaacuteliacutese de associaccedilatildeo entre as medianas de 2-∆CT dos grupos em uma
comparaccedilatildeo dois a dois) Fonte do autor
58
Figura 16 - Heat map de expressatildeo gecircnica A figura mostra a magnitude de expressatildeo gecircnica entre os grupos A cor mais clara
(verde) nos indica menor expressatildeo e a cor mais escura (vermelho) indica maior expressatildeoT0= tempo inicial antes do tratamento
farmacoloacutegico T2= duas semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico T4= quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento
farmacoloacutegico Fonte do autor gerada pelo software Gene Globe QIAGENreg
52 Mensuraccedilatildeo dos analitos
521 Caracterizaccedilatildeo da coluna teste exclusatildeo de proteiacutenas e interferentes da
matriz
Em relaccedilatildeo ao teste de capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas o pico de BSA sem
e com a nova coluna extratora apresentou tempo de retenccedilatildeo semelhante no entando a
aacuterea da curva do BSA na presenccedila do novo RAM foi bem menor do que na sua
ausecircncia conforme a Figura 17 A reduccedilatildeo de proteiacutenas (da soluccedilatildeo de BSA) pela
coluna foi de aproximadamente 98 e nas amostras de pools soro diluiacutedas (14) a
remoccedilatildeo foi de 99 (Figura 18)
A Figura 19 mostra a influecircncia do pH (escala de de 22 a 70) na exclusatildeo de
proteiacutenas fato que estaacute diretamente relacionado com a estrutura fiacutesico-quiacutemica do
RAM Diferentes pHs influenciaram na taxa de exclusatildeo de proteiacutenas esse
comportamento pode ser explicado devido agrave interaccedilotildees eletrostaacuteticas do novo RAM
com as proteiacutenas Valores de pH menores que o do ponto isoeleacutetrico das proteiacutenas
59
podem promover a prevalecircncia de proteiacutenas carregadas positivamente enquanto que
valores de pH superiores podem promover proteiacutenas carregadas negativamente 114
Dessa forma acredita-se que o comportamento de exclusatildeo de proteiacutenas do novo
material eacute semelhante ao descrito em outros estudos 108 109 115 116
Figura 17 - Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com soluccedilatildeo de BSA Graacuteficos obtidos apoacutes injeccedilatildeo de 10 microL de uma soluccedilatildeo aquosa de BSA (44 mg mL-1) no
sistema sem coluna (A) e com coluna extratora (B) A - aacuterea do pico 10142590 B - aacuterea
do pico 9713614 Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF
Unifal-MG
Figura 18 - Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com amostra de soro
diluiacuteda Graacuteficos obtidos apoacutes injeccedilatildeo de 100 microL de soro diluiacutedo em aacutegua ultra pura
(14 vv) no sistema sem coluna (A) e com coluna extratora (B) A aacuterea do pico
53981550 B - aacuterea do pico 53552824 Fonte do autor e do colaborador DrHenrique
Dipe de Faria LATF Unifal-MG
60
Figura 19 - Influecircncia do pH na exclusatildeo de proteiacutenas Fonte do autor e do colaborador Dr
Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
522 Otimizaccedilatildeo dos paracircmetros espectromeacutetricos
No processo de otimizaccedilatildeo das condiccedilotildees espectromeacutetricas foi adotado o modo
de ionizaccedilatildeo positivo (ESI+) isto eacute a ionizaccedilatildeo promove a protonaccedilatildeo (adiccedilatildeo de H+)
dos analitos e de seus fragmentos As energias de colisatildeo ideais e as muacuteltiplas transiccedilotildees
de monitoramento de reaccedilatildeo (MRM) foram otimizadas para cada analito separadamente
vide valores de energia de colisatildeo e fragmentos obtidos jaacute mostrados na Tabela 1 (no
toacutepico 461) A presenccedila de 3 fragmentos de cada analito foi necessaacuteria para a
identicaccedilatildeo qualitativa e a quantificaccedilatildeo foi dependente da concentraccedilatildeo do fragmento
mais abundante
As seguintes temperaturas foram utilizadas 40ordmC para o forno da coluna 250ordmC
para a linha de dessolvataccedilatildeo e 400ordmC para o bloco de aquecimento Foram utilizadas as
taxas de 20 ml min-1 de fluxo de gaacutes de nebulizaccedilatildeo e 150 ml min-1 de fluxo de gaacutes
para a secagem
61
523 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatrograacutefico multidimensional
Quanto a composiccedilatildeo e proporccedilatildeo da fase moacutevel responsaacutevel pela eluiccedilatildeo
separaccedilatildeo e ionizaccedilatildeo dos analitos (fase moacutevel de eluiccedilatildeo) testes foram realizados com
os solventes orgacircnicos acetonitrila ou metanol combinados com o tampatildeo formiato de
amocircnio 10 mM em diferentes pHs com proporccedilotildees que variaram de 973 vv a 7525
vv (fase orgacircnica fase aquosa) Os solventes orgacircnicos utilizados satildeo menos viscosos
em relaccedilatildeo agrave aacutegua por isso fluem mais facilmente no sistema e por serem volaacuteteis
favorecem tambeacutem a ionizaccedilatildeo dos analitos e evaporaccedilatildeo do solvente A fase moacutevel que
apresentou melhores resultados foi a composiccedilatildeo de metanol formiato de amocircnio 001
mol L-1 pH 42 (9010 vv)
Variados tipos de colunas analiacuteticas foram testadas sendo elas A NSTreg (150
mm 46 mm e 5 microm) a ACEreg (150 mm x 46 mm x 5 microm) a Phenomenexreg (250 x 46
mm x 5 microm) e a Atlantis T3 e da Watersreg (100 mm x 21 mm x 3 microm) (comprimento x
diacircmetro interno x tamanho de partiacutecula) no entanto essas colunas aumentaram o
tempo de retenccedilatildeo dos analitos pioraram o perfil cromatograacutefico gerando picos largos e
fragmentados Portanto os testes foram realizados com uma nova coluna analiacutetica a
ACEreg C18 (100 mm x 21 mm x 3 microm comprimento diacircmetro interno e tamanho de
partiacutecula) com preacute-coluna ACEreg C18 (21mm x 3 microm diacircmetro tamanho de partiacutecula)
obtendo-se um menor tempo de anaacutelise (maior frequecircncia analiacutetica) e melhor perfil
cromatograacutefico (picos simeacutetricos) para os analitos
Trecircs volumes de injeccedilatildeo de amostra foram testados (5 10 e 100 microL) devido a
baixa concentraccedilatildeo dos analitos foi adotada a maior quantidade (100 μL) pois forneceu
melhores sinais analiacuteticos Tambeacutem foi avaliado o uso do pool de soro sem diluiccedilatildeo e
diluiacutedo (11 vv) os perfis cromatograacuteficos de ambos foram oacutetimos no entanto
62
escolheu-se trabalhar com a amostra diluiacuteda para diminuir a presenccedila de interferentes e
consequentemente diminuir efeito matriz e aumentar o tempo de durabilidade da coluna
analiacutetica
Jaacute obtidas as melhores condiccedilotildees espectromeacutetricas e cromatograacuteficas foi
otimizado o sistema columm switching na configuraccedilatildeo de backflush o qual apresenta
trecircs eventos como mostrado na Figura 20
Figura 20 - Ilustraccedilatildeo do sistema de columm switching na configuraccedilatildeo de backflush Na posiccedilatildeo 1
correspondente ao evento 1 ocorre exclusatildeo dos interferentes e adsorccedilatildeo dos analitos a coluna extratora Na
posiccedilatildeo 2 durante o evento 2 ocorre a eluiccedilatildeo dos analitos adsorvidos No retorno para a posiccedilatildeo 1
correspondente ao evento 3 ocorre limpeza da coluna extratora separaccedilatildeo e detecccedilatildeo dos analitos e por fim
o recondicionamento do sistema BA = bomba A BB = bomba B BC = bomba C MS = espectrocircmetro de
massas UV = detector UV e W = descarte Fonte Traduzido de (De Faria et al 2017)
Com as vaacutelvulas do sistema na posiccedilatildeo 1 (evento 1) a bomba A promoveu a
liberaccedilatildeo da fase moacutevel de carregamento (aacutegua ultra pura) em um fluxo de 04 mL min-1 O
tempo de 3 minutos foi o necessaacuterio para a adsorccedilatildeo dos analitos e sua preacute-concentraccedilatildeo
aleacutem da eliminaccedilatildeo de macromoleacuteculas A aacutegua mostrou ser um solvente oacutetimo como fase
moacutevel de carregamento aleacutem de ser um recurso barato e natildeo causar danos ao meio
ambiente De forma simultacircnea a fase moacutevel de eluiccedilatildeo fornecida pela bomba C passa
para a coluna analiacutetica de forma a condionaacute-la ainda na ausecircncia dos analitos Ambas as
bombas operaram com uma taxa de fluxo inicial de 04 mL min -1
63
Na posiccedilatildeo 2 da vaacutelvula (evento 2) a bomba C liberou a fase moacutevel de eluiccedilatildeo
(metanol formiato de amocircnio 001 mol L-1 pH 42 (9010 vv) em direccedilatildeo agrave coluna
analiacutetica em fluxo contraacuterio ao que a fase moacutevel de carregamento percorreu (backflush) A
velocidade do fluxo da bomba C foi aumentada para 08 mL min -1 e o tempo determinado
para esta etapa foi de 03 minutos o qual promoveu um oacutetimo perfil cromatograacutefico dos
analitos
No evento 3 as vaacutelvulas foram colocadas na posiccedilatildeo 1 novamente A fase moacutevel
de eluiccedilatildeo (vinda da bomba C) novamente com um fluxo de 04 mL min-1 passou pela
coluna analiacutetica promovendo a separaccedilatildeo dos analitos e sua chegada no detector de
massas De forma simultacircnea a bomba B em um fluxo de 10 mL min -1 liberou a fase
moacutevel de limpeza (acetonitrila aacutegua ultra pura isopropanol 751510 vvv) a qual
passou pela coluna extratora (RAM) promovendo a remoccedilatildeo de resiacuteduos proveniente da
anaacutelise anterior tornando-a pronta para a reutilizaccedilatildeo em uma nova anaacutelise A fase de
limpeza ocorreu no tempo de 33 a 10 min O recondionamento do sistema agraves condiccedilotildees
iniciais de anaacutelise ocorreu nos uacuteltimos 5 min em que a fase moacutevel de limpeza foi
substituiacuteda pela fase moacutevel de carregamento O tempo total para cada anaacutelise foi de 15
minutos
Para a avaliaccedilatildeo da capacidade da fase moacutevel de limpeza (acetonitrila aacutegua
ultra pura isopropanol 751510 vvv) pools de soro branco dopado na maior
concentraccedilatildeo foram injetados no sistema (com a posiccedilatildeo 1 das vaacutelvulas mantida) e apoacutes
a realizaccedilatildeo da fase de limpeza foram injetados pools de soro branco diluiacutedos (11 vv)
O experimento foi realizado em triplicata O cromatograma do soro branco natildeo
apresentou sinal analiacutetico no mesmo tempo de retenccedilatildeo dos analitos o que mostra que a
fase moacutevel de limpeza foi eficiente em seu propoacutesito evitando o chamado efeito
residual (carry-over) De Faria et al 110
64
524 Validaccedilatildeo analiacutetica
Para os testes de validaccedilatildeo foram utilizados pools de amostras de soro branco
dopadas com cada um dos analitos nas concentraccedilotildees conforme o toacutepico 467
concentraccedilotildees menores foram utilizadas no entanto essas natildeo apresentaram bons sinais
analiacuteticos precisatildeo e exatidatildeo Os resultados dos testes de validaccedilatildeo estatildeo demonstrados
na Tabela 6
O teste de linearidade foi expresso como coeficiente de determinaccedilatildeo (r2)
calculado a partir das curvas de calibraccedilatildeo intra-ensaio Para esse teste foram utilizados
os analitos em diferentes concentraccedilotildees em soro branco conforme jaacute citado as
repeticcedilotildees geraram 6 curvas de calibraccedilatildeo para cada analito Os intervalos lineares
foram baseados nos intervalos terapecircuticos 51 117 118
As mesmas concentraccedilotildees dos analitos em soro no ensaio de linearidade foram
utilizadas no ensaio dos LD e LQ Estes foram calculados atraveacutes das 6 curvas de
calibraccedilatildeo e foram definidos como 3 e 10 vezes a relaccedilatildeo sinalruiacutedo respectivamente
para o LD e LQ
Para avaliar a precisatildeo e a exatidatildeo intra e inter-ensaios foram realizados 6
repeticcedilotildees de concentraccedilotildees de calibraccedilatildeo dos analitos Os testes intra-ensaio foram
realizados no mesmo dia e os testes inter-ensaios foram realizados em dias diferentes A
exatidatildeo foi calculada atraveacutes do erro relatico (E) e a precisatildeo atraveacutes do desvio
padratildeo relativo (RSD)
No teste de seletividade foi avaliado se houve a presenccedila picos de interferentes
nos mesmos tempos de retenccedilatildeo dos analitos e dos PIs deuterados As Figuras 21 e 22
mostram os cromatogramas obtidos apoacutes a injeccedilatildeo de soro branco e de soro dopado com
os analitos respectivamente mostrando que natildeo houve a presenccedila de interferentes nos
tempos de retenccedilatildeo dos analitos e PIs deuterados
65
Figura 21 - Cromatograma obtido de amostras de soro branco diluiacutedas em aacutegua ultra pura
Volume de injeccedilatildeo = 100 microL A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz 240rarr mz 131) C-
Hidroxibup (mz 256rarr mz 238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz 80) F-
Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G- Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr mz
244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz 134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz 196rarr
mz 80) Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
Figura 22 - Cromatograma obtido apoacutes anaacutelise de soro diluiacutedo e dopado com os analitos no niacutevel
meacutedio de calibraccedilatildeo e mais os padrotildees internos deuterados A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz
240rarr mz 131) C- Hidroxibup (mz 256rarr mz 238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz
80) F- Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G- Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr
mz 244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz 134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz 196rarr
mz 80) Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
Foram realizados os testes de estabilidade de bancada longo prazo e de
congelamento e descongelamento Para a anaacutelise de estabilidade de bancada soluccedilotildees de
soro dopada com os analitos foram analisadas imediatamente apoacutes a sua preparaccedilatildeo e
apoacutes 4 e 24 horas verificando assim a estabilidade da amostra a curto prazo Para uma
66
anaacutelise a longo prazo as amostras foram armazenadas a -20degC por 30 dias e apoacutes foram
avaliadas Quanto anaacutelises de congelamento e descongelamento foram realizados 3
ciclos de congelamento -20degC e posterior descongelamento e as amostras foram
avaliadas
O ensaio de recuperaccedilatildeo da extraccedilatildeo foi realizado em triplicata A anaacutelise
avaliou a recuperaccedilatildeo relativa comparando-se a extraccedilatildeo dos analitos a partir da matriz
de soro com a de aacutegua atraveacutes da passagem da amostra pela coluna de extraccedilatildeo (RAM)
A recuperaccedilatildeo relativa se daacute pela relaccedilatildeo das concentraccedilotildees nas duas matrizes
(concentraccedilatildeo no soro concentraccedilatildeo na aacutegua) x 100
O efeito residual (carry-over) foi avaliado injetando-se uma amostra de soro
branco antes de uma amostra de soro dopado na maior concentraccedilatildeo e apoacutes foi injetada
novamente uma amostra de soro branco foram inferior a 20 daqueles obtidos no LQ
Para avaliar o efeito matriz foram comparados os resultados da anaacutelise das
amostras de soro dopadas com os analitos em diferentes concentraccedilotildees em matrizes
diferentes (aacutegua e soro) O resultado para ser aceito precisava ser inferior a 15
Posteriormente foi realizada a mensuraccedilatildeo dos analitos em amostras reais de
soro provenientes de pacientes submetidos ao tratamento antitabagismo com doses
conforme bula As Figuras 23 e 24 mostram os cromatogramas de amostras de pacientes
submetidos ao tratamento com bupropiona e vareniclina respectivamente No momento
da coleta das amostras os pacientes estavam fumando e aleacutem de apresentarem os
analitos provenientes dos faacutermacos tambeacutem mostraram a presenccedila de analitos
provenientes da nicotina
67
Figura 23 - Cromatograma obtido atraveacutes da anaacutelise das amostras de soro dos pacientes
tratados com bupropiona (150 mg 2xdia) Os pacientes estavam fumando em torno de 10
cigarrosdia no dia da coleta A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz 240rarr mz 131) C-
hidroxibup (mz 256rarr mz 238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz 80) F-
Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G- Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr mz
244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz 134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz
196rarr mz 80) Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
Figura 24 - Cromatograma obtido atraveacutes da analise de amostras de soro de pacientes tratados
com vareniclina (10 mg 2xdia) Os pacientes fumavam em torno de 10 cigarrosdia no dia da
coleta A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz 240rarr mz 131) C- hidroxibup (mz 256rarr mz
238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz 80) F- Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G-
Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr mz 244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz
134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz 196rarr mz 80) Fonte do autor e do
colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
68
Tabela 6 - Paracircmetros de validaccedilatildeo obtidos na determinaccedilatildeo de faacutermacos antitabagismo em soro humano
Meacutedia plusmn Desvio padratildeo (n=6) amenor bmeacutedio e calto niacutevel de calibraccedilatildeo 1Estabilidade de bancada (4 a 24 horas) Precisatildeo RSD = [Desvio padratildeomeacutedia] x 100 E = [(Meacutedia experimental da
concentraccedilatildeo Concentraccedilatildeo nominal) x 100] ndash 100 2Efeito matriz E= [(Meacutedia da concentraccedilatildeo experimental no solventeMeacutedia experimental da concentraccedilatildeo no soro) x 100] ndash 100
Paracircmetros de validaccedilatildeo Vareniclina Bupropiona Hidroxibupropiona Nicotina Cotinina Hidroxicotinina
Intervalo linear (microg L-1) 5-100 1-1000 1-2000 5-1000 5-1000 5-1000
r2 ( n=6) 09952 09998 09998 09997 09998 09999
Decliacutenio (α) ( n=6) 00196plusmn 00095 00045plusmn00059 00051plusmn00057 00087plusmn00012 00073plusmn00048 00075plusmn00074
Intercepto ( n=6) -00316plusmn00004 -00022plusmn00020 00230plusmn00025 -00046plusmn00065 00767plusmn00012 01918plusmn00013
Tempo de retenccedilatildeo (min) 521 501 485 497 446 441
LD (microg L-1) 25 07 06 19 24 37
LQ (microg L-1) 50 10 10 50 50 50
Precisatildeo intra-ensaio RSD ( n=6) 93a
30a
100c
153a
37b
21c
140a
06b
06c
90a
26b
11c
117a
34b
61c
128a
138b
92c
Precisatildeo inter-ensaio RSD ( n=18 trecircs dias) 185a
115b
66c
82a
27b
20c
109a
17b
10c
83a
27b
14c
158a
41b
31c
161a
44b
92c
Acuraacutecia intra-ensaio E ( n=6) 196a
54b
-30c
-55a
-24b
-11c
-65a
19b
-04c
158a
09b
-26c
-87a
47b
-24c
71a
18b
05c
Acuraacutecia inter-ensaio E ( n=18 trecircs dias) 82a
-16b
035c
41a
-01b
-01c
-87a
27b
-20c
146a
40b
018c
-120a
25b
-110c
58a
-35b
30c
Recuperaccedilatildeo da extraccedilatildeo ( n=3) 883a
1104b
1014c
1101a
1009b
1028c
945a
1094b
1078c
1098a
1088b
1146c
941a
1093b
1116c
1167a
1112b
1141c
Estabilidade1 E
( n=6)
98a
11b
-50c
71a
-32b
-38c
140a
-16b
-79c
40a
-79b
-110c
-132a
-94b
-32c
86a
125b
-54c
Efeito matriz2 E
( n=6)
-117a
104b
14c
101a
09b
28c
-55a
94b
78c
98a
88b
146c
-59a
93b
116c
167a
112b
141c
69
525 Dados cliacutenicos e demograacuteficos dos pacientes submetidos a mensuraccedilatildeo dos
analitos
As Tabelas 7 a 10 mostram as caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos
pacientes submetidos agraves anaacutelises de concentraccedilatildeo dos analitos
As Tabelas 7 e 8 referem-se aos pacientes tratados com vareniclina sendo
considerado o grupo total e os grupos de desfecho respectivamente Os pacientes do
grupo resistente agrave vareniclina fumavam um maior nuacutemero de cigarrosdia (antes do
tratamento) em comparaccedilatildeo com os pacientes que obtiveram sucesso (21 vs 17
cigarrosdia P= 005)
As Tabelas 9 e 10 referem-se aos pacientes tratados com bupropiona no grupo
total e de acordo com desfecho respectivamente O grupo resistente ao tratamento com
bupropiona apresentou maior frequecircncia de pacientes com alta DN (atraveacutes dos escores
FTND e Issa categorizados) e de pacientes que fumavam no dia da coleta em
comparaccedilatildeo ao grupo sucesso (FTNDge6= 833 vs 429 P= 005 Escore Issage3=
1000 vs 429 P= 0001 fumo no dia da coleta= 1000 vs 429 P= 0001
respectivamente)
Tabela 7 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos (n= 74)
Idade (anos) 51 plusmn 12
Gecircnero mulheres () 500
Etnia autodeclarada brancos () 730
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 263 plusmn 49
10 1 4 1
7 1 3 1
8 1 3 1
9 1 3 1
8 1 4 1
5 0 3 1
8 1 4 1
8 1 4 1
7 1 4 1
7 1 3 1
9 1 3 1
7 1 4 1
Cigarrosdia inicial 19 plusmn 10
Fumo no dia da coleta () 919
FTND 62 plusmn 23
FTND ge 6 () 644
70
Escore Issa ge 3 () 851
Hipertensatildeo () 311
Dislipidemia () 392
Diabetes melito tipo 2 () 95
Depressatildeo () 135
Ansiedade () 176
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash
Fagerstroumlm test for nicotine dependence (escala de 0 a 10 pontos)
Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala de 0 a 4
pontos)
Tabela 8 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com o
desfecho de tratamento
Resistente (n=41) Sucesso (n=33) P valor
Idade (anos) 53 plusmn 11 49 plusmn 13 023
Gecircnero mulheres () 561 424 024
Etnia autodeclarada brancos () 683 788 031
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 270 plusmn 40 255 plusmn 58 028
Cigarrosdia 21 plusmn 11 17 plusmn 7 005
Fumo no dia da coleta () 976 848 008
FTND 65 plusmn 22 57 plusmn 23 019
FTND ge 6 () 659 625 077
Escore Issa ge 3 () 829 879 075
Hipertensatildeo () 390 212 010
Dislipidemia () 341 455 032
Diabetes melito tipo 2 () 73 121 069
Depressatildeo () 122 152 071
Ansiedade () 146 212 046
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fagerstroumlm test for nicotine
dependence (escala de 0 a 10 pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
71
Tabela 9 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos (n= 31)
Idade (anos) 52 plusmn 11
Gecircnero mulheres () 71
Etnia autodeclarada brancos () 931
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 258 plusmn 57
Cigarrosdia inicial 21 plusmn 7
Fumo no dia da coleta () 871
FTND 68 plusmn 21
FTND ge 6 () 742
Escore Issa ge 3 () 871
Hipertensatildeo () 226
Dislipidemia () 323
Diabetes melito tipo 2 () 32
Depressatildeo () 65
Ansiedade () 194
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash
Fagerstroumlm test for nicotine dependence (escala de 0 a 10
pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
Tabela 10 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com
o desfecho de tratamento
Resistente (n=24) Sucesso (n=7) Valor de P
Idade (anos) 53 plusmn 11 50 plusmn 11 054
Gecircnero mulheres () 708 714 100
Etnia autodeclarada brancos () 957 833 038
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 252 plusmn 61 278 plusmn 35 015
Cigarrosdia 21 plusmn 7 23 plusmn 7 071
Fumo no dia da coleta () 1000 429 0001
FTND 73 plusmn 15 54 plusmn 32 011
FTND ge 6 () 833 429 005
Escore Issa ge 3 () 1000 429 0001
Hipertensatildeo () 292 00 016
72
Dislipidemia () 375 143 038
Diabetes melito tipo 2 () 42 00 100
Depressatildeo () 83 00 100
Ansiedade () 250 00 029
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fagerstroumlm test for nicotine
dependence (escala de 0 a 10 pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
526 Anaacutelise de associaccedilatildeo dos analitos com desfecho de tratamento
A Tabela 11 mostra a frequecircncia do desfecho de tratamento de acordo com os
medicamentos antitabagismo pacientes estes cujas amostras de soro foram submetidas agrave
mensuraccedilatildeo dos analitos
Tabela 11 ndash Frequecircncia do desfecho de tratamento nos pacientes submetidos agraves
anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com os medicamentos
antitabagismo
Medicamento Resistente () Sucesso ()
Vareniclina (n=74) 544 446
Bupropiona (n=31) 774 226
As Tabelas de 12 a 15 mostram as concentraccedilotildees dos analitos nas amostras de
soro dos pacientes tratados com vareniclina e bupropiona no grupo total e de acordo
com o desfecho de tratamento
Os pacientes do grupo resistente tanto os pacientes tratados com vareniclina
(Tabela 13) quanto com bupropiona (Tabela 15) apresentaram concentraccedilatildeo
significativamente maior de cotinina e hidroxicotinina do que os grupos sucesso
(tratamento com vareniclina cotinina= 1182 vs 706 μgL P= 0009 hidroxicotinina=
845 vs 516 μgL P= 002 Tratamento com bupropiona cotinina= 1346 vs 160 μgL
P= 0005 hidroxicotinina= 972 vs 374 μgL P= 0004) No entanto quanto ao NMR
natildeo houve diferenccedila entre os desfechos de tratamento de ambos os faacutermacos Aleacutem
73
disso somente o grupo de pacientes tratados com vareniclina continha pacientes com
NMRlt031 (metabolizadores lentos para nicotina) e ainda sua frequecircncia foi baixa
(100 e 43 para os grupos de desfecho resistente e sucesso respectivamente)
Tabela 12 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos pacientes tratados
com vareniclina
Vareniclina μgL n=71 83 (81 ndash 95)
Nicotina μgL n=31 75 (76 ndash 112)
Cotinina μgL n=65 1007 (923 ndash 1225)
Hidroxicotinina μgL n=65 681 (638 ndash 874)
NMR n=63 069 (067 ndash 102)
NMR lt031 () n=63 79
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de
95) NMR=trans-3-hidroxicotininacotinina NMR lt031=
metabolizador lento NMR ge031= metabolizador normal e raacutepido A
hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo
trans-3- hidroxicotinina para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade
de outros isocircmeros satildeo irrelevantes
Tabela 13 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de tratamento
com vareniclina
Resistente Sucesso P
valor Vareniclina μgL n=71 84 (78 ndash 99) 83 (77 ndash 97) 096
Nicotina μgL n=31 83 (74 ndash 127) 70 (59 ndash 105) 032
Cotinina μgL n=65 1182 (1012 ndash 1426)
111114143ndash
1421426)
706 (643 ndash 1037) 0009
Hidroxicotinina μgL n=65 845 (702 ndash 1032) 516 (434 ndash 721) 002
NMR n=63 074 (062 ndash 107) 061 (055 ndash 113) 064
NMR lt031 () n=63 100 43 064
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de 95) NMR=trans-3-
hidroxicotininacotinina NMR lt031= metabolizador lento NMR ge031= metabolizador normal e
raacutepido A hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3- hidroxicotinina
para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros satildeo irrelevantes
74
Tabela 14 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos pacientes tratados
com bupropiona
Bupropiona μgL n=30 369 (332 ndash 493)
Hidroxibupropiona μgL n=23 7368 (5860 ndash 7824)
Nicotina μgL n=13 71 (62 ndash 109)
Cotinina μgL n=27 1159 (971 ndash 1648)
Hidroxicotinina μgL n=28 931 (838 ndash 1387)
NMR n=27 090 (074 ndash 149)
NMR lt031 () n=27 0
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de 95) NMR=
trans-3-hidroxicotininacotinina NMR lt031= metabolizador lento NMR
ge031= metabolizador normal e raacutepido Natildeo houve pacientes com NRM lt031 A
hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3-
hidroxicotinina para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros
satildeo irrelevantes
Tabela 15 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de tratamento
com bupropiona
Resistente Sucesso P
valor Bupropiona μgL n=30 372 (331 ndash 533) 300 (214 ndash 481) 048
Hidroxibupropiona μgL n=23 7795 (6078 ndash 8308) 5128 (2957 ndash 8195) 012
Nicotina μgL n=13 71 (62 ndash 109) - -
Cotinina μgL n=27 1346 (1097 ndash 1784) 160 (-195 ndash 712) 0005
Hidroxicotinina μgL n=28 972 (929 ndash 1520) 374 (33 ndash 847) 0004
NMR n=27 084 (076 ndash 109) 132 (-371 ndash 884) 014
NMR lt031 () n=27 0 0 -
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de 95) NMR= trans-3-
hidroxicotininacotinina NMR lt031= metabolizador lento NMR ge031= metabolizador normal e raacutepido
No grupo sucesso somente 1 paciente apresentou concentraccedilatildeo de nicotina Natildeo houve pacientes com NRM
lt031 A hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3- hidroxicotinina para o
caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros satildeo irrelevantes
75
6 DISCUSSAtildeO
61 Para os dados da anaacutelise de expressatildeo gecircnica
O presente estudo cliacutenico e exploratoacuterio identificou resultados significativos para
expressatildeo dos genes CHRNA7 e CHRNG de acordo com os tempos de coleta e o
desfecho de tratamento com vareniclina Amostras do grupo resistente nos tempos T2 e
T4 isto eacute jaacute com o uso da vareniclina apresentaram menores niacuteveis de expressatildeo
gecircnica do CHRNA7 comparado agraves amostras do T0 (antes de iniciar o tratamento
farmacoloacutegico) Estes resultados sugerem que o downregulation de α7 pode ter sido
responsaacutevel pela natildeo cessaccedilatildeo do fumo nos indiviacuteduos do grupo resistente o que natildeo foi
observado nas amostras do grupo sucesso
O gene CHRNA7 codifica a subunidade α7 dos nAChRs Esta possui grande
importacircncia estaacute presente em diversos tecidos e possui associaccedilatildeo consistente em
vaacuterios estudos com o processo de dependecircncia agrave nicotina processos cognitivos e
imunoloacutegicos 119-124 Estudos tambeacutem mostraram que haacute um locus contendo duplicaccedilatildeo
do gene CHRNA7 truncada composta pelos exons 5-10 do gene CHRNA7 precidida de
4 exons uacutenicos e uma deleccedilatildeo de dois pares de bases no eacutexon 6 o qual nomearam como
CHRNFAN7 A maioria dos indiviacuteduos possui uma ou duas coacutepias deste gene e satildeo
raros os casos em que esta coacutepia natildeo estaacute presente 125 126
No ceacuterebro de ratos Sprague-Dawley Ryan e Loiacono 119 detectaram niacuteveis de
α7 transcritos em diversos locais como na substacircncia negra compacta (SNpc) na
substacircncia negra reticular (SNpr) na aacuterea tegmental ventral (VTA) no coacutertex e no
hipocampo Os ratos submetidos ao tratamento crocircnico com nicotina mostraram maiores
niacuteveis de mRNA da subunidade α7 em SNpc SNpr e VTA em comparaccedilatildeo ao grupo
controle A VTA faz parte do sistema de recompensa mesoliacutembico o qual eacute muito
estudado nos processos de ND 12 15 No presente estudo (em amostras de PBMC) o
76
grupo de pacientes resistentes tambeacutem apresentou maior expressatildeo de α7 no momento
em que somente a nicotina estava presente no fumo crocircnico Ao introduzir a vareniclina
as expressotildees foram diminuiacutedas nos tempos T2 e T4 provavelmente devido ao
antagonismo competitivo da vareniclina com a nicotina no receptor
Benhammou et al 127 realizaram um estudo com amostras de ceacuterebro post mortem
de fumantes e com amostras de sangue de voluntaacuterios fumantes e natildeo fumantes Atraveacutes
do uso de nicotina radiomarcada nas amostras de ceacuterebro mostraram que os siacutetios de
ligaccedilatildeo agrave nicotina foram aumentados proporcionamente conforme o nuacutemero de cigarros
por dia O mesmo estudo ao analizar a expressatildeo gecircnica e proteiacutenas em linfoacutecitos e
ceacutelulas polimorfonucleares para um subconjunto de subunidades de receptores
nicotiacutenicos essas ceacutelulas assim como no tecido cerebral exibiram maiores nuacutemeros de
siacutetios de ligaccedilatildeo de alta afinidade agrave nicotina em fumantes em comparaccedilatildeo com natildeo
fumantes
A vareniclina em estudos funcionais mostrou ter atividade agonista total nos
receptores α7 40 Em um estudo realizou-se o tratamento crocircnico com vareniclina eou
nicotina em camundongos (10 dias) os niacuteveis das drogas no ceacuterebro e no plasma e a
toleracircncia e a expressatildeo de 4 subtipos de nAChR apoacutes dose aguda de nicotina foram
checados usando autoradiografia O upregulation de receptores α4β2 devido ao
tratamento crocircnico com vareniclina foi similar ao promovido pela nicotina e tambeacutem
ocorreu dowregulation de α6β2 assim como ocorreu com o uso de nicotina A
vareniclina aumentou significantemente os siacutetios de α3β4 e α7 enquanto a nicotina teve
menor efeito nestes siacutetios A combinaccedilatildeo da nicotina com a vareniclina foi similar agrave
vareniclina sozinha para os siacutetios de α3β4 enquanto para o siacutetio de α7 a combinaccedilatildeo
promoveu upregulation em menos regiotildees cerebrais em comparaccedilatildeo com a vareniclina
em monoterapia 77
77
No presente estudo os pacientes do grupo resistente apresentaram efeito
semelhante associado ao uso combinado de vareniclina e nicotina (devido ao fumo) os
niacuteveis de expressatildeo de CHRNA7 natildeo foram mantidos como nos pacientes que obtiveram
sucesso no tratamento No entanto o grupo sucesso soacute estava utilizando a vareniclina na
ausecircncia de nicotina entre os tempos T2 e T4 o que sugere que esse dowregulation
pode ocorrer em subgrupo de resposta
Diversos estudos mostraram diferenccedilas na expressatildeo gecircnica de a7 em
amostras de pacientes com diagnoacutesticos psiquiaacutetricos em comparaccedilatildeo com indiviacuteduos
sadios 102 128-134
Kunii et al 128 mostraram diferenccedila na expressatildeo de a7 em coacutertex preacute-frontal
dorsolateral post mortem de pacientes com depressatildeo ansiedade e transtorno bipolar e
inuacutemeros estudos mostraram menores niacuteveis de expressatildeo de α7 em pacientes com
esquizofrenia 102 129-134
Estudos de indiviacuteduos com esquizofrenia satildeo oacutetimos modelos para o
entendimento da importacircncia do receptor a7 em processos cognitivos em ND e em
como esses mecanismos estatildeo intimamente relacionados Diversos estudos mostraram
que haacute uma maior prevalecircncia de tabagismo em indiviacuteduos com esquizofrenia
comparados agrave populaccedilatildeo geral 135 136
Mexal el al 102 realizaram um estudo com amostras de ceacuterebro post mortem
provenientes de indiviacuteduos de 4 grupos distintos controle natildeo fumante controle
fumante pacientes com esquizofrenia natildeo fumantes e pacientes com esquizofrenia
fumantes O estudo realizou ensaio de expressatildeo de mRNA e de proteiacutena atraveacutes de
PCR quantitativo em tempo real e western blot As sondas da PCR foram desenhadas
para amplificar o gene completo CHRNA7 e sua coacutepia duplicada o CHRFAM7A Natildeo
fumantes com esquizofrecircnia apresentaram expressatildeo reduzida de mRNA e de proteiacutena
78
em relaccedilatildeo aos pacientes com esquizofrenia fumantes Natildeo fumantes com esquizofrenia
apresentaram menor expressatildeo em relaccedilatildeo ao controle natildeo fumante mas essa diferenccedila
foi estatisticamente significativa apenas no niacutevel do mRNA Outros estudos post
mortem cerebral mostraram menor expressatildeo dos receptores nicotiacutenicos no coacutertex e no
hipocampo de indiviacuteduos com esquizofrecircnia comparado aos controles saudaacuteveis 129-134
O CHRFAM7A assim como o CHRNA7 eacute polimoacuterfico e variantes neste gene
foram associadas agrave patologia auditoacuteria em casos de esquizofrenia Processos
diferenciados nos mecanismos de transcriccedilatildeo podem contribuir para um funcionamento
anormal de a7 como variaccedilotildees em promotor splicing alternativo eou desequiliacutebrio de
ligaccedilatildeo com o SNP do gene de neuroregulina -1 (gene que codifica moleacutecula de adesatildeo
celular envolvida em processos de neuroplasticidade sinaacuteptica) Estes processos podem
estar envonvidos em endofenoacutetipos da doenccedila 122 126 137-144
A nicotina parece melhorar a audiccedilatildeo em indiviacuteduos com deacuteficit auditoacuterio na
esquizofrenia associado ao α7 permitindo uma melhor filtragem dos estiacutemulos
auditivos estranhos A nicotina melhora a cogniccedilatildeo na esquizofrenia e agentes
alternativos que ativam o receptor nicotiacutenico foram testados e esses compostos
melhoraram a atenccedilatildeo a memoacuteria de trabalho e os sintomas negativos em um estudo
complementar de pacientes natildeo fumantes com esquizofrenia 145
Os estudos citados nos mostram grandes evidecircncias da associaccedilatildeo do α7 com
ND processos cognitivos e de resposta agrave vareniclina Esses achados podem explicar
nossos resultados em relaccedilatildeo agrave diminuiccedilatildeo da expressatildeo de 7 no grupo de pacientes
resistentes ao tratamento Os pacientes do grupo sucesso mantiveram os niacuteveis de
expressatildeo gecircnica em resposta agrave vareniclina jaacute no grupo resistente houve um
dowregulation Sugerimos que essa diminuiccedilatildeo pode ter sido a responsaacutevel ao menos
em parte pelos indiviacuteduos natildeo terem conseguido deixar de fumar A nicotina pode estar
79
compensando um deacuteficit de α7 que os indiviacuteduos resistentes podem apresentar No
entanto natildeo sabemos como seria a expressatildeo de α7 nestes indiviacuteduos na ausecircncia do
fumo
Quanto ao gene CHNRG natildeo haacute muitos resultados na literatura Este codifica
a subunidade γ dos receptores nicotiacutenicos A maioria dos estudos aponta associaccedilatildeo da
subunidade com distuacuterbios esqueleacutetico-musculares 146-149
No entanto King et al 65 encontraram a associaccedilatildeo de polimorfismos neste
gene com nausea no tratamento com vareniclina E Keskitalo-Vuokko 150 et al
encontraram associaccedilatildeo de SNPs em loci do cluster de genes CHRNGCHRND (genes
muitos proacuteximos o uacuteltimo codifica a subunidade delta dos nAChRs) com o niacutevel de
cotinina Saccone et al 151 encontraram a associaccedilatildeo de 4 loci no cluster
CHRNDCHRNG com ND Em outro estudo variantes nos genes CHRNDCHRNG
mostraram associaccedilatildeo modesta com o risco de ND em amostras de afro-americanos 152
Em um estudo o qual foi utilizado um modelo de esquizofrenia em ratos no
grupo de animais tratados com clozapina foi encontrado downregulation do Chrng no
nuacutecleo accumbens Neste mesmo estudo Santoro et al natildeo conseguiram formular uma
hipoacutetese para o achado devido ao lack de informaccedilotildees na literatura com o foco em ND
ou performance cognitiva 153
Haacute algumas limitaccedilotildees no estudo Primeira o ensaio da anaacutelise de expressatildeo
gecircnica foi realizado com amostras de sangue perifeacuterico e natildeo no SNC o que poderia nos
mostrar uma relaccedilatildeo mais clara e direta do faacutermaco com a via de resposta No entanto a
obtenccedilatildeo desta amostra eacute inviaacutevel Em contrapartida estudos jaacute demonstraram que haacute
similaridade entre a expressatildeo gecircnica de ceacutelulas do SNC e de ceacutelulas de sangue
perifeacuterico para alguns destes genes de receptores nicotiacutenicos 102 Segunda natildeo foi
realizado ensaio de expressatildeo gecircnica para amostras de indiviacuteduos natildeo fumantes o que
80
poderia fornecer mais paracircmetros de comparaccedilatildeo com os grupos resistente e sucesso
Terceira natildeo conseguimos qualidade necessaacuteria nas anaacutelises de genes potencialmente
importantes
62 Para os dados da mensuraccedilatildeo dos analitos
Um dos maiores desafios em anaacutelises de amostras bioloacutegicas eacute eliminar os
interferentes de sua matriz sem alterar substancialmente as quantidades dos analitos
presentes A matriz de amostras de soro e plasma satildeo complexas e envolve a presenccedila
de inuacutemeras macromoleacuteculas como lipiacutedios e proteiacutenas que obstruem colunas anaacuteliticas
diminuem o tempo de duraccedilatildeo de equipamentos e inviabilizam a interpretaccedilatildeo dos
dados devido a imensos picos e ruiacutedos formados nos cromatogramas e espectros de
massa Inumeros trabalhos executam uma preparaccedilatildeo preacutevia das amostras que envolve
processos como a extraccedilatildeo com uso de solventes preciptaccedilatildeo de proteiacutenas entre outros
os quais podem promover uma baixa recuperaccedilatildeo dos analitos tempo prolongado de
bancada e gasto de materiais 51 104-106
Devido agrave esse fato inuacutemeros estudos propuseram o uso de materiais de acesso
restrito (RAMs) para a purificaccedilatildeo da amostra sem tanto manuseio dentre eles estatildeo os
nanotubos de carbono (CNTs) modificados 109 110 114-116
O presente estudo desenvolveu uma coluna extratora composta por nanotubos
hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados quimicamente com a adiccedilatildeo de grupos
hidrofiacuteficos Essa coluna permitiu uma oacutetima exclusatildeo de macromoleacuteculas (98) A
aacutegua ultra pura foi o suficiente para ser utilizada como fase moacutevel de carregamento o
que eacute sustentaacutevel aleacutem de natildeo causar danos ao meio ambiente e o uacutenico preparo da
amostra foi uma diluiacuteccedilatildeo 11 tambeacutem em aacutegua O novo RAM desenvolvido foi
81
encaminhado para pedido de patente (Anexo 5) e portanto os processos para o seu
desenvolvimento foram mantidos em sigilo
Os CNTs possuem uma grande aacuterea superfiacutecial e oacutetima estabilidade em anaacutelise
de compostos no entanto o material natildeo promove a remoccedilatildeo de proteiacutenas com
eficiecircncia 110 115 Os poros dos CNTs formam uma barreira fiacutesica excluindo ou
permitindo a entrada de moleacuteculas por tamanho e os grupos hidrofiacutelicos adicionados ao
RAM desenvolvido natildeo permitem a ligaccedilatildeo de proteiacutenas de forma irreversiacutevel
formando uma barreira fiacutesico-quiacutemica Os demais CNTs natildeo modificados disponiacuteveis
natildeo promovem a exclusatildeo de macromoleacuteculas com tanta efetividade quanto o material
desenvolvido aleacutem disso o novo RAM apoacutes limpeza pode ser reutilizado cerca de 400
vezes (valor calculado durante os experimentos com amostras controle)
Quanto a otimizaccedilatildeo do meacutetodo de mensuraccedilatildeo a anaacutelise multidimensional
atraveacutes de equipamentos conectados por vaacutelvulas comutadoras promoveu a realizaccedilatildeo
da extraccedilatildeo eluiccedilatildeo anaacutelise limpeza e recondicionamento do sistema automaacuteticamente
A anaacutelise completa de uma amostra foi realizada em apenas 15 minutos O sistema
permitiu a mensuraccedilatildeo conjunta de diversos analitos com caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas
diferentes de uma mesma amostra mostrando bons sinais analiacuteticos e perfis
cromatograacuteficos
Quanto aos dados de validaccedilatildeo o meacutetodo permitiu uma oacutetima recuperaccedilatildeo dos
analitos com valores proacuteximos a 100 semelhante a outros estudos 104 117 154 155 A
maior dificuldade encontrada neste estudo foi a configuraccedilatildeo de paracircmetros
espectromeacutetricos e cromatograacuteficos que pudessem obter o maacuteximo de recuperaccedilatildeo e o
menor LQ possiacutevel para a anaacutelise de vareniclina ainda em um contexto de anaacutelise
multianalito
82
A dose posoloacutegica da vareniclina eacute muito baixa (1mg 2 vezes ao dia a partir do
8deg dia de tratamento) em comparaccedilatildeo com a da bupropiona (150 mg 2 vezes ao dia a
partir do 8deg dia de tratamento) dessa forma as concentraccedilotildees plasmaacuteticas de
vareniclina satildeo muito baixas Apesar do valor de LQ obtido (5 μg L-1) estar entre as
meacutedias plasmaacuteticas de intervalo terapecircutico (40 -70 μg L-1 de vareniclina em plasma e
soro) 51 118 ao mensurar amostras de pacientes em um cenaacuterio real de tratamento de 74
pacientes apenas 3 amostras apresentaram concentraccedilatildeo plasmaacutetica de vareniclina
abaixo do limite de quantificaccedilatildeo
Quanto a recuperaccedilatildeo do analito da matriz a vareniclina tambeacutem mostrou menor
taxa (883) em relaccedilatildeo aos outros analitos (valores proacuteximos ao 100) no entanto
essa taxa de recuperaccedilatildeo eacute considerada alta e foi semelhante ao estudo de Dobrinas et al
156 o qual realizou a extraccedilatildeo da amostra atraveacutes de coluna extratora de fase soacutelida
(SPE) disponiacutevel no mercado e a mensuraccedilatildeo tambeacutem foi realizada em um contexto
multianalito E ainda a recuperaccedilatildeo de vareniclina no presente estudo foi maior do que
a obtida pelo trabalho de Al-Haj et al 105 o qual realizou a preparaccedilatildeo preacutevia da amostra
por extraccedilatildeo liacutequido-liacutequido (LLE) e a mensuraccedilatildeo foi realizada para somente um
analito (4759 - 4872) e obteve recuperaccedilatildeo semelhante ao estudo de os qual
tambeacutem realizou a anaacutelise de vareniclina em um cenaacuterio multianalito (830 ndash 920)
Para nicotina e cotinina os valores de LQ obtidos no presente estudo (50 μg L-1)
se assemelham aos obtidos nos estudos de Abdallah et al 104 (70 μg L-1 para cotinina)
Onoue et al 157 (50 μg L-1 para nicotina e cotinina) Petersen et al 117 (50 μg L-1) Para
bupropiona e hidroxibupropiona o meacutetodo proposto eacute capaz de mensurar pequenas
quantidades do faacutermaco e de seu metaboacutelito (LQ 10 μg L-1 para ambos) quantidades
menores do que os LQs obtidos nos estudos de 158 (55 para bupropiona e 60 μgL para
83
hidroxibupropiona) e de 155 (100 μg L-1 para hidroxibupropiona) apesar das
concentraccedilotildees de metaboacutelitos em estado de equiliacutebrio em pacientes tratados com doses
terapecircuticas do faacutermaco serem bem maiores (45 ndash 75 μg L-1 e de 500 ndash 1500 μg L-1)
respectivamente para bupropiona e hidroxibupropiona 118
O Quadro 6 mostra os paracircmetros analiacuteticos do presente estudo comparados com
outros estudos presentes na literatura
Quanto agraves mensuraccedilotildees das amostras dos pacientes natildeo encontramos associaccedilatildeo
dos faacutermacos e seus metaboacutelitos com desfecho de tratamento Esse fato poderia ser
explicado pelo pequeno nuacutemero amostral do presente estudo
Encontramos diferenccedila significativa entre os grupos resistente e sucesso ao
tratamento quanto aos paracircmetros relacionados ao fumo e agrave DN Os pacientes do grupo
resistente tratados com vareniclina (ainda antes do iniacutecio do tratamento) fumavam um
maior nuacutemero de cigarrosdia em comparaccedilatildeo com os pacientes que obtiveram sucesso
O grupo resistente ao tratamento com bupropiona apresentou maior frequecircncia de
pacientes com alta DN (antes do tratamento) e de pacientes que fumavam no dia da
coleta em comparaccedilatildeo ao grupo sucesso Os dados tambeacutem mostraram que os pacientes
resistentes tratados com ambos os faacutermacos no dia da coleta apresentaram maiores
concentraccedilotildees dos metaboacutelitos da nicotina Esses dados podem indicar maior exposiccedilatildeo
ao fumo e maior DN podendo implicar na resposta ao tratamento antitabagismo
Haacute algumas limitaccedilotildees nesse estudo Primeira os pacientes natildeo fizeram exames
de funccedilatildeo hepaacutetica antes da inclusatildeo no entudo no entanto a presenccedila de comorbidades
hepaacuteticas foram questionadas Segunda natildeo podemos obter total rigor nos horaacuterios de
tomada dos medicamentos por parte dos pacientes no entanto os pacientes foram
84
orientados agrave tomar o medicamento sempre no mesmo horaacuterio e foram questionados
quanto ao cumprimento do protocolo Terceira o nuacutemero amostral para a anaacutelise dos
analitos e de NRM em estudos de associaccedilatildeo com desfecho de tratamento eacute considerado
modesto e consequentemente pode ter implicado nos resultados de natildeo associaccedilatildeo
85
Quadro 6 ndash Comparaccedilatildeo dos dados de validaccedilatildeo com outros estudos
Analitos Purificaccedilatildeo da
amostraextraccedilatildeo Meacutetodo Amostra Intervalo Linear (μg L-1) Recuperaccedilatildeo () LD μg L-1 LQ μg L-1 Referecircncia
Vareniclina
Bupropiona
Hidroxibupropiona
Nicotina
Cotinina
Hidroxicotinina
CS ndash SPE (novo
RAM) HPLC-MSMS Soro humano
50 ndash 1000
10 ndash 10000
10 ndash 20000
50 ndash 10000
50 ndash 10000
50 ndash 10000
883
1101
945
1098
941
1167
25
07
06
19
24
37
50
10
10
50
50
50
Presente
estudo
Nicotitna
Cotinina LLE (LCndashMSMS) Soro humano
03 ndash 525
70 ndash15000
978 ndash 1114
973 ndash1156 -
03
70
Abdalla et al 104
Bupropiona
Hidroxibupropiona PP + SPE online TFCndashMSMS) Soro humano 50 ndash 10000
1580
1160
13
45
55
60
Petrides et
al 158
Vareniclina LLE HPLCndashMSMS
(API) Plasma humano 01ndash100 4759 - 4872 005 01
Al-Haj et al 105
Vareniclina LLE HPLC-
APIMSMS
Plasma
Urina
01 - 500
10 ndash 5000 - -
lt01
100
Faessel et al 51
Nicotina
cotinina
trans-3 ndash
hidroxicotinina
vareniclina
SPE (Oasis MCX 10
mg 96-well extraction
plate)
UPLCndashMSMS
Soro humano
100 ndash 5000
100 ndash 5000
100 - 5000
100 ndash 2500
860 ndash 940
700 ndash 870
490 ndash 540
830 ndash 920
-
20
10
20
10
Dobrinas et
al 156
86
Nicotina
Cotinina Centrifugaccedilatildeo
Diluiccedilatildeo
isotoacutepica estaacutevel
ndash UPLC-
MSMS
Urina 50 ndash 350000 968ndash1051
943ndash992
07
04
17
11
Kuhn et al 154
Nicotina e Cotinina LLE PP SPE
(UPLC-
MSMS)
Sangue urina e
outros tecidos de
rato
100 ndash 6000 (plasma)
80 (nicotina e
cotininacom
precipitaccedilatildeo)
25 50 Onoue et al
157
Cotinina LL SPE (coluna
Zorbaxs XDB C8) HPLCUV Soro e urina 50 ndash 5000 978 ndash 102 018 50
Petersen et
al 117
hidroxibupropiona PP + SPE online RP‐HPLCUV Plasma humano 1000 - 25000 6118 1000 1000
Scherf-
Clavel et al 155
CS ndash SPE= Extraccedilatildeo em fase soacutelida no modo column switching LLE= extraccedilatildeo liacutequido-liacutequido PP=precipitaccedilatildeo de proteiacutenas SPE=extraccedilatildeo em fase soacutelida HPLC= cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia
UPLC=cromatografia liacutequida de ultra eficiecircncia RP‐HPLC=Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia em fase reversa TFC=Cromatografia liacutequida turbulenta API=ionizaccedilatildeo em pressatildeo atmosfeacutericaUV=
detector ultravioleta MSMS= espectometria de massas em tandem
87
7 CONCLUSOtildeES
Para a anaacutelise da expressatildeo gecircnica este estudo exploratoacuterio mostra a associaccedilatildeo
das subunidades α7 e γ com a efetividade do tratamento com vareniclina Estes
resultados poderiam contribuir ao menos em parte para o desenvolvimento de uma
terapecircutica individualizada
Para a mensuraccedilatildeo de analitos o novo RAM sintetizado eacute um produto de
extremo valor cientiacutefico podendo apresentar diversas aplicaccedilotildees em anaacutelise de amostras
de matrizes complexas sem muita preparaccedilatildeo preacutevia Para a associaccedilatildeo das
concentraccedilotildees dos faacutermacos e seus metaboacutelitos com o desfecho de tratamento satildeo
necessaacuterios estudos com um maior nuacutemero amostral
88
8 SUGESTOtildeES PARA ESTUDOS FUTUROS
Sugerimos estudos que promovam maior entendimento das subunidades α7 e γ
dos nAChRs nos processos de dependecircncia agrave nicotina e no tratamento com vareniclina
Sugerimos tambeacutem estudos de investigaccedilatildeo para novas aplicabilidades do novo RAM
desenvolvido
89
9 REFEREcircNCIAS
1 WHO Tobacco WHO Media Centre 2015
2 Oliveira AF Valente JG Leite IC [Aspects of tobacco attributable mortality
systematic review] Rev Saude Publica 200842(2)335-345
3 Koshiaris C Aveyard P Oke J Ryan R Szatkowski L Stevens R Farley A
Smoking cessation and survival in lung upper aero-digestive tract and bladder
cancer cohort study Br J Cancer 2017117(8)1224-1232
4 Leppanen T Toyras J Mervaala E Penzel T Kulkas A Severity of individual
obstruction events increases with age in patients with obstructive sleep apnea
Sleep Med 20173732-37
5 Cerda J Bambs C Vera C Infant morbidity and mortality attributable to
prenatal smoking in Chile Rev Panam Salud Publica 201741e106
6 Vigitel Brasil - Vigilacircncia de fatores de risco e proteccedilatildeo para doenccedilas crocircnicas
por inqueacuterito telefocircnico Estimativas sobre frequecircncia e distribuiccedilatildeo
sociodemograacutefica de fatores de risco e proteccedilatildeo para doenccedilas crocircnicas nas
capitais dos 26 estados brasileiros e no Distrito Federal em 2018 Brasiacutelia 2019
7 Rosemberg J Nicotina Droga Universal Instituto Nacional de Cacircncer
(wwwincagovbr) 2004
8 Kirchenchtein C Chatkin JM Dependecircncia da Nicotina In Diretrizes para
Cessaccedilatildeo do Tabagismo Jornal Brasileiro de Pneumologia Brasiacutelia DF 2004
9 Fagerstoumlm K Uma breve apresentaccedilatildeo da neurofarmacologia e fisiologia da
dependecircncia agrave nicotina In Gigliotti AP Presman S (Eds) Atualizaccedilatildeo no
Tratamento do Tabagismo ABP Sauacutede 2006
10 Gigliotti A Lemos T Quais satildeo os mecanismos da dependecircncia de nicotina
In Manual de Condutas e Praacuteticas em Tabagismo Sociedade Brasileira de
Pneumologia e Tisiologia 2012
11 Divisatildeo de Controle do Tabagismo Coordenaccedilatildeo de Accedilotildees Estrateacutegicas
Instituto Nacional de Cacircncer Silva AG Ministeacuterio da Sauacutede Protocolo cliacutenico
e diretrizes terapecircuticas dependecircncia agrave nicotina 2013
12 Schultz W Multiple reward signals in the brain Nat Rev Neurosci
20001(3)199-207
13 Stolerman IP Jarvis MJ The scientific case that nicotine is addictive
Psychopharmacology (Berl) 1995117(1)2-10 discussion 14-20
90
14 Koob GF Volkow ND Neurocircuitry of addiction Neuropsychopharmacology
200935(1)217-238
15 Martin-Soelch C Neuroadaptive changes associated with smoking structural
and functional neural changes in nicotine dependence Brain Sci 20133(1)159-
176
16 Boening JA Neurobiology of an addiction memory J Neural Transm (Vienna)
2001108(6)755-765
17 Robbins TW Everitt BJ Limbic-striatal memory systems and drug addiction
Neurobiol Learn Mem 200278(3)625-636
18 Everitt BJ Belin D Economidou D Pelloux Y Dalley JW Robbins TW
Review Neural mechanisms underlying the vulnerability to develop compulsive
drug-seeking habits and addiction Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci
2008363(1507)3125-3135
19 Fuentes RM Notkola IL Shemeikka S Tuomilehto J Nissinen A Familial
aggregation of blood pressure a population-based family study in eastern
Finland J Hum Hypertens 200014(7)441-445
20 Gotti C Zoli M Clementi F Brain nicotinic acetylcholine receptors native
subtypes and their relevance Trends Pharmacol Sci 200627(9)482-491
21 Benowitz NL Pharmacology of nicotine addiction smoking-induced disease
and therapeutics Annu Rev Pharmacol Toxicol 20094957-71
22 Benowitz NL Clinical pharmacology of inhaled drugs of abuse implications in
understanding nicotine dependence NIDA Res Monogr 19909912-29
23 Picciotto MR Zoli M Rimondini R Lena C Marubio LM Pich EM Fuxe K
Changeux JP Acetylcholine receptors containing the beta2 subunit are involved
in the reinforcing properties of nicotine Nature 1998391(6663)173-177
24 Maskos U Molles BE Pons S Besson M Guiard BP Guilloux JP Evrard A
Cazala P Cormier A Mameli-Engvall M Dufour N Cloez-Tayarani I
Bemelmans AP Mallet J Gardier AM David V Faure P Granon S Changeux
JP Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of
nicotinic receptors Nature 2005436(7047)103-107
25 Tapper AR McKinney SL Nashmi R Schwarz J Deshpande P Labarca C
Whiteaker P Marks MJ Collins AC Lester HA Nicotine activation of alpha4
receptors sufficient for reward tolerance and sensitization Science
2004306(5698)1029-1032
26 Aberger K Chitravanshi VC Sapru HN Cardiovascular responses to
microinjections of nicotine into the caudal ventrolateral medulla of the rat Brain
Res 2001892(1)138-146
91
27 Levin ED Bettegowda C Blosser J Gordon J AR-R17779 and alpha7
nicotinic agonist improves learning and memory in rats Behav Pharmacol
199910(6-7)675-680
28 Hajos M Hurst RS Hoffmann WE Krause M Wall TM Higdon NR Groppi
VE The selective alpha7 nicotinic acetylcholine receptor agonist PNU-282987
[N-[(3R)-1-Azabicyclo[222]oct-3-yl]-4-chlorobenzamide hydrochloride]
enhances GABAergic synaptic activity in brain slices and restores auditory
gating deficits in anesthetized rats J Pharmacol Exp Ther 2005312(3)1213-
1222
29 Salas R Orr-Urtreger A Broide RS Beaudet A Paylor R De Biasi M The
nicotinic acetylcholine receptor subunit alpha 5 mediates short-term effects of
nicotine in vivo Mol Pharmacol 200363(5)1059-1066
30 Henningfield JE Stapleton JM Benowitz NL Grayson RF London ED Higher
levels of nicotine in arterial than in venous blood after cigarette smoking Drug
Alcohol Depend 199333(1)23-29
31 Hukkanen J Jacob P 3rd Benowitz NL Metabolism and disposition kinetics of
nicotine Pharmacol Rev 200557(1)79-115
32 Dempsey D Tutka P Jacob P 3rd Allen F Schoedel K Tyndale RF Benowitz
NL Nicotine metabolite ratio as an index of cytochrome P450 2A6 metabolic
activity Clin Pharmacol Ther 200476(1)64-72
33 Allenby CE Boylan KA Lerman C Falcone M Precision Medicine for
Tobacco Dependence Development and Validation of the Nicotine Metabolite
Ratio J Neuroimmune Pharmacol 201611(3)471-483
34 Llaquet H Pichini S Joya X Papaseit E Vall O Klein J Garcia-Algar O
Biological matrices for the evaluation of exposure to environmental tobacco
smoke during prenatal life and childhood Anal Bioanal Chem 2010396(1)379-
399
35 Reichert J AA Gonccedilalves CMC Godoy I Chatkin JM Sales MPU et al
Diretrizes da Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisologia Diretrizes para
cessaccedilatildeo do tabagismo ndash 2008 J Bras Pneumol 200834(10)845-880
36 Fiore MC Jaeacuten C R Baker TB Treating tobacco use and dependence 2008
update Clinical Practice Guideline In services USDohah ed Public Health
Service Rockville (md) 2008
37 Kassem MG Al Hossaini AM Varenicline Profiles Drug Subst Excip Relat
Methodol 201237389-411
38 Zoli M Lena C Picciotto MR Changeux JP Identification of four classes of
brain nicotinic receptors using beta2 mutant mice J Neurosci
199818(12)4461-4472
92
39 Hogg RC Raggenbass M Bertrand D Nicotinic acetylcholine receptors from
structure to brain function Rev Physiol Biochem Pharmacol 20031471-46
40 Mihalak KB Carroll FI Luetje CW Varenicline is a partial agonist at
alpha4beta2 and a full agonist at alpha7 neuronal nicotinic receptors Mol
Pharmacol 200670(3)801-805
41 Swan GE Javitz HS Jack LM Wessel J Michel M Hinds DA Stokowksi RP
McClure JB Catz SL Richards J Zbikowski SM Deprey M McAfee T Conti
DV Bergen AW Varenicline for smoking cessation nausea severity and
variation in nicotinic receptor genes Pharmacogenomics J 201212(4)349-358
42 Kaur K Kaushal S Chopra SC Varenicline for smoking cessation A review of
the literature Curr Ther Res Clin Exp 200970(1)35-54
43 Catz SL Jack LM McClure JB Javitz HS Deprey M Zbikowski SM McAfee
T Richards J Swan GE Adherence to varenicline in the COMPASS smoking
cessation intervention trial Nicotine Tob Res 201113(5)361-368
44 Faessel HM Burstein AH Troutman MD Willavize SA Rohrbacher KD Clark
DJ Lack of a pharmacokinetic interaction between a new smoking cessation
therapy varenicline and digoxin in adult smokers Eur J Clin Pharmacol
200864(11)1101-1109
45 Mohanasundaram UM Chitkara R Krishna G Smoking cessation therapy with
varenicline Int J Chron Obstruct Pulmon Dis 20083(2)239-251
46 Faessel HM Smith BJ Gibbs MA Gobey JS Clark DJ Burstein AH Single-
dose pharmacokinetics of varenicline a selective nicotinic receptor partial
agonist in healthy smokers and nonsmokers J Clin Pharmacol 200646(9)991-
998
47 Faessel HM Obach RS Rollema H Ravva P Williams KE Burstein AH A
review of the clinical pharmacokinetics and pharmacodynamics of varenicline
for smoking cessation Clin Pharmacokinet 201049(12)799-816
48 Ravva P Gastonguay MR Tensfeldt TG Faessel HM Population
pharmacokinetic analysis of varenicline in adult smokers Br J Clin Pharmacol
200968(5)669-681
49 Obach RS Reed-Hagen AE Krueger SS Obach BJ OConnell TN Zandi KS
Miller S Coe JW Metabolism and disposition of varenicline a selective
alpha4beta2 acetylcholine receptor partial agonist in vivo and in vitro Drug
Metab Dispos 200634(1)121-130
50 Feng B Obach RS Burstein AH Clark DJ de Morais SM Faessel HM Effect
of human renal cationic transporter inhibition on the pharmacokinetics of
varenicline a new therapy for smoking cessation an in vitro-in vivo study Clin
Pharmacol Ther 200883(4)567-576
93
51 Faessel HM Gibbs MA Clark DJ Rohrbacher K Stolar M Burstein AH
Multiple-dose pharmacokinetics of the selective nicotinic receptor partial
agonist varenicline in healthy smokers J Clin Pharmacol 200646(12)1439-
1448
52 Slemmer JE Martin BR Damaj MI Bupropion is a nicotinic antagonist J
Pharmacol Exp Ther 2000295(1)321-327
53 Hughes JR Stead LF Lancaster T Antidepressants for smoking cessation
Cochrane Database Syst Rev 2007(1)CD000031
54 Goodnick PJ Pharmacokinetics of second generation antidepressants
bupropion Psychopharmacol Bull 199127(4)513-519
55 Hesse LM Venkatakrishnan K Court MH von Moltke LL Duan SX Shader
RI Greenblatt DJ CYP2B6 mediates the in vitro hydroxylation of bupropion
potential drug interactions with other antidepressants Drug Metab Dispos
200028(10)1176-1183
56 Faucette SR Hawke RL Lecluyse EL Shord SS Yan B Laethem RM Lindley
CM Validation of bupropion hydroxylation as a selective marker of human
cytochrome P450 2B6 catalytic activity Drug Metab Dispos 200028(10)1222-
1230
57 Walsky RL Astuccio AV Obach RS Evaluation of 227 drugs for in vitro
inhibition of cytochrome P450 2B6 J Clin Pharmacol 200646(12)1426-1438
58 Walsky RL Obach RS A comparison of 2-phenyl-2-(1-piperidinyl)propane
(ppp) 111-phosphinothioylidynetrisaziridine (thioTEPA) clopidogrel and
ticlopidine as selective inactivators of human cytochrome P450 2B6 Drug
Metab Dispos 200735(11)2053-2059
59 Quaak M van Schooten FJ van Schayck CP Pharmacogenetics of smoking
how far to the clinic Pharmacogenomics 201415(6)723-726
60 Swan GE Lessov-Schlaggar CN Tobacco addiction and pharmacogenetics of
nicotine metabolism J Neurogenet 200923(3)262-271
61 Tomaz PRX Kajita MS Santos JR Scholz J Abe TO Gaya PV Krieger JE
Pereira AC Santos P Cytochrome P450 2A6 and 2B6 polymorphisms and
smoking cessation success in patients treated with varenicline Eur J Clin
Pharmacol201975(11)1541-1545
62 Tomaz PRX Santos JR Scholz J Abe TO Gaya PV Negrao AB Krieger JE
Pereira AC Santos P Cholinergic receptor nicotinic alpha 5 subunit
polymorphisms are associated with smoking cessation success in women BMC
Med Genet201819(1)55
94
63 Scholz J Santos PC Buzo CG Lopes NH Abe TO Gaya PV Pierri H Amorim
C Pereira AC Effects of aging on the effectiveness of smoking cessation
medication Oncotarget 20167(21)30032-30036
64 Issa JS Santos PC Vieira LP Abe TO Kuperszmidt CS Nakasato M Cardoso
E Amorim C Pereira AC Smoking cessation and weight gain in patients with
cardiovascular disease or risk factor Int J Cardiol 2014172(2)485-487
65 King DP Paciga S Pickering E Benowitz NL Bierut LJ Conti DV Kaprio J
Lerman C Park PW Smoking cessation pharmacogenetics analysis of
varenicline and bupropion in placebo-controlled clinical trials
Neuropsychopharmacology 201237(3)641-650
66 Saccone NL Baurley JW Bergen AW David SP Elliott HR Foreman MG
Kaprio J Piasecki TM Relton CL Zawertailo L Bierut LJ Tyndale RF Chen
LS The Value of Biosamples in Smoking Cessation Trials A Review of
Genetic Metabolomic and Epigenetic Findings Nicotine Tob Res
201820(4)403-413
67 Rocha Santos J Tomaz PR Issa JS Abe TO Krieger JE Pereira AC Santos
PC CHRNA4 rs1044396 is associated with smoking cessation in varenicline
therapy Front Genet 2015646
68 Tomaz PR Santos JR Issa JS Abe TO Gaya PV Krieger JE Pereira AC
Santos PC CYP2B6 rs2279343 polymorphism is associated with smoking
cessation success in bupropion therapy Eur J Clin Pharmacol 2015
71(9)1067-73
69 David SP Brown RA Papandonatos GD Kahler CW Lloyd-Richardson EE
Munafo MR Shields PG Lerman C Strong D McCaffery J Niaura R
Pharmacogenetic clinical trial of sustained-release bupropion for smoking
cessation Nicotine Tob Res 20079(8)821-833
70 Lerman C Shields PG Wileyto EP Audrain J Pinto A Hawk L Krishnan S
Niaura R Epstein L Pharmacogenetic investigation of smoking cessation
treatment Pharmacogenetics 200212(8)627-634
71 Han DH Joe KH Na C Lee YS Effect of genetic polymorphisms on smoking
cessation a trial of bupropion in Korean male smokers Psychiatr Genet
200818(1)11-16
72 Zanger UM Klein K Pharmacogenetics of cytochrome P450 2B6 (CYP2B6)
advances on polymorphisms mechanisms and clinical relevance Front Genet
2013424
73 Zhu AZ Cox LS Nollen N Faseru B Okuyemi KS Ahluwalia JS Benowitz
NL Tyndale RF CYP2B6 and bupropions smoking-cessation pharmacology
the role of hydroxybupropion Clin Pharmacol Ther 201292(6)771-777
95
74 Laib AK Brunen S Pfeifer P Vincent P Hiemke C Serum concentrations of
hydroxybupropion for dose optimization of depressed patients treated with
bupropion Ther Drug Monit 201436(4)473-479
75 Hutchison KE Allen DL Filbey FM Jepson C Lerman C Benowitz NL Stitzel
J Bryan A McGeary J Haughey HM CHRNA4 and tobacco dependence from
gene regulation to treatment outcome Arch Gen Psychiatry 200764(9)1078-
1086
76 Smith RC Zhubi A Maloku E Sershen H Lajtha A Davis JM Costa E
Guidotti A Varenicline treatment decreases DNMT1 mRNA expression in
lymphocytes of schizophrenic patients who are cigarette smokers Schizophr
Res 2010119(1-3)269-270
77 Marks MJ ONeill HC Wynalda-Camozzi KM Ortiz NC Simmons EE Short
CA Butt CM McIntosh JM Grady SR Chronic treatment with varenicline
changes expression of four nAChR binding sites in mice Neuropharmacology
201599142-155
78 Middleton FA Pato CN Gentile KL McGann L Brown AM Trauzzi M Diab
H Morley CP Medeiros H Macedo A Azevedo MH Pato MT Gene
expression analysis of peripheral blood leukocytes from discordant sib-pairs
with schizophrenia and bipolar disorder reveals points of convergence between
genetic and functional genomic approaches Am J Med Genet B Neuropsychiatr
Genet 2005136B(1)12-25
79 Takahashi M Hayashi H Watanabe Y Sawamura K Fukui N Watanabe J
Kitajima T Yamanouchi Y Iwata N Mizukami K Hori T Shimoda K Ujike H
Ozaki N Iijima K Takemura K Aoshima H Someya T Diagnostic
classification of schizophrenia by neural network analysis of blood-based gene
expression signatures Schizophr Res 2010119(1-3)210-218
80 Lee J Goh LK Chen G Verma S Tan CH Lee TS Analysis of blood-based
gene expression signature in first-episode psychosis Psychiatry Res
2012200(1)52-54
81 Sullivan PF Fan C Perou CM Evaluating the comparability of gene expression
in blood and brain Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet
2006141B(3)261-268
82 Hennings JM Uhr M Klengel T Weber P Putz B Touma C Czamara D Ising
M Holsboer F Lucae S RNA expression profiling in depressed patients
suggests retinoid-related orphan receptor alpha as a biomarker for antidepressant
response Transl Psychiatry 20155e538
83 Ota VK Noto C Gadelha A Santoro ML Silva PN Melaragno MI Smith Mde
A Cordeiro Q Bressan RA Belangero SI Neurotransmitter receptor and
regulatory gene expression in peripheral blood of Brazilian drug-naive first-
96
episode psychosis patients before and after antipsychotic treatment Psychiatry
Res2013210(3)1290-1292
84 Kordi-Tamandani DM Tajoddini S Salimi F Promoter Methylation and BDNF
and DAT1 Gene Expression Profiles in Patients with Drug Addiction
Pathobiology 201582(2)94-99
85 Wongsriraksa A Parsons ME Whelan CJ Characterisation of nicotine receptors
on human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) Inflamm Res
200958(1)38-44
86 Kawashima K Fujii T Expression of non-neuronal acetylcholine in
lymphocytes and its contribution to the regulation of immune function Front
Biosci 200492063-2085
87 St-Pierre S Jiang W Roy P Champigny C LeBlanc E Morley BJ Hao J
Simard AR Nicotinic Acetylcholine Receptors Modulate Bone Marrow-Derived
Pro-Inflammatory Monocyte Production and Survival PLoS One
201611(2)e0150230
88 Zdanowski R Krzyzowska M Ujazdowska D Lewicka A Lewicki S Role of
alpha7 nicotinic receptor in the immune system and intracellular signaling
pathways Cent Eur J Immunol 201540(3)373-379
89 Baez-Pagan CA Delgado-Velez M Lasalde-Dominicci JA Activation of the
Macrophage alpha7 Nicotinic Acetylcholine Receptor and Control of
Inflammation J Neuroimmune Pharmacol 201510(3)468-476
90 Kalkman HO Feuerbach D Modulatory effects of alpha7 nAChRs on the
immune system and its relevance for CNS disorders Cell Mol Life Sci
201673(13)2511-2530
91 Zakrzewicz A Richter K Agne A Wilker S Siebers K Fink B Krasteva-Christ
G Althaus M Padberg W Hone AJ McIntosh JM Grau V Canonical and
Novel Non-Canonical Cholinergic Agonists Inhibit ATP-Induced Release of
Monocytic Interleukin-1beta via Different Combinations of Nicotinic
Acetylcholine Receptor Subunits alpha7 alpha9 and alpha10 Front Cell
Neurosci201711189
92 Arreola R Alvarez-Herrera S Perez-Sanchez G Becerril-Villanueva E Cruz-
Fuentes C Flores-Gutierrez EO Garces-Alvarez ME de la Cruz-Aguilera DL
Medina-Rivero E Hurtado-Alvarado G Quintero-Fabian S Pavon L
Immunomodulatory Effects Mediated by Dopamine J Immunol
Res20163160486
93 Nakajima M Yamamoto T Nunoya K Yokoi T Nagashima K Inoue K Funae
Y Shimada N Kamataki T Kuroiwa Y Role of human cytochrome P4502A6 in
C-oxidation of nicotine Drug Metab Dispos 199624(11)1212-1217
97
94 Messina ES Tyndale RF Sellers EM A major role for CYP2A6 in nicotine C-
oxidation by human liver microsomes J Pharmacol Exp Ther
1997282(3)1608-1614
95 Chen A Krebs NM Zhu J Muscat JE Nicotine metabolite ratio predicts
smoking topography The Pennsylvania Adult Smoking Study Drug Alcohol
Depend201819089-93
96 Shahab L BL McNeill Tyndale RF Does the nicotine metabolite ratio
moderate smoking cessation treatment outcomes in real-world settings A
prospective study Addiction 2019114(2)304-314 doi 101111add14450
97 Lea RA Dickson S Benowitz NL Within-subject variation of the salivary
3HCCOT ratio in regular daily smokers prospects for estimating CYP2A6
enzyme activity in large-scale surveys of nicotine metabolic rate J Anal Toxicol
200630(6)386-389
98 Mooney ME Li ZZ Murphy SE Pentel PR Le C Hatsukami DK Stability of
the nicotine metabolite ratio in ad libitum and reducing smokers Cancer
Epidemiol Biomarkers Prev 200817(6)1396-1400
99 Piestansky J Marakova K Veizerova L Galba J Mikus P On-line column
coupled isotachophoresis-capillary zone electrophoresis hyphenated with
tandem mass spectrometry in drug analysis varenicline and its metabolite in
human urine Anal Chim Acta 201482684-93
100 Fagerstrom KO Heatherton TF Kozlowski LT Nicotine addiction and its
assessment Ear Nose Throat J 199069(11)763-765
101 Issa JS A new nicotine dependence score and a new scale assessing patient
comfort during smoking cessation treatment J Bras Pneumol 201238(6)761-
765
102 Mexal S Berger R Logel J Ross RG Freedman R Leonard S Differential
regulation of alpha7 nicotinic receptor gene (CHRNA7) expression in
schizophrenic smokers J Mol Neurosci 201040(1-2)185-195
103 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-
time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods
200125(4)402-408
104 Abdallah IA Hammell DC Stinchcomb AL Hassan HE A fully validated LC-
MSMS method for simultaneous determination of nicotine and its metabolite
cotinine in human serum and its application to a pharmacokinetic study after
using nicotine transdermal delivery systems with standard heat application in
adult smokers J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2016102067-
77
98
105 Al-Haj A Alawi M Arafat T Hourani MK Method development validation
and bioequivalence of varenicline in human plasma by liquid chromatography
tandem mass spectrometry J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci
2013931134-139
106 Hegstad S Stray-Pedersen A Olsen L Vege A Rognum TO Morland J
Christophersen AS Determination of cotinine in pericardial fluid and whole
blood by liquid chromatography-tandem mass spectrometry J Anal Toxicol
200933(4)218-222
107 Santos MG Moraes Gde O Nakamura MG dos Santos-Neto AJ Figueiredo
EC Restricted access molecularly imprinted polymers obtained by bovine serum
albumin andor hydrophilic monomers external layers a comparison related to
physical and chemical properties Analyst 2015140(22)7768-7775
108 de Lima MM Vieira AC Martins I Boralli VB Borges KB Figueiredo EC
On-line restricted access molecularly imprinted solid phase extraction of
ivermectin in meat samples followed by HPLC-UV analysis Food Chem
2015197(Pt A)7-13
109 Barbosa AF Barbosa VM Bettini J Luccas PO Figueiredo EC Restricted
access carbon nanotubes for direct extraction of cadmium from human serum
samples followed by atomic absorption spectrometry analysis Talanta
2016131213-220
110 de Faria HD Abrao LC Santos MG Barbosa AF Figueiredo EC New
advances in restricted access materials for sample preparation A review Anal
Chim Acta 201795943-65
111 FRANQUI L S et al Synthesis and characterization of a magnetic molecularly
imprinted polymer for the selective extraction of nicotine and cotinine from
urine samples followed by GC-MS analysis Anal Methods 2015 7(21) 9237ndash
9244 2015
112 Santos MG Tavares IM Barbosa AF Bettini J Figueiredo EC Analysis of
tricyclic antidepressants in human plasma using online-restricted access
molecularly imprinted solid phase extraction followed by direct mass
spectrometry identificationquantification Talanta 20171638-16
113 US Department of Health and Human Services Food and Drug Administration
(FDA) Center for Drug Evaluation and Research (CDER)Center for Veterinary
Medicine (CVM) Guidance for IndustryBioanalytical method validation
Biopharmaceutics 2013
114 GOMES Raphael A B et al Evaluation of the pH influence on protein
exclusion by restricted access carbono nanotubes coated with bovine serum
albumin Journal Of Materials Science 2016 51(16)7407-7414
99
115 de Faria HD Rosa MA Silveira AT Figueiredo EC Direct extraction of
tetracyclines from bovine milk using restricted access carbon nanotubes in a
column switching liquid chromatography system Food Chem 201722598-106
116 de Faria HD Bueno CT Krieger JE Krieger EM Pereira AC Santos P
Figueiredo EC Online extraction of antihypertensive drugs and their metabolites
from untreated human serum samples using restricted access carbon nanotubes
in a column switching liquid chromatography system J Chromatogr A
2017152841-52
117 Petersen GO Leite CE Chatkin JM Thiesen FV Cotinine as a biomarker of
tobacco exposure development of a HPLC method and comparison of matrices
J Sep Sci 201033(4-5)516-521
118 Brunen S Vincent PD Baumann P Hiemke C Havemann-Reinecke U
Therapeutic drug monitoring for drugs used in the treatment of substance-related
disorders literature review using a therapeutic drug monitoring appropriateness
rating scale Ther Drug Monit 201133(5)561-572
119 Ryan RE Loiacono RE Nicotine regulates alpha7 nicotinic receptor subunit
mRNA implications for nicotine dependence Neuroreport 200112(3)569-
572
120 Cameli C Bacchelli E De Paola M Giucastro G Cifiello S Collo G Cainazzo
MM Pini LA Maestrini E Zoli M Genetic variation in CHRNA7 and
CHRFAM7A is associated with nicotine dependence and response to varenicline
treatment Eur J Hum Genet 201826(12)1824-1831
121 Wallace TL Bertrand D Importance of the nicotinic acetylcholine receptor
system in the prefrontal cortex Biochem Pharmacol 201385(12)1713-1720
122 Dempster EL Toulopoulou T McDonald C Bramon E Walshe M Wickham H
Sham PC Murray RM Collier DA Episodic memory performance predicted by
the 2bp deletion in exon 6 of the alpha 7-like nicotinic receptor subunit gene
Am J Psychiatry 2006163(10)1832-1834
123 Enioutina EY Myers EJ Tvrdik P Hoidal JR Rogers SW Gahring LC The
nicotinic receptor Alpha7 impacts the mouse lung response to LPS through
multiple mechanisms PLoS One 201510(3)e0121128
124 Sinkus ML Graw S Freedman R Ross RG Lester HA Leonard S The human
CHRNA7 and CHRFAM7A genes A review of the genetics regulation and
function Neuropharmacology 201596(Pt B)274-288
125 Gault J Robinson M Berger R Drebing C Logel J Hopkins J Moore T Jacobs
S Meriwether J Choi MJ Kim EJ Walton K Buiting K Davis A Breese C
Freedman R Leonard S Genomic organization and partial duplication of the
human alpha7 neuronal nicotinic acetylcholine receptor gene (CHRNA7)
Genomics 199852(2)173-185
100
126 Riley B Williamson M Collier D Wilkie H Makoff A A 3-Mb map of a large
Segmental duplication overlapping the alpha7-nicotinic acetylcholine receptor
gene (CHRNA7) at human 15q13-q14 Genomics 200279(2)197-209
127 Benhammou K Lee M Strook M Sullivan B Logel J Raschen K Gotti C
Leonard S [(3)H]Nicotine binding in peripheral blood cells of smokers is
correlated with the number of cigarettes smoked per day Neuropharmacology
200039(13)2818-2829
128 Kunii Y Zhang W Xu Q Hyde TM McFadden W Shin JH Deep-Soboslay A
Ye T Li C Kleinman JE Wang KH Lipska BK CHRNA7 and CHRFAM7A
mRNAs co-localized and their expression levels altered in the postmortem
dorsolateral prefrontal cortex in major psychiatric disorders Am J Psychiatry
2015172(11)1122-1130
129 Breese CR Lee MJ Adams CE Sullivan B Logel J Gillen KM Marks MJ
Collins AC Leonard S Abnormal regulation of high affinity nicotinic receptors
in subjects with schizophrenia Neuropsychopharmacology 200023(4)351-
364
130 Freedman R Hall M Adler LE Leonard S Evidence in postmortem brain tissue
for decreased numbers of hippocampal nicotinic receptors in schizophrenia Biol
Psychiatry 199538(1)22-33
131 Guan ZZ Zhang X Blennow K Nordberg A Decreased protein level of
nicotinic receptor alpha7 subunit in the frontal cortex from schizophrenic brain
Neuroreport 199910(8)1779-1782
132 Martin-Ruiz CM Haroutunian VH Long P Young AH Davis KL Perry EK
Court JA Dementia rating and nicotinic receptor expression in the prefrontal
cortex in schizophrenia Biol Psychiatry 200354(11)1222-1233
133 Marutle A Zhang X Court J Piggott M Johnson M Perry R Perry E
Nordberg A Laminar distribution of nicotinic receptor subtypes in cortical
regions in schizophrenia J Chem Neuroanat 200122(1-2)115-126
134 Leonard S Breese C Adams C Benhammou K Gault J Stevens K Lee M
Adler L Olincy A Ross R Freedman R Smoking and schizophrenia abnormal
nicotinic receptor expression Eur J Pharmacol 2000393(1-3)237-242
135 Kumari V Postma P Nicotine use in schizophrenia the self medication
hypotheses Neurosci Biobehav Rev 200529(6)1021-1034
136 de Leon J Diaz FJ A meta-analysis of worldwide studies demonstrates an
association between schizophrenia and tobacco smoking behaviors Schizophr
Res 200576(2-3)135-157
101
137 Flomen RH Collier DA Osborne S Munro J Breen G St Clair D Makoff AJ
Association study of CHRFAM7A copy number and 2 bp deletion
polymorphisms with schizophrenia and bipolar affective disorder Am J Med
Genet B Neuropsychiatr Genet 2006141B(6)571-575
138 Gault J Hopkins J Berger R Drebing C Logel J Walton C Short M Vianzon
R Olincy A Ross RG Adler LE Freedman R Leonard S Comparison of
polymorphisms in the alpha7 nicotinic receptor gene and its partial duplication
in schizophrenic and control subjects Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet
2003123B(1)39-49
139 Perl O Strous RD Dranikov A Chen R Fuchs S Low levels of alpha7-
nicotinic acetylcholine receptor mRNA on peripheral blood lymphocytes in
schizophrenia and its association with illness severity Neuropsychobiology
200653(2)88-93
140 Raux G Bonnet-Brilhault F Louchart S Houy E Gantier R Levillain D Allio
G Haouzir S Petit M Martinez M Frebourg T Thibaut F Campion D The -2
bp deletion in exon 6 of the alpha 7-like nicotinic receptor subunit gene is a risk
factor for the P50 sensory gating deficit Mol Psychiatry 20027(9)1006-1011
141 Leonard S Gault J Hopkins J Logel J Vianzon R Short M Drebing C Berger
R Venn D Sirota P Zerbe G Olincy A Ross RG Adler LE Freedman R
Association of promoter variants in the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor
subunit gene with an inhibitory deficit found in schizophrenia Arch Gen
Psychiatry 200259(12)1085-1096
142 Mathew SV Law AJ Lipska BK Davila-Garcia MI Zamora ED Mitkus SN
Vakkalanka R Straub RE Weinberger DR Kleinman JE Hyde TM Alpha7
nicotinic acetylcholine receptor mRNA expression and binding in postmortem
human brain are associated with genetic variation in neuregulin 1 Hum Mol
Genet 200716(23)2921-2932
143 Severance EG Yolken RH Novel alpha7 nicotinic receptor isoforms and
deficient cholinergic transcription in schizophrenia Genes Brain Behav
20087(1)37-45
144 Severance EG Dickerson FB Stallings CR Origoni AE Sullens A Monson
ET Yolken RH Differentiating nicotine- versus schizophrenia-associated
decreases of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor transcript CHRFAM7A
in peripheral blood lymphocytes J Neural Transm (Vienna) 2009116(2)213-
220
145 Olincy A Freedman R Nicotinic mechanisms in the treatment of psychotic
disorders a focus on the alpha7 nicotinic receptor Handb Exp Pharmacol
2012 (213)211-232
146 Kariminejad A Almadani N Khoshaeen A Olsson B Moslemi AR Tajsharghi
H Truncating CHRNG mutations associated with interfamilial variability of the
102
severity of the Escobar variant of multiple pterygium syndrome BMC
Genet201617(1)71
147 Liu Y Wang L Yang YK Liang Y Zhang TJ Liang N Yang LM Li SJ Shan
D Wu QQ Prenatal diagnosis of fetal skeletal dysplasia using targeted next-
generation sequencing an analysis of 30 cases Diagn Pathol 201914(1)76
148 Natera-de Benito D Topf A Vilchez JJ Gonzalez-Quereda L Dominguez-
Carral J Diaz-Manera J Ortez C Bestue M Gallano P Dusl M Abicht A
Muller JS Senderek J Garcia-Ribes A Muelas N Evangelista T Azuma Y
McMacken G Paipa Merchan A Rodriguez Cruz PM Camacho A Jimenez E
Miranda-Herrero MC Santana-Artiles A Garcia-Campos O Dominguez-Rubio
R Olive M Colomer J Beeson D Lochmuller H Nascimento A Molecular
characterization of congenital myasthenic syndromes in Spain Neuromuscul
Disord 201727(12)1087-1098
149 Seo J Choi IH Lee JS Yoo Y Kim NK Choi M Ko JM Shin YB Rare cases
of congenital arthrogryposis multiplex caused by novel recurrent CHRNG
mutations J Hum Genet 201560(4)213-215
150 Keskitalo-Vuokko K Pitkaniemi J Broms U Heliovaara M Aromaa A Perola
M Ripatti S Salminen O Salomaa V Loukola A Kaprio J Associations of
nicotine intake measures with CHRN genes in Finnish smokers Nicotine Tob
Res201113(8)686-690
151 Saccone NL Saccone SF Hinrichs AL Stitzel JA Duan W Pergadia ML
Agrawal A Breslau N Grucza RA Hatsukami D Johnson EO Madden PA
Swan GE Wang JC Goate AM Rice JP Bierut LJ Multiple distinct risk loci
for nicotine dependence identified by dense coverage of the complete family of
nicotinic receptor subunit (CHRN) genes Am J Med Genet B Neuropsychiatr
Genet 2009150B(4)453-466
152 Saccone NL Schwantes-An TH Wang JC Grucza RA Breslau N Hatsukami
D Johnson EO Rice JP Goate AM Bierut LJ Multiple cholinergic nicotinic
receptor genes affect nicotine dependence risk in African and European
Americans Genes Brain Behav 20109(7)741-750
153 Santoro ML Ota VK Stilhano RS Silva PN Santos CM Diana MC Gadelha
A Bressan RA Melaragno MI Han SW Abilio VC Belangero SI Effect of
antipsychotic drugs on gene expression in the prefrontal cortex and nucleus
accumbens in the spontaneously hypertensive rat (SHR) Schizophr Res
2014157(1-3)163-168
154 Kuhn J Vollmer T Martin C Hendig D Knabbe C Fast and sample cleanup-
free measurement of nicotine and cotinine by stable isotope dilution ultra-
performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry J Pharm
Biomed Anal 201267-68137-143
103
155 Scherf-Clavel M Wahl O Menke A Unterecker S Determination of
hydroxybupropion in human serum for routine therapeutic drug monitoring in
psychiatry A tool for dose-individualization in treatment with bupropion
Biomed Chromatogr 201933(10)e4609
156 Dobrinas M Choong E Noetzli M Cornuz J Ansermot N Eap CB
Quantification of nicotine cotinine trans-3-hydroxycotinine and varenicline in
human plasma by a sensitive and specific UPLC-tandem mass-spectrometry
procedure for a clinical study on smoking cessation J Chromatogr B Analyt
Technol Biomed Life Sci 2011879(30)3574-3582
157 Onoue S Yamamoto N Seto Y Yamada S Pharmacokinetic study of nicotine
and its metabolite cotinine to clarify possible association between smoking and
voiding dysfunction in rats using UPLCESI-MS Drug Metab Pharmacokinet
201126(4)416-422
158 Petrides AK Moskowitz J Johnson-Davis KL Jannetto PJ Langman LJ Clarke
W Marzinke MA The development and validation of a turbulent flow-liquid
chromatography-tandem mass spectrometric method for the simultaneous
quantification of citalopram sertraline bupropion and hydroxybupropion in
serum Clin Biochem 201447(15)73-79
Rubrica participante Rubrica pesquisador
APEcircNDICE - TCLE
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
HOSPITAL DAS CLIacuteNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SAtildeO
PAULO-HCFMUSP
Registro das explicaccedilotildees do pesquisador ao paciente ou seu representante legal sobre a pesquisa consignando
Vocecirc estaacute sendo convidado (a) a participar de um projeto de pesquisa Este projeto tem
como objetivos principais para os indiviacuteduos fumantes submetidos aos tratamentos
farmacoloacutegicos antitabagismo associar o efeito das caracteriacutesticas geneacuteticas (DNA ou RNA) e do
metabolismo (concentraccedilatildeo dos produtos de metabolismo dos medicamentos no sangue) com a
eficiecircncia do tratamento antitabagismo O objetivo do estudo eacute saber por que algumas pessoas
respondem bem aos medicamentos antitabagismo enquanto outras pessoas natildeo respondem e
consequentemente natildeo conseguem parar de fumar Para isto precisaremos de amostras de
sangue cuja quantidade eacute comumente solicitada em exames laboratoriais de rotina (2 tubos a
cada visita = 20mL) Precisaremos tambeacutem do seu consentimento para que dados de seu
prontuaacuterio meacutedico sejam consultados Para os pacientes que utilizaratildeo o medicamento
bupropiona precisaremos de amostras de sangue na primeira consulta (visita T-1) e duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento medicamentoso (visita T2) Para os pacientes que utilizaratildeo
o medicamento vareniclina precisaremos de uma amostra de sangue na primeira consulta (visita
T-1) na segunda consulta ndash ainda antes de iniciar o tratamento com medicamento (visita T0) duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento medicamentoso (visita T2) e quatro semanas apoacutes o iniacutecio
do tratamento medicamentoso (visita T4) Os desconfortos mais comuns que podem ocorrer com
sua participaccedilatildeo neste estudo satildeo os mesmos de uma coleta de sangue no braccedilo por exemplo
leve dor no local da punccedilatildeo e eventualmente hematoma local Este sangue seraacute encaminhado
ao Laboratoacuterio de Geneacutetica e Cardiologia Molecular do Instituto do Coraccedilatildeo onde seraacute
armazenado somente para a pesquisa Sua participaccedilatildeo eacute totalmente voluntaacuteria Apoacutes ler
entender e esclarecer suas duacutevidas vocecirc assinaraacute 2 vias de igual teor desse documento (termo de
consentimento Livre e Esclarecido) Ainda vocecirc poderaacute solicitar o seu desligamento deste projeto
a qualquer momento bastando para tal entrar em contato os pesquisadores no tel (11) 2661-5592
ou 2661-5995 Em qualquer etapa do estudo vocecirc teraacute acesso aos profissionais responsaacuteveis
pela pesquisa para esclarecimento de eventuais duacutevidas O pesquisador responsaacutevel eacute a Dra
Jaqueline Scholz que pode ser encontrada no endereccedilo Av Dr Eneacuteas de Carvalho Aguiar 44
Instituto do Coraccedilatildeo Bloco 2 andar 1 Programa Ambulatorial de Tratamento Tabagismo
INCOR-HCFMUSP telefone (11) 2661-5592 Se vocecirc tiver alguma consideraccedilatildeo ou duacutevida sobre
a eacutetica da pesquisa entre em contato com o Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa (CEP) ndash Rua Oviacutedio
Pires de Campos 225 ndash 5ordm andar ndash tel (11) 2661-7585 FAX (011) 2661-7585 ndash e-mail
Rubrica participante Rubrica pesquisador
cappesqadmhcfmuspbr Poderaacute tambeacutem solicitar a destruiccedilatildeo das amostras que estaratildeo
armazenadas no mesmo laboratoacuterio
As informaccedilotildees obtidas seratildeo analisadas em conjunto com outros pacientes natildeo sendo
divulgada a identificaccedilatildeo de nenhum paciente Natildeo haveraacute nenhuma despesa por parte do
participante Tambeacutem natildeo haacute compensaccedilatildeo financeira relacionada agrave sua participaccedilatildeo
Benefiacutecio direto para o participante eacute a possibilidade de parar de fumar e ser bem monitorado
durante todo o processo de 12 semanas
Estas informaccedilotildees poderatildeo auxiliar na elaboraccedilatildeo de programas eficazes para o uso
da informaccedilatildeo das caracteriacutesticas individuais em usuaacuterios de medicamentos antitabagismo
Acredito ter sido suficientemente informado a respeito das informaccedilotildees que li ou que
foram lidas para mim descrevendo o estudo ldquoAnaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de
expressatildeo gecircnica dos genoacutetipos preditores de metabolizaccedilatildeo e das concentraccedilotildees de
metaboacutelitos com a resposta ao tratamento antitabagismordquo Eu discuti com o Dra Jaqueline
Scholz com a Juliana da Rocha dos Santos eou Paulo Roberto Xavier Tomaz sobre a minha
decisatildeo em participar nesse estudo Ficaram claros para mim quais satildeo os propoacutesitos do
estudo os procedimentos a serem realizados seus desconfortos e riscos as garantias de
confidencialidade e de esclarecimentos permanentes Concordo voluntariamente em participar
deste estudo e poderei retirar o meu consentimento a qualquer momento antes ou durante o
mesmo sem penalidades ou prejuiacutezo ou perda de qualquer benefiacutecio que eu possa ter
adquirido ou no meu atendimento neste Serviccedilo
_____________________________________________________________________________________
Assinatura do pacienterepresentante legal Data
____________________________________________________________________________
Assinatura da testemunha Data
para casos de pacientes menores de 18 anos analfabetos semi-analfabetos ou portadores de deficiecircncia auditiva ou visual
(Somente para o responsaacutevel do projeto)
Declaro que obtive de forma apropriada e voluntaacuteria o Consentimento Livre e Esclarecido deste
paciente ou representante legal para a participaccedilatildeo neste estudo
____________________________________________________________________________
Assinatura do pesquisador Data
Rubrica participante Rubrica pesquisador
DADOS DE IDENTIFICACcedilAtildeO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSAacuteVEL LEGAL
1NOME
DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nordm SEXO M F
DATA NASCIMENTO
ENDERECcedilO NordmAPTO
BAIRROCIDADE
ESTADOCEPTELEFONE()
2RESPONSAacuteVEL LEGAL
NATUREZA (grau de parentesco tutor curador etc)
DOCUMENTO DE IDENTIDADE SEXO M F
DATA DE NASCIMENTOENDERECcedilO
Nordm APTO
BAIRROCIDADE ESTADOCEPTELEFONE() ___________________________________________________________________________________________________________________________
DADOS SOBRE A PESQUISA
1 TIacuteTULO DO SUBPROJETO DE PESQUISA ldquoAnaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de expressatildeo gecircnica dos genoacutetipos
preditores de metabolizaccedilatildeo e das concentraccedilotildees de metaboacutelitos com a resposta ao tratamento antitabagismordquo
PESQUISADOR RESPONSAacuteVEL Dr Jaqueline Scholz
CARGOFUNCcedilAtildeO Meacutedico Assistente Meacutedico Pesquisador ndash InCor ndash HCFMUSP CRM SP nordm 60179
UNIDADE DO HCFMUSP Programa Ambulatorial de Tratamento Tabagismo InCor-HCFMUSP
PESQUISADOR EXECUTANTE Juliana da Rocha dos Santos CRF SP nordm 62776
CARGOFUNCcedilAtildeO POacuteS-GRADUANDAndash InCor ndash HCFMUSP
UNIDADE DO HC-FMUSP Laboratoacuterio de Geneacutetica e Cardiologia Molecular InCor-HCFMUSP
3 AVALIACcedilAtildeO DO RISCO DA PESQUISA
RISCO MIacuteNIMO RISCO MEacuteDIO
RISCO BAIXO x RISCO MAIOR
4 DURACcedilAtildeO DA PESQUISA 4 anos
ANEXO 1 ndash Aprovaccedilatildeo no Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa
ANEXO 2 - Teste de Fagerstroumlm para a dependecircncia agrave nicotina (versatildeo em Portuguecircs)
Fonte Pietrobon RC Barbisan JN Manfroi WC Utilizaccedilatildeo do teste de dependecircncia agrave nicotina de
Fagerstroumlm como um instrumento de medida do grau de dependecircncia Versatildeo em Portuguecircs Rev HCPA
200727(3)31-6
ANEXO 3 - Escore de consumo situacional Issa
Fonte Issa J S Um novo escore para dependecircncia a nicotina e uma nova escala de conforto do paciente durante
o tratamento do tabagismo J Bras Pneumol 38(6) 761-5
ANEXO 4 ndash Desenho de estudo do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticos na escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismordquo
Desenho do estudo Seraacute randomizado em dois braccedilos um nuacutemero amostral total de 300 pacientes No braccedilo da esquerda 150 pacientes seratildeo tratados com base em teste geneacutetico para os
polimorfismos CYP2B6 (rs2279343) e CHRNA4 (rs1044396) No braccedilo da direita 150 pacientes faratildeo o tratamento tradicional com vareniclina (o faacutermaco de maior efetividade no tratamento
antitabagismo) Em um estudo anterior nosso grupo de pesquisadores 5152 mostrou maior sucesso terapecircutico nos pacientes portadores dos genoacutetipos AA para o gene CYP2B6 nos pacientes
tratados com bupropiona e nos portadores dos genoacutetipos CT e TT para o gene CHRNA4 nos pacientes tratados com vareniclina A escolha do tratamento no braccedilo farmacogeneacutetico prioriza o
tratamento mais barato (bupropiona) dessa forma primeiramente eacute analisado o genoacutetipo para o rs2279343 se o paciente apresentar o genoacutetipo AA o mesmo eacute tratado com bupropiona se ele tiver
o genoacutetipo AG ou GG eacute analisado o genoacutetipo para o polimorfismo rs1044396 Se o paciente apresentar o genoacutetipo CT ou TT para o rs1044396 ele eacute tratado com vareniclina se ele apresentar o
genoacutetipo CC (natildeo favoraacutevel a nenhum dos faacutermacos) ele eacute tratado com vareniclina e bupropiona em uso concomitante Seraacute comparado o custo-efetividade do tratamento baseado em
farmacogeneacutetica em relaccedilatildeo ao tratamento com vareniclina Os pacientes satildeo acompanhados por 12 semanas durante o tratamento farmacoloacutegico visita inicial (T-1) antes do iniacutecio da terapecircutica
(T0) 2 4 6 8 e 12 semanas apoacutes o tratamento (T2 T4 T6 T8 T12) Obs Os pacientes que natildeo conseguirem parar de fumar ateacute a 4 ordf semana de tratamento em monoterapia eacute adicionada a
segunda medicaccedilatildeo Fonte Eficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticos na escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismo InCor-HCFMUSP Projeto de doutorado da Dra Patriacutecia Viviane Gaya
sob a orientaccedilatildeo da Dr Jaqueline R Scholz desenvolvido a partir dos resultados dos estudos da nossa equipe de pesquisadores Rocha Santos et al 2015 67 e Tomaz et al 2015 68
ANEXO 5 ndash Pedido de depoacutesito de patente na Agecircncia de Inovaccedilatildeo e Empreendedorismo da
Universidade Federal de Alfenas-MG
Agradecimentos
Ao meu orientador Dr Paulo Caleb
Obrigada Paulo por ter apostado e confiado em mim eu natildeo tenho palavras
para agradecer diante de tudo que vocecirc me ensinou Hoje me sinto mais confiante e
parte dessa confianccedila devo a vocecirc Obrigada por me ajudar a amadurecer e por ter
sido tatildeo compreensiacutevel em momentos difiacuteceis Te considero mais que um mentor vocecirc eacute
tambeacutem um grande amigo
Ao meu amigo mestrando Paulo Roberto
Muito obrigada por tudo Fico feliz que Deus meu deu a graccedila de ter vocecirc como
amigo A sua participaccedilatildeo foi essencial neste trabalho Obrigada por me ouvir e me
ajudar acredito que ainda faremos muitas coisas juntos
Aos Doutores Alexandre Pereira Jaqueline Issa Patriacutecia Gaya Tacircnia Ogawa
Abe e Regina
Obrigada pelas dicas instruccedilotildees correccedilotildees e pelo conhecimento
proporcionado Jaque Paty Tania e Regina esse estudo natildeo teria existido sem o
excelente trabalho que vocecircs executam no ambulatoacuterio do tabagismo Vocecircs foram
fundamentais
Aos meus amigos do laboratoacuterio de Geneacutetica e cardiologia molecular Leiliane
Emanuelle Mariana Faacutebinho Faacutebio Bruna Gabriela Venturini Pamela Tamiris
Kalliandra Michelle Sabrina Liacutegia Gabriele Darezzo Theacuteo Mauriacutecio Isabela Almir
Fernanda Karina Mariliza Renata Carmona Ana Piesco Ednalva e Andreacuteia e
Maacutercio
Agradeccedilo a instruccedilatildeo e auxiacutelio na parte teacutecnica desse trabalho e muito obrigada
pela amizade companhia conselhos brincadeiras e almoccedilos juntos
Aos doutores Eduardo Costa de Figueiredo Henrique Dipe Faria e Isarita
Martins do LATF (Unifal MG)
Obrigada pela colaboraccedilatildeo neste trabalho Obrigada por esse produto maravilhoso
desenvolvido no laboratoacuterio de vocecircs (o novo RAM) Tenho a certeza que seraacute de
grande aplicabilidade Obrigada pela mensuraccedilatildeo das amostras Henrique muito
obrigada pela paciecircncia em explicar o trabalho que vocecircs realizaram Muito obrigada
pelo tempo disponibilizado e pelos dados fornecidos
Ao Prof Dr Joseacute Eduardo Krieger e ao LGCM (FMUSP)
Obrigada por disponibilizar a infraestutura do laboratoacuterio equipamentos
materiais e reagentes para execuccedilatildeo deste trabalho
Aos membros titulares e suplentes da banca examinadora
Muito obrigada pelo aceite do convite e por todas as sugestotildees e contribuiccedilotildees
Agrave FAPESP agrave CAPES e agrave CNPQ
Agradeccedilo o apoio financeiro para a execuccedilatildeo desse trabalho
A Deus
Pai muito obrigada pelo Senhor ter me dado essa oportunidade maravilhosa O
Senhor sempre me preparou o melhor e creio que continuaraacute preparando Obrigada
por me dar forccedilas em todos os momentos Te amo
Agrave minha famiacutelia
Obrigada por toda compreensatildeo Obrigada pelo apoio e por terem acreditado
na minha capacidade Vocecircs satildeo uma becircnccedilatildeo e essenciais na minha vida Amo vocecircs
Ao meu marido Sidnei
Lindo te amo muito Obrigada por ter me incentivado Obrigada pelos chaacutes
chocolates e comindinhas que vocecirc sempre ia me trazendo enquanto eu estava
escrevendo este trabalho Obrigada por ter me ajudado nas tarefas domeacutesticas tambeacutem
para que eu pudesse ter tempo para me dedicar Obrigada por todo amor carinho e
cumplicidade Vocecirc eacute um marido excelente
ldquoPorque os meus pensamentos natildeo satildeo os vossos pensamentos nem os vossos
caminhos os meus caminhos diz o Senhor Porque assim como os ceacuteus satildeo mais
altos do que a terra assim satildeo os meus caminhos mais altos do que os vossos
caminhos e os meus pensamentos mais altos do que os vossos pensamentos rdquo
Isaiacuteas 5589
Esta tese estaacute de acordo com as seguintes normas em vigor no momento desta
publicaccedilatildeo
Referecircncias adaptado de International Committee of Medical Journals Editors
(Vancouver)
Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Medicina Divisatildeo de Biblioteca e
Documentaccedilatildeo Guia de apresentaccedilatildeo de dissertaccedilotildees teses e monografias Elaborado
por Anneliese Carneiro da Cunha Maria Julia de A L Freddi Maria F Crestana
Marinalva de Souza Aragatildeo Suely Campos Cardoso Valeacuteria Vilhena 3a ed Satildeo Paulo
Divisatildeo de Biblioteca e Documentaccedilatildeo 2011 Abreviaturas dos tiacutetulos dos perioacutedicos
de acordo com List of Journals Indexed in Index Medicus
SUMAacuteRIO
LISTA DE ABREVIATURAS SIacuteMBOLOS E SIGLAS
LISTA DE EQUACcedilOtildeES
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE QUADROS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
11 Nicotina farmacodinacircmica e farmacocineacutetica 3
12 Faacutermacos antitabagismo 5
121 Vareniclina 6
1211 Farmacodinacircmica 6
1212 Farmacocineacutetica 7
122 Bupropiona 9
1221 Farmacodinacircmica 9
1222 Farmacocineacutetica 10
13 Pesquisa de biomarcadores 11
131 Estudos farmacogeneacuteticos e de expressatildeo gecircnica para vareniclina e bupropiona 12
132 Mensuraccedilatildeo de nicotina bupropiona vareniclina e seus metaboacutelitos em amostras
bioloacutegicas 15
2 JUSTIFICATIVA 17
3 OBJETIVOS 19
4 METODOLOGIA 20
41 Casuiacutestica 20
42 Fluxo de procedimentos adotados no atendimento aos pacientes 23
43 Coleta e armazenamento das amostras dos pacientes tratados com vareniclina e
bupropiona 26
44 Nuacutemero amostral 27
45 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica para amostras de pacientes tratados com vareniclina 28
451 Concentraccedilatildeo purificaccedilatildeo e extraccedilatildeo de RNA 28
452 Siacutentese de cDNA 31
453 Ensaio de controle de qualidade das amostras para o ensaio de expressatildeo gecircnica 31
454 Ensaio de expressatildeo gecircnica 35
455 Anaacutelise dos dados de expressatildeo gecircnica 37
46 Mensuraccedilatildeo de bupropiona vareniclina e de seus metaboacutelitos por HPLC-MSMS 38
461 Materiais equipamentos e condiccedilotildees adotadas para a mensuraccedilatildeo dos analitos apoacutes
validaccedilatildeo do meacutetodo 38
462 Visatildeo geral do desenvolvimento da coluna e padronizaccedilatildeo da anaacutelise 41
463 Desenvolvimento da coluna RAM para a purificaccedilatildeo da amostra 43
464 Caracterizaccedilatildeo do novo RAM 46
4641 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA 46
4642 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas no soro 46
4643 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA em diferentes pHs 47
465 Paracircmetros espectromeacutetricos 47
466 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatograacutefico multidimensional 48
467 validaccedilatildeo analiacutetica 49
47 Anaacutelise estatiacutestica 49
5 RESULTADOS 51
51 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica 51
511 Dados cliacutenicos e demograacuteficos 51
512 Dados de expressatildeo gecircnica 53
513 Anaacutelise de associaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica entre os desfechos e os tempos de
tratamento 54
52 Mensuraccedilatildeo dos analitos 58
521 Caracterizaccedilatildeo da coluna teste exclusatildeo de proteiacutenas e interferentes da matriz 58
522 Otimizaccedilatildeo dos paracircmetros espectromeacutetricos 60
523 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatrograacutefico multidimensional 61
524 Validaccedilatildeo analiacutetica 64
525 Dados cliacutenicos e demograacuteficos dos pacientes submetidos a mensuraccedilatildeo dos analitos
69
526 Anaacutelise de associaccedilatildeo dos analitos com desfecho de tratamento 72
6 DISCUSSAtildeO 75
61 Para os dados da anaacutelise de expressatildeo gecircnica 75
62 Para os dados da mensuraccedilatildeo dos analitos 80
7 CONCLUSOtildeES 87
8 SUGESTOtildeES PARA ESTUDOS FUTUROS 88
9 REFEREcircNCIAS 89
APEcircNDICE ndash TCLE
ANEXO 1 ndash Aprovaccedilatildeo no Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa
ANEXO 2 ndash Teste de Fagerstroumlm para a dependecircncia agrave nicotina (versatildeo em Portuguecircs)
ANEXO 3 - Escore de consumo situacional Issa
ANEXO 4 - Desenho de estudo do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticos na
escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismordquo
ANEXO 5 -Pedido de depoacutesito de patente na Agecircncia de Inovaccedilatildeo e Empreendedorismo
da Universidade Federal de Alfenas-MG
LISTA DE ABREVIATURAS SIacuteMBOLOS E SIGLAS
API Ionizaccedilatildeo em pressatildeo atmosfeacuterica - Atmospheric pressure ionization
ACTB Gene que codifica a proteiacutena β actina
ANKK1 Gene codificador da proteiacutena quinase envolvida em vias de transduccedilatildeo de sinal
B2M Gene que codifica a microbulina subunidade β2
BC3 Tampatildeo de reaccedilao de transcriptase reversa
BR1 Tampatildeo de ressuspensatildeo
BR2 Tampatildeo de ligaccedilatildeo
BR3 Tampatildeo de lavagem 1
BR4 Tampatildeo de lavagem 2
BR5 Tampatildeo de eluiccedilatildeo
BRT Tubos PAXgene
BSA Albumina de soro bovino
[C14] Carbono 14 (isoacutetopo radioativo do carbono de massa atocircmica 14)
cDNA DNA complementar sintetizado a partir de uma moleacutecula de RNA
CHRNA3 Gene codificador do receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α3
CHRNA4 Gene codificador da subunidade α4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNA5 Gene codificador da subunidade α5 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNA6 Gene codificador da subunidade α6 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNA7 Gene codificador da subunidade α7 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNB2 Gene codificador da subunidade β2 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNB3 Gene codificador da subunidade β3 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNB4 Gene codificador da subunidade β4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNG Gene codificador do receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade δ
CNTs Nanotubos de carbono - Carbon nanotubes
COMT Gene codificador da enzima catecol-O-metiltransferase (metaboliza dopamina)
CS ndash SPE Extraccedilatildeo em fase soacutelida no modo column switching
CT Ciclo de linha de base ndash threshold cicle (nuacutemero de ciclo em que a amostra
amplificou)
CYP2B6 Gene codificador do receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade γ
CYP2B6 Gene codificador da isoenzima CYP2B6
Disco QC Disco para a realizaccedilatildeo do controle de qualidade de amostras que seratildeo utilizadas
para o ensaio de expressatildeo gecircnica
DN Dependecircncia agrave nicotina
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
DNAse Enzima que degrada moleacuteculas de DNA
dNTP Dinucleotiacutedeos dATP dCTP dGTP e dTTP
DRD1 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 1
DRD2 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 2
DRD3 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 3
DRD4 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 4
E Erro relativo
EDTA Aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico
Escore Issa Escore de consumo situacional Issa
ESI+ Ionizaccedilatildeo positiva por electrospray - positive Electrospray ionization
FDA Orgatildeo de controle de alimentos e medicamentos americano ndash Food and drug
administration
FTND Teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fargestroumlm test for nicotine
dependence
g Velocidade de rotaccedilatildeo em forccedila g a qual considera a aceleraccedilatildeo da gravidade
GDC Controle de contaminaccedilatildeo de DNA genocircmico do disco QC
GE Tampatildeo de degradaccedilatildeo de DNA genocircmico
HGDC Controle de contaminaccedilatildeo de DNA genocircmico do ensaio de expressatildeo gecircnica
HPLC Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia ndash High Performance Liquid
Cromatograph
HPLC-MSMS Cromatografica liacutequida de alta eficiecircncia seguida por espectrometria de massas
em tandem ndash High Performance Liquid Cromatograph fowed by tandem Mass
Spectrometric
HPRT1 Gene que codifica a enzima hipoxantina fosforribosiltransferase 1
HTR3A Gene codificador da subunidade 3A do receptor de serotonina
HTR3B Gene codificador da subunidade 3B do receptor de serotonina
KV Energia de colisatildeo em quilovolt
LC-MS Cromatografia liacutequida seguida de espectrometria de massas - Liquid
Cromatograph fowed by Mass Spectrometric
LD Limite de detecccedilatildeo
LLE Extraccedilatildeo liacutequido-liacutequido (com o uso de solvente)
LQ Limite de quantificaccedilatildeo
LogP Coeficiente de particcedilatildeo relaccedilatildeo das concentraccedilotildees da substacircncia em um solvente
orgacircnico e em aacutegua dado que ambos os solventes satildeo necessariamente imisciacuteveis
MCT Microtubos de 15 mL
MS Espectrometria de massas - Mass Spectrometric
MRM Muacuteltiplas transiccedilotildees de monitoramento de reaccedilatildeo - multiple reaction monitoring
MSMS Espectrometria de massas em tandem
mz Relaccedilatildeo massacarga dos analitos
nAChR(s) Receptor(es) acetilcoliacutenico (s) nicotiacutenico (s)
NMR Taxa de metabolizaccedilatildeo da nicotina ndash Nicotine metabolite ratio
NTC Controle negativo
NTR Controle de natildeo transcriccedilatildeo reversa
OCT2 Transportador catiocircnico orgacircnico
P2 Controle externo de RNA
PAF Programa de Assistecircncia ao Fumante
PBMC Ceacutelulas mononucleares de sangue perifeacuterico - Peripheral blood mononuclear cell
PCR Amplificaccedilatildeo em cadeia da polimerase
PIs Padrotildees internos
PK Enzima proteinase K
pKa Valor negativo do logaritmo da constante de dissociaccedilatildeo de um aacutecido
pKb Valor negativo do logaritmo da constante de dissociaccedilatildeo de uma base
PP Extraccedilatildeo por preciptaccedilatildeo de proteiacutenas
PPC Controle positivo de PCR
PRC Coluna de rotaccedilatildeo de RNA vermelho
PSC Coluna de rotaccedilatildeo do homogeneizador lilaacutes
PT Tubo de processamento
RAM Material de acesso restrito ndash restrict access material
Rcf Forccedila centriacutefuga relativa ndash Relative centrifugal force
RDD Tampatildeo de digestatildeo de DNA
RE3 Mix de transcriptase reversa
RNA Aacutecido ribonucleico
RNase Enzima ribonuclease a qual degrada as moleacuteculas de RNA
RNFD Soluccedilatildeo matildee de DNase
RNFW Aacutegua livre de RNase
RFLP Restriccedilatildeo enzimaacutetica - Restriction fragment length polymorphism
RP‐HPLC Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia em fase reversa ndash Reverse-Phase High
Performance Liquid Cromatograph
Rpm Rotaccedilatildeo por minuto
RSD Desvio padratildeo relativo
SLC6A3 Gene codificador da proteiacutena transportadora de dopamina
SLC22A2 Gene codificador da proteiacutena OCT2 transportadora de caacutetions orgacircnicos
(transporta vareniclina)
SNC Sistema nervoso central
SPE Extraccedilatildeo em fase soacutelida
Sty I Enzima de restriccedilatildeo proveniente da Salmonella Typhi
TAE Tampatildeo formado com Tris Acetato e EDTA
TRN Terapia de reposiccedilatildeo nicotiacutenica
UGT2B7 Gene codificador da enzima UGT2B7 a qual metaboliza a vareniclina
UPLC Cromatografica liacutequida de ultra eficiecircncia - Ultra Performance Liquid
Cromatograph
UV Detector ultravioleta
α3 Subunidade alfa 3 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α4 Subunidade alfa 4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α5 Subunidade alfa 5 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α6 Subunidade alfa 6 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α7 Subunidade alfa 7 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
β2 Subunidade beta 2 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
β4 Subunidade beta 4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
T-1 Visita inicial
T0 Visita de iniacutecio do tratamento (coleta realizada antes de comeccedilar o tratamento no
mesmo dia)
T2 Visita de 2 semanas apoacutes tratamento farmacoloacutegico
T4 Visita de 4 semanas apoacutes tratamento farmacoloacutegico
T12 Visita de 12 semanas apoacutes tratamento farmacoloacutegico
TFC Cromatografia liacutequida turbulenta - Turbulent flow-liquid chromatography
LISTA DE EQUACcedilOtildeES
∆CT= (CTamostra ndash a meacutedia de CThousekeeping genes) Normalizaccedilatildeo da expressatildeo
gecircnica dos genes alvo atraveacutes de valores de expressatildeo de genes fisioloacutegicos
2-∆CT Transformaccedilatildeo dos valores de ∆CT em escala logariacutetmica para a realizaccedilatildeo
dos testes de hipoacutetese
∆∆CT= (mediana de ∆CTgrupo teste ndash mediana de ∆CT grupo referecircncia) Foacutermula
utilizada para posterior caacutelculo de fold change Considera-se os dois grupos
envolvidos no teste de hipoacutetese
2-∆∆CT Transformaccedilatildeo dos dados de ∆∆CT em escala logariacutetmica Atraveacutes dessa
foacutermula se obteacutem o fold change (diferenccedila de expressatildeo entre dois grupos)
NMR=(trans-3-hidroxicotininacotinina) Taxa de metabolizaccedilatildeo da nicotina
NMRlt031=metabolizador lento NMRgt031 metabolizador normal ou raacutepido
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Analitos precursores fragmentos e energias de colisatildeo
otimizados
40
Tabela 2 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina selecionados para os ensaios de expressatildeo gecircnica
52
Tabela 3 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina submetidos aos ensaios de expressatildeo gecircnica de acordo
com o desfecho de tratamento
52
Tabela 4 - Valores de mediana de ∆CT dos genes de acordo com os
tempos de tratamento e grupos de desfecho
53
Tabela 5 - Fold change e anaacutelise de associaccedilatildeo entre os tempos de
tratamento e grupos de desfecho
54
Tabela 6 - Paracircmetros de validaccedilatildeo obtidos na determinaccedilatildeo de faacutermacos
antitabagismo em soro humano
68
Tabela 7 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos
69
Tabela 8 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de
acordo com o desfecho de tratamento
70
Tabela 9 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos
71
Tabela 10 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes
tratados com bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos
analitos de acordo com o desfecho de tratamento
71
Tabela 11 ndash Frequecircncia do desfecho de tratamento nos pacientes
submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com os
medicamentos antitabagismo
72
Tabela 12 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos
pacientes tratados com vareniclina
73
Tabela 13 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de
tratamento com vareniclina
73
Tabela 14 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos
pacientes tratados com bupropiona
74
Tabela 15 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de
tratamento com bupropiona
74
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Aacutereas estimuladas atraveacutes de vias dopamineacutergicas e
serotonineacutergicas e sistema de recompensa
2
Figura 2 - Receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico 4
Figura 3 - Via primaacuteria do metabolismo da nicotina 5
Figura 4 - Mecanismo de accedilatildeo da vareniclina 7
Figura 5 - Metabolismo da vareniclina em humanos 8
Figura 6 - Mecanismo de accedilatildeo da bupropiona 9
Figura 7 - Metabolismo da bupropiona em seus principais metaboacutelitos ativo 11
Figura 8 - Desenho do estudo 22
Figura 9 - Representaccedilatildeo do Rotor-Disc100 33
Figura 10 - Mapa do disco QC (representaccedilatildeo planilhada) 33
Figura 11 - Exemplo de ajuste de Threshold 34
Figura 12 - Mapa do disco do ensaio RT2 profiler PCR array (representaccedilatildeo
planilhada)
37
Figura 13 - Representaccedilatildeo da composiccedilatildeo da coluna extratora (Novo RAM) 45
Figura 14 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNA7 entre os tempos de
tratamento e desfecho
56
Figura 15 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNG entre os tempos de
tratamento e desfecho
57
Figura 16 - Heat map de expressatildeo gecircnica 58
Figura 17 ndash Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com soluccedilatildeo de
BSA
59
Figura 18 - Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com amostra de
soro diluiacuteda
59
Figura 19 - Influecircncia do pH na exclusatildeo de proteiacutenas 60
Figura 20 - Ilustraccedilatildeo do sistema de columm switching na configuraccedilatildeo de
backflush
62
Figura 21 - Cromatograma obtido de amostras de soro branco diluiacutedas em
aacutegua ultra pura
65
Figura 22 - Cromatograma obtido apoacutes anaacutelise de soro diluiacutedo e dopado com
os analitos no niacutevel meacutedio de calibraccedilatildeo e mais os padrotildees internos deuterados
65
Figura 23 - Cromatograma obtido atraveacutes da anaacutelise das amostras de soro dos
pacientes tratados com bupropiona
67
Figura 24 - Cromatograma obtido atraveacutes da analise de amostras de soro de
pacientes tratados com vareniclina
67
LISTA DE QUADROS
Quadro 1- Procedimentos do protocolo em relaccedilatildeo aos pacientes 25
Quadro 2 - Paracircmetros de qualidade do ensaio QC 34
Quadro 3 - Genes escolhidos para o ensaio de expressatildeo 36
Quadro 4 - Housekeeping genes 36
Quadro 5 - Propriedades fiacutesico-quiacutemicas dos analitos 42
Quadro 6 ndash Comparaccedilatildeo dos dados de validaccedilatildeo com outros estudos 85
RESUMO
Santos JR Anaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de expressatildeo gecircnica e das concentraccedilotildees
de metaboacutelitos com a resposta ao tratamento antitabagismo [tese] Satildeo Paulo
Faculdade de Medicina Universidade de Satildeo Paulo 2020
Introduccedilatildeo O tabagismo eacute considerado a maior causa de morbidade e mortalidade
evitaacutevel no mundo Estudos tecircm buscado a identificaccedilatildeo de preditores de resposta aos
tratamentos de cessaccedilatildeo tabaacutegica Os principais objetivos deste estudo foram analisar a
possiacutevel associaccedilatildeo da expressatildeo de genes alvo e das concentraccedilotildees de analitos
(faacutermacos antitabagismo nicotina e seus metaboacutelitos) com a resposta ao tratamento
Meacutetodos Foram incluiacutedos 105 pacientes fumantes que iniciariam o tratamento com
vareniclina (n=74) ou bupropiona (n=31) As anaacutelises de expressatildeo gecircnica foram
realizadas atraveacutes do ensaio customizado RTsup2 Profiler PCR Array com a inclusatildeo de 17
genes para a anaacutelise em ceacutelulas mononucleares de sangue perifeacuterico (PBMC) A
preparaccedilatildeo das amostras de soro para a mensuraccedilatildeo dos analitos foi realizada atraveacutes de
uma coluna extratora composta por nanotubos hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados
com a adiccedilatildeo de grupos hidrofiacutelicos (material de acesso restrito - RAM) desenvolvida
no LATF Unifal MG A mensuraccedilatildeo dos analitos foi realizada por cromatografia
liacutequida de alta eficiecircncia em modo column switching seguida de espectrometria de
massa em tandem (HPLC-MSMS) Os tempos para a coleta de amostras foram para as
anaacutelises de expressatildeo gecircnica (sangue total) antes de iniciar o tratamento (T0) duas e
quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento (T2 e T4 respectivamente) e para a
mensuraccedilatildeo dos analitos (soro) as amostras foram coletadas na T2 Resultados Para as
anaacutelises de expressatildeo gecircnica selecionamos 14 pacientes que obtiveram sucesso e 13
pacientes resistentes ao tratamento com vareniclina Foi considerado sucesso quando o
paciente alcanccedilava abstinecircncia ao tabaco ateacute a 4 ordf semana de tratamento e resistente
quando o paciente natildeo conseguia parar de fumar ateacute a 4ordf semana de tratamento Foi
observada diferenccedila significativa para a expressatildeo do gene CHRNA7 no grupo
resistente amostras dos tempos T2 e T4 apresentaram menor expressatildeo comparadas ao
tempo T0 (fold change 038 P=0007 fold change 067 P=0004 respectivamente)
Para a mensuraccedilatildeo dos analitos a coluna RAM desenvolvida mostrou alta capacidade
para a remoccedilatildeo de macromoleacuteculas e de anaacutelise conjunta dos diferentes analitos aleacutem
de poder ser reutilizada diversas vezes (cerca de 400 ciclos) Os pacientes do grupo
resistente tratados com ambos os faacutermacos apresentaram maior concentraccedilatildeo de
metaboacutelitos da nicotina na T2 No entanto natildeo houve associaccedilatildeo dos faacutermacos e seus
metaboacutelitos com desfecho de tratamento Conclusotildees Para as anaacutelises de expressatildeo
gecircnica este estudo exploratoacuterio mostrou um possiacutevel preditor de efetividade no
tratamento com vareniclina reafirmando a associaccedilatildeo da subunidade α7 para os
processos de dependecircncia agrave nicotina e tratamento antitabagismo Estes resultados
podem contribuir ao menos em parte para o desenvolvimento de uma terapia
individualizada Contudo estudos futuros satildeo necessaacuterios para o entendimento do papel
da subunidade α7 dos receptores acetilcoliacutenicos-nicotiacutenicos no tratamento com
vareniclina Para a mensuraccedilatildeo dos analitos o novo RAM sintetizado eacute um produto de
extremo valor cientiacutefico podendo apresentar diversas aplicaccedilotildees em anaacutelise de amostras
com matrizes complexas sem muita preparaccedilatildeo preacutevia Para a associaccedilatildeo das
concentraccedilotildees dos faacutermacos e seus metaboacutelitos com o desfecho de tratamento satildeo
necessaacuterios estudos com um maior nuacutemero amostral
Descritores Vareniclina Bupropiona Nicotina Abandono do haacutebito de fumar
Expressatildeo gecircnica Biomarcadores farmacoloacutegicos
ABSTRACT
Santos JR Association analysis of gene expression profiles and metabolite
concentrations with response for smoking cessation treatment [thesis] Satildeo Paulo
ldquoFaculdade de Medicina Universidade de Satildeo Paulordquo 2020
Introduction Smoking is considered the largest cause of preventable morbidity and
mortality in the worldwide Studies have sought to identify predictors of responses to
smoking cessation treatments The main objectives of this study were to analyze the
possible association of the expression of target genes and concentrations of analytes
(drugs for smoking cessation nicotine and their metabolites) with the response to
treatment Methods We included 105 smoker patients who would start treatment with
varenicline (n=74) or bupropion (n=31) Gene expression analysis was performed
through custom RTsup2 Profiler PCR array assay including 17 genes for analysis in
peripheral blood mononuclear cells (PBMC) Serum sample preparation for the
measurement of analytes was performed by an extraction column composed of hybrid
carbon and silica nanotubes modified with the addition of hydrophilic groups (restricted
access material - RAM) developed by LATF Unifal MG The measurement of analytes
was performed by high efficient liquid chromatography in column switching mode
followed by tandem mass spectrometry (HPLC-MSMS) Times for sample collection
were for gene expression analysis (total blood) before start of therapy (T0) two and
four weeks after start of treatment (T2 and T4 respectively) and for measurement of
analytes (serum) the samples were collected at T2 Results For gene expression
analysis we selected 14 patients who had success and 13 patients resistant to the
varenicline treatment Success was considered to be when a patient achieved tobacco
abstinence until the 4th week of treatment and resistant was when a patient had not
stopped smoking as of the 4th week of treatment We observed a significant difference
for CHRNA7 gene expression in the resistant group samples from T2 and T4 had lower
expression compared with T0 (fold change 038 P=0007 fold change 067 P=0004
respectively) For measurement of analytes the developed RAM column showed high
capacity to remove macromolecules and joint analyzes of different analytes besides
being able to be reuse manny times (about 400 cycles) Patients from resistant group of
the both drugs treatment had a higher concentration of nicotine metabolites in T2
However there was no association of drugs for smoking cessation and their metabolites
with outcome treatment Conclusions For gene expression analysis this exploratory
study showed a possible predictor of effectiveness in the treatment with varenicline
reaffirming the association of the α7 subunit for nicotine dependence and smoking
therapy processes These results may contribute at least in part to the development of
individualized therapy However further studies are needed to understand the role of the
α7 subunit of acetylcholinic-nicotinic receptors in varenicline treatment For the
measurement of analytes the new synthesized RAM is a product of extreme scientific
value being able of several applications in the analysis of samples with complex
matrices without much prior preparation For an association of drugs for smoking
cessation and their metabolites with outcome treatment studies with a larger sample
size are needed
Descriptors Varenicline Bupropion Nicotine Smoking cessation Gene expression
Biomarkers pharmacological
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
O tabagismo eacute considerado a maior causa de morbidade e mortalidade evitaacutevel
em todo o mundo 1 Doenccedilas cardiacuteacas cerebrovasculares cerca de um quinto de todos
os tipos de cacircnceres doenccedilas pulmonares como apneia e enfisema aleacutem de distuacuterbios
preacute-natais estatildeo associadas ao consumo do tabaco 2-5
Dados recentes da Vigitel mostraram que no conjunto das 27 capitais brasileiras
a frequecircncia de adultos fumantes foi de 93 com valores duas vezes maior no sexo
masculino (121) do que no feminino (69) As menores frequecircncias foram
encontradas na populaccedilatildeo de jovens adultos (antes dos 25 anos) e em pessoas de mais
de 65 anos As maiores frequecircncias foram encontradas entre homens em Porto Alegre
(173) Campo Grande e Satildeo Paulo (156) 6
A nicotina eacute o principal componente do tabaco causador de dependecircncia Esta
age nos receptores acetilcoliacutenicos-nicotiacutenicos (nAChRs) promovendo a liberaccedilatildeo de
diversos neurotransmissores e neuroreguladores tais como dopamina acetilcolina
epinefrina norepinefrina serotonina beta-endorfina vasopressina e GABA O principal
neurotransmissor estudado eacute a dopamina pois a nicotina promove aumento de seus
niacuteveis na regiatildeo mesocorticoliacutembica cerebral principalmente em um circuito conhecido
como ldquosistema de recompensardquo (aacuterea tegmental ventral nuacutecleo accumbens e coacutertex preacute-
frontal) gerando sensaccedilotildees de prazer e bem-estar 7-15
O processo de adiccedilatildeo agrave nicotina eacute complexo e nem todos os mecanismos estatildeo
elucidados Aleacutem da ativaccedilatildeo do sistema de recompensa haacute a formaccedilatildeo de memoacuterias
associativas do efeito hedocircnico com os ambientes e situaccedilotildees de disponibilidade e uso
do tabaco resultando em reforccedilo positivo apoacutes o fumante entrar em contato com fatores
relacionados ao seu consumo Este tipo de memoacuteria aprendida envolve a amigdala o
hipocampo o coacutertex preacute-frontal e o coacutertex parietal 15-17 Evidecircncias tambeacutem satildeo
2
consistentes com a hipoacutetese da ativaccedilatildeo do estriado dorsal o qual estaacute envolvido no
processamento de memoacuterias de formaccedilatildeo de haacutebito em processos motores o que
poderia automatizar o ato de fumar 15 18 (Figura 1)
O uso continuado do tabaco promove a desensibilizaccedilatildeo e adaptaccedilatildeo dos
nAChRs causando toleracircncia e diminuiccedilatildeo dos efeitos de recompensa naturais Como
resultado o indiviacuteduo experimenta fissura ansiedade humor deprimido e irritabilidade
na ausecircncia da nicotina Estes sintomas acabam promovendo um reforccedilo negativo para o
fumo e o nuacutemero de cigarros consumidos aumenta cada vez mais 14 15
Todos os fatores acima mencionados contribuem para o mecanismo de
dependecircncia agrave nicotina (DN) Os efeitos hedocircnicos estatildeo relacionados com o processo
de iniciaccedilatildeo do tabagismo enquanto os efeitos negativos da falta da nicotina estatildeo mais
associados agrave manutenccedilatildeo do fumo 15
Para os indiviacuteduos que desejam parar de fumar o tratamento farmacoloacutegico
antitabagismo eacute o que apresenta maior eficaacutecia na reduccedilatildeo da prevalecircncia de fumantes
19
Figura 1 - Aacutereas estimuladas atraveacutes de vias dopamineacutergicas e serotonineacutergicas e sistema de recompensa A
Principais vias ativadas na dependecircncia como a aacuterea tegmental ventral nuacutecleos accumbens e da rafe coacutertex-frontal
estriado susbstacircncia negra e hipocampo As setas em rosa indicam aacutereas estimuladas pelas vias serotonineacutergicas de
transmissatildeo e em azul pelas vias dopamineacutergicas gerando diversos comportamentos B Sistema de recompensa
(composto pela VTA nuacutecleo accumbeacutens e coacutertex preacute-frontal) A nicotina age nos nAChRs no SNC gerando uma
3
descarga de dopamina no sistema de recompensa Haacute uma adaptaccedilatildeo desses receptores com o fumo continuado
fazendo com que haja a necessidade de maior consumo de nicotina e o desenvolvimento da dependecircncia VTA= aacuterea
tegmental ventral SNC sistema nervoso central nAChR= receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico Fonte adaptado de
Habermann A Brain awareness week addiction and the brainrsquos reward system Sovereign Health Group 2016 e de
Koob amp Volkow 2009 14
11 Nicotina farmacodinacircmica e farmacocineacutetica
O fumo permite uma titulaccedilatildeo precisa da dose de nicotina por parte do fumante
Sua absorccedilatildeo eacute raacutepida chegando em cerca de 10 segundos em todo o sistema nervoso
central (SNC) onde se liga nos nAChRs 20 21 22
Os nAChRs satildeo receptores de canais iocircnicos compostos por cinco subunidades
que podem estar combinadas de diferentes formas (Figura 2) 20 Os subtipos desses
receptores mais abundantes no ceacuterebro humano satildeo os α4β2 α3β4 e α7 (homomeacuterico)
Os receptores compostos pelas subunidades α4β2 (o asterisco indica que outras
subunidades podem estar presentes) possuem um papel fundamental na DN O nocaute
da subunidade β2 em ratos resultou na eliminaccedilatildeo dos efeitos comportamentais da
nicotina 23 Quanto agrave subunidade α4 parece estar envolvida na sensibilidade agrave nicotina
o que pode impactar nos efeitos de recompensa dessensibilizaccedilatildeo e toleracircncia24 25 Os
receptores compostos pelas subunidades α3β4 acredita-se mediar os efeitos
cardiovasculares 26 Os nAChRs α7 homomeacuterico estatildeo envolvidos na velocidade de
sinapses em processos de aprendizagem e controle sensorial 27 28 Os receptores
compostos pelas subunidades α4β2lowast podem conter outras subunidades como por
exemplo α5 α6 eou β3 as quais podem modificar a sensibilidade e funccedilatildeo do receptor
21 29
Como um agonista desses receptores a nicotina promove a sua abertura
permitindo a entrada de soacutedio e caacutelcio despolarizando assim a membrana dos
neurocircnios Aleacutem da entrada de caacutelcio atraveacutes dos nAChRs haacute tambeacutem a abertura de
4
canais de caacutelcio voltagem dependentes fazendo com que as vesiacuteculas que armazenam
os neurotransmissores sejam liberadas 20 21 O resultado da ativaccedilatildeo dos nAChRs em
neurocircnios poacutes-sinaacutepticos eacute a liberaccedilatildeo de diversos neurotransmissores ativando vaacuterias
aacutereas como jaacute mencionado
Figura 2 - Receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico O receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico funciona como um
canal iocircnico transmembracircnico Sua composiccedilatildeo eacute pentacircmera ou seja eacute formada por 5 subunidades que
podem se combinar de diferentes formas As subunidades satildeo classificadas de acordo com diferenccedilas nos
domiacutenios da sua estrutura proteiacuteca A acetilcolina e a nicotina satildeo agonistas desses receptores fazendo
com que os mesmos sejam abertos Assim ocorre a entrada de soacutedio despolarizando a membrana
gerando o potencial de accedilatildeo ACh= acetilcolina Nicot= Nicotina Na+= soacutedio K+= potaacutessio α =
subunidade alfa β= subunidade beta δ= subunidade delta γ= subunidade gama Fonte adaptado de Rang
amp Dale Farmacologia 5 ed Elsevier 2012
Haacute oscilaccedilatildeo dos picos de nicotina entre um cigarro e outro mas as quantidades
se acumulam entre 6 e 9 horas em um fumo regular saturando os nAChR causando
desensibilizaccedilatildeo adaptaccedilatildeo toleracircncia sintomas de abstinecircncia na falta do fumo e DN
30
A nicotina eacute rapidamente e extensivamente metabolizada pelo fiacutegado atraveacutes da
isoenzima CYP2A6 (e em menor grau pelas isoenzimas CYP2B6 e CYP2E1) agrave nicotina
-iacuteon iacuteminio e apoacutes pela enzima aldeiacutedo oxidase agrave cotinina O tempo de meia vida da
nicotina eacute de aproximadamente 2 horas e da cotinina 16 horas Posteriormente a
5
cotinina eacute metabolizada em trans-3-hidroxicotinina quase que exclusivamente pela
CYP2A6 (outros isocircmeros da hidroxicotina representam menos de 2 da dose) 31 32
(Figura 3) Esta eacute a maior via de metabolizaccedilatildeo da nicotina (70 - 80 do metabolismo
da nicotina em todo o corpo) 33 no entanto haacute vias menores como por exemplo a
glucoronidaccedilatildeo que pode ser a maior determinante no clearence da nicotina em
indiviacuteduos com menor atividade da CYP2A6 31
Figura 3 - Via primaacuteria do metabolismo da nicotina A nicotina eacute
metabolizada marjoritaramente pela isoenzima CYP2A6 em nicotina-
iacuteon imiacutenio e atraveacutes da enzima aldeiacutedo oxidase eacute convertida em
cotinina A cotinina eacute posteriomente metabolizada em trans-3-
hidroxicotinina novamente pela isoenzima CYP2A6 Fonte adaptado
de Llaquet et al 2010 34
12 Faacutermacos antitabagismo
Os medicamentos de primeira escolha aprovados pela Agecircncia Nacional de
Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) incluem tratamentos com base na terapia de reposiccedilatildeo
nicotiacutenica (TRN) como adesivo goma e pastilha e tambeacutem satildeo utilizados vareniclina e
bupropiona Estes uacuteltimos possuem maior eficaacutecia terapecircutica na cessaccedilatildeo tabaacutegica 35 36
6
121 Vareniclina
1211 Farmacodinacircmica
A vareniclina eacute o faacutermaco mais recentemente utilizado para a interrupccedilatildeo do
tabagismo este foi desenvolvido especificamente para atuar nos nAChRs A sua
farmacodinacircmica estaacute mais associada agrave atuaccedilatildeo como um agonista parcial nos nAChRs
compostos pelas subunidades α4β2 37 os quais satildeo importantes alvos de accedilatildeo da
nicotina pois satildeo necessaacuterios e suficientes para a recompensa toleracircncia e
sensibilizaccedilatildeo 25 38 39 (Figura 4)
Estudos mostraram que em relaccedilatildeo agrave nicotina a vareniclina possui 15 vezes
maior afinidade pelas subunidades α4β2 e ativa em torno de 50 a liberaccedilatildeo de
dopamina no sistema mesocorticoliacutembico 37 O faacutermaco atua tambeacutem em outros
nAChR como nos nAChRs (α3β4) age fracamente nos receptores contendo a
subunidade α6 e em nAChRs (α3β2) aleacutem de exercer atividade agonista total nos
receptores α7 40
Quanto agraves reaccedilotildees adversas no uso do faacutermaco a naacuteusea eacute a mais comum (cerca
de 10 a 45 dos indiviacuteduos tratados) a qual muitas vezes leva agrave natildeo aderecircncia ao
tratatamento 41-43
7
Figura 4 - Mecanismo de accedilatildeo da vareniclina A Na ausecircncia da vareniclina a nicotina se liga aos
nAChRs aumentando a ativaccedilatildeo nesses receptores Aleacutem disso haacute o estiacutemulo endoacutegeno (promovido
pela acetilcolina) B A vareniclina eacute um agonista parcial de nAChR (α4β2) ou seja tambeacutem estimula
os nAChRs mas em menor niacutevel do que a nicotina e ao mesmo tempo eacute antagonista na presenccedila de
nicotina fazendo com que ela natildeo consiga se ligar ao receptor Fonte do autor baseado nas
informaccedilotildees de Kassem et al 2012 37
1212 Farmacocineacutetica
A vareniclina eacute rapidamente absorvida pelo trato intestinal com absorccedilatildeo gt90
logo apoacutes a administraccedilatildeo oral As concentraccedilotildees plasmaacuteticas maacuteximas satildeo alcanccediladas
no periacuteodo entre 3 e 4 horas 44 e o estado de equiliacutebrio da sua concentraccedilatildeo ocorre
dentro de 4 dias 37 44-46 O faacutermaco possui baixa ligaccedilatildeo com proteiacutenas plasmaacuteticas
sendo que de acordo com ensaios in vitro a fraccedilatildeo de vareniclina (100 ngmL) livre foi
de 797 47 A sua biodisponibilidade natildeo eacute afetada pelo tempo de administraccedilatildeo ou
ingestatildeo de alimentos 37 45 46 Aleacutem disso a vareniclina possui ampla distribuiccedilatildeo nos
tecidos sendo que o volume meacutedio de distribuiccedilatildeo aparente eacute de 415 litros
apresentando um coeficiente de variaccedilatildeo (CV) de 50 48
Na circulaccedilatildeo humana a vareniclina se encontra em quantidade marjoritaacuteria satildeo
tambeacutem encontrados os metaboacutelitos conjugados vareniclina N-carbomoil glucoroniacutedeo
8
N-formilvareniclina e oxovareniclina O tempo de meia vida da vareniclina eacute em torno
de 24 horas independente da dose administrada
A eliminaccedilatildeo do faacutermaco e metaboacutelitos se daacute principalmente pela urina (99) 49
A eliminaccedilatildeo renal exibe cineacutetica linear e a sua excreccedilatildeo ocorre pela filtraccedilatildeo
glomerular na qual estaacute associada agrave secreccedilatildeo tubular realizada pelo transportador
catiocircnico orgacircnico OCT2 O clearence estimado da vareniclina eacute de 88 a 155 mLmin
apoacutes administraccedilatildeo de dose uacutenica e 92 a 143 mLmin apoacutes doses repetidas A
depuraccedilatildeo de vareniclina eacute reduzida na presenccedila de doenccedila renal Na urina cerca de
90 do produto eliminado eacute encontrado como vareniclina em sua forma inalterada e
menos de 10 eacute encontrado na forma de 2 metaboacutelitos a hidroxivareniclina e a
vareniclina-N-carbomoil glucoroniacutedeo 37 49-51
Nenhum dos metaboacutelitos da vareniclina eacute acreditado ser farmacologicamente
ativo Aleacutem disso esses metaboacutelitos estatildeo presentes em concentraccedilotildees muito baixas 37
46-49 A Figura 5 mostra os metaboacutelitos provenientes da vareniclina
A formaccedilatildeo dos metaboacutelitos da vareniclina natildeo eacute catalisada pelo complexo
enzimaacutetico CYP450 Ensaios realizados com microssoma hepaacutetico humano mostraram
que a formaccedilatildeo do conjugado vareniclina N-carbomilglucoroniacutedeo eacute provavelmente
catalisado pela enzima UGT2B7 37 49
Figura 5 ndash Metabolismo da vareniclina em humanos Fonte adaptado de Obach et al 2006 49
9
122 Bupropiona
1221 Farmacodinacircmica
A bupropiona eacute um antidepressivo no entanto tem sido utilizado como faacutermaco
antitabagismo devido o seu potencial em diminuir o desejo de fumar (o qual foi
percebido durante o tramento de iacutendiviacuteduos fumantes) Como mecanismo de accedilatildeo a
bupropiona atua como um inibidor relativamente se
letivo da recaptaccedilatildeo de norepinefrina e dopamina com pequeno efeito na
recaptaccedilatildeo de serotonina (Figura 6) aleacutem de ser um antagonista de nAChR natildeo
competitivo Essas propriedades minimizam os sintomas de retirada da nicotina
aumentando a probabilidade do indiviacuteduo se abster do fumo 52
Insocircnia e boca seca satildeo as reaccedilotildees adversas mais comumente relatadas ao uso da
bupropiona (30-40 e 10 dos pacientes respectivamente) 53
Figura 6 - Mecanismo de accedilatildeo da bupropiona A Na ausecircncia da bupropiona neurotransmissores
como a noradrenalina serotonina e a dopamina satildeo recaptados endogenamente pela bomba de
recaptaccedilatildeo B Na presenccedila da bupropiona a qual eacute inibidora da bomba de recaptaccedilatildeo desses
neurotransmissores haacute a estimulaccedilatildeo do sistema de recompensa mais especificamente atraveacutes do
aumento da concentraccedilatildeo de dopamina Dessa forma o sistema continua sendo estimulado mas em
menor grau que a nicotina e as chances de abstinecircncia ao tabaco satildeo aumentadas Fonte do autor
baseado nas informaccedilotildees de Slemmer et al 2000 52
10
1222 Farmacocineacutetica
Conforme ensaios em voluntaacuterios sadios os picos maacuteximos de concentraccedilatildeo
plasmaacutetica de bupropiona satildeo alcanccedilados aproximadamente 3 horas apoacutes a sua
administraccedilatildeo oral O volume de distribuiccedilatildeo aparente eacute de aproximadamente 2000L e
a ligaccedilatildeo com proteiacutenas plasmaacuteticas eacute de 84 para a bupropiona e de 77 para a
hidroxibupropiona (o seu principal metaboacutelito ativo) 54
A bupropiona eacute metabolizada primariamente em uma seacuterie de metaboacutelitos ativos
como a hidroxibupropiona a threohidrobupropiona e a eritrohidrobupropiona (Figura
7) A CYP2B6 eacute a principal enzima que converte a bupropiona em hidroxibupropiona
em humanos No entanto a formaccedilatildeo de threohidrobupropiona e a
eritrohidrobupropiona que ocorre atraveacutes de reaccedilatildeo redutiva natildeo eacute mediada pela
CYP2B6 55 56 A eritroidrobupropiona natildeo pode ser mensurada no plasma apoacutes a
administraccedilatildeo de uma uacutenica dose de bupropiona Os metaboacutelitos ativos satildeo
posteriormente metabolizados em inativos e estes satildeo excretados na urina 54
Inibidores da CYP2B6 como por exemplo a ticlodipina um agente
antiplaquetaacuterio derivado da tienopiridina interagem com a bupropiona diminuindo a sua
hidroxilaccedilatildeo 57 58
Apoacutes a administraccedilatildeo crocircnica de doses de 150 a 300 mgdia a bupropiona e seus
metaboacutelitos assumem cineacutetica linear A bupropiona possui meia vida de 20 horas
aproximadamente e apresenta clearence meacutedio aparente correspondente a cerca de
200Lh A eliminaccedilatildeo da bupropiona ocorre principalmente atraveacutes da urina (87) e das
fezes (10) e eacute excretada em apenas 05 de forma inalterada nos mostrando um
extenso metabolismo 54
11
Figura 7 - Metabolismo da bupropiona em seus principais metaboacutelitos ativos A bupropiona eacute
extensamente metabolizada em hidroxibupropiona pela isoenzima CYP2B6 Os demais metaboacutelitos ativos
aatildeo metabolizados por outras enzimas Fonte adaptado de Hesse et al 2000 55
13 Pesquisa de biomarcadores
A variabilidade interindividual em resposta a faacutermacos antitabagismo sugere que
os tratamentos podem ser mais efetivos em subgrupos de fumantes 59-64 No contexto de
medicina personalizada diversos pesquisadores tecircm buscado a identificaccedilatildeo de
preditores de resposta aos tratamentos de cessaccedilatildeo tabaacutegica os quais geralmente estatildeo
envolvidos em aspectos farmacocineacuteticos e farmacodinacircmicos ou via de atuaccedilatildeo do
faacutermaco como por exemplo os fatores geneacuteticos o perfil de expressatildeo gecircnica de
proteiacutenas e de metaboacutelitos 65-68
Aleacutem de refletir a efetividade do tratamento estes biomarcadores tambeacutem
poderiam indicar a toxicidade ou a ocorrecircncia de efeitos adversos A combinaccedilatildeo
desses fatores com outras variaacuteveis individuais pode ser utilizada para adequar as
estrateacutegias preventivas e terapecircuticas 65-68
12
131 Estudos farmacogeneacuteticos e de expressatildeo gecircnica para vareniclina e
bupropiona
Diversos polimorfismos geneacuteticos tecircm sido associados com resposta agrave
vareniclina e agrave bupropiona 41 65 67-71
King et al 65 mostraram a associaccedilatildeo de polimorfismos de nucleotiacutedeos uacutenicos
(SNPs - single nucletide polimorfisms) nos genes CHRNA4 CHRNA5 CHRNA7
CHRNB2 (codificadores das subunidades α4 α5 α7 e β2 dos nAChRs
respectivamente) com abstinecircncia contiacutenua em resposta agrave vareniclina O mesmo
trabalho tambeacutem encontrou associaccedilatildeo dos polimorfismos nos genes CHRNA3
CHRNA5 CHRNB4 CHRNG (codificam as subunidades α3 α5 β4 e γ dos nAChR
respectivamente) Aleacutem disso os autores demonstraram a associaccedilatildeo de polimorfismos
nos genes HTR3A e HTR3B (codificadores dos receptores serotonineacutergicos) com a
frequecircncia de recaiacuteda no tratamento antitabagismo
Swan et al 41 verificaram a associaccedilatildeo de polimorfismos no gene CHRNB2 com
naacuteusea severa em pacientes tratados com vareniclina
Nosso grupo de pesquisadores encontrou a associaccedilatildeo do polimorfismo
rs10443196 no gene CHRNA4 e do polimorfismo 785AgtG no gene CYP2B6
(codificador da principal isoenzima metabolizadora da bupropiona) com uma maior taxa
de sucesso no tratamento com vareniclina e bupropiona respectivamente 67 68
O gene CYP2B6 eacute um dos alvos mais importantes de estudos farmacogeneacuteticos
no tratamento com bupropiona Diversos polimorfismos neste gene satildeo preditores de
metabolizaccedilatildeo lenta ou raacutepida os quais foram associados com as diferenccedilas de
concentraccedilotildees do faacutermaco e de seu principal metaboacutelito ativo hidroxibupropiona em
amostras bioloacutegicas Essas concentraccedilotildees tambeacutem se associaram agrave variabilidade na
resposta ao tratamento com bupropiona 72-74
13
Polimorfismos podem implicar em diversos mecanismos moleculares como por
exemplo alteraccedilatildeo constituiccedilatildeo ou conformaccedilatildeo de proteiacutenas mudanccedilas poacutes-
traducionais e a regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica gerando variabilidade interindividual
nos niacuteveis de RNA transcrito o que poderiam explicar as diferenccedilas de resposta aos
faacutermacos antitabagismo 72
O polimorfismo CHRNA4 (rs2236196) assim como diversos polimorfismos
presentes no gene CYP2B6 os quais foram associados agrave resposta ao tratamento com
vareniclina e bupropiona respectivamente foram tambeacutem associados a maiores e
menores niacuteveis de expressatildeo gecircnica 72-75 Tambeacutem vale salientar que assim como a
expressatildeo gecircnica pode afetar a resposta ao tratamento a expressatildeo gecircnica tambeacutem pode
ser alterada em resposta aos faacutermacos 76 Neste sentido Smith et al 76 mostraram que a
vareniclina pode afetar a expressatildeo gecircnica da enzima DNA metiltransferase-1 (DNMT)
que mostrou estar envolvida em mecanismos epigeneacuteticos em neurocircnios corticais
GABaeacutergicos os quais estatildeo relacionados a processos cognitivos em indiviacuteduos
esquizofrecircnicos fumantes
O tratamento crocircnico com vareniclina modificou a expressatildeo dos nAChRs em
ceacuterebros de camundongos O upregulation dos nAChRs (α4β2) pelo uso crocircnico da
vareniclina foi similar ao promovido ao uso crocircnico da nicotina Similar dowregulation
foi visto para os nAChRs (α6β2) A vareniclina aumentou significantemente ambos
nAChRs (α3β4) e α7 enquanto a nicotina teve menor efeito nestes siacutetios 77
Em estudos com pacientes voluntaacuterios a obtenccedilatildeo de amostras do sistema
nervoso central eacute inviaacutevel Como alternativa a esse problema estudos tecircm proposto a
anaacutelise de expressatildeo gecircnica em sangue perifeacuterico 78-80 Embora natildeo seja o tecido alvo da
farmacodinacircmica dos medicamentos antitabagismo o sangue possui muitas
similaridades a niacutevel transcricional com muacuteltiplas regiotildees cerebrais 81
14
Hennings et al 82 mostraram diferenccedilas no perfil de expressatildeo gecircnica em ceacutelulas
mononucleares de sangue perifeacuterico (PBMCs) de pacientes respondedores e natildeo
respondedores a tratamentos com antidepressivos e muitos dos genes diferentemente
expressos satildeo codificadores de receptores tambeacutem presentes no SNC
Ota et al 83 mostraram que os genes GABRR2 (codificador de receptor
GABAeacutergico) e CHRNA3 (codificador da subunidade α3 de nAChR) foram
diferentemente expressos em sangue perifeacuterico em resposta ao tratamento com
risperidona em pacientes com esquizofrenia
Em outro estudo Kordi-Tamandani et al 84 mostraram que os niacuteveis de
expressatildeo gecircnica de SLC6A3 em leucoacutecitos diferiram entre indiviacuteduos dependentes de
opioacuteides e voluntaacuterios saacutedios Este gene eacute codificador de uma importante proteiacutena
recaptadora de dopamina em neurocircnios chamada DAT
Wongsriraksa et al 85 mostraram a expressatildeo das subunidades α4 α5 α7 β1 e
β2 em um estudo de caracterizaccedilatildeo de nAChRs em amostras de PBMC de humanos
atraveacutes de nicotina radioligante sugerindo conter as subunidades α4β2 α4β2α5 eou α7
Por fim diversos estudos tecircm mostrado que os nAChRs satildeo importantes para processos
imunoloacutegicos 86-91
Estudos tecircm evidenciado a expressatildeo de receptores dopamineacutergicos em
leucoacutecitos humanos Embora a dopamina natildeo ultrapasse a barreira hematoencefaacutelica as
diferenccedilas nos niacuteveis de dopamina do sistema nervoso central poderiam alterar a
expressatildeo desses receptores em leucoacutecitos ainda durante a sua formaccedilatildeo via inervaccedilatildeo
da coluna espinal doenccedilas como Parkinson Alzheimer e adiccedilatildeo agraves substacircncias
psicoativas poderiam influenciar na expressatildeo desses receptores em sangue perifeacuterico 92
15
132 Mensuraccedilatildeo de nicotina bupropiona vareniclina e seus metaboacutelitos em
amostras bioloacutegicas
A nicotina possui um baixo tempo de meia-vida e a isoenzima CYP2A6 eacute
predominante responsaacutevel pelo metabolismo da nicotina em cotinina e trans-3-
hidroxicotinina (seus principais metaboacutelitos) 93 94 Estes e a nicotina satildeo marcadores de
exposiccedilatildeo ao tabaco e indicativo de fumo 95
A taxa de metabolizaccedilatildeo da nicotina (NMR) obtida pela relaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de trans-3-hidroxicotininacotinina tem sido associada com DN com
desfecho e com escolha farmacoloacutegica de tratamento antitabagismo 95 96 Os valores
contiacutenuos e categoacutericos de NMR (metabolizadores lentos vs normais e raacutepidos) se
mostraram estaacuteveis em fumantes independente da carga tabaacutegica 32 97 98
A bupropiona eacute um faacutermaco extensamente metabolizado e a principal isoenzima
envolvida em seu metabolismo eacute a CYP2B6 a qual medeia quase que exclusivamente o
processo de hidroxilaccedilatildeo desse faacutermaco formando o metaboacutelito hidroxibupropiona 55
Diversos estudos tecircm associado as concentraccedilotildees de bupropiona e de hidroxibupropiona
em amostras de soro plasma e urina com a resposta ao faacutermaco 73 74
Zhu et al 73 em um estudo cliacutenico duplo-cego e placebo controlado os
indiviacuteduos foram tratados com bupropiona ou placebo por 6 meses Na terceira semana
de tratamento foram colhidas amostras de plasma para mensuraccedilatildeo de bupropiona e seu
principal metaboacutelito ativo a hidroxibupropiona As concentraccedilotildees mais elevadas de
hidroxibupropiona resultaram em melhores resultados de cessaccedilatildeo do tabagismo
Laib et al 74 apresentaram que as concentraccedilotildees de hidroxibupropiona em soro
foram correlacionadas com as diferentes respostas agrave bupropiona em pacientes com
depressatildeo analisadas atraveacutes de uma escala de impressatildeo clinica global
16
Quanto agrave vareniclina este eacute um faacutermaco pouco metabolizado sendo que 5 a
10 da dose pode ser encontrada na forma metaboacutelitos (soro plasma e urina) 49 Os
metaboacutelitos de vareniclina jaacute identificados em humanos em estudos preacutevios satildeo
hidroxivareniclina vareniclina N-carbomoilglucoroniacutedeo oxovareniclina N-
glicosilvareniclina e N-formilvareniclina 47 49 99 Pouco se conhece sobre as enzimas
que metabolizam a vareniclina Obach et al 49 mostrou o envolvimento da enzima
UG2B7 com o processo de glucoronidaccedilatildeo do faacutermaco Ainda natildeo haacute estudos que
associam os metaboacutelitos de vareniclina com resultados de desfecho de tratamento
17
2 JUSTIFICATIVA
Considerando a elevada prevalecircncia do tabagismo e a dificuldade dos indiviacuteduos
fumantes em se abster do tabaco estudos que apontem uma terapecircutica farmacoloacutegica
mais efetiva podem contribuir enormemente para o processo de cessaccedilatildeo tabaacutegica
Neste cenaacuterio a anaacutelise da expressatildeo de genes de interesse e a mensuraccedilatildeo de analitos
podem ser ferramentas uacuteteis na identificaccedilatildeo de marcadores e de subgrupos de resposta
ao tratamento antitabagismo
Escolhemos a realizaccedilatildeo da mensuraccedilatildeo de analitos nas amostras de soro dos
pacientes tratados com ambos os faacutermacos antitabagismo (vareniclina e bupropiona) e
especialmente para os pacientes tratados com vareniclina foram realizadas anaacutelises de
expressatildeo gecircnica de ceacutelulas mononucleares provenientes de amostras de sangue
perifeacuterico (do inglecircs Peripheral Blood Mononuclear Cell - PBMC) O ensaio
customizado para as anaacutelises da expressatildeo de 17 genes foi um grande investimento
financeiro nesta pesquisa e portanto o priorizamos para analisar as amostras dos
pacientes tratados com vareniclina jaacute que eacute o faacutermaco mais novo eficaz e custoso no
tratamento antitabagismo
As anaacutelises de expressatildeo gecircnica em amostras de PBMC satildeo de grande valia pois
seria importante encontrar em amostras de tatildeo faacutecil obtenccedilatildeo como amostras de sangue
um marcador de resposta que poderia ter correlaccedilatildeo com a expressatildeo gecircnica do sistema
nervoso central
Identificar um possiacutevel marcador preditivo de sucesso na utilizaccedilatildeo de um
determinado faacutermaco no iniacutecio da sua administraccedilatildeo foi uma das investigaccedilotildees deste
protocolo Os resultados desse estudo exploratoacuterio podem ser uacuteteis no entendimento do
comportamento de expressatildeo dos genes escolhidos (mais comumente expressos no
18
SNC) em amostras de sangue e na elaboraccedilatildeo de pesquisas mais amplas para a
identificaccedilatildeo de biomarcadores de resposta ao tratamento antitabagismo
19
3 OBJETIVOS
31 Analisar a possiacutevel associaccedilatildeo da expressatildeo de genes de interesse em amostras de
sangue perifeacuterico com a resposta ao tratamento com vareniclina
32 Analisar a possiacutevel associaccedilatildeo das concentraccedilotildees de faacutermacos antibagismo nicotina
e seus metaboacutelitos com a resposta ao tratamento com vareniclina e bupropiona
20
4 METODOLOGIA
41 Casuiacutestica
Foi realizado um estudo de coorte prospectivo no qual foram incluiacutedos 105
pacientes homens e mulheres fumantes provenientes do Programa de Assistecircncia ao
Fumante (PAF) do Instituto do Coraccedilatildeo do Hospital das Cliacutenicas da Faculdade de
Medicina da Universidade de Satildeo Paulo (InCor) com idade ge 18 anos IMC ge 185 e lt
30 kgm2 e que iniciariam o tratamento com vareniclina (n=74 para a mensuraccedilatildeo dos
analitos destes n=27 para as anaacutelises de expressatildeo gecircnica) ou com bupropiona (n=31
para a mensuraccedilatildeo dos analitos) (Figura 8)
A inclusatildeo dos pacientes ocorreu atraveacutes do protocolo de pesquisa ldquoEficaacutecia do
uso de marcadores geneacuteticos na escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismordquo o
qual foi aprovado no processo de submissatildeo ao Comitecirc de Eacutetica Institucional (CAAE
60133816000000068) - SDC 434116007 (Anexo 4) O presente estudo foi aprovado
como subprojeto do anterior atraveacutes do parecer nordm 2118913 (Anexo 1) Os pacientes
foram informados do estudo e consentiram a sua participaccedilatildeo ao assinar o termo de
consentimento livre e esclarecido (Apecircndice)
Foram excluiacutedos do estudo os pacientes que possuiacutessem desordens hepaacutetica
renal e gastrointestinal que comprometessem o metabolismo e eliminaccedilatildeo dos faacutermacos
os pacientes que faziam uso de medicamentos indutores ou inibidores das enzimas do
citocromo P450 nas uacuteltimas 6 semanas os pacientes etilistas e usuaacuterios de droga os
pacientes com doenccedilas psiquiaacutetricas instaacuteveis as mulheres em risco de gravidez e os
pacientes com contra-indicaccedilatildeo ao tratamento com bupropiona ou vareniclina
mencionados acima
21
Os pacientes foram acompanhados pela equipe do PAF e o tratamento
farmacoloacutegico foi conduzido por 12 semanas Foram considerados os seguintes
desfechos no tratamento ldquosucessordquo se o paciente parasse de fumar ateacute a 4ordf semana de
tratamento (T4) e ldquoresistenterdquo se o paciente natildeo conseguisse parar de fumar ateacute a 4ordf
semana de tratamento
22
Bupropiona
n=31
Visita T-1 Visita T0
(iniacutecio da medicaccedilatildeo)
Visita T2 Visita T4
Desfecho
Vareniclina
n=74
RNA Basal Vareniclina
n= 27
RNA RNA
Mensuraccedilatildeo de analitos vs Desfecho (T2)
vareniclina nicotina cotinina e hidroxicotinina
Mensuraccedilatildeo de analitos vs Desfecho (T2)
bupropiona hidroxibupropiona nicotina cotinina e hidroxicotinina
Soro
Soro
Figura 8 - Desenho do estudo O nuacutemero amostral total do estudo foi de 105 pacientes Foram incluiacutedos 74 pacientes tratados com vareniclina e 31 pacientes tratados com bupropiona Esses foram
submetidos agrave coleta de amostras de sangue no periacuteodo de 2 semanas (T2) apoacutes o iniacutecio da terapecircutica Apoacutes foi realizada a mensuraccedilatildeo de analitos e a anaacutelise de associaccedilatildeo com os desfechos de
tratamento Aleacutem disso os pacientes tratados com vareniclina tambeacutem foram submetidos agrave coleta de amostras para a obtenccedilatildeo de RNA em trecircs distintos periacuteodos de tempo antes de iniciar a
terapecircutica (T0) 2 semanas (T2) e 4 semanas apoacutes iniciar a terapecircutica farmacocoloacutegica (T4) Amostras de 14 pacientes que obtiveram sucesso no tratamento e de 13 que obtiveram resistecircncia (n=27)
foram analisadas quanto agrave expressatildeo de 17 genes candidatos (52 amostras ao todo 9 resistentes do tempo T0 7 resistentes do T2 8 resistente do T4 9 sucessos do T0 8 sucessos do T2 e 11 sucessos
do T4 vide toacutepico 42 Nuacutemero amostral) Apoacutes foram realizadas as anaacutelises de associaccedilatildeo entre os niacuteveis dos transcritos e os desfechos e tempos de tratamento Os pacientes foram acompanhados por
12 semanas durante o tratamento farmacoloacutegico no entanto o desfecho foi definido na 4 ordf semana (T4) pois apoacutes esse periacuteodo o tratamento seria reavaliado e poderia haver mudanccedila na medicaccedilatildeo T-
1= visita inicial T0= antes do iniacutecio da terapecircutica T2= 2 semanas apoacutes o iacutenicio do tratamento T4= 4 semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento T12= 12 semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento Desfecho na
visita T4 = ldquosucessordquo se o paciente parasse de fumar ateacute a 4ordf semana de tratamento (T4) e ldquoresistenterdquo se o paciente natildeo conseguisse parar de fumar ateacute a 4ordf semana de tratamento Fonte do autor
Visita T12
Final do tratamento farmacoloacutegico
RNA vs Desfecho (T0 T2 e T4)
14 sucessos e 13 resistentes
CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2
CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3 DRD4
HTR3A HTR3B COMT e SLC6A3
23
42 Fluxo de procedimentos adotados no atendimento aos pacientes
O tratamento farmacoloacutegico antitabagismo possui a duraccedilatildeo de 3 meses (12
semanas) No estudo de ldquoEficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticosrdquo foram coletados
dados cliacutenicos em 7 visitas T-1 (visita inicial) T0 (visita de iniacutecio do tratamento) T2
T4 T6 T8 e T12 (2 4 6 8 e 12 semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico)
Neste projeto foram utilizados os tempos de visita dos pacientes nas consultas
para a realizaccedilatildeo da coleta de amostras Dessa forma foi facilitado o comparecimento
desses pacientes ao procedimento Os pacientes precisavam estar comprometidos em
administrar os medicamentos todos os dias no horaacuterio combinado e terem
disponibilidade de tempo para as coletas as quais natildeo necessariamente coincidiram
com o horaacuterio das consultas pois as coletas foram realizadas no mesmo horaacuterio de
tomada do medicamento para que as anaacutelises de todos os pacientes pudessem ser
comparaacuteveis
Na visita T-1 foi aplicado o TCLE do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores
geneacuteticosrdquo bem como o questionaacuterio para coletar informaccedilotildees cliacutenicas Aleacutem disso os
pacientes foram avaliados quanto agrave DN atraveacutes do teste de Fagerstroumlm para DN (FTND)
100 e do escore de consumo situacional Issa (escore Issa) 101 (Anexos 2 e 3
respectivamente) O escore Issa eacute utilizado pelo PAF para a reclassificaccedilatildeo como
moderados ou altamente dependentes os pacientes que obteacutem o escore de FTND abaixo
de 5 mas que no entanto possuem niacutevel de DN consideraacutevel em relaccedilatildeo aos efeitos
psicoativos da nicotina A reclassificaccedilatildeo ocorre quando os pacientes obtecircm escore Issa
ge3 Apoacutes os pacientes foram randomizados em dois braccedilos do estudo tratamento com
vareniclina ou tratamento baseado na farmacogeneacutetica Os pacientes realizaram coleta
de sangue com o objetivo de obtenccedilatildeo do DNA para o estudo ldquoEficaacutecia do uso de
marcadores geneacuteticosrdquo
24
Apoacutes a genotipagem das amostras e escolha da medicaccedilatildeo dos pacientes
(vareniclina ou conforme geneacutetica) foi realizada ligaccedilatildeo telefocircnica para o paciente
informando o medicamento que iria tomar Nesta mesma ligaccedilatildeo o paciente tambeacutem foi
convidado a participar do presente estudo e todas as informaccedilotildees quanto agrave necessidade
de tomar o medicamento antitabagismo sempre no mesmo horaacuterio quanto aos dias das
coletas bem como as informaccedilotildees de preparaccedilatildeo para os procedimentos foram
transmitidas aos pacientes
Para os pacientes que seriam tratados com vareniclina ainda foi importante levar
em consideraccedilatildeo o horaacuterio que o paciente costumava tomar cafeacute da manhatilde para entatildeo
decidir o horaacuterio de administraccedilatildeo do faacutermaco pois o mesmo precisava ser
administrado apoacutes refeiccedilatildeo generosa com o intuito de diminuir o risco de naacuteusea
As coletas foram padronizadas para serem realizadas agraves manhatildes no mesmo
horaacuterio que o paciente tomaria a primeira dose do dia do medicamento antitabaacutegico O
horaacuterio de coleta entre os pacientes foi fixado entre 7 e 10 horas da manhatilde para evitar
variaccedilatildeo circadiana interpacientes No entanto entre as coletas do mesmo paciente o
horaacuterio de coleta e de administraccedilatildeo do medicamento foi sempre o mesmo com
variaccedilatildeo natildeo superior agrave 1 hora (esta variaccedilatildeo foi registrada)
Os pacientes foram orientados a realizar jejum de 10 horas (sendo liberada a
ingestatildeo de aacutegua e outros medicamentos ateacute 1 hora antes da coleta) e trazer o
medicamento antitabaacutegico para tomar apoacutes o procedimento A dose diurna dos
medicamentos antitabagismo natildeo foi administrada antes da coleta para evitar efeitos
agudos nas anaacutelises O periacuteodo de jejum foi realizado para que a amostra tivesse menor
quantidade de interferentes possiacutevel e tambeacutem para natildeo promover efeitos agudos dos
alimentos na expressatildeo gecircnica Um dia antes de cada coleta foi realizada ligaccedilatildeo
telefocircnica ou envio de mensagem para os pacientes com o objetivo de lembraacute-los do
25
procedimento das orientaccedilotildees de preparo e confirmar o uso e o cumprimento do horaacuterio
de administraccedilatildeo do medicamento antitabagismo (essa confirmaccedilatildeo da adesatildeo foi
realizada para as coletas nas visitas T2 e T4 quando os pacientes jaacute haviam iniciado o
tratamento farmacoloacutegico)
Na visita T0 para os pacientes que iniciariam o tratamento com vareniclina foi
aplicado o TCLE do presente projeto e colheu-se uma amostra de sangue para a
obtenccedilatildeo do RNA ainda antes de iniciarem o tratamento Foram fornecidas aos
pacientes as orientaccedilotildees de como tomar o medicamento e informaccedilotildees para a proacutexima
coleta Os pacientes foram orientados agrave tomarem o medicamento neste mesmo dia ou no
dia seguinte
Na visita T2 foram coletadas amostras de soro dos pacientes tratados com
bupropiona e amostras de soro e RNA dos pacientes tratados com vareniclina
Na visita T4 foram coletadas amostras de RNA dos pacientes tratados com
vareniclina
No Quadro 1 abaixo estatildeo resumidos os procedimentos orientaccedilotildees e coletas de
amostras
Quadro 1 - Procedimentos do protocolo em relaccedilatildeo aos pacientes
T-1 Aplicaccedilatildeo do TCLE do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores
geneacuteticosrdquo
Aplicaccedilatildeo de questionaacuterios
Coleta de DNA
1 dia antes de T0 Ligaccedilatildeo para informar o medicamento que o paciente iria tomar
Convite para participar do presente estudo
Determinar com o paciente qual era o melhor horaacuterio para
26
administraccedilatildeo do medicamento antibagismo (neste mesmo horaacuterio
que foram realizadas todas as coletas)
Orientaccedilotildees para a coleta em T0
T0 Aplicaccedilatildeo do TCLE do presente estudo
Coleta de amostra de RNA (para os pacientes que seriam tratados
com vareniclina)
Orientaccedilotildees para iniciar o tratamento no mesmo dia ou dia
seguinte
1 dia antes de T2 Orientaccedilotildees para coleta em T2
Confirmaccedilatildeo se o paciente estava tomando o medicamento e no
horaacuterio combinado
T2 Aplicaccedilatildeo do TCLE do presente estudo para os pacientes tratados
com bupropiona
Coleta de soro para os pacientes tratados com bupropiona e coleta
de RNA e soro dos pacientes tratados com vareniclina
1 dia antes de T4 Orientaccedilotildees para coleta em T2
Confirmaccedilatildeo se o paciente estava tomando o medicamento e no
horaacuterio combinado
T4 Coleta de RNA dos pacientes tratados com vareniclina
43 Coleta e armazenamento das amostras dos pacientes tratados com vareniclina e
bupropiona
Os pacientes tratados com vareniclina foram submetidos agrave coleta de sangue para
a obtenccedilatildeo de RNA em 3 periacuteodos de tempo T0 (ainda antes de iniciar o tratamento T2
27
e T4 Para isto foram utilizados os tubos PAXgene Blood RNA Tubes BRT (Qiagen
USA) para a obtenccedilatildeo de RNA Apoacutes a coleta os tubos PAXgene foram encubados em
bancada por 2 horas agrave temperatura ambiente para garantir a lise completa das ceacutelulas
sanguiacuteneas e apoacutes os tubos foram armazenados a -20degC ateacute a extraccedilatildeo do RNA das
amostras
No periacuteodo T2 tambeacutem foram coletadas amostras para a obtenccedilatildeo do soro dos
pacientes tratados com vareniclina e bupropiona Neste periacuteodo as concentraccedilotildees dos
metaboacutelitos dos faacutermacos jaacute se encontravam em estado de equiliacutebrio Para isto foram
utilizados tubos sem aditivo (Vacuette Greiner Bio-one) Os tubos foram mantidos a
temperatura ambiente ateacute a formaccedilatildeo de coaacutegulo Apoacutes os tubos foram centrifugados a
4degC a 3000 rpm por 10 min para se obter amostras de soro As amostras foram entatildeo
aliquotadas em 4 criotubos de soro e armazenadas em freezer a -80ordmC ateacute o momento
das anaacutelises
44 Nuacutemero amostral
Quanto ao nuacutemero amostral para o ensaio de expressatildeo gecircnica dos 74 pacientes
tratados com vareniclina foram escolhidas amostras de 27 pacientes (14 do grupo
sucesso e 13 do grupo resistente) baseado em estudos anteriores 83 102 que seguiram
corretamente o jejum que realizaram a tomada do medicamento nos horaacuterios
combinados e compareceram em todos e tempos de coleta Sendo ao todo 81 amostras
devido aos de 3 tempos de tratamento (T0 T2 e T4)
No entanto algumas amostras natildeo apresentaram bons resultados para a anaacutelise
de expressatildeo gecircnica e realizamos o ensaio de expressatildeo para 60 amostras de diversos
tempos Oito amostras natildeo apresentaram resultados de amplificaccedilatildeo e finalizamos com
52 amostras ao todo (9 resistentes do tempo T0 7 resistentes do T2 8 resistentes do T4
28
9 sucessos do T0 8 sucessos do T2 e 11 sucessos do T4) provenientes de 14 pacientes
do grupo sucesso e 13 do grupo resistente Esse tamanho amostral para cada grupo de
anaacutelise eacute comparaacutevel agrave estudos anteriores 102
Quanto ao nuacutemero amostral para a mensuraccedilatildeo dos analitos houve a inclusatildeo de
74 pacientes tratados com vareniclina e 31 tratados com bupropiona Nuacutemero amostral
semelhante foi utilizado no estudo de Laib et al 74 Das 105 amostras 3 amostras dos
pacientes tratados com vareniclina e 1 de paciente tratado com bupropiona apresentaram
concentraccedilotildees abaixo do limite de quantificaccedilatildeo (LQ) e estas foram excluiacutedas das
anaacutelises de concentraccedilatildeo dos analitos ficando com nuacutemero amostral final de 71 para
vareniclina e 30 para bupropiona
45 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica para amostras de pacientes tratados com
vareniclina
451 Concentraccedilatildeo purificaccedilatildeo e extraccedilatildeo de RNA
O processo de purificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo do RNA foi realizado atraveacutes do
PAXgene Blood RNA Kit (Qiagen USA) Antes de iniciar o procedimento a
temperatura dos tubos PAXgene Blood tubes (BRT) (Qiagen USA) os quais estavam
armazenados em freezer -20degC foi estabilizada mantendo os tubos em temperatura
ambiente em torno de 4 horas ou over night
Para o processo de purificaccedilatildeo do RNA primeiramente realizou-se a
homogeneizaccedilatildeo do sangue total contido no tubo PAXgene Blood tubes (BRT) e a
centrifugaccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos por 10 min em 3000 rcf havendo a formaccedilatildeo de um
pellet e o sobrenadante foi desprezado Apoacutes foi realizada a lavagem do pellet
adicionando-se 4 mL de aacutegua livre de RNase (RNFW) mistura foi submetida ao voacutertex
ateacute a dissoluccedilatildeo visiacutevel do pellet e o conteuacutedo foi centrifugado por 10 minutos a 3000
29
rcf sendo descartado o sobrenadante O pellet foi ressuspendido com 350 μL de tampatildeo
de ressuspensatildeo (BR1) atraveacutes de voacutertex ateacute a sua dissoluccedilatildeo e transferido para o tubo
de microcentrifugaccedilatildeo (15 mL MCT) Foram adicionados no tubo MCT 300 μL de
tampatildeo de ligaccedilatildeo (BR2) e 40 μL de proteinase K (PK) a mistura foi submetida ao
voacutertex durante 5 segundos e incubada durante 10 minutos a 55degC com agitaccedilatildeo de 1400
rpm provocando dessa forma a digestatildeo de proteiacutenas
Apoacutes o processo de incubaccedilatildeo foram realizados diversos processos de remoccedilatildeo
de impurezas em colunas de rotaccedilatildeo O lisado foi transferido para a coluna de rotaccedilatildeo
do homogeneizador PAXgene (PSC lilaacutes) a qual foi colocada em um tubo de
processamento (PT) de 2 mL e centrifugado durante 3 minutos agrave velocidade de 16100
rcf dessa forma foi realizada a homogeneizaccedilatildeo do lisado de ceacutelulas e remoccedilatildeo dos
detritos celulares residuais Em seguida o sobrenadante da fraccedilatildeo residual foi
transferido para o tubo de microcentrifugaccedilatildeo (15 mL MCT) novo (sem interferir no
pellet) e foram adicionados 350 μL de etanol (96-100 grau de pureza PA) a mistura
foi submetida ao voacutertex e centrifugada por breves instantes (1-2 segundos 500-1000 x g)
para remover as gotas presentes no interior da tampa do tubo
Foram transferidos 700 μL de amostra para a coluna de rotaccedilatildeo de RNA
PAXgene (PRC vermelho) esta foi colocada e um tubo de processamento (PT) de 2
mL no qual foi centrifugado durante 1 minuto a 12000 rcf Apoacutes a coluna de rotaccedilatildeo
foi colocada em um tubo PT novo (o tubo PT utilizado anteriormente foi descartado) O
restante da amostra foi colocado na mesma coluna de rotaccedilatildeo PRC e o processo de
centrifugaccedilatildeo foi repetido por mais 2 vezes sempre transferindo a coluna para um tubo
de processamento novo Antes da uacuteltima centrifugaccedilatildeo foram adicionados 350 μL de
tampatildeo de lavagem 1 (BR3) na coluna PRC
30
Em seguida foram adicionados 10 μL de soluccedilatildeo-matildee de DNase I (RNFD) a 70
μL de tampatildeo de digestatildeo de DNA (RDD) em um tubo de microcentrifugaccedilatildeo de 15
mL (MCT) O conteuacutedo foi misturado suavemente e centrifugado durante breves
instantes para colher o liacutequido residual dos lados do tubo Apoacutes 80 μL dessa mistura
foram transferidos diretamente para a membrana da coluna PRC e esta foi incubada agrave
temperatura ambiente (20-30degC) durante 15 minutos
Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foram adicionados 350 μL de tampatildeo de lavagem
1 (BR3) para a membrana da coluna e esta foi centrifugada durante 1 min a 12000 rcf
Apoacutes a coluna PRC foi colocada em um tubo (PT) novo e foram adicionados 500 μL de
tampatildeo de lavagem 2 (BR4) na membrana da coluna A centrifugaccedilatildeo foi repetida o
tubo PT foi descartado e a coluna PRC foi colocada em um novo tubo PT A lavagem
com 500 uL de BR4 e a centrifugaccedilatildeo foi repetida novamente (poreacutem o tempo de
centrifugaccedilatildeo foi de 3 minutos) Apoacutes foi realizada uma centrifugaccedilatildeo adicional em um
tubo PT novo durante 1 minuto a 12000 rcf (sem adiccedilatildeo de tampatildeo)
A coluna de rotaccedilatildeo (PRC) foi colocada em tubo de 15 mL (MCT) Foram
adicionados diretamente na membrana da coluna 80 μL de tampatildeo de eluiccedilatildeo (BR5) a
qual foi encubada agrave temperatura ambiente por 5 minutos e centrifugada por 1 minuto a
12000 rcf para eluir o RNA
As amostras foram quantificadas atraveacutes de leitura em espectrofotocircmetro no
comprimento de onda 260 nm (utilizando como branco o tampatildeo BR5) e foram
armazenadas a -20ordmC ateacute o momento das anaacutelises Para avaliar a qualidade do RNA
gerado foi realizada uma eletroforese em gel de agarose para a verificaccedilatildeo da
integridade do RNA ribossomal
31
452 Siacutentese de cDNA
O processo de siacutentese de cDNA foi realizado atraveacutes do RT2 First Strand Kit
(Qiagen USA) Os reagentes do kit foram descongelados e centrifugados brevemente
(10-15 segundos)
Primeiramente foi preparada uma mix para a degradaccedilatildeo do DNA genocircmico
composta por 2microL de tampatildeo GE 800 ng de RNA e quantidade variaacutevel de aacutegua livre
de RNase ateacute o volume final de 10 μL ou 8 μL de RNA (para amostras com
concentraccedilotildees abaixo de 100 ngμL) sem a aacutegua livre de RNase A mistura foi incubada
a 42ordmC por 5 minutos Apoacutes a incubaccedilatildeo a mistura foi colocada imediatamente em gelo
durante pelo menos 1 min
Apoacutes foi preparada uma mix para a realizaccedilatildeo da transcriccedilatildeo reversa esta foi
composta por 4 microL tampatildeo 5x (BC3) 1 microL de controle P2 (controle externo de RNA) 2
microL de mix de transcriptase reversa (RE3) e 3 microL de aacutegua livre de Rnase Foram
adicionados 10 μL da mix preparada em cada tubo contendo a mix de eliminaccedilatildeo de
DNA genocircmico A mistura foi homogeneizada delicadamente com a pipeta e incubada a
42 degC durante exatamente 15 min em seguida a reaccedilatildeo foi interrompida por incubaccedilatildeo
a 95 degC durante 5 min Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foram adicionados a cada reaccedilatildeo
91 μL de aacutegua livre de RNase e a mistura foi homogeneizada atraveacutes de pipeta diversas
vezes O produto final foi armazenado a -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo em cadeia da
polimerase (PCR) em tempo real
453 Ensaio de controle de qualidade das amostras para o ensaio de expressatildeo
gecircnica
Todas as amostras de cDNA foram analisadas quanto sua qualidade pelo ensaio
de controle de qualidade (disco QC Qiagen) em disco de 100 poccedilos (representaccedilatildeo do
32
disco nas Figuras 9 e 10) atraveacutes do PCR em tempo real com equipamento Rotor Gene
6000 (Corbett) Cada disco QC tem a capacidade de analisar 12 amostras sendo
necessaacuterios 5 discos para analisar 60 amostras
O disco QC eacute composto por primers especiacuteficos para a amplificaccedilatildeo de 2
Housekeeping genes ndash ACTB e HPRT1 (genes constitutivos que satildeo necessaacuterios para a
manutenccedilatildeo baacutesica da funccedilatildeo celular e satildeo expressos em todas as ceacutelulas de um
organismo em condiccedilotildees normais e fisiopatoloacutegicas) e 6 controles 1 controle de
transcriccedilatildeo reversa (RTC) 1 controle positivo de PCR (PPC) 1 controle de
contaminaccedilatildeo com DNA genocircmico (GDC) 1 controle de natildeo transcriccedilatildeo reversa
(NTR) 1 PPC (sem amostra) e 1 controle negativo NTC (mapa na Figura 10)
Foram preparadas 12 mixes para cada uma das amostras de cDNA Sendo 92 μL
de aacutegua livre de RNase e 08 μL de cDNA essas quantidades foram multiplicadas por 6
para se ter sobra e distribuir em 5 poccedilos cada mix de amostra (poccedilos que continham
pares de primers para 2 housekeeping genes e 3 controles) Foram distribuiacutedos 10 μL de
mix e 10 μL de RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR Master Mix (Qiagen USA) em cada
poccedilo (linhas A a E) Essa master mix conteacutem corante fluorescente intercalante de DNA
Apoacutes foram preparadas 12 mixes uma para cada amostra matildee de RNA (diluiacutedo
1100) Foram utilizados 963 μL de aacutegua livre de RNase e 072 μL de RNA (1100)
essas quantidades foram multiplicadas por 3 para se ter sobra Foram pipetados 1037
μL de mix de RNA e 963 μL de RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR Master Mix em
cada poccedilo da linha F para a anaacutelise do controle de transcriccedilatildeo reversa NTR
Apoacutes foram preparadas mixes sem as amostras para os 2 uacuteltimos controles PPC
e NTC compostas por 10 μL de aacutegua e 10 μL de RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR
Master Mix (multiplicados por 24) para as linhas G e H
33
O disco foi submetido agrave seguinte programaccedilatildeo 1 ciclo de 10 minutos a 95degC
(temperatura de ativaccedilatildeo da Taq polimerase) e 40 ciclos de 15 segundos a 95degC e 30
segundos a 60degC (para a amplificaccedilatildeo e realizaccedilatildeo da captura dos dados de
fluorescecircncia) Atraveacutes do software real-time cycler (Qiagen USA) foi ajustada a linha
de base (Threshold) do graacutefico de amplificaccedilatildeo logariacutetimica do cDNA para dessa
forma remover ruiacutedos na anaacutelise e verificar em qual ciclo de PCR que cada amostra
amplificou (cicle threshold ndash CT) (Figura 11) Os valores de CT foram planilhados e
analisados conforme os paracircmetros de qualidade (Quadro 2)
Figura 9 - Representaccedilatildeo do Rotor-Disc 100 Refere-se a um disco de material plaacutestico contendo 100
poccedilos Este veio de faacutebrica personalizado com primers para os ensaios QC ou RT2 profiler PCR array As
amostras e mixes satildeo pipetadas em cada poccedilo O disco eacute posteriormente colocado em um anel metaacutelico
proacuteprio para o encaixe no equipamento Rotor-Gene Cada poccedilo eacute nomeado com uma letra e um nuacutemero
iniciando no A1 ateacute o H12 Os quatro uacuteltimos poccedilos natildeo satildeo nomeados e natildeo conteacutem ensaio (no entanto
preenchemos com mix para equilibrar o peso do disco) Fonte do autor
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB
B HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1
C RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC
D PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC
E GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC
F NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR
G PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC
H NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC
Figura 10 - Mapa do disco QC (representaccedilatildeo planilhada) Do A1 ao B12 housekeeping genes para 12
amostras C1 ao H12 controles Cada grupo de cor representa a colocaccedilatildeo de uma mix Do A1 ao E1 mix de
A1
C1
E1
G1
34
cDNA da amostra 1 do A2 ao E2 mix de cDNA da amostra 2 (assim por diante ateacute A12 e E12) Linha F controle
com RNA diluiacutedo (1100) Linhas G e H controles com aacutegua livre de RNase Fonte do autor
Figura 11 - Exemplo de ajuste de Threshold A linha de base (Threshold) eacute ajustada na fase linear do ciclo
de amplificaccedilatildeo Dessa forma eacute possiacutevel remover os ruiacutedos e se obter o ciclo em que cada amostra foi
amplificada na PCR (CT) Fonte do autor imagem do equipamento Rotor Genereg
Quadro 2 - Paracircmetros de qualidade do ensaio QC
Controles Teste Passa no teste Falha no teste
Controle de transcriccedilatildeo reversa CT RTC (linha B) ndash CTPPC (linha G) lt5 gt5
Controle positivo de PCR CT PPC (linha G)
CT PPC (linha D) - CT PPC (linha G)
14 plusmn 2
lt3
gt16
gt3
Controle de contaminaccedilatildeo de DNA genocircmico CT GDC (linha E) gt33 lt33
Controle de natildeo transcriccedilatildeo reversa CT NTR (linha F) ge 33 ou NA lt33
Controle negativo CT NTC (linha H) ge 33 ou NA lt33
10-02
10-04
10-06
10-08
10-10
10-12
10-14
10-16
10-18
10-20
10-22
10-24
10-26
10-28
5 10 15 20 25 30 35 40
Ciclos
Flu
ore
scecircn
cia
No
rmal
izad
a
Fase Linear
35
De 60 amostras analisadas 52 passaram no teste quanto aos criteacuterios de
qualidade e prosseguiram para a anaacutelise de expressatildeo gecircnica do painel de genes
escolhidos
454 Ensaio de expressatildeo gecircnica
O protocolo de expressatildeo foi realizado por PCR em tempo real atraveacutes do
equipamento Rotor Gene 6000 (Corbett) com ensaio customizado RTsup2 Profiler PCR
Array em disco com capacidade de 100 poccedilos (Rotor-Disc 100 Qiagen USA) Nos 100
poccedilos de cada disco estavam distribuiacutedos primers especiacuteficos para o ensaio de expressatildeo
de 17 genes (Figuras 9 e 12 e Quadro 3) (17 pares de primers para cada gene repetidos 4
vezes na placa pois foi possiacutevel a anaacutelise de 4 amostras de cDNA por disco) 4 pares de
primers para os Housekeeping genes B2M GAPDH HPRT1 e ACTB (Quadro 4) e 3
controles 1 controle de contaminaccedilatildeo com DNA genocircmico (HGDC) 1 controle de
transcriccedilatildeo reversa (RTC) e 1 controle positivo de PCR (PPC) Os 4 Housekeeping
genes e os 3 controles tambeacutem satildeo repetidos 4 vezes no disco (Figura 5) Para as
reaccedilotildees foi utilizada a RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR Master Mix (Qiagen USA)
Primeiramente foi preparada 4 mixes (uma para cada amostra de cDNA) para um
disco de 100 poccedilos composta por 275 μL de 2X RT2 SYBR Green ROX FAST
Mastermix 2262 microL de aacutegua livre de RNase e 488 microL de amostra de cDNA cada Em
cada um dos poccedilos do disco foram adicionados 20 μL da mix preparada (utilizando
mixes de diferentes amostras a cada 24 poccedilos) Apoacutes deste processo o disco foi selado
com o Rotor-Disc Heat Sealer (Qiagen USA) e colocado no equipamento Rotor-Gene
6000 (Corbett) O real-time foi programado para ciclagem de PCR nas seguintes
condiccedilotildees 1 ciclo a 95deg C com duraccedilatildeo de 10 minutos 40 ciclos a 95degC por 15
segundos e 60degC por 30 segundos
36
Quadro 3 - Genes escolhidos para o ensaio de expressatildeo
CHRNA3 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α3
CHRNA4 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α4
CHRNA5 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α5
CHRNA6 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α6
CHRNA7 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α7
CHRNB2 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade β2
CHRNB3 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade β3
CHRNB4 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade β4
CHRNG Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade γ
DRD1 Codifica o receptor de dopamina tipo 1
DRD2 Codifica o receptor de dopamina tipo 2
DRD3 Codifica o receptor de dopamina tipo 3
DRD4 Codifica o receptor de dopamina tipo 4
HTR3A Codifica o receptor 3A de serotonina
HTR3B Codifica o receptor 3B de serotonina
COMT Codifica a enzima catecol-O-metiltransferase (metaboliza dopamina)
SLC6A3 Codifica a proteiacutena DAT que promove a recaptaccedilatildeo de dopamina DAT
Quadro 4 - Housekeeping genes
B2M Codifica a microbulina subunidade β2
GAPDH Codifica a enzima gliceraldeiacutedo ndash 3 fosfato desidrogenase
HPRT1 Codifica a enzima hipoxantina fosforribosiltransferase 1
ACTB Codifica a β actina
37
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
B DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
C CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
D DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
E CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
F DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
G CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
H DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
Figura 12 - Mapa do disco do ensaio RT2 profiler PCR array (representaccedilatildeo planilhada) O disco conteacutem 100 poccedilos no
entanto apenas 96 poccedilos contecircm ensaios sendo que 4 poccedilos ficam vazios A1 ao B5 = genes escolhidos para anaacutelise de
expressatildeo Do B6 ao B9= Housekeeping genes Do B10 ao B12= controles C1 ao D12 E1 ao F12 e G1 ao H12= repeticcedilatildeo dos
ensaios permitindo a anaacutelise completa de 4 amostra Cada cor diferente (a cada 2 linhas) representam a anaacutelise de uma
amostra Fonte do autor
455 Anaacutelise dos dados de expressatildeo gecircnica
Para a anaacutelise de expressatildeo gecircnica foi utilizado o meacutetodo de 2-∆∆CT 103 Apoacutes o
teacutermino da corrida do ensaio de expressatildeo gecircnica atraveacutes do software real-time cycler
(Qiagen USA) foi ajustada a linha de base (threshold) no graacutefico de amplificaccedilatildeo em
escala logariacutetmica (Figura 11) Todos os discos (total de 13) foram analisados com o
mesmo valor de threshold (010869) para que os valores de CT de todas as amostras
fossem comparaacuteveis
Os dados de CT tambeacutem foram inseridos no programa SPSS para as anaacutelises
estatiacutesticas Os valores de CT foram normalizados atraveacutes da expressatildeo dos
housekeeping genes utilizando a seguinte foacutermula ∆CT= (CTamostra ndash a meacutedia de
CThousekeeping genes) Os valores de mediana de 2-∆CT (em escala logariacutetmica) de cada grupo
foram utilizados para os testes de hipoacutetese Apoacutes foram obtidos os valores de ∆∆CT
(mediana de ∆CTgrupo teste ndash mediana de ∆CT grupo referecircncia) e o fold change (aumento ou
diminuiccedilatildeo da expressatildeo dos genes em relaccedilatildeo ao grupo referecircncia) foi calculado
atraveacutes da foacutermula 2-∆∆CT
38
46 Mensuraccedilatildeo de bupropiona vareniclina e de seus metaboacutelitos por HPLC-
MSMS
461 Materiais equipamentos e condiccedilotildees adotadas para a mensuraccedilatildeo dos
analitos apoacutes validaccedilatildeo do meacutetodo
Padrotildees analiacuteticos e padrotildees internos (PIs) deuterados bupropiona
hidroxibupropiona vareniclina (Santa Cruzreg) vareniclina d4 (TRCreg) nicotina
(ChemCruzreg) cotinina (Sigma-Aldrichreg) hidroxicotinina (Torontoreg) e
hidroxibupropiona d6 nicotina d4 cotinina d3 hidroxicotinina d3 (Cerilliantreg)
Solventes orgacircnicos Metanol acetonitrila (JT Baker) e sais acetato de amocircnio
fosfato de soacutedio (Vetecreg) fosfato de soacutedio monobaacutesico (Proquimiosreg) fosfato
de amocircnio (Reagenreg) formiato de amocircnio (Sigma-Aldrichreg)
Equipamentos e acessoacuterios
o HPLC Shimadzureg (Kyoto Japatildeo) equipado com uma vaacutelvula comutadora
de 6 vias automaacutetica
o Auto-amostrador Shimadzureg (Kyoto Japatildeo)
o Vaacutelvula comutadora de 6 vias 11R-0016H (Valcoreg Houston TX USA)
o Espectrocircmetro de massas LCMS-8030 Shimadzureg (Kyoto Japatildeo)
o Analisador de massa triplo quadrupolo (Shimadzureg Kyoto Japatildeo)
o Coluna analiacutetica ACEreg C18 (100 mm x 21 mm x 3 microm comprimento
diacircmetro interno e tamanho de partiacutecula)
o Preacute-coluna ACEreg C18 (21mm x 3 microm diacircmetro tamanho de partiacutecula)
39
o Coluna de extraccedilatildeo coluna contendo aproximadamente 70 mg do novo
RAM
Software
o LabSolutionsreg para anaacutelise dos dados e programaccedilatildeo do meacutetodo no
HPLC-MSMS
Condiccedilotildees espectrometricas e cromatograacuteficas
o Temperatura da forno da coluna 40ordmC
o Temperatura da linha de dessolvataccedilatildeo 250ordmC
o Temperatura do bloco de aquecimento 400ordmC
o Fluxo do gaacutes de nebulizaccedilatildeo 20 ml min-1
o Fluxo de gaacutes para secagem 150 ml min-1
o Energias de colisatildeo precursores e fragmentos dos analitos (Tabela 1)
o Fase moacutevel de carregamento (liberada pela bomba A) Aacutegua ultra pura
em um fluxo de 04 mL min-1
o Fase moacutevel de eluiccedilatildeoseparaccedilatildeoionizaccedilatildeo (liberada pela bomba C)
metanol tampatildeo formiato de amocircnio 001 mol L-1 pH=42 (9010 vv)
em um fluxo de 04 mL min-1
o Fase moacutevel de limpeza (liberada pela bomba B) acetonitrila aacutegua ultra
pura isopropanol (751510 vvv) em um fluxo de 10 mL min -1
o Sistema de anaacutelise ULPC-MSMS no modo columns switching em
configuraccedilatildeo backflush modo de ionizaccedilatildeo positiva por electrospray
(ESI+)
40
Tempos
o Fase de carregamento e condionamento do sistema (vaacutelvula na posiccedilatildeo
1) 0 - 30 min
o Fase de eluiccedilatildeo (vaacutelvula na posiccedilatildeo 2) 03 min
o Fase de limpeza separaccedilatildeo e anaacutelise por MS (vaacutelvula na posiccedilatildeo 1) 67
min
o Recondiocionamento do sistema (vaacutelvula na posiccedilatildeo 1) 50 min
o Tempo total incluindo todos os processos 15 min
o
Tabela 1 - Analitos precursores fragmentos e energias de colisatildeo otimizados
Analitos Precursor (mz) Fragmentos (mz) Energia de colisatildeo
(KV)
Vareniclina 212 169 -23
183 -24
141 -43
Bupropiona 240 131 -28
139 -26
103 -39
Hidroxibupropiona 256 139 -29
131 -29
167 -29
Nicotina 163 117 -28
130 -22
77 -44
Cotinina 177 80 -24
98 -21
70 -34
Hidroxicotinina 193 80 -30
134 -19
118 -21
Fragmentos quantificados
41
462 Visatildeo geral do desenvolvimento da coluna e padronizaccedilatildeo da anaacutelise
Todos os padrotildees para as anaacutelises dos analitos foram adquiridos e armazenados
conforme recomendaccedilatildeo do fabricante ateacute o momento da padronizaccedilatildeo das anaacutelises As
anaacutelises foram realizadas atraveacutes da colaboraccedilatildeo com o Prof Dr Eduardo Costa de
Figueiredo Dr Henrique Dipe Faria e Prof Dra Isarita Martins do Laboratoacuterio de
Anaacutelises de Toxicantes e Faacutermacos ndash LATF da Faculdade de Ciecircncias Farmacecircuticas da
Universidade Federal de Alfenas (Unifal MG) A escolha de cada analito foi
determinada atraveacutes de sua importacircncia cliacutenica e tambeacutem devido agrave disponibilidade dos
padrotildees dos analitos no mercado Os analitos mensurados para as amostras provenientes
dos pacientes tratados com os faacutermacos antitabagismo foram bupropiona
hidroxibupropiona vareniclina nicotina cotinina e hidroxicotinina (os trecircs uacuteltimos satildeo
proveninentes do fumo) Foi realizado um levantamento das propriedades fiacutesico-
quiacutemicas dos metaboacutelitos conforme Quadro 5
Para a remoccedilatildeo das macromoleacuteculas (como proteiacutenas) presentes na matriz de
soro foi desenvolvida uma coluna extratora de acesso restrito a partir de nanotubos
hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados com ligaccedilotildees hidrofiacutelicas (novo RAM) O
material foi desenvolvido e caracterizado antes mesmo da padronizaccedilatildeo das condiccedilotildees
de anaacutelise nos equipamentos
Foram obtidas as condiccedilotildees espectomeacutetricas (modo de ionizaccedilatildeo e as condiccedilotildees
de sua fonte temperatura do bloco de calor fluxo de gaacutes nebulizador e fluxo do gaacutes
secante) e cromatograacuteficas (tempo de retenccedilatildeo e separaccedilatildeo e aacutereas obtidas dos picos de
cada analito) Apoacutes as condiccedilotildees foram otimizadas em sistema de cromatografia liacutequida
de alta eficiecircncia multidimensional seguida por espectrometria de massa (HPLC-
MSMS) O sistema multimensional constituiacutedo por vaacutelvulas comutadoras permite a
anaacutelise online e automatizada com configuraccedilatildeo via software As vaacutelvulas permitem
42
diferentes posiccedilotildees promovendo a ocorrecircncia de eventos distintos no sistema como a
concentraccedilatildeo dos analitos e remoccedilatildeo de macromoleacuteculas atraveacutes da coluna extratora
(posiccedilatildeo 1) a eluiccedilatildeo dos analitos da coluna extratora para a coluna analiacutetica (posiccedilatildeo 2)
e novamente na posiccedilatildeo 1 ocorre a eluiccedilatildeo dos analitos da coluna analiacutetica para o
espectrocircmetro de massas a limpeza da coluna extratora e o recondionamento do
sistema
Quadro 5 - Propriedades fiacutesico-quiacutemicas dos analitos
Bupropiona
Peso molecular 27620 gmol
Ponto de fusatildeo 243-246deg C
Solubilidade em aacutegua 00693 mgmL
pKa (aacutecido forte) 1829
pKa (mais forte baacutesico) 822
Aacuterea da superfiacutecie polar 291 Aring2
Log P 36
Hidroxibupropiona
Peso molecular 25574 gmol
Ponto de fusatildeo 121-123degC
Solubilidade em aacutegua 02 mgmL
pKa (aacutecido forte) 1479
pKa (mais forte baacutesico) 765
Aacuterea da superfiacutecie polar 4933 Aring2
Log P 222
Vareniclina
Peso molecular 21127 gmol
Pressatildeo de vapor 25degC
Solubilidade em aacutegua 877 x 10-2 gL
pKa1 182 pKa2 = 973
Aacuterea da superfiacutecie polar 378 Aring2
Log P 103
43
Nicotina
Peso molecular 16223 gmol
Pressatildeo de vapor 618 degC
Solubilidade em aacutegua 100 mM
pKa 85 pKb1 616 a 15degC e pKb2 1096
Aacuterea da superfiacutecie polar 378 Aring2
Log P 117
Cotinina
Peso molecular 176215 gmol
Solubilidade em aacutegua 10 x10-6 mgL a 25degC
Aacuterea da superfiacutecie polar 332 Åsup2
Log P 007
Hidroxicotinina
Peso molecular 192214 gmol
Aacuterea da superfiacutecie polar 53 Å2
ACDLog P -148
Fonte Banco de dados Pubchem e ChemSpider Obs Algumas informaccedilotildees referentes agraves
propriedades fiacutesico-quiacutemicas dos analitos ainda natildeo estatildeo disponiacuteveis na literatura pKa= valor
negativo do logaritmo da constante de dissociaccedilatildeo de um aacutecido pKb= valor negativo do logaritmo
da constante de dissociaccedilatildeo de uma base LogP= coeficiente de particcedilatildeo
463 Desenvolvimento da coluna RAM para a purificaccedilatildeo da amostra
As amostras de soro e plasma satildeo matrizes ricas em moleacuteculas que interferem na
mensuraccedilatildeo dos analitos como lipiacutedios e principalmente proteiacutenas Estas podem
obstruir colunas analiacuteticas e diminuir a concentraccedilatildeo dos analitos jaacute que muitos destes
estatildeo ligados a essas proteiacutenas Devido a esse fato geralmente eacute realizada uma
preparaccedilatildeo das amostras antes de sua mensuraccedilatildeo Essa preparaccedilatildeo envolve processos
como a extraccedilatildeo com o uso de solventes precipitaccedilatildeo entre outros os quais geram
custo de materiais aumento do tempo de trabalho e de erros 104 105 51 106 Dessa forma
44
diversos estudos vecircm tentando desenvolver meacutetodos que natildeo exijam tanta manipulaccedilatildeo
das amostras Os materiais de acesso restrito (RAMs) estatildeo sendo utilizados para a
menor preparaccedilatildeo da amostra e sua injeccedilatildeo direta Dentre os RAMs estatildeo os nanotubos
de carbono (CNTs) modificados 107-109 Nesta colaboraccedilatildeo foi desenvolvida a coluna
extratora composta por nanotubos hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados com a
adiccedilatildeo de grupos hidrofiacutelicos Esse material entrou com pedido de patente na Agecircncia
de Inovaccedilatildeo e Empreendedorismo da Universidade Federal de Alfenas-MG atraveacutes do
Processo 230870001282019-84 e portanto a sua composiccedilatildeo e os resultados de
alguns testes da sua caracterizaccedilatildeo seratildeo mantidos em sigilo (vide declaraccedilatildeo Anexo
5)
Diferentes RAMs foram sintetizados a partir de CNTs para que fosse obtido o
melhor desempenho na remoccedilatildeo de macromoleacuteculas e retenccedilatildeo dos analitos da amostra
Os CNTs utilizados foram compostos por paredes muacuteltiplas pois apresentam uma
elevada aacuterea superficial e consequentemente uma maior capacidade de adsorccedilatildeo Os
CNTs foram adquiridos comercialmente e inicialmente foram funcionalizados a partir
de reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo aacutecida com aacutecido niacutetrico como desenvolvido por Barbosa et al 109
Os CNTs oxidados foram utilizados em etapas de siacutentese posteriores
adicionando grupos quiacutemicos hidrofiacutelicos que fossem capazes de realizar a exclusatildeo de
proteiacutenas e permitir a adsorccedilatildeo dos analitos As reaccedilotildees de siacutentese posteriores foram
semelhantes as promovidas para a realizaccedilatildeo de revestimento externo de poliacutemeros
poliacutemeros biomimeacuteticos nanomagneacuteticos com e sem acesso restrito 107 110-112 poreacutem
foram utilizadas estrateacutegias e proporccedilotildees de reagentes distintas na tentativa de obter o
RAM mais eficiente Aleacutem disso tambeacutem foi priorizada a siacutentese mais simples e
reprodutiacutevel bem como o material que apresentar maior vida uacutetil Os diferentes
materiais sintetizados foram testados em relaccedilatildeo agrave exclusatildeo de proteiacutenas e adsorccedilatildeo dos
45
analitos e tambeacutem foram realizados testes de caracterizaccedilatildeo para determinar suas
propriedades fiacutesico-quiacutemicas e confirmar a estrutura originada
A anaacutelise termogravimeacutetrica foi realizada com a finalidade de determinar a
variaccedilatildeo de massa (ganho ou perda) do RAM em funccedilatildeo de emprego de temperatura
programada proporcionando informaccedilotildees importantes a respeito da estabilidade do
material e de sua composiccedilatildeo Outras teacutecnicas tambeacutem foram utilizadas com o objetivo
de obter dados relacionados agrave estrutura e composiccedilatildeo do novo RAM como o
infravermelho e anaacutelise elementar Anaacutelises de microscopias eletrocircnicas de varredura e
de transmissatildeo tambeacutem foram realizadas para a determinaccedilatildeo da composiccedilatildeo da
superfiacutecie externa e arranjo estrutural do material com as modificaccedilotildees realizadas
Apoacutes o teacutermino do preparo do novo RAM eles foram colocados dentro de uma
coluna (aproximadamente 70 mg) conforme (Figura 13) A coluna foi posteriormente
empregada no preparo de amostras online no sistema cromatograacutefico
Figura 13 ndash Representaccedilatildeo da composiccedilatildeo da coluna extratora (Novo RAM) O novo RAM formado
a partir de nanotubos hiacutedridos de carbono e siacutelica dotado de muacuteltiplas camadas e modificados com grupos
hidrofiacutelicos promovem a retenccedilatildeo de analitos e exclusatildeo de macromoleacuteculas como proteiacutenas O RAM foi
posteriormente empacotado em coluna para a utilizaccedilatildeo em sistema cromatograacutefico Fonte adaptado do
colaborador Dr Henrique Dipe de Faria Unifal-MG
46
464 Caracterizaccedilatildeo do novo RAM
4641 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA
Na ausecircncia da coluna extratora foi preparada primeiramente uma soluccedilatildeo
aquosa de albumina de soro bovino (BSA) em uma concentraccedilatildeo de 44 mgmL-1
(semelhante agrave concentraccedilatildeo de proteiacutenas presentes no plasma humano) Foram injetados
10 microl desta soluccedilatildeo em triplicata diretamente em sistema cromatograacutefico com detector
UV ajustado a 255 nm utilizando como fase moacutevel o tampatildeo formiato de amocircnio 10
mM pH=42 em um fluxo de 04 mL min-1 O sinal detectado foi de 100 BSA
Posteriormente a coluna preenchida com 70 mg do novo RAM foi inserida no sistema
cromatograacutefico entre o injetor e o detector A soluccedilatildeo de BSA foi analisada em triplicata
novamente no entanto com a presenccedila da coluna extratora desenvolvida (novo RAM)
A aacuterea do sinal obtido nesta segunda anaacutelise dividida pela aacuterea do sinal de 100 BSA
obtida na primeira anaacutelise foi correspondente agrave porcentagem de BSA excluiacuteda pela
coluna
4642 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas no soro
Para analisar a exclusatildeo total de macromoleacuteculas (como lipiacutedios proteiacutenas e
sacariacutedeos) agora nas amostras de soro foi utilizado procedimento semelhante Na
ausecircncia da coluna extratora injetou-se no sistema cromatograacutefico em triplicata 100 μL
de amostra de soro humano branco foram testados pools de soro puros e diluiacutedos 14 A
aacutegua ultra pura foi utilizada como fase moacutevel em um fluxo de 04 mL min-1 e o sinal
obtido foi relacionado a 100 dos interferentes Apoacutes a coluna extratora (o novo
RAM) foi adionado ao sistema e a amostra foi inserida novamente A divisatildeo entre a
aacuterea do pico na primeira anaacutelise pelo pico da segunda anaacutelise refere-se agrave porcentagem
de exclusatildeo de interferentes As condiccedilotildees cromatograacuteficas foram as mesmas do teste
com BSA
47
4643 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA em diferentes pHs
O teste de exclusatildeo de proteiacutenas tambeacutem foi realizado nas mesmas condiccedilotildees
cromatograacuteficas que a anaacutelise anterior utilizando soluccedilatildeo de BSA em triplicata no
entanto diferentes soluccedilotildees como fase moacutevel (variaccedilatildeo de pH de 22 a 70) foram
testadas pois o pH pode influenciar na ionizaccedilatildeo dos analitos dos grupos funcionais
presentes na superfiacutecie do novo RAM e na interaccedilatildeo entre eles o que pode resultar em
diferentes taxas de exclusatildeo de proteiacutenas Estas soluccedilotildees foram os tampotildees fosfato de
soacutedio 10 mM (pHs 22 e 26) formiato de amocircnio 10 mM (pHs 30 a 46) acetato de
amocircnio 5 mM (pHs 52 a 66) e fosfato de soacutedio 5mM (pH 70)
465 Paracircmetros espectromeacutetricos
Com a finalidade de se obter um meacutetodo de anaacutelise capaz de detectar e
quantificar menores niacuteveis possiacuteveis de concentraccedilatildeo dos analitos foram otimizados os
paracircmetros espectromeacutetricos fluxos dos gases secantes e nebulizador modo de
ionizaccedilatildeo temperaturas da linha de dessolvataccedilatildeo e de bloco de aquecimento e as
energias de colisotildees utilizadas para fragmentar os iacuteons precursores para originar os
fragmentos iocircnicos de cada analito Foram realizadas soluccedilotildees padrotildees de cada analito e
dos padrotildees internos (PIs) deuterados (vareniclina d-4 hidroxibupropiona d6 nicotina
d4 cotinina d3 e hidroxicotinina d3) na concentraccedilatildeo de 1 mg L-1 em metanol Cada
uma destas soluccedilotildees foram injetadas separadamente no sistema em um volume de 5 microL
A fase moacutevel utilizada foi constituiacuteda por metanol tampatildeo formiato de amocircnio 001
mol L-1 pH=42 (9010 vv) em um fluxo de 04 mL min-1 e o modo de ionizaccedilatildeo
positiva (ESI+) foi utilizado pois demonstrou ser mais eficiente para ionizar as
moleacuteculas analisadas Essa otimizaccedilatildeo foi obtida utilizando o software Labsolutionsreg
48
466 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatograacutefico multidimensional
Para esta otimizaccedilatildeo foi utilizado um HPLC de dotado de vaacutelvula comutadora
automaacutetica de 6 vias e um injetor automaacutetico de amostras o que permitiu a
automatizaccedilatildeo do processo Ainda o sistema cromatograacutefico foi acoplado a um
espectrocircmetro de massas em tandem (HPLC-MSMS) dotado de um analisador de
massa triplo quadrupolo o qual possui alta sensibilidade e seletividade Incorporou-se
neste sistema uma coluna extratora preenchida com o RAM desenvolvido
O forno foi mantido a 40ordmC e o detector UV operando em um comprimento de
onda de 255 nm A fim de padronizar a anaacutelise foram testadas colunas anaacuteliticas de
diversos tamanhos e composiccedilotildees e variadas proporccedilotildees de fases de moacuteveis
Atraveacutes da anaacutelise do cromatograma foram avaliados o tempo de retenccedilatildeo e
separaccedilatildeo e as aacutereas obtidas dos picos de cada analito O sistema foi utilizado no modo
columns switching na configuraccedilatildeo backflush e as condiccedilotildees da anaacutelise foram
otimizadas como os tempos de exclusatildeo de proteiacutenas de adsorccedilatildeo e eluiccedilatildeo dos
analitos de separaccedilatildeo cromatograacutefica de limpeza da coluna extratora e de
recondicionamento do sistema bem como a composiccedilatildeo das fases moacuteveis de
carregamento de eluiccedilatildeoseparaccedilatildeo e de limpeza
Para a otimizaccedilatildeo dos paracircmetros de anaacutelise foi utilizado um pool de amostras
de soro humano branco em sexplicata Este soro foi dopado com os analitos vareniclina
bupropiona hidroxibupropiona nicotina cotinina e hidroxicotinina em 3 concentraccedilotildees
01 100 e 1000 microg L -1 e com os PIs deuterados na concentraccedilatildeo de 500 microg L -1 Como
o soro eacute uma matriz com alta concentraccedilatildeo de interferentes foram testados pools de
soro branco dopados e injetados sem diluiccedilatildeo diretamente no sistema e diluiacutedos em aacutegua
ultra pura (11) e os perfis analiacuteticos foram entatildeo avaliados
49
467 validaccedilatildeo analiacutetica
Testes para a validaccedilatildeo da anaacutelise otimizada foram realizadas conforme
diretrizes do US Department of Health and Human Services e do Food and Drug
Administration (FDA) 2013 113 Os paracircmetros avaliados foram a seletividade limite
de detecccedilatildeo (LD) limite de quantificaccedilatildeo (LQ) linearidade estabilidade dos analitos
efeito residual e de matriz e recuperaccedilatildeo da extraccedilatildeo
Os ensaios foram realizados em seis repeticcedilotildees (n=6) exceto o ensaio de
recuperaccedilatildeo (n=3) e foi utilizado um pool de amostras de soro branco dopadas com cada
um dos analitos nas concentraccedilotildees de 5 10 20 50 75 100 μg L-1 para vareniclina 1 5
50 250 500 1000 μg L-1 para bupropiona 1 10 100 500 1000 2000 para
hidroxibupropiona 5 10 50 250 500 1000 μg L-1 para nicotina cotinina e
hidroxicotinina Os PIs deuterados foram utilizados na concentraccedilatildeo de 200 μg L-1
47 Anaacutelise estatiacutestica
Em relaccedilatildeo agraves caracteriacutesticas demograacuteficas as variaacuteveis contiacutenuas foram
apresentadas como meacutedia e desvio padratildeo e as categoacutericas como frequecircncias Os testes
Shapiro-Wilk e KolmogorovndashSmirnov foram realizados para verificar a normalidade da
distribuiccedilatildeo das variaacuteveis quantitativas e assim escolher testes parameacutetricos ou natildeo
parameacutetricos Foram realizados os testes Qui-quadrado Exato de Fisher t de Student ou
Mann-Whitney para as anaacutelises comparativas de caracteriacutesticas gerais entre os grupos
de desfecho dos pacientes tanto no ensaio de expressatildeo como de mensuraccedilatildeo dos
analitos Para as anaacutelises de expressatildeo gecircnica o meacutetodo 2-∆∆CT foi utilizado 103 Como os
dados de expressatildeo natildeo apresentaram distribuiccedilatildeo normal foi realizado o teste natildeo
parameacutetrico de Mann-Whitney para testar a hipoacutetese de diferenccedila (valores de 2-∆CT)
intra e entre os grupos de desfechos (sucesso e resistente e tempos de tratamento
50
farmacoloacutegico T0 T2 e T4) Os valores de ∆∆CT (mediana de ∆CTgrupo teste ndash mediana
de ∆CTgrupo referecircncia) foram obtidos para o caacutelculo do fold change O fold-change (2-∆∆CT)
foi calculado para verificar o aumento ou diminuiccedilatildeo de expressatildeo gecircnica entre os
grupos analisados O graacutefico heat map foi construiacutedo atraveacutes do software Gene-globe
(Qiagen USA) para verificar as diferenccedilas no perfil de expressatildeo dos genes estudados
de acordo com os tempos (T0 T2 e T4) e de acordo com a efetividade de tratamento
com vareniclina (sucesso e resistente) O teste de Manny-Whitney foi utilizado para
analisar os niacuteveis de concentraccedilotildees de vareniclina de bupropiona de nicotina e de seus
metaboacutelitos de acordo com os desfechos de tratamento (sucesso e resistente) pois natildeo
apresentaram distribuiccedilatildeo normal A taxa de metabolizaccedilatildeo de nicotina (NRM) foi
calculada pela seguinte foacutermula NMR= trans-3-hidroxicotininacotinina A
hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3- hidroxicotinina
para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros da hidroxicotinina satildeo
irrelevantes 31 32 Os pacientes foram classificados em metabolizadores lentos se
NMRlt031 e normais ou raacutepidos se NMRgt031 Todas as anaacutelises estatiacutesticas foram
realizadas utilizando o software SPSS (versatildeo 20 IBM New York NY) considerando
o niacutevel de significacircncia de P lt005
51
5 RESULTADOS
Este projeto incluiu 105 pacientes sendo 74 tratados com vareniclina e 31
com bupropiona Dos 74 pacientes tratados com vareniclina amostras de 27 pacientes
foram analisadas quanto agrave expressatildeo gecircnica (14 pacientes do grupo de desfecho sucesso
e 13 do grupo resistente) Sendo provenientes destes pacientes 52 amostras ao todo (de
diversos tempos) 9 resistentes do tempo T0 7 resistentes do T2 8 resistente do T4 9
sucessos do T0 8 sucessos do T2 e 11 sucessos do T4 (vide toacutepico 42 Nuacutemero
amostral)
Quanto a mensuraccedilatildeo dos analitos foi desenvolvida uma coluna extratora para a
purificaccedilatildeo da amostra agrave base de nanotubos hiacutedridos de carbono e siacutelica modificados
com a adiccedilatildeo de grupos hidrofiacutelicos (novo RAM) o meacutetodo HPLC-MSMS
multidimensional no modo column switching e na configuraccedilatildeo backflush foi
otimizado e validado Setenta e quatro pacientes tratados com vareniclina e 31 tratados
com bupropiona foram submetidos agrave anaacutelise Apenas 4 amostras das 105 apresentaram
valores abaixo do LQ (3 de pacientes tratados com vareniclina e 1 de paciente tratado
com bupropiona) e estas foram excluiacutedas das anaacutelises dos analitos (vide toacutepico 42
Nuacutemero amostral)
51 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica
511 Dados cliacutenicos e demograacuteficos
As Tabelas 2 e 3 mostram as caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes
selecionados para o ensaio de expressatildeo gecircnica do grupo total e por grupo de desfecho
respectivamente A variaacutevel idade apresentou diferenccedila significativa entre os grupos
resistente e sucesso
52
Tabela 2 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina selecionados para os ensaios de expressatildeo gecircnica (n=27)
Idade (anos) 50 plusmn 13
Gecircnero mulheres () 464
Etnia autodeclarada brancos () 740
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 271 plusmn 50
Cigarrosdia 17 plusmn 7
FTND 62 plusmn 20
FTND ge 6 () 607
Escore Issa ge 3 () 857
Hipertensatildeo () 179
Dislipidemia () 250
Diabetes melito tipo 2 () 107
Depressatildeo () 71
Ansiedade () 286
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash
Fagerstroumlm test for nicotine dependence (escala de 0 a 10
pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
Tabela 3 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina submetidos aos ensaios de expressatildeo gecircnica de acordo com o desfecho
de tratamento
Resistente (n=13) Sucesso (n=14) Valor de P
Idade (anos) 55 plusmn 11 45 plusmn 12 0045
Gecircnero mulheres () 538 357 045
Etnia autodeclarada brancos () 769 786 100
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 271 plusmn 46 273 plusmn 54 092
Cigarrosdia 20 plusmn 6 15 plusmn 6 006
FTND 63 plusmn 22 59 plusmn 19 058
FTND ge 6 () 538 643 070
Escore Issa ge 3 () 846 857 100
Hipertensatildeo () 231 71 033
Dislipidemia () 231 286 100
Diabetes melito tipo 2 () 231 00 010
Depressatildeo () 77 71 100
53
Ansiedade () 308 357 100
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fagerstroumlm test for nicotine
dependence (escala de 0 a 10 pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
512 Dados de expressatildeo gecircnica
Dos 17 genes escolhidos para testar com a resposta ao tratamento apenas 4
apresentaram valores de amplificaccedilatildeo aceitaacuteveis para uma interpretaccedilatildeo de qualidade
mais especificamente valores de CT lt 33 Os valores das expressotildees dos genes (CTs)
foram normalizados atraveacutes das meacutedias de CT dos housekeeping genes para cada
amostra obtendo-se os valores de ∆CT = (CTgene alvo ndash meacutedia CT housekeepings genes) A
Tabela 4 mostra os valores de mediana de ∆CT dos genes analisaacuteveis de acordo com os
tempos de tratamento e grupos de desfecho
Tabela 4 - Valores de mediana de ∆CT dos genes de acordo com os tempos de
tratamento e grupos de desfecho
∆CT = (CTgene alvo ndash meacutedia CThousekeepings genes) T0= Tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico
T2= Duas semanas apoacutes o iacutenicio do tratamento farmacoloacutegico T4= Quatro semanas apoacutes o iniacutecio do
tratamento farmacoloacutegico IC 95 = Intervalo de confianccedila de 95
Resistente T0 Resistente T2 Resistente T4
∆CT IC 95 ∆CT IC 95 ∆CT IC 95
CHRNA5 818 (732 ndash 870) 845 (748 ndash 887) 767 (727 ndash 905)
CHRNA7 662 (617 ndash 697) 802 (707 ndash 848) 719 (696 ndash 786)
CHRNG 620 (579 ndash 695) 647 (601 ndash 668) 663 (602 ndash 702)
COMT 467 (440ndash 501) 480 (443 ndash 503) 487 (452 ndash 524)
Sucesso T0 Sucesso T2 Sucesso T4
∆CT IC 95 ∆CT IC 95 ∆CT IC 95
CHRNA5 832 (738 ndash 917) 707 (653 ndash 896) 837 (754 ndash 882)
CHRNA7 726 (611 ndash 842) 704 (640 ndash 779) 738 (676 ndash 820)
CHRNG 682 (619 ndash 774) 683 (656 ndash 733) 659 (625 ndash 703)
COMT 488 (430 ndash 511) 458 (433 -515) 481 (448 ndash 516)
54
513 Anaacutelise de associaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica entre os desfechos e os tempos de
tratamento
A Tabela 5 mostra o fold change e anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos de
tempos de tratamento e grupos de desfecho Foi observada diferenccedila significativa para a
expressatildeo do gene CHRNA7 no grupo resistente amostras dos tempos T2 e T4
apresentaram menor expressatildeo comparadas com amostras do T0 (fold change 038
P=0007 fold change 067 P=0004 respectivamente) Para a expressatildeo do gene
CHRNG amostras do grupo sucesso mostraram menor expressatildeo comparadas com
amostras do grupo resistente no tempo T2 (fold change= 077 P=0006)
Tabela 5 - Fold change e anaacutelise de associaccedilatildeo entre os tempos de tratamento e
grupos de desfecho
Resistente T2 vs T0 Resistente T4 vs T0 Resistente T4 vs T2
Genes 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P
CHRNA5 083 (034 ndash 233) 057 142 (030 ndash 269) 095 172 (034 ndash 303) 089
CHRNA7 038 (020 ndash 093) 0007 067 (031 ndash 101) 0004 178 (058 ndash 287) 037
CHRNG 083 (054 ndash 192) 037 074 (043 ndash 190) 044 090 (050 ndash 158) 036
COMT 091 (065 ndash 149) 092 087 (056 ndash 140) 063 095 (057 ndash 142) 073
Sucesso T2 vs T0 Sucesso T4 vs T0 Sucesso T4 vs T2
Genes 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P
CHRNA5 238 (033 ndash 623) 037 097 (037 ndash 310) 061 041 (020 ndash 268) 069
CHRNA7 116 (031 ndash 406) 064 092 (023 ndash 316) 091 079 (029 ndash 204) 055
CHRNG 099 (045 ndash 227) 049 117 (056 ndash 281) 062 118 (072 ndash 211) 033
COMT 123 (055 ndash 172) 092 105 (055 ndash 155) 068 085 (056 ndash 159) 041
Sucesso vs resistente T0 Sucesso vs resistente T2 Sucesso vs resistente T4
Genes 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P
CHRNA5 091 (028 ndash 250) 075 260 (036 ndash 506) 047 062 (034 ndash 285) 085
CHRNA7 064 (021 ndash 182) 013 197 (061 ndash 423) 009 088 (042 ndash 214) 074
CHRNG 065 (026 ndash 169) 012 077 (040 ndash 109) 0006 103 (050 ndash 171) 079
55
T0= Tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico T2= Duas semanas apoacutes o iacutenicio do tratamento
farmacoloacutegico T4= Quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico 2-∆∆CT = Fold change (diferenccedila de
expressatildeo) P valor (anaacutelise de associaccedilatildeo entre as medianas de 2-∆CT dos grupos) IC 95 = Intervalo de confianccedila
de 95
As Figura 14 e 15 mostram graacuteficos de barras das diferenccedilas de expressatildeo dos
genes CHRNA7 e CHRNG entre os tempos de tratamento e desfecho respectivamente
O heat map (Figura 16) mostra que natildeo houve diferenciaccedilatildeo nos perfis de expressatildeo
gecircnica em uma anaacutelise conjunta dos genes de acordo com os desfechos e tempos de
tratamento
Devido agrave diferenccedila significativa nas meacutedias de idade entre os grupos sucesso e
resistente foi realizada regressatildeo linear multipla na anaacutelise de expressatildeo dos quatro
genes analisaacuteveis A regressatildeo foi ajustada por idade e tambeacutem gecircnero e cigarros por
dia No entanto os resultados de expressatildeo dos genes natildeo foram impactados por estas
covariaacuteveis
COMT 086 (061 ndash 164) 090 116 (061 ndash 162) 049 104 (064 ndash 169) 093
56
Figura 14 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNA7 entre os tempos de tratamento e desfecho A Anaacutelise intragrupo do
desfecho resistente B Anaacutelise intragrupo do desfecho sucesso T0= tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico T2= duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico T4= quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico P= 0007
(resistente T2 vs T0 fold change de 038) P=0004 (resistente T4 vs T0 fold change de 067) Valor de P (anaacuteliacutese de
associaccedilatildeo entre as medianas de 2-∆CT dos grupos em uma comparaccedilatildeo dois a dois) Fonte do autor
57
Figura 15 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNG entre os tempos de tratamento e desfecho A Anaacutelise intragrupo do
desfecho resistente B Anaacutelise intragrupo do desfecho sucesso T0= tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico T2= duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico T4= quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico P= 0006
(sucesso vs resistente T2 fold change de 077) Valor de P (anaacuteliacutese de associaccedilatildeo entre as medianas de 2-∆CT dos grupos em uma
comparaccedilatildeo dois a dois) Fonte do autor
58
Figura 16 - Heat map de expressatildeo gecircnica A figura mostra a magnitude de expressatildeo gecircnica entre os grupos A cor mais clara
(verde) nos indica menor expressatildeo e a cor mais escura (vermelho) indica maior expressatildeoT0= tempo inicial antes do tratamento
farmacoloacutegico T2= duas semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico T4= quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento
farmacoloacutegico Fonte do autor gerada pelo software Gene Globe QIAGENreg
52 Mensuraccedilatildeo dos analitos
521 Caracterizaccedilatildeo da coluna teste exclusatildeo de proteiacutenas e interferentes da
matriz
Em relaccedilatildeo ao teste de capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas o pico de BSA sem
e com a nova coluna extratora apresentou tempo de retenccedilatildeo semelhante no entando a
aacuterea da curva do BSA na presenccedila do novo RAM foi bem menor do que na sua
ausecircncia conforme a Figura 17 A reduccedilatildeo de proteiacutenas (da soluccedilatildeo de BSA) pela
coluna foi de aproximadamente 98 e nas amostras de pools soro diluiacutedas (14) a
remoccedilatildeo foi de 99 (Figura 18)
A Figura 19 mostra a influecircncia do pH (escala de de 22 a 70) na exclusatildeo de
proteiacutenas fato que estaacute diretamente relacionado com a estrutura fiacutesico-quiacutemica do
RAM Diferentes pHs influenciaram na taxa de exclusatildeo de proteiacutenas esse
comportamento pode ser explicado devido agrave interaccedilotildees eletrostaacuteticas do novo RAM
com as proteiacutenas Valores de pH menores que o do ponto isoeleacutetrico das proteiacutenas
59
podem promover a prevalecircncia de proteiacutenas carregadas positivamente enquanto que
valores de pH superiores podem promover proteiacutenas carregadas negativamente 114
Dessa forma acredita-se que o comportamento de exclusatildeo de proteiacutenas do novo
material eacute semelhante ao descrito em outros estudos 108 109 115 116
Figura 17 - Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com soluccedilatildeo de BSA Graacuteficos obtidos apoacutes injeccedilatildeo de 10 microL de uma soluccedilatildeo aquosa de BSA (44 mg mL-1) no
sistema sem coluna (A) e com coluna extratora (B) A - aacuterea do pico 10142590 B - aacuterea
do pico 9713614 Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF
Unifal-MG
Figura 18 - Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com amostra de soro
diluiacuteda Graacuteficos obtidos apoacutes injeccedilatildeo de 100 microL de soro diluiacutedo em aacutegua ultra pura
(14 vv) no sistema sem coluna (A) e com coluna extratora (B) A aacuterea do pico
53981550 B - aacuterea do pico 53552824 Fonte do autor e do colaborador DrHenrique
Dipe de Faria LATF Unifal-MG
60
Figura 19 - Influecircncia do pH na exclusatildeo de proteiacutenas Fonte do autor e do colaborador Dr
Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
522 Otimizaccedilatildeo dos paracircmetros espectromeacutetricos
No processo de otimizaccedilatildeo das condiccedilotildees espectromeacutetricas foi adotado o modo
de ionizaccedilatildeo positivo (ESI+) isto eacute a ionizaccedilatildeo promove a protonaccedilatildeo (adiccedilatildeo de H+)
dos analitos e de seus fragmentos As energias de colisatildeo ideais e as muacuteltiplas transiccedilotildees
de monitoramento de reaccedilatildeo (MRM) foram otimizadas para cada analito separadamente
vide valores de energia de colisatildeo e fragmentos obtidos jaacute mostrados na Tabela 1 (no
toacutepico 461) A presenccedila de 3 fragmentos de cada analito foi necessaacuteria para a
identicaccedilatildeo qualitativa e a quantificaccedilatildeo foi dependente da concentraccedilatildeo do fragmento
mais abundante
As seguintes temperaturas foram utilizadas 40ordmC para o forno da coluna 250ordmC
para a linha de dessolvataccedilatildeo e 400ordmC para o bloco de aquecimento Foram utilizadas as
taxas de 20 ml min-1 de fluxo de gaacutes de nebulizaccedilatildeo e 150 ml min-1 de fluxo de gaacutes
para a secagem
61
523 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatrograacutefico multidimensional
Quanto a composiccedilatildeo e proporccedilatildeo da fase moacutevel responsaacutevel pela eluiccedilatildeo
separaccedilatildeo e ionizaccedilatildeo dos analitos (fase moacutevel de eluiccedilatildeo) testes foram realizados com
os solventes orgacircnicos acetonitrila ou metanol combinados com o tampatildeo formiato de
amocircnio 10 mM em diferentes pHs com proporccedilotildees que variaram de 973 vv a 7525
vv (fase orgacircnica fase aquosa) Os solventes orgacircnicos utilizados satildeo menos viscosos
em relaccedilatildeo agrave aacutegua por isso fluem mais facilmente no sistema e por serem volaacuteteis
favorecem tambeacutem a ionizaccedilatildeo dos analitos e evaporaccedilatildeo do solvente A fase moacutevel que
apresentou melhores resultados foi a composiccedilatildeo de metanol formiato de amocircnio 001
mol L-1 pH 42 (9010 vv)
Variados tipos de colunas analiacuteticas foram testadas sendo elas A NSTreg (150
mm 46 mm e 5 microm) a ACEreg (150 mm x 46 mm x 5 microm) a Phenomenexreg (250 x 46
mm x 5 microm) e a Atlantis T3 e da Watersreg (100 mm x 21 mm x 3 microm) (comprimento x
diacircmetro interno x tamanho de partiacutecula) no entanto essas colunas aumentaram o
tempo de retenccedilatildeo dos analitos pioraram o perfil cromatograacutefico gerando picos largos e
fragmentados Portanto os testes foram realizados com uma nova coluna analiacutetica a
ACEreg C18 (100 mm x 21 mm x 3 microm comprimento diacircmetro interno e tamanho de
partiacutecula) com preacute-coluna ACEreg C18 (21mm x 3 microm diacircmetro tamanho de partiacutecula)
obtendo-se um menor tempo de anaacutelise (maior frequecircncia analiacutetica) e melhor perfil
cromatograacutefico (picos simeacutetricos) para os analitos
Trecircs volumes de injeccedilatildeo de amostra foram testados (5 10 e 100 microL) devido a
baixa concentraccedilatildeo dos analitos foi adotada a maior quantidade (100 μL) pois forneceu
melhores sinais analiacuteticos Tambeacutem foi avaliado o uso do pool de soro sem diluiccedilatildeo e
diluiacutedo (11 vv) os perfis cromatograacuteficos de ambos foram oacutetimos no entanto
62
escolheu-se trabalhar com a amostra diluiacuteda para diminuir a presenccedila de interferentes e
consequentemente diminuir efeito matriz e aumentar o tempo de durabilidade da coluna
analiacutetica
Jaacute obtidas as melhores condiccedilotildees espectromeacutetricas e cromatograacuteficas foi
otimizado o sistema columm switching na configuraccedilatildeo de backflush o qual apresenta
trecircs eventos como mostrado na Figura 20
Figura 20 - Ilustraccedilatildeo do sistema de columm switching na configuraccedilatildeo de backflush Na posiccedilatildeo 1
correspondente ao evento 1 ocorre exclusatildeo dos interferentes e adsorccedilatildeo dos analitos a coluna extratora Na
posiccedilatildeo 2 durante o evento 2 ocorre a eluiccedilatildeo dos analitos adsorvidos No retorno para a posiccedilatildeo 1
correspondente ao evento 3 ocorre limpeza da coluna extratora separaccedilatildeo e detecccedilatildeo dos analitos e por fim
o recondicionamento do sistema BA = bomba A BB = bomba B BC = bomba C MS = espectrocircmetro de
massas UV = detector UV e W = descarte Fonte Traduzido de (De Faria et al 2017)
Com as vaacutelvulas do sistema na posiccedilatildeo 1 (evento 1) a bomba A promoveu a
liberaccedilatildeo da fase moacutevel de carregamento (aacutegua ultra pura) em um fluxo de 04 mL min-1 O
tempo de 3 minutos foi o necessaacuterio para a adsorccedilatildeo dos analitos e sua preacute-concentraccedilatildeo
aleacutem da eliminaccedilatildeo de macromoleacuteculas A aacutegua mostrou ser um solvente oacutetimo como fase
moacutevel de carregamento aleacutem de ser um recurso barato e natildeo causar danos ao meio
ambiente De forma simultacircnea a fase moacutevel de eluiccedilatildeo fornecida pela bomba C passa
para a coluna analiacutetica de forma a condionaacute-la ainda na ausecircncia dos analitos Ambas as
bombas operaram com uma taxa de fluxo inicial de 04 mL min -1
63
Na posiccedilatildeo 2 da vaacutelvula (evento 2) a bomba C liberou a fase moacutevel de eluiccedilatildeo
(metanol formiato de amocircnio 001 mol L-1 pH 42 (9010 vv) em direccedilatildeo agrave coluna
analiacutetica em fluxo contraacuterio ao que a fase moacutevel de carregamento percorreu (backflush) A
velocidade do fluxo da bomba C foi aumentada para 08 mL min -1 e o tempo determinado
para esta etapa foi de 03 minutos o qual promoveu um oacutetimo perfil cromatograacutefico dos
analitos
No evento 3 as vaacutelvulas foram colocadas na posiccedilatildeo 1 novamente A fase moacutevel
de eluiccedilatildeo (vinda da bomba C) novamente com um fluxo de 04 mL min-1 passou pela
coluna analiacutetica promovendo a separaccedilatildeo dos analitos e sua chegada no detector de
massas De forma simultacircnea a bomba B em um fluxo de 10 mL min -1 liberou a fase
moacutevel de limpeza (acetonitrila aacutegua ultra pura isopropanol 751510 vvv) a qual
passou pela coluna extratora (RAM) promovendo a remoccedilatildeo de resiacuteduos proveniente da
anaacutelise anterior tornando-a pronta para a reutilizaccedilatildeo em uma nova anaacutelise A fase de
limpeza ocorreu no tempo de 33 a 10 min O recondionamento do sistema agraves condiccedilotildees
iniciais de anaacutelise ocorreu nos uacuteltimos 5 min em que a fase moacutevel de limpeza foi
substituiacuteda pela fase moacutevel de carregamento O tempo total para cada anaacutelise foi de 15
minutos
Para a avaliaccedilatildeo da capacidade da fase moacutevel de limpeza (acetonitrila aacutegua
ultra pura isopropanol 751510 vvv) pools de soro branco dopado na maior
concentraccedilatildeo foram injetados no sistema (com a posiccedilatildeo 1 das vaacutelvulas mantida) e apoacutes
a realizaccedilatildeo da fase de limpeza foram injetados pools de soro branco diluiacutedos (11 vv)
O experimento foi realizado em triplicata O cromatograma do soro branco natildeo
apresentou sinal analiacutetico no mesmo tempo de retenccedilatildeo dos analitos o que mostra que a
fase moacutevel de limpeza foi eficiente em seu propoacutesito evitando o chamado efeito
residual (carry-over) De Faria et al 110
64
524 Validaccedilatildeo analiacutetica
Para os testes de validaccedilatildeo foram utilizados pools de amostras de soro branco
dopadas com cada um dos analitos nas concentraccedilotildees conforme o toacutepico 467
concentraccedilotildees menores foram utilizadas no entanto essas natildeo apresentaram bons sinais
analiacuteticos precisatildeo e exatidatildeo Os resultados dos testes de validaccedilatildeo estatildeo demonstrados
na Tabela 6
O teste de linearidade foi expresso como coeficiente de determinaccedilatildeo (r2)
calculado a partir das curvas de calibraccedilatildeo intra-ensaio Para esse teste foram utilizados
os analitos em diferentes concentraccedilotildees em soro branco conforme jaacute citado as
repeticcedilotildees geraram 6 curvas de calibraccedilatildeo para cada analito Os intervalos lineares
foram baseados nos intervalos terapecircuticos 51 117 118
As mesmas concentraccedilotildees dos analitos em soro no ensaio de linearidade foram
utilizadas no ensaio dos LD e LQ Estes foram calculados atraveacutes das 6 curvas de
calibraccedilatildeo e foram definidos como 3 e 10 vezes a relaccedilatildeo sinalruiacutedo respectivamente
para o LD e LQ
Para avaliar a precisatildeo e a exatidatildeo intra e inter-ensaios foram realizados 6
repeticcedilotildees de concentraccedilotildees de calibraccedilatildeo dos analitos Os testes intra-ensaio foram
realizados no mesmo dia e os testes inter-ensaios foram realizados em dias diferentes A
exatidatildeo foi calculada atraveacutes do erro relatico (E) e a precisatildeo atraveacutes do desvio
padratildeo relativo (RSD)
No teste de seletividade foi avaliado se houve a presenccedila picos de interferentes
nos mesmos tempos de retenccedilatildeo dos analitos e dos PIs deuterados As Figuras 21 e 22
mostram os cromatogramas obtidos apoacutes a injeccedilatildeo de soro branco e de soro dopado com
os analitos respectivamente mostrando que natildeo houve a presenccedila de interferentes nos
tempos de retenccedilatildeo dos analitos e PIs deuterados
65
Figura 21 - Cromatograma obtido de amostras de soro branco diluiacutedas em aacutegua ultra pura
Volume de injeccedilatildeo = 100 microL A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz 240rarr mz 131) C-
Hidroxibup (mz 256rarr mz 238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz 80) F-
Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G- Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr mz
244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz 134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz 196rarr
mz 80) Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
Figura 22 - Cromatograma obtido apoacutes anaacutelise de soro diluiacutedo e dopado com os analitos no niacutevel
meacutedio de calibraccedilatildeo e mais os padrotildees internos deuterados A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz
240rarr mz 131) C- Hidroxibup (mz 256rarr mz 238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz
80) F- Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G- Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr
mz 244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz 134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz 196rarr
mz 80) Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
Foram realizados os testes de estabilidade de bancada longo prazo e de
congelamento e descongelamento Para a anaacutelise de estabilidade de bancada soluccedilotildees de
soro dopada com os analitos foram analisadas imediatamente apoacutes a sua preparaccedilatildeo e
apoacutes 4 e 24 horas verificando assim a estabilidade da amostra a curto prazo Para uma
66
anaacutelise a longo prazo as amostras foram armazenadas a -20degC por 30 dias e apoacutes foram
avaliadas Quanto anaacutelises de congelamento e descongelamento foram realizados 3
ciclos de congelamento -20degC e posterior descongelamento e as amostras foram
avaliadas
O ensaio de recuperaccedilatildeo da extraccedilatildeo foi realizado em triplicata A anaacutelise
avaliou a recuperaccedilatildeo relativa comparando-se a extraccedilatildeo dos analitos a partir da matriz
de soro com a de aacutegua atraveacutes da passagem da amostra pela coluna de extraccedilatildeo (RAM)
A recuperaccedilatildeo relativa se daacute pela relaccedilatildeo das concentraccedilotildees nas duas matrizes
(concentraccedilatildeo no soro concentraccedilatildeo na aacutegua) x 100
O efeito residual (carry-over) foi avaliado injetando-se uma amostra de soro
branco antes de uma amostra de soro dopado na maior concentraccedilatildeo e apoacutes foi injetada
novamente uma amostra de soro branco foram inferior a 20 daqueles obtidos no LQ
Para avaliar o efeito matriz foram comparados os resultados da anaacutelise das
amostras de soro dopadas com os analitos em diferentes concentraccedilotildees em matrizes
diferentes (aacutegua e soro) O resultado para ser aceito precisava ser inferior a 15
Posteriormente foi realizada a mensuraccedilatildeo dos analitos em amostras reais de
soro provenientes de pacientes submetidos ao tratamento antitabagismo com doses
conforme bula As Figuras 23 e 24 mostram os cromatogramas de amostras de pacientes
submetidos ao tratamento com bupropiona e vareniclina respectivamente No momento
da coleta das amostras os pacientes estavam fumando e aleacutem de apresentarem os
analitos provenientes dos faacutermacos tambeacutem mostraram a presenccedila de analitos
provenientes da nicotina
67
Figura 23 - Cromatograma obtido atraveacutes da anaacutelise das amostras de soro dos pacientes
tratados com bupropiona (150 mg 2xdia) Os pacientes estavam fumando em torno de 10
cigarrosdia no dia da coleta A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz 240rarr mz 131) C-
hidroxibup (mz 256rarr mz 238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz 80) F-
Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G- Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr mz
244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz 134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz
196rarr mz 80) Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
Figura 24 - Cromatograma obtido atraveacutes da analise de amostras de soro de pacientes tratados
com vareniclina (10 mg 2xdia) Os pacientes fumavam em torno de 10 cigarrosdia no dia da
coleta A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz 240rarr mz 131) C- hidroxibup (mz 256rarr mz
238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz 80) F- Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G-
Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr mz 244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz
134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz 196rarr mz 80) Fonte do autor e do
colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
68
Tabela 6 - Paracircmetros de validaccedilatildeo obtidos na determinaccedilatildeo de faacutermacos antitabagismo em soro humano
Meacutedia plusmn Desvio padratildeo (n=6) amenor bmeacutedio e calto niacutevel de calibraccedilatildeo 1Estabilidade de bancada (4 a 24 horas) Precisatildeo RSD = [Desvio padratildeomeacutedia] x 100 E = [(Meacutedia experimental da
concentraccedilatildeo Concentraccedilatildeo nominal) x 100] ndash 100 2Efeito matriz E= [(Meacutedia da concentraccedilatildeo experimental no solventeMeacutedia experimental da concentraccedilatildeo no soro) x 100] ndash 100
Paracircmetros de validaccedilatildeo Vareniclina Bupropiona Hidroxibupropiona Nicotina Cotinina Hidroxicotinina
Intervalo linear (microg L-1) 5-100 1-1000 1-2000 5-1000 5-1000 5-1000
r2 ( n=6) 09952 09998 09998 09997 09998 09999
Decliacutenio (α) ( n=6) 00196plusmn 00095 00045plusmn00059 00051plusmn00057 00087plusmn00012 00073plusmn00048 00075plusmn00074
Intercepto ( n=6) -00316plusmn00004 -00022plusmn00020 00230plusmn00025 -00046plusmn00065 00767plusmn00012 01918plusmn00013
Tempo de retenccedilatildeo (min) 521 501 485 497 446 441
LD (microg L-1) 25 07 06 19 24 37
LQ (microg L-1) 50 10 10 50 50 50
Precisatildeo intra-ensaio RSD ( n=6) 93a
30a
100c
153a
37b
21c
140a
06b
06c
90a
26b
11c
117a
34b
61c
128a
138b
92c
Precisatildeo inter-ensaio RSD ( n=18 trecircs dias) 185a
115b
66c
82a
27b
20c
109a
17b
10c
83a
27b
14c
158a
41b
31c
161a
44b
92c
Acuraacutecia intra-ensaio E ( n=6) 196a
54b
-30c
-55a
-24b
-11c
-65a
19b
-04c
158a
09b
-26c
-87a
47b
-24c
71a
18b
05c
Acuraacutecia inter-ensaio E ( n=18 trecircs dias) 82a
-16b
035c
41a
-01b
-01c
-87a
27b
-20c
146a
40b
018c
-120a
25b
-110c
58a
-35b
30c
Recuperaccedilatildeo da extraccedilatildeo ( n=3) 883a
1104b
1014c
1101a
1009b
1028c
945a
1094b
1078c
1098a
1088b
1146c
941a
1093b
1116c
1167a
1112b
1141c
Estabilidade1 E
( n=6)
98a
11b
-50c
71a
-32b
-38c
140a
-16b
-79c
40a
-79b
-110c
-132a
-94b
-32c
86a
125b
-54c
Efeito matriz2 E
( n=6)
-117a
104b
14c
101a
09b
28c
-55a
94b
78c
98a
88b
146c
-59a
93b
116c
167a
112b
141c
69
525 Dados cliacutenicos e demograacuteficos dos pacientes submetidos a mensuraccedilatildeo dos
analitos
As Tabelas 7 a 10 mostram as caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos
pacientes submetidos agraves anaacutelises de concentraccedilatildeo dos analitos
As Tabelas 7 e 8 referem-se aos pacientes tratados com vareniclina sendo
considerado o grupo total e os grupos de desfecho respectivamente Os pacientes do
grupo resistente agrave vareniclina fumavam um maior nuacutemero de cigarrosdia (antes do
tratamento) em comparaccedilatildeo com os pacientes que obtiveram sucesso (21 vs 17
cigarrosdia P= 005)
As Tabelas 9 e 10 referem-se aos pacientes tratados com bupropiona no grupo
total e de acordo com desfecho respectivamente O grupo resistente ao tratamento com
bupropiona apresentou maior frequecircncia de pacientes com alta DN (atraveacutes dos escores
FTND e Issa categorizados) e de pacientes que fumavam no dia da coleta em
comparaccedilatildeo ao grupo sucesso (FTNDge6= 833 vs 429 P= 005 Escore Issage3=
1000 vs 429 P= 0001 fumo no dia da coleta= 1000 vs 429 P= 0001
respectivamente)
Tabela 7 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos (n= 74)
Idade (anos) 51 plusmn 12
Gecircnero mulheres () 500
Etnia autodeclarada brancos () 730
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 263 plusmn 49
10 1 4 1
7 1 3 1
8 1 3 1
9 1 3 1
8 1 4 1
5 0 3 1
8 1 4 1
8 1 4 1
7 1 4 1
7 1 3 1
9 1 3 1
7 1 4 1
Cigarrosdia inicial 19 plusmn 10
Fumo no dia da coleta () 919
FTND 62 plusmn 23
FTND ge 6 () 644
70
Escore Issa ge 3 () 851
Hipertensatildeo () 311
Dislipidemia () 392
Diabetes melito tipo 2 () 95
Depressatildeo () 135
Ansiedade () 176
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash
Fagerstroumlm test for nicotine dependence (escala de 0 a 10 pontos)
Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala de 0 a 4
pontos)
Tabela 8 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com o
desfecho de tratamento
Resistente (n=41) Sucesso (n=33) P valor
Idade (anos) 53 plusmn 11 49 plusmn 13 023
Gecircnero mulheres () 561 424 024
Etnia autodeclarada brancos () 683 788 031
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 270 plusmn 40 255 plusmn 58 028
Cigarrosdia 21 plusmn 11 17 plusmn 7 005
Fumo no dia da coleta () 976 848 008
FTND 65 plusmn 22 57 plusmn 23 019
FTND ge 6 () 659 625 077
Escore Issa ge 3 () 829 879 075
Hipertensatildeo () 390 212 010
Dislipidemia () 341 455 032
Diabetes melito tipo 2 () 73 121 069
Depressatildeo () 122 152 071
Ansiedade () 146 212 046
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fagerstroumlm test for nicotine
dependence (escala de 0 a 10 pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
71
Tabela 9 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos (n= 31)
Idade (anos) 52 plusmn 11
Gecircnero mulheres () 71
Etnia autodeclarada brancos () 931
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 258 plusmn 57
Cigarrosdia inicial 21 plusmn 7
Fumo no dia da coleta () 871
FTND 68 plusmn 21
FTND ge 6 () 742
Escore Issa ge 3 () 871
Hipertensatildeo () 226
Dislipidemia () 323
Diabetes melito tipo 2 () 32
Depressatildeo () 65
Ansiedade () 194
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash
Fagerstroumlm test for nicotine dependence (escala de 0 a 10
pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
Tabela 10 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com
o desfecho de tratamento
Resistente (n=24) Sucesso (n=7) Valor de P
Idade (anos) 53 plusmn 11 50 plusmn 11 054
Gecircnero mulheres () 708 714 100
Etnia autodeclarada brancos () 957 833 038
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 252 plusmn 61 278 plusmn 35 015
Cigarrosdia 21 plusmn 7 23 plusmn 7 071
Fumo no dia da coleta () 1000 429 0001
FTND 73 plusmn 15 54 plusmn 32 011
FTND ge 6 () 833 429 005
Escore Issa ge 3 () 1000 429 0001
Hipertensatildeo () 292 00 016
72
Dislipidemia () 375 143 038
Diabetes melito tipo 2 () 42 00 100
Depressatildeo () 83 00 100
Ansiedade () 250 00 029
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fagerstroumlm test for nicotine
dependence (escala de 0 a 10 pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
526 Anaacutelise de associaccedilatildeo dos analitos com desfecho de tratamento
A Tabela 11 mostra a frequecircncia do desfecho de tratamento de acordo com os
medicamentos antitabagismo pacientes estes cujas amostras de soro foram submetidas agrave
mensuraccedilatildeo dos analitos
Tabela 11 ndash Frequecircncia do desfecho de tratamento nos pacientes submetidos agraves
anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com os medicamentos
antitabagismo
Medicamento Resistente () Sucesso ()
Vareniclina (n=74) 544 446
Bupropiona (n=31) 774 226
As Tabelas de 12 a 15 mostram as concentraccedilotildees dos analitos nas amostras de
soro dos pacientes tratados com vareniclina e bupropiona no grupo total e de acordo
com o desfecho de tratamento
Os pacientes do grupo resistente tanto os pacientes tratados com vareniclina
(Tabela 13) quanto com bupropiona (Tabela 15) apresentaram concentraccedilatildeo
significativamente maior de cotinina e hidroxicotinina do que os grupos sucesso
(tratamento com vareniclina cotinina= 1182 vs 706 μgL P= 0009 hidroxicotinina=
845 vs 516 μgL P= 002 Tratamento com bupropiona cotinina= 1346 vs 160 μgL
P= 0005 hidroxicotinina= 972 vs 374 μgL P= 0004) No entanto quanto ao NMR
natildeo houve diferenccedila entre os desfechos de tratamento de ambos os faacutermacos Aleacutem
73
disso somente o grupo de pacientes tratados com vareniclina continha pacientes com
NMRlt031 (metabolizadores lentos para nicotina) e ainda sua frequecircncia foi baixa
(100 e 43 para os grupos de desfecho resistente e sucesso respectivamente)
Tabela 12 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos pacientes tratados
com vareniclina
Vareniclina μgL n=71 83 (81 ndash 95)
Nicotina μgL n=31 75 (76 ndash 112)
Cotinina μgL n=65 1007 (923 ndash 1225)
Hidroxicotinina μgL n=65 681 (638 ndash 874)
NMR n=63 069 (067 ndash 102)
NMR lt031 () n=63 79
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de
95) NMR=trans-3-hidroxicotininacotinina NMR lt031=
metabolizador lento NMR ge031= metabolizador normal e raacutepido A
hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo
trans-3- hidroxicotinina para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade
de outros isocircmeros satildeo irrelevantes
Tabela 13 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de tratamento
com vareniclina
Resistente Sucesso P
valor Vareniclina μgL n=71 84 (78 ndash 99) 83 (77 ndash 97) 096
Nicotina μgL n=31 83 (74 ndash 127) 70 (59 ndash 105) 032
Cotinina μgL n=65 1182 (1012 ndash 1426)
111114143ndash
1421426)
706 (643 ndash 1037) 0009
Hidroxicotinina μgL n=65 845 (702 ndash 1032) 516 (434 ndash 721) 002
NMR n=63 074 (062 ndash 107) 061 (055 ndash 113) 064
NMR lt031 () n=63 100 43 064
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de 95) NMR=trans-3-
hidroxicotininacotinina NMR lt031= metabolizador lento NMR ge031= metabolizador normal e
raacutepido A hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3- hidroxicotinina
para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros satildeo irrelevantes
74
Tabela 14 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos pacientes tratados
com bupropiona
Bupropiona μgL n=30 369 (332 ndash 493)
Hidroxibupropiona μgL n=23 7368 (5860 ndash 7824)
Nicotina μgL n=13 71 (62 ndash 109)
Cotinina μgL n=27 1159 (971 ndash 1648)
Hidroxicotinina μgL n=28 931 (838 ndash 1387)
NMR n=27 090 (074 ndash 149)
NMR lt031 () n=27 0
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de 95) NMR=
trans-3-hidroxicotininacotinina NMR lt031= metabolizador lento NMR
ge031= metabolizador normal e raacutepido Natildeo houve pacientes com NRM lt031 A
hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3-
hidroxicotinina para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros
satildeo irrelevantes
Tabela 15 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de tratamento
com bupropiona
Resistente Sucesso P
valor Bupropiona μgL n=30 372 (331 ndash 533) 300 (214 ndash 481) 048
Hidroxibupropiona μgL n=23 7795 (6078 ndash 8308) 5128 (2957 ndash 8195) 012
Nicotina μgL n=13 71 (62 ndash 109) - -
Cotinina μgL n=27 1346 (1097 ndash 1784) 160 (-195 ndash 712) 0005
Hidroxicotinina μgL n=28 972 (929 ndash 1520) 374 (33 ndash 847) 0004
NMR n=27 084 (076 ndash 109) 132 (-371 ndash 884) 014
NMR lt031 () n=27 0 0 -
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de 95) NMR= trans-3-
hidroxicotininacotinina NMR lt031= metabolizador lento NMR ge031= metabolizador normal e raacutepido
No grupo sucesso somente 1 paciente apresentou concentraccedilatildeo de nicotina Natildeo houve pacientes com NRM
lt031 A hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3- hidroxicotinina para o
caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros satildeo irrelevantes
75
6 DISCUSSAtildeO
61 Para os dados da anaacutelise de expressatildeo gecircnica
O presente estudo cliacutenico e exploratoacuterio identificou resultados significativos para
expressatildeo dos genes CHRNA7 e CHRNG de acordo com os tempos de coleta e o
desfecho de tratamento com vareniclina Amostras do grupo resistente nos tempos T2 e
T4 isto eacute jaacute com o uso da vareniclina apresentaram menores niacuteveis de expressatildeo
gecircnica do CHRNA7 comparado agraves amostras do T0 (antes de iniciar o tratamento
farmacoloacutegico) Estes resultados sugerem que o downregulation de α7 pode ter sido
responsaacutevel pela natildeo cessaccedilatildeo do fumo nos indiviacuteduos do grupo resistente o que natildeo foi
observado nas amostras do grupo sucesso
O gene CHRNA7 codifica a subunidade α7 dos nAChRs Esta possui grande
importacircncia estaacute presente em diversos tecidos e possui associaccedilatildeo consistente em
vaacuterios estudos com o processo de dependecircncia agrave nicotina processos cognitivos e
imunoloacutegicos 119-124 Estudos tambeacutem mostraram que haacute um locus contendo duplicaccedilatildeo
do gene CHRNA7 truncada composta pelos exons 5-10 do gene CHRNA7 precidida de
4 exons uacutenicos e uma deleccedilatildeo de dois pares de bases no eacutexon 6 o qual nomearam como
CHRNFAN7 A maioria dos indiviacuteduos possui uma ou duas coacutepias deste gene e satildeo
raros os casos em que esta coacutepia natildeo estaacute presente 125 126
No ceacuterebro de ratos Sprague-Dawley Ryan e Loiacono 119 detectaram niacuteveis de
α7 transcritos em diversos locais como na substacircncia negra compacta (SNpc) na
substacircncia negra reticular (SNpr) na aacuterea tegmental ventral (VTA) no coacutertex e no
hipocampo Os ratos submetidos ao tratamento crocircnico com nicotina mostraram maiores
niacuteveis de mRNA da subunidade α7 em SNpc SNpr e VTA em comparaccedilatildeo ao grupo
controle A VTA faz parte do sistema de recompensa mesoliacutembico o qual eacute muito
estudado nos processos de ND 12 15 No presente estudo (em amostras de PBMC) o
76
grupo de pacientes resistentes tambeacutem apresentou maior expressatildeo de α7 no momento
em que somente a nicotina estava presente no fumo crocircnico Ao introduzir a vareniclina
as expressotildees foram diminuiacutedas nos tempos T2 e T4 provavelmente devido ao
antagonismo competitivo da vareniclina com a nicotina no receptor
Benhammou et al 127 realizaram um estudo com amostras de ceacuterebro post mortem
de fumantes e com amostras de sangue de voluntaacuterios fumantes e natildeo fumantes Atraveacutes
do uso de nicotina radiomarcada nas amostras de ceacuterebro mostraram que os siacutetios de
ligaccedilatildeo agrave nicotina foram aumentados proporcionamente conforme o nuacutemero de cigarros
por dia O mesmo estudo ao analizar a expressatildeo gecircnica e proteiacutenas em linfoacutecitos e
ceacutelulas polimorfonucleares para um subconjunto de subunidades de receptores
nicotiacutenicos essas ceacutelulas assim como no tecido cerebral exibiram maiores nuacutemeros de
siacutetios de ligaccedilatildeo de alta afinidade agrave nicotina em fumantes em comparaccedilatildeo com natildeo
fumantes
A vareniclina em estudos funcionais mostrou ter atividade agonista total nos
receptores α7 40 Em um estudo realizou-se o tratamento crocircnico com vareniclina eou
nicotina em camundongos (10 dias) os niacuteveis das drogas no ceacuterebro e no plasma e a
toleracircncia e a expressatildeo de 4 subtipos de nAChR apoacutes dose aguda de nicotina foram
checados usando autoradiografia O upregulation de receptores α4β2 devido ao
tratamento crocircnico com vareniclina foi similar ao promovido pela nicotina e tambeacutem
ocorreu dowregulation de α6β2 assim como ocorreu com o uso de nicotina A
vareniclina aumentou significantemente os siacutetios de α3β4 e α7 enquanto a nicotina teve
menor efeito nestes siacutetios A combinaccedilatildeo da nicotina com a vareniclina foi similar agrave
vareniclina sozinha para os siacutetios de α3β4 enquanto para o siacutetio de α7 a combinaccedilatildeo
promoveu upregulation em menos regiotildees cerebrais em comparaccedilatildeo com a vareniclina
em monoterapia 77
77
No presente estudo os pacientes do grupo resistente apresentaram efeito
semelhante associado ao uso combinado de vareniclina e nicotina (devido ao fumo) os
niacuteveis de expressatildeo de CHRNA7 natildeo foram mantidos como nos pacientes que obtiveram
sucesso no tratamento No entanto o grupo sucesso soacute estava utilizando a vareniclina na
ausecircncia de nicotina entre os tempos T2 e T4 o que sugere que esse dowregulation
pode ocorrer em subgrupo de resposta
Diversos estudos mostraram diferenccedilas na expressatildeo gecircnica de a7 em
amostras de pacientes com diagnoacutesticos psiquiaacutetricos em comparaccedilatildeo com indiviacuteduos
sadios 102 128-134
Kunii et al 128 mostraram diferenccedila na expressatildeo de a7 em coacutertex preacute-frontal
dorsolateral post mortem de pacientes com depressatildeo ansiedade e transtorno bipolar e
inuacutemeros estudos mostraram menores niacuteveis de expressatildeo de α7 em pacientes com
esquizofrenia 102 129-134
Estudos de indiviacuteduos com esquizofrenia satildeo oacutetimos modelos para o
entendimento da importacircncia do receptor a7 em processos cognitivos em ND e em
como esses mecanismos estatildeo intimamente relacionados Diversos estudos mostraram
que haacute uma maior prevalecircncia de tabagismo em indiviacuteduos com esquizofrenia
comparados agrave populaccedilatildeo geral 135 136
Mexal el al 102 realizaram um estudo com amostras de ceacuterebro post mortem
provenientes de indiviacuteduos de 4 grupos distintos controle natildeo fumante controle
fumante pacientes com esquizofrenia natildeo fumantes e pacientes com esquizofrenia
fumantes O estudo realizou ensaio de expressatildeo de mRNA e de proteiacutena atraveacutes de
PCR quantitativo em tempo real e western blot As sondas da PCR foram desenhadas
para amplificar o gene completo CHRNA7 e sua coacutepia duplicada o CHRFAM7A Natildeo
fumantes com esquizofrecircnia apresentaram expressatildeo reduzida de mRNA e de proteiacutena
78
em relaccedilatildeo aos pacientes com esquizofrenia fumantes Natildeo fumantes com esquizofrenia
apresentaram menor expressatildeo em relaccedilatildeo ao controle natildeo fumante mas essa diferenccedila
foi estatisticamente significativa apenas no niacutevel do mRNA Outros estudos post
mortem cerebral mostraram menor expressatildeo dos receptores nicotiacutenicos no coacutertex e no
hipocampo de indiviacuteduos com esquizofrecircnia comparado aos controles saudaacuteveis 129-134
O CHRFAM7A assim como o CHRNA7 eacute polimoacuterfico e variantes neste gene
foram associadas agrave patologia auditoacuteria em casos de esquizofrenia Processos
diferenciados nos mecanismos de transcriccedilatildeo podem contribuir para um funcionamento
anormal de a7 como variaccedilotildees em promotor splicing alternativo eou desequiliacutebrio de
ligaccedilatildeo com o SNP do gene de neuroregulina -1 (gene que codifica moleacutecula de adesatildeo
celular envolvida em processos de neuroplasticidade sinaacuteptica) Estes processos podem
estar envonvidos em endofenoacutetipos da doenccedila 122 126 137-144
A nicotina parece melhorar a audiccedilatildeo em indiviacuteduos com deacuteficit auditoacuterio na
esquizofrenia associado ao α7 permitindo uma melhor filtragem dos estiacutemulos
auditivos estranhos A nicotina melhora a cogniccedilatildeo na esquizofrenia e agentes
alternativos que ativam o receptor nicotiacutenico foram testados e esses compostos
melhoraram a atenccedilatildeo a memoacuteria de trabalho e os sintomas negativos em um estudo
complementar de pacientes natildeo fumantes com esquizofrenia 145
Os estudos citados nos mostram grandes evidecircncias da associaccedilatildeo do α7 com
ND processos cognitivos e de resposta agrave vareniclina Esses achados podem explicar
nossos resultados em relaccedilatildeo agrave diminuiccedilatildeo da expressatildeo de 7 no grupo de pacientes
resistentes ao tratamento Os pacientes do grupo sucesso mantiveram os niacuteveis de
expressatildeo gecircnica em resposta agrave vareniclina jaacute no grupo resistente houve um
dowregulation Sugerimos que essa diminuiccedilatildeo pode ter sido a responsaacutevel ao menos
em parte pelos indiviacuteduos natildeo terem conseguido deixar de fumar A nicotina pode estar
79
compensando um deacuteficit de α7 que os indiviacuteduos resistentes podem apresentar No
entanto natildeo sabemos como seria a expressatildeo de α7 nestes indiviacuteduos na ausecircncia do
fumo
Quanto ao gene CHNRG natildeo haacute muitos resultados na literatura Este codifica
a subunidade γ dos receptores nicotiacutenicos A maioria dos estudos aponta associaccedilatildeo da
subunidade com distuacuterbios esqueleacutetico-musculares 146-149
No entanto King et al 65 encontraram a associaccedilatildeo de polimorfismos neste
gene com nausea no tratamento com vareniclina E Keskitalo-Vuokko 150 et al
encontraram associaccedilatildeo de SNPs em loci do cluster de genes CHRNGCHRND (genes
muitos proacuteximos o uacuteltimo codifica a subunidade delta dos nAChRs) com o niacutevel de
cotinina Saccone et al 151 encontraram a associaccedilatildeo de 4 loci no cluster
CHRNDCHRNG com ND Em outro estudo variantes nos genes CHRNDCHRNG
mostraram associaccedilatildeo modesta com o risco de ND em amostras de afro-americanos 152
Em um estudo o qual foi utilizado um modelo de esquizofrenia em ratos no
grupo de animais tratados com clozapina foi encontrado downregulation do Chrng no
nuacutecleo accumbens Neste mesmo estudo Santoro et al natildeo conseguiram formular uma
hipoacutetese para o achado devido ao lack de informaccedilotildees na literatura com o foco em ND
ou performance cognitiva 153
Haacute algumas limitaccedilotildees no estudo Primeira o ensaio da anaacutelise de expressatildeo
gecircnica foi realizado com amostras de sangue perifeacuterico e natildeo no SNC o que poderia nos
mostrar uma relaccedilatildeo mais clara e direta do faacutermaco com a via de resposta No entanto a
obtenccedilatildeo desta amostra eacute inviaacutevel Em contrapartida estudos jaacute demonstraram que haacute
similaridade entre a expressatildeo gecircnica de ceacutelulas do SNC e de ceacutelulas de sangue
perifeacuterico para alguns destes genes de receptores nicotiacutenicos 102 Segunda natildeo foi
realizado ensaio de expressatildeo gecircnica para amostras de indiviacuteduos natildeo fumantes o que
80
poderia fornecer mais paracircmetros de comparaccedilatildeo com os grupos resistente e sucesso
Terceira natildeo conseguimos qualidade necessaacuteria nas anaacutelises de genes potencialmente
importantes
62 Para os dados da mensuraccedilatildeo dos analitos
Um dos maiores desafios em anaacutelises de amostras bioloacutegicas eacute eliminar os
interferentes de sua matriz sem alterar substancialmente as quantidades dos analitos
presentes A matriz de amostras de soro e plasma satildeo complexas e envolve a presenccedila
de inuacutemeras macromoleacuteculas como lipiacutedios e proteiacutenas que obstruem colunas anaacuteliticas
diminuem o tempo de duraccedilatildeo de equipamentos e inviabilizam a interpretaccedilatildeo dos
dados devido a imensos picos e ruiacutedos formados nos cromatogramas e espectros de
massa Inumeros trabalhos executam uma preparaccedilatildeo preacutevia das amostras que envolve
processos como a extraccedilatildeo com uso de solventes preciptaccedilatildeo de proteiacutenas entre outros
os quais podem promover uma baixa recuperaccedilatildeo dos analitos tempo prolongado de
bancada e gasto de materiais 51 104-106
Devido agrave esse fato inuacutemeros estudos propuseram o uso de materiais de acesso
restrito (RAMs) para a purificaccedilatildeo da amostra sem tanto manuseio dentre eles estatildeo os
nanotubos de carbono (CNTs) modificados 109 110 114-116
O presente estudo desenvolveu uma coluna extratora composta por nanotubos
hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados quimicamente com a adiccedilatildeo de grupos
hidrofiacuteficos Essa coluna permitiu uma oacutetima exclusatildeo de macromoleacuteculas (98) A
aacutegua ultra pura foi o suficiente para ser utilizada como fase moacutevel de carregamento o
que eacute sustentaacutevel aleacutem de natildeo causar danos ao meio ambiente e o uacutenico preparo da
amostra foi uma diluiacuteccedilatildeo 11 tambeacutem em aacutegua O novo RAM desenvolvido foi
81
encaminhado para pedido de patente (Anexo 5) e portanto os processos para o seu
desenvolvimento foram mantidos em sigilo
Os CNTs possuem uma grande aacuterea superfiacutecial e oacutetima estabilidade em anaacutelise
de compostos no entanto o material natildeo promove a remoccedilatildeo de proteiacutenas com
eficiecircncia 110 115 Os poros dos CNTs formam uma barreira fiacutesica excluindo ou
permitindo a entrada de moleacuteculas por tamanho e os grupos hidrofiacutelicos adicionados ao
RAM desenvolvido natildeo permitem a ligaccedilatildeo de proteiacutenas de forma irreversiacutevel
formando uma barreira fiacutesico-quiacutemica Os demais CNTs natildeo modificados disponiacuteveis
natildeo promovem a exclusatildeo de macromoleacuteculas com tanta efetividade quanto o material
desenvolvido aleacutem disso o novo RAM apoacutes limpeza pode ser reutilizado cerca de 400
vezes (valor calculado durante os experimentos com amostras controle)
Quanto a otimizaccedilatildeo do meacutetodo de mensuraccedilatildeo a anaacutelise multidimensional
atraveacutes de equipamentos conectados por vaacutelvulas comutadoras promoveu a realizaccedilatildeo
da extraccedilatildeo eluiccedilatildeo anaacutelise limpeza e recondicionamento do sistema automaacuteticamente
A anaacutelise completa de uma amostra foi realizada em apenas 15 minutos O sistema
permitiu a mensuraccedilatildeo conjunta de diversos analitos com caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas
diferentes de uma mesma amostra mostrando bons sinais analiacuteticos e perfis
cromatograacuteficos
Quanto aos dados de validaccedilatildeo o meacutetodo permitiu uma oacutetima recuperaccedilatildeo dos
analitos com valores proacuteximos a 100 semelhante a outros estudos 104 117 154 155 A
maior dificuldade encontrada neste estudo foi a configuraccedilatildeo de paracircmetros
espectromeacutetricos e cromatograacuteficos que pudessem obter o maacuteximo de recuperaccedilatildeo e o
menor LQ possiacutevel para a anaacutelise de vareniclina ainda em um contexto de anaacutelise
multianalito
82
A dose posoloacutegica da vareniclina eacute muito baixa (1mg 2 vezes ao dia a partir do
8deg dia de tratamento) em comparaccedilatildeo com a da bupropiona (150 mg 2 vezes ao dia a
partir do 8deg dia de tratamento) dessa forma as concentraccedilotildees plasmaacuteticas de
vareniclina satildeo muito baixas Apesar do valor de LQ obtido (5 μg L-1) estar entre as
meacutedias plasmaacuteticas de intervalo terapecircutico (40 -70 μg L-1 de vareniclina em plasma e
soro) 51 118 ao mensurar amostras de pacientes em um cenaacuterio real de tratamento de 74
pacientes apenas 3 amostras apresentaram concentraccedilatildeo plasmaacutetica de vareniclina
abaixo do limite de quantificaccedilatildeo
Quanto a recuperaccedilatildeo do analito da matriz a vareniclina tambeacutem mostrou menor
taxa (883) em relaccedilatildeo aos outros analitos (valores proacuteximos ao 100) no entanto
essa taxa de recuperaccedilatildeo eacute considerada alta e foi semelhante ao estudo de Dobrinas et al
156 o qual realizou a extraccedilatildeo da amostra atraveacutes de coluna extratora de fase soacutelida
(SPE) disponiacutevel no mercado e a mensuraccedilatildeo tambeacutem foi realizada em um contexto
multianalito E ainda a recuperaccedilatildeo de vareniclina no presente estudo foi maior do que
a obtida pelo trabalho de Al-Haj et al 105 o qual realizou a preparaccedilatildeo preacutevia da amostra
por extraccedilatildeo liacutequido-liacutequido (LLE) e a mensuraccedilatildeo foi realizada para somente um
analito (4759 - 4872) e obteve recuperaccedilatildeo semelhante ao estudo de os qual
tambeacutem realizou a anaacutelise de vareniclina em um cenaacuterio multianalito (830 ndash 920)
Para nicotina e cotinina os valores de LQ obtidos no presente estudo (50 μg L-1)
se assemelham aos obtidos nos estudos de Abdallah et al 104 (70 μg L-1 para cotinina)
Onoue et al 157 (50 μg L-1 para nicotina e cotinina) Petersen et al 117 (50 μg L-1) Para
bupropiona e hidroxibupropiona o meacutetodo proposto eacute capaz de mensurar pequenas
quantidades do faacutermaco e de seu metaboacutelito (LQ 10 μg L-1 para ambos) quantidades
menores do que os LQs obtidos nos estudos de 158 (55 para bupropiona e 60 μgL para
83
hidroxibupropiona) e de 155 (100 μg L-1 para hidroxibupropiona) apesar das
concentraccedilotildees de metaboacutelitos em estado de equiliacutebrio em pacientes tratados com doses
terapecircuticas do faacutermaco serem bem maiores (45 ndash 75 μg L-1 e de 500 ndash 1500 μg L-1)
respectivamente para bupropiona e hidroxibupropiona 118
O Quadro 6 mostra os paracircmetros analiacuteticos do presente estudo comparados com
outros estudos presentes na literatura
Quanto agraves mensuraccedilotildees das amostras dos pacientes natildeo encontramos associaccedilatildeo
dos faacutermacos e seus metaboacutelitos com desfecho de tratamento Esse fato poderia ser
explicado pelo pequeno nuacutemero amostral do presente estudo
Encontramos diferenccedila significativa entre os grupos resistente e sucesso ao
tratamento quanto aos paracircmetros relacionados ao fumo e agrave DN Os pacientes do grupo
resistente tratados com vareniclina (ainda antes do iniacutecio do tratamento) fumavam um
maior nuacutemero de cigarrosdia em comparaccedilatildeo com os pacientes que obtiveram sucesso
O grupo resistente ao tratamento com bupropiona apresentou maior frequecircncia de
pacientes com alta DN (antes do tratamento) e de pacientes que fumavam no dia da
coleta em comparaccedilatildeo ao grupo sucesso Os dados tambeacutem mostraram que os pacientes
resistentes tratados com ambos os faacutermacos no dia da coleta apresentaram maiores
concentraccedilotildees dos metaboacutelitos da nicotina Esses dados podem indicar maior exposiccedilatildeo
ao fumo e maior DN podendo implicar na resposta ao tratamento antitabagismo
Haacute algumas limitaccedilotildees nesse estudo Primeira os pacientes natildeo fizeram exames
de funccedilatildeo hepaacutetica antes da inclusatildeo no entudo no entanto a presenccedila de comorbidades
hepaacuteticas foram questionadas Segunda natildeo podemos obter total rigor nos horaacuterios de
tomada dos medicamentos por parte dos pacientes no entanto os pacientes foram
84
orientados agrave tomar o medicamento sempre no mesmo horaacuterio e foram questionados
quanto ao cumprimento do protocolo Terceira o nuacutemero amostral para a anaacutelise dos
analitos e de NRM em estudos de associaccedilatildeo com desfecho de tratamento eacute considerado
modesto e consequentemente pode ter implicado nos resultados de natildeo associaccedilatildeo
85
Quadro 6 ndash Comparaccedilatildeo dos dados de validaccedilatildeo com outros estudos
Analitos Purificaccedilatildeo da
amostraextraccedilatildeo Meacutetodo Amostra Intervalo Linear (μg L-1) Recuperaccedilatildeo () LD μg L-1 LQ μg L-1 Referecircncia
Vareniclina
Bupropiona
Hidroxibupropiona
Nicotina
Cotinina
Hidroxicotinina
CS ndash SPE (novo
RAM) HPLC-MSMS Soro humano
50 ndash 1000
10 ndash 10000
10 ndash 20000
50 ndash 10000
50 ndash 10000
50 ndash 10000
883
1101
945
1098
941
1167
25
07
06
19
24
37
50
10
10
50
50
50
Presente
estudo
Nicotitna
Cotinina LLE (LCndashMSMS) Soro humano
03 ndash 525
70 ndash15000
978 ndash 1114
973 ndash1156 -
03
70
Abdalla et al 104
Bupropiona
Hidroxibupropiona PP + SPE online TFCndashMSMS) Soro humano 50 ndash 10000
1580
1160
13
45
55
60
Petrides et
al 158
Vareniclina LLE HPLCndashMSMS
(API) Plasma humano 01ndash100 4759 - 4872 005 01
Al-Haj et al 105
Vareniclina LLE HPLC-
APIMSMS
Plasma
Urina
01 - 500
10 ndash 5000 - -
lt01
100
Faessel et al 51
Nicotina
cotinina
trans-3 ndash
hidroxicotinina
vareniclina
SPE (Oasis MCX 10
mg 96-well extraction
plate)
UPLCndashMSMS
Soro humano
100 ndash 5000
100 ndash 5000
100 - 5000
100 ndash 2500
860 ndash 940
700 ndash 870
490 ndash 540
830 ndash 920
-
20
10
20
10
Dobrinas et
al 156
86
Nicotina
Cotinina Centrifugaccedilatildeo
Diluiccedilatildeo
isotoacutepica estaacutevel
ndash UPLC-
MSMS
Urina 50 ndash 350000 968ndash1051
943ndash992
07
04
17
11
Kuhn et al 154
Nicotina e Cotinina LLE PP SPE
(UPLC-
MSMS)
Sangue urina e
outros tecidos de
rato
100 ndash 6000 (plasma)
80 (nicotina e
cotininacom
precipitaccedilatildeo)
25 50 Onoue et al
157
Cotinina LL SPE (coluna
Zorbaxs XDB C8) HPLCUV Soro e urina 50 ndash 5000 978 ndash 102 018 50
Petersen et
al 117
hidroxibupropiona PP + SPE online RP‐HPLCUV Plasma humano 1000 - 25000 6118 1000 1000
Scherf-
Clavel et al 155
CS ndash SPE= Extraccedilatildeo em fase soacutelida no modo column switching LLE= extraccedilatildeo liacutequido-liacutequido PP=precipitaccedilatildeo de proteiacutenas SPE=extraccedilatildeo em fase soacutelida HPLC= cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia
UPLC=cromatografia liacutequida de ultra eficiecircncia RP‐HPLC=Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia em fase reversa TFC=Cromatografia liacutequida turbulenta API=ionizaccedilatildeo em pressatildeo atmosfeacutericaUV=
detector ultravioleta MSMS= espectometria de massas em tandem
87
7 CONCLUSOtildeES
Para a anaacutelise da expressatildeo gecircnica este estudo exploratoacuterio mostra a associaccedilatildeo
das subunidades α7 e γ com a efetividade do tratamento com vareniclina Estes
resultados poderiam contribuir ao menos em parte para o desenvolvimento de uma
terapecircutica individualizada
Para a mensuraccedilatildeo de analitos o novo RAM sintetizado eacute um produto de
extremo valor cientiacutefico podendo apresentar diversas aplicaccedilotildees em anaacutelise de amostras
de matrizes complexas sem muita preparaccedilatildeo preacutevia Para a associaccedilatildeo das
concentraccedilotildees dos faacutermacos e seus metaboacutelitos com o desfecho de tratamento satildeo
necessaacuterios estudos com um maior nuacutemero amostral
88
8 SUGESTOtildeES PARA ESTUDOS FUTUROS
Sugerimos estudos que promovam maior entendimento das subunidades α7 e γ
dos nAChRs nos processos de dependecircncia agrave nicotina e no tratamento com vareniclina
Sugerimos tambeacutem estudos de investigaccedilatildeo para novas aplicabilidades do novo RAM
desenvolvido
89
9 REFEREcircNCIAS
1 WHO Tobacco WHO Media Centre 2015
2 Oliveira AF Valente JG Leite IC [Aspects of tobacco attributable mortality
systematic review] Rev Saude Publica 200842(2)335-345
3 Koshiaris C Aveyard P Oke J Ryan R Szatkowski L Stevens R Farley A
Smoking cessation and survival in lung upper aero-digestive tract and bladder
cancer cohort study Br J Cancer 2017117(8)1224-1232
4 Leppanen T Toyras J Mervaala E Penzel T Kulkas A Severity of individual
obstruction events increases with age in patients with obstructive sleep apnea
Sleep Med 20173732-37
5 Cerda J Bambs C Vera C Infant morbidity and mortality attributable to
prenatal smoking in Chile Rev Panam Salud Publica 201741e106
6 Vigitel Brasil - Vigilacircncia de fatores de risco e proteccedilatildeo para doenccedilas crocircnicas
por inqueacuterito telefocircnico Estimativas sobre frequecircncia e distribuiccedilatildeo
sociodemograacutefica de fatores de risco e proteccedilatildeo para doenccedilas crocircnicas nas
capitais dos 26 estados brasileiros e no Distrito Federal em 2018 Brasiacutelia 2019
7 Rosemberg J Nicotina Droga Universal Instituto Nacional de Cacircncer
(wwwincagovbr) 2004
8 Kirchenchtein C Chatkin JM Dependecircncia da Nicotina In Diretrizes para
Cessaccedilatildeo do Tabagismo Jornal Brasileiro de Pneumologia Brasiacutelia DF 2004
9 Fagerstoumlm K Uma breve apresentaccedilatildeo da neurofarmacologia e fisiologia da
dependecircncia agrave nicotina In Gigliotti AP Presman S (Eds) Atualizaccedilatildeo no
Tratamento do Tabagismo ABP Sauacutede 2006
10 Gigliotti A Lemos T Quais satildeo os mecanismos da dependecircncia de nicotina
In Manual de Condutas e Praacuteticas em Tabagismo Sociedade Brasileira de
Pneumologia e Tisiologia 2012
11 Divisatildeo de Controle do Tabagismo Coordenaccedilatildeo de Accedilotildees Estrateacutegicas
Instituto Nacional de Cacircncer Silva AG Ministeacuterio da Sauacutede Protocolo cliacutenico
e diretrizes terapecircuticas dependecircncia agrave nicotina 2013
12 Schultz W Multiple reward signals in the brain Nat Rev Neurosci
20001(3)199-207
13 Stolerman IP Jarvis MJ The scientific case that nicotine is addictive
Psychopharmacology (Berl) 1995117(1)2-10 discussion 14-20
90
14 Koob GF Volkow ND Neurocircuitry of addiction Neuropsychopharmacology
200935(1)217-238
15 Martin-Soelch C Neuroadaptive changes associated with smoking structural
and functional neural changes in nicotine dependence Brain Sci 20133(1)159-
176
16 Boening JA Neurobiology of an addiction memory J Neural Transm (Vienna)
2001108(6)755-765
17 Robbins TW Everitt BJ Limbic-striatal memory systems and drug addiction
Neurobiol Learn Mem 200278(3)625-636
18 Everitt BJ Belin D Economidou D Pelloux Y Dalley JW Robbins TW
Review Neural mechanisms underlying the vulnerability to develop compulsive
drug-seeking habits and addiction Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci
2008363(1507)3125-3135
19 Fuentes RM Notkola IL Shemeikka S Tuomilehto J Nissinen A Familial
aggregation of blood pressure a population-based family study in eastern
Finland J Hum Hypertens 200014(7)441-445
20 Gotti C Zoli M Clementi F Brain nicotinic acetylcholine receptors native
subtypes and their relevance Trends Pharmacol Sci 200627(9)482-491
21 Benowitz NL Pharmacology of nicotine addiction smoking-induced disease
and therapeutics Annu Rev Pharmacol Toxicol 20094957-71
22 Benowitz NL Clinical pharmacology of inhaled drugs of abuse implications in
understanding nicotine dependence NIDA Res Monogr 19909912-29
23 Picciotto MR Zoli M Rimondini R Lena C Marubio LM Pich EM Fuxe K
Changeux JP Acetylcholine receptors containing the beta2 subunit are involved
in the reinforcing properties of nicotine Nature 1998391(6663)173-177
24 Maskos U Molles BE Pons S Besson M Guiard BP Guilloux JP Evrard A
Cazala P Cormier A Mameli-Engvall M Dufour N Cloez-Tayarani I
Bemelmans AP Mallet J Gardier AM David V Faure P Granon S Changeux
JP Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of
nicotinic receptors Nature 2005436(7047)103-107
25 Tapper AR McKinney SL Nashmi R Schwarz J Deshpande P Labarca C
Whiteaker P Marks MJ Collins AC Lester HA Nicotine activation of alpha4
receptors sufficient for reward tolerance and sensitization Science
2004306(5698)1029-1032
26 Aberger K Chitravanshi VC Sapru HN Cardiovascular responses to
microinjections of nicotine into the caudal ventrolateral medulla of the rat Brain
Res 2001892(1)138-146
91
27 Levin ED Bettegowda C Blosser J Gordon J AR-R17779 and alpha7
nicotinic agonist improves learning and memory in rats Behav Pharmacol
199910(6-7)675-680
28 Hajos M Hurst RS Hoffmann WE Krause M Wall TM Higdon NR Groppi
VE The selective alpha7 nicotinic acetylcholine receptor agonist PNU-282987
[N-[(3R)-1-Azabicyclo[222]oct-3-yl]-4-chlorobenzamide hydrochloride]
enhances GABAergic synaptic activity in brain slices and restores auditory
gating deficits in anesthetized rats J Pharmacol Exp Ther 2005312(3)1213-
1222
29 Salas R Orr-Urtreger A Broide RS Beaudet A Paylor R De Biasi M The
nicotinic acetylcholine receptor subunit alpha 5 mediates short-term effects of
nicotine in vivo Mol Pharmacol 200363(5)1059-1066
30 Henningfield JE Stapleton JM Benowitz NL Grayson RF London ED Higher
levels of nicotine in arterial than in venous blood after cigarette smoking Drug
Alcohol Depend 199333(1)23-29
31 Hukkanen J Jacob P 3rd Benowitz NL Metabolism and disposition kinetics of
nicotine Pharmacol Rev 200557(1)79-115
32 Dempsey D Tutka P Jacob P 3rd Allen F Schoedel K Tyndale RF Benowitz
NL Nicotine metabolite ratio as an index of cytochrome P450 2A6 metabolic
activity Clin Pharmacol Ther 200476(1)64-72
33 Allenby CE Boylan KA Lerman C Falcone M Precision Medicine for
Tobacco Dependence Development and Validation of the Nicotine Metabolite
Ratio J Neuroimmune Pharmacol 201611(3)471-483
34 Llaquet H Pichini S Joya X Papaseit E Vall O Klein J Garcia-Algar O
Biological matrices for the evaluation of exposure to environmental tobacco
smoke during prenatal life and childhood Anal Bioanal Chem 2010396(1)379-
399
35 Reichert J AA Gonccedilalves CMC Godoy I Chatkin JM Sales MPU et al
Diretrizes da Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisologia Diretrizes para
cessaccedilatildeo do tabagismo ndash 2008 J Bras Pneumol 200834(10)845-880
36 Fiore MC Jaeacuten C R Baker TB Treating tobacco use and dependence 2008
update Clinical Practice Guideline In services USDohah ed Public Health
Service Rockville (md) 2008
37 Kassem MG Al Hossaini AM Varenicline Profiles Drug Subst Excip Relat
Methodol 201237389-411
38 Zoli M Lena C Picciotto MR Changeux JP Identification of four classes of
brain nicotinic receptors using beta2 mutant mice J Neurosci
199818(12)4461-4472
92
39 Hogg RC Raggenbass M Bertrand D Nicotinic acetylcholine receptors from
structure to brain function Rev Physiol Biochem Pharmacol 20031471-46
40 Mihalak KB Carroll FI Luetje CW Varenicline is a partial agonist at
alpha4beta2 and a full agonist at alpha7 neuronal nicotinic receptors Mol
Pharmacol 200670(3)801-805
41 Swan GE Javitz HS Jack LM Wessel J Michel M Hinds DA Stokowksi RP
McClure JB Catz SL Richards J Zbikowski SM Deprey M McAfee T Conti
DV Bergen AW Varenicline for smoking cessation nausea severity and
variation in nicotinic receptor genes Pharmacogenomics J 201212(4)349-358
42 Kaur K Kaushal S Chopra SC Varenicline for smoking cessation A review of
the literature Curr Ther Res Clin Exp 200970(1)35-54
43 Catz SL Jack LM McClure JB Javitz HS Deprey M Zbikowski SM McAfee
T Richards J Swan GE Adherence to varenicline in the COMPASS smoking
cessation intervention trial Nicotine Tob Res 201113(5)361-368
44 Faessel HM Burstein AH Troutman MD Willavize SA Rohrbacher KD Clark
DJ Lack of a pharmacokinetic interaction between a new smoking cessation
therapy varenicline and digoxin in adult smokers Eur J Clin Pharmacol
200864(11)1101-1109
45 Mohanasundaram UM Chitkara R Krishna G Smoking cessation therapy with
varenicline Int J Chron Obstruct Pulmon Dis 20083(2)239-251
46 Faessel HM Smith BJ Gibbs MA Gobey JS Clark DJ Burstein AH Single-
dose pharmacokinetics of varenicline a selective nicotinic receptor partial
agonist in healthy smokers and nonsmokers J Clin Pharmacol 200646(9)991-
998
47 Faessel HM Obach RS Rollema H Ravva P Williams KE Burstein AH A
review of the clinical pharmacokinetics and pharmacodynamics of varenicline
for smoking cessation Clin Pharmacokinet 201049(12)799-816
48 Ravva P Gastonguay MR Tensfeldt TG Faessel HM Population
pharmacokinetic analysis of varenicline in adult smokers Br J Clin Pharmacol
200968(5)669-681
49 Obach RS Reed-Hagen AE Krueger SS Obach BJ OConnell TN Zandi KS
Miller S Coe JW Metabolism and disposition of varenicline a selective
alpha4beta2 acetylcholine receptor partial agonist in vivo and in vitro Drug
Metab Dispos 200634(1)121-130
50 Feng B Obach RS Burstein AH Clark DJ de Morais SM Faessel HM Effect
of human renal cationic transporter inhibition on the pharmacokinetics of
varenicline a new therapy for smoking cessation an in vitro-in vivo study Clin
Pharmacol Ther 200883(4)567-576
93
51 Faessel HM Gibbs MA Clark DJ Rohrbacher K Stolar M Burstein AH
Multiple-dose pharmacokinetics of the selective nicotinic receptor partial
agonist varenicline in healthy smokers J Clin Pharmacol 200646(12)1439-
1448
52 Slemmer JE Martin BR Damaj MI Bupropion is a nicotinic antagonist J
Pharmacol Exp Ther 2000295(1)321-327
53 Hughes JR Stead LF Lancaster T Antidepressants for smoking cessation
Cochrane Database Syst Rev 2007(1)CD000031
54 Goodnick PJ Pharmacokinetics of second generation antidepressants
bupropion Psychopharmacol Bull 199127(4)513-519
55 Hesse LM Venkatakrishnan K Court MH von Moltke LL Duan SX Shader
RI Greenblatt DJ CYP2B6 mediates the in vitro hydroxylation of bupropion
potential drug interactions with other antidepressants Drug Metab Dispos
200028(10)1176-1183
56 Faucette SR Hawke RL Lecluyse EL Shord SS Yan B Laethem RM Lindley
CM Validation of bupropion hydroxylation as a selective marker of human
cytochrome P450 2B6 catalytic activity Drug Metab Dispos 200028(10)1222-
1230
57 Walsky RL Astuccio AV Obach RS Evaluation of 227 drugs for in vitro
inhibition of cytochrome P450 2B6 J Clin Pharmacol 200646(12)1426-1438
58 Walsky RL Obach RS A comparison of 2-phenyl-2-(1-piperidinyl)propane
(ppp) 111-phosphinothioylidynetrisaziridine (thioTEPA) clopidogrel and
ticlopidine as selective inactivators of human cytochrome P450 2B6 Drug
Metab Dispos 200735(11)2053-2059
59 Quaak M van Schooten FJ van Schayck CP Pharmacogenetics of smoking
how far to the clinic Pharmacogenomics 201415(6)723-726
60 Swan GE Lessov-Schlaggar CN Tobacco addiction and pharmacogenetics of
nicotine metabolism J Neurogenet 200923(3)262-271
61 Tomaz PRX Kajita MS Santos JR Scholz J Abe TO Gaya PV Krieger JE
Pereira AC Santos P Cytochrome P450 2A6 and 2B6 polymorphisms and
smoking cessation success in patients treated with varenicline Eur J Clin
Pharmacol201975(11)1541-1545
62 Tomaz PRX Santos JR Scholz J Abe TO Gaya PV Negrao AB Krieger JE
Pereira AC Santos P Cholinergic receptor nicotinic alpha 5 subunit
polymorphisms are associated with smoking cessation success in women BMC
Med Genet201819(1)55
94
63 Scholz J Santos PC Buzo CG Lopes NH Abe TO Gaya PV Pierri H Amorim
C Pereira AC Effects of aging on the effectiveness of smoking cessation
medication Oncotarget 20167(21)30032-30036
64 Issa JS Santos PC Vieira LP Abe TO Kuperszmidt CS Nakasato M Cardoso
E Amorim C Pereira AC Smoking cessation and weight gain in patients with
cardiovascular disease or risk factor Int J Cardiol 2014172(2)485-487
65 King DP Paciga S Pickering E Benowitz NL Bierut LJ Conti DV Kaprio J
Lerman C Park PW Smoking cessation pharmacogenetics analysis of
varenicline and bupropion in placebo-controlled clinical trials
Neuropsychopharmacology 201237(3)641-650
66 Saccone NL Baurley JW Bergen AW David SP Elliott HR Foreman MG
Kaprio J Piasecki TM Relton CL Zawertailo L Bierut LJ Tyndale RF Chen
LS The Value of Biosamples in Smoking Cessation Trials A Review of
Genetic Metabolomic and Epigenetic Findings Nicotine Tob Res
201820(4)403-413
67 Rocha Santos J Tomaz PR Issa JS Abe TO Krieger JE Pereira AC Santos
PC CHRNA4 rs1044396 is associated with smoking cessation in varenicline
therapy Front Genet 2015646
68 Tomaz PR Santos JR Issa JS Abe TO Gaya PV Krieger JE Pereira AC
Santos PC CYP2B6 rs2279343 polymorphism is associated with smoking
cessation success in bupropion therapy Eur J Clin Pharmacol 2015
71(9)1067-73
69 David SP Brown RA Papandonatos GD Kahler CW Lloyd-Richardson EE
Munafo MR Shields PG Lerman C Strong D McCaffery J Niaura R
Pharmacogenetic clinical trial of sustained-release bupropion for smoking
cessation Nicotine Tob Res 20079(8)821-833
70 Lerman C Shields PG Wileyto EP Audrain J Pinto A Hawk L Krishnan S
Niaura R Epstein L Pharmacogenetic investigation of smoking cessation
treatment Pharmacogenetics 200212(8)627-634
71 Han DH Joe KH Na C Lee YS Effect of genetic polymorphisms on smoking
cessation a trial of bupropion in Korean male smokers Psychiatr Genet
200818(1)11-16
72 Zanger UM Klein K Pharmacogenetics of cytochrome P450 2B6 (CYP2B6)
advances on polymorphisms mechanisms and clinical relevance Front Genet
2013424
73 Zhu AZ Cox LS Nollen N Faseru B Okuyemi KS Ahluwalia JS Benowitz
NL Tyndale RF CYP2B6 and bupropions smoking-cessation pharmacology
the role of hydroxybupropion Clin Pharmacol Ther 201292(6)771-777
95
74 Laib AK Brunen S Pfeifer P Vincent P Hiemke C Serum concentrations of
hydroxybupropion for dose optimization of depressed patients treated with
bupropion Ther Drug Monit 201436(4)473-479
75 Hutchison KE Allen DL Filbey FM Jepson C Lerman C Benowitz NL Stitzel
J Bryan A McGeary J Haughey HM CHRNA4 and tobacco dependence from
gene regulation to treatment outcome Arch Gen Psychiatry 200764(9)1078-
1086
76 Smith RC Zhubi A Maloku E Sershen H Lajtha A Davis JM Costa E
Guidotti A Varenicline treatment decreases DNMT1 mRNA expression in
lymphocytes of schizophrenic patients who are cigarette smokers Schizophr
Res 2010119(1-3)269-270
77 Marks MJ ONeill HC Wynalda-Camozzi KM Ortiz NC Simmons EE Short
CA Butt CM McIntosh JM Grady SR Chronic treatment with varenicline
changes expression of four nAChR binding sites in mice Neuropharmacology
201599142-155
78 Middleton FA Pato CN Gentile KL McGann L Brown AM Trauzzi M Diab
H Morley CP Medeiros H Macedo A Azevedo MH Pato MT Gene
expression analysis of peripheral blood leukocytes from discordant sib-pairs
with schizophrenia and bipolar disorder reveals points of convergence between
genetic and functional genomic approaches Am J Med Genet B Neuropsychiatr
Genet 2005136B(1)12-25
79 Takahashi M Hayashi H Watanabe Y Sawamura K Fukui N Watanabe J
Kitajima T Yamanouchi Y Iwata N Mizukami K Hori T Shimoda K Ujike H
Ozaki N Iijima K Takemura K Aoshima H Someya T Diagnostic
classification of schizophrenia by neural network analysis of blood-based gene
expression signatures Schizophr Res 2010119(1-3)210-218
80 Lee J Goh LK Chen G Verma S Tan CH Lee TS Analysis of blood-based
gene expression signature in first-episode psychosis Psychiatry Res
2012200(1)52-54
81 Sullivan PF Fan C Perou CM Evaluating the comparability of gene expression
in blood and brain Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet
2006141B(3)261-268
82 Hennings JM Uhr M Klengel T Weber P Putz B Touma C Czamara D Ising
M Holsboer F Lucae S RNA expression profiling in depressed patients
suggests retinoid-related orphan receptor alpha as a biomarker for antidepressant
response Transl Psychiatry 20155e538
83 Ota VK Noto C Gadelha A Santoro ML Silva PN Melaragno MI Smith Mde
A Cordeiro Q Bressan RA Belangero SI Neurotransmitter receptor and
regulatory gene expression in peripheral blood of Brazilian drug-naive first-
96
episode psychosis patients before and after antipsychotic treatment Psychiatry
Res2013210(3)1290-1292
84 Kordi-Tamandani DM Tajoddini S Salimi F Promoter Methylation and BDNF
and DAT1 Gene Expression Profiles in Patients with Drug Addiction
Pathobiology 201582(2)94-99
85 Wongsriraksa A Parsons ME Whelan CJ Characterisation of nicotine receptors
on human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) Inflamm Res
200958(1)38-44
86 Kawashima K Fujii T Expression of non-neuronal acetylcholine in
lymphocytes and its contribution to the regulation of immune function Front
Biosci 200492063-2085
87 St-Pierre S Jiang W Roy P Champigny C LeBlanc E Morley BJ Hao J
Simard AR Nicotinic Acetylcholine Receptors Modulate Bone Marrow-Derived
Pro-Inflammatory Monocyte Production and Survival PLoS One
201611(2)e0150230
88 Zdanowski R Krzyzowska M Ujazdowska D Lewicka A Lewicki S Role of
alpha7 nicotinic receptor in the immune system and intracellular signaling
pathways Cent Eur J Immunol 201540(3)373-379
89 Baez-Pagan CA Delgado-Velez M Lasalde-Dominicci JA Activation of the
Macrophage alpha7 Nicotinic Acetylcholine Receptor and Control of
Inflammation J Neuroimmune Pharmacol 201510(3)468-476
90 Kalkman HO Feuerbach D Modulatory effects of alpha7 nAChRs on the
immune system and its relevance for CNS disorders Cell Mol Life Sci
201673(13)2511-2530
91 Zakrzewicz A Richter K Agne A Wilker S Siebers K Fink B Krasteva-Christ
G Althaus M Padberg W Hone AJ McIntosh JM Grau V Canonical and
Novel Non-Canonical Cholinergic Agonists Inhibit ATP-Induced Release of
Monocytic Interleukin-1beta via Different Combinations of Nicotinic
Acetylcholine Receptor Subunits alpha7 alpha9 and alpha10 Front Cell
Neurosci201711189
92 Arreola R Alvarez-Herrera S Perez-Sanchez G Becerril-Villanueva E Cruz-
Fuentes C Flores-Gutierrez EO Garces-Alvarez ME de la Cruz-Aguilera DL
Medina-Rivero E Hurtado-Alvarado G Quintero-Fabian S Pavon L
Immunomodulatory Effects Mediated by Dopamine J Immunol
Res20163160486
93 Nakajima M Yamamoto T Nunoya K Yokoi T Nagashima K Inoue K Funae
Y Shimada N Kamataki T Kuroiwa Y Role of human cytochrome P4502A6 in
C-oxidation of nicotine Drug Metab Dispos 199624(11)1212-1217
97
94 Messina ES Tyndale RF Sellers EM A major role for CYP2A6 in nicotine C-
oxidation by human liver microsomes J Pharmacol Exp Ther
1997282(3)1608-1614
95 Chen A Krebs NM Zhu J Muscat JE Nicotine metabolite ratio predicts
smoking topography The Pennsylvania Adult Smoking Study Drug Alcohol
Depend201819089-93
96 Shahab L BL McNeill Tyndale RF Does the nicotine metabolite ratio
moderate smoking cessation treatment outcomes in real-world settings A
prospective study Addiction 2019114(2)304-314 doi 101111add14450
97 Lea RA Dickson S Benowitz NL Within-subject variation of the salivary
3HCCOT ratio in regular daily smokers prospects for estimating CYP2A6
enzyme activity in large-scale surveys of nicotine metabolic rate J Anal Toxicol
200630(6)386-389
98 Mooney ME Li ZZ Murphy SE Pentel PR Le C Hatsukami DK Stability of
the nicotine metabolite ratio in ad libitum and reducing smokers Cancer
Epidemiol Biomarkers Prev 200817(6)1396-1400
99 Piestansky J Marakova K Veizerova L Galba J Mikus P On-line column
coupled isotachophoresis-capillary zone electrophoresis hyphenated with
tandem mass spectrometry in drug analysis varenicline and its metabolite in
human urine Anal Chim Acta 201482684-93
100 Fagerstrom KO Heatherton TF Kozlowski LT Nicotine addiction and its
assessment Ear Nose Throat J 199069(11)763-765
101 Issa JS A new nicotine dependence score and a new scale assessing patient
comfort during smoking cessation treatment J Bras Pneumol 201238(6)761-
765
102 Mexal S Berger R Logel J Ross RG Freedman R Leonard S Differential
regulation of alpha7 nicotinic receptor gene (CHRNA7) expression in
schizophrenic smokers J Mol Neurosci 201040(1-2)185-195
103 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-
time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods
200125(4)402-408
104 Abdallah IA Hammell DC Stinchcomb AL Hassan HE A fully validated LC-
MSMS method for simultaneous determination of nicotine and its metabolite
cotinine in human serum and its application to a pharmacokinetic study after
using nicotine transdermal delivery systems with standard heat application in
adult smokers J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2016102067-
77
98
105 Al-Haj A Alawi M Arafat T Hourani MK Method development validation
and bioequivalence of varenicline in human plasma by liquid chromatography
tandem mass spectrometry J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci
2013931134-139
106 Hegstad S Stray-Pedersen A Olsen L Vege A Rognum TO Morland J
Christophersen AS Determination of cotinine in pericardial fluid and whole
blood by liquid chromatography-tandem mass spectrometry J Anal Toxicol
200933(4)218-222
107 Santos MG Moraes Gde O Nakamura MG dos Santos-Neto AJ Figueiredo
EC Restricted access molecularly imprinted polymers obtained by bovine serum
albumin andor hydrophilic monomers external layers a comparison related to
physical and chemical properties Analyst 2015140(22)7768-7775
108 de Lima MM Vieira AC Martins I Boralli VB Borges KB Figueiredo EC
On-line restricted access molecularly imprinted solid phase extraction of
ivermectin in meat samples followed by HPLC-UV analysis Food Chem
2015197(Pt A)7-13
109 Barbosa AF Barbosa VM Bettini J Luccas PO Figueiredo EC Restricted
access carbon nanotubes for direct extraction of cadmium from human serum
samples followed by atomic absorption spectrometry analysis Talanta
2016131213-220
110 de Faria HD Abrao LC Santos MG Barbosa AF Figueiredo EC New
advances in restricted access materials for sample preparation A review Anal
Chim Acta 201795943-65
111 FRANQUI L S et al Synthesis and characterization of a magnetic molecularly
imprinted polymer for the selective extraction of nicotine and cotinine from
urine samples followed by GC-MS analysis Anal Methods 2015 7(21) 9237ndash
9244 2015
112 Santos MG Tavares IM Barbosa AF Bettini J Figueiredo EC Analysis of
tricyclic antidepressants in human plasma using online-restricted access
molecularly imprinted solid phase extraction followed by direct mass
spectrometry identificationquantification Talanta 20171638-16
113 US Department of Health and Human Services Food and Drug Administration
(FDA) Center for Drug Evaluation and Research (CDER)Center for Veterinary
Medicine (CVM) Guidance for IndustryBioanalytical method validation
Biopharmaceutics 2013
114 GOMES Raphael A B et al Evaluation of the pH influence on protein
exclusion by restricted access carbono nanotubes coated with bovine serum
albumin Journal Of Materials Science 2016 51(16)7407-7414
99
115 de Faria HD Rosa MA Silveira AT Figueiredo EC Direct extraction of
tetracyclines from bovine milk using restricted access carbon nanotubes in a
column switching liquid chromatography system Food Chem 201722598-106
116 de Faria HD Bueno CT Krieger JE Krieger EM Pereira AC Santos P
Figueiredo EC Online extraction of antihypertensive drugs and their metabolites
from untreated human serum samples using restricted access carbon nanotubes
in a column switching liquid chromatography system J Chromatogr A
2017152841-52
117 Petersen GO Leite CE Chatkin JM Thiesen FV Cotinine as a biomarker of
tobacco exposure development of a HPLC method and comparison of matrices
J Sep Sci 201033(4-5)516-521
118 Brunen S Vincent PD Baumann P Hiemke C Havemann-Reinecke U
Therapeutic drug monitoring for drugs used in the treatment of substance-related
disorders literature review using a therapeutic drug monitoring appropriateness
rating scale Ther Drug Monit 201133(5)561-572
119 Ryan RE Loiacono RE Nicotine regulates alpha7 nicotinic receptor subunit
mRNA implications for nicotine dependence Neuroreport 200112(3)569-
572
120 Cameli C Bacchelli E De Paola M Giucastro G Cifiello S Collo G Cainazzo
MM Pini LA Maestrini E Zoli M Genetic variation in CHRNA7 and
CHRFAM7A is associated with nicotine dependence and response to varenicline
treatment Eur J Hum Genet 201826(12)1824-1831
121 Wallace TL Bertrand D Importance of the nicotinic acetylcholine receptor
system in the prefrontal cortex Biochem Pharmacol 201385(12)1713-1720
122 Dempster EL Toulopoulou T McDonald C Bramon E Walshe M Wickham H
Sham PC Murray RM Collier DA Episodic memory performance predicted by
the 2bp deletion in exon 6 of the alpha 7-like nicotinic receptor subunit gene
Am J Psychiatry 2006163(10)1832-1834
123 Enioutina EY Myers EJ Tvrdik P Hoidal JR Rogers SW Gahring LC The
nicotinic receptor Alpha7 impacts the mouse lung response to LPS through
multiple mechanisms PLoS One 201510(3)e0121128
124 Sinkus ML Graw S Freedman R Ross RG Lester HA Leonard S The human
CHRNA7 and CHRFAM7A genes A review of the genetics regulation and
function Neuropharmacology 201596(Pt B)274-288
125 Gault J Robinson M Berger R Drebing C Logel J Hopkins J Moore T Jacobs
S Meriwether J Choi MJ Kim EJ Walton K Buiting K Davis A Breese C
Freedman R Leonard S Genomic organization and partial duplication of the
human alpha7 neuronal nicotinic acetylcholine receptor gene (CHRNA7)
Genomics 199852(2)173-185
100
126 Riley B Williamson M Collier D Wilkie H Makoff A A 3-Mb map of a large
Segmental duplication overlapping the alpha7-nicotinic acetylcholine receptor
gene (CHRNA7) at human 15q13-q14 Genomics 200279(2)197-209
127 Benhammou K Lee M Strook M Sullivan B Logel J Raschen K Gotti C
Leonard S [(3)H]Nicotine binding in peripheral blood cells of smokers is
correlated with the number of cigarettes smoked per day Neuropharmacology
200039(13)2818-2829
128 Kunii Y Zhang W Xu Q Hyde TM McFadden W Shin JH Deep-Soboslay A
Ye T Li C Kleinman JE Wang KH Lipska BK CHRNA7 and CHRFAM7A
mRNAs co-localized and their expression levels altered in the postmortem
dorsolateral prefrontal cortex in major psychiatric disorders Am J Psychiatry
2015172(11)1122-1130
129 Breese CR Lee MJ Adams CE Sullivan B Logel J Gillen KM Marks MJ
Collins AC Leonard S Abnormal regulation of high affinity nicotinic receptors
in subjects with schizophrenia Neuropsychopharmacology 200023(4)351-
364
130 Freedman R Hall M Adler LE Leonard S Evidence in postmortem brain tissue
for decreased numbers of hippocampal nicotinic receptors in schizophrenia Biol
Psychiatry 199538(1)22-33
131 Guan ZZ Zhang X Blennow K Nordberg A Decreased protein level of
nicotinic receptor alpha7 subunit in the frontal cortex from schizophrenic brain
Neuroreport 199910(8)1779-1782
132 Martin-Ruiz CM Haroutunian VH Long P Young AH Davis KL Perry EK
Court JA Dementia rating and nicotinic receptor expression in the prefrontal
cortex in schizophrenia Biol Psychiatry 200354(11)1222-1233
133 Marutle A Zhang X Court J Piggott M Johnson M Perry R Perry E
Nordberg A Laminar distribution of nicotinic receptor subtypes in cortical
regions in schizophrenia J Chem Neuroanat 200122(1-2)115-126
134 Leonard S Breese C Adams C Benhammou K Gault J Stevens K Lee M
Adler L Olincy A Ross R Freedman R Smoking and schizophrenia abnormal
nicotinic receptor expression Eur J Pharmacol 2000393(1-3)237-242
135 Kumari V Postma P Nicotine use in schizophrenia the self medication
hypotheses Neurosci Biobehav Rev 200529(6)1021-1034
136 de Leon J Diaz FJ A meta-analysis of worldwide studies demonstrates an
association between schizophrenia and tobacco smoking behaviors Schizophr
Res 200576(2-3)135-157
101
137 Flomen RH Collier DA Osborne S Munro J Breen G St Clair D Makoff AJ
Association study of CHRFAM7A copy number and 2 bp deletion
polymorphisms with schizophrenia and bipolar affective disorder Am J Med
Genet B Neuropsychiatr Genet 2006141B(6)571-575
138 Gault J Hopkins J Berger R Drebing C Logel J Walton C Short M Vianzon
R Olincy A Ross RG Adler LE Freedman R Leonard S Comparison of
polymorphisms in the alpha7 nicotinic receptor gene and its partial duplication
in schizophrenic and control subjects Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet
2003123B(1)39-49
139 Perl O Strous RD Dranikov A Chen R Fuchs S Low levels of alpha7-
nicotinic acetylcholine receptor mRNA on peripheral blood lymphocytes in
schizophrenia and its association with illness severity Neuropsychobiology
200653(2)88-93
140 Raux G Bonnet-Brilhault F Louchart S Houy E Gantier R Levillain D Allio
G Haouzir S Petit M Martinez M Frebourg T Thibaut F Campion D The -2
bp deletion in exon 6 of the alpha 7-like nicotinic receptor subunit gene is a risk
factor for the P50 sensory gating deficit Mol Psychiatry 20027(9)1006-1011
141 Leonard S Gault J Hopkins J Logel J Vianzon R Short M Drebing C Berger
R Venn D Sirota P Zerbe G Olincy A Ross RG Adler LE Freedman R
Association of promoter variants in the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor
subunit gene with an inhibitory deficit found in schizophrenia Arch Gen
Psychiatry 200259(12)1085-1096
142 Mathew SV Law AJ Lipska BK Davila-Garcia MI Zamora ED Mitkus SN
Vakkalanka R Straub RE Weinberger DR Kleinman JE Hyde TM Alpha7
nicotinic acetylcholine receptor mRNA expression and binding in postmortem
human brain are associated with genetic variation in neuregulin 1 Hum Mol
Genet 200716(23)2921-2932
143 Severance EG Yolken RH Novel alpha7 nicotinic receptor isoforms and
deficient cholinergic transcription in schizophrenia Genes Brain Behav
20087(1)37-45
144 Severance EG Dickerson FB Stallings CR Origoni AE Sullens A Monson
ET Yolken RH Differentiating nicotine- versus schizophrenia-associated
decreases of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor transcript CHRFAM7A
in peripheral blood lymphocytes J Neural Transm (Vienna) 2009116(2)213-
220
145 Olincy A Freedman R Nicotinic mechanisms in the treatment of psychotic
disorders a focus on the alpha7 nicotinic receptor Handb Exp Pharmacol
2012 (213)211-232
146 Kariminejad A Almadani N Khoshaeen A Olsson B Moslemi AR Tajsharghi
H Truncating CHRNG mutations associated with interfamilial variability of the
102
severity of the Escobar variant of multiple pterygium syndrome BMC
Genet201617(1)71
147 Liu Y Wang L Yang YK Liang Y Zhang TJ Liang N Yang LM Li SJ Shan
D Wu QQ Prenatal diagnosis of fetal skeletal dysplasia using targeted next-
generation sequencing an analysis of 30 cases Diagn Pathol 201914(1)76
148 Natera-de Benito D Topf A Vilchez JJ Gonzalez-Quereda L Dominguez-
Carral J Diaz-Manera J Ortez C Bestue M Gallano P Dusl M Abicht A
Muller JS Senderek J Garcia-Ribes A Muelas N Evangelista T Azuma Y
McMacken G Paipa Merchan A Rodriguez Cruz PM Camacho A Jimenez E
Miranda-Herrero MC Santana-Artiles A Garcia-Campos O Dominguez-Rubio
R Olive M Colomer J Beeson D Lochmuller H Nascimento A Molecular
characterization of congenital myasthenic syndromes in Spain Neuromuscul
Disord 201727(12)1087-1098
149 Seo J Choi IH Lee JS Yoo Y Kim NK Choi M Ko JM Shin YB Rare cases
of congenital arthrogryposis multiplex caused by novel recurrent CHRNG
mutations J Hum Genet 201560(4)213-215
150 Keskitalo-Vuokko K Pitkaniemi J Broms U Heliovaara M Aromaa A Perola
M Ripatti S Salminen O Salomaa V Loukola A Kaprio J Associations of
nicotine intake measures with CHRN genes in Finnish smokers Nicotine Tob
Res201113(8)686-690
151 Saccone NL Saccone SF Hinrichs AL Stitzel JA Duan W Pergadia ML
Agrawal A Breslau N Grucza RA Hatsukami D Johnson EO Madden PA
Swan GE Wang JC Goate AM Rice JP Bierut LJ Multiple distinct risk loci
for nicotine dependence identified by dense coverage of the complete family of
nicotinic receptor subunit (CHRN) genes Am J Med Genet B Neuropsychiatr
Genet 2009150B(4)453-466
152 Saccone NL Schwantes-An TH Wang JC Grucza RA Breslau N Hatsukami
D Johnson EO Rice JP Goate AM Bierut LJ Multiple cholinergic nicotinic
receptor genes affect nicotine dependence risk in African and European
Americans Genes Brain Behav 20109(7)741-750
153 Santoro ML Ota VK Stilhano RS Silva PN Santos CM Diana MC Gadelha
A Bressan RA Melaragno MI Han SW Abilio VC Belangero SI Effect of
antipsychotic drugs on gene expression in the prefrontal cortex and nucleus
accumbens in the spontaneously hypertensive rat (SHR) Schizophr Res
2014157(1-3)163-168
154 Kuhn J Vollmer T Martin C Hendig D Knabbe C Fast and sample cleanup-
free measurement of nicotine and cotinine by stable isotope dilution ultra-
performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry J Pharm
Biomed Anal 201267-68137-143
103
155 Scherf-Clavel M Wahl O Menke A Unterecker S Determination of
hydroxybupropion in human serum for routine therapeutic drug monitoring in
psychiatry A tool for dose-individualization in treatment with bupropion
Biomed Chromatogr 201933(10)e4609
156 Dobrinas M Choong E Noetzli M Cornuz J Ansermot N Eap CB
Quantification of nicotine cotinine trans-3-hydroxycotinine and varenicline in
human plasma by a sensitive and specific UPLC-tandem mass-spectrometry
procedure for a clinical study on smoking cessation J Chromatogr B Analyt
Technol Biomed Life Sci 2011879(30)3574-3582
157 Onoue S Yamamoto N Seto Y Yamada S Pharmacokinetic study of nicotine
and its metabolite cotinine to clarify possible association between smoking and
voiding dysfunction in rats using UPLCESI-MS Drug Metab Pharmacokinet
201126(4)416-422
158 Petrides AK Moskowitz J Johnson-Davis KL Jannetto PJ Langman LJ Clarke
W Marzinke MA The development and validation of a turbulent flow-liquid
chromatography-tandem mass spectrometric method for the simultaneous
quantification of citalopram sertraline bupropion and hydroxybupropion in
serum Clin Biochem 201447(15)73-79
Rubrica participante Rubrica pesquisador
APEcircNDICE - TCLE
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
HOSPITAL DAS CLIacuteNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SAtildeO
PAULO-HCFMUSP
Registro das explicaccedilotildees do pesquisador ao paciente ou seu representante legal sobre a pesquisa consignando
Vocecirc estaacute sendo convidado (a) a participar de um projeto de pesquisa Este projeto tem
como objetivos principais para os indiviacuteduos fumantes submetidos aos tratamentos
farmacoloacutegicos antitabagismo associar o efeito das caracteriacutesticas geneacuteticas (DNA ou RNA) e do
metabolismo (concentraccedilatildeo dos produtos de metabolismo dos medicamentos no sangue) com a
eficiecircncia do tratamento antitabagismo O objetivo do estudo eacute saber por que algumas pessoas
respondem bem aos medicamentos antitabagismo enquanto outras pessoas natildeo respondem e
consequentemente natildeo conseguem parar de fumar Para isto precisaremos de amostras de
sangue cuja quantidade eacute comumente solicitada em exames laboratoriais de rotina (2 tubos a
cada visita = 20mL) Precisaremos tambeacutem do seu consentimento para que dados de seu
prontuaacuterio meacutedico sejam consultados Para os pacientes que utilizaratildeo o medicamento
bupropiona precisaremos de amostras de sangue na primeira consulta (visita T-1) e duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento medicamentoso (visita T2) Para os pacientes que utilizaratildeo
o medicamento vareniclina precisaremos de uma amostra de sangue na primeira consulta (visita
T-1) na segunda consulta ndash ainda antes de iniciar o tratamento com medicamento (visita T0) duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento medicamentoso (visita T2) e quatro semanas apoacutes o iniacutecio
do tratamento medicamentoso (visita T4) Os desconfortos mais comuns que podem ocorrer com
sua participaccedilatildeo neste estudo satildeo os mesmos de uma coleta de sangue no braccedilo por exemplo
leve dor no local da punccedilatildeo e eventualmente hematoma local Este sangue seraacute encaminhado
ao Laboratoacuterio de Geneacutetica e Cardiologia Molecular do Instituto do Coraccedilatildeo onde seraacute
armazenado somente para a pesquisa Sua participaccedilatildeo eacute totalmente voluntaacuteria Apoacutes ler
entender e esclarecer suas duacutevidas vocecirc assinaraacute 2 vias de igual teor desse documento (termo de
consentimento Livre e Esclarecido) Ainda vocecirc poderaacute solicitar o seu desligamento deste projeto
a qualquer momento bastando para tal entrar em contato os pesquisadores no tel (11) 2661-5592
ou 2661-5995 Em qualquer etapa do estudo vocecirc teraacute acesso aos profissionais responsaacuteveis
pela pesquisa para esclarecimento de eventuais duacutevidas O pesquisador responsaacutevel eacute a Dra
Jaqueline Scholz que pode ser encontrada no endereccedilo Av Dr Eneacuteas de Carvalho Aguiar 44
Instituto do Coraccedilatildeo Bloco 2 andar 1 Programa Ambulatorial de Tratamento Tabagismo
INCOR-HCFMUSP telefone (11) 2661-5592 Se vocecirc tiver alguma consideraccedilatildeo ou duacutevida sobre
a eacutetica da pesquisa entre em contato com o Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa (CEP) ndash Rua Oviacutedio
Pires de Campos 225 ndash 5ordm andar ndash tel (11) 2661-7585 FAX (011) 2661-7585 ndash e-mail
Rubrica participante Rubrica pesquisador
cappesqadmhcfmuspbr Poderaacute tambeacutem solicitar a destruiccedilatildeo das amostras que estaratildeo
armazenadas no mesmo laboratoacuterio
As informaccedilotildees obtidas seratildeo analisadas em conjunto com outros pacientes natildeo sendo
divulgada a identificaccedilatildeo de nenhum paciente Natildeo haveraacute nenhuma despesa por parte do
participante Tambeacutem natildeo haacute compensaccedilatildeo financeira relacionada agrave sua participaccedilatildeo
Benefiacutecio direto para o participante eacute a possibilidade de parar de fumar e ser bem monitorado
durante todo o processo de 12 semanas
Estas informaccedilotildees poderatildeo auxiliar na elaboraccedilatildeo de programas eficazes para o uso
da informaccedilatildeo das caracteriacutesticas individuais em usuaacuterios de medicamentos antitabagismo
Acredito ter sido suficientemente informado a respeito das informaccedilotildees que li ou que
foram lidas para mim descrevendo o estudo ldquoAnaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de
expressatildeo gecircnica dos genoacutetipos preditores de metabolizaccedilatildeo e das concentraccedilotildees de
metaboacutelitos com a resposta ao tratamento antitabagismordquo Eu discuti com o Dra Jaqueline
Scholz com a Juliana da Rocha dos Santos eou Paulo Roberto Xavier Tomaz sobre a minha
decisatildeo em participar nesse estudo Ficaram claros para mim quais satildeo os propoacutesitos do
estudo os procedimentos a serem realizados seus desconfortos e riscos as garantias de
confidencialidade e de esclarecimentos permanentes Concordo voluntariamente em participar
deste estudo e poderei retirar o meu consentimento a qualquer momento antes ou durante o
mesmo sem penalidades ou prejuiacutezo ou perda de qualquer benefiacutecio que eu possa ter
adquirido ou no meu atendimento neste Serviccedilo
_____________________________________________________________________________________
Assinatura do pacienterepresentante legal Data
____________________________________________________________________________
Assinatura da testemunha Data
para casos de pacientes menores de 18 anos analfabetos semi-analfabetos ou portadores de deficiecircncia auditiva ou visual
(Somente para o responsaacutevel do projeto)
Declaro que obtive de forma apropriada e voluntaacuteria o Consentimento Livre e Esclarecido deste
paciente ou representante legal para a participaccedilatildeo neste estudo
____________________________________________________________________________
Assinatura do pesquisador Data
Rubrica participante Rubrica pesquisador
DADOS DE IDENTIFICACcedilAtildeO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSAacuteVEL LEGAL
1NOME
DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nordm SEXO M F
DATA NASCIMENTO
ENDERECcedilO NordmAPTO
BAIRROCIDADE
ESTADOCEPTELEFONE()
2RESPONSAacuteVEL LEGAL
NATUREZA (grau de parentesco tutor curador etc)
DOCUMENTO DE IDENTIDADE SEXO M F
DATA DE NASCIMENTOENDERECcedilO
Nordm APTO
BAIRROCIDADE ESTADOCEPTELEFONE() ___________________________________________________________________________________________________________________________
DADOS SOBRE A PESQUISA
1 TIacuteTULO DO SUBPROJETO DE PESQUISA ldquoAnaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de expressatildeo gecircnica dos genoacutetipos
preditores de metabolizaccedilatildeo e das concentraccedilotildees de metaboacutelitos com a resposta ao tratamento antitabagismordquo
PESQUISADOR RESPONSAacuteVEL Dr Jaqueline Scholz
CARGOFUNCcedilAtildeO Meacutedico Assistente Meacutedico Pesquisador ndash InCor ndash HCFMUSP CRM SP nordm 60179
UNIDADE DO HCFMUSP Programa Ambulatorial de Tratamento Tabagismo InCor-HCFMUSP
PESQUISADOR EXECUTANTE Juliana da Rocha dos Santos CRF SP nordm 62776
CARGOFUNCcedilAtildeO POacuteS-GRADUANDAndash InCor ndash HCFMUSP
UNIDADE DO HC-FMUSP Laboratoacuterio de Geneacutetica e Cardiologia Molecular InCor-HCFMUSP
3 AVALIACcedilAtildeO DO RISCO DA PESQUISA
RISCO MIacuteNIMO RISCO MEacuteDIO
RISCO BAIXO x RISCO MAIOR
4 DURACcedilAtildeO DA PESQUISA 4 anos
ANEXO 1 ndash Aprovaccedilatildeo no Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa
ANEXO 2 - Teste de Fagerstroumlm para a dependecircncia agrave nicotina (versatildeo em Portuguecircs)
Fonte Pietrobon RC Barbisan JN Manfroi WC Utilizaccedilatildeo do teste de dependecircncia agrave nicotina de
Fagerstroumlm como um instrumento de medida do grau de dependecircncia Versatildeo em Portuguecircs Rev HCPA
200727(3)31-6
ANEXO 3 - Escore de consumo situacional Issa
Fonte Issa J S Um novo escore para dependecircncia a nicotina e uma nova escala de conforto do paciente durante
o tratamento do tabagismo J Bras Pneumol 38(6) 761-5
ANEXO 4 ndash Desenho de estudo do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticos na escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismordquo
Desenho do estudo Seraacute randomizado em dois braccedilos um nuacutemero amostral total de 300 pacientes No braccedilo da esquerda 150 pacientes seratildeo tratados com base em teste geneacutetico para os
polimorfismos CYP2B6 (rs2279343) e CHRNA4 (rs1044396) No braccedilo da direita 150 pacientes faratildeo o tratamento tradicional com vareniclina (o faacutermaco de maior efetividade no tratamento
antitabagismo) Em um estudo anterior nosso grupo de pesquisadores 5152 mostrou maior sucesso terapecircutico nos pacientes portadores dos genoacutetipos AA para o gene CYP2B6 nos pacientes
tratados com bupropiona e nos portadores dos genoacutetipos CT e TT para o gene CHRNA4 nos pacientes tratados com vareniclina A escolha do tratamento no braccedilo farmacogeneacutetico prioriza o
tratamento mais barato (bupropiona) dessa forma primeiramente eacute analisado o genoacutetipo para o rs2279343 se o paciente apresentar o genoacutetipo AA o mesmo eacute tratado com bupropiona se ele tiver
o genoacutetipo AG ou GG eacute analisado o genoacutetipo para o polimorfismo rs1044396 Se o paciente apresentar o genoacutetipo CT ou TT para o rs1044396 ele eacute tratado com vareniclina se ele apresentar o
genoacutetipo CC (natildeo favoraacutevel a nenhum dos faacutermacos) ele eacute tratado com vareniclina e bupropiona em uso concomitante Seraacute comparado o custo-efetividade do tratamento baseado em
farmacogeneacutetica em relaccedilatildeo ao tratamento com vareniclina Os pacientes satildeo acompanhados por 12 semanas durante o tratamento farmacoloacutegico visita inicial (T-1) antes do iniacutecio da terapecircutica
(T0) 2 4 6 8 e 12 semanas apoacutes o tratamento (T2 T4 T6 T8 T12) Obs Os pacientes que natildeo conseguirem parar de fumar ateacute a 4 ordf semana de tratamento em monoterapia eacute adicionada a
segunda medicaccedilatildeo Fonte Eficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticos na escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismo InCor-HCFMUSP Projeto de doutorado da Dra Patriacutecia Viviane Gaya
sob a orientaccedilatildeo da Dr Jaqueline R Scholz desenvolvido a partir dos resultados dos estudos da nossa equipe de pesquisadores Rocha Santos et al 2015 67 e Tomaz et al 2015 68
ANEXO 5 ndash Pedido de depoacutesito de patente na Agecircncia de Inovaccedilatildeo e Empreendedorismo da
Universidade Federal de Alfenas-MG
Fernanda Karina Mariliza Renata Carmona Ana Piesco Ednalva e Andreacuteia e
Maacutercio
Agradeccedilo a instruccedilatildeo e auxiacutelio na parte teacutecnica desse trabalho e muito obrigada
pela amizade companhia conselhos brincadeiras e almoccedilos juntos
Aos doutores Eduardo Costa de Figueiredo Henrique Dipe Faria e Isarita
Martins do LATF (Unifal MG)
Obrigada pela colaboraccedilatildeo neste trabalho Obrigada por esse produto maravilhoso
desenvolvido no laboratoacuterio de vocecircs (o novo RAM) Tenho a certeza que seraacute de
grande aplicabilidade Obrigada pela mensuraccedilatildeo das amostras Henrique muito
obrigada pela paciecircncia em explicar o trabalho que vocecircs realizaram Muito obrigada
pelo tempo disponibilizado e pelos dados fornecidos
Ao Prof Dr Joseacute Eduardo Krieger e ao LGCM (FMUSP)
Obrigada por disponibilizar a infraestutura do laboratoacuterio equipamentos
materiais e reagentes para execuccedilatildeo deste trabalho
Aos membros titulares e suplentes da banca examinadora
Muito obrigada pelo aceite do convite e por todas as sugestotildees e contribuiccedilotildees
Agrave FAPESP agrave CAPES e agrave CNPQ
Agradeccedilo o apoio financeiro para a execuccedilatildeo desse trabalho
A Deus
Pai muito obrigada pelo Senhor ter me dado essa oportunidade maravilhosa O
Senhor sempre me preparou o melhor e creio que continuaraacute preparando Obrigada
por me dar forccedilas em todos os momentos Te amo
Agrave minha famiacutelia
Obrigada por toda compreensatildeo Obrigada pelo apoio e por terem acreditado
na minha capacidade Vocecircs satildeo uma becircnccedilatildeo e essenciais na minha vida Amo vocecircs
Ao meu marido Sidnei
Lindo te amo muito Obrigada por ter me incentivado Obrigada pelos chaacutes
chocolates e comindinhas que vocecirc sempre ia me trazendo enquanto eu estava
escrevendo este trabalho Obrigada por ter me ajudado nas tarefas domeacutesticas tambeacutem
para que eu pudesse ter tempo para me dedicar Obrigada por todo amor carinho e
cumplicidade Vocecirc eacute um marido excelente
ldquoPorque os meus pensamentos natildeo satildeo os vossos pensamentos nem os vossos
caminhos os meus caminhos diz o Senhor Porque assim como os ceacuteus satildeo mais
altos do que a terra assim satildeo os meus caminhos mais altos do que os vossos
caminhos e os meus pensamentos mais altos do que os vossos pensamentos rdquo
Isaiacuteas 5589
Esta tese estaacute de acordo com as seguintes normas em vigor no momento desta
publicaccedilatildeo
Referecircncias adaptado de International Committee of Medical Journals Editors
(Vancouver)
Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Medicina Divisatildeo de Biblioteca e
Documentaccedilatildeo Guia de apresentaccedilatildeo de dissertaccedilotildees teses e monografias Elaborado
por Anneliese Carneiro da Cunha Maria Julia de A L Freddi Maria F Crestana
Marinalva de Souza Aragatildeo Suely Campos Cardoso Valeacuteria Vilhena 3a ed Satildeo Paulo
Divisatildeo de Biblioteca e Documentaccedilatildeo 2011 Abreviaturas dos tiacutetulos dos perioacutedicos
de acordo com List of Journals Indexed in Index Medicus
SUMAacuteRIO
LISTA DE ABREVIATURAS SIacuteMBOLOS E SIGLAS
LISTA DE EQUACcedilOtildeES
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE QUADROS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
11 Nicotina farmacodinacircmica e farmacocineacutetica 3
12 Faacutermacos antitabagismo 5
121 Vareniclina 6
1211 Farmacodinacircmica 6
1212 Farmacocineacutetica 7
122 Bupropiona 9
1221 Farmacodinacircmica 9
1222 Farmacocineacutetica 10
13 Pesquisa de biomarcadores 11
131 Estudos farmacogeneacuteticos e de expressatildeo gecircnica para vareniclina e bupropiona 12
132 Mensuraccedilatildeo de nicotina bupropiona vareniclina e seus metaboacutelitos em amostras
bioloacutegicas 15
2 JUSTIFICATIVA 17
3 OBJETIVOS 19
4 METODOLOGIA 20
41 Casuiacutestica 20
42 Fluxo de procedimentos adotados no atendimento aos pacientes 23
43 Coleta e armazenamento das amostras dos pacientes tratados com vareniclina e
bupropiona 26
44 Nuacutemero amostral 27
45 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica para amostras de pacientes tratados com vareniclina 28
451 Concentraccedilatildeo purificaccedilatildeo e extraccedilatildeo de RNA 28
452 Siacutentese de cDNA 31
453 Ensaio de controle de qualidade das amostras para o ensaio de expressatildeo gecircnica 31
454 Ensaio de expressatildeo gecircnica 35
455 Anaacutelise dos dados de expressatildeo gecircnica 37
46 Mensuraccedilatildeo de bupropiona vareniclina e de seus metaboacutelitos por HPLC-MSMS 38
461 Materiais equipamentos e condiccedilotildees adotadas para a mensuraccedilatildeo dos analitos apoacutes
validaccedilatildeo do meacutetodo 38
462 Visatildeo geral do desenvolvimento da coluna e padronizaccedilatildeo da anaacutelise 41
463 Desenvolvimento da coluna RAM para a purificaccedilatildeo da amostra 43
464 Caracterizaccedilatildeo do novo RAM 46
4641 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA 46
4642 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas no soro 46
4643 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA em diferentes pHs 47
465 Paracircmetros espectromeacutetricos 47
466 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatograacutefico multidimensional 48
467 validaccedilatildeo analiacutetica 49
47 Anaacutelise estatiacutestica 49
5 RESULTADOS 51
51 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica 51
511 Dados cliacutenicos e demograacuteficos 51
512 Dados de expressatildeo gecircnica 53
513 Anaacutelise de associaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica entre os desfechos e os tempos de
tratamento 54
52 Mensuraccedilatildeo dos analitos 58
521 Caracterizaccedilatildeo da coluna teste exclusatildeo de proteiacutenas e interferentes da matriz 58
522 Otimizaccedilatildeo dos paracircmetros espectromeacutetricos 60
523 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatrograacutefico multidimensional 61
524 Validaccedilatildeo analiacutetica 64
525 Dados cliacutenicos e demograacuteficos dos pacientes submetidos a mensuraccedilatildeo dos analitos
69
526 Anaacutelise de associaccedilatildeo dos analitos com desfecho de tratamento 72
6 DISCUSSAtildeO 75
61 Para os dados da anaacutelise de expressatildeo gecircnica 75
62 Para os dados da mensuraccedilatildeo dos analitos 80
7 CONCLUSOtildeES 87
8 SUGESTOtildeES PARA ESTUDOS FUTUROS 88
9 REFEREcircNCIAS 89
APEcircNDICE ndash TCLE
ANEXO 1 ndash Aprovaccedilatildeo no Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa
ANEXO 2 ndash Teste de Fagerstroumlm para a dependecircncia agrave nicotina (versatildeo em Portuguecircs)
ANEXO 3 - Escore de consumo situacional Issa
ANEXO 4 - Desenho de estudo do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticos na
escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismordquo
ANEXO 5 -Pedido de depoacutesito de patente na Agecircncia de Inovaccedilatildeo e Empreendedorismo
da Universidade Federal de Alfenas-MG
LISTA DE ABREVIATURAS SIacuteMBOLOS E SIGLAS
API Ionizaccedilatildeo em pressatildeo atmosfeacuterica - Atmospheric pressure ionization
ACTB Gene que codifica a proteiacutena β actina
ANKK1 Gene codificador da proteiacutena quinase envolvida em vias de transduccedilatildeo de sinal
B2M Gene que codifica a microbulina subunidade β2
BC3 Tampatildeo de reaccedilao de transcriptase reversa
BR1 Tampatildeo de ressuspensatildeo
BR2 Tampatildeo de ligaccedilatildeo
BR3 Tampatildeo de lavagem 1
BR4 Tampatildeo de lavagem 2
BR5 Tampatildeo de eluiccedilatildeo
BRT Tubos PAXgene
BSA Albumina de soro bovino
[C14] Carbono 14 (isoacutetopo radioativo do carbono de massa atocircmica 14)
cDNA DNA complementar sintetizado a partir de uma moleacutecula de RNA
CHRNA3 Gene codificador do receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α3
CHRNA4 Gene codificador da subunidade α4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNA5 Gene codificador da subunidade α5 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNA6 Gene codificador da subunidade α6 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNA7 Gene codificador da subunidade α7 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNB2 Gene codificador da subunidade β2 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNB3 Gene codificador da subunidade β3 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNB4 Gene codificador da subunidade β4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNG Gene codificador do receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade δ
CNTs Nanotubos de carbono - Carbon nanotubes
COMT Gene codificador da enzima catecol-O-metiltransferase (metaboliza dopamina)
CS ndash SPE Extraccedilatildeo em fase soacutelida no modo column switching
CT Ciclo de linha de base ndash threshold cicle (nuacutemero de ciclo em que a amostra
amplificou)
CYP2B6 Gene codificador do receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade γ
CYP2B6 Gene codificador da isoenzima CYP2B6
Disco QC Disco para a realizaccedilatildeo do controle de qualidade de amostras que seratildeo utilizadas
para o ensaio de expressatildeo gecircnica
DN Dependecircncia agrave nicotina
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
DNAse Enzima que degrada moleacuteculas de DNA
dNTP Dinucleotiacutedeos dATP dCTP dGTP e dTTP
DRD1 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 1
DRD2 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 2
DRD3 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 3
DRD4 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 4
E Erro relativo
EDTA Aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico
Escore Issa Escore de consumo situacional Issa
ESI+ Ionizaccedilatildeo positiva por electrospray - positive Electrospray ionization
FDA Orgatildeo de controle de alimentos e medicamentos americano ndash Food and drug
administration
FTND Teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fargestroumlm test for nicotine
dependence
g Velocidade de rotaccedilatildeo em forccedila g a qual considera a aceleraccedilatildeo da gravidade
GDC Controle de contaminaccedilatildeo de DNA genocircmico do disco QC
GE Tampatildeo de degradaccedilatildeo de DNA genocircmico
HGDC Controle de contaminaccedilatildeo de DNA genocircmico do ensaio de expressatildeo gecircnica
HPLC Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia ndash High Performance Liquid
Cromatograph
HPLC-MSMS Cromatografica liacutequida de alta eficiecircncia seguida por espectrometria de massas
em tandem ndash High Performance Liquid Cromatograph fowed by tandem Mass
Spectrometric
HPRT1 Gene que codifica a enzima hipoxantina fosforribosiltransferase 1
HTR3A Gene codificador da subunidade 3A do receptor de serotonina
HTR3B Gene codificador da subunidade 3B do receptor de serotonina
KV Energia de colisatildeo em quilovolt
LC-MS Cromatografia liacutequida seguida de espectrometria de massas - Liquid
Cromatograph fowed by Mass Spectrometric
LD Limite de detecccedilatildeo
LLE Extraccedilatildeo liacutequido-liacutequido (com o uso de solvente)
LQ Limite de quantificaccedilatildeo
LogP Coeficiente de particcedilatildeo relaccedilatildeo das concentraccedilotildees da substacircncia em um solvente
orgacircnico e em aacutegua dado que ambos os solventes satildeo necessariamente imisciacuteveis
MCT Microtubos de 15 mL
MS Espectrometria de massas - Mass Spectrometric
MRM Muacuteltiplas transiccedilotildees de monitoramento de reaccedilatildeo - multiple reaction monitoring
MSMS Espectrometria de massas em tandem
mz Relaccedilatildeo massacarga dos analitos
nAChR(s) Receptor(es) acetilcoliacutenico (s) nicotiacutenico (s)
NMR Taxa de metabolizaccedilatildeo da nicotina ndash Nicotine metabolite ratio
NTC Controle negativo
NTR Controle de natildeo transcriccedilatildeo reversa
OCT2 Transportador catiocircnico orgacircnico
P2 Controle externo de RNA
PAF Programa de Assistecircncia ao Fumante
PBMC Ceacutelulas mononucleares de sangue perifeacuterico - Peripheral blood mononuclear cell
PCR Amplificaccedilatildeo em cadeia da polimerase
PIs Padrotildees internos
PK Enzima proteinase K
pKa Valor negativo do logaritmo da constante de dissociaccedilatildeo de um aacutecido
pKb Valor negativo do logaritmo da constante de dissociaccedilatildeo de uma base
PP Extraccedilatildeo por preciptaccedilatildeo de proteiacutenas
PPC Controle positivo de PCR
PRC Coluna de rotaccedilatildeo de RNA vermelho
PSC Coluna de rotaccedilatildeo do homogeneizador lilaacutes
PT Tubo de processamento
RAM Material de acesso restrito ndash restrict access material
Rcf Forccedila centriacutefuga relativa ndash Relative centrifugal force
RDD Tampatildeo de digestatildeo de DNA
RE3 Mix de transcriptase reversa
RNA Aacutecido ribonucleico
RNase Enzima ribonuclease a qual degrada as moleacuteculas de RNA
RNFD Soluccedilatildeo matildee de DNase
RNFW Aacutegua livre de RNase
RFLP Restriccedilatildeo enzimaacutetica - Restriction fragment length polymorphism
RP‐HPLC Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia em fase reversa ndash Reverse-Phase High
Performance Liquid Cromatograph
Rpm Rotaccedilatildeo por minuto
RSD Desvio padratildeo relativo
SLC6A3 Gene codificador da proteiacutena transportadora de dopamina
SLC22A2 Gene codificador da proteiacutena OCT2 transportadora de caacutetions orgacircnicos
(transporta vareniclina)
SNC Sistema nervoso central
SPE Extraccedilatildeo em fase soacutelida
Sty I Enzima de restriccedilatildeo proveniente da Salmonella Typhi
TAE Tampatildeo formado com Tris Acetato e EDTA
TRN Terapia de reposiccedilatildeo nicotiacutenica
UGT2B7 Gene codificador da enzima UGT2B7 a qual metaboliza a vareniclina
UPLC Cromatografica liacutequida de ultra eficiecircncia - Ultra Performance Liquid
Cromatograph
UV Detector ultravioleta
α3 Subunidade alfa 3 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α4 Subunidade alfa 4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α5 Subunidade alfa 5 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α6 Subunidade alfa 6 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α7 Subunidade alfa 7 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
β2 Subunidade beta 2 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
β4 Subunidade beta 4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
T-1 Visita inicial
T0 Visita de iniacutecio do tratamento (coleta realizada antes de comeccedilar o tratamento no
mesmo dia)
T2 Visita de 2 semanas apoacutes tratamento farmacoloacutegico
T4 Visita de 4 semanas apoacutes tratamento farmacoloacutegico
T12 Visita de 12 semanas apoacutes tratamento farmacoloacutegico
TFC Cromatografia liacutequida turbulenta - Turbulent flow-liquid chromatography
LISTA DE EQUACcedilOtildeES
∆CT= (CTamostra ndash a meacutedia de CThousekeeping genes) Normalizaccedilatildeo da expressatildeo
gecircnica dos genes alvo atraveacutes de valores de expressatildeo de genes fisioloacutegicos
2-∆CT Transformaccedilatildeo dos valores de ∆CT em escala logariacutetmica para a realizaccedilatildeo
dos testes de hipoacutetese
∆∆CT= (mediana de ∆CTgrupo teste ndash mediana de ∆CT grupo referecircncia) Foacutermula
utilizada para posterior caacutelculo de fold change Considera-se os dois grupos
envolvidos no teste de hipoacutetese
2-∆∆CT Transformaccedilatildeo dos dados de ∆∆CT em escala logariacutetmica Atraveacutes dessa
foacutermula se obteacutem o fold change (diferenccedila de expressatildeo entre dois grupos)
NMR=(trans-3-hidroxicotininacotinina) Taxa de metabolizaccedilatildeo da nicotina
NMRlt031=metabolizador lento NMRgt031 metabolizador normal ou raacutepido
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Analitos precursores fragmentos e energias de colisatildeo
otimizados
40
Tabela 2 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina selecionados para os ensaios de expressatildeo gecircnica
52
Tabela 3 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina submetidos aos ensaios de expressatildeo gecircnica de acordo
com o desfecho de tratamento
52
Tabela 4 - Valores de mediana de ∆CT dos genes de acordo com os
tempos de tratamento e grupos de desfecho
53
Tabela 5 - Fold change e anaacutelise de associaccedilatildeo entre os tempos de
tratamento e grupos de desfecho
54
Tabela 6 - Paracircmetros de validaccedilatildeo obtidos na determinaccedilatildeo de faacutermacos
antitabagismo em soro humano
68
Tabela 7 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos
69
Tabela 8 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de
acordo com o desfecho de tratamento
70
Tabela 9 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos
71
Tabela 10 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes
tratados com bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos
analitos de acordo com o desfecho de tratamento
71
Tabela 11 ndash Frequecircncia do desfecho de tratamento nos pacientes
submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com os
medicamentos antitabagismo
72
Tabela 12 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos
pacientes tratados com vareniclina
73
Tabela 13 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de
tratamento com vareniclina
73
Tabela 14 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos
pacientes tratados com bupropiona
74
Tabela 15 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de
tratamento com bupropiona
74
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Aacutereas estimuladas atraveacutes de vias dopamineacutergicas e
serotonineacutergicas e sistema de recompensa
2
Figura 2 - Receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico 4
Figura 3 - Via primaacuteria do metabolismo da nicotina 5
Figura 4 - Mecanismo de accedilatildeo da vareniclina 7
Figura 5 - Metabolismo da vareniclina em humanos 8
Figura 6 - Mecanismo de accedilatildeo da bupropiona 9
Figura 7 - Metabolismo da bupropiona em seus principais metaboacutelitos ativo 11
Figura 8 - Desenho do estudo 22
Figura 9 - Representaccedilatildeo do Rotor-Disc100 33
Figura 10 - Mapa do disco QC (representaccedilatildeo planilhada) 33
Figura 11 - Exemplo de ajuste de Threshold 34
Figura 12 - Mapa do disco do ensaio RT2 profiler PCR array (representaccedilatildeo
planilhada)
37
Figura 13 - Representaccedilatildeo da composiccedilatildeo da coluna extratora (Novo RAM) 45
Figura 14 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNA7 entre os tempos de
tratamento e desfecho
56
Figura 15 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNG entre os tempos de
tratamento e desfecho
57
Figura 16 - Heat map de expressatildeo gecircnica 58
Figura 17 ndash Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com soluccedilatildeo de
BSA
59
Figura 18 - Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com amostra de
soro diluiacuteda
59
Figura 19 - Influecircncia do pH na exclusatildeo de proteiacutenas 60
Figura 20 - Ilustraccedilatildeo do sistema de columm switching na configuraccedilatildeo de
backflush
62
Figura 21 - Cromatograma obtido de amostras de soro branco diluiacutedas em
aacutegua ultra pura
65
Figura 22 - Cromatograma obtido apoacutes anaacutelise de soro diluiacutedo e dopado com
os analitos no niacutevel meacutedio de calibraccedilatildeo e mais os padrotildees internos deuterados
65
Figura 23 - Cromatograma obtido atraveacutes da anaacutelise das amostras de soro dos
pacientes tratados com bupropiona
67
Figura 24 - Cromatograma obtido atraveacutes da analise de amostras de soro de
pacientes tratados com vareniclina
67
LISTA DE QUADROS
Quadro 1- Procedimentos do protocolo em relaccedilatildeo aos pacientes 25
Quadro 2 - Paracircmetros de qualidade do ensaio QC 34
Quadro 3 - Genes escolhidos para o ensaio de expressatildeo 36
Quadro 4 - Housekeeping genes 36
Quadro 5 - Propriedades fiacutesico-quiacutemicas dos analitos 42
Quadro 6 ndash Comparaccedilatildeo dos dados de validaccedilatildeo com outros estudos 85
RESUMO
Santos JR Anaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de expressatildeo gecircnica e das concentraccedilotildees
de metaboacutelitos com a resposta ao tratamento antitabagismo [tese] Satildeo Paulo
Faculdade de Medicina Universidade de Satildeo Paulo 2020
Introduccedilatildeo O tabagismo eacute considerado a maior causa de morbidade e mortalidade
evitaacutevel no mundo Estudos tecircm buscado a identificaccedilatildeo de preditores de resposta aos
tratamentos de cessaccedilatildeo tabaacutegica Os principais objetivos deste estudo foram analisar a
possiacutevel associaccedilatildeo da expressatildeo de genes alvo e das concentraccedilotildees de analitos
(faacutermacos antitabagismo nicotina e seus metaboacutelitos) com a resposta ao tratamento
Meacutetodos Foram incluiacutedos 105 pacientes fumantes que iniciariam o tratamento com
vareniclina (n=74) ou bupropiona (n=31) As anaacutelises de expressatildeo gecircnica foram
realizadas atraveacutes do ensaio customizado RTsup2 Profiler PCR Array com a inclusatildeo de 17
genes para a anaacutelise em ceacutelulas mononucleares de sangue perifeacuterico (PBMC) A
preparaccedilatildeo das amostras de soro para a mensuraccedilatildeo dos analitos foi realizada atraveacutes de
uma coluna extratora composta por nanotubos hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados
com a adiccedilatildeo de grupos hidrofiacutelicos (material de acesso restrito - RAM) desenvolvida
no LATF Unifal MG A mensuraccedilatildeo dos analitos foi realizada por cromatografia
liacutequida de alta eficiecircncia em modo column switching seguida de espectrometria de
massa em tandem (HPLC-MSMS) Os tempos para a coleta de amostras foram para as
anaacutelises de expressatildeo gecircnica (sangue total) antes de iniciar o tratamento (T0) duas e
quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento (T2 e T4 respectivamente) e para a
mensuraccedilatildeo dos analitos (soro) as amostras foram coletadas na T2 Resultados Para as
anaacutelises de expressatildeo gecircnica selecionamos 14 pacientes que obtiveram sucesso e 13
pacientes resistentes ao tratamento com vareniclina Foi considerado sucesso quando o
paciente alcanccedilava abstinecircncia ao tabaco ateacute a 4 ordf semana de tratamento e resistente
quando o paciente natildeo conseguia parar de fumar ateacute a 4ordf semana de tratamento Foi
observada diferenccedila significativa para a expressatildeo do gene CHRNA7 no grupo
resistente amostras dos tempos T2 e T4 apresentaram menor expressatildeo comparadas ao
tempo T0 (fold change 038 P=0007 fold change 067 P=0004 respectivamente)
Para a mensuraccedilatildeo dos analitos a coluna RAM desenvolvida mostrou alta capacidade
para a remoccedilatildeo de macromoleacuteculas e de anaacutelise conjunta dos diferentes analitos aleacutem
de poder ser reutilizada diversas vezes (cerca de 400 ciclos) Os pacientes do grupo
resistente tratados com ambos os faacutermacos apresentaram maior concentraccedilatildeo de
metaboacutelitos da nicotina na T2 No entanto natildeo houve associaccedilatildeo dos faacutermacos e seus
metaboacutelitos com desfecho de tratamento Conclusotildees Para as anaacutelises de expressatildeo
gecircnica este estudo exploratoacuterio mostrou um possiacutevel preditor de efetividade no
tratamento com vareniclina reafirmando a associaccedilatildeo da subunidade α7 para os
processos de dependecircncia agrave nicotina e tratamento antitabagismo Estes resultados
podem contribuir ao menos em parte para o desenvolvimento de uma terapia
individualizada Contudo estudos futuros satildeo necessaacuterios para o entendimento do papel
da subunidade α7 dos receptores acetilcoliacutenicos-nicotiacutenicos no tratamento com
vareniclina Para a mensuraccedilatildeo dos analitos o novo RAM sintetizado eacute um produto de
extremo valor cientiacutefico podendo apresentar diversas aplicaccedilotildees em anaacutelise de amostras
com matrizes complexas sem muita preparaccedilatildeo preacutevia Para a associaccedilatildeo das
concentraccedilotildees dos faacutermacos e seus metaboacutelitos com o desfecho de tratamento satildeo
necessaacuterios estudos com um maior nuacutemero amostral
Descritores Vareniclina Bupropiona Nicotina Abandono do haacutebito de fumar
Expressatildeo gecircnica Biomarcadores farmacoloacutegicos
ABSTRACT
Santos JR Association analysis of gene expression profiles and metabolite
concentrations with response for smoking cessation treatment [thesis] Satildeo Paulo
ldquoFaculdade de Medicina Universidade de Satildeo Paulordquo 2020
Introduction Smoking is considered the largest cause of preventable morbidity and
mortality in the worldwide Studies have sought to identify predictors of responses to
smoking cessation treatments The main objectives of this study were to analyze the
possible association of the expression of target genes and concentrations of analytes
(drugs for smoking cessation nicotine and their metabolites) with the response to
treatment Methods We included 105 smoker patients who would start treatment with
varenicline (n=74) or bupropion (n=31) Gene expression analysis was performed
through custom RTsup2 Profiler PCR array assay including 17 genes for analysis in
peripheral blood mononuclear cells (PBMC) Serum sample preparation for the
measurement of analytes was performed by an extraction column composed of hybrid
carbon and silica nanotubes modified with the addition of hydrophilic groups (restricted
access material - RAM) developed by LATF Unifal MG The measurement of analytes
was performed by high efficient liquid chromatography in column switching mode
followed by tandem mass spectrometry (HPLC-MSMS) Times for sample collection
were for gene expression analysis (total blood) before start of therapy (T0) two and
four weeks after start of treatment (T2 and T4 respectively) and for measurement of
analytes (serum) the samples were collected at T2 Results For gene expression
analysis we selected 14 patients who had success and 13 patients resistant to the
varenicline treatment Success was considered to be when a patient achieved tobacco
abstinence until the 4th week of treatment and resistant was when a patient had not
stopped smoking as of the 4th week of treatment We observed a significant difference
for CHRNA7 gene expression in the resistant group samples from T2 and T4 had lower
expression compared with T0 (fold change 038 P=0007 fold change 067 P=0004
respectively) For measurement of analytes the developed RAM column showed high
capacity to remove macromolecules and joint analyzes of different analytes besides
being able to be reuse manny times (about 400 cycles) Patients from resistant group of
the both drugs treatment had a higher concentration of nicotine metabolites in T2
However there was no association of drugs for smoking cessation and their metabolites
with outcome treatment Conclusions For gene expression analysis this exploratory
study showed a possible predictor of effectiveness in the treatment with varenicline
reaffirming the association of the α7 subunit for nicotine dependence and smoking
therapy processes These results may contribute at least in part to the development of
individualized therapy However further studies are needed to understand the role of the
α7 subunit of acetylcholinic-nicotinic receptors in varenicline treatment For the
measurement of analytes the new synthesized RAM is a product of extreme scientific
value being able of several applications in the analysis of samples with complex
matrices without much prior preparation For an association of drugs for smoking
cessation and their metabolites with outcome treatment studies with a larger sample
size are needed
Descriptors Varenicline Bupropion Nicotine Smoking cessation Gene expression
Biomarkers pharmacological
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
O tabagismo eacute considerado a maior causa de morbidade e mortalidade evitaacutevel
em todo o mundo 1 Doenccedilas cardiacuteacas cerebrovasculares cerca de um quinto de todos
os tipos de cacircnceres doenccedilas pulmonares como apneia e enfisema aleacutem de distuacuterbios
preacute-natais estatildeo associadas ao consumo do tabaco 2-5
Dados recentes da Vigitel mostraram que no conjunto das 27 capitais brasileiras
a frequecircncia de adultos fumantes foi de 93 com valores duas vezes maior no sexo
masculino (121) do que no feminino (69) As menores frequecircncias foram
encontradas na populaccedilatildeo de jovens adultos (antes dos 25 anos) e em pessoas de mais
de 65 anos As maiores frequecircncias foram encontradas entre homens em Porto Alegre
(173) Campo Grande e Satildeo Paulo (156) 6
A nicotina eacute o principal componente do tabaco causador de dependecircncia Esta
age nos receptores acetilcoliacutenicos-nicotiacutenicos (nAChRs) promovendo a liberaccedilatildeo de
diversos neurotransmissores e neuroreguladores tais como dopamina acetilcolina
epinefrina norepinefrina serotonina beta-endorfina vasopressina e GABA O principal
neurotransmissor estudado eacute a dopamina pois a nicotina promove aumento de seus
niacuteveis na regiatildeo mesocorticoliacutembica cerebral principalmente em um circuito conhecido
como ldquosistema de recompensardquo (aacuterea tegmental ventral nuacutecleo accumbens e coacutertex preacute-
frontal) gerando sensaccedilotildees de prazer e bem-estar 7-15
O processo de adiccedilatildeo agrave nicotina eacute complexo e nem todos os mecanismos estatildeo
elucidados Aleacutem da ativaccedilatildeo do sistema de recompensa haacute a formaccedilatildeo de memoacuterias
associativas do efeito hedocircnico com os ambientes e situaccedilotildees de disponibilidade e uso
do tabaco resultando em reforccedilo positivo apoacutes o fumante entrar em contato com fatores
relacionados ao seu consumo Este tipo de memoacuteria aprendida envolve a amigdala o
hipocampo o coacutertex preacute-frontal e o coacutertex parietal 15-17 Evidecircncias tambeacutem satildeo
2
consistentes com a hipoacutetese da ativaccedilatildeo do estriado dorsal o qual estaacute envolvido no
processamento de memoacuterias de formaccedilatildeo de haacutebito em processos motores o que
poderia automatizar o ato de fumar 15 18 (Figura 1)
O uso continuado do tabaco promove a desensibilizaccedilatildeo e adaptaccedilatildeo dos
nAChRs causando toleracircncia e diminuiccedilatildeo dos efeitos de recompensa naturais Como
resultado o indiviacuteduo experimenta fissura ansiedade humor deprimido e irritabilidade
na ausecircncia da nicotina Estes sintomas acabam promovendo um reforccedilo negativo para o
fumo e o nuacutemero de cigarros consumidos aumenta cada vez mais 14 15
Todos os fatores acima mencionados contribuem para o mecanismo de
dependecircncia agrave nicotina (DN) Os efeitos hedocircnicos estatildeo relacionados com o processo
de iniciaccedilatildeo do tabagismo enquanto os efeitos negativos da falta da nicotina estatildeo mais
associados agrave manutenccedilatildeo do fumo 15
Para os indiviacuteduos que desejam parar de fumar o tratamento farmacoloacutegico
antitabagismo eacute o que apresenta maior eficaacutecia na reduccedilatildeo da prevalecircncia de fumantes
19
Figura 1 - Aacutereas estimuladas atraveacutes de vias dopamineacutergicas e serotonineacutergicas e sistema de recompensa A
Principais vias ativadas na dependecircncia como a aacuterea tegmental ventral nuacutecleos accumbens e da rafe coacutertex-frontal
estriado susbstacircncia negra e hipocampo As setas em rosa indicam aacutereas estimuladas pelas vias serotonineacutergicas de
transmissatildeo e em azul pelas vias dopamineacutergicas gerando diversos comportamentos B Sistema de recompensa
(composto pela VTA nuacutecleo accumbeacutens e coacutertex preacute-frontal) A nicotina age nos nAChRs no SNC gerando uma
3
descarga de dopamina no sistema de recompensa Haacute uma adaptaccedilatildeo desses receptores com o fumo continuado
fazendo com que haja a necessidade de maior consumo de nicotina e o desenvolvimento da dependecircncia VTA= aacuterea
tegmental ventral SNC sistema nervoso central nAChR= receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico Fonte adaptado de
Habermann A Brain awareness week addiction and the brainrsquos reward system Sovereign Health Group 2016 e de
Koob amp Volkow 2009 14
11 Nicotina farmacodinacircmica e farmacocineacutetica
O fumo permite uma titulaccedilatildeo precisa da dose de nicotina por parte do fumante
Sua absorccedilatildeo eacute raacutepida chegando em cerca de 10 segundos em todo o sistema nervoso
central (SNC) onde se liga nos nAChRs 20 21 22
Os nAChRs satildeo receptores de canais iocircnicos compostos por cinco subunidades
que podem estar combinadas de diferentes formas (Figura 2) 20 Os subtipos desses
receptores mais abundantes no ceacuterebro humano satildeo os α4β2 α3β4 e α7 (homomeacuterico)
Os receptores compostos pelas subunidades α4β2 (o asterisco indica que outras
subunidades podem estar presentes) possuem um papel fundamental na DN O nocaute
da subunidade β2 em ratos resultou na eliminaccedilatildeo dos efeitos comportamentais da
nicotina 23 Quanto agrave subunidade α4 parece estar envolvida na sensibilidade agrave nicotina
o que pode impactar nos efeitos de recompensa dessensibilizaccedilatildeo e toleracircncia24 25 Os
receptores compostos pelas subunidades α3β4 acredita-se mediar os efeitos
cardiovasculares 26 Os nAChRs α7 homomeacuterico estatildeo envolvidos na velocidade de
sinapses em processos de aprendizagem e controle sensorial 27 28 Os receptores
compostos pelas subunidades α4β2lowast podem conter outras subunidades como por
exemplo α5 α6 eou β3 as quais podem modificar a sensibilidade e funccedilatildeo do receptor
21 29
Como um agonista desses receptores a nicotina promove a sua abertura
permitindo a entrada de soacutedio e caacutelcio despolarizando assim a membrana dos
neurocircnios Aleacutem da entrada de caacutelcio atraveacutes dos nAChRs haacute tambeacutem a abertura de
4
canais de caacutelcio voltagem dependentes fazendo com que as vesiacuteculas que armazenam
os neurotransmissores sejam liberadas 20 21 O resultado da ativaccedilatildeo dos nAChRs em
neurocircnios poacutes-sinaacutepticos eacute a liberaccedilatildeo de diversos neurotransmissores ativando vaacuterias
aacutereas como jaacute mencionado
Figura 2 - Receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico O receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico funciona como um
canal iocircnico transmembracircnico Sua composiccedilatildeo eacute pentacircmera ou seja eacute formada por 5 subunidades que
podem se combinar de diferentes formas As subunidades satildeo classificadas de acordo com diferenccedilas nos
domiacutenios da sua estrutura proteiacuteca A acetilcolina e a nicotina satildeo agonistas desses receptores fazendo
com que os mesmos sejam abertos Assim ocorre a entrada de soacutedio despolarizando a membrana
gerando o potencial de accedilatildeo ACh= acetilcolina Nicot= Nicotina Na+= soacutedio K+= potaacutessio α =
subunidade alfa β= subunidade beta δ= subunidade delta γ= subunidade gama Fonte adaptado de Rang
amp Dale Farmacologia 5 ed Elsevier 2012
Haacute oscilaccedilatildeo dos picos de nicotina entre um cigarro e outro mas as quantidades
se acumulam entre 6 e 9 horas em um fumo regular saturando os nAChR causando
desensibilizaccedilatildeo adaptaccedilatildeo toleracircncia sintomas de abstinecircncia na falta do fumo e DN
30
A nicotina eacute rapidamente e extensivamente metabolizada pelo fiacutegado atraveacutes da
isoenzima CYP2A6 (e em menor grau pelas isoenzimas CYP2B6 e CYP2E1) agrave nicotina
-iacuteon iacuteminio e apoacutes pela enzima aldeiacutedo oxidase agrave cotinina O tempo de meia vida da
nicotina eacute de aproximadamente 2 horas e da cotinina 16 horas Posteriormente a
5
cotinina eacute metabolizada em trans-3-hidroxicotinina quase que exclusivamente pela
CYP2A6 (outros isocircmeros da hidroxicotina representam menos de 2 da dose) 31 32
(Figura 3) Esta eacute a maior via de metabolizaccedilatildeo da nicotina (70 - 80 do metabolismo
da nicotina em todo o corpo) 33 no entanto haacute vias menores como por exemplo a
glucoronidaccedilatildeo que pode ser a maior determinante no clearence da nicotina em
indiviacuteduos com menor atividade da CYP2A6 31
Figura 3 - Via primaacuteria do metabolismo da nicotina A nicotina eacute
metabolizada marjoritaramente pela isoenzima CYP2A6 em nicotina-
iacuteon imiacutenio e atraveacutes da enzima aldeiacutedo oxidase eacute convertida em
cotinina A cotinina eacute posteriomente metabolizada em trans-3-
hidroxicotinina novamente pela isoenzima CYP2A6 Fonte adaptado
de Llaquet et al 2010 34
12 Faacutermacos antitabagismo
Os medicamentos de primeira escolha aprovados pela Agecircncia Nacional de
Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) incluem tratamentos com base na terapia de reposiccedilatildeo
nicotiacutenica (TRN) como adesivo goma e pastilha e tambeacutem satildeo utilizados vareniclina e
bupropiona Estes uacuteltimos possuem maior eficaacutecia terapecircutica na cessaccedilatildeo tabaacutegica 35 36
6
121 Vareniclina
1211 Farmacodinacircmica
A vareniclina eacute o faacutermaco mais recentemente utilizado para a interrupccedilatildeo do
tabagismo este foi desenvolvido especificamente para atuar nos nAChRs A sua
farmacodinacircmica estaacute mais associada agrave atuaccedilatildeo como um agonista parcial nos nAChRs
compostos pelas subunidades α4β2 37 os quais satildeo importantes alvos de accedilatildeo da
nicotina pois satildeo necessaacuterios e suficientes para a recompensa toleracircncia e
sensibilizaccedilatildeo 25 38 39 (Figura 4)
Estudos mostraram que em relaccedilatildeo agrave nicotina a vareniclina possui 15 vezes
maior afinidade pelas subunidades α4β2 e ativa em torno de 50 a liberaccedilatildeo de
dopamina no sistema mesocorticoliacutembico 37 O faacutermaco atua tambeacutem em outros
nAChR como nos nAChRs (α3β4) age fracamente nos receptores contendo a
subunidade α6 e em nAChRs (α3β2) aleacutem de exercer atividade agonista total nos
receptores α7 40
Quanto agraves reaccedilotildees adversas no uso do faacutermaco a naacuteusea eacute a mais comum (cerca
de 10 a 45 dos indiviacuteduos tratados) a qual muitas vezes leva agrave natildeo aderecircncia ao
tratatamento 41-43
7
Figura 4 - Mecanismo de accedilatildeo da vareniclina A Na ausecircncia da vareniclina a nicotina se liga aos
nAChRs aumentando a ativaccedilatildeo nesses receptores Aleacutem disso haacute o estiacutemulo endoacutegeno (promovido
pela acetilcolina) B A vareniclina eacute um agonista parcial de nAChR (α4β2) ou seja tambeacutem estimula
os nAChRs mas em menor niacutevel do que a nicotina e ao mesmo tempo eacute antagonista na presenccedila de
nicotina fazendo com que ela natildeo consiga se ligar ao receptor Fonte do autor baseado nas
informaccedilotildees de Kassem et al 2012 37
1212 Farmacocineacutetica
A vareniclina eacute rapidamente absorvida pelo trato intestinal com absorccedilatildeo gt90
logo apoacutes a administraccedilatildeo oral As concentraccedilotildees plasmaacuteticas maacuteximas satildeo alcanccediladas
no periacuteodo entre 3 e 4 horas 44 e o estado de equiliacutebrio da sua concentraccedilatildeo ocorre
dentro de 4 dias 37 44-46 O faacutermaco possui baixa ligaccedilatildeo com proteiacutenas plasmaacuteticas
sendo que de acordo com ensaios in vitro a fraccedilatildeo de vareniclina (100 ngmL) livre foi
de 797 47 A sua biodisponibilidade natildeo eacute afetada pelo tempo de administraccedilatildeo ou
ingestatildeo de alimentos 37 45 46 Aleacutem disso a vareniclina possui ampla distribuiccedilatildeo nos
tecidos sendo que o volume meacutedio de distribuiccedilatildeo aparente eacute de 415 litros
apresentando um coeficiente de variaccedilatildeo (CV) de 50 48
Na circulaccedilatildeo humana a vareniclina se encontra em quantidade marjoritaacuteria satildeo
tambeacutem encontrados os metaboacutelitos conjugados vareniclina N-carbomoil glucoroniacutedeo
8
N-formilvareniclina e oxovareniclina O tempo de meia vida da vareniclina eacute em torno
de 24 horas independente da dose administrada
A eliminaccedilatildeo do faacutermaco e metaboacutelitos se daacute principalmente pela urina (99) 49
A eliminaccedilatildeo renal exibe cineacutetica linear e a sua excreccedilatildeo ocorre pela filtraccedilatildeo
glomerular na qual estaacute associada agrave secreccedilatildeo tubular realizada pelo transportador
catiocircnico orgacircnico OCT2 O clearence estimado da vareniclina eacute de 88 a 155 mLmin
apoacutes administraccedilatildeo de dose uacutenica e 92 a 143 mLmin apoacutes doses repetidas A
depuraccedilatildeo de vareniclina eacute reduzida na presenccedila de doenccedila renal Na urina cerca de
90 do produto eliminado eacute encontrado como vareniclina em sua forma inalterada e
menos de 10 eacute encontrado na forma de 2 metaboacutelitos a hidroxivareniclina e a
vareniclina-N-carbomoil glucoroniacutedeo 37 49-51
Nenhum dos metaboacutelitos da vareniclina eacute acreditado ser farmacologicamente
ativo Aleacutem disso esses metaboacutelitos estatildeo presentes em concentraccedilotildees muito baixas 37
46-49 A Figura 5 mostra os metaboacutelitos provenientes da vareniclina
A formaccedilatildeo dos metaboacutelitos da vareniclina natildeo eacute catalisada pelo complexo
enzimaacutetico CYP450 Ensaios realizados com microssoma hepaacutetico humano mostraram
que a formaccedilatildeo do conjugado vareniclina N-carbomilglucoroniacutedeo eacute provavelmente
catalisado pela enzima UGT2B7 37 49
Figura 5 ndash Metabolismo da vareniclina em humanos Fonte adaptado de Obach et al 2006 49
9
122 Bupropiona
1221 Farmacodinacircmica
A bupropiona eacute um antidepressivo no entanto tem sido utilizado como faacutermaco
antitabagismo devido o seu potencial em diminuir o desejo de fumar (o qual foi
percebido durante o tramento de iacutendiviacuteduos fumantes) Como mecanismo de accedilatildeo a
bupropiona atua como um inibidor relativamente se
letivo da recaptaccedilatildeo de norepinefrina e dopamina com pequeno efeito na
recaptaccedilatildeo de serotonina (Figura 6) aleacutem de ser um antagonista de nAChR natildeo
competitivo Essas propriedades minimizam os sintomas de retirada da nicotina
aumentando a probabilidade do indiviacuteduo se abster do fumo 52
Insocircnia e boca seca satildeo as reaccedilotildees adversas mais comumente relatadas ao uso da
bupropiona (30-40 e 10 dos pacientes respectivamente) 53
Figura 6 - Mecanismo de accedilatildeo da bupropiona A Na ausecircncia da bupropiona neurotransmissores
como a noradrenalina serotonina e a dopamina satildeo recaptados endogenamente pela bomba de
recaptaccedilatildeo B Na presenccedila da bupropiona a qual eacute inibidora da bomba de recaptaccedilatildeo desses
neurotransmissores haacute a estimulaccedilatildeo do sistema de recompensa mais especificamente atraveacutes do
aumento da concentraccedilatildeo de dopamina Dessa forma o sistema continua sendo estimulado mas em
menor grau que a nicotina e as chances de abstinecircncia ao tabaco satildeo aumentadas Fonte do autor
baseado nas informaccedilotildees de Slemmer et al 2000 52
10
1222 Farmacocineacutetica
Conforme ensaios em voluntaacuterios sadios os picos maacuteximos de concentraccedilatildeo
plasmaacutetica de bupropiona satildeo alcanccedilados aproximadamente 3 horas apoacutes a sua
administraccedilatildeo oral O volume de distribuiccedilatildeo aparente eacute de aproximadamente 2000L e
a ligaccedilatildeo com proteiacutenas plasmaacuteticas eacute de 84 para a bupropiona e de 77 para a
hidroxibupropiona (o seu principal metaboacutelito ativo) 54
A bupropiona eacute metabolizada primariamente em uma seacuterie de metaboacutelitos ativos
como a hidroxibupropiona a threohidrobupropiona e a eritrohidrobupropiona (Figura
7) A CYP2B6 eacute a principal enzima que converte a bupropiona em hidroxibupropiona
em humanos No entanto a formaccedilatildeo de threohidrobupropiona e a
eritrohidrobupropiona que ocorre atraveacutes de reaccedilatildeo redutiva natildeo eacute mediada pela
CYP2B6 55 56 A eritroidrobupropiona natildeo pode ser mensurada no plasma apoacutes a
administraccedilatildeo de uma uacutenica dose de bupropiona Os metaboacutelitos ativos satildeo
posteriormente metabolizados em inativos e estes satildeo excretados na urina 54
Inibidores da CYP2B6 como por exemplo a ticlodipina um agente
antiplaquetaacuterio derivado da tienopiridina interagem com a bupropiona diminuindo a sua
hidroxilaccedilatildeo 57 58
Apoacutes a administraccedilatildeo crocircnica de doses de 150 a 300 mgdia a bupropiona e seus
metaboacutelitos assumem cineacutetica linear A bupropiona possui meia vida de 20 horas
aproximadamente e apresenta clearence meacutedio aparente correspondente a cerca de
200Lh A eliminaccedilatildeo da bupropiona ocorre principalmente atraveacutes da urina (87) e das
fezes (10) e eacute excretada em apenas 05 de forma inalterada nos mostrando um
extenso metabolismo 54
11
Figura 7 - Metabolismo da bupropiona em seus principais metaboacutelitos ativos A bupropiona eacute
extensamente metabolizada em hidroxibupropiona pela isoenzima CYP2B6 Os demais metaboacutelitos ativos
aatildeo metabolizados por outras enzimas Fonte adaptado de Hesse et al 2000 55
13 Pesquisa de biomarcadores
A variabilidade interindividual em resposta a faacutermacos antitabagismo sugere que
os tratamentos podem ser mais efetivos em subgrupos de fumantes 59-64 No contexto de
medicina personalizada diversos pesquisadores tecircm buscado a identificaccedilatildeo de
preditores de resposta aos tratamentos de cessaccedilatildeo tabaacutegica os quais geralmente estatildeo
envolvidos em aspectos farmacocineacuteticos e farmacodinacircmicos ou via de atuaccedilatildeo do
faacutermaco como por exemplo os fatores geneacuteticos o perfil de expressatildeo gecircnica de
proteiacutenas e de metaboacutelitos 65-68
Aleacutem de refletir a efetividade do tratamento estes biomarcadores tambeacutem
poderiam indicar a toxicidade ou a ocorrecircncia de efeitos adversos A combinaccedilatildeo
desses fatores com outras variaacuteveis individuais pode ser utilizada para adequar as
estrateacutegias preventivas e terapecircuticas 65-68
12
131 Estudos farmacogeneacuteticos e de expressatildeo gecircnica para vareniclina e
bupropiona
Diversos polimorfismos geneacuteticos tecircm sido associados com resposta agrave
vareniclina e agrave bupropiona 41 65 67-71
King et al 65 mostraram a associaccedilatildeo de polimorfismos de nucleotiacutedeos uacutenicos
(SNPs - single nucletide polimorfisms) nos genes CHRNA4 CHRNA5 CHRNA7
CHRNB2 (codificadores das subunidades α4 α5 α7 e β2 dos nAChRs
respectivamente) com abstinecircncia contiacutenua em resposta agrave vareniclina O mesmo
trabalho tambeacutem encontrou associaccedilatildeo dos polimorfismos nos genes CHRNA3
CHRNA5 CHRNB4 CHRNG (codificam as subunidades α3 α5 β4 e γ dos nAChR
respectivamente) Aleacutem disso os autores demonstraram a associaccedilatildeo de polimorfismos
nos genes HTR3A e HTR3B (codificadores dos receptores serotonineacutergicos) com a
frequecircncia de recaiacuteda no tratamento antitabagismo
Swan et al 41 verificaram a associaccedilatildeo de polimorfismos no gene CHRNB2 com
naacuteusea severa em pacientes tratados com vareniclina
Nosso grupo de pesquisadores encontrou a associaccedilatildeo do polimorfismo
rs10443196 no gene CHRNA4 e do polimorfismo 785AgtG no gene CYP2B6
(codificador da principal isoenzima metabolizadora da bupropiona) com uma maior taxa
de sucesso no tratamento com vareniclina e bupropiona respectivamente 67 68
O gene CYP2B6 eacute um dos alvos mais importantes de estudos farmacogeneacuteticos
no tratamento com bupropiona Diversos polimorfismos neste gene satildeo preditores de
metabolizaccedilatildeo lenta ou raacutepida os quais foram associados com as diferenccedilas de
concentraccedilotildees do faacutermaco e de seu principal metaboacutelito ativo hidroxibupropiona em
amostras bioloacutegicas Essas concentraccedilotildees tambeacutem se associaram agrave variabilidade na
resposta ao tratamento com bupropiona 72-74
13
Polimorfismos podem implicar em diversos mecanismos moleculares como por
exemplo alteraccedilatildeo constituiccedilatildeo ou conformaccedilatildeo de proteiacutenas mudanccedilas poacutes-
traducionais e a regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica gerando variabilidade interindividual
nos niacuteveis de RNA transcrito o que poderiam explicar as diferenccedilas de resposta aos
faacutermacos antitabagismo 72
O polimorfismo CHRNA4 (rs2236196) assim como diversos polimorfismos
presentes no gene CYP2B6 os quais foram associados agrave resposta ao tratamento com
vareniclina e bupropiona respectivamente foram tambeacutem associados a maiores e
menores niacuteveis de expressatildeo gecircnica 72-75 Tambeacutem vale salientar que assim como a
expressatildeo gecircnica pode afetar a resposta ao tratamento a expressatildeo gecircnica tambeacutem pode
ser alterada em resposta aos faacutermacos 76 Neste sentido Smith et al 76 mostraram que a
vareniclina pode afetar a expressatildeo gecircnica da enzima DNA metiltransferase-1 (DNMT)
que mostrou estar envolvida em mecanismos epigeneacuteticos em neurocircnios corticais
GABaeacutergicos os quais estatildeo relacionados a processos cognitivos em indiviacuteduos
esquizofrecircnicos fumantes
O tratamento crocircnico com vareniclina modificou a expressatildeo dos nAChRs em
ceacuterebros de camundongos O upregulation dos nAChRs (α4β2) pelo uso crocircnico da
vareniclina foi similar ao promovido ao uso crocircnico da nicotina Similar dowregulation
foi visto para os nAChRs (α6β2) A vareniclina aumentou significantemente ambos
nAChRs (α3β4) e α7 enquanto a nicotina teve menor efeito nestes siacutetios 77
Em estudos com pacientes voluntaacuterios a obtenccedilatildeo de amostras do sistema
nervoso central eacute inviaacutevel Como alternativa a esse problema estudos tecircm proposto a
anaacutelise de expressatildeo gecircnica em sangue perifeacuterico 78-80 Embora natildeo seja o tecido alvo da
farmacodinacircmica dos medicamentos antitabagismo o sangue possui muitas
similaridades a niacutevel transcricional com muacuteltiplas regiotildees cerebrais 81
14
Hennings et al 82 mostraram diferenccedilas no perfil de expressatildeo gecircnica em ceacutelulas
mononucleares de sangue perifeacuterico (PBMCs) de pacientes respondedores e natildeo
respondedores a tratamentos com antidepressivos e muitos dos genes diferentemente
expressos satildeo codificadores de receptores tambeacutem presentes no SNC
Ota et al 83 mostraram que os genes GABRR2 (codificador de receptor
GABAeacutergico) e CHRNA3 (codificador da subunidade α3 de nAChR) foram
diferentemente expressos em sangue perifeacuterico em resposta ao tratamento com
risperidona em pacientes com esquizofrenia
Em outro estudo Kordi-Tamandani et al 84 mostraram que os niacuteveis de
expressatildeo gecircnica de SLC6A3 em leucoacutecitos diferiram entre indiviacuteduos dependentes de
opioacuteides e voluntaacuterios saacutedios Este gene eacute codificador de uma importante proteiacutena
recaptadora de dopamina em neurocircnios chamada DAT
Wongsriraksa et al 85 mostraram a expressatildeo das subunidades α4 α5 α7 β1 e
β2 em um estudo de caracterizaccedilatildeo de nAChRs em amostras de PBMC de humanos
atraveacutes de nicotina radioligante sugerindo conter as subunidades α4β2 α4β2α5 eou α7
Por fim diversos estudos tecircm mostrado que os nAChRs satildeo importantes para processos
imunoloacutegicos 86-91
Estudos tecircm evidenciado a expressatildeo de receptores dopamineacutergicos em
leucoacutecitos humanos Embora a dopamina natildeo ultrapasse a barreira hematoencefaacutelica as
diferenccedilas nos niacuteveis de dopamina do sistema nervoso central poderiam alterar a
expressatildeo desses receptores em leucoacutecitos ainda durante a sua formaccedilatildeo via inervaccedilatildeo
da coluna espinal doenccedilas como Parkinson Alzheimer e adiccedilatildeo agraves substacircncias
psicoativas poderiam influenciar na expressatildeo desses receptores em sangue perifeacuterico 92
15
132 Mensuraccedilatildeo de nicotina bupropiona vareniclina e seus metaboacutelitos em
amostras bioloacutegicas
A nicotina possui um baixo tempo de meia-vida e a isoenzima CYP2A6 eacute
predominante responsaacutevel pelo metabolismo da nicotina em cotinina e trans-3-
hidroxicotinina (seus principais metaboacutelitos) 93 94 Estes e a nicotina satildeo marcadores de
exposiccedilatildeo ao tabaco e indicativo de fumo 95
A taxa de metabolizaccedilatildeo da nicotina (NMR) obtida pela relaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de trans-3-hidroxicotininacotinina tem sido associada com DN com
desfecho e com escolha farmacoloacutegica de tratamento antitabagismo 95 96 Os valores
contiacutenuos e categoacutericos de NMR (metabolizadores lentos vs normais e raacutepidos) se
mostraram estaacuteveis em fumantes independente da carga tabaacutegica 32 97 98
A bupropiona eacute um faacutermaco extensamente metabolizado e a principal isoenzima
envolvida em seu metabolismo eacute a CYP2B6 a qual medeia quase que exclusivamente o
processo de hidroxilaccedilatildeo desse faacutermaco formando o metaboacutelito hidroxibupropiona 55
Diversos estudos tecircm associado as concentraccedilotildees de bupropiona e de hidroxibupropiona
em amostras de soro plasma e urina com a resposta ao faacutermaco 73 74
Zhu et al 73 em um estudo cliacutenico duplo-cego e placebo controlado os
indiviacuteduos foram tratados com bupropiona ou placebo por 6 meses Na terceira semana
de tratamento foram colhidas amostras de plasma para mensuraccedilatildeo de bupropiona e seu
principal metaboacutelito ativo a hidroxibupropiona As concentraccedilotildees mais elevadas de
hidroxibupropiona resultaram em melhores resultados de cessaccedilatildeo do tabagismo
Laib et al 74 apresentaram que as concentraccedilotildees de hidroxibupropiona em soro
foram correlacionadas com as diferentes respostas agrave bupropiona em pacientes com
depressatildeo analisadas atraveacutes de uma escala de impressatildeo clinica global
16
Quanto agrave vareniclina este eacute um faacutermaco pouco metabolizado sendo que 5 a
10 da dose pode ser encontrada na forma metaboacutelitos (soro plasma e urina) 49 Os
metaboacutelitos de vareniclina jaacute identificados em humanos em estudos preacutevios satildeo
hidroxivareniclina vareniclina N-carbomoilglucoroniacutedeo oxovareniclina N-
glicosilvareniclina e N-formilvareniclina 47 49 99 Pouco se conhece sobre as enzimas
que metabolizam a vareniclina Obach et al 49 mostrou o envolvimento da enzima
UG2B7 com o processo de glucoronidaccedilatildeo do faacutermaco Ainda natildeo haacute estudos que
associam os metaboacutelitos de vareniclina com resultados de desfecho de tratamento
17
2 JUSTIFICATIVA
Considerando a elevada prevalecircncia do tabagismo e a dificuldade dos indiviacuteduos
fumantes em se abster do tabaco estudos que apontem uma terapecircutica farmacoloacutegica
mais efetiva podem contribuir enormemente para o processo de cessaccedilatildeo tabaacutegica
Neste cenaacuterio a anaacutelise da expressatildeo de genes de interesse e a mensuraccedilatildeo de analitos
podem ser ferramentas uacuteteis na identificaccedilatildeo de marcadores e de subgrupos de resposta
ao tratamento antitabagismo
Escolhemos a realizaccedilatildeo da mensuraccedilatildeo de analitos nas amostras de soro dos
pacientes tratados com ambos os faacutermacos antitabagismo (vareniclina e bupropiona) e
especialmente para os pacientes tratados com vareniclina foram realizadas anaacutelises de
expressatildeo gecircnica de ceacutelulas mononucleares provenientes de amostras de sangue
perifeacuterico (do inglecircs Peripheral Blood Mononuclear Cell - PBMC) O ensaio
customizado para as anaacutelises da expressatildeo de 17 genes foi um grande investimento
financeiro nesta pesquisa e portanto o priorizamos para analisar as amostras dos
pacientes tratados com vareniclina jaacute que eacute o faacutermaco mais novo eficaz e custoso no
tratamento antitabagismo
As anaacutelises de expressatildeo gecircnica em amostras de PBMC satildeo de grande valia pois
seria importante encontrar em amostras de tatildeo faacutecil obtenccedilatildeo como amostras de sangue
um marcador de resposta que poderia ter correlaccedilatildeo com a expressatildeo gecircnica do sistema
nervoso central
Identificar um possiacutevel marcador preditivo de sucesso na utilizaccedilatildeo de um
determinado faacutermaco no iniacutecio da sua administraccedilatildeo foi uma das investigaccedilotildees deste
protocolo Os resultados desse estudo exploratoacuterio podem ser uacuteteis no entendimento do
comportamento de expressatildeo dos genes escolhidos (mais comumente expressos no
18
SNC) em amostras de sangue e na elaboraccedilatildeo de pesquisas mais amplas para a
identificaccedilatildeo de biomarcadores de resposta ao tratamento antitabagismo
19
3 OBJETIVOS
31 Analisar a possiacutevel associaccedilatildeo da expressatildeo de genes de interesse em amostras de
sangue perifeacuterico com a resposta ao tratamento com vareniclina
32 Analisar a possiacutevel associaccedilatildeo das concentraccedilotildees de faacutermacos antibagismo nicotina
e seus metaboacutelitos com a resposta ao tratamento com vareniclina e bupropiona
20
4 METODOLOGIA
41 Casuiacutestica
Foi realizado um estudo de coorte prospectivo no qual foram incluiacutedos 105
pacientes homens e mulheres fumantes provenientes do Programa de Assistecircncia ao
Fumante (PAF) do Instituto do Coraccedilatildeo do Hospital das Cliacutenicas da Faculdade de
Medicina da Universidade de Satildeo Paulo (InCor) com idade ge 18 anos IMC ge 185 e lt
30 kgm2 e que iniciariam o tratamento com vareniclina (n=74 para a mensuraccedilatildeo dos
analitos destes n=27 para as anaacutelises de expressatildeo gecircnica) ou com bupropiona (n=31
para a mensuraccedilatildeo dos analitos) (Figura 8)
A inclusatildeo dos pacientes ocorreu atraveacutes do protocolo de pesquisa ldquoEficaacutecia do
uso de marcadores geneacuteticos na escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismordquo o
qual foi aprovado no processo de submissatildeo ao Comitecirc de Eacutetica Institucional (CAAE
60133816000000068) - SDC 434116007 (Anexo 4) O presente estudo foi aprovado
como subprojeto do anterior atraveacutes do parecer nordm 2118913 (Anexo 1) Os pacientes
foram informados do estudo e consentiram a sua participaccedilatildeo ao assinar o termo de
consentimento livre e esclarecido (Apecircndice)
Foram excluiacutedos do estudo os pacientes que possuiacutessem desordens hepaacutetica
renal e gastrointestinal que comprometessem o metabolismo e eliminaccedilatildeo dos faacutermacos
os pacientes que faziam uso de medicamentos indutores ou inibidores das enzimas do
citocromo P450 nas uacuteltimas 6 semanas os pacientes etilistas e usuaacuterios de droga os
pacientes com doenccedilas psiquiaacutetricas instaacuteveis as mulheres em risco de gravidez e os
pacientes com contra-indicaccedilatildeo ao tratamento com bupropiona ou vareniclina
mencionados acima
21
Os pacientes foram acompanhados pela equipe do PAF e o tratamento
farmacoloacutegico foi conduzido por 12 semanas Foram considerados os seguintes
desfechos no tratamento ldquosucessordquo se o paciente parasse de fumar ateacute a 4ordf semana de
tratamento (T4) e ldquoresistenterdquo se o paciente natildeo conseguisse parar de fumar ateacute a 4ordf
semana de tratamento
22
Bupropiona
n=31
Visita T-1 Visita T0
(iniacutecio da medicaccedilatildeo)
Visita T2 Visita T4
Desfecho
Vareniclina
n=74
RNA Basal Vareniclina
n= 27
RNA RNA
Mensuraccedilatildeo de analitos vs Desfecho (T2)
vareniclina nicotina cotinina e hidroxicotinina
Mensuraccedilatildeo de analitos vs Desfecho (T2)
bupropiona hidroxibupropiona nicotina cotinina e hidroxicotinina
Soro
Soro
Figura 8 - Desenho do estudo O nuacutemero amostral total do estudo foi de 105 pacientes Foram incluiacutedos 74 pacientes tratados com vareniclina e 31 pacientes tratados com bupropiona Esses foram
submetidos agrave coleta de amostras de sangue no periacuteodo de 2 semanas (T2) apoacutes o iniacutecio da terapecircutica Apoacutes foi realizada a mensuraccedilatildeo de analitos e a anaacutelise de associaccedilatildeo com os desfechos de
tratamento Aleacutem disso os pacientes tratados com vareniclina tambeacutem foram submetidos agrave coleta de amostras para a obtenccedilatildeo de RNA em trecircs distintos periacuteodos de tempo antes de iniciar a
terapecircutica (T0) 2 semanas (T2) e 4 semanas apoacutes iniciar a terapecircutica farmacocoloacutegica (T4) Amostras de 14 pacientes que obtiveram sucesso no tratamento e de 13 que obtiveram resistecircncia (n=27)
foram analisadas quanto agrave expressatildeo de 17 genes candidatos (52 amostras ao todo 9 resistentes do tempo T0 7 resistentes do T2 8 resistente do T4 9 sucessos do T0 8 sucessos do T2 e 11 sucessos
do T4 vide toacutepico 42 Nuacutemero amostral) Apoacutes foram realizadas as anaacutelises de associaccedilatildeo entre os niacuteveis dos transcritos e os desfechos e tempos de tratamento Os pacientes foram acompanhados por
12 semanas durante o tratamento farmacoloacutegico no entanto o desfecho foi definido na 4 ordf semana (T4) pois apoacutes esse periacuteodo o tratamento seria reavaliado e poderia haver mudanccedila na medicaccedilatildeo T-
1= visita inicial T0= antes do iniacutecio da terapecircutica T2= 2 semanas apoacutes o iacutenicio do tratamento T4= 4 semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento T12= 12 semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento Desfecho na
visita T4 = ldquosucessordquo se o paciente parasse de fumar ateacute a 4ordf semana de tratamento (T4) e ldquoresistenterdquo se o paciente natildeo conseguisse parar de fumar ateacute a 4ordf semana de tratamento Fonte do autor
Visita T12
Final do tratamento farmacoloacutegico
RNA vs Desfecho (T0 T2 e T4)
14 sucessos e 13 resistentes
CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2
CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3 DRD4
HTR3A HTR3B COMT e SLC6A3
23
42 Fluxo de procedimentos adotados no atendimento aos pacientes
O tratamento farmacoloacutegico antitabagismo possui a duraccedilatildeo de 3 meses (12
semanas) No estudo de ldquoEficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticosrdquo foram coletados
dados cliacutenicos em 7 visitas T-1 (visita inicial) T0 (visita de iniacutecio do tratamento) T2
T4 T6 T8 e T12 (2 4 6 8 e 12 semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico)
Neste projeto foram utilizados os tempos de visita dos pacientes nas consultas
para a realizaccedilatildeo da coleta de amostras Dessa forma foi facilitado o comparecimento
desses pacientes ao procedimento Os pacientes precisavam estar comprometidos em
administrar os medicamentos todos os dias no horaacuterio combinado e terem
disponibilidade de tempo para as coletas as quais natildeo necessariamente coincidiram
com o horaacuterio das consultas pois as coletas foram realizadas no mesmo horaacuterio de
tomada do medicamento para que as anaacutelises de todos os pacientes pudessem ser
comparaacuteveis
Na visita T-1 foi aplicado o TCLE do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores
geneacuteticosrdquo bem como o questionaacuterio para coletar informaccedilotildees cliacutenicas Aleacutem disso os
pacientes foram avaliados quanto agrave DN atraveacutes do teste de Fagerstroumlm para DN (FTND)
100 e do escore de consumo situacional Issa (escore Issa) 101 (Anexos 2 e 3
respectivamente) O escore Issa eacute utilizado pelo PAF para a reclassificaccedilatildeo como
moderados ou altamente dependentes os pacientes que obteacutem o escore de FTND abaixo
de 5 mas que no entanto possuem niacutevel de DN consideraacutevel em relaccedilatildeo aos efeitos
psicoativos da nicotina A reclassificaccedilatildeo ocorre quando os pacientes obtecircm escore Issa
ge3 Apoacutes os pacientes foram randomizados em dois braccedilos do estudo tratamento com
vareniclina ou tratamento baseado na farmacogeneacutetica Os pacientes realizaram coleta
de sangue com o objetivo de obtenccedilatildeo do DNA para o estudo ldquoEficaacutecia do uso de
marcadores geneacuteticosrdquo
24
Apoacutes a genotipagem das amostras e escolha da medicaccedilatildeo dos pacientes
(vareniclina ou conforme geneacutetica) foi realizada ligaccedilatildeo telefocircnica para o paciente
informando o medicamento que iria tomar Nesta mesma ligaccedilatildeo o paciente tambeacutem foi
convidado a participar do presente estudo e todas as informaccedilotildees quanto agrave necessidade
de tomar o medicamento antitabagismo sempre no mesmo horaacuterio quanto aos dias das
coletas bem como as informaccedilotildees de preparaccedilatildeo para os procedimentos foram
transmitidas aos pacientes
Para os pacientes que seriam tratados com vareniclina ainda foi importante levar
em consideraccedilatildeo o horaacuterio que o paciente costumava tomar cafeacute da manhatilde para entatildeo
decidir o horaacuterio de administraccedilatildeo do faacutermaco pois o mesmo precisava ser
administrado apoacutes refeiccedilatildeo generosa com o intuito de diminuir o risco de naacuteusea
As coletas foram padronizadas para serem realizadas agraves manhatildes no mesmo
horaacuterio que o paciente tomaria a primeira dose do dia do medicamento antitabaacutegico O
horaacuterio de coleta entre os pacientes foi fixado entre 7 e 10 horas da manhatilde para evitar
variaccedilatildeo circadiana interpacientes No entanto entre as coletas do mesmo paciente o
horaacuterio de coleta e de administraccedilatildeo do medicamento foi sempre o mesmo com
variaccedilatildeo natildeo superior agrave 1 hora (esta variaccedilatildeo foi registrada)
Os pacientes foram orientados a realizar jejum de 10 horas (sendo liberada a
ingestatildeo de aacutegua e outros medicamentos ateacute 1 hora antes da coleta) e trazer o
medicamento antitabaacutegico para tomar apoacutes o procedimento A dose diurna dos
medicamentos antitabagismo natildeo foi administrada antes da coleta para evitar efeitos
agudos nas anaacutelises O periacuteodo de jejum foi realizado para que a amostra tivesse menor
quantidade de interferentes possiacutevel e tambeacutem para natildeo promover efeitos agudos dos
alimentos na expressatildeo gecircnica Um dia antes de cada coleta foi realizada ligaccedilatildeo
telefocircnica ou envio de mensagem para os pacientes com o objetivo de lembraacute-los do
25
procedimento das orientaccedilotildees de preparo e confirmar o uso e o cumprimento do horaacuterio
de administraccedilatildeo do medicamento antitabagismo (essa confirmaccedilatildeo da adesatildeo foi
realizada para as coletas nas visitas T2 e T4 quando os pacientes jaacute haviam iniciado o
tratamento farmacoloacutegico)
Na visita T0 para os pacientes que iniciariam o tratamento com vareniclina foi
aplicado o TCLE do presente projeto e colheu-se uma amostra de sangue para a
obtenccedilatildeo do RNA ainda antes de iniciarem o tratamento Foram fornecidas aos
pacientes as orientaccedilotildees de como tomar o medicamento e informaccedilotildees para a proacutexima
coleta Os pacientes foram orientados agrave tomarem o medicamento neste mesmo dia ou no
dia seguinte
Na visita T2 foram coletadas amostras de soro dos pacientes tratados com
bupropiona e amostras de soro e RNA dos pacientes tratados com vareniclina
Na visita T4 foram coletadas amostras de RNA dos pacientes tratados com
vareniclina
No Quadro 1 abaixo estatildeo resumidos os procedimentos orientaccedilotildees e coletas de
amostras
Quadro 1 - Procedimentos do protocolo em relaccedilatildeo aos pacientes
T-1 Aplicaccedilatildeo do TCLE do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores
geneacuteticosrdquo
Aplicaccedilatildeo de questionaacuterios
Coleta de DNA
1 dia antes de T0 Ligaccedilatildeo para informar o medicamento que o paciente iria tomar
Convite para participar do presente estudo
Determinar com o paciente qual era o melhor horaacuterio para
26
administraccedilatildeo do medicamento antibagismo (neste mesmo horaacuterio
que foram realizadas todas as coletas)
Orientaccedilotildees para a coleta em T0
T0 Aplicaccedilatildeo do TCLE do presente estudo
Coleta de amostra de RNA (para os pacientes que seriam tratados
com vareniclina)
Orientaccedilotildees para iniciar o tratamento no mesmo dia ou dia
seguinte
1 dia antes de T2 Orientaccedilotildees para coleta em T2
Confirmaccedilatildeo se o paciente estava tomando o medicamento e no
horaacuterio combinado
T2 Aplicaccedilatildeo do TCLE do presente estudo para os pacientes tratados
com bupropiona
Coleta de soro para os pacientes tratados com bupropiona e coleta
de RNA e soro dos pacientes tratados com vareniclina
1 dia antes de T4 Orientaccedilotildees para coleta em T2
Confirmaccedilatildeo se o paciente estava tomando o medicamento e no
horaacuterio combinado
T4 Coleta de RNA dos pacientes tratados com vareniclina
43 Coleta e armazenamento das amostras dos pacientes tratados com vareniclina e
bupropiona
Os pacientes tratados com vareniclina foram submetidos agrave coleta de sangue para
a obtenccedilatildeo de RNA em 3 periacuteodos de tempo T0 (ainda antes de iniciar o tratamento T2
27
e T4 Para isto foram utilizados os tubos PAXgene Blood RNA Tubes BRT (Qiagen
USA) para a obtenccedilatildeo de RNA Apoacutes a coleta os tubos PAXgene foram encubados em
bancada por 2 horas agrave temperatura ambiente para garantir a lise completa das ceacutelulas
sanguiacuteneas e apoacutes os tubos foram armazenados a -20degC ateacute a extraccedilatildeo do RNA das
amostras
No periacuteodo T2 tambeacutem foram coletadas amostras para a obtenccedilatildeo do soro dos
pacientes tratados com vareniclina e bupropiona Neste periacuteodo as concentraccedilotildees dos
metaboacutelitos dos faacutermacos jaacute se encontravam em estado de equiliacutebrio Para isto foram
utilizados tubos sem aditivo (Vacuette Greiner Bio-one) Os tubos foram mantidos a
temperatura ambiente ateacute a formaccedilatildeo de coaacutegulo Apoacutes os tubos foram centrifugados a
4degC a 3000 rpm por 10 min para se obter amostras de soro As amostras foram entatildeo
aliquotadas em 4 criotubos de soro e armazenadas em freezer a -80ordmC ateacute o momento
das anaacutelises
44 Nuacutemero amostral
Quanto ao nuacutemero amostral para o ensaio de expressatildeo gecircnica dos 74 pacientes
tratados com vareniclina foram escolhidas amostras de 27 pacientes (14 do grupo
sucesso e 13 do grupo resistente) baseado em estudos anteriores 83 102 que seguiram
corretamente o jejum que realizaram a tomada do medicamento nos horaacuterios
combinados e compareceram em todos e tempos de coleta Sendo ao todo 81 amostras
devido aos de 3 tempos de tratamento (T0 T2 e T4)
No entanto algumas amostras natildeo apresentaram bons resultados para a anaacutelise
de expressatildeo gecircnica e realizamos o ensaio de expressatildeo para 60 amostras de diversos
tempos Oito amostras natildeo apresentaram resultados de amplificaccedilatildeo e finalizamos com
52 amostras ao todo (9 resistentes do tempo T0 7 resistentes do T2 8 resistentes do T4
28
9 sucessos do T0 8 sucessos do T2 e 11 sucessos do T4) provenientes de 14 pacientes
do grupo sucesso e 13 do grupo resistente Esse tamanho amostral para cada grupo de
anaacutelise eacute comparaacutevel agrave estudos anteriores 102
Quanto ao nuacutemero amostral para a mensuraccedilatildeo dos analitos houve a inclusatildeo de
74 pacientes tratados com vareniclina e 31 tratados com bupropiona Nuacutemero amostral
semelhante foi utilizado no estudo de Laib et al 74 Das 105 amostras 3 amostras dos
pacientes tratados com vareniclina e 1 de paciente tratado com bupropiona apresentaram
concentraccedilotildees abaixo do limite de quantificaccedilatildeo (LQ) e estas foram excluiacutedas das
anaacutelises de concentraccedilatildeo dos analitos ficando com nuacutemero amostral final de 71 para
vareniclina e 30 para bupropiona
45 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica para amostras de pacientes tratados com
vareniclina
451 Concentraccedilatildeo purificaccedilatildeo e extraccedilatildeo de RNA
O processo de purificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo do RNA foi realizado atraveacutes do
PAXgene Blood RNA Kit (Qiagen USA) Antes de iniciar o procedimento a
temperatura dos tubos PAXgene Blood tubes (BRT) (Qiagen USA) os quais estavam
armazenados em freezer -20degC foi estabilizada mantendo os tubos em temperatura
ambiente em torno de 4 horas ou over night
Para o processo de purificaccedilatildeo do RNA primeiramente realizou-se a
homogeneizaccedilatildeo do sangue total contido no tubo PAXgene Blood tubes (BRT) e a
centrifugaccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos por 10 min em 3000 rcf havendo a formaccedilatildeo de um
pellet e o sobrenadante foi desprezado Apoacutes foi realizada a lavagem do pellet
adicionando-se 4 mL de aacutegua livre de RNase (RNFW) mistura foi submetida ao voacutertex
ateacute a dissoluccedilatildeo visiacutevel do pellet e o conteuacutedo foi centrifugado por 10 minutos a 3000
29
rcf sendo descartado o sobrenadante O pellet foi ressuspendido com 350 μL de tampatildeo
de ressuspensatildeo (BR1) atraveacutes de voacutertex ateacute a sua dissoluccedilatildeo e transferido para o tubo
de microcentrifugaccedilatildeo (15 mL MCT) Foram adicionados no tubo MCT 300 μL de
tampatildeo de ligaccedilatildeo (BR2) e 40 μL de proteinase K (PK) a mistura foi submetida ao
voacutertex durante 5 segundos e incubada durante 10 minutos a 55degC com agitaccedilatildeo de 1400
rpm provocando dessa forma a digestatildeo de proteiacutenas
Apoacutes o processo de incubaccedilatildeo foram realizados diversos processos de remoccedilatildeo
de impurezas em colunas de rotaccedilatildeo O lisado foi transferido para a coluna de rotaccedilatildeo
do homogeneizador PAXgene (PSC lilaacutes) a qual foi colocada em um tubo de
processamento (PT) de 2 mL e centrifugado durante 3 minutos agrave velocidade de 16100
rcf dessa forma foi realizada a homogeneizaccedilatildeo do lisado de ceacutelulas e remoccedilatildeo dos
detritos celulares residuais Em seguida o sobrenadante da fraccedilatildeo residual foi
transferido para o tubo de microcentrifugaccedilatildeo (15 mL MCT) novo (sem interferir no
pellet) e foram adicionados 350 μL de etanol (96-100 grau de pureza PA) a mistura
foi submetida ao voacutertex e centrifugada por breves instantes (1-2 segundos 500-1000 x g)
para remover as gotas presentes no interior da tampa do tubo
Foram transferidos 700 μL de amostra para a coluna de rotaccedilatildeo de RNA
PAXgene (PRC vermelho) esta foi colocada e um tubo de processamento (PT) de 2
mL no qual foi centrifugado durante 1 minuto a 12000 rcf Apoacutes a coluna de rotaccedilatildeo
foi colocada em um tubo PT novo (o tubo PT utilizado anteriormente foi descartado) O
restante da amostra foi colocado na mesma coluna de rotaccedilatildeo PRC e o processo de
centrifugaccedilatildeo foi repetido por mais 2 vezes sempre transferindo a coluna para um tubo
de processamento novo Antes da uacuteltima centrifugaccedilatildeo foram adicionados 350 μL de
tampatildeo de lavagem 1 (BR3) na coluna PRC
30
Em seguida foram adicionados 10 μL de soluccedilatildeo-matildee de DNase I (RNFD) a 70
μL de tampatildeo de digestatildeo de DNA (RDD) em um tubo de microcentrifugaccedilatildeo de 15
mL (MCT) O conteuacutedo foi misturado suavemente e centrifugado durante breves
instantes para colher o liacutequido residual dos lados do tubo Apoacutes 80 μL dessa mistura
foram transferidos diretamente para a membrana da coluna PRC e esta foi incubada agrave
temperatura ambiente (20-30degC) durante 15 minutos
Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foram adicionados 350 μL de tampatildeo de lavagem
1 (BR3) para a membrana da coluna e esta foi centrifugada durante 1 min a 12000 rcf
Apoacutes a coluna PRC foi colocada em um tubo (PT) novo e foram adicionados 500 μL de
tampatildeo de lavagem 2 (BR4) na membrana da coluna A centrifugaccedilatildeo foi repetida o
tubo PT foi descartado e a coluna PRC foi colocada em um novo tubo PT A lavagem
com 500 uL de BR4 e a centrifugaccedilatildeo foi repetida novamente (poreacutem o tempo de
centrifugaccedilatildeo foi de 3 minutos) Apoacutes foi realizada uma centrifugaccedilatildeo adicional em um
tubo PT novo durante 1 minuto a 12000 rcf (sem adiccedilatildeo de tampatildeo)
A coluna de rotaccedilatildeo (PRC) foi colocada em tubo de 15 mL (MCT) Foram
adicionados diretamente na membrana da coluna 80 μL de tampatildeo de eluiccedilatildeo (BR5) a
qual foi encubada agrave temperatura ambiente por 5 minutos e centrifugada por 1 minuto a
12000 rcf para eluir o RNA
As amostras foram quantificadas atraveacutes de leitura em espectrofotocircmetro no
comprimento de onda 260 nm (utilizando como branco o tampatildeo BR5) e foram
armazenadas a -20ordmC ateacute o momento das anaacutelises Para avaliar a qualidade do RNA
gerado foi realizada uma eletroforese em gel de agarose para a verificaccedilatildeo da
integridade do RNA ribossomal
31
452 Siacutentese de cDNA
O processo de siacutentese de cDNA foi realizado atraveacutes do RT2 First Strand Kit
(Qiagen USA) Os reagentes do kit foram descongelados e centrifugados brevemente
(10-15 segundos)
Primeiramente foi preparada uma mix para a degradaccedilatildeo do DNA genocircmico
composta por 2microL de tampatildeo GE 800 ng de RNA e quantidade variaacutevel de aacutegua livre
de RNase ateacute o volume final de 10 μL ou 8 μL de RNA (para amostras com
concentraccedilotildees abaixo de 100 ngμL) sem a aacutegua livre de RNase A mistura foi incubada
a 42ordmC por 5 minutos Apoacutes a incubaccedilatildeo a mistura foi colocada imediatamente em gelo
durante pelo menos 1 min
Apoacutes foi preparada uma mix para a realizaccedilatildeo da transcriccedilatildeo reversa esta foi
composta por 4 microL tampatildeo 5x (BC3) 1 microL de controle P2 (controle externo de RNA) 2
microL de mix de transcriptase reversa (RE3) e 3 microL de aacutegua livre de Rnase Foram
adicionados 10 μL da mix preparada em cada tubo contendo a mix de eliminaccedilatildeo de
DNA genocircmico A mistura foi homogeneizada delicadamente com a pipeta e incubada a
42 degC durante exatamente 15 min em seguida a reaccedilatildeo foi interrompida por incubaccedilatildeo
a 95 degC durante 5 min Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foram adicionados a cada reaccedilatildeo
91 μL de aacutegua livre de RNase e a mistura foi homogeneizada atraveacutes de pipeta diversas
vezes O produto final foi armazenado a -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo em cadeia da
polimerase (PCR) em tempo real
453 Ensaio de controle de qualidade das amostras para o ensaio de expressatildeo
gecircnica
Todas as amostras de cDNA foram analisadas quanto sua qualidade pelo ensaio
de controle de qualidade (disco QC Qiagen) em disco de 100 poccedilos (representaccedilatildeo do
32
disco nas Figuras 9 e 10) atraveacutes do PCR em tempo real com equipamento Rotor Gene
6000 (Corbett) Cada disco QC tem a capacidade de analisar 12 amostras sendo
necessaacuterios 5 discos para analisar 60 amostras
O disco QC eacute composto por primers especiacuteficos para a amplificaccedilatildeo de 2
Housekeeping genes ndash ACTB e HPRT1 (genes constitutivos que satildeo necessaacuterios para a
manutenccedilatildeo baacutesica da funccedilatildeo celular e satildeo expressos em todas as ceacutelulas de um
organismo em condiccedilotildees normais e fisiopatoloacutegicas) e 6 controles 1 controle de
transcriccedilatildeo reversa (RTC) 1 controle positivo de PCR (PPC) 1 controle de
contaminaccedilatildeo com DNA genocircmico (GDC) 1 controle de natildeo transcriccedilatildeo reversa
(NTR) 1 PPC (sem amostra) e 1 controle negativo NTC (mapa na Figura 10)
Foram preparadas 12 mixes para cada uma das amostras de cDNA Sendo 92 μL
de aacutegua livre de RNase e 08 μL de cDNA essas quantidades foram multiplicadas por 6
para se ter sobra e distribuir em 5 poccedilos cada mix de amostra (poccedilos que continham
pares de primers para 2 housekeeping genes e 3 controles) Foram distribuiacutedos 10 μL de
mix e 10 μL de RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR Master Mix (Qiagen USA) em cada
poccedilo (linhas A a E) Essa master mix conteacutem corante fluorescente intercalante de DNA
Apoacutes foram preparadas 12 mixes uma para cada amostra matildee de RNA (diluiacutedo
1100) Foram utilizados 963 μL de aacutegua livre de RNase e 072 μL de RNA (1100)
essas quantidades foram multiplicadas por 3 para se ter sobra Foram pipetados 1037
μL de mix de RNA e 963 μL de RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR Master Mix em
cada poccedilo da linha F para a anaacutelise do controle de transcriccedilatildeo reversa NTR
Apoacutes foram preparadas mixes sem as amostras para os 2 uacuteltimos controles PPC
e NTC compostas por 10 μL de aacutegua e 10 μL de RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR
Master Mix (multiplicados por 24) para as linhas G e H
33
O disco foi submetido agrave seguinte programaccedilatildeo 1 ciclo de 10 minutos a 95degC
(temperatura de ativaccedilatildeo da Taq polimerase) e 40 ciclos de 15 segundos a 95degC e 30
segundos a 60degC (para a amplificaccedilatildeo e realizaccedilatildeo da captura dos dados de
fluorescecircncia) Atraveacutes do software real-time cycler (Qiagen USA) foi ajustada a linha
de base (Threshold) do graacutefico de amplificaccedilatildeo logariacutetimica do cDNA para dessa
forma remover ruiacutedos na anaacutelise e verificar em qual ciclo de PCR que cada amostra
amplificou (cicle threshold ndash CT) (Figura 11) Os valores de CT foram planilhados e
analisados conforme os paracircmetros de qualidade (Quadro 2)
Figura 9 - Representaccedilatildeo do Rotor-Disc 100 Refere-se a um disco de material plaacutestico contendo 100
poccedilos Este veio de faacutebrica personalizado com primers para os ensaios QC ou RT2 profiler PCR array As
amostras e mixes satildeo pipetadas em cada poccedilo O disco eacute posteriormente colocado em um anel metaacutelico
proacuteprio para o encaixe no equipamento Rotor-Gene Cada poccedilo eacute nomeado com uma letra e um nuacutemero
iniciando no A1 ateacute o H12 Os quatro uacuteltimos poccedilos natildeo satildeo nomeados e natildeo conteacutem ensaio (no entanto
preenchemos com mix para equilibrar o peso do disco) Fonte do autor
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB
B HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1
C RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC
D PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC
E GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC
F NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR
G PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC
H NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC
Figura 10 - Mapa do disco QC (representaccedilatildeo planilhada) Do A1 ao B12 housekeeping genes para 12
amostras C1 ao H12 controles Cada grupo de cor representa a colocaccedilatildeo de uma mix Do A1 ao E1 mix de
A1
C1
E1
G1
34
cDNA da amostra 1 do A2 ao E2 mix de cDNA da amostra 2 (assim por diante ateacute A12 e E12) Linha F controle
com RNA diluiacutedo (1100) Linhas G e H controles com aacutegua livre de RNase Fonte do autor
Figura 11 - Exemplo de ajuste de Threshold A linha de base (Threshold) eacute ajustada na fase linear do ciclo
de amplificaccedilatildeo Dessa forma eacute possiacutevel remover os ruiacutedos e se obter o ciclo em que cada amostra foi
amplificada na PCR (CT) Fonte do autor imagem do equipamento Rotor Genereg
Quadro 2 - Paracircmetros de qualidade do ensaio QC
Controles Teste Passa no teste Falha no teste
Controle de transcriccedilatildeo reversa CT RTC (linha B) ndash CTPPC (linha G) lt5 gt5
Controle positivo de PCR CT PPC (linha G)
CT PPC (linha D) - CT PPC (linha G)
14 plusmn 2
lt3
gt16
gt3
Controle de contaminaccedilatildeo de DNA genocircmico CT GDC (linha E) gt33 lt33
Controle de natildeo transcriccedilatildeo reversa CT NTR (linha F) ge 33 ou NA lt33
Controle negativo CT NTC (linha H) ge 33 ou NA lt33
10-02
10-04
10-06
10-08
10-10
10-12
10-14
10-16
10-18
10-20
10-22
10-24
10-26
10-28
5 10 15 20 25 30 35 40
Ciclos
Flu
ore
scecircn
cia
No
rmal
izad
a
Fase Linear
35
De 60 amostras analisadas 52 passaram no teste quanto aos criteacuterios de
qualidade e prosseguiram para a anaacutelise de expressatildeo gecircnica do painel de genes
escolhidos
454 Ensaio de expressatildeo gecircnica
O protocolo de expressatildeo foi realizado por PCR em tempo real atraveacutes do
equipamento Rotor Gene 6000 (Corbett) com ensaio customizado RTsup2 Profiler PCR
Array em disco com capacidade de 100 poccedilos (Rotor-Disc 100 Qiagen USA) Nos 100
poccedilos de cada disco estavam distribuiacutedos primers especiacuteficos para o ensaio de expressatildeo
de 17 genes (Figuras 9 e 12 e Quadro 3) (17 pares de primers para cada gene repetidos 4
vezes na placa pois foi possiacutevel a anaacutelise de 4 amostras de cDNA por disco) 4 pares de
primers para os Housekeeping genes B2M GAPDH HPRT1 e ACTB (Quadro 4) e 3
controles 1 controle de contaminaccedilatildeo com DNA genocircmico (HGDC) 1 controle de
transcriccedilatildeo reversa (RTC) e 1 controle positivo de PCR (PPC) Os 4 Housekeeping
genes e os 3 controles tambeacutem satildeo repetidos 4 vezes no disco (Figura 5) Para as
reaccedilotildees foi utilizada a RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR Master Mix (Qiagen USA)
Primeiramente foi preparada 4 mixes (uma para cada amostra de cDNA) para um
disco de 100 poccedilos composta por 275 μL de 2X RT2 SYBR Green ROX FAST
Mastermix 2262 microL de aacutegua livre de RNase e 488 microL de amostra de cDNA cada Em
cada um dos poccedilos do disco foram adicionados 20 μL da mix preparada (utilizando
mixes de diferentes amostras a cada 24 poccedilos) Apoacutes deste processo o disco foi selado
com o Rotor-Disc Heat Sealer (Qiagen USA) e colocado no equipamento Rotor-Gene
6000 (Corbett) O real-time foi programado para ciclagem de PCR nas seguintes
condiccedilotildees 1 ciclo a 95deg C com duraccedilatildeo de 10 minutos 40 ciclos a 95degC por 15
segundos e 60degC por 30 segundos
36
Quadro 3 - Genes escolhidos para o ensaio de expressatildeo
CHRNA3 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α3
CHRNA4 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α4
CHRNA5 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α5
CHRNA6 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α6
CHRNA7 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α7
CHRNB2 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade β2
CHRNB3 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade β3
CHRNB4 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade β4
CHRNG Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade γ
DRD1 Codifica o receptor de dopamina tipo 1
DRD2 Codifica o receptor de dopamina tipo 2
DRD3 Codifica o receptor de dopamina tipo 3
DRD4 Codifica o receptor de dopamina tipo 4
HTR3A Codifica o receptor 3A de serotonina
HTR3B Codifica o receptor 3B de serotonina
COMT Codifica a enzima catecol-O-metiltransferase (metaboliza dopamina)
SLC6A3 Codifica a proteiacutena DAT que promove a recaptaccedilatildeo de dopamina DAT
Quadro 4 - Housekeeping genes
B2M Codifica a microbulina subunidade β2
GAPDH Codifica a enzima gliceraldeiacutedo ndash 3 fosfato desidrogenase
HPRT1 Codifica a enzima hipoxantina fosforribosiltransferase 1
ACTB Codifica a β actina
37
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
B DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
C CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
D DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
E CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
F DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
G CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
H DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
Figura 12 - Mapa do disco do ensaio RT2 profiler PCR array (representaccedilatildeo planilhada) O disco conteacutem 100 poccedilos no
entanto apenas 96 poccedilos contecircm ensaios sendo que 4 poccedilos ficam vazios A1 ao B5 = genes escolhidos para anaacutelise de
expressatildeo Do B6 ao B9= Housekeeping genes Do B10 ao B12= controles C1 ao D12 E1 ao F12 e G1 ao H12= repeticcedilatildeo dos
ensaios permitindo a anaacutelise completa de 4 amostra Cada cor diferente (a cada 2 linhas) representam a anaacutelise de uma
amostra Fonte do autor
455 Anaacutelise dos dados de expressatildeo gecircnica
Para a anaacutelise de expressatildeo gecircnica foi utilizado o meacutetodo de 2-∆∆CT 103 Apoacutes o
teacutermino da corrida do ensaio de expressatildeo gecircnica atraveacutes do software real-time cycler
(Qiagen USA) foi ajustada a linha de base (threshold) no graacutefico de amplificaccedilatildeo em
escala logariacutetmica (Figura 11) Todos os discos (total de 13) foram analisados com o
mesmo valor de threshold (010869) para que os valores de CT de todas as amostras
fossem comparaacuteveis
Os dados de CT tambeacutem foram inseridos no programa SPSS para as anaacutelises
estatiacutesticas Os valores de CT foram normalizados atraveacutes da expressatildeo dos
housekeeping genes utilizando a seguinte foacutermula ∆CT= (CTamostra ndash a meacutedia de
CThousekeeping genes) Os valores de mediana de 2-∆CT (em escala logariacutetmica) de cada grupo
foram utilizados para os testes de hipoacutetese Apoacutes foram obtidos os valores de ∆∆CT
(mediana de ∆CTgrupo teste ndash mediana de ∆CT grupo referecircncia) e o fold change (aumento ou
diminuiccedilatildeo da expressatildeo dos genes em relaccedilatildeo ao grupo referecircncia) foi calculado
atraveacutes da foacutermula 2-∆∆CT
38
46 Mensuraccedilatildeo de bupropiona vareniclina e de seus metaboacutelitos por HPLC-
MSMS
461 Materiais equipamentos e condiccedilotildees adotadas para a mensuraccedilatildeo dos
analitos apoacutes validaccedilatildeo do meacutetodo
Padrotildees analiacuteticos e padrotildees internos (PIs) deuterados bupropiona
hidroxibupropiona vareniclina (Santa Cruzreg) vareniclina d4 (TRCreg) nicotina
(ChemCruzreg) cotinina (Sigma-Aldrichreg) hidroxicotinina (Torontoreg) e
hidroxibupropiona d6 nicotina d4 cotinina d3 hidroxicotinina d3 (Cerilliantreg)
Solventes orgacircnicos Metanol acetonitrila (JT Baker) e sais acetato de amocircnio
fosfato de soacutedio (Vetecreg) fosfato de soacutedio monobaacutesico (Proquimiosreg) fosfato
de amocircnio (Reagenreg) formiato de amocircnio (Sigma-Aldrichreg)
Equipamentos e acessoacuterios
o HPLC Shimadzureg (Kyoto Japatildeo) equipado com uma vaacutelvula comutadora
de 6 vias automaacutetica
o Auto-amostrador Shimadzureg (Kyoto Japatildeo)
o Vaacutelvula comutadora de 6 vias 11R-0016H (Valcoreg Houston TX USA)
o Espectrocircmetro de massas LCMS-8030 Shimadzureg (Kyoto Japatildeo)
o Analisador de massa triplo quadrupolo (Shimadzureg Kyoto Japatildeo)
o Coluna analiacutetica ACEreg C18 (100 mm x 21 mm x 3 microm comprimento
diacircmetro interno e tamanho de partiacutecula)
o Preacute-coluna ACEreg C18 (21mm x 3 microm diacircmetro tamanho de partiacutecula)
39
o Coluna de extraccedilatildeo coluna contendo aproximadamente 70 mg do novo
RAM
Software
o LabSolutionsreg para anaacutelise dos dados e programaccedilatildeo do meacutetodo no
HPLC-MSMS
Condiccedilotildees espectrometricas e cromatograacuteficas
o Temperatura da forno da coluna 40ordmC
o Temperatura da linha de dessolvataccedilatildeo 250ordmC
o Temperatura do bloco de aquecimento 400ordmC
o Fluxo do gaacutes de nebulizaccedilatildeo 20 ml min-1
o Fluxo de gaacutes para secagem 150 ml min-1
o Energias de colisatildeo precursores e fragmentos dos analitos (Tabela 1)
o Fase moacutevel de carregamento (liberada pela bomba A) Aacutegua ultra pura
em um fluxo de 04 mL min-1
o Fase moacutevel de eluiccedilatildeoseparaccedilatildeoionizaccedilatildeo (liberada pela bomba C)
metanol tampatildeo formiato de amocircnio 001 mol L-1 pH=42 (9010 vv)
em um fluxo de 04 mL min-1
o Fase moacutevel de limpeza (liberada pela bomba B) acetonitrila aacutegua ultra
pura isopropanol (751510 vvv) em um fluxo de 10 mL min -1
o Sistema de anaacutelise ULPC-MSMS no modo columns switching em
configuraccedilatildeo backflush modo de ionizaccedilatildeo positiva por electrospray
(ESI+)
40
Tempos
o Fase de carregamento e condionamento do sistema (vaacutelvula na posiccedilatildeo
1) 0 - 30 min
o Fase de eluiccedilatildeo (vaacutelvula na posiccedilatildeo 2) 03 min
o Fase de limpeza separaccedilatildeo e anaacutelise por MS (vaacutelvula na posiccedilatildeo 1) 67
min
o Recondiocionamento do sistema (vaacutelvula na posiccedilatildeo 1) 50 min
o Tempo total incluindo todos os processos 15 min
o
Tabela 1 - Analitos precursores fragmentos e energias de colisatildeo otimizados
Analitos Precursor (mz) Fragmentos (mz) Energia de colisatildeo
(KV)
Vareniclina 212 169 -23
183 -24
141 -43
Bupropiona 240 131 -28
139 -26
103 -39
Hidroxibupropiona 256 139 -29
131 -29
167 -29
Nicotina 163 117 -28
130 -22
77 -44
Cotinina 177 80 -24
98 -21
70 -34
Hidroxicotinina 193 80 -30
134 -19
118 -21
Fragmentos quantificados
41
462 Visatildeo geral do desenvolvimento da coluna e padronizaccedilatildeo da anaacutelise
Todos os padrotildees para as anaacutelises dos analitos foram adquiridos e armazenados
conforme recomendaccedilatildeo do fabricante ateacute o momento da padronizaccedilatildeo das anaacutelises As
anaacutelises foram realizadas atraveacutes da colaboraccedilatildeo com o Prof Dr Eduardo Costa de
Figueiredo Dr Henrique Dipe Faria e Prof Dra Isarita Martins do Laboratoacuterio de
Anaacutelises de Toxicantes e Faacutermacos ndash LATF da Faculdade de Ciecircncias Farmacecircuticas da
Universidade Federal de Alfenas (Unifal MG) A escolha de cada analito foi
determinada atraveacutes de sua importacircncia cliacutenica e tambeacutem devido agrave disponibilidade dos
padrotildees dos analitos no mercado Os analitos mensurados para as amostras provenientes
dos pacientes tratados com os faacutermacos antitabagismo foram bupropiona
hidroxibupropiona vareniclina nicotina cotinina e hidroxicotinina (os trecircs uacuteltimos satildeo
proveninentes do fumo) Foi realizado um levantamento das propriedades fiacutesico-
quiacutemicas dos metaboacutelitos conforme Quadro 5
Para a remoccedilatildeo das macromoleacuteculas (como proteiacutenas) presentes na matriz de
soro foi desenvolvida uma coluna extratora de acesso restrito a partir de nanotubos
hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados com ligaccedilotildees hidrofiacutelicas (novo RAM) O
material foi desenvolvido e caracterizado antes mesmo da padronizaccedilatildeo das condiccedilotildees
de anaacutelise nos equipamentos
Foram obtidas as condiccedilotildees espectomeacutetricas (modo de ionizaccedilatildeo e as condiccedilotildees
de sua fonte temperatura do bloco de calor fluxo de gaacutes nebulizador e fluxo do gaacutes
secante) e cromatograacuteficas (tempo de retenccedilatildeo e separaccedilatildeo e aacutereas obtidas dos picos de
cada analito) Apoacutes as condiccedilotildees foram otimizadas em sistema de cromatografia liacutequida
de alta eficiecircncia multidimensional seguida por espectrometria de massa (HPLC-
MSMS) O sistema multimensional constituiacutedo por vaacutelvulas comutadoras permite a
anaacutelise online e automatizada com configuraccedilatildeo via software As vaacutelvulas permitem
42
diferentes posiccedilotildees promovendo a ocorrecircncia de eventos distintos no sistema como a
concentraccedilatildeo dos analitos e remoccedilatildeo de macromoleacuteculas atraveacutes da coluna extratora
(posiccedilatildeo 1) a eluiccedilatildeo dos analitos da coluna extratora para a coluna analiacutetica (posiccedilatildeo 2)
e novamente na posiccedilatildeo 1 ocorre a eluiccedilatildeo dos analitos da coluna analiacutetica para o
espectrocircmetro de massas a limpeza da coluna extratora e o recondionamento do
sistema
Quadro 5 - Propriedades fiacutesico-quiacutemicas dos analitos
Bupropiona
Peso molecular 27620 gmol
Ponto de fusatildeo 243-246deg C
Solubilidade em aacutegua 00693 mgmL
pKa (aacutecido forte) 1829
pKa (mais forte baacutesico) 822
Aacuterea da superfiacutecie polar 291 Aring2
Log P 36
Hidroxibupropiona
Peso molecular 25574 gmol
Ponto de fusatildeo 121-123degC
Solubilidade em aacutegua 02 mgmL
pKa (aacutecido forte) 1479
pKa (mais forte baacutesico) 765
Aacuterea da superfiacutecie polar 4933 Aring2
Log P 222
Vareniclina
Peso molecular 21127 gmol
Pressatildeo de vapor 25degC
Solubilidade em aacutegua 877 x 10-2 gL
pKa1 182 pKa2 = 973
Aacuterea da superfiacutecie polar 378 Aring2
Log P 103
43
Nicotina
Peso molecular 16223 gmol
Pressatildeo de vapor 618 degC
Solubilidade em aacutegua 100 mM
pKa 85 pKb1 616 a 15degC e pKb2 1096
Aacuterea da superfiacutecie polar 378 Aring2
Log P 117
Cotinina
Peso molecular 176215 gmol
Solubilidade em aacutegua 10 x10-6 mgL a 25degC
Aacuterea da superfiacutecie polar 332 Åsup2
Log P 007
Hidroxicotinina
Peso molecular 192214 gmol
Aacuterea da superfiacutecie polar 53 Å2
ACDLog P -148
Fonte Banco de dados Pubchem e ChemSpider Obs Algumas informaccedilotildees referentes agraves
propriedades fiacutesico-quiacutemicas dos analitos ainda natildeo estatildeo disponiacuteveis na literatura pKa= valor
negativo do logaritmo da constante de dissociaccedilatildeo de um aacutecido pKb= valor negativo do logaritmo
da constante de dissociaccedilatildeo de uma base LogP= coeficiente de particcedilatildeo
463 Desenvolvimento da coluna RAM para a purificaccedilatildeo da amostra
As amostras de soro e plasma satildeo matrizes ricas em moleacuteculas que interferem na
mensuraccedilatildeo dos analitos como lipiacutedios e principalmente proteiacutenas Estas podem
obstruir colunas analiacuteticas e diminuir a concentraccedilatildeo dos analitos jaacute que muitos destes
estatildeo ligados a essas proteiacutenas Devido a esse fato geralmente eacute realizada uma
preparaccedilatildeo das amostras antes de sua mensuraccedilatildeo Essa preparaccedilatildeo envolve processos
como a extraccedilatildeo com o uso de solventes precipitaccedilatildeo entre outros os quais geram
custo de materiais aumento do tempo de trabalho e de erros 104 105 51 106 Dessa forma
44
diversos estudos vecircm tentando desenvolver meacutetodos que natildeo exijam tanta manipulaccedilatildeo
das amostras Os materiais de acesso restrito (RAMs) estatildeo sendo utilizados para a
menor preparaccedilatildeo da amostra e sua injeccedilatildeo direta Dentre os RAMs estatildeo os nanotubos
de carbono (CNTs) modificados 107-109 Nesta colaboraccedilatildeo foi desenvolvida a coluna
extratora composta por nanotubos hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados com a
adiccedilatildeo de grupos hidrofiacutelicos Esse material entrou com pedido de patente na Agecircncia
de Inovaccedilatildeo e Empreendedorismo da Universidade Federal de Alfenas-MG atraveacutes do
Processo 230870001282019-84 e portanto a sua composiccedilatildeo e os resultados de
alguns testes da sua caracterizaccedilatildeo seratildeo mantidos em sigilo (vide declaraccedilatildeo Anexo
5)
Diferentes RAMs foram sintetizados a partir de CNTs para que fosse obtido o
melhor desempenho na remoccedilatildeo de macromoleacuteculas e retenccedilatildeo dos analitos da amostra
Os CNTs utilizados foram compostos por paredes muacuteltiplas pois apresentam uma
elevada aacuterea superficial e consequentemente uma maior capacidade de adsorccedilatildeo Os
CNTs foram adquiridos comercialmente e inicialmente foram funcionalizados a partir
de reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo aacutecida com aacutecido niacutetrico como desenvolvido por Barbosa et al 109
Os CNTs oxidados foram utilizados em etapas de siacutentese posteriores
adicionando grupos quiacutemicos hidrofiacutelicos que fossem capazes de realizar a exclusatildeo de
proteiacutenas e permitir a adsorccedilatildeo dos analitos As reaccedilotildees de siacutentese posteriores foram
semelhantes as promovidas para a realizaccedilatildeo de revestimento externo de poliacutemeros
poliacutemeros biomimeacuteticos nanomagneacuteticos com e sem acesso restrito 107 110-112 poreacutem
foram utilizadas estrateacutegias e proporccedilotildees de reagentes distintas na tentativa de obter o
RAM mais eficiente Aleacutem disso tambeacutem foi priorizada a siacutentese mais simples e
reprodutiacutevel bem como o material que apresentar maior vida uacutetil Os diferentes
materiais sintetizados foram testados em relaccedilatildeo agrave exclusatildeo de proteiacutenas e adsorccedilatildeo dos
45
analitos e tambeacutem foram realizados testes de caracterizaccedilatildeo para determinar suas
propriedades fiacutesico-quiacutemicas e confirmar a estrutura originada
A anaacutelise termogravimeacutetrica foi realizada com a finalidade de determinar a
variaccedilatildeo de massa (ganho ou perda) do RAM em funccedilatildeo de emprego de temperatura
programada proporcionando informaccedilotildees importantes a respeito da estabilidade do
material e de sua composiccedilatildeo Outras teacutecnicas tambeacutem foram utilizadas com o objetivo
de obter dados relacionados agrave estrutura e composiccedilatildeo do novo RAM como o
infravermelho e anaacutelise elementar Anaacutelises de microscopias eletrocircnicas de varredura e
de transmissatildeo tambeacutem foram realizadas para a determinaccedilatildeo da composiccedilatildeo da
superfiacutecie externa e arranjo estrutural do material com as modificaccedilotildees realizadas
Apoacutes o teacutermino do preparo do novo RAM eles foram colocados dentro de uma
coluna (aproximadamente 70 mg) conforme (Figura 13) A coluna foi posteriormente
empregada no preparo de amostras online no sistema cromatograacutefico
Figura 13 ndash Representaccedilatildeo da composiccedilatildeo da coluna extratora (Novo RAM) O novo RAM formado
a partir de nanotubos hiacutedridos de carbono e siacutelica dotado de muacuteltiplas camadas e modificados com grupos
hidrofiacutelicos promovem a retenccedilatildeo de analitos e exclusatildeo de macromoleacuteculas como proteiacutenas O RAM foi
posteriormente empacotado em coluna para a utilizaccedilatildeo em sistema cromatograacutefico Fonte adaptado do
colaborador Dr Henrique Dipe de Faria Unifal-MG
46
464 Caracterizaccedilatildeo do novo RAM
4641 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA
Na ausecircncia da coluna extratora foi preparada primeiramente uma soluccedilatildeo
aquosa de albumina de soro bovino (BSA) em uma concentraccedilatildeo de 44 mgmL-1
(semelhante agrave concentraccedilatildeo de proteiacutenas presentes no plasma humano) Foram injetados
10 microl desta soluccedilatildeo em triplicata diretamente em sistema cromatograacutefico com detector
UV ajustado a 255 nm utilizando como fase moacutevel o tampatildeo formiato de amocircnio 10
mM pH=42 em um fluxo de 04 mL min-1 O sinal detectado foi de 100 BSA
Posteriormente a coluna preenchida com 70 mg do novo RAM foi inserida no sistema
cromatograacutefico entre o injetor e o detector A soluccedilatildeo de BSA foi analisada em triplicata
novamente no entanto com a presenccedila da coluna extratora desenvolvida (novo RAM)
A aacuterea do sinal obtido nesta segunda anaacutelise dividida pela aacuterea do sinal de 100 BSA
obtida na primeira anaacutelise foi correspondente agrave porcentagem de BSA excluiacuteda pela
coluna
4642 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas no soro
Para analisar a exclusatildeo total de macromoleacuteculas (como lipiacutedios proteiacutenas e
sacariacutedeos) agora nas amostras de soro foi utilizado procedimento semelhante Na
ausecircncia da coluna extratora injetou-se no sistema cromatograacutefico em triplicata 100 μL
de amostra de soro humano branco foram testados pools de soro puros e diluiacutedos 14 A
aacutegua ultra pura foi utilizada como fase moacutevel em um fluxo de 04 mL min-1 e o sinal
obtido foi relacionado a 100 dos interferentes Apoacutes a coluna extratora (o novo
RAM) foi adionado ao sistema e a amostra foi inserida novamente A divisatildeo entre a
aacuterea do pico na primeira anaacutelise pelo pico da segunda anaacutelise refere-se agrave porcentagem
de exclusatildeo de interferentes As condiccedilotildees cromatograacuteficas foram as mesmas do teste
com BSA
47
4643 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA em diferentes pHs
O teste de exclusatildeo de proteiacutenas tambeacutem foi realizado nas mesmas condiccedilotildees
cromatograacuteficas que a anaacutelise anterior utilizando soluccedilatildeo de BSA em triplicata no
entanto diferentes soluccedilotildees como fase moacutevel (variaccedilatildeo de pH de 22 a 70) foram
testadas pois o pH pode influenciar na ionizaccedilatildeo dos analitos dos grupos funcionais
presentes na superfiacutecie do novo RAM e na interaccedilatildeo entre eles o que pode resultar em
diferentes taxas de exclusatildeo de proteiacutenas Estas soluccedilotildees foram os tampotildees fosfato de
soacutedio 10 mM (pHs 22 e 26) formiato de amocircnio 10 mM (pHs 30 a 46) acetato de
amocircnio 5 mM (pHs 52 a 66) e fosfato de soacutedio 5mM (pH 70)
465 Paracircmetros espectromeacutetricos
Com a finalidade de se obter um meacutetodo de anaacutelise capaz de detectar e
quantificar menores niacuteveis possiacuteveis de concentraccedilatildeo dos analitos foram otimizados os
paracircmetros espectromeacutetricos fluxos dos gases secantes e nebulizador modo de
ionizaccedilatildeo temperaturas da linha de dessolvataccedilatildeo e de bloco de aquecimento e as
energias de colisotildees utilizadas para fragmentar os iacuteons precursores para originar os
fragmentos iocircnicos de cada analito Foram realizadas soluccedilotildees padrotildees de cada analito e
dos padrotildees internos (PIs) deuterados (vareniclina d-4 hidroxibupropiona d6 nicotina
d4 cotinina d3 e hidroxicotinina d3) na concentraccedilatildeo de 1 mg L-1 em metanol Cada
uma destas soluccedilotildees foram injetadas separadamente no sistema em um volume de 5 microL
A fase moacutevel utilizada foi constituiacuteda por metanol tampatildeo formiato de amocircnio 001
mol L-1 pH=42 (9010 vv) em um fluxo de 04 mL min-1 e o modo de ionizaccedilatildeo
positiva (ESI+) foi utilizado pois demonstrou ser mais eficiente para ionizar as
moleacuteculas analisadas Essa otimizaccedilatildeo foi obtida utilizando o software Labsolutionsreg
48
466 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatograacutefico multidimensional
Para esta otimizaccedilatildeo foi utilizado um HPLC de dotado de vaacutelvula comutadora
automaacutetica de 6 vias e um injetor automaacutetico de amostras o que permitiu a
automatizaccedilatildeo do processo Ainda o sistema cromatograacutefico foi acoplado a um
espectrocircmetro de massas em tandem (HPLC-MSMS) dotado de um analisador de
massa triplo quadrupolo o qual possui alta sensibilidade e seletividade Incorporou-se
neste sistema uma coluna extratora preenchida com o RAM desenvolvido
O forno foi mantido a 40ordmC e o detector UV operando em um comprimento de
onda de 255 nm A fim de padronizar a anaacutelise foram testadas colunas anaacuteliticas de
diversos tamanhos e composiccedilotildees e variadas proporccedilotildees de fases de moacuteveis
Atraveacutes da anaacutelise do cromatograma foram avaliados o tempo de retenccedilatildeo e
separaccedilatildeo e as aacutereas obtidas dos picos de cada analito O sistema foi utilizado no modo
columns switching na configuraccedilatildeo backflush e as condiccedilotildees da anaacutelise foram
otimizadas como os tempos de exclusatildeo de proteiacutenas de adsorccedilatildeo e eluiccedilatildeo dos
analitos de separaccedilatildeo cromatograacutefica de limpeza da coluna extratora e de
recondicionamento do sistema bem como a composiccedilatildeo das fases moacuteveis de
carregamento de eluiccedilatildeoseparaccedilatildeo e de limpeza
Para a otimizaccedilatildeo dos paracircmetros de anaacutelise foi utilizado um pool de amostras
de soro humano branco em sexplicata Este soro foi dopado com os analitos vareniclina
bupropiona hidroxibupropiona nicotina cotinina e hidroxicotinina em 3 concentraccedilotildees
01 100 e 1000 microg L -1 e com os PIs deuterados na concentraccedilatildeo de 500 microg L -1 Como
o soro eacute uma matriz com alta concentraccedilatildeo de interferentes foram testados pools de
soro branco dopados e injetados sem diluiccedilatildeo diretamente no sistema e diluiacutedos em aacutegua
ultra pura (11) e os perfis analiacuteticos foram entatildeo avaliados
49
467 validaccedilatildeo analiacutetica
Testes para a validaccedilatildeo da anaacutelise otimizada foram realizadas conforme
diretrizes do US Department of Health and Human Services e do Food and Drug
Administration (FDA) 2013 113 Os paracircmetros avaliados foram a seletividade limite
de detecccedilatildeo (LD) limite de quantificaccedilatildeo (LQ) linearidade estabilidade dos analitos
efeito residual e de matriz e recuperaccedilatildeo da extraccedilatildeo
Os ensaios foram realizados em seis repeticcedilotildees (n=6) exceto o ensaio de
recuperaccedilatildeo (n=3) e foi utilizado um pool de amostras de soro branco dopadas com cada
um dos analitos nas concentraccedilotildees de 5 10 20 50 75 100 μg L-1 para vareniclina 1 5
50 250 500 1000 μg L-1 para bupropiona 1 10 100 500 1000 2000 para
hidroxibupropiona 5 10 50 250 500 1000 μg L-1 para nicotina cotinina e
hidroxicotinina Os PIs deuterados foram utilizados na concentraccedilatildeo de 200 μg L-1
47 Anaacutelise estatiacutestica
Em relaccedilatildeo agraves caracteriacutesticas demograacuteficas as variaacuteveis contiacutenuas foram
apresentadas como meacutedia e desvio padratildeo e as categoacutericas como frequecircncias Os testes
Shapiro-Wilk e KolmogorovndashSmirnov foram realizados para verificar a normalidade da
distribuiccedilatildeo das variaacuteveis quantitativas e assim escolher testes parameacutetricos ou natildeo
parameacutetricos Foram realizados os testes Qui-quadrado Exato de Fisher t de Student ou
Mann-Whitney para as anaacutelises comparativas de caracteriacutesticas gerais entre os grupos
de desfecho dos pacientes tanto no ensaio de expressatildeo como de mensuraccedilatildeo dos
analitos Para as anaacutelises de expressatildeo gecircnica o meacutetodo 2-∆∆CT foi utilizado 103 Como os
dados de expressatildeo natildeo apresentaram distribuiccedilatildeo normal foi realizado o teste natildeo
parameacutetrico de Mann-Whitney para testar a hipoacutetese de diferenccedila (valores de 2-∆CT)
intra e entre os grupos de desfechos (sucesso e resistente e tempos de tratamento
50
farmacoloacutegico T0 T2 e T4) Os valores de ∆∆CT (mediana de ∆CTgrupo teste ndash mediana
de ∆CTgrupo referecircncia) foram obtidos para o caacutelculo do fold change O fold-change (2-∆∆CT)
foi calculado para verificar o aumento ou diminuiccedilatildeo de expressatildeo gecircnica entre os
grupos analisados O graacutefico heat map foi construiacutedo atraveacutes do software Gene-globe
(Qiagen USA) para verificar as diferenccedilas no perfil de expressatildeo dos genes estudados
de acordo com os tempos (T0 T2 e T4) e de acordo com a efetividade de tratamento
com vareniclina (sucesso e resistente) O teste de Manny-Whitney foi utilizado para
analisar os niacuteveis de concentraccedilotildees de vareniclina de bupropiona de nicotina e de seus
metaboacutelitos de acordo com os desfechos de tratamento (sucesso e resistente) pois natildeo
apresentaram distribuiccedilatildeo normal A taxa de metabolizaccedilatildeo de nicotina (NRM) foi
calculada pela seguinte foacutermula NMR= trans-3-hidroxicotininacotinina A
hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3- hidroxicotinina
para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros da hidroxicotinina satildeo
irrelevantes 31 32 Os pacientes foram classificados em metabolizadores lentos se
NMRlt031 e normais ou raacutepidos se NMRgt031 Todas as anaacutelises estatiacutesticas foram
realizadas utilizando o software SPSS (versatildeo 20 IBM New York NY) considerando
o niacutevel de significacircncia de P lt005
51
5 RESULTADOS
Este projeto incluiu 105 pacientes sendo 74 tratados com vareniclina e 31
com bupropiona Dos 74 pacientes tratados com vareniclina amostras de 27 pacientes
foram analisadas quanto agrave expressatildeo gecircnica (14 pacientes do grupo de desfecho sucesso
e 13 do grupo resistente) Sendo provenientes destes pacientes 52 amostras ao todo (de
diversos tempos) 9 resistentes do tempo T0 7 resistentes do T2 8 resistente do T4 9
sucessos do T0 8 sucessos do T2 e 11 sucessos do T4 (vide toacutepico 42 Nuacutemero
amostral)
Quanto a mensuraccedilatildeo dos analitos foi desenvolvida uma coluna extratora para a
purificaccedilatildeo da amostra agrave base de nanotubos hiacutedridos de carbono e siacutelica modificados
com a adiccedilatildeo de grupos hidrofiacutelicos (novo RAM) o meacutetodo HPLC-MSMS
multidimensional no modo column switching e na configuraccedilatildeo backflush foi
otimizado e validado Setenta e quatro pacientes tratados com vareniclina e 31 tratados
com bupropiona foram submetidos agrave anaacutelise Apenas 4 amostras das 105 apresentaram
valores abaixo do LQ (3 de pacientes tratados com vareniclina e 1 de paciente tratado
com bupropiona) e estas foram excluiacutedas das anaacutelises dos analitos (vide toacutepico 42
Nuacutemero amostral)
51 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica
511 Dados cliacutenicos e demograacuteficos
As Tabelas 2 e 3 mostram as caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes
selecionados para o ensaio de expressatildeo gecircnica do grupo total e por grupo de desfecho
respectivamente A variaacutevel idade apresentou diferenccedila significativa entre os grupos
resistente e sucesso
52
Tabela 2 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina selecionados para os ensaios de expressatildeo gecircnica (n=27)
Idade (anos) 50 plusmn 13
Gecircnero mulheres () 464
Etnia autodeclarada brancos () 740
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 271 plusmn 50
Cigarrosdia 17 plusmn 7
FTND 62 plusmn 20
FTND ge 6 () 607
Escore Issa ge 3 () 857
Hipertensatildeo () 179
Dislipidemia () 250
Diabetes melito tipo 2 () 107
Depressatildeo () 71
Ansiedade () 286
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash
Fagerstroumlm test for nicotine dependence (escala de 0 a 10
pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
Tabela 3 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina submetidos aos ensaios de expressatildeo gecircnica de acordo com o desfecho
de tratamento
Resistente (n=13) Sucesso (n=14) Valor de P
Idade (anos) 55 plusmn 11 45 plusmn 12 0045
Gecircnero mulheres () 538 357 045
Etnia autodeclarada brancos () 769 786 100
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 271 plusmn 46 273 plusmn 54 092
Cigarrosdia 20 plusmn 6 15 plusmn 6 006
FTND 63 plusmn 22 59 plusmn 19 058
FTND ge 6 () 538 643 070
Escore Issa ge 3 () 846 857 100
Hipertensatildeo () 231 71 033
Dislipidemia () 231 286 100
Diabetes melito tipo 2 () 231 00 010
Depressatildeo () 77 71 100
53
Ansiedade () 308 357 100
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fagerstroumlm test for nicotine
dependence (escala de 0 a 10 pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
512 Dados de expressatildeo gecircnica
Dos 17 genes escolhidos para testar com a resposta ao tratamento apenas 4
apresentaram valores de amplificaccedilatildeo aceitaacuteveis para uma interpretaccedilatildeo de qualidade
mais especificamente valores de CT lt 33 Os valores das expressotildees dos genes (CTs)
foram normalizados atraveacutes das meacutedias de CT dos housekeeping genes para cada
amostra obtendo-se os valores de ∆CT = (CTgene alvo ndash meacutedia CT housekeepings genes) A
Tabela 4 mostra os valores de mediana de ∆CT dos genes analisaacuteveis de acordo com os
tempos de tratamento e grupos de desfecho
Tabela 4 - Valores de mediana de ∆CT dos genes de acordo com os tempos de
tratamento e grupos de desfecho
∆CT = (CTgene alvo ndash meacutedia CThousekeepings genes) T0= Tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico
T2= Duas semanas apoacutes o iacutenicio do tratamento farmacoloacutegico T4= Quatro semanas apoacutes o iniacutecio do
tratamento farmacoloacutegico IC 95 = Intervalo de confianccedila de 95
Resistente T0 Resistente T2 Resistente T4
∆CT IC 95 ∆CT IC 95 ∆CT IC 95
CHRNA5 818 (732 ndash 870) 845 (748 ndash 887) 767 (727 ndash 905)
CHRNA7 662 (617 ndash 697) 802 (707 ndash 848) 719 (696 ndash 786)
CHRNG 620 (579 ndash 695) 647 (601 ndash 668) 663 (602 ndash 702)
COMT 467 (440ndash 501) 480 (443 ndash 503) 487 (452 ndash 524)
Sucesso T0 Sucesso T2 Sucesso T4
∆CT IC 95 ∆CT IC 95 ∆CT IC 95
CHRNA5 832 (738 ndash 917) 707 (653 ndash 896) 837 (754 ndash 882)
CHRNA7 726 (611 ndash 842) 704 (640 ndash 779) 738 (676 ndash 820)
CHRNG 682 (619 ndash 774) 683 (656 ndash 733) 659 (625 ndash 703)
COMT 488 (430 ndash 511) 458 (433 -515) 481 (448 ndash 516)
54
513 Anaacutelise de associaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica entre os desfechos e os tempos de
tratamento
A Tabela 5 mostra o fold change e anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos de
tempos de tratamento e grupos de desfecho Foi observada diferenccedila significativa para a
expressatildeo do gene CHRNA7 no grupo resistente amostras dos tempos T2 e T4
apresentaram menor expressatildeo comparadas com amostras do T0 (fold change 038
P=0007 fold change 067 P=0004 respectivamente) Para a expressatildeo do gene
CHRNG amostras do grupo sucesso mostraram menor expressatildeo comparadas com
amostras do grupo resistente no tempo T2 (fold change= 077 P=0006)
Tabela 5 - Fold change e anaacutelise de associaccedilatildeo entre os tempos de tratamento e
grupos de desfecho
Resistente T2 vs T0 Resistente T4 vs T0 Resistente T4 vs T2
Genes 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P
CHRNA5 083 (034 ndash 233) 057 142 (030 ndash 269) 095 172 (034 ndash 303) 089
CHRNA7 038 (020 ndash 093) 0007 067 (031 ndash 101) 0004 178 (058 ndash 287) 037
CHRNG 083 (054 ndash 192) 037 074 (043 ndash 190) 044 090 (050 ndash 158) 036
COMT 091 (065 ndash 149) 092 087 (056 ndash 140) 063 095 (057 ndash 142) 073
Sucesso T2 vs T0 Sucesso T4 vs T0 Sucesso T4 vs T2
Genes 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P
CHRNA5 238 (033 ndash 623) 037 097 (037 ndash 310) 061 041 (020 ndash 268) 069
CHRNA7 116 (031 ndash 406) 064 092 (023 ndash 316) 091 079 (029 ndash 204) 055
CHRNG 099 (045 ndash 227) 049 117 (056 ndash 281) 062 118 (072 ndash 211) 033
COMT 123 (055 ndash 172) 092 105 (055 ndash 155) 068 085 (056 ndash 159) 041
Sucesso vs resistente T0 Sucesso vs resistente T2 Sucesso vs resistente T4
Genes 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P
CHRNA5 091 (028 ndash 250) 075 260 (036 ndash 506) 047 062 (034 ndash 285) 085
CHRNA7 064 (021 ndash 182) 013 197 (061 ndash 423) 009 088 (042 ndash 214) 074
CHRNG 065 (026 ndash 169) 012 077 (040 ndash 109) 0006 103 (050 ndash 171) 079
55
T0= Tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico T2= Duas semanas apoacutes o iacutenicio do tratamento
farmacoloacutegico T4= Quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico 2-∆∆CT = Fold change (diferenccedila de
expressatildeo) P valor (anaacutelise de associaccedilatildeo entre as medianas de 2-∆CT dos grupos) IC 95 = Intervalo de confianccedila
de 95
As Figura 14 e 15 mostram graacuteficos de barras das diferenccedilas de expressatildeo dos
genes CHRNA7 e CHRNG entre os tempos de tratamento e desfecho respectivamente
O heat map (Figura 16) mostra que natildeo houve diferenciaccedilatildeo nos perfis de expressatildeo
gecircnica em uma anaacutelise conjunta dos genes de acordo com os desfechos e tempos de
tratamento
Devido agrave diferenccedila significativa nas meacutedias de idade entre os grupos sucesso e
resistente foi realizada regressatildeo linear multipla na anaacutelise de expressatildeo dos quatro
genes analisaacuteveis A regressatildeo foi ajustada por idade e tambeacutem gecircnero e cigarros por
dia No entanto os resultados de expressatildeo dos genes natildeo foram impactados por estas
covariaacuteveis
COMT 086 (061 ndash 164) 090 116 (061 ndash 162) 049 104 (064 ndash 169) 093
56
Figura 14 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNA7 entre os tempos de tratamento e desfecho A Anaacutelise intragrupo do
desfecho resistente B Anaacutelise intragrupo do desfecho sucesso T0= tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico T2= duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico T4= quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico P= 0007
(resistente T2 vs T0 fold change de 038) P=0004 (resistente T4 vs T0 fold change de 067) Valor de P (anaacuteliacutese de
associaccedilatildeo entre as medianas de 2-∆CT dos grupos em uma comparaccedilatildeo dois a dois) Fonte do autor
57
Figura 15 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNG entre os tempos de tratamento e desfecho A Anaacutelise intragrupo do
desfecho resistente B Anaacutelise intragrupo do desfecho sucesso T0= tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico T2= duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico T4= quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico P= 0006
(sucesso vs resistente T2 fold change de 077) Valor de P (anaacuteliacutese de associaccedilatildeo entre as medianas de 2-∆CT dos grupos em uma
comparaccedilatildeo dois a dois) Fonte do autor
58
Figura 16 - Heat map de expressatildeo gecircnica A figura mostra a magnitude de expressatildeo gecircnica entre os grupos A cor mais clara
(verde) nos indica menor expressatildeo e a cor mais escura (vermelho) indica maior expressatildeoT0= tempo inicial antes do tratamento
farmacoloacutegico T2= duas semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico T4= quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento
farmacoloacutegico Fonte do autor gerada pelo software Gene Globe QIAGENreg
52 Mensuraccedilatildeo dos analitos
521 Caracterizaccedilatildeo da coluna teste exclusatildeo de proteiacutenas e interferentes da
matriz
Em relaccedilatildeo ao teste de capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas o pico de BSA sem
e com a nova coluna extratora apresentou tempo de retenccedilatildeo semelhante no entando a
aacuterea da curva do BSA na presenccedila do novo RAM foi bem menor do que na sua
ausecircncia conforme a Figura 17 A reduccedilatildeo de proteiacutenas (da soluccedilatildeo de BSA) pela
coluna foi de aproximadamente 98 e nas amostras de pools soro diluiacutedas (14) a
remoccedilatildeo foi de 99 (Figura 18)
A Figura 19 mostra a influecircncia do pH (escala de de 22 a 70) na exclusatildeo de
proteiacutenas fato que estaacute diretamente relacionado com a estrutura fiacutesico-quiacutemica do
RAM Diferentes pHs influenciaram na taxa de exclusatildeo de proteiacutenas esse
comportamento pode ser explicado devido agrave interaccedilotildees eletrostaacuteticas do novo RAM
com as proteiacutenas Valores de pH menores que o do ponto isoeleacutetrico das proteiacutenas
59
podem promover a prevalecircncia de proteiacutenas carregadas positivamente enquanto que
valores de pH superiores podem promover proteiacutenas carregadas negativamente 114
Dessa forma acredita-se que o comportamento de exclusatildeo de proteiacutenas do novo
material eacute semelhante ao descrito em outros estudos 108 109 115 116
Figura 17 - Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com soluccedilatildeo de BSA Graacuteficos obtidos apoacutes injeccedilatildeo de 10 microL de uma soluccedilatildeo aquosa de BSA (44 mg mL-1) no
sistema sem coluna (A) e com coluna extratora (B) A - aacuterea do pico 10142590 B - aacuterea
do pico 9713614 Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF
Unifal-MG
Figura 18 - Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com amostra de soro
diluiacuteda Graacuteficos obtidos apoacutes injeccedilatildeo de 100 microL de soro diluiacutedo em aacutegua ultra pura
(14 vv) no sistema sem coluna (A) e com coluna extratora (B) A aacuterea do pico
53981550 B - aacuterea do pico 53552824 Fonte do autor e do colaborador DrHenrique
Dipe de Faria LATF Unifal-MG
60
Figura 19 - Influecircncia do pH na exclusatildeo de proteiacutenas Fonte do autor e do colaborador Dr
Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
522 Otimizaccedilatildeo dos paracircmetros espectromeacutetricos
No processo de otimizaccedilatildeo das condiccedilotildees espectromeacutetricas foi adotado o modo
de ionizaccedilatildeo positivo (ESI+) isto eacute a ionizaccedilatildeo promove a protonaccedilatildeo (adiccedilatildeo de H+)
dos analitos e de seus fragmentos As energias de colisatildeo ideais e as muacuteltiplas transiccedilotildees
de monitoramento de reaccedilatildeo (MRM) foram otimizadas para cada analito separadamente
vide valores de energia de colisatildeo e fragmentos obtidos jaacute mostrados na Tabela 1 (no
toacutepico 461) A presenccedila de 3 fragmentos de cada analito foi necessaacuteria para a
identicaccedilatildeo qualitativa e a quantificaccedilatildeo foi dependente da concentraccedilatildeo do fragmento
mais abundante
As seguintes temperaturas foram utilizadas 40ordmC para o forno da coluna 250ordmC
para a linha de dessolvataccedilatildeo e 400ordmC para o bloco de aquecimento Foram utilizadas as
taxas de 20 ml min-1 de fluxo de gaacutes de nebulizaccedilatildeo e 150 ml min-1 de fluxo de gaacutes
para a secagem
61
523 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatrograacutefico multidimensional
Quanto a composiccedilatildeo e proporccedilatildeo da fase moacutevel responsaacutevel pela eluiccedilatildeo
separaccedilatildeo e ionizaccedilatildeo dos analitos (fase moacutevel de eluiccedilatildeo) testes foram realizados com
os solventes orgacircnicos acetonitrila ou metanol combinados com o tampatildeo formiato de
amocircnio 10 mM em diferentes pHs com proporccedilotildees que variaram de 973 vv a 7525
vv (fase orgacircnica fase aquosa) Os solventes orgacircnicos utilizados satildeo menos viscosos
em relaccedilatildeo agrave aacutegua por isso fluem mais facilmente no sistema e por serem volaacuteteis
favorecem tambeacutem a ionizaccedilatildeo dos analitos e evaporaccedilatildeo do solvente A fase moacutevel que
apresentou melhores resultados foi a composiccedilatildeo de metanol formiato de amocircnio 001
mol L-1 pH 42 (9010 vv)
Variados tipos de colunas analiacuteticas foram testadas sendo elas A NSTreg (150
mm 46 mm e 5 microm) a ACEreg (150 mm x 46 mm x 5 microm) a Phenomenexreg (250 x 46
mm x 5 microm) e a Atlantis T3 e da Watersreg (100 mm x 21 mm x 3 microm) (comprimento x
diacircmetro interno x tamanho de partiacutecula) no entanto essas colunas aumentaram o
tempo de retenccedilatildeo dos analitos pioraram o perfil cromatograacutefico gerando picos largos e
fragmentados Portanto os testes foram realizados com uma nova coluna analiacutetica a
ACEreg C18 (100 mm x 21 mm x 3 microm comprimento diacircmetro interno e tamanho de
partiacutecula) com preacute-coluna ACEreg C18 (21mm x 3 microm diacircmetro tamanho de partiacutecula)
obtendo-se um menor tempo de anaacutelise (maior frequecircncia analiacutetica) e melhor perfil
cromatograacutefico (picos simeacutetricos) para os analitos
Trecircs volumes de injeccedilatildeo de amostra foram testados (5 10 e 100 microL) devido a
baixa concentraccedilatildeo dos analitos foi adotada a maior quantidade (100 μL) pois forneceu
melhores sinais analiacuteticos Tambeacutem foi avaliado o uso do pool de soro sem diluiccedilatildeo e
diluiacutedo (11 vv) os perfis cromatograacuteficos de ambos foram oacutetimos no entanto
62
escolheu-se trabalhar com a amostra diluiacuteda para diminuir a presenccedila de interferentes e
consequentemente diminuir efeito matriz e aumentar o tempo de durabilidade da coluna
analiacutetica
Jaacute obtidas as melhores condiccedilotildees espectromeacutetricas e cromatograacuteficas foi
otimizado o sistema columm switching na configuraccedilatildeo de backflush o qual apresenta
trecircs eventos como mostrado na Figura 20
Figura 20 - Ilustraccedilatildeo do sistema de columm switching na configuraccedilatildeo de backflush Na posiccedilatildeo 1
correspondente ao evento 1 ocorre exclusatildeo dos interferentes e adsorccedilatildeo dos analitos a coluna extratora Na
posiccedilatildeo 2 durante o evento 2 ocorre a eluiccedilatildeo dos analitos adsorvidos No retorno para a posiccedilatildeo 1
correspondente ao evento 3 ocorre limpeza da coluna extratora separaccedilatildeo e detecccedilatildeo dos analitos e por fim
o recondicionamento do sistema BA = bomba A BB = bomba B BC = bomba C MS = espectrocircmetro de
massas UV = detector UV e W = descarte Fonte Traduzido de (De Faria et al 2017)
Com as vaacutelvulas do sistema na posiccedilatildeo 1 (evento 1) a bomba A promoveu a
liberaccedilatildeo da fase moacutevel de carregamento (aacutegua ultra pura) em um fluxo de 04 mL min-1 O
tempo de 3 minutos foi o necessaacuterio para a adsorccedilatildeo dos analitos e sua preacute-concentraccedilatildeo
aleacutem da eliminaccedilatildeo de macromoleacuteculas A aacutegua mostrou ser um solvente oacutetimo como fase
moacutevel de carregamento aleacutem de ser um recurso barato e natildeo causar danos ao meio
ambiente De forma simultacircnea a fase moacutevel de eluiccedilatildeo fornecida pela bomba C passa
para a coluna analiacutetica de forma a condionaacute-la ainda na ausecircncia dos analitos Ambas as
bombas operaram com uma taxa de fluxo inicial de 04 mL min -1
63
Na posiccedilatildeo 2 da vaacutelvula (evento 2) a bomba C liberou a fase moacutevel de eluiccedilatildeo
(metanol formiato de amocircnio 001 mol L-1 pH 42 (9010 vv) em direccedilatildeo agrave coluna
analiacutetica em fluxo contraacuterio ao que a fase moacutevel de carregamento percorreu (backflush) A
velocidade do fluxo da bomba C foi aumentada para 08 mL min -1 e o tempo determinado
para esta etapa foi de 03 minutos o qual promoveu um oacutetimo perfil cromatograacutefico dos
analitos
No evento 3 as vaacutelvulas foram colocadas na posiccedilatildeo 1 novamente A fase moacutevel
de eluiccedilatildeo (vinda da bomba C) novamente com um fluxo de 04 mL min-1 passou pela
coluna analiacutetica promovendo a separaccedilatildeo dos analitos e sua chegada no detector de
massas De forma simultacircnea a bomba B em um fluxo de 10 mL min -1 liberou a fase
moacutevel de limpeza (acetonitrila aacutegua ultra pura isopropanol 751510 vvv) a qual
passou pela coluna extratora (RAM) promovendo a remoccedilatildeo de resiacuteduos proveniente da
anaacutelise anterior tornando-a pronta para a reutilizaccedilatildeo em uma nova anaacutelise A fase de
limpeza ocorreu no tempo de 33 a 10 min O recondionamento do sistema agraves condiccedilotildees
iniciais de anaacutelise ocorreu nos uacuteltimos 5 min em que a fase moacutevel de limpeza foi
substituiacuteda pela fase moacutevel de carregamento O tempo total para cada anaacutelise foi de 15
minutos
Para a avaliaccedilatildeo da capacidade da fase moacutevel de limpeza (acetonitrila aacutegua
ultra pura isopropanol 751510 vvv) pools de soro branco dopado na maior
concentraccedilatildeo foram injetados no sistema (com a posiccedilatildeo 1 das vaacutelvulas mantida) e apoacutes
a realizaccedilatildeo da fase de limpeza foram injetados pools de soro branco diluiacutedos (11 vv)
O experimento foi realizado em triplicata O cromatograma do soro branco natildeo
apresentou sinal analiacutetico no mesmo tempo de retenccedilatildeo dos analitos o que mostra que a
fase moacutevel de limpeza foi eficiente em seu propoacutesito evitando o chamado efeito
residual (carry-over) De Faria et al 110
64
524 Validaccedilatildeo analiacutetica
Para os testes de validaccedilatildeo foram utilizados pools de amostras de soro branco
dopadas com cada um dos analitos nas concentraccedilotildees conforme o toacutepico 467
concentraccedilotildees menores foram utilizadas no entanto essas natildeo apresentaram bons sinais
analiacuteticos precisatildeo e exatidatildeo Os resultados dos testes de validaccedilatildeo estatildeo demonstrados
na Tabela 6
O teste de linearidade foi expresso como coeficiente de determinaccedilatildeo (r2)
calculado a partir das curvas de calibraccedilatildeo intra-ensaio Para esse teste foram utilizados
os analitos em diferentes concentraccedilotildees em soro branco conforme jaacute citado as
repeticcedilotildees geraram 6 curvas de calibraccedilatildeo para cada analito Os intervalos lineares
foram baseados nos intervalos terapecircuticos 51 117 118
As mesmas concentraccedilotildees dos analitos em soro no ensaio de linearidade foram
utilizadas no ensaio dos LD e LQ Estes foram calculados atraveacutes das 6 curvas de
calibraccedilatildeo e foram definidos como 3 e 10 vezes a relaccedilatildeo sinalruiacutedo respectivamente
para o LD e LQ
Para avaliar a precisatildeo e a exatidatildeo intra e inter-ensaios foram realizados 6
repeticcedilotildees de concentraccedilotildees de calibraccedilatildeo dos analitos Os testes intra-ensaio foram
realizados no mesmo dia e os testes inter-ensaios foram realizados em dias diferentes A
exatidatildeo foi calculada atraveacutes do erro relatico (E) e a precisatildeo atraveacutes do desvio
padratildeo relativo (RSD)
No teste de seletividade foi avaliado se houve a presenccedila picos de interferentes
nos mesmos tempos de retenccedilatildeo dos analitos e dos PIs deuterados As Figuras 21 e 22
mostram os cromatogramas obtidos apoacutes a injeccedilatildeo de soro branco e de soro dopado com
os analitos respectivamente mostrando que natildeo houve a presenccedila de interferentes nos
tempos de retenccedilatildeo dos analitos e PIs deuterados
65
Figura 21 - Cromatograma obtido de amostras de soro branco diluiacutedas em aacutegua ultra pura
Volume de injeccedilatildeo = 100 microL A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz 240rarr mz 131) C-
Hidroxibup (mz 256rarr mz 238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz 80) F-
Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G- Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr mz
244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz 134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz 196rarr
mz 80) Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
Figura 22 - Cromatograma obtido apoacutes anaacutelise de soro diluiacutedo e dopado com os analitos no niacutevel
meacutedio de calibraccedilatildeo e mais os padrotildees internos deuterados A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz
240rarr mz 131) C- Hidroxibup (mz 256rarr mz 238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz
80) F- Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G- Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr
mz 244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz 134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz 196rarr
mz 80) Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
Foram realizados os testes de estabilidade de bancada longo prazo e de
congelamento e descongelamento Para a anaacutelise de estabilidade de bancada soluccedilotildees de
soro dopada com os analitos foram analisadas imediatamente apoacutes a sua preparaccedilatildeo e
apoacutes 4 e 24 horas verificando assim a estabilidade da amostra a curto prazo Para uma
66
anaacutelise a longo prazo as amostras foram armazenadas a -20degC por 30 dias e apoacutes foram
avaliadas Quanto anaacutelises de congelamento e descongelamento foram realizados 3
ciclos de congelamento -20degC e posterior descongelamento e as amostras foram
avaliadas
O ensaio de recuperaccedilatildeo da extraccedilatildeo foi realizado em triplicata A anaacutelise
avaliou a recuperaccedilatildeo relativa comparando-se a extraccedilatildeo dos analitos a partir da matriz
de soro com a de aacutegua atraveacutes da passagem da amostra pela coluna de extraccedilatildeo (RAM)
A recuperaccedilatildeo relativa se daacute pela relaccedilatildeo das concentraccedilotildees nas duas matrizes
(concentraccedilatildeo no soro concentraccedilatildeo na aacutegua) x 100
O efeito residual (carry-over) foi avaliado injetando-se uma amostra de soro
branco antes de uma amostra de soro dopado na maior concentraccedilatildeo e apoacutes foi injetada
novamente uma amostra de soro branco foram inferior a 20 daqueles obtidos no LQ
Para avaliar o efeito matriz foram comparados os resultados da anaacutelise das
amostras de soro dopadas com os analitos em diferentes concentraccedilotildees em matrizes
diferentes (aacutegua e soro) O resultado para ser aceito precisava ser inferior a 15
Posteriormente foi realizada a mensuraccedilatildeo dos analitos em amostras reais de
soro provenientes de pacientes submetidos ao tratamento antitabagismo com doses
conforme bula As Figuras 23 e 24 mostram os cromatogramas de amostras de pacientes
submetidos ao tratamento com bupropiona e vareniclina respectivamente No momento
da coleta das amostras os pacientes estavam fumando e aleacutem de apresentarem os
analitos provenientes dos faacutermacos tambeacutem mostraram a presenccedila de analitos
provenientes da nicotina
67
Figura 23 - Cromatograma obtido atraveacutes da anaacutelise das amostras de soro dos pacientes
tratados com bupropiona (150 mg 2xdia) Os pacientes estavam fumando em torno de 10
cigarrosdia no dia da coleta A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz 240rarr mz 131) C-
hidroxibup (mz 256rarr mz 238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz 80) F-
Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G- Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr mz
244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz 134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz
196rarr mz 80) Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
Figura 24 - Cromatograma obtido atraveacutes da analise de amostras de soro de pacientes tratados
com vareniclina (10 mg 2xdia) Os pacientes fumavam em torno de 10 cigarrosdia no dia da
coleta A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz 240rarr mz 131) C- hidroxibup (mz 256rarr mz
238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz 80) F- Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G-
Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr mz 244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz
134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz 196rarr mz 80) Fonte do autor e do
colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
68
Tabela 6 - Paracircmetros de validaccedilatildeo obtidos na determinaccedilatildeo de faacutermacos antitabagismo em soro humano
Meacutedia plusmn Desvio padratildeo (n=6) amenor bmeacutedio e calto niacutevel de calibraccedilatildeo 1Estabilidade de bancada (4 a 24 horas) Precisatildeo RSD = [Desvio padratildeomeacutedia] x 100 E = [(Meacutedia experimental da
concentraccedilatildeo Concentraccedilatildeo nominal) x 100] ndash 100 2Efeito matriz E= [(Meacutedia da concentraccedilatildeo experimental no solventeMeacutedia experimental da concentraccedilatildeo no soro) x 100] ndash 100
Paracircmetros de validaccedilatildeo Vareniclina Bupropiona Hidroxibupropiona Nicotina Cotinina Hidroxicotinina
Intervalo linear (microg L-1) 5-100 1-1000 1-2000 5-1000 5-1000 5-1000
r2 ( n=6) 09952 09998 09998 09997 09998 09999
Decliacutenio (α) ( n=6) 00196plusmn 00095 00045plusmn00059 00051plusmn00057 00087plusmn00012 00073plusmn00048 00075plusmn00074
Intercepto ( n=6) -00316plusmn00004 -00022plusmn00020 00230plusmn00025 -00046plusmn00065 00767plusmn00012 01918plusmn00013
Tempo de retenccedilatildeo (min) 521 501 485 497 446 441
LD (microg L-1) 25 07 06 19 24 37
LQ (microg L-1) 50 10 10 50 50 50
Precisatildeo intra-ensaio RSD ( n=6) 93a
30a
100c
153a
37b
21c
140a
06b
06c
90a
26b
11c
117a
34b
61c
128a
138b
92c
Precisatildeo inter-ensaio RSD ( n=18 trecircs dias) 185a
115b
66c
82a
27b
20c
109a
17b
10c
83a
27b
14c
158a
41b
31c
161a
44b
92c
Acuraacutecia intra-ensaio E ( n=6) 196a
54b
-30c
-55a
-24b
-11c
-65a
19b
-04c
158a
09b
-26c
-87a
47b
-24c
71a
18b
05c
Acuraacutecia inter-ensaio E ( n=18 trecircs dias) 82a
-16b
035c
41a
-01b
-01c
-87a
27b
-20c
146a
40b
018c
-120a
25b
-110c
58a
-35b
30c
Recuperaccedilatildeo da extraccedilatildeo ( n=3) 883a
1104b
1014c
1101a
1009b
1028c
945a
1094b
1078c
1098a
1088b
1146c
941a
1093b
1116c
1167a
1112b
1141c
Estabilidade1 E
( n=6)
98a
11b
-50c
71a
-32b
-38c
140a
-16b
-79c
40a
-79b
-110c
-132a
-94b
-32c
86a
125b
-54c
Efeito matriz2 E
( n=6)
-117a
104b
14c
101a
09b
28c
-55a
94b
78c
98a
88b
146c
-59a
93b
116c
167a
112b
141c
69
525 Dados cliacutenicos e demograacuteficos dos pacientes submetidos a mensuraccedilatildeo dos
analitos
As Tabelas 7 a 10 mostram as caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos
pacientes submetidos agraves anaacutelises de concentraccedilatildeo dos analitos
As Tabelas 7 e 8 referem-se aos pacientes tratados com vareniclina sendo
considerado o grupo total e os grupos de desfecho respectivamente Os pacientes do
grupo resistente agrave vareniclina fumavam um maior nuacutemero de cigarrosdia (antes do
tratamento) em comparaccedilatildeo com os pacientes que obtiveram sucesso (21 vs 17
cigarrosdia P= 005)
As Tabelas 9 e 10 referem-se aos pacientes tratados com bupropiona no grupo
total e de acordo com desfecho respectivamente O grupo resistente ao tratamento com
bupropiona apresentou maior frequecircncia de pacientes com alta DN (atraveacutes dos escores
FTND e Issa categorizados) e de pacientes que fumavam no dia da coleta em
comparaccedilatildeo ao grupo sucesso (FTNDge6= 833 vs 429 P= 005 Escore Issage3=
1000 vs 429 P= 0001 fumo no dia da coleta= 1000 vs 429 P= 0001
respectivamente)
Tabela 7 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos (n= 74)
Idade (anos) 51 plusmn 12
Gecircnero mulheres () 500
Etnia autodeclarada brancos () 730
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 263 plusmn 49
10 1 4 1
7 1 3 1
8 1 3 1
9 1 3 1
8 1 4 1
5 0 3 1
8 1 4 1
8 1 4 1
7 1 4 1
7 1 3 1
9 1 3 1
7 1 4 1
Cigarrosdia inicial 19 plusmn 10
Fumo no dia da coleta () 919
FTND 62 plusmn 23
FTND ge 6 () 644
70
Escore Issa ge 3 () 851
Hipertensatildeo () 311
Dislipidemia () 392
Diabetes melito tipo 2 () 95
Depressatildeo () 135
Ansiedade () 176
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash
Fagerstroumlm test for nicotine dependence (escala de 0 a 10 pontos)
Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala de 0 a 4
pontos)
Tabela 8 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com o
desfecho de tratamento
Resistente (n=41) Sucesso (n=33) P valor
Idade (anos) 53 plusmn 11 49 plusmn 13 023
Gecircnero mulheres () 561 424 024
Etnia autodeclarada brancos () 683 788 031
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 270 plusmn 40 255 plusmn 58 028
Cigarrosdia 21 plusmn 11 17 plusmn 7 005
Fumo no dia da coleta () 976 848 008
FTND 65 plusmn 22 57 plusmn 23 019
FTND ge 6 () 659 625 077
Escore Issa ge 3 () 829 879 075
Hipertensatildeo () 390 212 010
Dislipidemia () 341 455 032
Diabetes melito tipo 2 () 73 121 069
Depressatildeo () 122 152 071
Ansiedade () 146 212 046
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fagerstroumlm test for nicotine
dependence (escala de 0 a 10 pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
71
Tabela 9 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos (n= 31)
Idade (anos) 52 plusmn 11
Gecircnero mulheres () 71
Etnia autodeclarada brancos () 931
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 258 plusmn 57
Cigarrosdia inicial 21 plusmn 7
Fumo no dia da coleta () 871
FTND 68 plusmn 21
FTND ge 6 () 742
Escore Issa ge 3 () 871
Hipertensatildeo () 226
Dislipidemia () 323
Diabetes melito tipo 2 () 32
Depressatildeo () 65
Ansiedade () 194
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash
Fagerstroumlm test for nicotine dependence (escala de 0 a 10
pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
Tabela 10 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com
o desfecho de tratamento
Resistente (n=24) Sucesso (n=7) Valor de P
Idade (anos) 53 plusmn 11 50 plusmn 11 054
Gecircnero mulheres () 708 714 100
Etnia autodeclarada brancos () 957 833 038
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 252 plusmn 61 278 plusmn 35 015
Cigarrosdia 21 plusmn 7 23 plusmn 7 071
Fumo no dia da coleta () 1000 429 0001
FTND 73 plusmn 15 54 plusmn 32 011
FTND ge 6 () 833 429 005
Escore Issa ge 3 () 1000 429 0001
Hipertensatildeo () 292 00 016
72
Dislipidemia () 375 143 038
Diabetes melito tipo 2 () 42 00 100
Depressatildeo () 83 00 100
Ansiedade () 250 00 029
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fagerstroumlm test for nicotine
dependence (escala de 0 a 10 pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
526 Anaacutelise de associaccedilatildeo dos analitos com desfecho de tratamento
A Tabela 11 mostra a frequecircncia do desfecho de tratamento de acordo com os
medicamentos antitabagismo pacientes estes cujas amostras de soro foram submetidas agrave
mensuraccedilatildeo dos analitos
Tabela 11 ndash Frequecircncia do desfecho de tratamento nos pacientes submetidos agraves
anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com os medicamentos
antitabagismo
Medicamento Resistente () Sucesso ()
Vareniclina (n=74) 544 446
Bupropiona (n=31) 774 226
As Tabelas de 12 a 15 mostram as concentraccedilotildees dos analitos nas amostras de
soro dos pacientes tratados com vareniclina e bupropiona no grupo total e de acordo
com o desfecho de tratamento
Os pacientes do grupo resistente tanto os pacientes tratados com vareniclina
(Tabela 13) quanto com bupropiona (Tabela 15) apresentaram concentraccedilatildeo
significativamente maior de cotinina e hidroxicotinina do que os grupos sucesso
(tratamento com vareniclina cotinina= 1182 vs 706 μgL P= 0009 hidroxicotinina=
845 vs 516 μgL P= 002 Tratamento com bupropiona cotinina= 1346 vs 160 μgL
P= 0005 hidroxicotinina= 972 vs 374 μgL P= 0004) No entanto quanto ao NMR
natildeo houve diferenccedila entre os desfechos de tratamento de ambos os faacutermacos Aleacutem
73
disso somente o grupo de pacientes tratados com vareniclina continha pacientes com
NMRlt031 (metabolizadores lentos para nicotina) e ainda sua frequecircncia foi baixa
(100 e 43 para os grupos de desfecho resistente e sucesso respectivamente)
Tabela 12 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos pacientes tratados
com vareniclina
Vareniclina μgL n=71 83 (81 ndash 95)
Nicotina μgL n=31 75 (76 ndash 112)
Cotinina μgL n=65 1007 (923 ndash 1225)
Hidroxicotinina μgL n=65 681 (638 ndash 874)
NMR n=63 069 (067 ndash 102)
NMR lt031 () n=63 79
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de
95) NMR=trans-3-hidroxicotininacotinina NMR lt031=
metabolizador lento NMR ge031= metabolizador normal e raacutepido A
hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo
trans-3- hidroxicotinina para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade
de outros isocircmeros satildeo irrelevantes
Tabela 13 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de tratamento
com vareniclina
Resistente Sucesso P
valor Vareniclina μgL n=71 84 (78 ndash 99) 83 (77 ndash 97) 096
Nicotina μgL n=31 83 (74 ndash 127) 70 (59 ndash 105) 032
Cotinina μgL n=65 1182 (1012 ndash 1426)
111114143ndash
1421426)
706 (643 ndash 1037) 0009
Hidroxicotinina μgL n=65 845 (702 ndash 1032) 516 (434 ndash 721) 002
NMR n=63 074 (062 ndash 107) 061 (055 ndash 113) 064
NMR lt031 () n=63 100 43 064
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de 95) NMR=trans-3-
hidroxicotininacotinina NMR lt031= metabolizador lento NMR ge031= metabolizador normal e
raacutepido A hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3- hidroxicotinina
para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros satildeo irrelevantes
74
Tabela 14 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos pacientes tratados
com bupropiona
Bupropiona μgL n=30 369 (332 ndash 493)
Hidroxibupropiona μgL n=23 7368 (5860 ndash 7824)
Nicotina μgL n=13 71 (62 ndash 109)
Cotinina μgL n=27 1159 (971 ndash 1648)
Hidroxicotinina μgL n=28 931 (838 ndash 1387)
NMR n=27 090 (074 ndash 149)
NMR lt031 () n=27 0
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de 95) NMR=
trans-3-hidroxicotininacotinina NMR lt031= metabolizador lento NMR
ge031= metabolizador normal e raacutepido Natildeo houve pacientes com NRM lt031 A
hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3-
hidroxicotinina para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros
satildeo irrelevantes
Tabela 15 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de tratamento
com bupropiona
Resistente Sucesso P
valor Bupropiona μgL n=30 372 (331 ndash 533) 300 (214 ndash 481) 048
Hidroxibupropiona μgL n=23 7795 (6078 ndash 8308) 5128 (2957 ndash 8195) 012
Nicotina μgL n=13 71 (62 ndash 109) - -
Cotinina μgL n=27 1346 (1097 ndash 1784) 160 (-195 ndash 712) 0005
Hidroxicotinina μgL n=28 972 (929 ndash 1520) 374 (33 ndash 847) 0004
NMR n=27 084 (076 ndash 109) 132 (-371 ndash 884) 014
NMR lt031 () n=27 0 0 -
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de 95) NMR= trans-3-
hidroxicotininacotinina NMR lt031= metabolizador lento NMR ge031= metabolizador normal e raacutepido
No grupo sucesso somente 1 paciente apresentou concentraccedilatildeo de nicotina Natildeo houve pacientes com NRM
lt031 A hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3- hidroxicotinina para o
caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros satildeo irrelevantes
75
6 DISCUSSAtildeO
61 Para os dados da anaacutelise de expressatildeo gecircnica
O presente estudo cliacutenico e exploratoacuterio identificou resultados significativos para
expressatildeo dos genes CHRNA7 e CHRNG de acordo com os tempos de coleta e o
desfecho de tratamento com vareniclina Amostras do grupo resistente nos tempos T2 e
T4 isto eacute jaacute com o uso da vareniclina apresentaram menores niacuteveis de expressatildeo
gecircnica do CHRNA7 comparado agraves amostras do T0 (antes de iniciar o tratamento
farmacoloacutegico) Estes resultados sugerem que o downregulation de α7 pode ter sido
responsaacutevel pela natildeo cessaccedilatildeo do fumo nos indiviacuteduos do grupo resistente o que natildeo foi
observado nas amostras do grupo sucesso
O gene CHRNA7 codifica a subunidade α7 dos nAChRs Esta possui grande
importacircncia estaacute presente em diversos tecidos e possui associaccedilatildeo consistente em
vaacuterios estudos com o processo de dependecircncia agrave nicotina processos cognitivos e
imunoloacutegicos 119-124 Estudos tambeacutem mostraram que haacute um locus contendo duplicaccedilatildeo
do gene CHRNA7 truncada composta pelos exons 5-10 do gene CHRNA7 precidida de
4 exons uacutenicos e uma deleccedilatildeo de dois pares de bases no eacutexon 6 o qual nomearam como
CHRNFAN7 A maioria dos indiviacuteduos possui uma ou duas coacutepias deste gene e satildeo
raros os casos em que esta coacutepia natildeo estaacute presente 125 126
No ceacuterebro de ratos Sprague-Dawley Ryan e Loiacono 119 detectaram niacuteveis de
α7 transcritos em diversos locais como na substacircncia negra compacta (SNpc) na
substacircncia negra reticular (SNpr) na aacuterea tegmental ventral (VTA) no coacutertex e no
hipocampo Os ratos submetidos ao tratamento crocircnico com nicotina mostraram maiores
niacuteveis de mRNA da subunidade α7 em SNpc SNpr e VTA em comparaccedilatildeo ao grupo
controle A VTA faz parte do sistema de recompensa mesoliacutembico o qual eacute muito
estudado nos processos de ND 12 15 No presente estudo (em amostras de PBMC) o
76
grupo de pacientes resistentes tambeacutem apresentou maior expressatildeo de α7 no momento
em que somente a nicotina estava presente no fumo crocircnico Ao introduzir a vareniclina
as expressotildees foram diminuiacutedas nos tempos T2 e T4 provavelmente devido ao
antagonismo competitivo da vareniclina com a nicotina no receptor
Benhammou et al 127 realizaram um estudo com amostras de ceacuterebro post mortem
de fumantes e com amostras de sangue de voluntaacuterios fumantes e natildeo fumantes Atraveacutes
do uso de nicotina radiomarcada nas amostras de ceacuterebro mostraram que os siacutetios de
ligaccedilatildeo agrave nicotina foram aumentados proporcionamente conforme o nuacutemero de cigarros
por dia O mesmo estudo ao analizar a expressatildeo gecircnica e proteiacutenas em linfoacutecitos e
ceacutelulas polimorfonucleares para um subconjunto de subunidades de receptores
nicotiacutenicos essas ceacutelulas assim como no tecido cerebral exibiram maiores nuacutemeros de
siacutetios de ligaccedilatildeo de alta afinidade agrave nicotina em fumantes em comparaccedilatildeo com natildeo
fumantes
A vareniclina em estudos funcionais mostrou ter atividade agonista total nos
receptores α7 40 Em um estudo realizou-se o tratamento crocircnico com vareniclina eou
nicotina em camundongos (10 dias) os niacuteveis das drogas no ceacuterebro e no plasma e a
toleracircncia e a expressatildeo de 4 subtipos de nAChR apoacutes dose aguda de nicotina foram
checados usando autoradiografia O upregulation de receptores α4β2 devido ao
tratamento crocircnico com vareniclina foi similar ao promovido pela nicotina e tambeacutem
ocorreu dowregulation de α6β2 assim como ocorreu com o uso de nicotina A
vareniclina aumentou significantemente os siacutetios de α3β4 e α7 enquanto a nicotina teve
menor efeito nestes siacutetios A combinaccedilatildeo da nicotina com a vareniclina foi similar agrave
vareniclina sozinha para os siacutetios de α3β4 enquanto para o siacutetio de α7 a combinaccedilatildeo
promoveu upregulation em menos regiotildees cerebrais em comparaccedilatildeo com a vareniclina
em monoterapia 77
77
No presente estudo os pacientes do grupo resistente apresentaram efeito
semelhante associado ao uso combinado de vareniclina e nicotina (devido ao fumo) os
niacuteveis de expressatildeo de CHRNA7 natildeo foram mantidos como nos pacientes que obtiveram
sucesso no tratamento No entanto o grupo sucesso soacute estava utilizando a vareniclina na
ausecircncia de nicotina entre os tempos T2 e T4 o que sugere que esse dowregulation
pode ocorrer em subgrupo de resposta
Diversos estudos mostraram diferenccedilas na expressatildeo gecircnica de a7 em
amostras de pacientes com diagnoacutesticos psiquiaacutetricos em comparaccedilatildeo com indiviacuteduos
sadios 102 128-134
Kunii et al 128 mostraram diferenccedila na expressatildeo de a7 em coacutertex preacute-frontal
dorsolateral post mortem de pacientes com depressatildeo ansiedade e transtorno bipolar e
inuacutemeros estudos mostraram menores niacuteveis de expressatildeo de α7 em pacientes com
esquizofrenia 102 129-134
Estudos de indiviacuteduos com esquizofrenia satildeo oacutetimos modelos para o
entendimento da importacircncia do receptor a7 em processos cognitivos em ND e em
como esses mecanismos estatildeo intimamente relacionados Diversos estudos mostraram
que haacute uma maior prevalecircncia de tabagismo em indiviacuteduos com esquizofrenia
comparados agrave populaccedilatildeo geral 135 136
Mexal el al 102 realizaram um estudo com amostras de ceacuterebro post mortem
provenientes de indiviacuteduos de 4 grupos distintos controle natildeo fumante controle
fumante pacientes com esquizofrenia natildeo fumantes e pacientes com esquizofrenia
fumantes O estudo realizou ensaio de expressatildeo de mRNA e de proteiacutena atraveacutes de
PCR quantitativo em tempo real e western blot As sondas da PCR foram desenhadas
para amplificar o gene completo CHRNA7 e sua coacutepia duplicada o CHRFAM7A Natildeo
fumantes com esquizofrecircnia apresentaram expressatildeo reduzida de mRNA e de proteiacutena
78
em relaccedilatildeo aos pacientes com esquizofrenia fumantes Natildeo fumantes com esquizofrenia
apresentaram menor expressatildeo em relaccedilatildeo ao controle natildeo fumante mas essa diferenccedila
foi estatisticamente significativa apenas no niacutevel do mRNA Outros estudos post
mortem cerebral mostraram menor expressatildeo dos receptores nicotiacutenicos no coacutertex e no
hipocampo de indiviacuteduos com esquizofrecircnia comparado aos controles saudaacuteveis 129-134
O CHRFAM7A assim como o CHRNA7 eacute polimoacuterfico e variantes neste gene
foram associadas agrave patologia auditoacuteria em casos de esquizofrenia Processos
diferenciados nos mecanismos de transcriccedilatildeo podem contribuir para um funcionamento
anormal de a7 como variaccedilotildees em promotor splicing alternativo eou desequiliacutebrio de
ligaccedilatildeo com o SNP do gene de neuroregulina -1 (gene que codifica moleacutecula de adesatildeo
celular envolvida em processos de neuroplasticidade sinaacuteptica) Estes processos podem
estar envonvidos em endofenoacutetipos da doenccedila 122 126 137-144
A nicotina parece melhorar a audiccedilatildeo em indiviacuteduos com deacuteficit auditoacuterio na
esquizofrenia associado ao α7 permitindo uma melhor filtragem dos estiacutemulos
auditivos estranhos A nicotina melhora a cogniccedilatildeo na esquizofrenia e agentes
alternativos que ativam o receptor nicotiacutenico foram testados e esses compostos
melhoraram a atenccedilatildeo a memoacuteria de trabalho e os sintomas negativos em um estudo
complementar de pacientes natildeo fumantes com esquizofrenia 145
Os estudos citados nos mostram grandes evidecircncias da associaccedilatildeo do α7 com
ND processos cognitivos e de resposta agrave vareniclina Esses achados podem explicar
nossos resultados em relaccedilatildeo agrave diminuiccedilatildeo da expressatildeo de 7 no grupo de pacientes
resistentes ao tratamento Os pacientes do grupo sucesso mantiveram os niacuteveis de
expressatildeo gecircnica em resposta agrave vareniclina jaacute no grupo resistente houve um
dowregulation Sugerimos que essa diminuiccedilatildeo pode ter sido a responsaacutevel ao menos
em parte pelos indiviacuteduos natildeo terem conseguido deixar de fumar A nicotina pode estar
79
compensando um deacuteficit de α7 que os indiviacuteduos resistentes podem apresentar No
entanto natildeo sabemos como seria a expressatildeo de α7 nestes indiviacuteduos na ausecircncia do
fumo
Quanto ao gene CHNRG natildeo haacute muitos resultados na literatura Este codifica
a subunidade γ dos receptores nicotiacutenicos A maioria dos estudos aponta associaccedilatildeo da
subunidade com distuacuterbios esqueleacutetico-musculares 146-149
No entanto King et al 65 encontraram a associaccedilatildeo de polimorfismos neste
gene com nausea no tratamento com vareniclina E Keskitalo-Vuokko 150 et al
encontraram associaccedilatildeo de SNPs em loci do cluster de genes CHRNGCHRND (genes
muitos proacuteximos o uacuteltimo codifica a subunidade delta dos nAChRs) com o niacutevel de
cotinina Saccone et al 151 encontraram a associaccedilatildeo de 4 loci no cluster
CHRNDCHRNG com ND Em outro estudo variantes nos genes CHRNDCHRNG
mostraram associaccedilatildeo modesta com o risco de ND em amostras de afro-americanos 152
Em um estudo o qual foi utilizado um modelo de esquizofrenia em ratos no
grupo de animais tratados com clozapina foi encontrado downregulation do Chrng no
nuacutecleo accumbens Neste mesmo estudo Santoro et al natildeo conseguiram formular uma
hipoacutetese para o achado devido ao lack de informaccedilotildees na literatura com o foco em ND
ou performance cognitiva 153
Haacute algumas limitaccedilotildees no estudo Primeira o ensaio da anaacutelise de expressatildeo
gecircnica foi realizado com amostras de sangue perifeacuterico e natildeo no SNC o que poderia nos
mostrar uma relaccedilatildeo mais clara e direta do faacutermaco com a via de resposta No entanto a
obtenccedilatildeo desta amostra eacute inviaacutevel Em contrapartida estudos jaacute demonstraram que haacute
similaridade entre a expressatildeo gecircnica de ceacutelulas do SNC e de ceacutelulas de sangue
perifeacuterico para alguns destes genes de receptores nicotiacutenicos 102 Segunda natildeo foi
realizado ensaio de expressatildeo gecircnica para amostras de indiviacuteduos natildeo fumantes o que
80
poderia fornecer mais paracircmetros de comparaccedilatildeo com os grupos resistente e sucesso
Terceira natildeo conseguimos qualidade necessaacuteria nas anaacutelises de genes potencialmente
importantes
62 Para os dados da mensuraccedilatildeo dos analitos
Um dos maiores desafios em anaacutelises de amostras bioloacutegicas eacute eliminar os
interferentes de sua matriz sem alterar substancialmente as quantidades dos analitos
presentes A matriz de amostras de soro e plasma satildeo complexas e envolve a presenccedila
de inuacutemeras macromoleacuteculas como lipiacutedios e proteiacutenas que obstruem colunas anaacuteliticas
diminuem o tempo de duraccedilatildeo de equipamentos e inviabilizam a interpretaccedilatildeo dos
dados devido a imensos picos e ruiacutedos formados nos cromatogramas e espectros de
massa Inumeros trabalhos executam uma preparaccedilatildeo preacutevia das amostras que envolve
processos como a extraccedilatildeo com uso de solventes preciptaccedilatildeo de proteiacutenas entre outros
os quais podem promover uma baixa recuperaccedilatildeo dos analitos tempo prolongado de
bancada e gasto de materiais 51 104-106
Devido agrave esse fato inuacutemeros estudos propuseram o uso de materiais de acesso
restrito (RAMs) para a purificaccedilatildeo da amostra sem tanto manuseio dentre eles estatildeo os
nanotubos de carbono (CNTs) modificados 109 110 114-116
O presente estudo desenvolveu uma coluna extratora composta por nanotubos
hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados quimicamente com a adiccedilatildeo de grupos
hidrofiacuteficos Essa coluna permitiu uma oacutetima exclusatildeo de macromoleacuteculas (98) A
aacutegua ultra pura foi o suficiente para ser utilizada como fase moacutevel de carregamento o
que eacute sustentaacutevel aleacutem de natildeo causar danos ao meio ambiente e o uacutenico preparo da
amostra foi uma diluiacuteccedilatildeo 11 tambeacutem em aacutegua O novo RAM desenvolvido foi
81
encaminhado para pedido de patente (Anexo 5) e portanto os processos para o seu
desenvolvimento foram mantidos em sigilo
Os CNTs possuem uma grande aacuterea superfiacutecial e oacutetima estabilidade em anaacutelise
de compostos no entanto o material natildeo promove a remoccedilatildeo de proteiacutenas com
eficiecircncia 110 115 Os poros dos CNTs formam uma barreira fiacutesica excluindo ou
permitindo a entrada de moleacuteculas por tamanho e os grupos hidrofiacutelicos adicionados ao
RAM desenvolvido natildeo permitem a ligaccedilatildeo de proteiacutenas de forma irreversiacutevel
formando uma barreira fiacutesico-quiacutemica Os demais CNTs natildeo modificados disponiacuteveis
natildeo promovem a exclusatildeo de macromoleacuteculas com tanta efetividade quanto o material
desenvolvido aleacutem disso o novo RAM apoacutes limpeza pode ser reutilizado cerca de 400
vezes (valor calculado durante os experimentos com amostras controle)
Quanto a otimizaccedilatildeo do meacutetodo de mensuraccedilatildeo a anaacutelise multidimensional
atraveacutes de equipamentos conectados por vaacutelvulas comutadoras promoveu a realizaccedilatildeo
da extraccedilatildeo eluiccedilatildeo anaacutelise limpeza e recondicionamento do sistema automaacuteticamente
A anaacutelise completa de uma amostra foi realizada em apenas 15 minutos O sistema
permitiu a mensuraccedilatildeo conjunta de diversos analitos com caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas
diferentes de uma mesma amostra mostrando bons sinais analiacuteticos e perfis
cromatograacuteficos
Quanto aos dados de validaccedilatildeo o meacutetodo permitiu uma oacutetima recuperaccedilatildeo dos
analitos com valores proacuteximos a 100 semelhante a outros estudos 104 117 154 155 A
maior dificuldade encontrada neste estudo foi a configuraccedilatildeo de paracircmetros
espectromeacutetricos e cromatograacuteficos que pudessem obter o maacuteximo de recuperaccedilatildeo e o
menor LQ possiacutevel para a anaacutelise de vareniclina ainda em um contexto de anaacutelise
multianalito
82
A dose posoloacutegica da vareniclina eacute muito baixa (1mg 2 vezes ao dia a partir do
8deg dia de tratamento) em comparaccedilatildeo com a da bupropiona (150 mg 2 vezes ao dia a
partir do 8deg dia de tratamento) dessa forma as concentraccedilotildees plasmaacuteticas de
vareniclina satildeo muito baixas Apesar do valor de LQ obtido (5 μg L-1) estar entre as
meacutedias plasmaacuteticas de intervalo terapecircutico (40 -70 μg L-1 de vareniclina em plasma e
soro) 51 118 ao mensurar amostras de pacientes em um cenaacuterio real de tratamento de 74
pacientes apenas 3 amostras apresentaram concentraccedilatildeo plasmaacutetica de vareniclina
abaixo do limite de quantificaccedilatildeo
Quanto a recuperaccedilatildeo do analito da matriz a vareniclina tambeacutem mostrou menor
taxa (883) em relaccedilatildeo aos outros analitos (valores proacuteximos ao 100) no entanto
essa taxa de recuperaccedilatildeo eacute considerada alta e foi semelhante ao estudo de Dobrinas et al
156 o qual realizou a extraccedilatildeo da amostra atraveacutes de coluna extratora de fase soacutelida
(SPE) disponiacutevel no mercado e a mensuraccedilatildeo tambeacutem foi realizada em um contexto
multianalito E ainda a recuperaccedilatildeo de vareniclina no presente estudo foi maior do que
a obtida pelo trabalho de Al-Haj et al 105 o qual realizou a preparaccedilatildeo preacutevia da amostra
por extraccedilatildeo liacutequido-liacutequido (LLE) e a mensuraccedilatildeo foi realizada para somente um
analito (4759 - 4872) e obteve recuperaccedilatildeo semelhante ao estudo de os qual
tambeacutem realizou a anaacutelise de vareniclina em um cenaacuterio multianalito (830 ndash 920)
Para nicotina e cotinina os valores de LQ obtidos no presente estudo (50 μg L-1)
se assemelham aos obtidos nos estudos de Abdallah et al 104 (70 μg L-1 para cotinina)
Onoue et al 157 (50 μg L-1 para nicotina e cotinina) Petersen et al 117 (50 μg L-1) Para
bupropiona e hidroxibupropiona o meacutetodo proposto eacute capaz de mensurar pequenas
quantidades do faacutermaco e de seu metaboacutelito (LQ 10 μg L-1 para ambos) quantidades
menores do que os LQs obtidos nos estudos de 158 (55 para bupropiona e 60 μgL para
83
hidroxibupropiona) e de 155 (100 μg L-1 para hidroxibupropiona) apesar das
concentraccedilotildees de metaboacutelitos em estado de equiliacutebrio em pacientes tratados com doses
terapecircuticas do faacutermaco serem bem maiores (45 ndash 75 μg L-1 e de 500 ndash 1500 μg L-1)
respectivamente para bupropiona e hidroxibupropiona 118
O Quadro 6 mostra os paracircmetros analiacuteticos do presente estudo comparados com
outros estudos presentes na literatura
Quanto agraves mensuraccedilotildees das amostras dos pacientes natildeo encontramos associaccedilatildeo
dos faacutermacos e seus metaboacutelitos com desfecho de tratamento Esse fato poderia ser
explicado pelo pequeno nuacutemero amostral do presente estudo
Encontramos diferenccedila significativa entre os grupos resistente e sucesso ao
tratamento quanto aos paracircmetros relacionados ao fumo e agrave DN Os pacientes do grupo
resistente tratados com vareniclina (ainda antes do iniacutecio do tratamento) fumavam um
maior nuacutemero de cigarrosdia em comparaccedilatildeo com os pacientes que obtiveram sucesso
O grupo resistente ao tratamento com bupropiona apresentou maior frequecircncia de
pacientes com alta DN (antes do tratamento) e de pacientes que fumavam no dia da
coleta em comparaccedilatildeo ao grupo sucesso Os dados tambeacutem mostraram que os pacientes
resistentes tratados com ambos os faacutermacos no dia da coleta apresentaram maiores
concentraccedilotildees dos metaboacutelitos da nicotina Esses dados podem indicar maior exposiccedilatildeo
ao fumo e maior DN podendo implicar na resposta ao tratamento antitabagismo
Haacute algumas limitaccedilotildees nesse estudo Primeira os pacientes natildeo fizeram exames
de funccedilatildeo hepaacutetica antes da inclusatildeo no entudo no entanto a presenccedila de comorbidades
hepaacuteticas foram questionadas Segunda natildeo podemos obter total rigor nos horaacuterios de
tomada dos medicamentos por parte dos pacientes no entanto os pacientes foram
84
orientados agrave tomar o medicamento sempre no mesmo horaacuterio e foram questionados
quanto ao cumprimento do protocolo Terceira o nuacutemero amostral para a anaacutelise dos
analitos e de NRM em estudos de associaccedilatildeo com desfecho de tratamento eacute considerado
modesto e consequentemente pode ter implicado nos resultados de natildeo associaccedilatildeo
85
Quadro 6 ndash Comparaccedilatildeo dos dados de validaccedilatildeo com outros estudos
Analitos Purificaccedilatildeo da
amostraextraccedilatildeo Meacutetodo Amostra Intervalo Linear (μg L-1) Recuperaccedilatildeo () LD μg L-1 LQ μg L-1 Referecircncia
Vareniclina
Bupropiona
Hidroxibupropiona
Nicotina
Cotinina
Hidroxicotinina
CS ndash SPE (novo
RAM) HPLC-MSMS Soro humano
50 ndash 1000
10 ndash 10000
10 ndash 20000
50 ndash 10000
50 ndash 10000
50 ndash 10000
883
1101
945
1098
941
1167
25
07
06
19
24
37
50
10
10
50
50
50
Presente
estudo
Nicotitna
Cotinina LLE (LCndashMSMS) Soro humano
03 ndash 525
70 ndash15000
978 ndash 1114
973 ndash1156 -
03
70
Abdalla et al 104
Bupropiona
Hidroxibupropiona PP + SPE online TFCndashMSMS) Soro humano 50 ndash 10000
1580
1160
13
45
55
60
Petrides et
al 158
Vareniclina LLE HPLCndashMSMS
(API) Plasma humano 01ndash100 4759 - 4872 005 01
Al-Haj et al 105
Vareniclina LLE HPLC-
APIMSMS
Plasma
Urina
01 - 500
10 ndash 5000 - -
lt01
100
Faessel et al 51
Nicotina
cotinina
trans-3 ndash
hidroxicotinina
vareniclina
SPE (Oasis MCX 10
mg 96-well extraction
plate)
UPLCndashMSMS
Soro humano
100 ndash 5000
100 ndash 5000
100 - 5000
100 ndash 2500
860 ndash 940
700 ndash 870
490 ndash 540
830 ndash 920
-
20
10
20
10
Dobrinas et
al 156
86
Nicotina
Cotinina Centrifugaccedilatildeo
Diluiccedilatildeo
isotoacutepica estaacutevel
ndash UPLC-
MSMS
Urina 50 ndash 350000 968ndash1051
943ndash992
07
04
17
11
Kuhn et al 154
Nicotina e Cotinina LLE PP SPE
(UPLC-
MSMS)
Sangue urina e
outros tecidos de
rato
100 ndash 6000 (plasma)
80 (nicotina e
cotininacom
precipitaccedilatildeo)
25 50 Onoue et al
157
Cotinina LL SPE (coluna
Zorbaxs XDB C8) HPLCUV Soro e urina 50 ndash 5000 978 ndash 102 018 50
Petersen et
al 117
hidroxibupropiona PP + SPE online RP‐HPLCUV Plasma humano 1000 - 25000 6118 1000 1000
Scherf-
Clavel et al 155
CS ndash SPE= Extraccedilatildeo em fase soacutelida no modo column switching LLE= extraccedilatildeo liacutequido-liacutequido PP=precipitaccedilatildeo de proteiacutenas SPE=extraccedilatildeo em fase soacutelida HPLC= cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia
UPLC=cromatografia liacutequida de ultra eficiecircncia RP‐HPLC=Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia em fase reversa TFC=Cromatografia liacutequida turbulenta API=ionizaccedilatildeo em pressatildeo atmosfeacutericaUV=
detector ultravioleta MSMS= espectometria de massas em tandem
87
7 CONCLUSOtildeES
Para a anaacutelise da expressatildeo gecircnica este estudo exploratoacuterio mostra a associaccedilatildeo
das subunidades α7 e γ com a efetividade do tratamento com vareniclina Estes
resultados poderiam contribuir ao menos em parte para o desenvolvimento de uma
terapecircutica individualizada
Para a mensuraccedilatildeo de analitos o novo RAM sintetizado eacute um produto de
extremo valor cientiacutefico podendo apresentar diversas aplicaccedilotildees em anaacutelise de amostras
de matrizes complexas sem muita preparaccedilatildeo preacutevia Para a associaccedilatildeo das
concentraccedilotildees dos faacutermacos e seus metaboacutelitos com o desfecho de tratamento satildeo
necessaacuterios estudos com um maior nuacutemero amostral
88
8 SUGESTOtildeES PARA ESTUDOS FUTUROS
Sugerimos estudos que promovam maior entendimento das subunidades α7 e γ
dos nAChRs nos processos de dependecircncia agrave nicotina e no tratamento com vareniclina
Sugerimos tambeacutem estudos de investigaccedilatildeo para novas aplicabilidades do novo RAM
desenvolvido
89
9 REFEREcircNCIAS
1 WHO Tobacco WHO Media Centre 2015
2 Oliveira AF Valente JG Leite IC [Aspects of tobacco attributable mortality
systematic review] Rev Saude Publica 200842(2)335-345
3 Koshiaris C Aveyard P Oke J Ryan R Szatkowski L Stevens R Farley A
Smoking cessation and survival in lung upper aero-digestive tract and bladder
cancer cohort study Br J Cancer 2017117(8)1224-1232
4 Leppanen T Toyras J Mervaala E Penzel T Kulkas A Severity of individual
obstruction events increases with age in patients with obstructive sleep apnea
Sleep Med 20173732-37
5 Cerda J Bambs C Vera C Infant morbidity and mortality attributable to
prenatal smoking in Chile Rev Panam Salud Publica 201741e106
6 Vigitel Brasil - Vigilacircncia de fatores de risco e proteccedilatildeo para doenccedilas crocircnicas
por inqueacuterito telefocircnico Estimativas sobre frequecircncia e distribuiccedilatildeo
sociodemograacutefica de fatores de risco e proteccedilatildeo para doenccedilas crocircnicas nas
capitais dos 26 estados brasileiros e no Distrito Federal em 2018 Brasiacutelia 2019
7 Rosemberg J Nicotina Droga Universal Instituto Nacional de Cacircncer
(wwwincagovbr) 2004
8 Kirchenchtein C Chatkin JM Dependecircncia da Nicotina In Diretrizes para
Cessaccedilatildeo do Tabagismo Jornal Brasileiro de Pneumologia Brasiacutelia DF 2004
9 Fagerstoumlm K Uma breve apresentaccedilatildeo da neurofarmacologia e fisiologia da
dependecircncia agrave nicotina In Gigliotti AP Presman S (Eds) Atualizaccedilatildeo no
Tratamento do Tabagismo ABP Sauacutede 2006
10 Gigliotti A Lemos T Quais satildeo os mecanismos da dependecircncia de nicotina
In Manual de Condutas e Praacuteticas em Tabagismo Sociedade Brasileira de
Pneumologia e Tisiologia 2012
11 Divisatildeo de Controle do Tabagismo Coordenaccedilatildeo de Accedilotildees Estrateacutegicas
Instituto Nacional de Cacircncer Silva AG Ministeacuterio da Sauacutede Protocolo cliacutenico
e diretrizes terapecircuticas dependecircncia agrave nicotina 2013
12 Schultz W Multiple reward signals in the brain Nat Rev Neurosci
20001(3)199-207
13 Stolerman IP Jarvis MJ The scientific case that nicotine is addictive
Psychopharmacology (Berl) 1995117(1)2-10 discussion 14-20
90
14 Koob GF Volkow ND Neurocircuitry of addiction Neuropsychopharmacology
200935(1)217-238
15 Martin-Soelch C Neuroadaptive changes associated with smoking structural
and functional neural changes in nicotine dependence Brain Sci 20133(1)159-
176
16 Boening JA Neurobiology of an addiction memory J Neural Transm (Vienna)
2001108(6)755-765
17 Robbins TW Everitt BJ Limbic-striatal memory systems and drug addiction
Neurobiol Learn Mem 200278(3)625-636
18 Everitt BJ Belin D Economidou D Pelloux Y Dalley JW Robbins TW
Review Neural mechanisms underlying the vulnerability to develop compulsive
drug-seeking habits and addiction Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci
2008363(1507)3125-3135
19 Fuentes RM Notkola IL Shemeikka S Tuomilehto J Nissinen A Familial
aggregation of blood pressure a population-based family study in eastern
Finland J Hum Hypertens 200014(7)441-445
20 Gotti C Zoli M Clementi F Brain nicotinic acetylcholine receptors native
subtypes and their relevance Trends Pharmacol Sci 200627(9)482-491
21 Benowitz NL Pharmacology of nicotine addiction smoking-induced disease
and therapeutics Annu Rev Pharmacol Toxicol 20094957-71
22 Benowitz NL Clinical pharmacology of inhaled drugs of abuse implications in
understanding nicotine dependence NIDA Res Monogr 19909912-29
23 Picciotto MR Zoli M Rimondini R Lena C Marubio LM Pich EM Fuxe K
Changeux JP Acetylcholine receptors containing the beta2 subunit are involved
in the reinforcing properties of nicotine Nature 1998391(6663)173-177
24 Maskos U Molles BE Pons S Besson M Guiard BP Guilloux JP Evrard A
Cazala P Cormier A Mameli-Engvall M Dufour N Cloez-Tayarani I
Bemelmans AP Mallet J Gardier AM David V Faure P Granon S Changeux
JP Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of
nicotinic receptors Nature 2005436(7047)103-107
25 Tapper AR McKinney SL Nashmi R Schwarz J Deshpande P Labarca C
Whiteaker P Marks MJ Collins AC Lester HA Nicotine activation of alpha4
receptors sufficient for reward tolerance and sensitization Science
2004306(5698)1029-1032
26 Aberger K Chitravanshi VC Sapru HN Cardiovascular responses to
microinjections of nicotine into the caudal ventrolateral medulla of the rat Brain
Res 2001892(1)138-146
91
27 Levin ED Bettegowda C Blosser J Gordon J AR-R17779 and alpha7
nicotinic agonist improves learning and memory in rats Behav Pharmacol
199910(6-7)675-680
28 Hajos M Hurst RS Hoffmann WE Krause M Wall TM Higdon NR Groppi
VE The selective alpha7 nicotinic acetylcholine receptor agonist PNU-282987
[N-[(3R)-1-Azabicyclo[222]oct-3-yl]-4-chlorobenzamide hydrochloride]
enhances GABAergic synaptic activity in brain slices and restores auditory
gating deficits in anesthetized rats J Pharmacol Exp Ther 2005312(3)1213-
1222
29 Salas R Orr-Urtreger A Broide RS Beaudet A Paylor R De Biasi M The
nicotinic acetylcholine receptor subunit alpha 5 mediates short-term effects of
nicotine in vivo Mol Pharmacol 200363(5)1059-1066
30 Henningfield JE Stapleton JM Benowitz NL Grayson RF London ED Higher
levels of nicotine in arterial than in venous blood after cigarette smoking Drug
Alcohol Depend 199333(1)23-29
31 Hukkanen J Jacob P 3rd Benowitz NL Metabolism and disposition kinetics of
nicotine Pharmacol Rev 200557(1)79-115
32 Dempsey D Tutka P Jacob P 3rd Allen F Schoedel K Tyndale RF Benowitz
NL Nicotine metabolite ratio as an index of cytochrome P450 2A6 metabolic
activity Clin Pharmacol Ther 200476(1)64-72
33 Allenby CE Boylan KA Lerman C Falcone M Precision Medicine for
Tobacco Dependence Development and Validation of the Nicotine Metabolite
Ratio J Neuroimmune Pharmacol 201611(3)471-483
34 Llaquet H Pichini S Joya X Papaseit E Vall O Klein J Garcia-Algar O
Biological matrices for the evaluation of exposure to environmental tobacco
smoke during prenatal life and childhood Anal Bioanal Chem 2010396(1)379-
399
35 Reichert J AA Gonccedilalves CMC Godoy I Chatkin JM Sales MPU et al
Diretrizes da Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisologia Diretrizes para
cessaccedilatildeo do tabagismo ndash 2008 J Bras Pneumol 200834(10)845-880
36 Fiore MC Jaeacuten C R Baker TB Treating tobacco use and dependence 2008
update Clinical Practice Guideline In services USDohah ed Public Health
Service Rockville (md) 2008
37 Kassem MG Al Hossaini AM Varenicline Profiles Drug Subst Excip Relat
Methodol 201237389-411
38 Zoli M Lena C Picciotto MR Changeux JP Identification of four classes of
brain nicotinic receptors using beta2 mutant mice J Neurosci
199818(12)4461-4472
92
39 Hogg RC Raggenbass M Bertrand D Nicotinic acetylcholine receptors from
structure to brain function Rev Physiol Biochem Pharmacol 20031471-46
40 Mihalak KB Carroll FI Luetje CW Varenicline is a partial agonist at
alpha4beta2 and a full agonist at alpha7 neuronal nicotinic receptors Mol
Pharmacol 200670(3)801-805
41 Swan GE Javitz HS Jack LM Wessel J Michel M Hinds DA Stokowksi RP
McClure JB Catz SL Richards J Zbikowski SM Deprey M McAfee T Conti
DV Bergen AW Varenicline for smoking cessation nausea severity and
variation in nicotinic receptor genes Pharmacogenomics J 201212(4)349-358
42 Kaur K Kaushal S Chopra SC Varenicline for smoking cessation A review of
the literature Curr Ther Res Clin Exp 200970(1)35-54
43 Catz SL Jack LM McClure JB Javitz HS Deprey M Zbikowski SM McAfee
T Richards J Swan GE Adherence to varenicline in the COMPASS smoking
cessation intervention trial Nicotine Tob Res 201113(5)361-368
44 Faessel HM Burstein AH Troutman MD Willavize SA Rohrbacher KD Clark
DJ Lack of a pharmacokinetic interaction between a new smoking cessation
therapy varenicline and digoxin in adult smokers Eur J Clin Pharmacol
200864(11)1101-1109
45 Mohanasundaram UM Chitkara R Krishna G Smoking cessation therapy with
varenicline Int J Chron Obstruct Pulmon Dis 20083(2)239-251
46 Faessel HM Smith BJ Gibbs MA Gobey JS Clark DJ Burstein AH Single-
dose pharmacokinetics of varenicline a selective nicotinic receptor partial
agonist in healthy smokers and nonsmokers J Clin Pharmacol 200646(9)991-
998
47 Faessel HM Obach RS Rollema H Ravva P Williams KE Burstein AH A
review of the clinical pharmacokinetics and pharmacodynamics of varenicline
for smoking cessation Clin Pharmacokinet 201049(12)799-816
48 Ravva P Gastonguay MR Tensfeldt TG Faessel HM Population
pharmacokinetic analysis of varenicline in adult smokers Br J Clin Pharmacol
200968(5)669-681
49 Obach RS Reed-Hagen AE Krueger SS Obach BJ OConnell TN Zandi KS
Miller S Coe JW Metabolism and disposition of varenicline a selective
alpha4beta2 acetylcholine receptor partial agonist in vivo and in vitro Drug
Metab Dispos 200634(1)121-130
50 Feng B Obach RS Burstein AH Clark DJ de Morais SM Faessel HM Effect
of human renal cationic transporter inhibition on the pharmacokinetics of
varenicline a new therapy for smoking cessation an in vitro-in vivo study Clin
Pharmacol Ther 200883(4)567-576
93
51 Faessel HM Gibbs MA Clark DJ Rohrbacher K Stolar M Burstein AH
Multiple-dose pharmacokinetics of the selective nicotinic receptor partial
agonist varenicline in healthy smokers J Clin Pharmacol 200646(12)1439-
1448
52 Slemmer JE Martin BR Damaj MI Bupropion is a nicotinic antagonist J
Pharmacol Exp Ther 2000295(1)321-327
53 Hughes JR Stead LF Lancaster T Antidepressants for smoking cessation
Cochrane Database Syst Rev 2007(1)CD000031
54 Goodnick PJ Pharmacokinetics of second generation antidepressants
bupropion Psychopharmacol Bull 199127(4)513-519
55 Hesse LM Venkatakrishnan K Court MH von Moltke LL Duan SX Shader
RI Greenblatt DJ CYP2B6 mediates the in vitro hydroxylation of bupropion
potential drug interactions with other antidepressants Drug Metab Dispos
200028(10)1176-1183
56 Faucette SR Hawke RL Lecluyse EL Shord SS Yan B Laethem RM Lindley
CM Validation of bupropion hydroxylation as a selective marker of human
cytochrome P450 2B6 catalytic activity Drug Metab Dispos 200028(10)1222-
1230
57 Walsky RL Astuccio AV Obach RS Evaluation of 227 drugs for in vitro
inhibition of cytochrome P450 2B6 J Clin Pharmacol 200646(12)1426-1438
58 Walsky RL Obach RS A comparison of 2-phenyl-2-(1-piperidinyl)propane
(ppp) 111-phosphinothioylidynetrisaziridine (thioTEPA) clopidogrel and
ticlopidine as selective inactivators of human cytochrome P450 2B6 Drug
Metab Dispos 200735(11)2053-2059
59 Quaak M van Schooten FJ van Schayck CP Pharmacogenetics of smoking
how far to the clinic Pharmacogenomics 201415(6)723-726
60 Swan GE Lessov-Schlaggar CN Tobacco addiction and pharmacogenetics of
nicotine metabolism J Neurogenet 200923(3)262-271
61 Tomaz PRX Kajita MS Santos JR Scholz J Abe TO Gaya PV Krieger JE
Pereira AC Santos P Cytochrome P450 2A6 and 2B6 polymorphisms and
smoking cessation success in patients treated with varenicline Eur J Clin
Pharmacol201975(11)1541-1545
62 Tomaz PRX Santos JR Scholz J Abe TO Gaya PV Negrao AB Krieger JE
Pereira AC Santos P Cholinergic receptor nicotinic alpha 5 subunit
polymorphisms are associated with smoking cessation success in women BMC
Med Genet201819(1)55
94
63 Scholz J Santos PC Buzo CG Lopes NH Abe TO Gaya PV Pierri H Amorim
C Pereira AC Effects of aging on the effectiveness of smoking cessation
medication Oncotarget 20167(21)30032-30036
64 Issa JS Santos PC Vieira LP Abe TO Kuperszmidt CS Nakasato M Cardoso
E Amorim C Pereira AC Smoking cessation and weight gain in patients with
cardiovascular disease or risk factor Int J Cardiol 2014172(2)485-487
65 King DP Paciga S Pickering E Benowitz NL Bierut LJ Conti DV Kaprio J
Lerman C Park PW Smoking cessation pharmacogenetics analysis of
varenicline and bupropion in placebo-controlled clinical trials
Neuropsychopharmacology 201237(3)641-650
66 Saccone NL Baurley JW Bergen AW David SP Elliott HR Foreman MG
Kaprio J Piasecki TM Relton CL Zawertailo L Bierut LJ Tyndale RF Chen
LS The Value of Biosamples in Smoking Cessation Trials A Review of
Genetic Metabolomic and Epigenetic Findings Nicotine Tob Res
201820(4)403-413
67 Rocha Santos J Tomaz PR Issa JS Abe TO Krieger JE Pereira AC Santos
PC CHRNA4 rs1044396 is associated with smoking cessation in varenicline
therapy Front Genet 2015646
68 Tomaz PR Santos JR Issa JS Abe TO Gaya PV Krieger JE Pereira AC
Santos PC CYP2B6 rs2279343 polymorphism is associated with smoking
cessation success in bupropion therapy Eur J Clin Pharmacol 2015
71(9)1067-73
69 David SP Brown RA Papandonatos GD Kahler CW Lloyd-Richardson EE
Munafo MR Shields PG Lerman C Strong D McCaffery J Niaura R
Pharmacogenetic clinical trial of sustained-release bupropion for smoking
cessation Nicotine Tob Res 20079(8)821-833
70 Lerman C Shields PG Wileyto EP Audrain J Pinto A Hawk L Krishnan S
Niaura R Epstein L Pharmacogenetic investigation of smoking cessation
treatment Pharmacogenetics 200212(8)627-634
71 Han DH Joe KH Na C Lee YS Effect of genetic polymorphisms on smoking
cessation a trial of bupropion in Korean male smokers Psychiatr Genet
200818(1)11-16
72 Zanger UM Klein K Pharmacogenetics of cytochrome P450 2B6 (CYP2B6)
advances on polymorphisms mechanisms and clinical relevance Front Genet
2013424
73 Zhu AZ Cox LS Nollen N Faseru B Okuyemi KS Ahluwalia JS Benowitz
NL Tyndale RF CYP2B6 and bupropions smoking-cessation pharmacology
the role of hydroxybupropion Clin Pharmacol Ther 201292(6)771-777
95
74 Laib AK Brunen S Pfeifer P Vincent P Hiemke C Serum concentrations of
hydroxybupropion for dose optimization of depressed patients treated with
bupropion Ther Drug Monit 201436(4)473-479
75 Hutchison KE Allen DL Filbey FM Jepson C Lerman C Benowitz NL Stitzel
J Bryan A McGeary J Haughey HM CHRNA4 and tobacco dependence from
gene regulation to treatment outcome Arch Gen Psychiatry 200764(9)1078-
1086
76 Smith RC Zhubi A Maloku E Sershen H Lajtha A Davis JM Costa E
Guidotti A Varenicline treatment decreases DNMT1 mRNA expression in
lymphocytes of schizophrenic patients who are cigarette smokers Schizophr
Res 2010119(1-3)269-270
77 Marks MJ ONeill HC Wynalda-Camozzi KM Ortiz NC Simmons EE Short
CA Butt CM McIntosh JM Grady SR Chronic treatment with varenicline
changes expression of four nAChR binding sites in mice Neuropharmacology
201599142-155
78 Middleton FA Pato CN Gentile KL McGann L Brown AM Trauzzi M Diab
H Morley CP Medeiros H Macedo A Azevedo MH Pato MT Gene
expression analysis of peripheral blood leukocytes from discordant sib-pairs
with schizophrenia and bipolar disorder reveals points of convergence between
genetic and functional genomic approaches Am J Med Genet B Neuropsychiatr
Genet 2005136B(1)12-25
79 Takahashi M Hayashi H Watanabe Y Sawamura K Fukui N Watanabe J
Kitajima T Yamanouchi Y Iwata N Mizukami K Hori T Shimoda K Ujike H
Ozaki N Iijima K Takemura K Aoshima H Someya T Diagnostic
classification of schizophrenia by neural network analysis of blood-based gene
expression signatures Schizophr Res 2010119(1-3)210-218
80 Lee J Goh LK Chen G Verma S Tan CH Lee TS Analysis of blood-based
gene expression signature in first-episode psychosis Psychiatry Res
2012200(1)52-54
81 Sullivan PF Fan C Perou CM Evaluating the comparability of gene expression
in blood and brain Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet
2006141B(3)261-268
82 Hennings JM Uhr M Klengel T Weber P Putz B Touma C Czamara D Ising
M Holsboer F Lucae S RNA expression profiling in depressed patients
suggests retinoid-related orphan receptor alpha as a biomarker for antidepressant
response Transl Psychiatry 20155e538
83 Ota VK Noto C Gadelha A Santoro ML Silva PN Melaragno MI Smith Mde
A Cordeiro Q Bressan RA Belangero SI Neurotransmitter receptor and
regulatory gene expression in peripheral blood of Brazilian drug-naive first-
96
episode psychosis patients before and after antipsychotic treatment Psychiatry
Res2013210(3)1290-1292
84 Kordi-Tamandani DM Tajoddini S Salimi F Promoter Methylation and BDNF
and DAT1 Gene Expression Profiles in Patients with Drug Addiction
Pathobiology 201582(2)94-99
85 Wongsriraksa A Parsons ME Whelan CJ Characterisation of nicotine receptors
on human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) Inflamm Res
200958(1)38-44
86 Kawashima K Fujii T Expression of non-neuronal acetylcholine in
lymphocytes and its contribution to the regulation of immune function Front
Biosci 200492063-2085
87 St-Pierre S Jiang W Roy P Champigny C LeBlanc E Morley BJ Hao J
Simard AR Nicotinic Acetylcholine Receptors Modulate Bone Marrow-Derived
Pro-Inflammatory Monocyte Production and Survival PLoS One
201611(2)e0150230
88 Zdanowski R Krzyzowska M Ujazdowska D Lewicka A Lewicki S Role of
alpha7 nicotinic receptor in the immune system and intracellular signaling
pathways Cent Eur J Immunol 201540(3)373-379
89 Baez-Pagan CA Delgado-Velez M Lasalde-Dominicci JA Activation of the
Macrophage alpha7 Nicotinic Acetylcholine Receptor and Control of
Inflammation J Neuroimmune Pharmacol 201510(3)468-476
90 Kalkman HO Feuerbach D Modulatory effects of alpha7 nAChRs on the
immune system and its relevance for CNS disorders Cell Mol Life Sci
201673(13)2511-2530
91 Zakrzewicz A Richter K Agne A Wilker S Siebers K Fink B Krasteva-Christ
G Althaus M Padberg W Hone AJ McIntosh JM Grau V Canonical and
Novel Non-Canonical Cholinergic Agonists Inhibit ATP-Induced Release of
Monocytic Interleukin-1beta via Different Combinations of Nicotinic
Acetylcholine Receptor Subunits alpha7 alpha9 and alpha10 Front Cell
Neurosci201711189
92 Arreola R Alvarez-Herrera S Perez-Sanchez G Becerril-Villanueva E Cruz-
Fuentes C Flores-Gutierrez EO Garces-Alvarez ME de la Cruz-Aguilera DL
Medina-Rivero E Hurtado-Alvarado G Quintero-Fabian S Pavon L
Immunomodulatory Effects Mediated by Dopamine J Immunol
Res20163160486
93 Nakajima M Yamamoto T Nunoya K Yokoi T Nagashima K Inoue K Funae
Y Shimada N Kamataki T Kuroiwa Y Role of human cytochrome P4502A6 in
C-oxidation of nicotine Drug Metab Dispos 199624(11)1212-1217
97
94 Messina ES Tyndale RF Sellers EM A major role for CYP2A6 in nicotine C-
oxidation by human liver microsomes J Pharmacol Exp Ther
1997282(3)1608-1614
95 Chen A Krebs NM Zhu J Muscat JE Nicotine metabolite ratio predicts
smoking topography The Pennsylvania Adult Smoking Study Drug Alcohol
Depend201819089-93
96 Shahab L BL McNeill Tyndale RF Does the nicotine metabolite ratio
moderate smoking cessation treatment outcomes in real-world settings A
prospective study Addiction 2019114(2)304-314 doi 101111add14450
97 Lea RA Dickson S Benowitz NL Within-subject variation of the salivary
3HCCOT ratio in regular daily smokers prospects for estimating CYP2A6
enzyme activity in large-scale surveys of nicotine metabolic rate J Anal Toxicol
200630(6)386-389
98 Mooney ME Li ZZ Murphy SE Pentel PR Le C Hatsukami DK Stability of
the nicotine metabolite ratio in ad libitum and reducing smokers Cancer
Epidemiol Biomarkers Prev 200817(6)1396-1400
99 Piestansky J Marakova K Veizerova L Galba J Mikus P On-line column
coupled isotachophoresis-capillary zone electrophoresis hyphenated with
tandem mass spectrometry in drug analysis varenicline and its metabolite in
human urine Anal Chim Acta 201482684-93
100 Fagerstrom KO Heatherton TF Kozlowski LT Nicotine addiction and its
assessment Ear Nose Throat J 199069(11)763-765
101 Issa JS A new nicotine dependence score and a new scale assessing patient
comfort during smoking cessation treatment J Bras Pneumol 201238(6)761-
765
102 Mexal S Berger R Logel J Ross RG Freedman R Leonard S Differential
regulation of alpha7 nicotinic receptor gene (CHRNA7) expression in
schizophrenic smokers J Mol Neurosci 201040(1-2)185-195
103 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-
time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods
200125(4)402-408
104 Abdallah IA Hammell DC Stinchcomb AL Hassan HE A fully validated LC-
MSMS method for simultaneous determination of nicotine and its metabolite
cotinine in human serum and its application to a pharmacokinetic study after
using nicotine transdermal delivery systems with standard heat application in
adult smokers J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2016102067-
77
98
105 Al-Haj A Alawi M Arafat T Hourani MK Method development validation
and bioequivalence of varenicline in human plasma by liquid chromatography
tandem mass spectrometry J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci
2013931134-139
106 Hegstad S Stray-Pedersen A Olsen L Vege A Rognum TO Morland J
Christophersen AS Determination of cotinine in pericardial fluid and whole
blood by liquid chromatography-tandem mass spectrometry J Anal Toxicol
200933(4)218-222
107 Santos MG Moraes Gde O Nakamura MG dos Santos-Neto AJ Figueiredo
EC Restricted access molecularly imprinted polymers obtained by bovine serum
albumin andor hydrophilic monomers external layers a comparison related to
physical and chemical properties Analyst 2015140(22)7768-7775
108 de Lima MM Vieira AC Martins I Boralli VB Borges KB Figueiredo EC
On-line restricted access molecularly imprinted solid phase extraction of
ivermectin in meat samples followed by HPLC-UV analysis Food Chem
2015197(Pt A)7-13
109 Barbosa AF Barbosa VM Bettini J Luccas PO Figueiredo EC Restricted
access carbon nanotubes for direct extraction of cadmium from human serum
samples followed by atomic absorption spectrometry analysis Talanta
2016131213-220
110 de Faria HD Abrao LC Santos MG Barbosa AF Figueiredo EC New
advances in restricted access materials for sample preparation A review Anal
Chim Acta 201795943-65
111 FRANQUI L S et al Synthesis and characterization of a magnetic molecularly
imprinted polymer for the selective extraction of nicotine and cotinine from
urine samples followed by GC-MS analysis Anal Methods 2015 7(21) 9237ndash
9244 2015
112 Santos MG Tavares IM Barbosa AF Bettini J Figueiredo EC Analysis of
tricyclic antidepressants in human plasma using online-restricted access
molecularly imprinted solid phase extraction followed by direct mass
spectrometry identificationquantification Talanta 20171638-16
113 US Department of Health and Human Services Food and Drug Administration
(FDA) Center for Drug Evaluation and Research (CDER)Center for Veterinary
Medicine (CVM) Guidance for IndustryBioanalytical method validation
Biopharmaceutics 2013
114 GOMES Raphael A B et al Evaluation of the pH influence on protein
exclusion by restricted access carbono nanotubes coated with bovine serum
albumin Journal Of Materials Science 2016 51(16)7407-7414
99
115 de Faria HD Rosa MA Silveira AT Figueiredo EC Direct extraction of
tetracyclines from bovine milk using restricted access carbon nanotubes in a
column switching liquid chromatography system Food Chem 201722598-106
116 de Faria HD Bueno CT Krieger JE Krieger EM Pereira AC Santos P
Figueiredo EC Online extraction of antihypertensive drugs and their metabolites
from untreated human serum samples using restricted access carbon nanotubes
in a column switching liquid chromatography system J Chromatogr A
2017152841-52
117 Petersen GO Leite CE Chatkin JM Thiesen FV Cotinine as a biomarker of
tobacco exposure development of a HPLC method and comparison of matrices
J Sep Sci 201033(4-5)516-521
118 Brunen S Vincent PD Baumann P Hiemke C Havemann-Reinecke U
Therapeutic drug monitoring for drugs used in the treatment of substance-related
disorders literature review using a therapeutic drug monitoring appropriateness
rating scale Ther Drug Monit 201133(5)561-572
119 Ryan RE Loiacono RE Nicotine regulates alpha7 nicotinic receptor subunit
mRNA implications for nicotine dependence Neuroreport 200112(3)569-
572
120 Cameli C Bacchelli E De Paola M Giucastro G Cifiello S Collo G Cainazzo
MM Pini LA Maestrini E Zoli M Genetic variation in CHRNA7 and
CHRFAM7A is associated with nicotine dependence and response to varenicline
treatment Eur J Hum Genet 201826(12)1824-1831
121 Wallace TL Bertrand D Importance of the nicotinic acetylcholine receptor
system in the prefrontal cortex Biochem Pharmacol 201385(12)1713-1720
122 Dempster EL Toulopoulou T McDonald C Bramon E Walshe M Wickham H
Sham PC Murray RM Collier DA Episodic memory performance predicted by
the 2bp deletion in exon 6 of the alpha 7-like nicotinic receptor subunit gene
Am J Psychiatry 2006163(10)1832-1834
123 Enioutina EY Myers EJ Tvrdik P Hoidal JR Rogers SW Gahring LC The
nicotinic receptor Alpha7 impacts the mouse lung response to LPS through
multiple mechanisms PLoS One 201510(3)e0121128
124 Sinkus ML Graw S Freedman R Ross RG Lester HA Leonard S The human
CHRNA7 and CHRFAM7A genes A review of the genetics regulation and
function Neuropharmacology 201596(Pt B)274-288
125 Gault J Robinson M Berger R Drebing C Logel J Hopkins J Moore T Jacobs
S Meriwether J Choi MJ Kim EJ Walton K Buiting K Davis A Breese C
Freedman R Leonard S Genomic organization and partial duplication of the
human alpha7 neuronal nicotinic acetylcholine receptor gene (CHRNA7)
Genomics 199852(2)173-185
100
126 Riley B Williamson M Collier D Wilkie H Makoff A A 3-Mb map of a large
Segmental duplication overlapping the alpha7-nicotinic acetylcholine receptor
gene (CHRNA7) at human 15q13-q14 Genomics 200279(2)197-209
127 Benhammou K Lee M Strook M Sullivan B Logel J Raschen K Gotti C
Leonard S [(3)H]Nicotine binding in peripheral blood cells of smokers is
correlated with the number of cigarettes smoked per day Neuropharmacology
200039(13)2818-2829
128 Kunii Y Zhang W Xu Q Hyde TM McFadden W Shin JH Deep-Soboslay A
Ye T Li C Kleinman JE Wang KH Lipska BK CHRNA7 and CHRFAM7A
mRNAs co-localized and their expression levels altered in the postmortem
dorsolateral prefrontal cortex in major psychiatric disorders Am J Psychiatry
2015172(11)1122-1130
129 Breese CR Lee MJ Adams CE Sullivan B Logel J Gillen KM Marks MJ
Collins AC Leonard S Abnormal regulation of high affinity nicotinic receptors
in subjects with schizophrenia Neuropsychopharmacology 200023(4)351-
364
130 Freedman R Hall M Adler LE Leonard S Evidence in postmortem brain tissue
for decreased numbers of hippocampal nicotinic receptors in schizophrenia Biol
Psychiatry 199538(1)22-33
131 Guan ZZ Zhang X Blennow K Nordberg A Decreased protein level of
nicotinic receptor alpha7 subunit in the frontal cortex from schizophrenic brain
Neuroreport 199910(8)1779-1782
132 Martin-Ruiz CM Haroutunian VH Long P Young AH Davis KL Perry EK
Court JA Dementia rating and nicotinic receptor expression in the prefrontal
cortex in schizophrenia Biol Psychiatry 200354(11)1222-1233
133 Marutle A Zhang X Court J Piggott M Johnson M Perry R Perry E
Nordberg A Laminar distribution of nicotinic receptor subtypes in cortical
regions in schizophrenia J Chem Neuroanat 200122(1-2)115-126
134 Leonard S Breese C Adams C Benhammou K Gault J Stevens K Lee M
Adler L Olincy A Ross R Freedman R Smoking and schizophrenia abnormal
nicotinic receptor expression Eur J Pharmacol 2000393(1-3)237-242
135 Kumari V Postma P Nicotine use in schizophrenia the self medication
hypotheses Neurosci Biobehav Rev 200529(6)1021-1034
136 de Leon J Diaz FJ A meta-analysis of worldwide studies demonstrates an
association between schizophrenia and tobacco smoking behaviors Schizophr
Res 200576(2-3)135-157
101
137 Flomen RH Collier DA Osborne S Munro J Breen G St Clair D Makoff AJ
Association study of CHRFAM7A copy number and 2 bp deletion
polymorphisms with schizophrenia and bipolar affective disorder Am J Med
Genet B Neuropsychiatr Genet 2006141B(6)571-575
138 Gault J Hopkins J Berger R Drebing C Logel J Walton C Short M Vianzon
R Olincy A Ross RG Adler LE Freedman R Leonard S Comparison of
polymorphisms in the alpha7 nicotinic receptor gene and its partial duplication
in schizophrenic and control subjects Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet
2003123B(1)39-49
139 Perl O Strous RD Dranikov A Chen R Fuchs S Low levels of alpha7-
nicotinic acetylcholine receptor mRNA on peripheral blood lymphocytes in
schizophrenia and its association with illness severity Neuropsychobiology
200653(2)88-93
140 Raux G Bonnet-Brilhault F Louchart S Houy E Gantier R Levillain D Allio
G Haouzir S Petit M Martinez M Frebourg T Thibaut F Campion D The -2
bp deletion in exon 6 of the alpha 7-like nicotinic receptor subunit gene is a risk
factor for the P50 sensory gating deficit Mol Psychiatry 20027(9)1006-1011
141 Leonard S Gault J Hopkins J Logel J Vianzon R Short M Drebing C Berger
R Venn D Sirota P Zerbe G Olincy A Ross RG Adler LE Freedman R
Association of promoter variants in the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor
subunit gene with an inhibitory deficit found in schizophrenia Arch Gen
Psychiatry 200259(12)1085-1096
142 Mathew SV Law AJ Lipska BK Davila-Garcia MI Zamora ED Mitkus SN
Vakkalanka R Straub RE Weinberger DR Kleinman JE Hyde TM Alpha7
nicotinic acetylcholine receptor mRNA expression and binding in postmortem
human brain are associated with genetic variation in neuregulin 1 Hum Mol
Genet 200716(23)2921-2932
143 Severance EG Yolken RH Novel alpha7 nicotinic receptor isoforms and
deficient cholinergic transcription in schizophrenia Genes Brain Behav
20087(1)37-45
144 Severance EG Dickerson FB Stallings CR Origoni AE Sullens A Monson
ET Yolken RH Differentiating nicotine- versus schizophrenia-associated
decreases of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor transcript CHRFAM7A
in peripheral blood lymphocytes J Neural Transm (Vienna) 2009116(2)213-
220
145 Olincy A Freedman R Nicotinic mechanisms in the treatment of psychotic
disorders a focus on the alpha7 nicotinic receptor Handb Exp Pharmacol
2012 (213)211-232
146 Kariminejad A Almadani N Khoshaeen A Olsson B Moslemi AR Tajsharghi
H Truncating CHRNG mutations associated with interfamilial variability of the
102
severity of the Escobar variant of multiple pterygium syndrome BMC
Genet201617(1)71
147 Liu Y Wang L Yang YK Liang Y Zhang TJ Liang N Yang LM Li SJ Shan
D Wu QQ Prenatal diagnosis of fetal skeletal dysplasia using targeted next-
generation sequencing an analysis of 30 cases Diagn Pathol 201914(1)76
148 Natera-de Benito D Topf A Vilchez JJ Gonzalez-Quereda L Dominguez-
Carral J Diaz-Manera J Ortez C Bestue M Gallano P Dusl M Abicht A
Muller JS Senderek J Garcia-Ribes A Muelas N Evangelista T Azuma Y
McMacken G Paipa Merchan A Rodriguez Cruz PM Camacho A Jimenez E
Miranda-Herrero MC Santana-Artiles A Garcia-Campos O Dominguez-Rubio
R Olive M Colomer J Beeson D Lochmuller H Nascimento A Molecular
characterization of congenital myasthenic syndromes in Spain Neuromuscul
Disord 201727(12)1087-1098
149 Seo J Choi IH Lee JS Yoo Y Kim NK Choi M Ko JM Shin YB Rare cases
of congenital arthrogryposis multiplex caused by novel recurrent CHRNG
mutations J Hum Genet 201560(4)213-215
150 Keskitalo-Vuokko K Pitkaniemi J Broms U Heliovaara M Aromaa A Perola
M Ripatti S Salminen O Salomaa V Loukola A Kaprio J Associations of
nicotine intake measures with CHRN genes in Finnish smokers Nicotine Tob
Res201113(8)686-690
151 Saccone NL Saccone SF Hinrichs AL Stitzel JA Duan W Pergadia ML
Agrawal A Breslau N Grucza RA Hatsukami D Johnson EO Madden PA
Swan GE Wang JC Goate AM Rice JP Bierut LJ Multiple distinct risk loci
for nicotine dependence identified by dense coverage of the complete family of
nicotinic receptor subunit (CHRN) genes Am J Med Genet B Neuropsychiatr
Genet 2009150B(4)453-466
152 Saccone NL Schwantes-An TH Wang JC Grucza RA Breslau N Hatsukami
D Johnson EO Rice JP Goate AM Bierut LJ Multiple cholinergic nicotinic
receptor genes affect nicotine dependence risk in African and European
Americans Genes Brain Behav 20109(7)741-750
153 Santoro ML Ota VK Stilhano RS Silva PN Santos CM Diana MC Gadelha
A Bressan RA Melaragno MI Han SW Abilio VC Belangero SI Effect of
antipsychotic drugs on gene expression in the prefrontal cortex and nucleus
accumbens in the spontaneously hypertensive rat (SHR) Schizophr Res
2014157(1-3)163-168
154 Kuhn J Vollmer T Martin C Hendig D Knabbe C Fast and sample cleanup-
free measurement of nicotine and cotinine by stable isotope dilution ultra-
performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry J Pharm
Biomed Anal 201267-68137-143
103
155 Scherf-Clavel M Wahl O Menke A Unterecker S Determination of
hydroxybupropion in human serum for routine therapeutic drug monitoring in
psychiatry A tool for dose-individualization in treatment with bupropion
Biomed Chromatogr 201933(10)e4609
156 Dobrinas M Choong E Noetzli M Cornuz J Ansermot N Eap CB
Quantification of nicotine cotinine trans-3-hydroxycotinine and varenicline in
human plasma by a sensitive and specific UPLC-tandem mass-spectrometry
procedure for a clinical study on smoking cessation J Chromatogr B Analyt
Technol Biomed Life Sci 2011879(30)3574-3582
157 Onoue S Yamamoto N Seto Y Yamada S Pharmacokinetic study of nicotine
and its metabolite cotinine to clarify possible association between smoking and
voiding dysfunction in rats using UPLCESI-MS Drug Metab Pharmacokinet
201126(4)416-422
158 Petrides AK Moskowitz J Johnson-Davis KL Jannetto PJ Langman LJ Clarke
W Marzinke MA The development and validation of a turbulent flow-liquid
chromatography-tandem mass spectrometric method for the simultaneous
quantification of citalopram sertraline bupropion and hydroxybupropion in
serum Clin Biochem 201447(15)73-79
Rubrica participante Rubrica pesquisador
APEcircNDICE - TCLE
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
HOSPITAL DAS CLIacuteNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SAtildeO
PAULO-HCFMUSP
Registro das explicaccedilotildees do pesquisador ao paciente ou seu representante legal sobre a pesquisa consignando
Vocecirc estaacute sendo convidado (a) a participar de um projeto de pesquisa Este projeto tem
como objetivos principais para os indiviacuteduos fumantes submetidos aos tratamentos
farmacoloacutegicos antitabagismo associar o efeito das caracteriacutesticas geneacuteticas (DNA ou RNA) e do
metabolismo (concentraccedilatildeo dos produtos de metabolismo dos medicamentos no sangue) com a
eficiecircncia do tratamento antitabagismo O objetivo do estudo eacute saber por que algumas pessoas
respondem bem aos medicamentos antitabagismo enquanto outras pessoas natildeo respondem e
consequentemente natildeo conseguem parar de fumar Para isto precisaremos de amostras de
sangue cuja quantidade eacute comumente solicitada em exames laboratoriais de rotina (2 tubos a
cada visita = 20mL) Precisaremos tambeacutem do seu consentimento para que dados de seu
prontuaacuterio meacutedico sejam consultados Para os pacientes que utilizaratildeo o medicamento
bupropiona precisaremos de amostras de sangue na primeira consulta (visita T-1) e duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento medicamentoso (visita T2) Para os pacientes que utilizaratildeo
o medicamento vareniclina precisaremos de uma amostra de sangue na primeira consulta (visita
T-1) na segunda consulta ndash ainda antes de iniciar o tratamento com medicamento (visita T0) duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento medicamentoso (visita T2) e quatro semanas apoacutes o iniacutecio
do tratamento medicamentoso (visita T4) Os desconfortos mais comuns que podem ocorrer com
sua participaccedilatildeo neste estudo satildeo os mesmos de uma coleta de sangue no braccedilo por exemplo
leve dor no local da punccedilatildeo e eventualmente hematoma local Este sangue seraacute encaminhado
ao Laboratoacuterio de Geneacutetica e Cardiologia Molecular do Instituto do Coraccedilatildeo onde seraacute
armazenado somente para a pesquisa Sua participaccedilatildeo eacute totalmente voluntaacuteria Apoacutes ler
entender e esclarecer suas duacutevidas vocecirc assinaraacute 2 vias de igual teor desse documento (termo de
consentimento Livre e Esclarecido) Ainda vocecirc poderaacute solicitar o seu desligamento deste projeto
a qualquer momento bastando para tal entrar em contato os pesquisadores no tel (11) 2661-5592
ou 2661-5995 Em qualquer etapa do estudo vocecirc teraacute acesso aos profissionais responsaacuteveis
pela pesquisa para esclarecimento de eventuais duacutevidas O pesquisador responsaacutevel eacute a Dra
Jaqueline Scholz que pode ser encontrada no endereccedilo Av Dr Eneacuteas de Carvalho Aguiar 44
Instituto do Coraccedilatildeo Bloco 2 andar 1 Programa Ambulatorial de Tratamento Tabagismo
INCOR-HCFMUSP telefone (11) 2661-5592 Se vocecirc tiver alguma consideraccedilatildeo ou duacutevida sobre
a eacutetica da pesquisa entre em contato com o Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa (CEP) ndash Rua Oviacutedio
Pires de Campos 225 ndash 5ordm andar ndash tel (11) 2661-7585 FAX (011) 2661-7585 ndash e-mail
Rubrica participante Rubrica pesquisador
cappesqadmhcfmuspbr Poderaacute tambeacutem solicitar a destruiccedilatildeo das amostras que estaratildeo
armazenadas no mesmo laboratoacuterio
As informaccedilotildees obtidas seratildeo analisadas em conjunto com outros pacientes natildeo sendo
divulgada a identificaccedilatildeo de nenhum paciente Natildeo haveraacute nenhuma despesa por parte do
participante Tambeacutem natildeo haacute compensaccedilatildeo financeira relacionada agrave sua participaccedilatildeo
Benefiacutecio direto para o participante eacute a possibilidade de parar de fumar e ser bem monitorado
durante todo o processo de 12 semanas
Estas informaccedilotildees poderatildeo auxiliar na elaboraccedilatildeo de programas eficazes para o uso
da informaccedilatildeo das caracteriacutesticas individuais em usuaacuterios de medicamentos antitabagismo
Acredito ter sido suficientemente informado a respeito das informaccedilotildees que li ou que
foram lidas para mim descrevendo o estudo ldquoAnaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de
expressatildeo gecircnica dos genoacutetipos preditores de metabolizaccedilatildeo e das concentraccedilotildees de
metaboacutelitos com a resposta ao tratamento antitabagismordquo Eu discuti com o Dra Jaqueline
Scholz com a Juliana da Rocha dos Santos eou Paulo Roberto Xavier Tomaz sobre a minha
decisatildeo em participar nesse estudo Ficaram claros para mim quais satildeo os propoacutesitos do
estudo os procedimentos a serem realizados seus desconfortos e riscos as garantias de
confidencialidade e de esclarecimentos permanentes Concordo voluntariamente em participar
deste estudo e poderei retirar o meu consentimento a qualquer momento antes ou durante o
mesmo sem penalidades ou prejuiacutezo ou perda de qualquer benefiacutecio que eu possa ter
adquirido ou no meu atendimento neste Serviccedilo
_____________________________________________________________________________________
Assinatura do pacienterepresentante legal Data
____________________________________________________________________________
Assinatura da testemunha Data
para casos de pacientes menores de 18 anos analfabetos semi-analfabetos ou portadores de deficiecircncia auditiva ou visual
(Somente para o responsaacutevel do projeto)
Declaro que obtive de forma apropriada e voluntaacuteria o Consentimento Livre e Esclarecido deste
paciente ou representante legal para a participaccedilatildeo neste estudo
____________________________________________________________________________
Assinatura do pesquisador Data
Rubrica participante Rubrica pesquisador
DADOS DE IDENTIFICACcedilAtildeO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSAacuteVEL LEGAL
1NOME
DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nordm SEXO M F
DATA NASCIMENTO
ENDERECcedilO NordmAPTO
BAIRROCIDADE
ESTADOCEPTELEFONE()
2RESPONSAacuteVEL LEGAL
NATUREZA (grau de parentesco tutor curador etc)
DOCUMENTO DE IDENTIDADE SEXO M F
DATA DE NASCIMENTOENDERECcedilO
Nordm APTO
BAIRROCIDADE ESTADOCEPTELEFONE() ___________________________________________________________________________________________________________________________
DADOS SOBRE A PESQUISA
1 TIacuteTULO DO SUBPROJETO DE PESQUISA ldquoAnaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de expressatildeo gecircnica dos genoacutetipos
preditores de metabolizaccedilatildeo e das concentraccedilotildees de metaboacutelitos com a resposta ao tratamento antitabagismordquo
PESQUISADOR RESPONSAacuteVEL Dr Jaqueline Scholz
CARGOFUNCcedilAtildeO Meacutedico Assistente Meacutedico Pesquisador ndash InCor ndash HCFMUSP CRM SP nordm 60179
UNIDADE DO HCFMUSP Programa Ambulatorial de Tratamento Tabagismo InCor-HCFMUSP
PESQUISADOR EXECUTANTE Juliana da Rocha dos Santos CRF SP nordm 62776
CARGOFUNCcedilAtildeO POacuteS-GRADUANDAndash InCor ndash HCFMUSP
UNIDADE DO HC-FMUSP Laboratoacuterio de Geneacutetica e Cardiologia Molecular InCor-HCFMUSP
3 AVALIACcedilAtildeO DO RISCO DA PESQUISA
RISCO MIacuteNIMO RISCO MEacuteDIO
RISCO BAIXO x RISCO MAIOR
4 DURACcedilAtildeO DA PESQUISA 4 anos
ANEXO 1 ndash Aprovaccedilatildeo no Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa
ANEXO 2 - Teste de Fagerstroumlm para a dependecircncia agrave nicotina (versatildeo em Portuguecircs)
Fonte Pietrobon RC Barbisan JN Manfroi WC Utilizaccedilatildeo do teste de dependecircncia agrave nicotina de
Fagerstroumlm como um instrumento de medida do grau de dependecircncia Versatildeo em Portuguecircs Rev HCPA
200727(3)31-6
ANEXO 3 - Escore de consumo situacional Issa
Fonte Issa J S Um novo escore para dependecircncia a nicotina e uma nova escala de conforto do paciente durante
o tratamento do tabagismo J Bras Pneumol 38(6) 761-5
ANEXO 4 ndash Desenho de estudo do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticos na escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismordquo
Desenho do estudo Seraacute randomizado em dois braccedilos um nuacutemero amostral total de 300 pacientes No braccedilo da esquerda 150 pacientes seratildeo tratados com base em teste geneacutetico para os
polimorfismos CYP2B6 (rs2279343) e CHRNA4 (rs1044396) No braccedilo da direita 150 pacientes faratildeo o tratamento tradicional com vareniclina (o faacutermaco de maior efetividade no tratamento
antitabagismo) Em um estudo anterior nosso grupo de pesquisadores 5152 mostrou maior sucesso terapecircutico nos pacientes portadores dos genoacutetipos AA para o gene CYP2B6 nos pacientes
tratados com bupropiona e nos portadores dos genoacutetipos CT e TT para o gene CHRNA4 nos pacientes tratados com vareniclina A escolha do tratamento no braccedilo farmacogeneacutetico prioriza o
tratamento mais barato (bupropiona) dessa forma primeiramente eacute analisado o genoacutetipo para o rs2279343 se o paciente apresentar o genoacutetipo AA o mesmo eacute tratado com bupropiona se ele tiver
o genoacutetipo AG ou GG eacute analisado o genoacutetipo para o polimorfismo rs1044396 Se o paciente apresentar o genoacutetipo CT ou TT para o rs1044396 ele eacute tratado com vareniclina se ele apresentar o
genoacutetipo CC (natildeo favoraacutevel a nenhum dos faacutermacos) ele eacute tratado com vareniclina e bupropiona em uso concomitante Seraacute comparado o custo-efetividade do tratamento baseado em
farmacogeneacutetica em relaccedilatildeo ao tratamento com vareniclina Os pacientes satildeo acompanhados por 12 semanas durante o tratamento farmacoloacutegico visita inicial (T-1) antes do iniacutecio da terapecircutica
(T0) 2 4 6 8 e 12 semanas apoacutes o tratamento (T2 T4 T6 T8 T12) Obs Os pacientes que natildeo conseguirem parar de fumar ateacute a 4 ordf semana de tratamento em monoterapia eacute adicionada a
segunda medicaccedilatildeo Fonte Eficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticos na escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismo InCor-HCFMUSP Projeto de doutorado da Dra Patriacutecia Viviane Gaya
sob a orientaccedilatildeo da Dr Jaqueline R Scholz desenvolvido a partir dos resultados dos estudos da nossa equipe de pesquisadores Rocha Santos et al 2015 67 e Tomaz et al 2015 68
ANEXO 5 ndash Pedido de depoacutesito de patente na Agecircncia de Inovaccedilatildeo e Empreendedorismo da
Universidade Federal de Alfenas-MG
A Deus
Pai muito obrigada pelo Senhor ter me dado essa oportunidade maravilhosa O
Senhor sempre me preparou o melhor e creio que continuaraacute preparando Obrigada
por me dar forccedilas em todos os momentos Te amo
Agrave minha famiacutelia
Obrigada por toda compreensatildeo Obrigada pelo apoio e por terem acreditado
na minha capacidade Vocecircs satildeo uma becircnccedilatildeo e essenciais na minha vida Amo vocecircs
Ao meu marido Sidnei
Lindo te amo muito Obrigada por ter me incentivado Obrigada pelos chaacutes
chocolates e comindinhas que vocecirc sempre ia me trazendo enquanto eu estava
escrevendo este trabalho Obrigada por ter me ajudado nas tarefas domeacutesticas tambeacutem
para que eu pudesse ter tempo para me dedicar Obrigada por todo amor carinho e
cumplicidade Vocecirc eacute um marido excelente
ldquoPorque os meus pensamentos natildeo satildeo os vossos pensamentos nem os vossos
caminhos os meus caminhos diz o Senhor Porque assim como os ceacuteus satildeo mais
altos do que a terra assim satildeo os meus caminhos mais altos do que os vossos
caminhos e os meus pensamentos mais altos do que os vossos pensamentos rdquo
Isaiacuteas 5589
Esta tese estaacute de acordo com as seguintes normas em vigor no momento desta
publicaccedilatildeo
Referecircncias adaptado de International Committee of Medical Journals Editors
(Vancouver)
Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Medicina Divisatildeo de Biblioteca e
Documentaccedilatildeo Guia de apresentaccedilatildeo de dissertaccedilotildees teses e monografias Elaborado
por Anneliese Carneiro da Cunha Maria Julia de A L Freddi Maria F Crestana
Marinalva de Souza Aragatildeo Suely Campos Cardoso Valeacuteria Vilhena 3a ed Satildeo Paulo
Divisatildeo de Biblioteca e Documentaccedilatildeo 2011 Abreviaturas dos tiacutetulos dos perioacutedicos
de acordo com List of Journals Indexed in Index Medicus
SUMAacuteRIO
LISTA DE ABREVIATURAS SIacuteMBOLOS E SIGLAS
LISTA DE EQUACcedilOtildeES
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE QUADROS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
11 Nicotina farmacodinacircmica e farmacocineacutetica 3
12 Faacutermacos antitabagismo 5
121 Vareniclina 6
1211 Farmacodinacircmica 6
1212 Farmacocineacutetica 7
122 Bupropiona 9
1221 Farmacodinacircmica 9
1222 Farmacocineacutetica 10
13 Pesquisa de biomarcadores 11
131 Estudos farmacogeneacuteticos e de expressatildeo gecircnica para vareniclina e bupropiona 12
132 Mensuraccedilatildeo de nicotina bupropiona vareniclina e seus metaboacutelitos em amostras
bioloacutegicas 15
2 JUSTIFICATIVA 17
3 OBJETIVOS 19
4 METODOLOGIA 20
41 Casuiacutestica 20
42 Fluxo de procedimentos adotados no atendimento aos pacientes 23
43 Coleta e armazenamento das amostras dos pacientes tratados com vareniclina e
bupropiona 26
44 Nuacutemero amostral 27
45 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica para amostras de pacientes tratados com vareniclina 28
451 Concentraccedilatildeo purificaccedilatildeo e extraccedilatildeo de RNA 28
452 Siacutentese de cDNA 31
453 Ensaio de controle de qualidade das amostras para o ensaio de expressatildeo gecircnica 31
454 Ensaio de expressatildeo gecircnica 35
455 Anaacutelise dos dados de expressatildeo gecircnica 37
46 Mensuraccedilatildeo de bupropiona vareniclina e de seus metaboacutelitos por HPLC-MSMS 38
461 Materiais equipamentos e condiccedilotildees adotadas para a mensuraccedilatildeo dos analitos apoacutes
validaccedilatildeo do meacutetodo 38
462 Visatildeo geral do desenvolvimento da coluna e padronizaccedilatildeo da anaacutelise 41
463 Desenvolvimento da coluna RAM para a purificaccedilatildeo da amostra 43
464 Caracterizaccedilatildeo do novo RAM 46
4641 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA 46
4642 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas no soro 46
4643 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA em diferentes pHs 47
465 Paracircmetros espectromeacutetricos 47
466 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatograacutefico multidimensional 48
467 validaccedilatildeo analiacutetica 49
47 Anaacutelise estatiacutestica 49
5 RESULTADOS 51
51 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica 51
511 Dados cliacutenicos e demograacuteficos 51
512 Dados de expressatildeo gecircnica 53
513 Anaacutelise de associaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica entre os desfechos e os tempos de
tratamento 54
52 Mensuraccedilatildeo dos analitos 58
521 Caracterizaccedilatildeo da coluna teste exclusatildeo de proteiacutenas e interferentes da matriz 58
522 Otimizaccedilatildeo dos paracircmetros espectromeacutetricos 60
523 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatrograacutefico multidimensional 61
524 Validaccedilatildeo analiacutetica 64
525 Dados cliacutenicos e demograacuteficos dos pacientes submetidos a mensuraccedilatildeo dos analitos
69
526 Anaacutelise de associaccedilatildeo dos analitos com desfecho de tratamento 72
6 DISCUSSAtildeO 75
61 Para os dados da anaacutelise de expressatildeo gecircnica 75
62 Para os dados da mensuraccedilatildeo dos analitos 80
7 CONCLUSOtildeES 87
8 SUGESTOtildeES PARA ESTUDOS FUTUROS 88
9 REFEREcircNCIAS 89
APEcircNDICE ndash TCLE
ANEXO 1 ndash Aprovaccedilatildeo no Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa
ANEXO 2 ndash Teste de Fagerstroumlm para a dependecircncia agrave nicotina (versatildeo em Portuguecircs)
ANEXO 3 - Escore de consumo situacional Issa
ANEXO 4 - Desenho de estudo do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticos na
escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismordquo
ANEXO 5 -Pedido de depoacutesito de patente na Agecircncia de Inovaccedilatildeo e Empreendedorismo
da Universidade Federal de Alfenas-MG
LISTA DE ABREVIATURAS SIacuteMBOLOS E SIGLAS
API Ionizaccedilatildeo em pressatildeo atmosfeacuterica - Atmospheric pressure ionization
ACTB Gene que codifica a proteiacutena β actina
ANKK1 Gene codificador da proteiacutena quinase envolvida em vias de transduccedilatildeo de sinal
B2M Gene que codifica a microbulina subunidade β2
BC3 Tampatildeo de reaccedilao de transcriptase reversa
BR1 Tampatildeo de ressuspensatildeo
BR2 Tampatildeo de ligaccedilatildeo
BR3 Tampatildeo de lavagem 1
BR4 Tampatildeo de lavagem 2
BR5 Tampatildeo de eluiccedilatildeo
BRT Tubos PAXgene
BSA Albumina de soro bovino
[C14] Carbono 14 (isoacutetopo radioativo do carbono de massa atocircmica 14)
cDNA DNA complementar sintetizado a partir de uma moleacutecula de RNA
CHRNA3 Gene codificador do receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α3
CHRNA4 Gene codificador da subunidade α4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNA5 Gene codificador da subunidade α5 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNA6 Gene codificador da subunidade α6 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNA7 Gene codificador da subunidade α7 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNB2 Gene codificador da subunidade β2 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNB3 Gene codificador da subunidade β3 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNB4 Gene codificador da subunidade β4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNG Gene codificador do receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade δ
CNTs Nanotubos de carbono - Carbon nanotubes
COMT Gene codificador da enzima catecol-O-metiltransferase (metaboliza dopamina)
CS ndash SPE Extraccedilatildeo em fase soacutelida no modo column switching
CT Ciclo de linha de base ndash threshold cicle (nuacutemero de ciclo em que a amostra
amplificou)
CYP2B6 Gene codificador do receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade γ
CYP2B6 Gene codificador da isoenzima CYP2B6
Disco QC Disco para a realizaccedilatildeo do controle de qualidade de amostras que seratildeo utilizadas
para o ensaio de expressatildeo gecircnica
DN Dependecircncia agrave nicotina
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
DNAse Enzima que degrada moleacuteculas de DNA
dNTP Dinucleotiacutedeos dATP dCTP dGTP e dTTP
DRD1 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 1
DRD2 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 2
DRD3 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 3
DRD4 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 4
E Erro relativo
EDTA Aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico
Escore Issa Escore de consumo situacional Issa
ESI+ Ionizaccedilatildeo positiva por electrospray - positive Electrospray ionization
FDA Orgatildeo de controle de alimentos e medicamentos americano ndash Food and drug
administration
FTND Teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fargestroumlm test for nicotine
dependence
g Velocidade de rotaccedilatildeo em forccedila g a qual considera a aceleraccedilatildeo da gravidade
GDC Controle de contaminaccedilatildeo de DNA genocircmico do disco QC
GE Tampatildeo de degradaccedilatildeo de DNA genocircmico
HGDC Controle de contaminaccedilatildeo de DNA genocircmico do ensaio de expressatildeo gecircnica
HPLC Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia ndash High Performance Liquid
Cromatograph
HPLC-MSMS Cromatografica liacutequida de alta eficiecircncia seguida por espectrometria de massas
em tandem ndash High Performance Liquid Cromatograph fowed by tandem Mass
Spectrometric
HPRT1 Gene que codifica a enzima hipoxantina fosforribosiltransferase 1
HTR3A Gene codificador da subunidade 3A do receptor de serotonina
HTR3B Gene codificador da subunidade 3B do receptor de serotonina
KV Energia de colisatildeo em quilovolt
LC-MS Cromatografia liacutequida seguida de espectrometria de massas - Liquid
Cromatograph fowed by Mass Spectrometric
LD Limite de detecccedilatildeo
LLE Extraccedilatildeo liacutequido-liacutequido (com o uso de solvente)
LQ Limite de quantificaccedilatildeo
LogP Coeficiente de particcedilatildeo relaccedilatildeo das concentraccedilotildees da substacircncia em um solvente
orgacircnico e em aacutegua dado que ambos os solventes satildeo necessariamente imisciacuteveis
MCT Microtubos de 15 mL
MS Espectrometria de massas - Mass Spectrometric
MRM Muacuteltiplas transiccedilotildees de monitoramento de reaccedilatildeo - multiple reaction monitoring
MSMS Espectrometria de massas em tandem
mz Relaccedilatildeo massacarga dos analitos
nAChR(s) Receptor(es) acetilcoliacutenico (s) nicotiacutenico (s)
NMR Taxa de metabolizaccedilatildeo da nicotina ndash Nicotine metabolite ratio
NTC Controle negativo
NTR Controle de natildeo transcriccedilatildeo reversa
OCT2 Transportador catiocircnico orgacircnico
P2 Controle externo de RNA
PAF Programa de Assistecircncia ao Fumante
PBMC Ceacutelulas mononucleares de sangue perifeacuterico - Peripheral blood mononuclear cell
PCR Amplificaccedilatildeo em cadeia da polimerase
PIs Padrotildees internos
PK Enzima proteinase K
pKa Valor negativo do logaritmo da constante de dissociaccedilatildeo de um aacutecido
pKb Valor negativo do logaritmo da constante de dissociaccedilatildeo de uma base
PP Extraccedilatildeo por preciptaccedilatildeo de proteiacutenas
PPC Controle positivo de PCR
PRC Coluna de rotaccedilatildeo de RNA vermelho
PSC Coluna de rotaccedilatildeo do homogeneizador lilaacutes
PT Tubo de processamento
RAM Material de acesso restrito ndash restrict access material
Rcf Forccedila centriacutefuga relativa ndash Relative centrifugal force
RDD Tampatildeo de digestatildeo de DNA
RE3 Mix de transcriptase reversa
RNA Aacutecido ribonucleico
RNase Enzima ribonuclease a qual degrada as moleacuteculas de RNA
RNFD Soluccedilatildeo matildee de DNase
RNFW Aacutegua livre de RNase
RFLP Restriccedilatildeo enzimaacutetica - Restriction fragment length polymorphism
RP‐HPLC Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia em fase reversa ndash Reverse-Phase High
Performance Liquid Cromatograph
Rpm Rotaccedilatildeo por minuto
RSD Desvio padratildeo relativo
SLC6A3 Gene codificador da proteiacutena transportadora de dopamina
SLC22A2 Gene codificador da proteiacutena OCT2 transportadora de caacutetions orgacircnicos
(transporta vareniclina)
SNC Sistema nervoso central
SPE Extraccedilatildeo em fase soacutelida
Sty I Enzima de restriccedilatildeo proveniente da Salmonella Typhi
TAE Tampatildeo formado com Tris Acetato e EDTA
TRN Terapia de reposiccedilatildeo nicotiacutenica
UGT2B7 Gene codificador da enzima UGT2B7 a qual metaboliza a vareniclina
UPLC Cromatografica liacutequida de ultra eficiecircncia - Ultra Performance Liquid
Cromatograph
UV Detector ultravioleta
α3 Subunidade alfa 3 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α4 Subunidade alfa 4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α5 Subunidade alfa 5 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α6 Subunidade alfa 6 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α7 Subunidade alfa 7 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
β2 Subunidade beta 2 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
β4 Subunidade beta 4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
T-1 Visita inicial
T0 Visita de iniacutecio do tratamento (coleta realizada antes de comeccedilar o tratamento no
mesmo dia)
T2 Visita de 2 semanas apoacutes tratamento farmacoloacutegico
T4 Visita de 4 semanas apoacutes tratamento farmacoloacutegico
T12 Visita de 12 semanas apoacutes tratamento farmacoloacutegico
TFC Cromatografia liacutequida turbulenta - Turbulent flow-liquid chromatography
LISTA DE EQUACcedilOtildeES
∆CT= (CTamostra ndash a meacutedia de CThousekeeping genes) Normalizaccedilatildeo da expressatildeo
gecircnica dos genes alvo atraveacutes de valores de expressatildeo de genes fisioloacutegicos
2-∆CT Transformaccedilatildeo dos valores de ∆CT em escala logariacutetmica para a realizaccedilatildeo
dos testes de hipoacutetese
∆∆CT= (mediana de ∆CTgrupo teste ndash mediana de ∆CT grupo referecircncia) Foacutermula
utilizada para posterior caacutelculo de fold change Considera-se os dois grupos
envolvidos no teste de hipoacutetese
2-∆∆CT Transformaccedilatildeo dos dados de ∆∆CT em escala logariacutetmica Atraveacutes dessa
foacutermula se obteacutem o fold change (diferenccedila de expressatildeo entre dois grupos)
NMR=(trans-3-hidroxicotininacotinina) Taxa de metabolizaccedilatildeo da nicotina
NMRlt031=metabolizador lento NMRgt031 metabolizador normal ou raacutepido
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Analitos precursores fragmentos e energias de colisatildeo
otimizados
40
Tabela 2 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina selecionados para os ensaios de expressatildeo gecircnica
52
Tabela 3 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina submetidos aos ensaios de expressatildeo gecircnica de acordo
com o desfecho de tratamento
52
Tabela 4 - Valores de mediana de ∆CT dos genes de acordo com os
tempos de tratamento e grupos de desfecho
53
Tabela 5 - Fold change e anaacutelise de associaccedilatildeo entre os tempos de
tratamento e grupos de desfecho
54
Tabela 6 - Paracircmetros de validaccedilatildeo obtidos na determinaccedilatildeo de faacutermacos
antitabagismo em soro humano
68
Tabela 7 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos
69
Tabela 8 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de
acordo com o desfecho de tratamento
70
Tabela 9 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos
71
Tabela 10 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes
tratados com bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos
analitos de acordo com o desfecho de tratamento
71
Tabela 11 ndash Frequecircncia do desfecho de tratamento nos pacientes
submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com os
medicamentos antitabagismo
72
Tabela 12 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos
pacientes tratados com vareniclina
73
Tabela 13 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de
tratamento com vareniclina
73
Tabela 14 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos
pacientes tratados com bupropiona
74
Tabela 15 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de
tratamento com bupropiona
74
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Aacutereas estimuladas atraveacutes de vias dopamineacutergicas e
serotonineacutergicas e sistema de recompensa
2
Figura 2 - Receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico 4
Figura 3 - Via primaacuteria do metabolismo da nicotina 5
Figura 4 - Mecanismo de accedilatildeo da vareniclina 7
Figura 5 - Metabolismo da vareniclina em humanos 8
Figura 6 - Mecanismo de accedilatildeo da bupropiona 9
Figura 7 - Metabolismo da bupropiona em seus principais metaboacutelitos ativo 11
Figura 8 - Desenho do estudo 22
Figura 9 - Representaccedilatildeo do Rotor-Disc100 33
Figura 10 - Mapa do disco QC (representaccedilatildeo planilhada) 33
Figura 11 - Exemplo de ajuste de Threshold 34
Figura 12 - Mapa do disco do ensaio RT2 profiler PCR array (representaccedilatildeo
planilhada)
37
Figura 13 - Representaccedilatildeo da composiccedilatildeo da coluna extratora (Novo RAM) 45
Figura 14 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNA7 entre os tempos de
tratamento e desfecho
56
Figura 15 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNG entre os tempos de
tratamento e desfecho
57
Figura 16 - Heat map de expressatildeo gecircnica 58
Figura 17 ndash Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com soluccedilatildeo de
BSA
59
Figura 18 - Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com amostra de
soro diluiacuteda
59
Figura 19 - Influecircncia do pH na exclusatildeo de proteiacutenas 60
Figura 20 - Ilustraccedilatildeo do sistema de columm switching na configuraccedilatildeo de
backflush
62
Figura 21 - Cromatograma obtido de amostras de soro branco diluiacutedas em
aacutegua ultra pura
65
Figura 22 - Cromatograma obtido apoacutes anaacutelise de soro diluiacutedo e dopado com
os analitos no niacutevel meacutedio de calibraccedilatildeo e mais os padrotildees internos deuterados
65
Figura 23 - Cromatograma obtido atraveacutes da anaacutelise das amostras de soro dos
pacientes tratados com bupropiona
67
Figura 24 - Cromatograma obtido atraveacutes da analise de amostras de soro de
pacientes tratados com vareniclina
67
LISTA DE QUADROS
Quadro 1- Procedimentos do protocolo em relaccedilatildeo aos pacientes 25
Quadro 2 - Paracircmetros de qualidade do ensaio QC 34
Quadro 3 - Genes escolhidos para o ensaio de expressatildeo 36
Quadro 4 - Housekeeping genes 36
Quadro 5 - Propriedades fiacutesico-quiacutemicas dos analitos 42
Quadro 6 ndash Comparaccedilatildeo dos dados de validaccedilatildeo com outros estudos 85
RESUMO
Santos JR Anaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de expressatildeo gecircnica e das concentraccedilotildees
de metaboacutelitos com a resposta ao tratamento antitabagismo [tese] Satildeo Paulo
Faculdade de Medicina Universidade de Satildeo Paulo 2020
Introduccedilatildeo O tabagismo eacute considerado a maior causa de morbidade e mortalidade
evitaacutevel no mundo Estudos tecircm buscado a identificaccedilatildeo de preditores de resposta aos
tratamentos de cessaccedilatildeo tabaacutegica Os principais objetivos deste estudo foram analisar a
possiacutevel associaccedilatildeo da expressatildeo de genes alvo e das concentraccedilotildees de analitos
(faacutermacos antitabagismo nicotina e seus metaboacutelitos) com a resposta ao tratamento
Meacutetodos Foram incluiacutedos 105 pacientes fumantes que iniciariam o tratamento com
vareniclina (n=74) ou bupropiona (n=31) As anaacutelises de expressatildeo gecircnica foram
realizadas atraveacutes do ensaio customizado RTsup2 Profiler PCR Array com a inclusatildeo de 17
genes para a anaacutelise em ceacutelulas mononucleares de sangue perifeacuterico (PBMC) A
preparaccedilatildeo das amostras de soro para a mensuraccedilatildeo dos analitos foi realizada atraveacutes de
uma coluna extratora composta por nanotubos hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados
com a adiccedilatildeo de grupos hidrofiacutelicos (material de acesso restrito - RAM) desenvolvida
no LATF Unifal MG A mensuraccedilatildeo dos analitos foi realizada por cromatografia
liacutequida de alta eficiecircncia em modo column switching seguida de espectrometria de
massa em tandem (HPLC-MSMS) Os tempos para a coleta de amostras foram para as
anaacutelises de expressatildeo gecircnica (sangue total) antes de iniciar o tratamento (T0) duas e
quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento (T2 e T4 respectivamente) e para a
mensuraccedilatildeo dos analitos (soro) as amostras foram coletadas na T2 Resultados Para as
anaacutelises de expressatildeo gecircnica selecionamos 14 pacientes que obtiveram sucesso e 13
pacientes resistentes ao tratamento com vareniclina Foi considerado sucesso quando o
paciente alcanccedilava abstinecircncia ao tabaco ateacute a 4 ordf semana de tratamento e resistente
quando o paciente natildeo conseguia parar de fumar ateacute a 4ordf semana de tratamento Foi
observada diferenccedila significativa para a expressatildeo do gene CHRNA7 no grupo
resistente amostras dos tempos T2 e T4 apresentaram menor expressatildeo comparadas ao
tempo T0 (fold change 038 P=0007 fold change 067 P=0004 respectivamente)
Para a mensuraccedilatildeo dos analitos a coluna RAM desenvolvida mostrou alta capacidade
para a remoccedilatildeo de macromoleacuteculas e de anaacutelise conjunta dos diferentes analitos aleacutem
de poder ser reutilizada diversas vezes (cerca de 400 ciclos) Os pacientes do grupo
resistente tratados com ambos os faacutermacos apresentaram maior concentraccedilatildeo de
metaboacutelitos da nicotina na T2 No entanto natildeo houve associaccedilatildeo dos faacutermacos e seus
metaboacutelitos com desfecho de tratamento Conclusotildees Para as anaacutelises de expressatildeo
gecircnica este estudo exploratoacuterio mostrou um possiacutevel preditor de efetividade no
tratamento com vareniclina reafirmando a associaccedilatildeo da subunidade α7 para os
processos de dependecircncia agrave nicotina e tratamento antitabagismo Estes resultados
podem contribuir ao menos em parte para o desenvolvimento de uma terapia
individualizada Contudo estudos futuros satildeo necessaacuterios para o entendimento do papel
da subunidade α7 dos receptores acetilcoliacutenicos-nicotiacutenicos no tratamento com
vareniclina Para a mensuraccedilatildeo dos analitos o novo RAM sintetizado eacute um produto de
extremo valor cientiacutefico podendo apresentar diversas aplicaccedilotildees em anaacutelise de amostras
com matrizes complexas sem muita preparaccedilatildeo preacutevia Para a associaccedilatildeo das
concentraccedilotildees dos faacutermacos e seus metaboacutelitos com o desfecho de tratamento satildeo
necessaacuterios estudos com um maior nuacutemero amostral
Descritores Vareniclina Bupropiona Nicotina Abandono do haacutebito de fumar
Expressatildeo gecircnica Biomarcadores farmacoloacutegicos
ABSTRACT
Santos JR Association analysis of gene expression profiles and metabolite
concentrations with response for smoking cessation treatment [thesis] Satildeo Paulo
ldquoFaculdade de Medicina Universidade de Satildeo Paulordquo 2020
Introduction Smoking is considered the largest cause of preventable morbidity and
mortality in the worldwide Studies have sought to identify predictors of responses to
smoking cessation treatments The main objectives of this study were to analyze the
possible association of the expression of target genes and concentrations of analytes
(drugs for smoking cessation nicotine and their metabolites) with the response to
treatment Methods We included 105 smoker patients who would start treatment with
varenicline (n=74) or bupropion (n=31) Gene expression analysis was performed
through custom RTsup2 Profiler PCR array assay including 17 genes for analysis in
peripheral blood mononuclear cells (PBMC) Serum sample preparation for the
measurement of analytes was performed by an extraction column composed of hybrid
carbon and silica nanotubes modified with the addition of hydrophilic groups (restricted
access material - RAM) developed by LATF Unifal MG The measurement of analytes
was performed by high efficient liquid chromatography in column switching mode
followed by tandem mass spectrometry (HPLC-MSMS) Times for sample collection
were for gene expression analysis (total blood) before start of therapy (T0) two and
four weeks after start of treatment (T2 and T4 respectively) and for measurement of
analytes (serum) the samples were collected at T2 Results For gene expression
analysis we selected 14 patients who had success and 13 patients resistant to the
varenicline treatment Success was considered to be when a patient achieved tobacco
abstinence until the 4th week of treatment and resistant was when a patient had not
stopped smoking as of the 4th week of treatment We observed a significant difference
for CHRNA7 gene expression in the resistant group samples from T2 and T4 had lower
expression compared with T0 (fold change 038 P=0007 fold change 067 P=0004
respectively) For measurement of analytes the developed RAM column showed high
capacity to remove macromolecules and joint analyzes of different analytes besides
being able to be reuse manny times (about 400 cycles) Patients from resistant group of
the both drugs treatment had a higher concentration of nicotine metabolites in T2
However there was no association of drugs for smoking cessation and their metabolites
with outcome treatment Conclusions For gene expression analysis this exploratory
study showed a possible predictor of effectiveness in the treatment with varenicline
reaffirming the association of the α7 subunit for nicotine dependence and smoking
therapy processes These results may contribute at least in part to the development of
individualized therapy However further studies are needed to understand the role of the
α7 subunit of acetylcholinic-nicotinic receptors in varenicline treatment For the
measurement of analytes the new synthesized RAM is a product of extreme scientific
value being able of several applications in the analysis of samples with complex
matrices without much prior preparation For an association of drugs for smoking
cessation and their metabolites with outcome treatment studies with a larger sample
size are needed
Descriptors Varenicline Bupropion Nicotine Smoking cessation Gene expression
Biomarkers pharmacological
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
O tabagismo eacute considerado a maior causa de morbidade e mortalidade evitaacutevel
em todo o mundo 1 Doenccedilas cardiacuteacas cerebrovasculares cerca de um quinto de todos
os tipos de cacircnceres doenccedilas pulmonares como apneia e enfisema aleacutem de distuacuterbios
preacute-natais estatildeo associadas ao consumo do tabaco 2-5
Dados recentes da Vigitel mostraram que no conjunto das 27 capitais brasileiras
a frequecircncia de adultos fumantes foi de 93 com valores duas vezes maior no sexo
masculino (121) do que no feminino (69) As menores frequecircncias foram
encontradas na populaccedilatildeo de jovens adultos (antes dos 25 anos) e em pessoas de mais
de 65 anos As maiores frequecircncias foram encontradas entre homens em Porto Alegre
(173) Campo Grande e Satildeo Paulo (156) 6
A nicotina eacute o principal componente do tabaco causador de dependecircncia Esta
age nos receptores acetilcoliacutenicos-nicotiacutenicos (nAChRs) promovendo a liberaccedilatildeo de
diversos neurotransmissores e neuroreguladores tais como dopamina acetilcolina
epinefrina norepinefrina serotonina beta-endorfina vasopressina e GABA O principal
neurotransmissor estudado eacute a dopamina pois a nicotina promove aumento de seus
niacuteveis na regiatildeo mesocorticoliacutembica cerebral principalmente em um circuito conhecido
como ldquosistema de recompensardquo (aacuterea tegmental ventral nuacutecleo accumbens e coacutertex preacute-
frontal) gerando sensaccedilotildees de prazer e bem-estar 7-15
O processo de adiccedilatildeo agrave nicotina eacute complexo e nem todos os mecanismos estatildeo
elucidados Aleacutem da ativaccedilatildeo do sistema de recompensa haacute a formaccedilatildeo de memoacuterias
associativas do efeito hedocircnico com os ambientes e situaccedilotildees de disponibilidade e uso
do tabaco resultando em reforccedilo positivo apoacutes o fumante entrar em contato com fatores
relacionados ao seu consumo Este tipo de memoacuteria aprendida envolve a amigdala o
hipocampo o coacutertex preacute-frontal e o coacutertex parietal 15-17 Evidecircncias tambeacutem satildeo
2
consistentes com a hipoacutetese da ativaccedilatildeo do estriado dorsal o qual estaacute envolvido no
processamento de memoacuterias de formaccedilatildeo de haacutebito em processos motores o que
poderia automatizar o ato de fumar 15 18 (Figura 1)
O uso continuado do tabaco promove a desensibilizaccedilatildeo e adaptaccedilatildeo dos
nAChRs causando toleracircncia e diminuiccedilatildeo dos efeitos de recompensa naturais Como
resultado o indiviacuteduo experimenta fissura ansiedade humor deprimido e irritabilidade
na ausecircncia da nicotina Estes sintomas acabam promovendo um reforccedilo negativo para o
fumo e o nuacutemero de cigarros consumidos aumenta cada vez mais 14 15
Todos os fatores acima mencionados contribuem para o mecanismo de
dependecircncia agrave nicotina (DN) Os efeitos hedocircnicos estatildeo relacionados com o processo
de iniciaccedilatildeo do tabagismo enquanto os efeitos negativos da falta da nicotina estatildeo mais
associados agrave manutenccedilatildeo do fumo 15
Para os indiviacuteduos que desejam parar de fumar o tratamento farmacoloacutegico
antitabagismo eacute o que apresenta maior eficaacutecia na reduccedilatildeo da prevalecircncia de fumantes
19
Figura 1 - Aacutereas estimuladas atraveacutes de vias dopamineacutergicas e serotonineacutergicas e sistema de recompensa A
Principais vias ativadas na dependecircncia como a aacuterea tegmental ventral nuacutecleos accumbens e da rafe coacutertex-frontal
estriado susbstacircncia negra e hipocampo As setas em rosa indicam aacutereas estimuladas pelas vias serotonineacutergicas de
transmissatildeo e em azul pelas vias dopamineacutergicas gerando diversos comportamentos B Sistema de recompensa
(composto pela VTA nuacutecleo accumbeacutens e coacutertex preacute-frontal) A nicotina age nos nAChRs no SNC gerando uma
3
descarga de dopamina no sistema de recompensa Haacute uma adaptaccedilatildeo desses receptores com o fumo continuado
fazendo com que haja a necessidade de maior consumo de nicotina e o desenvolvimento da dependecircncia VTA= aacuterea
tegmental ventral SNC sistema nervoso central nAChR= receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico Fonte adaptado de
Habermann A Brain awareness week addiction and the brainrsquos reward system Sovereign Health Group 2016 e de
Koob amp Volkow 2009 14
11 Nicotina farmacodinacircmica e farmacocineacutetica
O fumo permite uma titulaccedilatildeo precisa da dose de nicotina por parte do fumante
Sua absorccedilatildeo eacute raacutepida chegando em cerca de 10 segundos em todo o sistema nervoso
central (SNC) onde se liga nos nAChRs 20 21 22
Os nAChRs satildeo receptores de canais iocircnicos compostos por cinco subunidades
que podem estar combinadas de diferentes formas (Figura 2) 20 Os subtipos desses
receptores mais abundantes no ceacuterebro humano satildeo os α4β2 α3β4 e α7 (homomeacuterico)
Os receptores compostos pelas subunidades α4β2 (o asterisco indica que outras
subunidades podem estar presentes) possuem um papel fundamental na DN O nocaute
da subunidade β2 em ratos resultou na eliminaccedilatildeo dos efeitos comportamentais da
nicotina 23 Quanto agrave subunidade α4 parece estar envolvida na sensibilidade agrave nicotina
o que pode impactar nos efeitos de recompensa dessensibilizaccedilatildeo e toleracircncia24 25 Os
receptores compostos pelas subunidades α3β4 acredita-se mediar os efeitos
cardiovasculares 26 Os nAChRs α7 homomeacuterico estatildeo envolvidos na velocidade de
sinapses em processos de aprendizagem e controle sensorial 27 28 Os receptores
compostos pelas subunidades α4β2lowast podem conter outras subunidades como por
exemplo α5 α6 eou β3 as quais podem modificar a sensibilidade e funccedilatildeo do receptor
21 29
Como um agonista desses receptores a nicotina promove a sua abertura
permitindo a entrada de soacutedio e caacutelcio despolarizando assim a membrana dos
neurocircnios Aleacutem da entrada de caacutelcio atraveacutes dos nAChRs haacute tambeacutem a abertura de
4
canais de caacutelcio voltagem dependentes fazendo com que as vesiacuteculas que armazenam
os neurotransmissores sejam liberadas 20 21 O resultado da ativaccedilatildeo dos nAChRs em
neurocircnios poacutes-sinaacutepticos eacute a liberaccedilatildeo de diversos neurotransmissores ativando vaacuterias
aacutereas como jaacute mencionado
Figura 2 - Receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico O receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico funciona como um
canal iocircnico transmembracircnico Sua composiccedilatildeo eacute pentacircmera ou seja eacute formada por 5 subunidades que
podem se combinar de diferentes formas As subunidades satildeo classificadas de acordo com diferenccedilas nos
domiacutenios da sua estrutura proteiacuteca A acetilcolina e a nicotina satildeo agonistas desses receptores fazendo
com que os mesmos sejam abertos Assim ocorre a entrada de soacutedio despolarizando a membrana
gerando o potencial de accedilatildeo ACh= acetilcolina Nicot= Nicotina Na+= soacutedio K+= potaacutessio α =
subunidade alfa β= subunidade beta δ= subunidade delta γ= subunidade gama Fonte adaptado de Rang
amp Dale Farmacologia 5 ed Elsevier 2012
Haacute oscilaccedilatildeo dos picos de nicotina entre um cigarro e outro mas as quantidades
se acumulam entre 6 e 9 horas em um fumo regular saturando os nAChR causando
desensibilizaccedilatildeo adaptaccedilatildeo toleracircncia sintomas de abstinecircncia na falta do fumo e DN
30
A nicotina eacute rapidamente e extensivamente metabolizada pelo fiacutegado atraveacutes da
isoenzima CYP2A6 (e em menor grau pelas isoenzimas CYP2B6 e CYP2E1) agrave nicotina
-iacuteon iacuteminio e apoacutes pela enzima aldeiacutedo oxidase agrave cotinina O tempo de meia vida da
nicotina eacute de aproximadamente 2 horas e da cotinina 16 horas Posteriormente a
5
cotinina eacute metabolizada em trans-3-hidroxicotinina quase que exclusivamente pela
CYP2A6 (outros isocircmeros da hidroxicotina representam menos de 2 da dose) 31 32
(Figura 3) Esta eacute a maior via de metabolizaccedilatildeo da nicotina (70 - 80 do metabolismo
da nicotina em todo o corpo) 33 no entanto haacute vias menores como por exemplo a
glucoronidaccedilatildeo que pode ser a maior determinante no clearence da nicotina em
indiviacuteduos com menor atividade da CYP2A6 31
Figura 3 - Via primaacuteria do metabolismo da nicotina A nicotina eacute
metabolizada marjoritaramente pela isoenzima CYP2A6 em nicotina-
iacuteon imiacutenio e atraveacutes da enzima aldeiacutedo oxidase eacute convertida em
cotinina A cotinina eacute posteriomente metabolizada em trans-3-
hidroxicotinina novamente pela isoenzima CYP2A6 Fonte adaptado
de Llaquet et al 2010 34
12 Faacutermacos antitabagismo
Os medicamentos de primeira escolha aprovados pela Agecircncia Nacional de
Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) incluem tratamentos com base na terapia de reposiccedilatildeo
nicotiacutenica (TRN) como adesivo goma e pastilha e tambeacutem satildeo utilizados vareniclina e
bupropiona Estes uacuteltimos possuem maior eficaacutecia terapecircutica na cessaccedilatildeo tabaacutegica 35 36
6
121 Vareniclina
1211 Farmacodinacircmica
A vareniclina eacute o faacutermaco mais recentemente utilizado para a interrupccedilatildeo do
tabagismo este foi desenvolvido especificamente para atuar nos nAChRs A sua
farmacodinacircmica estaacute mais associada agrave atuaccedilatildeo como um agonista parcial nos nAChRs
compostos pelas subunidades α4β2 37 os quais satildeo importantes alvos de accedilatildeo da
nicotina pois satildeo necessaacuterios e suficientes para a recompensa toleracircncia e
sensibilizaccedilatildeo 25 38 39 (Figura 4)
Estudos mostraram que em relaccedilatildeo agrave nicotina a vareniclina possui 15 vezes
maior afinidade pelas subunidades α4β2 e ativa em torno de 50 a liberaccedilatildeo de
dopamina no sistema mesocorticoliacutembico 37 O faacutermaco atua tambeacutem em outros
nAChR como nos nAChRs (α3β4) age fracamente nos receptores contendo a
subunidade α6 e em nAChRs (α3β2) aleacutem de exercer atividade agonista total nos
receptores α7 40
Quanto agraves reaccedilotildees adversas no uso do faacutermaco a naacuteusea eacute a mais comum (cerca
de 10 a 45 dos indiviacuteduos tratados) a qual muitas vezes leva agrave natildeo aderecircncia ao
tratatamento 41-43
7
Figura 4 - Mecanismo de accedilatildeo da vareniclina A Na ausecircncia da vareniclina a nicotina se liga aos
nAChRs aumentando a ativaccedilatildeo nesses receptores Aleacutem disso haacute o estiacutemulo endoacutegeno (promovido
pela acetilcolina) B A vareniclina eacute um agonista parcial de nAChR (α4β2) ou seja tambeacutem estimula
os nAChRs mas em menor niacutevel do que a nicotina e ao mesmo tempo eacute antagonista na presenccedila de
nicotina fazendo com que ela natildeo consiga se ligar ao receptor Fonte do autor baseado nas
informaccedilotildees de Kassem et al 2012 37
1212 Farmacocineacutetica
A vareniclina eacute rapidamente absorvida pelo trato intestinal com absorccedilatildeo gt90
logo apoacutes a administraccedilatildeo oral As concentraccedilotildees plasmaacuteticas maacuteximas satildeo alcanccediladas
no periacuteodo entre 3 e 4 horas 44 e o estado de equiliacutebrio da sua concentraccedilatildeo ocorre
dentro de 4 dias 37 44-46 O faacutermaco possui baixa ligaccedilatildeo com proteiacutenas plasmaacuteticas
sendo que de acordo com ensaios in vitro a fraccedilatildeo de vareniclina (100 ngmL) livre foi
de 797 47 A sua biodisponibilidade natildeo eacute afetada pelo tempo de administraccedilatildeo ou
ingestatildeo de alimentos 37 45 46 Aleacutem disso a vareniclina possui ampla distribuiccedilatildeo nos
tecidos sendo que o volume meacutedio de distribuiccedilatildeo aparente eacute de 415 litros
apresentando um coeficiente de variaccedilatildeo (CV) de 50 48
Na circulaccedilatildeo humana a vareniclina se encontra em quantidade marjoritaacuteria satildeo
tambeacutem encontrados os metaboacutelitos conjugados vareniclina N-carbomoil glucoroniacutedeo
8
N-formilvareniclina e oxovareniclina O tempo de meia vida da vareniclina eacute em torno
de 24 horas independente da dose administrada
A eliminaccedilatildeo do faacutermaco e metaboacutelitos se daacute principalmente pela urina (99) 49
A eliminaccedilatildeo renal exibe cineacutetica linear e a sua excreccedilatildeo ocorre pela filtraccedilatildeo
glomerular na qual estaacute associada agrave secreccedilatildeo tubular realizada pelo transportador
catiocircnico orgacircnico OCT2 O clearence estimado da vareniclina eacute de 88 a 155 mLmin
apoacutes administraccedilatildeo de dose uacutenica e 92 a 143 mLmin apoacutes doses repetidas A
depuraccedilatildeo de vareniclina eacute reduzida na presenccedila de doenccedila renal Na urina cerca de
90 do produto eliminado eacute encontrado como vareniclina em sua forma inalterada e
menos de 10 eacute encontrado na forma de 2 metaboacutelitos a hidroxivareniclina e a
vareniclina-N-carbomoil glucoroniacutedeo 37 49-51
Nenhum dos metaboacutelitos da vareniclina eacute acreditado ser farmacologicamente
ativo Aleacutem disso esses metaboacutelitos estatildeo presentes em concentraccedilotildees muito baixas 37
46-49 A Figura 5 mostra os metaboacutelitos provenientes da vareniclina
A formaccedilatildeo dos metaboacutelitos da vareniclina natildeo eacute catalisada pelo complexo
enzimaacutetico CYP450 Ensaios realizados com microssoma hepaacutetico humano mostraram
que a formaccedilatildeo do conjugado vareniclina N-carbomilglucoroniacutedeo eacute provavelmente
catalisado pela enzima UGT2B7 37 49
Figura 5 ndash Metabolismo da vareniclina em humanos Fonte adaptado de Obach et al 2006 49
9
122 Bupropiona
1221 Farmacodinacircmica
A bupropiona eacute um antidepressivo no entanto tem sido utilizado como faacutermaco
antitabagismo devido o seu potencial em diminuir o desejo de fumar (o qual foi
percebido durante o tramento de iacutendiviacuteduos fumantes) Como mecanismo de accedilatildeo a
bupropiona atua como um inibidor relativamente se
letivo da recaptaccedilatildeo de norepinefrina e dopamina com pequeno efeito na
recaptaccedilatildeo de serotonina (Figura 6) aleacutem de ser um antagonista de nAChR natildeo
competitivo Essas propriedades minimizam os sintomas de retirada da nicotina
aumentando a probabilidade do indiviacuteduo se abster do fumo 52
Insocircnia e boca seca satildeo as reaccedilotildees adversas mais comumente relatadas ao uso da
bupropiona (30-40 e 10 dos pacientes respectivamente) 53
Figura 6 - Mecanismo de accedilatildeo da bupropiona A Na ausecircncia da bupropiona neurotransmissores
como a noradrenalina serotonina e a dopamina satildeo recaptados endogenamente pela bomba de
recaptaccedilatildeo B Na presenccedila da bupropiona a qual eacute inibidora da bomba de recaptaccedilatildeo desses
neurotransmissores haacute a estimulaccedilatildeo do sistema de recompensa mais especificamente atraveacutes do
aumento da concentraccedilatildeo de dopamina Dessa forma o sistema continua sendo estimulado mas em
menor grau que a nicotina e as chances de abstinecircncia ao tabaco satildeo aumentadas Fonte do autor
baseado nas informaccedilotildees de Slemmer et al 2000 52
10
1222 Farmacocineacutetica
Conforme ensaios em voluntaacuterios sadios os picos maacuteximos de concentraccedilatildeo
plasmaacutetica de bupropiona satildeo alcanccedilados aproximadamente 3 horas apoacutes a sua
administraccedilatildeo oral O volume de distribuiccedilatildeo aparente eacute de aproximadamente 2000L e
a ligaccedilatildeo com proteiacutenas plasmaacuteticas eacute de 84 para a bupropiona e de 77 para a
hidroxibupropiona (o seu principal metaboacutelito ativo) 54
A bupropiona eacute metabolizada primariamente em uma seacuterie de metaboacutelitos ativos
como a hidroxibupropiona a threohidrobupropiona e a eritrohidrobupropiona (Figura
7) A CYP2B6 eacute a principal enzima que converte a bupropiona em hidroxibupropiona
em humanos No entanto a formaccedilatildeo de threohidrobupropiona e a
eritrohidrobupropiona que ocorre atraveacutes de reaccedilatildeo redutiva natildeo eacute mediada pela
CYP2B6 55 56 A eritroidrobupropiona natildeo pode ser mensurada no plasma apoacutes a
administraccedilatildeo de uma uacutenica dose de bupropiona Os metaboacutelitos ativos satildeo
posteriormente metabolizados em inativos e estes satildeo excretados na urina 54
Inibidores da CYP2B6 como por exemplo a ticlodipina um agente
antiplaquetaacuterio derivado da tienopiridina interagem com a bupropiona diminuindo a sua
hidroxilaccedilatildeo 57 58
Apoacutes a administraccedilatildeo crocircnica de doses de 150 a 300 mgdia a bupropiona e seus
metaboacutelitos assumem cineacutetica linear A bupropiona possui meia vida de 20 horas
aproximadamente e apresenta clearence meacutedio aparente correspondente a cerca de
200Lh A eliminaccedilatildeo da bupropiona ocorre principalmente atraveacutes da urina (87) e das
fezes (10) e eacute excretada em apenas 05 de forma inalterada nos mostrando um
extenso metabolismo 54
11
Figura 7 - Metabolismo da bupropiona em seus principais metaboacutelitos ativos A bupropiona eacute
extensamente metabolizada em hidroxibupropiona pela isoenzima CYP2B6 Os demais metaboacutelitos ativos
aatildeo metabolizados por outras enzimas Fonte adaptado de Hesse et al 2000 55
13 Pesquisa de biomarcadores
A variabilidade interindividual em resposta a faacutermacos antitabagismo sugere que
os tratamentos podem ser mais efetivos em subgrupos de fumantes 59-64 No contexto de
medicina personalizada diversos pesquisadores tecircm buscado a identificaccedilatildeo de
preditores de resposta aos tratamentos de cessaccedilatildeo tabaacutegica os quais geralmente estatildeo
envolvidos em aspectos farmacocineacuteticos e farmacodinacircmicos ou via de atuaccedilatildeo do
faacutermaco como por exemplo os fatores geneacuteticos o perfil de expressatildeo gecircnica de
proteiacutenas e de metaboacutelitos 65-68
Aleacutem de refletir a efetividade do tratamento estes biomarcadores tambeacutem
poderiam indicar a toxicidade ou a ocorrecircncia de efeitos adversos A combinaccedilatildeo
desses fatores com outras variaacuteveis individuais pode ser utilizada para adequar as
estrateacutegias preventivas e terapecircuticas 65-68
12
131 Estudos farmacogeneacuteticos e de expressatildeo gecircnica para vareniclina e
bupropiona
Diversos polimorfismos geneacuteticos tecircm sido associados com resposta agrave
vareniclina e agrave bupropiona 41 65 67-71
King et al 65 mostraram a associaccedilatildeo de polimorfismos de nucleotiacutedeos uacutenicos
(SNPs - single nucletide polimorfisms) nos genes CHRNA4 CHRNA5 CHRNA7
CHRNB2 (codificadores das subunidades α4 α5 α7 e β2 dos nAChRs
respectivamente) com abstinecircncia contiacutenua em resposta agrave vareniclina O mesmo
trabalho tambeacutem encontrou associaccedilatildeo dos polimorfismos nos genes CHRNA3
CHRNA5 CHRNB4 CHRNG (codificam as subunidades α3 α5 β4 e γ dos nAChR
respectivamente) Aleacutem disso os autores demonstraram a associaccedilatildeo de polimorfismos
nos genes HTR3A e HTR3B (codificadores dos receptores serotonineacutergicos) com a
frequecircncia de recaiacuteda no tratamento antitabagismo
Swan et al 41 verificaram a associaccedilatildeo de polimorfismos no gene CHRNB2 com
naacuteusea severa em pacientes tratados com vareniclina
Nosso grupo de pesquisadores encontrou a associaccedilatildeo do polimorfismo
rs10443196 no gene CHRNA4 e do polimorfismo 785AgtG no gene CYP2B6
(codificador da principal isoenzima metabolizadora da bupropiona) com uma maior taxa
de sucesso no tratamento com vareniclina e bupropiona respectivamente 67 68
O gene CYP2B6 eacute um dos alvos mais importantes de estudos farmacogeneacuteticos
no tratamento com bupropiona Diversos polimorfismos neste gene satildeo preditores de
metabolizaccedilatildeo lenta ou raacutepida os quais foram associados com as diferenccedilas de
concentraccedilotildees do faacutermaco e de seu principal metaboacutelito ativo hidroxibupropiona em
amostras bioloacutegicas Essas concentraccedilotildees tambeacutem se associaram agrave variabilidade na
resposta ao tratamento com bupropiona 72-74
13
Polimorfismos podem implicar em diversos mecanismos moleculares como por
exemplo alteraccedilatildeo constituiccedilatildeo ou conformaccedilatildeo de proteiacutenas mudanccedilas poacutes-
traducionais e a regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica gerando variabilidade interindividual
nos niacuteveis de RNA transcrito o que poderiam explicar as diferenccedilas de resposta aos
faacutermacos antitabagismo 72
O polimorfismo CHRNA4 (rs2236196) assim como diversos polimorfismos
presentes no gene CYP2B6 os quais foram associados agrave resposta ao tratamento com
vareniclina e bupropiona respectivamente foram tambeacutem associados a maiores e
menores niacuteveis de expressatildeo gecircnica 72-75 Tambeacutem vale salientar que assim como a
expressatildeo gecircnica pode afetar a resposta ao tratamento a expressatildeo gecircnica tambeacutem pode
ser alterada em resposta aos faacutermacos 76 Neste sentido Smith et al 76 mostraram que a
vareniclina pode afetar a expressatildeo gecircnica da enzima DNA metiltransferase-1 (DNMT)
que mostrou estar envolvida em mecanismos epigeneacuteticos em neurocircnios corticais
GABaeacutergicos os quais estatildeo relacionados a processos cognitivos em indiviacuteduos
esquizofrecircnicos fumantes
O tratamento crocircnico com vareniclina modificou a expressatildeo dos nAChRs em
ceacuterebros de camundongos O upregulation dos nAChRs (α4β2) pelo uso crocircnico da
vareniclina foi similar ao promovido ao uso crocircnico da nicotina Similar dowregulation
foi visto para os nAChRs (α6β2) A vareniclina aumentou significantemente ambos
nAChRs (α3β4) e α7 enquanto a nicotina teve menor efeito nestes siacutetios 77
Em estudos com pacientes voluntaacuterios a obtenccedilatildeo de amostras do sistema
nervoso central eacute inviaacutevel Como alternativa a esse problema estudos tecircm proposto a
anaacutelise de expressatildeo gecircnica em sangue perifeacuterico 78-80 Embora natildeo seja o tecido alvo da
farmacodinacircmica dos medicamentos antitabagismo o sangue possui muitas
similaridades a niacutevel transcricional com muacuteltiplas regiotildees cerebrais 81
14
Hennings et al 82 mostraram diferenccedilas no perfil de expressatildeo gecircnica em ceacutelulas
mononucleares de sangue perifeacuterico (PBMCs) de pacientes respondedores e natildeo
respondedores a tratamentos com antidepressivos e muitos dos genes diferentemente
expressos satildeo codificadores de receptores tambeacutem presentes no SNC
Ota et al 83 mostraram que os genes GABRR2 (codificador de receptor
GABAeacutergico) e CHRNA3 (codificador da subunidade α3 de nAChR) foram
diferentemente expressos em sangue perifeacuterico em resposta ao tratamento com
risperidona em pacientes com esquizofrenia
Em outro estudo Kordi-Tamandani et al 84 mostraram que os niacuteveis de
expressatildeo gecircnica de SLC6A3 em leucoacutecitos diferiram entre indiviacuteduos dependentes de
opioacuteides e voluntaacuterios saacutedios Este gene eacute codificador de uma importante proteiacutena
recaptadora de dopamina em neurocircnios chamada DAT
Wongsriraksa et al 85 mostraram a expressatildeo das subunidades α4 α5 α7 β1 e
β2 em um estudo de caracterizaccedilatildeo de nAChRs em amostras de PBMC de humanos
atraveacutes de nicotina radioligante sugerindo conter as subunidades α4β2 α4β2α5 eou α7
Por fim diversos estudos tecircm mostrado que os nAChRs satildeo importantes para processos
imunoloacutegicos 86-91
Estudos tecircm evidenciado a expressatildeo de receptores dopamineacutergicos em
leucoacutecitos humanos Embora a dopamina natildeo ultrapasse a barreira hematoencefaacutelica as
diferenccedilas nos niacuteveis de dopamina do sistema nervoso central poderiam alterar a
expressatildeo desses receptores em leucoacutecitos ainda durante a sua formaccedilatildeo via inervaccedilatildeo
da coluna espinal doenccedilas como Parkinson Alzheimer e adiccedilatildeo agraves substacircncias
psicoativas poderiam influenciar na expressatildeo desses receptores em sangue perifeacuterico 92
15
132 Mensuraccedilatildeo de nicotina bupropiona vareniclina e seus metaboacutelitos em
amostras bioloacutegicas
A nicotina possui um baixo tempo de meia-vida e a isoenzima CYP2A6 eacute
predominante responsaacutevel pelo metabolismo da nicotina em cotinina e trans-3-
hidroxicotinina (seus principais metaboacutelitos) 93 94 Estes e a nicotina satildeo marcadores de
exposiccedilatildeo ao tabaco e indicativo de fumo 95
A taxa de metabolizaccedilatildeo da nicotina (NMR) obtida pela relaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de trans-3-hidroxicotininacotinina tem sido associada com DN com
desfecho e com escolha farmacoloacutegica de tratamento antitabagismo 95 96 Os valores
contiacutenuos e categoacutericos de NMR (metabolizadores lentos vs normais e raacutepidos) se
mostraram estaacuteveis em fumantes independente da carga tabaacutegica 32 97 98
A bupropiona eacute um faacutermaco extensamente metabolizado e a principal isoenzima
envolvida em seu metabolismo eacute a CYP2B6 a qual medeia quase que exclusivamente o
processo de hidroxilaccedilatildeo desse faacutermaco formando o metaboacutelito hidroxibupropiona 55
Diversos estudos tecircm associado as concentraccedilotildees de bupropiona e de hidroxibupropiona
em amostras de soro plasma e urina com a resposta ao faacutermaco 73 74
Zhu et al 73 em um estudo cliacutenico duplo-cego e placebo controlado os
indiviacuteduos foram tratados com bupropiona ou placebo por 6 meses Na terceira semana
de tratamento foram colhidas amostras de plasma para mensuraccedilatildeo de bupropiona e seu
principal metaboacutelito ativo a hidroxibupropiona As concentraccedilotildees mais elevadas de
hidroxibupropiona resultaram em melhores resultados de cessaccedilatildeo do tabagismo
Laib et al 74 apresentaram que as concentraccedilotildees de hidroxibupropiona em soro
foram correlacionadas com as diferentes respostas agrave bupropiona em pacientes com
depressatildeo analisadas atraveacutes de uma escala de impressatildeo clinica global
16
Quanto agrave vareniclina este eacute um faacutermaco pouco metabolizado sendo que 5 a
10 da dose pode ser encontrada na forma metaboacutelitos (soro plasma e urina) 49 Os
metaboacutelitos de vareniclina jaacute identificados em humanos em estudos preacutevios satildeo
hidroxivareniclina vareniclina N-carbomoilglucoroniacutedeo oxovareniclina N-
glicosilvareniclina e N-formilvareniclina 47 49 99 Pouco se conhece sobre as enzimas
que metabolizam a vareniclina Obach et al 49 mostrou o envolvimento da enzima
UG2B7 com o processo de glucoronidaccedilatildeo do faacutermaco Ainda natildeo haacute estudos que
associam os metaboacutelitos de vareniclina com resultados de desfecho de tratamento
17
2 JUSTIFICATIVA
Considerando a elevada prevalecircncia do tabagismo e a dificuldade dos indiviacuteduos
fumantes em se abster do tabaco estudos que apontem uma terapecircutica farmacoloacutegica
mais efetiva podem contribuir enormemente para o processo de cessaccedilatildeo tabaacutegica
Neste cenaacuterio a anaacutelise da expressatildeo de genes de interesse e a mensuraccedilatildeo de analitos
podem ser ferramentas uacuteteis na identificaccedilatildeo de marcadores e de subgrupos de resposta
ao tratamento antitabagismo
Escolhemos a realizaccedilatildeo da mensuraccedilatildeo de analitos nas amostras de soro dos
pacientes tratados com ambos os faacutermacos antitabagismo (vareniclina e bupropiona) e
especialmente para os pacientes tratados com vareniclina foram realizadas anaacutelises de
expressatildeo gecircnica de ceacutelulas mononucleares provenientes de amostras de sangue
perifeacuterico (do inglecircs Peripheral Blood Mononuclear Cell - PBMC) O ensaio
customizado para as anaacutelises da expressatildeo de 17 genes foi um grande investimento
financeiro nesta pesquisa e portanto o priorizamos para analisar as amostras dos
pacientes tratados com vareniclina jaacute que eacute o faacutermaco mais novo eficaz e custoso no
tratamento antitabagismo
As anaacutelises de expressatildeo gecircnica em amostras de PBMC satildeo de grande valia pois
seria importante encontrar em amostras de tatildeo faacutecil obtenccedilatildeo como amostras de sangue
um marcador de resposta que poderia ter correlaccedilatildeo com a expressatildeo gecircnica do sistema
nervoso central
Identificar um possiacutevel marcador preditivo de sucesso na utilizaccedilatildeo de um
determinado faacutermaco no iniacutecio da sua administraccedilatildeo foi uma das investigaccedilotildees deste
protocolo Os resultados desse estudo exploratoacuterio podem ser uacuteteis no entendimento do
comportamento de expressatildeo dos genes escolhidos (mais comumente expressos no
18
SNC) em amostras de sangue e na elaboraccedilatildeo de pesquisas mais amplas para a
identificaccedilatildeo de biomarcadores de resposta ao tratamento antitabagismo
19
3 OBJETIVOS
31 Analisar a possiacutevel associaccedilatildeo da expressatildeo de genes de interesse em amostras de
sangue perifeacuterico com a resposta ao tratamento com vareniclina
32 Analisar a possiacutevel associaccedilatildeo das concentraccedilotildees de faacutermacos antibagismo nicotina
e seus metaboacutelitos com a resposta ao tratamento com vareniclina e bupropiona
20
4 METODOLOGIA
41 Casuiacutestica
Foi realizado um estudo de coorte prospectivo no qual foram incluiacutedos 105
pacientes homens e mulheres fumantes provenientes do Programa de Assistecircncia ao
Fumante (PAF) do Instituto do Coraccedilatildeo do Hospital das Cliacutenicas da Faculdade de
Medicina da Universidade de Satildeo Paulo (InCor) com idade ge 18 anos IMC ge 185 e lt
30 kgm2 e que iniciariam o tratamento com vareniclina (n=74 para a mensuraccedilatildeo dos
analitos destes n=27 para as anaacutelises de expressatildeo gecircnica) ou com bupropiona (n=31
para a mensuraccedilatildeo dos analitos) (Figura 8)
A inclusatildeo dos pacientes ocorreu atraveacutes do protocolo de pesquisa ldquoEficaacutecia do
uso de marcadores geneacuteticos na escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismordquo o
qual foi aprovado no processo de submissatildeo ao Comitecirc de Eacutetica Institucional (CAAE
60133816000000068) - SDC 434116007 (Anexo 4) O presente estudo foi aprovado
como subprojeto do anterior atraveacutes do parecer nordm 2118913 (Anexo 1) Os pacientes
foram informados do estudo e consentiram a sua participaccedilatildeo ao assinar o termo de
consentimento livre e esclarecido (Apecircndice)
Foram excluiacutedos do estudo os pacientes que possuiacutessem desordens hepaacutetica
renal e gastrointestinal que comprometessem o metabolismo e eliminaccedilatildeo dos faacutermacos
os pacientes que faziam uso de medicamentos indutores ou inibidores das enzimas do
citocromo P450 nas uacuteltimas 6 semanas os pacientes etilistas e usuaacuterios de droga os
pacientes com doenccedilas psiquiaacutetricas instaacuteveis as mulheres em risco de gravidez e os
pacientes com contra-indicaccedilatildeo ao tratamento com bupropiona ou vareniclina
mencionados acima
21
Os pacientes foram acompanhados pela equipe do PAF e o tratamento
farmacoloacutegico foi conduzido por 12 semanas Foram considerados os seguintes
desfechos no tratamento ldquosucessordquo se o paciente parasse de fumar ateacute a 4ordf semana de
tratamento (T4) e ldquoresistenterdquo se o paciente natildeo conseguisse parar de fumar ateacute a 4ordf
semana de tratamento
22
Bupropiona
n=31
Visita T-1 Visita T0
(iniacutecio da medicaccedilatildeo)
Visita T2 Visita T4
Desfecho
Vareniclina
n=74
RNA Basal Vareniclina
n= 27
RNA RNA
Mensuraccedilatildeo de analitos vs Desfecho (T2)
vareniclina nicotina cotinina e hidroxicotinina
Mensuraccedilatildeo de analitos vs Desfecho (T2)
bupropiona hidroxibupropiona nicotina cotinina e hidroxicotinina
Soro
Soro
Figura 8 - Desenho do estudo O nuacutemero amostral total do estudo foi de 105 pacientes Foram incluiacutedos 74 pacientes tratados com vareniclina e 31 pacientes tratados com bupropiona Esses foram
submetidos agrave coleta de amostras de sangue no periacuteodo de 2 semanas (T2) apoacutes o iniacutecio da terapecircutica Apoacutes foi realizada a mensuraccedilatildeo de analitos e a anaacutelise de associaccedilatildeo com os desfechos de
tratamento Aleacutem disso os pacientes tratados com vareniclina tambeacutem foram submetidos agrave coleta de amostras para a obtenccedilatildeo de RNA em trecircs distintos periacuteodos de tempo antes de iniciar a
terapecircutica (T0) 2 semanas (T2) e 4 semanas apoacutes iniciar a terapecircutica farmacocoloacutegica (T4) Amostras de 14 pacientes que obtiveram sucesso no tratamento e de 13 que obtiveram resistecircncia (n=27)
foram analisadas quanto agrave expressatildeo de 17 genes candidatos (52 amostras ao todo 9 resistentes do tempo T0 7 resistentes do T2 8 resistente do T4 9 sucessos do T0 8 sucessos do T2 e 11 sucessos
do T4 vide toacutepico 42 Nuacutemero amostral) Apoacutes foram realizadas as anaacutelises de associaccedilatildeo entre os niacuteveis dos transcritos e os desfechos e tempos de tratamento Os pacientes foram acompanhados por
12 semanas durante o tratamento farmacoloacutegico no entanto o desfecho foi definido na 4 ordf semana (T4) pois apoacutes esse periacuteodo o tratamento seria reavaliado e poderia haver mudanccedila na medicaccedilatildeo T-
1= visita inicial T0= antes do iniacutecio da terapecircutica T2= 2 semanas apoacutes o iacutenicio do tratamento T4= 4 semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento T12= 12 semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento Desfecho na
visita T4 = ldquosucessordquo se o paciente parasse de fumar ateacute a 4ordf semana de tratamento (T4) e ldquoresistenterdquo se o paciente natildeo conseguisse parar de fumar ateacute a 4ordf semana de tratamento Fonte do autor
Visita T12
Final do tratamento farmacoloacutegico
RNA vs Desfecho (T0 T2 e T4)
14 sucessos e 13 resistentes
CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2
CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3 DRD4
HTR3A HTR3B COMT e SLC6A3
23
42 Fluxo de procedimentos adotados no atendimento aos pacientes
O tratamento farmacoloacutegico antitabagismo possui a duraccedilatildeo de 3 meses (12
semanas) No estudo de ldquoEficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticosrdquo foram coletados
dados cliacutenicos em 7 visitas T-1 (visita inicial) T0 (visita de iniacutecio do tratamento) T2
T4 T6 T8 e T12 (2 4 6 8 e 12 semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico)
Neste projeto foram utilizados os tempos de visita dos pacientes nas consultas
para a realizaccedilatildeo da coleta de amostras Dessa forma foi facilitado o comparecimento
desses pacientes ao procedimento Os pacientes precisavam estar comprometidos em
administrar os medicamentos todos os dias no horaacuterio combinado e terem
disponibilidade de tempo para as coletas as quais natildeo necessariamente coincidiram
com o horaacuterio das consultas pois as coletas foram realizadas no mesmo horaacuterio de
tomada do medicamento para que as anaacutelises de todos os pacientes pudessem ser
comparaacuteveis
Na visita T-1 foi aplicado o TCLE do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores
geneacuteticosrdquo bem como o questionaacuterio para coletar informaccedilotildees cliacutenicas Aleacutem disso os
pacientes foram avaliados quanto agrave DN atraveacutes do teste de Fagerstroumlm para DN (FTND)
100 e do escore de consumo situacional Issa (escore Issa) 101 (Anexos 2 e 3
respectivamente) O escore Issa eacute utilizado pelo PAF para a reclassificaccedilatildeo como
moderados ou altamente dependentes os pacientes que obteacutem o escore de FTND abaixo
de 5 mas que no entanto possuem niacutevel de DN consideraacutevel em relaccedilatildeo aos efeitos
psicoativos da nicotina A reclassificaccedilatildeo ocorre quando os pacientes obtecircm escore Issa
ge3 Apoacutes os pacientes foram randomizados em dois braccedilos do estudo tratamento com
vareniclina ou tratamento baseado na farmacogeneacutetica Os pacientes realizaram coleta
de sangue com o objetivo de obtenccedilatildeo do DNA para o estudo ldquoEficaacutecia do uso de
marcadores geneacuteticosrdquo
24
Apoacutes a genotipagem das amostras e escolha da medicaccedilatildeo dos pacientes
(vareniclina ou conforme geneacutetica) foi realizada ligaccedilatildeo telefocircnica para o paciente
informando o medicamento que iria tomar Nesta mesma ligaccedilatildeo o paciente tambeacutem foi
convidado a participar do presente estudo e todas as informaccedilotildees quanto agrave necessidade
de tomar o medicamento antitabagismo sempre no mesmo horaacuterio quanto aos dias das
coletas bem como as informaccedilotildees de preparaccedilatildeo para os procedimentos foram
transmitidas aos pacientes
Para os pacientes que seriam tratados com vareniclina ainda foi importante levar
em consideraccedilatildeo o horaacuterio que o paciente costumava tomar cafeacute da manhatilde para entatildeo
decidir o horaacuterio de administraccedilatildeo do faacutermaco pois o mesmo precisava ser
administrado apoacutes refeiccedilatildeo generosa com o intuito de diminuir o risco de naacuteusea
As coletas foram padronizadas para serem realizadas agraves manhatildes no mesmo
horaacuterio que o paciente tomaria a primeira dose do dia do medicamento antitabaacutegico O
horaacuterio de coleta entre os pacientes foi fixado entre 7 e 10 horas da manhatilde para evitar
variaccedilatildeo circadiana interpacientes No entanto entre as coletas do mesmo paciente o
horaacuterio de coleta e de administraccedilatildeo do medicamento foi sempre o mesmo com
variaccedilatildeo natildeo superior agrave 1 hora (esta variaccedilatildeo foi registrada)
Os pacientes foram orientados a realizar jejum de 10 horas (sendo liberada a
ingestatildeo de aacutegua e outros medicamentos ateacute 1 hora antes da coleta) e trazer o
medicamento antitabaacutegico para tomar apoacutes o procedimento A dose diurna dos
medicamentos antitabagismo natildeo foi administrada antes da coleta para evitar efeitos
agudos nas anaacutelises O periacuteodo de jejum foi realizado para que a amostra tivesse menor
quantidade de interferentes possiacutevel e tambeacutem para natildeo promover efeitos agudos dos
alimentos na expressatildeo gecircnica Um dia antes de cada coleta foi realizada ligaccedilatildeo
telefocircnica ou envio de mensagem para os pacientes com o objetivo de lembraacute-los do
25
procedimento das orientaccedilotildees de preparo e confirmar o uso e o cumprimento do horaacuterio
de administraccedilatildeo do medicamento antitabagismo (essa confirmaccedilatildeo da adesatildeo foi
realizada para as coletas nas visitas T2 e T4 quando os pacientes jaacute haviam iniciado o
tratamento farmacoloacutegico)
Na visita T0 para os pacientes que iniciariam o tratamento com vareniclina foi
aplicado o TCLE do presente projeto e colheu-se uma amostra de sangue para a
obtenccedilatildeo do RNA ainda antes de iniciarem o tratamento Foram fornecidas aos
pacientes as orientaccedilotildees de como tomar o medicamento e informaccedilotildees para a proacutexima
coleta Os pacientes foram orientados agrave tomarem o medicamento neste mesmo dia ou no
dia seguinte
Na visita T2 foram coletadas amostras de soro dos pacientes tratados com
bupropiona e amostras de soro e RNA dos pacientes tratados com vareniclina
Na visita T4 foram coletadas amostras de RNA dos pacientes tratados com
vareniclina
No Quadro 1 abaixo estatildeo resumidos os procedimentos orientaccedilotildees e coletas de
amostras
Quadro 1 - Procedimentos do protocolo em relaccedilatildeo aos pacientes
T-1 Aplicaccedilatildeo do TCLE do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores
geneacuteticosrdquo
Aplicaccedilatildeo de questionaacuterios
Coleta de DNA
1 dia antes de T0 Ligaccedilatildeo para informar o medicamento que o paciente iria tomar
Convite para participar do presente estudo
Determinar com o paciente qual era o melhor horaacuterio para
26
administraccedilatildeo do medicamento antibagismo (neste mesmo horaacuterio
que foram realizadas todas as coletas)
Orientaccedilotildees para a coleta em T0
T0 Aplicaccedilatildeo do TCLE do presente estudo
Coleta de amostra de RNA (para os pacientes que seriam tratados
com vareniclina)
Orientaccedilotildees para iniciar o tratamento no mesmo dia ou dia
seguinte
1 dia antes de T2 Orientaccedilotildees para coleta em T2
Confirmaccedilatildeo se o paciente estava tomando o medicamento e no
horaacuterio combinado
T2 Aplicaccedilatildeo do TCLE do presente estudo para os pacientes tratados
com bupropiona
Coleta de soro para os pacientes tratados com bupropiona e coleta
de RNA e soro dos pacientes tratados com vareniclina
1 dia antes de T4 Orientaccedilotildees para coleta em T2
Confirmaccedilatildeo se o paciente estava tomando o medicamento e no
horaacuterio combinado
T4 Coleta de RNA dos pacientes tratados com vareniclina
43 Coleta e armazenamento das amostras dos pacientes tratados com vareniclina e
bupropiona
Os pacientes tratados com vareniclina foram submetidos agrave coleta de sangue para
a obtenccedilatildeo de RNA em 3 periacuteodos de tempo T0 (ainda antes de iniciar o tratamento T2
27
e T4 Para isto foram utilizados os tubos PAXgene Blood RNA Tubes BRT (Qiagen
USA) para a obtenccedilatildeo de RNA Apoacutes a coleta os tubos PAXgene foram encubados em
bancada por 2 horas agrave temperatura ambiente para garantir a lise completa das ceacutelulas
sanguiacuteneas e apoacutes os tubos foram armazenados a -20degC ateacute a extraccedilatildeo do RNA das
amostras
No periacuteodo T2 tambeacutem foram coletadas amostras para a obtenccedilatildeo do soro dos
pacientes tratados com vareniclina e bupropiona Neste periacuteodo as concentraccedilotildees dos
metaboacutelitos dos faacutermacos jaacute se encontravam em estado de equiliacutebrio Para isto foram
utilizados tubos sem aditivo (Vacuette Greiner Bio-one) Os tubos foram mantidos a
temperatura ambiente ateacute a formaccedilatildeo de coaacutegulo Apoacutes os tubos foram centrifugados a
4degC a 3000 rpm por 10 min para se obter amostras de soro As amostras foram entatildeo
aliquotadas em 4 criotubos de soro e armazenadas em freezer a -80ordmC ateacute o momento
das anaacutelises
44 Nuacutemero amostral
Quanto ao nuacutemero amostral para o ensaio de expressatildeo gecircnica dos 74 pacientes
tratados com vareniclina foram escolhidas amostras de 27 pacientes (14 do grupo
sucesso e 13 do grupo resistente) baseado em estudos anteriores 83 102 que seguiram
corretamente o jejum que realizaram a tomada do medicamento nos horaacuterios
combinados e compareceram em todos e tempos de coleta Sendo ao todo 81 amostras
devido aos de 3 tempos de tratamento (T0 T2 e T4)
No entanto algumas amostras natildeo apresentaram bons resultados para a anaacutelise
de expressatildeo gecircnica e realizamos o ensaio de expressatildeo para 60 amostras de diversos
tempos Oito amostras natildeo apresentaram resultados de amplificaccedilatildeo e finalizamos com
52 amostras ao todo (9 resistentes do tempo T0 7 resistentes do T2 8 resistentes do T4
28
9 sucessos do T0 8 sucessos do T2 e 11 sucessos do T4) provenientes de 14 pacientes
do grupo sucesso e 13 do grupo resistente Esse tamanho amostral para cada grupo de
anaacutelise eacute comparaacutevel agrave estudos anteriores 102
Quanto ao nuacutemero amostral para a mensuraccedilatildeo dos analitos houve a inclusatildeo de
74 pacientes tratados com vareniclina e 31 tratados com bupropiona Nuacutemero amostral
semelhante foi utilizado no estudo de Laib et al 74 Das 105 amostras 3 amostras dos
pacientes tratados com vareniclina e 1 de paciente tratado com bupropiona apresentaram
concentraccedilotildees abaixo do limite de quantificaccedilatildeo (LQ) e estas foram excluiacutedas das
anaacutelises de concentraccedilatildeo dos analitos ficando com nuacutemero amostral final de 71 para
vareniclina e 30 para bupropiona
45 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica para amostras de pacientes tratados com
vareniclina
451 Concentraccedilatildeo purificaccedilatildeo e extraccedilatildeo de RNA
O processo de purificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo do RNA foi realizado atraveacutes do
PAXgene Blood RNA Kit (Qiagen USA) Antes de iniciar o procedimento a
temperatura dos tubos PAXgene Blood tubes (BRT) (Qiagen USA) os quais estavam
armazenados em freezer -20degC foi estabilizada mantendo os tubos em temperatura
ambiente em torno de 4 horas ou over night
Para o processo de purificaccedilatildeo do RNA primeiramente realizou-se a
homogeneizaccedilatildeo do sangue total contido no tubo PAXgene Blood tubes (BRT) e a
centrifugaccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos por 10 min em 3000 rcf havendo a formaccedilatildeo de um
pellet e o sobrenadante foi desprezado Apoacutes foi realizada a lavagem do pellet
adicionando-se 4 mL de aacutegua livre de RNase (RNFW) mistura foi submetida ao voacutertex
ateacute a dissoluccedilatildeo visiacutevel do pellet e o conteuacutedo foi centrifugado por 10 minutos a 3000
29
rcf sendo descartado o sobrenadante O pellet foi ressuspendido com 350 μL de tampatildeo
de ressuspensatildeo (BR1) atraveacutes de voacutertex ateacute a sua dissoluccedilatildeo e transferido para o tubo
de microcentrifugaccedilatildeo (15 mL MCT) Foram adicionados no tubo MCT 300 μL de
tampatildeo de ligaccedilatildeo (BR2) e 40 μL de proteinase K (PK) a mistura foi submetida ao
voacutertex durante 5 segundos e incubada durante 10 minutos a 55degC com agitaccedilatildeo de 1400
rpm provocando dessa forma a digestatildeo de proteiacutenas
Apoacutes o processo de incubaccedilatildeo foram realizados diversos processos de remoccedilatildeo
de impurezas em colunas de rotaccedilatildeo O lisado foi transferido para a coluna de rotaccedilatildeo
do homogeneizador PAXgene (PSC lilaacutes) a qual foi colocada em um tubo de
processamento (PT) de 2 mL e centrifugado durante 3 minutos agrave velocidade de 16100
rcf dessa forma foi realizada a homogeneizaccedilatildeo do lisado de ceacutelulas e remoccedilatildeo dos
detritos celulares residuais Em seguida o sobrenadante da fraccedilatildeo residual foi
transferido para o tubo de microcentrifugaccedilatildeo (15 mL MCT) novo (sem interferir no
pellet) e foram adicionados 350 μL de etanol (96-100 grau de pureza PA) a mistura
foi submetida ao voacutertex e centrifugada por breves instantes (1-2 segundos 500-1000 x g)
para remover as gotas presentes no interior da tampa do tubo
Foram transferidos 700 μL de amostra para a coluna de rotaccedilatildeo de RNA
PAXgene (PRC vermelho) esta foi colocada e um tubo de processamento (PT) de 2
mL no qual foi centrifugado durante 1 minuto a 12000 rcf Apoacutes a coluna de rotaccedilatildeo
foi colocada em um tubo PT novo (o tubo PT utilizado anteriormente foi descartado) O
restante da amostra foi colocado na mesma coluna de rotaccedilatildeo PRC e o processo de
centrifugaccedilatildeo foi repetido por mais 2 vezes sempre transferindo a coluna para um tubo
de processamento novo Antes da uacuteltima centrifugaccedilatildeo foram adicionados 350 μL de
tampatildeo de lavagem 1 (BR3) na coluna PRC
30
Em seguida foram adicionados 10 μL de soluccedilatildeo-matildee de DNase I (RNFD) a 70
μL de tampatildeo de digestatildeo de DNA (RDD) em um tubo de microcentrifugaccedilatildeo de 15
mL (MCT) O conteuacutedo foi misturado suavemente e centrifugado durante breves
instantes para colher o liacutequido residual dos lados do tubo Apoacutes 80 μL dessa mistura
foram transferidos diretamente para a membrana da coluna PRC e esta foi incubada agrave
temperatura ambiente (20-30degC) durante 15 minutos
Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foram adicionados 350 μL de tampatildeo de lavagem
1 (BR3) para a membrana da coluna e esta foi centrifugada durante 1 min a 12000 rcf
Apoacutes a coluna PRC foi colocada em um tubo (PT) novo e foram adicionados 500 μL de
tampatildeo de lavagem 2 (BR4) na membrana da coluna A centrifugaccedilatildeo foi repetida o
tubo PT foi descartado e a coluna PRC foi colocada em um novo tubo PT A lavagem
com 500 uL de BR4 e a centrifugaccedilatildeo foi repetida novamente (poreacutem o tempo de
centrifugaccedilatildeo foi de 3 minutos) Apoacutes foi realizada uma centrifugaccedilatildeo adicional em um
tubo PT novo durante 1 minuto a 12000 rcf (sem adiccedilatildeo de tampatildeo)
A coluna de rotaccedilatildeo (PRC) foi colocada em tubo de 15 mL (MCT) Foram
adicionados diretamente na membrana da coluna 80 μL de tampatildeo de eluiccedilatildeo (BR5) a
qual foi encubada agrave temperatura ambiente por 5 minutos e centrifugada por 1 minuto a
12000 rcf para eluir o RNA
As amostras foram quantificadas atraveacutes de leitura em espectrofotocircmetro no
comprimento de onda 260 nm (utilizando como branco o tampatildeo BR5) e foram
armazenadas a -20ordmC ateacute o momento das anaacutelises Para avaliar a qualidade do RNA
gerado foi realizada uma eletroforese em gel de agarose para a verificaccedilatildeo da
integridade do RNA ribossomal
31
452 Siacutentese de cDNA
O processo de siacutentese de cDNA foi realizado atraveacutes do RT2 First Strand Kit
(Qiagen USA) Os reagentes do kit foram descongelados e centrifugados brevemente
(10-15 segundos)
Primeiramente foi preparada uma mix para a degradaccedilatildeo do DNA genocircmico
composta por 2microL de tampatildeo GE 800 ng de RNA e quantidade variaacutevel de aacutegua livre
de RNase ateacute o volume final de 10 μL ou 8 μL de RNA (para amostras com
concentraccedilotildees abaixo de 100 ngμL) sem a aacutegua livre de RNase A mistura foi incubada
a 42ordmC por 5 minutos Apoacutes a incubaccedilatildeo a mistura foi colocada imediatamente em gelo
durante pelo menos 1 min
Apoacutes foi preparada uma mix para a realizaccedilatildeo da transcriccedilatildeo reversa esta foi
composta por 4 microL tampatildeo 5x (BC3) 1 microL de controle P2 (controle externo de RNA) 2
microL de mix de transcriptase reversa (RE3) e 3 microL de aacutegua livre de Rnase Foram
adicionados 10 μL da mix preparada em cada tubo contendo a mix de eliminaccedilatildeo de
DNA genocircmico A mistura foi homogeneizada delicadamente com a pipeta e incubada a
42 degC durante exatamente 15 min em seguida a reaccedilatildeo foi interrompida por incubaccedilatildeo
a 95 degC durante 5 min Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foram adicionados a cada reaccedilatildeo
91 μL de aacutegua livre de RNase e a mistura foi homogeneizada atraveacutes de pipeta diversas
vezes O produto final foi armazenado a -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo em cadeia da
polimerase (PCR) em tempo real
453 Ensaio de controle de qualidade das amostras para o ensaio de expressatildeo
gecircnica
Todas as amostras de cDNA foram analisadas quanto sua qualidade pelo ensaio
de controle de qualidade (disco QC Qiagen) em disco de 100 poccedilos (representaccedilatildeo do
32
disco nas Figuras 9 e 10) atraveacutes do PCR em tempo real com equipamento Rotor Gene
6000 (Corbett) Cada disco QC tem a capacidade de analisar 12 amostras sendo
necessaacuterios 5 discos para analisar 60 amostras
O disco QC eacute composto por primers especiacuteficos para a amplificaccedilatildeo de 2
Housekeeping genes ndash ACTB e HPRT1 (genes constitutivos que satildeo necessaacuterios para a
manutenccedilatildeo baacutesica da funccedilatildeo celular e satildeo expressos em todas as ceacutelulas de um
organismo em condiccedilotildees normais e fisiopatoloacutegicas) e 6 controles 1 controle de
transcriccedilatildeo reversa (RTC) 1 controle positivo de PCR (PPC) 1 controle de
contaminaccedilatildeo com DNA genocircmico (GDC) 1 controle de natildeo transcriccedilatildeo reversa
(NTR) 1 PPC (sem amostra) e 1 controle negativo NTC (mapa na Figura 10)
Foram preparadas 12 mixes para cada uma das amostras de cDNA Sendo 92 μL
de aacutegua livre de RNase e 08 μL de cDNA essas quantidades foram multiplicadas por 6
para se ter sobra e distribuir em 5 poccedilos cada mix de amostra (poccedilos que continham
pares de primers para 2 housekeeping genes e 3 controles) Foram distribuiacutedos 10 μL de
mix e 10 μL de RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR Master Mix (Qiagen USA) em cada
poccedilo (linhas A a E) Essa master mix conteacutem corante fluorescente intercalante de DNA
Apoacutes foram preparadas 12 mixes uma para cada amostra matildee de RNA (diluiacutedo
1100) Foram utilizados 963 μL de aacutegua livre de RNase e 072 μL de RNA (1100)
essas quantidades foram multiplicadas por 3 para se ter sobra Foram pipetados 1037
μL de mix de RNA e 963 μL de RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR Master Mix em
cada poccedilo da linha F para a anaacutelise do controle de transcriccedilatildeo reversa NTR
Apoacutes foram preparadas mixes sem as amostras para os 2 uacuteltimos controles PPC
e NTC compostas por 10 μL de aacutegua e 10 μL de RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR
Master Mix (multiplicados por 24) para as linhas G e H
33
O disco foi submetido agrave seguinte programaccedilatildeo 1 ciclo de 10 minutos a 95degC
(temperatura de ativaccedilatildeo da Taq polimerase) e 40 ciclos de 15 segundos a 95degC e 30
segundos a 60degC (para a amplificaccedilatildeo e realizaccedilatildeo da captura dos dados de
fluorescecircncia) Atraveacutes do software real-time cycler (Qiagen USA) foi ajustada a linha
de base (Threshold) do graacutefico de amplificaccedilatildeo logariacutetimica do cDNA para dessa
forma remover ruiacutedos na anaacutelise e verificar em qual ciclo de PCR que cada amostra
amplificou (cicle threshold ndash CT) (Figura 11) Os valores de CT foram planilhados e
analisados conforme os paracircmetros de qualidade (Quadro 2)
Figura 9 - Representaccedilatildeo do Rotor-Disc 100 Refere-se a um disco de material plaacutestico contendo 100
poccedilos Este veio de faacutebrica personalizado com primers para os ensaios QC ou RT2 profiler PCR array As
amostras e mixes satildeo pipetadas em cada poccedilo O disco eacute posteriormente colocado em um anel metaacutelico
proacuteprio para o encaixe no equipamento Rotor-Gene Cada poccedilo eacute nomeado com uma letra e um nuacutemero
iniciando no A1 ateacute o H12 Os quatro uacuteltimos poccedilos natildeo satildeo nomeados e natildeo conteacutem ensaio (no entanto
preenchemos com mix para equilibrar o peso do disco) Fonte do autor
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB
B HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1
C RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC
D PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC
E GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC
F NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR
G PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC
H NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC
Figura 10 - Mapa do disco QC (representaccedilatildeo planilhada) Do A1 ao B12 housekeeping genes para 12
amostras C1 ao H12 controles Cada grupo de cor representa a colocaccedilatildeo de uma mix Do A1 ao E1 mix de
A1
C1
E1
G1
34
cDNA da amostra 1 do A2 ao E2 mix de cDNA da amostra 2 (assim por diante ateacute A12 e E12) Linha F controle
com RNA diluiacutedo (1100) Linhas G e H controles com aacutegua livre de RNase Fonte do autor
Figura 11 - Exemplo de ajuste de Threshold A linha de base (Threshold) eacute ajustada na fase linear do ciclo
de amplificaccedilatildeo Dessa forma eacute possiacutevel remover os ruiacutedos e se obter o ciclo em que cada amostra foi
amplificada na PCR (CT) Fonte do autor imagem do equipamento Rotor Genereg
Quadro 2 - Paracircmetros de qualidade do ensaio QC
Controles Teste Passa no teste Falha no teste
Controle de transcriccedilatildeo reversa CT RTC (linha B) ndash CTPPC (linha G) lt5 gt5
Controle positivo de PCR CT PPC (linha G)
CT PPC (linha D) - CT PPC (linha G)
14 plusmn 2
lt3
gt16
gt3
Controle de contaminaccedilatildeo de DNA genocircmico CT GDC (linha E) gt33 lt33
Controle de natildeo transcriccedilatildeo reversa CT NTR (linha F) ge 33 ou NA lt33
Controle negativo CT NTC (linha H) ge 33 ou NA lt33
10-02
10-04
10-06
10-08
10-10
10-12
10-14
10-16
10-18
10-20
10-22
10-24
10-26
10-28
5 10 15 20 25 30 35 40
Ciclos
Flu
ore
scecircn
cia
No
rmal
izad
a
Fase Linear
35
De 60 amostras analisadas 52 passaram no teste quanto aos criteacuterios de
qualidade e prosseguiram para a anaacutelise de expressatildeo gecircnica do painel de genes
escolhidos
454 Ensaio de expressatildeo gecircnica
O protocolo de expressatildeo foi realizado por PCR em tempo real atraveacutes do
equipamento Rotor Gene 6000 (Corbett) com ensaio customizado RTsup2 Profiler PCR
Array em disco com capacidade de 100 poccedilos (Rotor-Disc 100 Qiagen USA) Nos 100
poccedilos de cada disco estavam distribuiacutedos primers especiacuteficos para o ensaio de expressatildeo
de 17 genes (Figuras 9 e 12 e Quadro 3) (17 pares de primers para cada gene repetidos 4
vezes na placa pois foi possiacutevel a anaacutelise de 4 amostras de cDNA por disco) 4 pares de
primers para os Housekeeping genes B2M GAPDH HPRT1 e ACTB (Quadro 4) e 3
controles 1 controle de contaminaccedilatildeo com DNA genocircmico (HGDC) 1 controle de
transcriccedilatildeo reversa (RTC) e 1 controle positivo de PCR (PPC) Os 4 Housekeeping
genes e os 3 controles tambeacutem satildeo repetidos 4 vezes no disco (Figura 5) Para as
reaccedilotildees foi utilizada a RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR Master Mix (Qiagen USA)
Primeiramente foi preparada 4 mixes (uma para cada amostra de cDNA) para um
disco de 100 poccedilos composta por 275 μL de 2X RT2 SYBR Green ROX FAST
Mastermix 2262 microL de aacutegua livre de RNase e 488 microL de amostra de cDNA cada Em
cada um dos poccedilos do disco foram adicionados 20 μL da mix preparada (utilizando
mixes de diferentes amostras a cada 24 poccedilos) Apoacutes deste processo o disco foi selado
com o Rotor-Disc Heat Sealer (Qiagen USA) e colocado no equipamento Rotor-Gene
6000 (Corbett) O real-time foi programado para ciclagem de PCR nas seguintes
condiccedilotildees 1 ciclo a 95deg C com duraccedilatildeo de 10 minutos 40 ciclos a 95degC por 15
segundos e 60degC por 30 segundos
36
Quadro 3 - Genes escolhidos para o ensaio de expressatildeo
CHRNA3 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α3
CHRNA4 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α4
CHRNA5 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α5
CHRNA6 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α6
CHRNA7 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α7
CHRNB2 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade β2
CHRNB3 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade β3
CHRNB4 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade β4
CHRNG Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade γ
DRD1 Codifica o receptor de dopamina tipo 1
DRD2 Codifica o receptor de dopamina tipo 2
DRD3 Codifica o receptor de dopamina tipo 3
DRD4 Codifica o receptor de dopamina tipo 4
HTR3A Codifica o receptor 3A de serotonina
HTR3B Codifica o receptor 3B de serotonina
COMT Codifica a enzima catecol-O-metiltransferase (metaboliza dopamina)
SLC6A3 Codifica a proteiacutena DAT que promove a recaptaccedilatildeo de dopamina DAT
Quadro 4 - Housekeeping genes
B2M Codifica a microbulina subunidade β2
GAPDH Codifica a enzima gliceraldeiacutedo ndash 3 fosfato desidrogenase
HPRT1 Codifica a enzima hipoxantina fosforribosiltransferase 1
ACTB Codifica a β actina
37
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
B DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
C CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
D DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
E CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
F DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
G CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
H DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
Figura 12 - Mapa do disco do ensaio RT2 profiler PCR array (representaccedilatildeo planilhada) O disco conteacutem 100 poccedilos no
entanto apenas 96 poccedilos contecircm ensaios sendo que 4 poccedilos ficam vazios A1 ao B5 = genes escolhidos para anaacutelise de
expressatildeo Do B6 ao B9= Housekeeping genes Do B10 ao B12= controles C1 ao D12 E1 ao F12 e G1 ao H12= repeticcedilatildeo dos
ensaios permitindo a anaacutelise completa de 4 amostra Cada cor diferente (a cada 2 linhas) representam a anaacutelise de uma
amostra Fonte do autor
455 Anaacutelise dos dados de expressatildeo gecircnica
Para a anaacutelise de expressatildeo gecircnica foi utilizado o meacutetodo de 2-∆∆CT 103 Apoacutes o
teacutermino da corrida do ensaio de expressatildeo gecircnica atraveacutes do software real-time cycler
(Qiagen USA) foi ajustada a linha de base (threshold) no graacutefico de amplificaccedilatildeo em
escala logariacutetmica (Figura 11) Todos os discos (total de 13) foram analisados com o
mesmo valor de threshold (010869) para que os valores de CT de todas as amostras
fossem comparaacuteveis
Os dados de CT tambeacutem foram inseridos no programa SPSS para as anaacutelises
estatiacutesticas Os valores de CT foram normalizados atraveacutes da expressatildeo dos
housekeeping genes utilizando a seguinte foacutermula ∆CT= (CTamostra ndash a meacutedia de
CThousekeeping genes) Os valores de mediana de 2-∆CT (em escala logariacutetmica) de cada grupo
foram utilizados para os testes de hipoacutetese Apoacutes foram obtidos os valores de ∆∆CT
(mediana de ∆CTgrupo teste ndash mediana de ∆CT grupo referecircncia) e o fold change (aumento ou
diminuiccedilatildeo da expressatildeo dos genes em relaccedilatildeo ao grupo referecircncia) foi calculado
atraveacutes da foacutermula 2-∆∆CT
38
46 Mensuraccedilatildeo de bupropiona vareniclina e de seus metaboacutelitos por HPLC-
MSMS
461 Materiais equipamentos e condiccedilotildees adotadas para a mensuraccedilatildeo dos
analitos apoacutes validaccedilatildeo do meacutetodo
Padrotildees analiacuteticos e padrotildees internos (PIs) deuterados bupropiona
hidroxibupropiona vareniclina (Santa Cruzreg) vareniclina d4 (TRCreg) nicotina
(ChemCruzreg) cotinina (Sigma-Aldrichreg) hidroxicotinina (Torontoreg) e
hidroxibupropiona d6 nicotina d4 cotinina d3 hidroxicotinina d3 (Cerilliantreg)
Solventes orgacircnicos Metanol acetonitrila (JT Baker) e sais acetato de amocircnio
fosfato de soacutedio (Vetecreg) fosfato de soacutedio monobaacutesico (Proquimiosreg) fosfato
de amocircnio (Reagenreg) formiato de amocircnio (Sigma-Aldrichreg)
Equipamentos e acessoacuterios
o HPLC Shimadzureg (Kyoto Japatildeo) equipado com uma vaacutelvula comutadora
de 6 vias automaacutetica
o Auto-amostrador Shimadzureg (Kyoto Japatildeo)
o Vaacutelvula comutadora de 6 vias 11R-0016H (Valcoreg Houston TX USA)
o Espectrocircmetro de massas LCMS-8030 Shimadzureg (Kyoto Japatildeo)
o Analisador de massa triplo quadrupolo (Shimadzureg Kyoto Japatildeo)
o Coluna analiacutetica ACEreg C18 (100 mm x 21 mm x 3 microm comprimento
diacircmetro interno e tamanho de partiacutecula)
o Preacute-coluna ACEreg C18 (21mm x 3 microm diacircmetro tamanho de partiacutecula)
39
o Coluna de extraccedilatildeo coluna contendo aproximadamente 70 mg do novo
RAM
Software
o LabSolutionsreg para anaacutelise dos dados e programaccedilatildeo do meacutetodo no
HPLC-MSMS
Condiccedilotildees espectrometricas e cromatograacuteficas
o Temperatura da forno da coluna 40ordmC
o Temperatura da linha de dessolvataccedilatildeo 250ordmC
o Temperatura do bloco de aquecimento 400ordmC
o Fluxo do gaacutes de nebulizaccedilatildeo 20 ml min-1
o Fluxo de gaacutes para secagem 150 ml min-1
o Energias de colisatildeo precursores e fragmentos dos analitos (Tabela 1)
o Fase moacutevel de carregamento (liberada pela bomba A) Aacutegua ultra pura
em um fluxo de 04 mL min-1
o Fase moacutevel de eluiccedilatildeoseparaccedilatildeoionizaccedilatildeo (liberada pela bomba C)
metanol tampatildeo formiato de amocircnio 001 mol L-1 pH=42 (9010 vv)
em um fluxo de 04 mL min-1
o Fase moacutevel de limpeza (liberada pela bomba B) acetonitrila aacutegua ultra
pura isopropanol (751510 vvv) em um fluxo de 10 mL min -1
o Sistema de anaacutelise ULPC-MSMS no modo columns switching em
configuraccedilatildeo backflush modo de ionizaccedilatildeo positiva por electrospray
(ESI+)
40
Tempos
o Fase de carregamento e condionamento do sistema (vaacutelvula na posiccedilatildeo
1) 0 - 30 min
o Fase de eluiccedilatildeo (vaacutelvula na posiccedilatildeo 2) 03 min
o Fase de limpeza separaccedilatildeo e anaacutelise por MS (vaacutelvula na posiccedilatildeo 1) 67
min
o Recondiocionamento do sistema (vaacutelvula na posiccedilatildeo 1) 50 min
o Tempo total incluindo todos os processos 15 min
o
Tabela 1 - Analitos precursores fragmentos e energias de colisatildeo otimizados
Analitos Precursor (mz) Fragmentos (mz) Energia de colisatildeo
(KV)
Vareniclina 212 169 -23
183 -24
141 -43
Bupropiona 240 131 -28
139 -26
103 -39
Hidroxibupropiona 256 139 -29
131 -29
167 -29
Nicotina 163 117 -28
130 -22
77 -44
Cotinina 177 80 -24
98 -21
70 -34
Hidroxicotinina 193 80 -30
134 -19
118 -21
Fragmentos quantificados
41
462 Visatildeo geral do desenvolvimento da coluna e padronizaccedilatildeo da anaacutelise
Todos os padrotildees para as anaacutelises dos analitos foram adquiridos e armazenados
conforme recomendaccedilatildeo do fabricante ateacute o momento da padronizaccedilatildeo das anaacutelises As
anaacutelises foram realizadas atraveacutes da colaboraccedilatildeo com o Prof Dr Eduardo Costa de
Figueiredo Dr Henrique Dipe Faria e Prof Dra Isarita Martins do Laboratoacuterio de
Anaacutelises de Toxicantes e Faacutermacos ndash LATF da Faculdade de Ciecircncias Farmacecircuticas da
Universidade Federal de Alfenas (Unifal MG) A escolha de cada analito foi
determinada atraveacutes de sua importacircncia cliacutenica e tambeacutem devido agrave disponibilidade dos
padrotildees dos analitos no mercado Os analitos mensurados para as amostras provenientes
dos pacientes tratados com os faacutermacos antitabagismo foram bupropiona
hidroxibupropiona vareniclina nicotina cotinina e hidroxicotinina (os trecircs uacuteltimos satildeo
proveninentes do fumo) Foi realizado um levantamento das propriedades fiacutesico-
quiacutemicas dos metaboacutelitos conforme Quadro 5
Para a remoccedilatildeo das macromoleacuteculas (como proteiacutenas) presentes na matriz de
soro foi desenvolvida uma coluna extratora de acesso restrito a partir de nanotubos
hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados com ligaccedilotildees hidrofiacutelicas (novo RAM) O
material foi desenvolvido e caracterizado antes mesmo da padronizaccedilatildeo das condiccedilotildees
de anaacutelise nos equipamentos
Foram obtidas as condiccedilotildees espectomeacutetricas (modo de ionizaccedilatildeo e as condiccedilotildees
de sua fonte temperatura do bloco de calor fluxo de gaacutes nebulizador e fluxo do gaacutes
secante) e cromatograacuteficas (tempo de retenccedilatildeo e separaccedilatildeo e aacutereas obtidas dos picos de
cada analito) Apoacutes as condiccedilotildees foram otimizadas em sistema de cromatografia liacutequida
de alta eficiecircncia multidimensional seguida por espectrometria de massa (HPLC-
MSMS) O sistema multimensional constituiacutedo por vaacutelvulas comutadoras permite a
anaacutelise online e automatizada com configuraccedilatildeo via software As vaacutelvulas permitem
42
diferentes posiccedilotildees promovendo a ocorrecircncia de eventos distintos no sistema como a
concentraccedilatildeo dos analitos e remoccedilatildeo de macromoleacuteculas atraveacutes da coluna extratora
(posiccedilatildeo 1) a eluiccedilatildeo dos analitos da coluna extratora para a coluna analiacutetica (posiccedilatildeo 2)
e novamente na posiccedilatildeo 1 ocorre a eluiccedilatildeo dos analitos da coluna analiacutetica para o
espectrocircmetro de massas a limpeza da coluna extratora e o recondionamento do
sistema
Quadro 5 - Propriedades fiacutesico-quiacutemicas dos analitos
Bupropiona
Peso molecular 27620 gmol
Ponto de fusatildeo 243-246deg C
Solubilidade em aacutegua 00693 mgmL
pKa (aacutecido forte) 1829
pKa (mais forte baacutesico) 822
Aacuterea da superfiacutecie polar 291 Aring2
Log P 36
Hidroxibupropiona
Peso molecular 25574 gmol
Ponto de fusatildeo 121-123degC
Solubilidade em aacutegua 02 mgmL
pKa (aacutecido forte) 1479
pKa (mais forte baacutesico) 765
Aacuterea da superfiacutecie polar 4933 Aring2
Log P 222
Vareniclina
Peso molecular 21127 gmol
Pressatildeo de vapor 25degC
Solubilidade em aacutegua 877 x 10-2 gL
pKa1 182 pKa2 = 973
Aacuterea da superfiacutecie polar 378 Aring2
Log P 103
43
Nicotina
Peso molecular 16223 gmol
Pressatildeo de vapor 618 degC
Solubilidade em aacutegua 100 mM
pKa 85 pKb1 616 a 15degC e pKb2 1096
Aacuterea da superfiacutecie polar 378 Aring2
Log P 117
Cotinina
Peso molecular 176215 gmol
Solubilidade em aacutegua 10 x10-6 mgL a 25degC
Aacuterea da superfiacutecie polar 332 Åsup2
Log P 007
Hidroxicotinina
Peso molecular 192214 gmol
Aacuterea da superfiacutecie polar 53 Å2
ACDLog P -148
Fonte Banco de dados Pubchem e ChemSpider Obs Algumas informaccedilotildees referentes agraves
propriedades fiacutesico-quiacutemicas dos analitos ainda natildeo estatildeo disponiacuteveis na literatura pKa= valor
negativo do logaritmo da constante de dissociaccedilatildeo de um aacutecido pKb= valor negativo do logaritmo
da constante de dissociaccedilatildeo de uma base LogP= coeficiente de particcedilatildeo
463 Desenvolvimento da coluna RAM para a purificaccedilatildeo da amostra
As amostras de soro e plasma satildeo matrizes ricas em moleacuteculas que interferem na
mensuraccedilatildeo dos analitos como lipiacutedios e principalmente proteiacutenas Estas podem
obstruir colunas analiacuteticas e diminuir a concentraccedilatildeo dos analitos jaacute que muitos destes
estatildeo ligados a essas proteiacutenas Devido a esse fato geralmente eacute realizada uma
preparaccedilatildeo das amostras antes de sua mensuraccedilatildeo Essa preparaccedilatildeo envolve processos
como a extraccedilatildeo com o uso de solventes precipitaccedilatildeo entre outros os quais geram
custo de materiais aumento do tempo de trabalho e de erros 104 105 51 106 Dessa forma
44
diversos estudos vecircm tentando desenvolver meacutetodos que natildeo exijam tanta manipulaccedilatildeo
das amostras Os materiais de acesso restrito (RAMs) estatildeo sendo utilizados para a
menor preparaccedilatildeo da amostra e sua injeccedilatildeo direta Dentre os RAMs estatildeo os nanotubos
de carbono (CNTs) modificados 107-109 Nesta colaboraccedilatildeo foi desenvolvida a coluna
extratora composta por nanotubos hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados com a
adiccedilatildeo de grupos hidrofiacutelicos Esse material entrou com pedido de patente na Agecircncia
de Inovaccedilatildeo e Empreendedorismo da Universidade Federal de Alfenas-MG atraveacutes do
Processo 230870001282019-84 e portanto a sua composiccedilatildeo e os resultados de
alguns testes da sua caracterizaccedilatildeo seratildeo mantidos em sigilo (vide declaraccedilatildeo Anexo
5)
Diferentes RAMs foram sintetizados a partir de CNTs para que fosse obtido o
melhor desempenho na remoccedilatildeo de macromoleacuteculas e retenccedilatildeo dos analitos da amostra
Os CNTs utilizados foram compostos por paredes muacuteltiplas pois apresentam uma
elevada aacuterea superficial e consequentemente uma maior capacidade de adsorccedilatildeo Os
CNTs foram adquiridos comercialmente e inicialmente foram funcionalizados a partir
de reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo aacutecida com aacutecido niacutetrico como desenvolvido por Barbosa et al 109
Os CNTs oxidados foram utilizados em etapas de siacutentese posteriores
adicionando grupos quiacutemicos hidrofiacutelicos que fossem capazes de realizar a exclusatildeo de
proteiacutenas e permitir a adsorccedilatildeo dos analitos As reaccedilotildees de siacutentese posteriores foram
semelhantes as promovidas para a realizaccedilatildeo de revestimento externo de poliacutemeros
poliacutemeros biomimeacuteticos nanomagneacuteticos com e sem acesso restrito 107 110-112 poreacutem
foram utilizadas estrateacutegias e proporccedilotildees de reagentes distintas na tentativa de obter o
RAM mais eficiente Aleacutem disso tambeacutem foi priorizada a siacutentese mais simples e
reprodutiacutevel bem como o material que apresentar maior vida uacutetil Os diferentes
materiais sintetizados foram testados em relaccedilatildeo agrave exclusatildeo de proteiacutenas e adsorccedilatildeo dos
45
analitos e tambeacutem foram realizados testes de caracterizaccedilatildeo para determinar suas
propriedades fiacutesico-quiacutemicas e confirmar a estrutura originada
A anaacutelise termogravimeacutetrica foi realizada com a finalidade de determinar a
variaccedilatildeo de massa (ganho ou perda) do RAM em funccedilatildeo de emprego de temperatura
programada proporcionando informaccedilotildees importantes a respeito da estabilidade do
material e de sua composiccedilatildeo Outras teacutecnicas tambeacutem foram utilizadas com o objetivo
de obter dados relacionados agrave estrutura e composiccedilatildeo do novo RAM como o
infravermelho e anaacutelise elementar Anaacutelises de microscopias eletrocircnicas de varredura e
de transmissatildeo tambeacutem foram realizadas para a determinaccedilatildeo da composiccedilatildeo da
superfiacutecie externa e arranjo estrutural do material com as modificaccedilotildees realizadas
Apoacutes o teacutermino do preparo do novo RAM eles foram colocados dentro de uma
coluna (aproximadamente 70 mg) conforme (Figura 13) A coluna foi posteriormente
empregada no preparo de amostras online no sistema cromatograacutefico
Figura 13 ndash Representaccedilatildeo da composiccedilatildeo da coluna extratora (Novo RAM) O novo RAM formado
a partir de nanotubos hiacutedridos de carbono e siacutelica dotado de muacuteltiplas camadas e modificados com grupos
hidrofiacutelicos promovem a retenccedilatildeo de analitos e exclusatildeo de macromoleacuteculas como proteiacutenas O RAM foi
posteriormente empacotado em coluna para a utilizaccedilatildeo em sistema cromatograacutefico Fonte adaptado do
colaborador Dr Henrique Dipe de Faria Unifal-MG
46
464 Caracterizaccedilatildeo do novo RAM
4641 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA
Na ausecircncia da coluna extratora foi preparada primeiramente uma soluccedilatildeo
aquosa de albumina de soro bovino (BSA) em uma concentraccedilatildeo de 44 mgmL-1
(semelhante agrave concentraccedilatildeo de proteiacutenas presentes no plasma humano) Foram injetados
10 microl desta soluccedilatildeo em triplicata diretamente em sistema cromatograacutefico com detector
UV ajustado a 255 nm utilizando como fase moacutevel o tampatildeo formiato de amocircnio 10
mM pH=42 em um fluxo de 04 mL min-1 O sinal detectado foi de 100 BSA
Posteriormente a coluna preenchida com 70 mg do novo RAM foi inserida no sistema
cromatograacutefico entre o injetor e o detector A soluccedilatildeo de BSA foi analisada em triplicata
novamente no entanto com a presenccedila da coluna extratora desenvolvida (novo RAM)
A aacuterea do sinal obtido nesta segunda anaacutelise dividida pela aacuterea do sinal de 100 BSA
obtida na primeira anaacutelise foi correspondente agrave porcentagem de BSA excluiacuteda pela
coluna
4642 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas no soro
Para analisar a exclusatildeo total de macromoleacuteculas (como lipiacutedios proteiacutenas e
sacariacutedeos) agora nas amostras de soro foi utilizado procedimento semelhante Na
ausecircncia da coluna extratora injetou-se no sistema cromatograacutefico em triplicata 100 μL
de amostra de soro humano branco foram testados pools de soro puros e diluiacutedos 14 A
aacutegua ultra pura foi utilizada como fase moacutevel em um fluxo de 04 mL min-1 e o sinal
obtido foi relacionado a 100 dos interferentes Apoacutes a coluna extratora (o novo
RAM) foi adionado ao sistema e a amostra foi inserida novamente A divisatildeo entre a
aacuterea do pico na primeira anaacutelise pelo pico da segunda anaacutelise refere-se agrave porcentagem
de exclusatildeo de interferentes As condiccedilotildees cromatograacuteficas foram as mesmas do teste
com BSA
47
4643 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA em diferentes pHs
O teste de exclusatildeo de proteiacutenas tambeacutem foi realizado nas mesmas condiccedilotildees
cromatograacuteficas que a anaacutelise anterior utilizando soluccedilatildeo de BSA em triplicata no
entanto diferentes soluccedilotildees como fase moacutevel (variaccedilatildeo de pH de 22 a 70) foram
testadas pois o pH pode influenciar na ionizaccedilatildeo dos analitos dos grupos funcionais
presentes na superfiacutecie do novo RAM e na interaccedilatildeo entre eles o que pode resultar em
diferentes taxas de exclusatildeo de proteiacutenas Estas soluccedilotildees foram os tampotildees fosfato de
soacutedio 10 mM (pHs 22 e 26) formiato de amocircnio 10 mM (pHs 30 a 46) acetato de
amocircnio 5 mM (pHs 52 a 66) e fosfato de soacutedio 5mM (pH 70)
465 Paracircmetros espectromeacutetricos
Com a finalidade de se obter um meacutetodo de anaacutelise capaz de detectar e
quantificar menores niacuteveis possiacuteveis de concentraccedilatildeo dos analitos foram otimizados os
paracircmetros espectromeacutetricos fluxos dos gases secantes e nebulizador modo de
ionizaccedilatildeo temperaturas da linha de dessolvataccedilatildeo e de bloco de aquecimento e as
energias de colisotildees utilizadas para fragmentar os iacuteons precursores para originar os
fragmentos iocircnicos de cada analito Foram realizadas soluccedilotildees padrotildees de cada analito e
dos padrotildees internos (PIs) deuterados (vareniclina d-4 hidroxibupropiona d6 nicotina
d4 cotinina d3 e hidroxicotinina d3) na concentraccedilatildeo de 1 mg L-1 em metanol Cada
uma destas soluccedilotildees foram injetadas separadamente no sistema em um volume de 5 microL
A fase moacutevel utilizada foi constituiacuteda por metanol tampatildeo formiato de amocircnio 001
mol L-1 pH=42 (9010 vv) em um fluxo de 04 mL min-1 e o modo de ionizaccedilatildeo
positiva (ESI+) foi utilizado pois demonstrou ser mais eficiente para ionizar as
moleacuteculas analisadas Essa otimizaccedilatildeo foi obtida utilizando o software Labsolutionsreg
48
466 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatograacutefico multidimensional
Para esta otimizaccedilatildeo foi utilizado um HPLC de dotado de vaacutelvula comutadora
automaacutetica de 6 vias e um injetor automaacutetico de amostras o que permitiu a
automatizaccedilatildeo do processo Ainda o sistema cromatograacutefico foi acoplado a um
espectrocircmetro de massas em tandem (HPLC-MSMS) dotado de um analisador de
massa triplo quadrupolo o qual possui alta sensibilidade e seletividade Incorporou-se
neste sistema uma coluna extratora preenchida com o RAM desenvolvido
O forno foi mantido a 40ordmC e o detector UV operando em um comprimento de
onda de 255 nm A fim de padronizar a anaacutelise foram testadas colunas anaacuteliticas de
diversos tamanhos e composiccedilotildees e variadas proporccedilotildees de fases de moacuteveis
Atraveacutes da anaacutelise do cromatograma foram avaliados o tempo de retenccedilatildeo e
separaccedilatildeo e as aacutereas obtidas dos picos de cada analito O sistema foi utilizado no modo
columns switching na configuraccedilatildeo backflush e as condiccedilotildees da anaacutelise foram
otimizadas como os tempos de exclusatildeo de proteiacutenas de adsorccedilatildeo e eluiccedilatildeo dos
analitos de separaccedilatildeo cromatograacutefica de limpeza da coluna extratora e de
recondicionamento do sistema bem como a composiccedilatildeo das fases moacuteveis de
carregamento de eluiccedilatildeoseparaccedilatildeo e de limpeza
Para a otimizaccedilatildeo dos paracircmetros de anaacutelise foi utilizado um pool de amostras
de soro humano branco em sexplicata Este soro foi dopado com os analitos vareniclina
bupropiona hidroxibupropiona nicotina cotinina e hidroxicotinina em 3 concentraccedilotildees
01 100 e 1000 microg L -1 e com os PIs deuterados na concentraccedilatildeo de 500 microg L -1 Como
o soro eacute uma matriz com alta concentraccedilatildeo de interferentes foram testados pools de
soro branco dopados e injetados sem diluiccedilatildeo diretamente no sistema e diluiacutedos em aacutegua
ultra pura (11) e os perfis analiacuteticos foram entatildeo avaliados
49
467 validaccedilatildeo analiacutetica
Testes para a validaccedilatildeo da anaacutelise otimizada foram realizadas conforme
diretrizes do US Department of Health and Human Services e do Food and Drug
Administration (FDA) 2013 113 Os paracircmetros avaliados foram a seletividade limite
de detecccedilatildeo (LD) limite de quantificaccedilatildeo (LQ) linearidade estabilidade dos analitos
efeito residual e de matriz e recuperaccedilatildeo da extraccedilatildeo
Os ensaios foram realizados em seis repeticcedilotildees (n=6) exceto o ensaio de
recuperaccedilatildeo (n=3) e foi utilizado um pool de amostras de soro branco dopadas com cada
um dos analitos nas concentraccedilotildees de 5 10 20 50 75 100 μg L-1 para vareniclina 1 5
50 250 500 1000 μg L-1 para bupropiona 1 10 100 500 1000 2000 para
hidroxibupropiona 5 10 50 250 500 1000 μg L-1 para nicotina cotinina e
hidroxicotinina Os PIs deuterados foram utilizados na concentraccedilatildeo de 200 μg L-1
47 Anaacutelise estatiacutestica
Em relaccedilatildeo agraves caracteriacutesticas demograacuteficas as variaacuteveis contiacutenuas foram
apresentadas como meacutedia e desvio padratildeo e as categoacutericas como frequecircncias Os testes
Shapiro-Wilk e KolmogorovndashSmirnov foram realizados para verificar a normalidade da
distribuiccedilatildeo das variaacuteveis quantitativas e assim escolher testes parameacutetricos ou natildeo
parameacutetricos Foram realizados os testes Qui-quadrado Exato de Fisher t de Student ou
Mann-Whitney para as anaacutelises comparativas de caracteriacutesticas gerais entre os grupos
de desfecho dos pacientes tanto no ensaio de expressatildeo como de mensuraccedilatildeo dos
analitos Para as anaacutelises de expressatildeo gecircnica o meacutetodo 2-∆∆CT foi utilizado 103 Como os
dados de expressatildeo natildeo apresentaram distribuiccedilatildeo normal foi realizado o teste natildeo
parameacutetrico de Mann-Whitney para testar a hipoacutetese de diferenccedila (valores de 2-∆CT)
intra e entre os grupos de desfechos (sucesso e resistente e tempos de tratamento
50
farmacoloacutegico T0 T2 e T4) Os valores de ∆∆CT (mediana de ∆CTgrupo teste ndash mediana
de ∆CTgrupo referecircncia) foram obtidos para o caacutelculo do fold change O fold-change (2-∆∆CT)
foi calculado para verificar o aumento ou diminuiccedilatildeo de expressatildeo gecircnica entre os
grupos analisados O graacutefico heat map foi construiacutedo atraveacutes do software Gene-globe
(Qiagen USA) para verificar as diferenccedilas no perfil de expressatildeo dos genes estudados
de acordo com os tempos (T0 T2 e T4) e de acordo com a efetividade de tratamento
com vareniclina (sucesso e resistente) O teste de Manny-Whitney foi utilizado para
analisar os niacuteveis de concentraccedilotildees de vareniclina de bupropiona de nicotina e de seus
metaboacutelitos de acordo com os desfechos de tratamento (sucesso e resistente) pois natildeo
apresentaram distribuiccedilatildeo normal A taxa de metabolizaccedilatildeo de nicotina (NRM) foi
calculada pela seguinte foacutermula NMR= trans-3-hidroxicotininacotinina A
hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3- hidroxicotinina
para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros da hidroxicotinina satildeo
irrelevantes 31 32 Os pacientes foram classificados em metabolizadores lentos se
NMRlt031 e normais ou raacutepidos se NMRgt031 Todas as anaacutelises estatiacutesticas foram
realizadas utilizando o software SPSS (versatildeo 20 IBM New York NY) considerando
o niacutevel de significacircncia de P lt005
51
5 RESULTADOS
Este projeto incluiu 105 pacientes sendo 74 tratados com vareniclina e 31
com bupropiona Dos 74 pacientes tratados com vareniclina amostras de 27 pacientes
foram analisadas quanto agrave expressatildeo gecircnica (14 pacientes do grupo de desfecho sucesso
e 13 do grupo resistente) Sendo provenientes destes pacientes 52 amostras ao todo (de
diversos tempos) 9 resistentes do tempo T0 7 resistentes do T2 8 resistente do T4 9
sucessos do T0 8 sucessos do T2 e 11 sucessos do T4 (vide toacutepico 42 Nuacutemero
amostral)
Quanto a mensuraccedilatildeo dos analitos foi desenvolvida uma coluna extratora para a
purificaccedilatildeo da amostra agrave base de nanotubos hiacutedridos de carbono e siacutelica modificados
com a adiccedilatildeo de grupos hidrofiacutelicos (novo RAM) o meacutetodo HPLC-MSMS
multidimensional no modo column switching e na configuraccedilatildeo backflush foi
otimizado e validado Setenta e quatro pacientes tratados com vareniclina e 31 tratados
com bupropiona foram submetidos agrave anaacutelise Apenas 4 amostras das 105 apresentaram
valores abaixo do LQ (3 de pacientes tratados com vareniclina e 1 de paciente tratado
com bupropiona) e estas foram excluiacutedas das anaacutelises dos analitos (vide toacutepico 42
Nuacutemero amostral)
51 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica
511 Dados cliacutenicos e demograacuteficos
As Tabelas 2 e 3 mostram as caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes
selecionados para o ensaio de expressatildeo gecircnica do grupo total e por grupo de desfecho
respectivamente A variaacutevel idade apresentou diferenccedila significativa entre os grupos
resistente e sucesso
52
Tabela 2 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina selecionados para os ensaios de expressatildeo gecircnica (n=27)
Idade (anos) 50 plusmn 13
Gecircnero mulheres () 464
Etnia autodeclarada brancos () 740
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 271 plusmn 50
Cigarrosdia 17 plusmn 7
FTND 62 plusmn 20
FTND ge 6 () 607
Escore Issa ge 3 () 857
Hipertensatildeo () 179
Dislipidemia () 250
Diabetes melito tipo 2 () 107
Depressatildeo () 71
Ansiedade () 286
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash
Fagerstroumlm test for nicotine dependence (escala de 0 a 10
pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
Tabela 3 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina submetidos aos ensaios de expressatildeo gecircnica de acordo com o desfecho
de tratamento
Resistente (n=13) Sucesso (n=14) Valor de P
Idade (anos) 55 plusmn 11 45 plusmn 12 0045
Gecircnero mulheres () 538 357 045
Etnia autodeclarada brancos () 769 786 100
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 271 plusmn 46 273 plusmn 54 092
Cigarrosdia 20 plusmn 6 15 plusmn 6 006
FTND 63 plusmn 22 59 plusmn 19 058
FTND ge 6 () 538 643 070
Escore Issa ge 3 () 846 857 100
Hipertensatildeo () 231 71 033
Dislipidemia () 231 286 100
Diabetes melito tipo 2 () 231 00 010
Depressatildeo () 77 71 100
53
Ansiedade () 308 357 100
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fagerstroumlm test for nicotine
dependence (escala de 0 a 10 pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
512 Dados de expressatildeo gecircnica
Dos 17 genes escolhidos para testar com a resposta ao tratamento apenas 4
apresentaram valores de amplificaccedilatildeo aceitaacuteveis para uma interpretaccedilatildeo de qualidade
mais especificamente valores de CT lt 33 Os valores das expressotildees dos genes (CTs)
foram normalizados atraveacutes das meacutedias de CT dos housekeeping genes para cada
amostra obtendo-se os valores de ∆CT = (CTgene alvo ndash meacutedia CT housekeepings genes) A
Tabela 4 mostra os valores de mediana de ∆CT dos genes analisaacuteveis de acordo com os
tempos de tratamento e grupos de desfecho
Tabela 4 - Valores de mediana de ∆CT dos genes de acordo com os tempos de
tratamento e grupos de desfecho
∆CT = (CTgene alvo ndash meacutedia CThousekeepings genes) T0= Tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico
T2= Duas semanas apoacutes o iacutenicio do tratamento farmacoloacutegico T4= Quatro semanas apoacutes o iniacutecio do
tratamento farmacoloacutegico IC 95 = Intervalo de confianccedila de 95
Resistente T0 Resistente T2 Resistente T4
∆CT IC 95 ∆CT IC 95 ∆CT IC 95
CHRNA5 818 (732 ndash 870) 845 (748 ndash 887) 767 (727 ndash 905)
CHRNA7 662 (617 ndash 697) 802 (707 ndash 848) 719 (696 ndash 786)
CHRNG 620 (579 ndash 695) 647 (601 ndash 668) 663 (602 ndash 702)
COMT 467 (440ndash 501) 480 (443 ndash 503) 487 (452 ndash 524)
Sucesso T0 Sucesso T2 Sucesso T4
∆CT IC 95 ∆CT IC 95 ∆CT IC 95
CHRNA5 832 (738 ndash 917) 707 (653 ndash 896) 837 (754 ndash 882)
CHRNA7 726 (611 ndash 842) 704 (640 ndash 779) 738 (676 ndash 820)
CHRNG 682 (619 ndash 774) 683 (656 ndash 733) 659 (625 ndash 703)
COMT 488 (430 ndash 511) 458 (433 -515) 481 (448 ndash 516)
54
513 Anaacutelise de associaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica entre os desfechos e os tempos de
tratamento
A Tabela 5 mostra o fold change e anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos de
tempos de tratamento e grupos de desfecho Foi observada diferenccedila significativa para a
expressatildeo do gene CHRNA7 no grupo resistente amostras dos tempos T2 e T4
apresentaram menor expressatildeo comparadas com amostras do T0 (fold change 038
P=0007 fold change 067 P=0004 respectivamente) Para a expressatildeo do gene
CHRNG amostras do grupo sucesso mostraram menor expressatildeo comparadas com
amostras do grupo resistente no tempo T2 (fold change= 077 P=0006)
Tabela 5 - Fold change e anaacutelise de associaccedilatildeo entre os tempos de tratamento e
grupos de desfecho
Resistente T2 vs T0 Resistente T4 vs T0 Resistente T4 vs T2
Genes 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P
CHRNA5 083 (034 ndash 233) 057 142 (030 ndash 269) 095 172 (034 ndash 303) 089
CHRNA7 038 (020 ndash 093) 0007 067 (031 ndash 101) 0004 178 (058 ndash 287) 037
CHRNG 083 (054 ndash 192) 037 074 (043 ndash 190) 044 090 (050 ndash 158) 036
COMT 091 (065 ndash 149) 092 087 (056 ndash 140) 063 095 (057 ndash 142) 073
Sucesso T2 vs T0 Sucesso T4 vs T0 Sucesso T4 vs T2
Genes 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P
CHRNA5 238 (033 ndash 623) 037 097 (037 ndash 310) 061 041 (020 ndash 268) 069
CHRNA7 116 (031 ndash 406) 064 092 (023 ndash 316) 091 079 (029 ndash 204) 055
CHRNG 099 (045 ndash 227) 049 117 (056 ndash 281) 062 118 (072 ndash 211) 033
COMT 123 (055 ndash 172) 092 105 (055 ndash 155) 068 085 (056 ndash 159) 041
Sucesso vs resistente T0 Sucesso vs resistente T2 Sucesso vs resistente T4
Genes 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P
CHRNA5 091 (028 ndash 250) 075 260 (036 ndash 506) 047 062 (034 ndash 285) 085
CHRNA7 064 (021 ndash 182) 013 197 (061 ndash 423) 009 088 (042 ndash 214) 074
CHRNG 065 (026 ndash 169) 012 077 (040 ndash 109) 0006 103 (050 ndash 171) 079
55
T0= Tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico T2= Duas semanas apoacutes o iacutenicio do tratamento
farmacoloacutegico T4= Quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico 2-∆∆CT = Fold change (diferenccedila de
expressatildeo) P valor (anaacutelise de associaccedilatildeo entre as medianas de 2-∆CT dos grupos) IC 95 = Intervalo de confianccedila
de 95
As Figura 14 e 15 mostram graacuteficos de barras das diferenccedilas de expressatildeo dos
genes CHRNA7 e CHRNG entre os tempos de tratamento e desfecho respectivamente
O heat map (Figura 16) mostra que natildeo houve diferenciaccedilatildeo nos perfis de expressatildeo
gecircnica em uma anaacutelise conjunta dos genes de acordo com os desfechos e tempos de
tratamento
Devido agrave diferenccedila significativa nas meacutedias de idade entre os grupos sucesso e
resistente foi realizada regressatildeo linear multipla na anaacutelise de expressatildeo dos quatro
genes analisaacuteveis A regressatildeo foi ajustada por idade e tambeacutem gecircnero e cigarros por
dia No entanto os resultados de expressatildeo dos genes natildeo foram impactados por estas
covariaacuteveis
COMT 086 (061 ndash 164) 090 116 (061 ndash 162) 049 104 (064 ndash 169) 093
56
Figura 14 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNA7 entre os tempos de tratamento e desfecho A Anaacutelise intragrupo do
desfecho resistente B Anaacutelise intragrupo do desfecho sucesso T0= tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico T2= duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico T4= quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico P= 0007
(resistente T2 vs T0 fold change de 038) P=0004 (resistente T4 vs T0 fold change de 067) Valor de P (anaacuteliacutese de
associaccedilatildeo entre as medianas de 2-∆CT dos grupos em uma comparaccedilatildeo dois a dois) Fonte do autor
57
Figura 15 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNG entre os tempos de tratamento e desfecho A Anaacutelise intragrupo do
desfecho resistente B Anaacutelise intragrupo do desfecho sucesso T0= tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico T2= duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico T4= quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico P= 0006
(sucesso vs resistente T2 fold change de 077) Valor de P (anaacuteliacutese de associaccedilatildeo entre as medianas de 2-∆CT dos grupos em uma
comparaccedilatildeo dois a dois) Fonte do autor
58
Figura 16 - Heat map de expressatildeo gecircnica A figura mostra a magnitude de expressatildeo gecircnica entre os grupos A cor mais clara
(verde) nos indica menor expressatildeo e a cor mais escura (vermelho) indica maior expressatildeoT0= tempo inicial antes do tratamento
farmacoloacutegico T2= duas semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico T4= quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento
farmacoloacutegico Fonte do autor gerada pelo software Gene Globe QIAGENreg
52 Mensuraccedilatildeo dos analitos
521 Caracterizaccedilatildeo da coluna teste exclusatildeo de proteiacutenas e interferentes da
matriz
Em relaccedilatildeo ao teste de capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas o pico de BSA sem
e com a nova coluna extratora apresentou tempo de retenccedilatildeo semelhante no entando a
aacuterea da curva do BSA na presenccedila do novo RAM foi bem menor do que na sua
ausecircncia conforme a Figura 17 A reduccedilatildeo de proteiacutenas (da soluccedilatildeo de BSA) pela
coluna foi de aproximadamente 98 e nas amostras de pools soro diluiacutedas (14) a
remoccedilatildeo foi de 99 (Figura 18)
A Figura 19 mostra a influecircncia do pH (escala de de 22 a 70) na exclusatildeo de
proteiacutenas fato que estaacute diretamente relacionado com a estrutura fiacutesico-quiacutemica do
RAM Diferentes pHs influenciaram na taxa de exclusatildeo de proteiacutenas esse
comportamento pode ser explicado devido agrave interaccedilotildees eletrostaacuteticas do novo RAM
com as proteiacutenas Valores de pH menores que o do ponto isoeleacutetrico das proteiacutenas
59
podem promover a prevalecircncia de proteiacutenas carregadas positivamente enquanto que
valores de pH superiores podem promover proteiacutenas carregadas negativamente 114
Dessa forma acredita-se que o comportamento de exclusatildeo de proteiacutenas do novo
material eacute semelhante ao descrito em outros estudos 108 109 115 116
Figura 17 - Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com soluccedilatildeo de BSA Graacuteficos obtidos apoacutes injeccedilatildeo de 10 microL de uma soluccedilatildeo aquosa de BSA (44 mg mL-1) no
sistema sem coluna (A) e com coluna extratora (B) A - aacuterea do pico 10142590 B - aacuterea
do pico 9713614 Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF
Unifal-MG
Figura 18 - Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com amostra de soro
diluiacuteda Graacuteficos obtidos apoacutes injeccedilatildeo de 100 microL de soro diluiacutedo em aacutegua ultra pura
(14 vv) no sistema sem coluna (A) e com coluna extratora (B) A aacuterea do pico
53981550 B - aacuterea do pico 53552824 Fonte do autor e do colaborador DrHenrique
Dipe de Faria LATF Unifal-MG
60
Figura 19 - Influecircncia do pH na exclusatildeo de proteiacutenas Fonte do autor e do colaborador Dr
Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
522 Otimizaccedilatildeo dos paracircmetros espectromeacutetricos
No processo de otimizaccedilatildeo das condiccedilotildees espectromeacutetricas foi adotado o modo
de ionizaccedilatildeo positivo (ESI+) isto eacute a ionizaccedilatildeo promove a protonaccedilatildeo (adiccedilatildeo de H+)
dos analitos e de seus fragmentos As energias de colisatildeo ideais e as muacuteltiplas transiccedilotildees
de monitoramento de reaccedilatildeo (MRM) foram otimizadas para cada analito separadamente
vide valores de energia de colisatildeo e fragmentos obtidos jaacute mostrados na Tabela 1 (no
toacutepico 461) A presenccedila de 3 fragmentos de cada analito foi necessaacuteria para a
identicaccedilatildeo qualitativa e a quantificaccedilatildeo foi dependente da concentraccedilatildeo do fragmento
mais abundante
As seguintes temperaturas foram utilizadas 40ordmC para o forno da coluna 250ordmC
para a linha de dessolvataccedilatildeo e 400ordmC para o bloco de aquecimento Foram utilizadas as
taxas de 20 ml min-1 de fluxo de gaacutes de nebulizaccedilatildeo e 150 ml min-1 de fluxo de gaacutes
para a secagem
61
523 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatrograacutefico multidimensional
Quanto a composiccedilatildeo e proporccedilatildeo da fase moacutevel responsaacutevel pela eluiccedilatildeo
separaccedilatildeo e ionizaccedilatildeo dos analitos (fase moacutevel de eluiccedilatildeo) testes foram realizados com
os solventes orgacircnicos acetonitrila ou metanol combinados com o tampatildeo formiato de
amocircnio 10 mM em diferentes pHs com proporccedilotildees que variaram de 973 vv a 7525
vv (fase orgacircnica fase aquosa) Os solventes orgacircnicos utilizados satildeo menos viscosos
em relaccedilatildeo agrave aacutegua por isso fluem mais facilmente no sistema e por serem volaacuteteis
favorecem tambeacutem a ionizaccedilatildeo dos analitos e evaporaccedilatildeo do solvente A fase moacutevel que
apresentou melhores resultados foi a composiccedilatildeo de metanol formiato de amocircnio 001
mol L-1 pH 42 (9010 vv)
Variados tipos de colunas analiacuteticas foram testadas sendo elas A NSTreg (150
mm 46 mm e 5 microm) a ACEreg (150 mm x 46 mm x 5 microm) a Phenomenexreg (250 x 46
mm x 5 microm) e a Atlantis T3 e da Watersreg (100 mm x 21 mm x 3 microm) (comprimento x
diacircmetro interno x tamanho de partiacutecula) no entanto essas colunas aumentaram o
tempo de retenccedilatildeo dos analitos pioraram o perfil cromatograacutefico gerando picos largos e
fragmentados Portanto os testes foram realizados com uma nova coluna analiacutetica a
ACEreg C18 (100 mm x 21 mm x 3 microm comprimento diacircmetro interno e tamanho de
partiacutecula) com preacute-coluna ACEreg C18 (21mm x 3 microm diacircmetro tamanho de partiacutecula)
obtendo-se um menor tempo de anaacutelise (maior frequecircncia analiacutetica) e melhor perfil
cromatograacutefico (picos simeacutetricos) para os analitos
Trecircs volumes de injeccedilatildeo de amostra foram testados (5 10 e 100 microL) devido a
baixa concentraccedilatildeo dos analitos foi adotada a maior quantidade (100 μL) pois forneceu
melhores sinais analiacuteticos Tambeacutem foi avaliado o uso do pool de soro sem diluiccedilatildeo e
diluiacutedo (11 vv) os perfis cromatograacuteficos de ambos foram oacutetimos no entanto
62
escolheu-se trabalhar com a amostra diluiacuteda para diminuir a presenccedila de interferentes e
consequentemente diminuir efeito matriz e aumentar o tempo de durabilidade da coluna
analiacutetica
Jaacute obtidas as melhores condiccedilotildees espectromeacutetricas e cromatograacuteficas foi
otimizado o sistema columm switching na configuraccedilatildeo de backflush o qual apresenta
trecircs eventos como mostrado na Figura 20
Figura 20 - Ilustraccedilatildeo do sistema de columm switching na configuraccedilatildeo de backflush Na posiccedilatildeo 1
correspondente ao evento 1 ocorre exclusatildeo dos interferentes e adsorccedilatildeo dos analitos a coluna extratora Na
posiccedilatildeo 2 durante o evento 2 ocorre a eluiccedilatildeo dos analitos adsorvidos No retorno para a posiccedilatildeo 1
correspondente ao evento 3 ocorre limpeza da coluna extratora separaccedilatildeo e detecccedilatildeo dos analitos e por fim
o recondicionamento do sistema BA = bomba A BB = bomba B BC = bomba C MS = espectrocircmetro de
massas UV = detector UV e W = descarte Fonte Traduzido de (De Faria et al 2017)
Com as vaacutelvulas do sistema na posiccedilatildeo 1 (evento 1) a bomba A promoveu a
liberaccedilatildeo da fase moacutevel de carregamento (aacutegua ultra pura) em um fluxo de 04 mL min-1 O
tempo de 3 minutos foi o necessaacuterio para a adsorccedilatildeo dos analitos e sua preacute-concentraccedilatildeo
aleacutem da eliminaccedilatildeo de macromoleacuteculas A aacutegua mostrou ser um solvente oacutetimo como fase
moacutevel de carregamento aleacutem de ser um recurso barato e natildeo causar danos ao meio
ambiente De forma simultacircnea a fase moacutevel de eluiccedilatildeo fornecida pela bomba C passa
para a coluna analiacutetica de forma a condionaacute-la ainda na ausecircncia dos analitos Ambas as
bombas operaram com uma taxa de fluxo inicial de 04 mL min -1
63
Na posiccedilatildeo 2 da vaacutelvula (evento 2) a bomba C liberou a fase moacutevel de eluiccedilatildeo
(metanol formiato de amocircnio 001 mol L-1 pH 42 (9010 vv) em direccedilatildeo agrave coluna
analiacutetica em fluxo contraacuterio ao que a fase moacutevel de carregamento percorreu (backflush) A
velocidade do fluxo da bomba C foi aumentada para 08 mL min -1 e o tempo determinado
para esta etapa foi de 03 minutos o qual promoveu um oacutetimo perfil cromatograacutefico dos
analitos
No evento 3 as vaacutelvulas foram colocadas na posiccedilatildeo 1 novamente A fase moacutevel
de eluiccedilatildeo (vinda da bomba C) novamente com um fluxo de 04 mL min-1 passou pela
coluna analiacutetica promovendo a separaccedilatildeo dos analitos e sua chegada no detector de
massas De forma simultacircnea a bomba B em um fluxo de 10 mL min -1 liberou a fase
moacutevel de limpeza (acetonitrila aacutegua ultra pura isopropanol 751510 vvv) a qual
passou pela coluna extratora (RAM) promovendo a remoccedilatildeo de resiacuteduos proveniente da
anaacutelise anterior tornando-a pronta para a reutilizaccedilatildeo em uma nova anaacutelise A fase de
limpeza ocorreu no tempo de 33 a 10 min O recondionamento do sistema agraves condiccedilotildees
iniciais de anaacutelise ocorreu nos uacuteltimos 5 min em que a fase moacutevel de limpeza foi
substituiacuteda pela fase moacutevel de carregamento O tempo total para cada anaacutelise foi de 15
minutos
Para a avaliaccedilatildeo da capacidade da fase moacutevel de limpeza (acetonitrila aacutegua
ultra pura isopropanol 751510 vvv) pools de soro branco dopado na maior
concentraccedilatildeo foram injetados no sistema (com a posiccedilatildeo 1 das vaacutelvulas mantida) e apoacutes
a realizaccedilatildeo da fase de limpeza foram injetados pools de soro branco diluiacutedos (11 vv)
O experimento foi realizado em triplicata O cromatograma do soro branco natildeo
apresentou sinal analiacutetico no mesmo tempo de retenccedilatildeo dos analitos o que mostra que a
fase moacutevel de limpeza foi eficiente em seu propoacutesito evitando o chamado efeito
residual (carry-over) De Faria et al 110
64
524 Validaccedilatildeo analiacutetica
Para os testes de validaccedilatildeo foram utilizados pools de amostras de soro branco
dopadas com cada um dos analitos nas concentraccedilotildees conforme o toacutepico 467
concentraccedilotildees menores foram utilizadas no entanto essas natildeo apresentaram bons sinais
analiacuteticos precisatildeo e exatidatildeo Os resultados dos testes de validaccedilatildeo estatildeo demonstrados
na Tabela 6
O teste de linearidade foi expresso como coeficiente de determinaccedilatildeo (r2)
calculado a partir das curvas de calibraccedilatildeo intra-ensaio Para esse teste foram utilizados
os analitos em diferentes concentraccedilotildees em soro branco conforme jaacute citado as
repeticcedilotildees geraram 6 curvas de calibraccedilatildeo para cada analito Os intervalos lineares
foram baseados nos intervalos terapecircuticos 51 117 118
As mesmas concentraccedilotildees dos analitos em soro no ensaio de linearidade foram
utilizadas no ensaio dos LD e LQ Estes foram calculados atraveacutes das 6 curvas de
calibraccedilatildeo e foram definidos como 3 e 10 vezes a relaccedilatildeo sinalruiacutedo respectivamente
para o LD e LQ
Para avaliar a precisatildeo e a exatidatildeo intra e inter-ensaios foram realizados 6
repeticcedilotildees de concentraccedilotildees de calibraccedilatildeo dos analitos Os testes intra-ensaio foram
realizados no mesmo dia e os testes inter-ensaios foram realizados em dias diferentes A
exatidatildeo foi calculada atraveacutes do erro relatico (E) e a precisatildeo atraveacutes do desvio
padratildeo relativo (RSD)
No teste de seletividade foi avaliado se houve a presenccedila picos de interferentes
nos mesmos tempos de retenccedilatildeo dos analitos e dos PIs deuterados As Figuras 21 e 22
mostram os cromatogramas obtidos apoacutes a injeccedilatildeo de soro branco e de soro dopado com
os analitos respectivamente mostrando que natildeo houve a presenccedila de interferentes nos
tempos de retenccedilatildeo dos analitos e PIs deuterados
65
Figura 21 - Cromatograma obtido de amostras de soro branco diluiacutedas em aacutegua ultra pura
Volume de injeccedilatildeo = 100 microL A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz 240rarr mz 131) C-
Hidroxibup (mz 256rarr mz 238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz 80) F-
Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G- Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr mz
244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz 134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz 196rarr
mz 80) Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
Figura 22 - Cromatograma obtido apoacutes anaacutelise de soro diluiacutedo e dopado com os analitos no niacutevel
meacutedio de calibraccedilatildeo e mais os padrotildees internos deuterados A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz
240rarr mz 131) C- Hidroxibup (mz 256rarr mz 238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz
80) F- Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G- Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr
mz 244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz 134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz 196rarr
mz 80) Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
Foram realizados os testes de estabilidade de bancada longo prazo e de
congelamento e descongelamento Para a anaacutelise de estabilidade de bancada soluccedilotildees de
soro dopada com os analitos foram analisadas imediatamente apoacutes a sua preparaccedilatildeo e
apoacutes 4 e 24 horas verificando assim a estabilidade da amostra a curto prazo Para uma
66
anaacutelise a longo prazo as amostras foram armazenadas a -20degC por 30 dias e apoacutes foram
avaliadas Quanto anaacutelises de congelamento e descongelamento foram realizados 3
ciclos de congelamento -20degC e posterior descongelamento e as amostras foram
avaliadas
O ensaio de recuperaccedilatildeo da extraccedilatildeo foi realizado em triplicata A anaacutelise
avaliou a recuperaccedilatildeo relativa comparando-se a extraccedilatildeo dos analitos a partir da matriz
de soro com a de aacutegua atraveacutes da passagem da amostra pela coluna de extraccedilatildeo (RAM)
A recuperaccedilatildeo relativa se daacute pela relaccedilatildeo das concentraccedilotildees nas duas matrizes
(concentraccedilatildeo no soro concentraccedilatildeo na aacutegua) x 100
O efeito residual (carry-over) foi avaliado injetando-se uma amostra de soro
branco antes de uma amostra de soro dopado na maior concentraccedilatildeo e apoacutes foi injetada
novamente uma amostra de soro branco foram inferior a 20 daqueles obtidos no LQ
Para avaliar o efeito matriz foram comparados os resultados da anaacutelise das
amostras de soro dopadas com os analitos em diferentes concentraccedilotildees em matrizes
diferentes (aacutegua e soro) O resultado para ser aceito precisava ser inferior a 15
Posteriormente foi realizada a mensuraccedilatildeo dos analitos em amostras reais de
soro provenientes de pacientes submetidos ao tratamento antitabagismo com doses
conforme bula As Figuras 23 e 24 mostram os cromatogramas de amostras de pacientes
submetidos ao tratamento com bupropiona e vareniclina respectivamente No momento
da coleta das amostras os pacientes estavam fumando e aleacutem de apresentarem os
analitos provenientes dos faacutermacos tambeacutem mostraram a presenccedila de analitos
provenientes da nicotina
67
Figura 23 - Cromatograma obtido atraveacutes da anaacutelise das amostras de soro dos pacientes
tratados com bupropiona (150 mg 2xdia) Os pacientes estavam fumando em torno de 10
cigarrosdia no dia da coleta A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz 240rarr mz 131) C-
hidroxibup (mz 256rarr mz 238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz 80) F-
Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G- Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr mz
244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz 134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz
196rarr mz 80) Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
Figura 24 - Cromatograma obtido atraveacutes da analise de amostras de soro de pacientes tratados
com vareniclina (10 mg 2xdia) Os pacientes fumavam em torno de 10 cigarrosdia no dia da
coleta A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz 240rarr mz 131) C- hidroxibup (mz 256rarr mz
238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz 80) F- Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G-
Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr mz 244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz
134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz 196rarr mz 80) Fonte do autor e do
colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
68
Tabela 6 - Paracircmetros de validaccedilatildeo obtidos na determinaccedilatildeo de faacutermacos antitabagismo em soro humano
Meacutedia plusmn Desvio padratildeo (n=6) amenor bmeacutedio e calto niacutevel de calibraccedilatildeo 1Estabilidade de bancada (4 a 24 horas) Precisatildeo RSD = [Desvio padratildeomeacutedia] x 100 E = [(Meacutedia experimental da
concentraccedilatildeo Concentraccedilatildeo nominal) x 100] ndash 100 2Efeito matriz E= [(Meacutedia da concentraccedilatildeo experimental no solventeMeacutedia experimental da concentraccedilatildeo no soro) x 100] ndash 100
Paracircmetros de validaccedilatildeo Vareniclina Bupropiona Hidroxibupropiona Nicotina Cotinina Hidroxicotinina
Intervalo linear (microg L-1) 5-100 1-1000 1-2000 5-1000 5-1000 5-1000
r2 ( n=6) 09952 09998 09998 09997 09998 09999
Decliacutenio (α) ( n=6) 00196plusmn 00095 00045plusmn00059 00051plusmn00057 00087plusmn00012 00073plusmn00048 00075plusmn00074
Intercepto ( n=6) -00316plusmn00004 -00022plusmn00020 00230plusmn00025 -00046plusmn00065 00767plusmn00012 01918plusmn00013
Tempo de retenccedilatildeo (min) 521 501 485 497 446 441
LD (microg L-1) 25 07 06 19 24 37
LQ (microg L-1) 50 10 10 50 50 50
Precisatildeo intra-ensaio RSD ( n=6) 93a
30a
100c
153a
37b
21c
140a
06b
06c
90a
26b
11c
117a
34b
61c
128a
138b
92c
Precisatildeo inter-ensaio RSD ( n=18 trecircs dias) 185a
115b
66c
82a
27b
20c
109a
17b
10c
83a
27b
14c
158a
41b
31c
161a
44b
92c
Acuraacutecia intra-ensaio E ( n=6) 196a
54b
-30c
-55a
-24b
-11c
-65a
19b
-04c
158a
09b
-26c
-87a
47b
-24c
71a
18b
05c
Acuraacutecia inter-ensaio E ( n=18 trecircs dias) 82a
-16b
035c
41a
-01b
-01c
-87a
27b
-20c
146a
40b
018c
-120a
25b
-110c
58a
-35b
30c
Recuperaccedilatildeo da extraccedilatildeo ( n=3) 883a
1104b
1014c
1101a
1009b
1028c
945a
1094b
1078c
1098a
1088b
1146c
941a
1093b
1116c
1167a
1112b
1141c
Estabilidade1 E
( n=6)
98a
11b
-50c
71a
-32b
-38c
140a
-16b
-79c
40a
-79b
-110c
-132a
-94b
-32c
86a
125b
-54c
Efeito matriz2 E
( n=6)
-117a
104b
14c
101a
09b
28c
-55a
94b
78c
98a
88b
146c
-59a
93b
116c
167a
112b
141c
69
525 Dados cliacutenicos e demograacuteficos dos pacientes submetidos a mensuraccedilatildeo dos
analitos
As Tabelas 7 a 10 mostram as caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos
pacientes submetidos agraves anaacutelises de concentraccedilatildeo dos analitos
As Tabelas 7 e 8 referem-se aos pacientes tratados com vareniclina sendo
considerado o grupo total e os grupos de desfecho respectivamente Os pacientes do
grupo resistente agrave vareniclina fumavam um maior nuacutemero de cigarrosdia (antes do
tratamento) em comparaccedilatildeo com os pacientes que obtiveram sucesso (21 vs 17
cigarrosdia P= 005)
As Tabelas 9 e 10 referem-se aos pacientes tratados com bupropiona no grupo
total e de acordo com desfecho respectivamente O grupo resistente ao tratamento com
bupropiona apresentou maior frequecircncia de pacientes com alta DN (atraveacutes dos escores
FTND e Issa categorizados) e de pacientes que fumavam no dia da coleta em
comparaccedilatildeo ao grupo sucesso (FTNDge6= 833 vs 429 P= 005 Escore Issage3=
1000 vs 429 P= 0001 fumo no dia da coleta= 1000 vs 429 P= 0001
respectivamente)
Tabela 7 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos (n= 74)
Idade (anos) 51 plusmn 12
Gecircnero mulheres () 500
Etnia autodeclarada brancos () 730
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 263 plusmn 49
10 1 4 1
7 1 3 1
8 1 3 1
9 1 3 1
8 1 4 1
5 0 3 1
8 1 4 1
8 1 4 1
7 1 4 1
7 1 3 1
9 1 3 1
7 1 4 1
Cigarrosdia inicial 19 plusmn 10
Fumo no dia da coleta () 919
FTND 62 plusmn 23
FTND ge 6 () 644
70
Escore Issa ge 3 () 851
Hipertensatildeo () 311
Dislipidemia () 392
Diabetes melito tipo 2 () 95
Depressatildeo () 135
Ansiedade () 176
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash
Fagerstroumlm test for nicotine dependence (escala de 0 a 10 pontos)
Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala de 0 a 4
pontos)
Tabela 8 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com o
desfecho de tratamento
Resistente (n=41) Sucesso (n=33) P valor
Idade (anos) 53 plusmn 11 49 plusmn 13 023
Gecircnero mulheres () 561 424 024
Etnia autodeclarada brancos () 683 788 031
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 270 plusmn 40 255 plusmn 58 028
Cigarrosdia 21 plusmn 11 17 plusmn 7 005
Fumo no dia da coleta () 976 848 008
FTND 65 plusmn 22 57 plusmn 23 019
FTND ge 6 () 659 625 077
Escore Issa ge 3 () 829 879 075
Hipertensatildeo () 390 212 010
Dislipidemia () 341 455 032
Diabetes melito tipo 2 () 73 121 069
Depressatildeo () 122 152 071
Ansiedade () 146 212 046
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fagerstroumlm test for nicotine
dependence (escala de 0 a 10 pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
71
Tabela 9 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos (n= 31)
Idade (anos) 52 plusmn 11
Gecircnero mulheres () 71
Etnia autodeclarada brancos () 931
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 258 plusmn 57
Cigarrosdia inicial 21 plusmn 7
Fumo no dia da coleta () 871
FTND 68 plusmn 21
FTND ge 6 () 742
Escore Issa ge 3 () 871
Hipertensatildeo () 226
Dislipidemia () 323
Diabetes melito tipo 2 () 32
Depressatildeo () 65
Ansiedade () 194
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash
Fagerstroumlm test for nicotine dependence (escala de 0 a 10
pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
Tabela 10 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com
o desfecho de tratamento
Resistente (n=24) Sucesso (n=7) Valor de P
Idade (anos) 53 plusmn 11 50 plusmn 11 054
Gecircnero mulheres () 708 714 100
Etnia autodeclarada brancos () 957 833 038
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 252 plusmn 61 278 plusmn 35 015
Cigarrosdia 21 plusmn 7 23 plusmn 7 071
Fumo no dia da coleta () 1000 429 0001
FTND 73 plusmn 15 54 plusmn 32 011
FTND ge 6 () 833 429 005
Escore Issa ge 3 () 1000 429 0001
Hipertensatildeo () 292 00 016
72
Dislipidemia () 375 143 038
Diabetes melito tipo 2 () 42 00 100
Depressatildeo () 83 00 100
Ansiedade () 250 00 029
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fagerstroumlm test for nicotine
dependence (escala de 0 a 10 pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
526 Anaacutelise de associaccedilatildeo dos analitos com desfecho de tratamento
A Tabela 11 mostra a frequecircncia do desfecho de tratamento de acordo com os
medicamentos antitabagismo pacientes estes cujas amostras de soro foram submetidas agrave
mensuraccedilatildeo dos analitos
Tabela 11 ndash Frequecircncia do desfecho de tratamento nos pacientes submetidos agraves
anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com os medicamentos
antitabagismo
Medicamento Resistente () Sucesso ()
Vareniclina (n=74) 544 446
Bupropiona (n=31) 774 226
As Tabelas de 12 a 15 mostram as concentraccedilotildees dos analitos nas amostras de
soro dos pacientes tratados com vareniclina e bupropiona no grupo total e de acordo
com o desfecho de tratamento
Os pacientes do grupo resistente tanto os pacientes tratados com vareniclina
(Tabela 13) quanto com bupropiona (Tabela 15) apresentaram concentraccedilatildeo
significativamente maior de cotinina e hidroxicotinina do que os grupos sucesso
(tratamento com vareniclina cotinina= 1182 vs 706 μgL P= 0009 hidroxicotinina=
845 vs 516 μgL P= 002 Tratamento com bupropiona cotinina= 1346 vs 160 μgL
P= 0005 hidroxicotinina= 972 vs 374 μgL P= 0004) No entanto quanto ao NMR
natildeo houve diferenccedila entre os desfechos de tratamento de ambos os faacutermacos Aleacutem
73
disso somente o grupo de pacientes tratados com vareniclina continha pacientes com
NMRlt031 (metabolizadores lentos para nicotina) e ainda sua frequecircncia foi baixa
(100 e 43 para os grupos de desfecho resistente e sucesso respectivamente)
Tabela 12 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos pacientes tratados
com vareniclina
Vareniclina μgL n=71 83 (81 ndash 95)
Nicotina μgL n=31 75 (76 ndash 112)
Cotinina μgL n=65 1007 (923 ndash 1225)
Hidroxicotinina μgL n=65 681 (638 ndash 874)
NMR n=63 069 (067 ndash 102)
NMR lt031 () n=63 79
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de
95) NMR=trans-3-hidroxicotininacotinina NMR lt031=
metabolizador lento NMR ge031= metabolizador normal e raacutepido A
hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo
trans-3- hidroxicotinina para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade
de outros isocircmeros satildeo irrelevantes
Tabela 13 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de tratamento
com vareniclina
Resistente Sucesso P
valor Vareniclina μgL n=71 84 (78 ndash 99) 83 (77 ndash 97) 096
Nicotina μgL n=31 83 (74 ndash 127) 70 (59 ndash 105) 032
Cotinina μgL n=65 1182 (1012 ndash 1426)
111114143ndash
1421426)
706 (643 ndash 1037) 0009
Hidroxicotinina μgL n=65 845 (702 ndash 1032) 516 (434 ndash 721) 002
NMR n=63 074 (062 ndash 107) 061 (055 ndash 113) 064
NMR lt031 () n=63 100 43 064
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de 95) NMR=trans-3-
hidroxicotininacotinina NMR lt031= metabolizador lento NMR ge031= metabolizador normal e
raacutepido A hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3- hidroxicotinina
para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros satildeo irrelevantes
74
Tabela 14 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos pacientes tratados
com bupropiona
Bupropiona μgL n=30 369 (332 ndash 493)
Hidroxibupropiona μgL n=23 7368 (5860 ndash 7824)
Nicotina μgL n=13 71 (62 ndash 109)
Cotinina μgL n=27 1159 (971 ndash 1648)
Hidroxicotinina μgL n=28 931 (838 ndash 1387)
NMR n=27 090 (074 ndash 149)
NMR lt031 () n=27 0
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de 95) NMR=
trans-3-hidroxicotininacotinina NMR lt031= metabolizador lento NMR
ge031= metabolizador normal e raacutepido Natildeo houve pacientes com NRM lt031 A
hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3-
hidroxicotinina para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros
satildeo irrelevantes
Tabela 15 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de tratamento
com bupropiona
Resistente Sucesso P
valor Bupropiona μgL n=30 372 (331 ndash 533) 300 (214 ndash 481) 048
Hidroxibupropiona μgL n=23 7795 (6078 ndash 8308) 5128 (2957 ndash 8195) 012
Nicotina μgL n=13 71 (62 ndash 109) - -
Cotinina μgL n=27 1346 (1097 ndash 1784) 160 (-195 ndash 712) 0005
Hidroxicotinina μgL n=28 972 (929 ndash 1520) 374 (33 ndash 847) 0004
NMR n=27 084 (076 ndash 109) 132 (-371 ndash 884) 014
NMR lt031 () n=27 0 0 -
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de 95) NMR= trans-3-
hidroxicotininacotinina NMR lt031= metabolizador lento NMR ge031= metabolizador normal e raacutepido
No grupo sucesso somente 1 paciente apresentou concentraccedilatildeo de nicotina Natildeo houve pacientes com NRM
lt031 A hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3- hidroxicotinina para o
caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros satildeo irrelevantes
75
6 DISCUSSAtildeO
61 Para os dados da anaacutelise de expressatildeo gecircnica
O presente estudo cliacutenico e exploratoacuterio identificou resultados significativos para
expressatildeo dos genes CHRNA7 e CHRNG de acordo com os tempos de coleta e o
desfecho de tratamento com vareniclina Amostras do grupo resistente nos tempos T2 e
T4 isto eacute jaacute com o uso da vareniclina apresentaram menores niacuteveis de expressatildeo
gecircnica do CHRNA7 comparado agraves amostras do T0 (antes de iniciar o tratamento
farmacoloacutegico) Estes resultados sugerem que o downregulation de α7 pode ter sido
responsaacutevel pela natildeo cessaccedilatildeo do fumo nos indiviacuteduos do grupo resistente o que natildeo foi
observado nas amostras do grupo sucesso
O gene CHRNA7 codifica a subunidade α7 dos nAChRs Esta possui grande
importacircncia estaacute presente em diversos tecidos e possui associaccedilatildeo consistente em
vaacuterios estudos com o processo de dependecircncia agrave nicotina processos cognitivos e
imunoloacutegicos 119-124 Estudos tambeacutem mostraram que haacute um locus contendo duplicaccedilatildeo
do gene CHRNA7 truncada composta pelos exons 5-10 do gene CHRNA7 precidida de
4 exons uacutenicos e uma deleccedilatildeo de dois pares de bases no eacutexon 6 o qual nomearam como
CHRNFAN7 A maioria dos indiviacuteduos possui uma ou duas coacutepias deste gene e satildeo
raros os casos em que esta coacutepia natildeo estaacute presente 125 126
No ceacuterebro de ratos Sprague-Dawley Ryan e Loiacono 119 detectaram niacuteveis de
α7 transcritos em diversos locais como na substacircncia negra compacta (SNpc) na
substacircncia negra reticular (SNpr) na aacuterea tegmental ventral (VTA) no coacutertex e no
hipocampo Os ratos submetidos ao tratamento crocircnico com nicotina mostraram maiores
niacuteveis de mRNA da subunidade α7 em SNpc SNpr e VTA em comparaccedilatildeo ao grupo
controle A VTA faz parte do sistema de recompensa mesoliacutembico o qual eacute muito
estudado nos processos de ND 12 15 No presente estudo (em amostras de PBMC) o
76
grupo de pacientes resistentes tambeacutem apresentou maior expressatildeo de α7 no momento
em que somente a nicotina estava presente no fumo crocircnico Ao introduzir a vareniclina
as expressotildees foram diminuiacutedas nos tempos T2 e T4 provavelmente devido ao
antagonismo competitivo da vareniclina com a nicotina no receptor
Benhammou et al 127 realizaram um estudo com amostras de ceacuterebro post mortem
de fumantes e com amostras de sangue de voluntaacuterios fumantes e natildeo fumantes Atraveacutes
do uso de nicotina radiomarcada nas amostras de ceacuterebro mostraram que os siacutetios de
ligaccedilatildeo agrave nicotina foram aumentados proporcionamente conforme o nuacutemero de cigarros
por dia O mesmo estudo ao analizar a expressatildeo gecircnica e proteiacutenas em linfoacutecitos e
ceacutelulas polimorfonucleares para um subconjunto de subunidades de receptores
nicotiacutenicos essas ceacutelulas assim como no tecido cerebral exibiram maiores nuacutemeros de
siacutetios de ligaccedilatildeo de alta afinidade agrave nicotina em fumantes em comparaccedilatildeo com natildeo
fumantes
A vareniclina em estudos funcionais mostrou ter atividade agonista total nos
receptores α7 40 Em um estudo realizou-se o tratamento crocircnico com vareniclina eou
nicotina em camundongos (10 dias) os niacuteveis das drogas no ceacuterebro e no plasma e a
toleracircncia e a expressatildeo de 4 subtipos de nAChR apoacutes dose aguda de nicotina foram
checados usando autoradiografia O upregulation de receptores α4β2 devido ao
tratamento crocircnico com vareniclina foi similar ao promovido pela nicotina e tambeacutem
ocorreu dowregulation de α6β2 assim como ocorreu com o uso de nicotina A
vareniclina aumentou significantemente os siacutetios de α3β4 e α7 enquanto a nicotina teve
menor efeito nestes siacutetios A combinaccedilatildeo da nicotina com a vareniclina foi similar agrave
vareniclina sozinha para os siacutetios de α3β4 enquanto para o siacutetio de α7 a combinaccedilatildeo
promoveu upregulation em menos regiotildees cerebrais em comparaccedilatildeo com a vareniclina
em monoterapia 77
77
No presente estudo os pacientes do grupo resistente apresentaram efeito
semelhante associado ao uso combinado de vareniclina e nicotina (devido ao fumo) os
niacuteveis de expressatildeo de CHRNA7 natildeo foram mantidos como nos pacientes que obtiveram
sucesso no tratamento No entanto o grupo sucesso soacute estava utilizando a vareniclina na
ausecircncia de nicotina entre os tempos T2 e T4 o que sugere que esse dowregulation
pode ocorrer em subgrupo de resposta
Diversos estudos mostraram diferenccedilas na expressatildeo gecircnica de a7 em
amostras de pacientes com diagnoacutesticos psiquiaacutetricos em comparaccedilatildeo com indiviacuteduos
sadios 102 128-134
Kunii et al 128 mostraram diferenccedila na expressatildeo de a7 em coacutertex preacute-frontal
dorsolateral post mortem de pacientes com depressatildeo ansiedade e transtorno bipolar e
inuacutemeros estudos mostraram menores niacuteveis de expressatildeo de α7 em pacientes com
esquizofrenia 102 129-134
Estudos de indiviacuteduos com esquizofrenia satildeo oacutetimos modelos para o
entendimento da importacircncia do receptor a7 em processos cognitivos em ND e em
como esses mecanismos estatildeo intimamente relacionados Diversos estudos mostraram
que haacute uma maior prevalecircncia de tabagismo em indiviacuteduos com esquizofrenia
comparados agrave populaccedilatildeo geral 135 136
Mexal el al 102 realizaram um estudo com amostras de ceacuterebro post mortem
provenientes de indiviacuteduos de 4 grupos distintos controle natildeo fumante controle
fumante pacientes com esquizofrenia natildeo fumantes e pacientes com esquizofrenia
fumantes O estudo realizou ensaio de expressatildeo de mRNA e de proteiacutena atraveacutes de
PCR quantitativo em tempo real e western blot As sondas da PCR foram desenhadas
para amplificar o gene completo CHRNA7 e sua coacutepia duplicada o CHRFAM7A Natildeo
fumantes com esquizofrecircnia apresentaram expressatildeo reduzida de mRNA e de proteiacutena
78
em relaccedilatildeo aos pacientes com esquizofrenia fumantes Natildeo fumantes com esquizofrenia
apresentaram menor expressatildeo em relaccedilatildeo ao controle natildeo fumante mas essa diferenccedila
foi estatisticamente significativa apenas no niacutevel do mRNA Outros estudos post
mortem cerebral mostraram menor expressatildeo dos receptores nicotiacutenicos no coacutertex e no
hipocampo de indiviacuteduos com esquizofrecircnia comparado aos controles saudaacuteveis 129-134
O CHRFAM7A assim como o CHRNA7 eacute polimoacuterfico e variantes neste gene
foram associadas agrave patologia auditoacuteria em casos de esquizofrenia Processos
diferenciados nos mecanismos de transcriccedilatildeo podem contribuir para um funcionamento
anormal de a7 como variaccedilotildees em promotor splicing alternativo eou desequiliacutebrio de
ligaccedilatildeo com o SNP do gene de neuroregulina -1 (gene que codifica moleacutecula de adesatildeo
celular envolvida em processos de neuroplasticidade sinaacuteptica) Estes processos podem
estar envonvidos em endofenoacutetipos da doenccedila 122 126 137-144
A nicotina parece melhorar a audiccedilatildeo em indiviacuteduos com deacuteficit auditoacuterio na
esquizofrenia associado ao α7 permitindo uma melhor filtragem dos estiacutemulos
auditivos estranhos A nicotina melhora a cogniccedilatildeo na esquizofrenia e agentes
alternativos que ativam o receptor nicotiacutenico foram testados e esses compostos
melhoraram a atenccedilatildeo a memoacuteria de trabalho e os sintomas negativos em um estudo
complementar de pacientes natildeo fumantes com esquizofrenia 145
Os estudos citados nos mostram grandes evidecircncias da associaccedilatildeo do α7 com
ND processos cognitivos e de resposta agrave vareniclina Esses achados podem explicar
nossos resultados em relaccedilatildeo agrave diminuiccedilatildeo da expressatildeo de 7 no grupo de pacientes
resistentes ao tratamento Os pacientes do grupo sucesso mantiveram os niacuteveis de
expressatildeo gecircnica em resposta agrave vareniclina jaacute no grupo resistente houve um
dowregulation Sugerimos que essa diminuiccedilatildeo pode ter sido a responsaacutevel ao menos
em parte pelos indiviacuteduos natildeo terem conseguido deixar de fumar A nicotina pode estar
79
compensando um deacuteficit de α7 que os indiviacuteduos resistentes podem apresentar No
entanto natildeo sabemos como seria a expressatildeo de α7 nestes indiviacuteduos na ausecircncia do
fumo
Quanto ao gene CHNRG natildeo haacute muitos resultados na literatura Este codifica
a subunidade γ dos receptores nicotiacutenicos A maioria dos estudos aponta associaccedilatildeo da
subunidade com distuacuterbios esqueleacutetico-musculares 146-149
No entanto King et al 65 encontraram a associaccedilatildeo de polimorfismos neste
gene com nausea no tratamento com vareniclina E Keskitalo-Vuokko 150 et al
encontraram associaccedilatildeo de SNPs em loci do cluster de genes CHRNGCHRND (genes
muitos proacuteximos o uacuteltimo codifica a subunidade delta dos nAChRs) com o niacutevel de
cotinina Saccone et al 151 encontraram a associaccedilatildeo de 4 loci no cluster
CHRNDCHRNG com ND Em outro estudo variantes nos genes CHRNDCHRNG
mostraram associaccedilatildeo modesta com o risco de ND em amostras de afro-americanos 152
Em um estudo o qual foi utilizado um modelo de esquizofrenia em ratos no
grupo de animais tratados com clozapina foi encontrado downregulation do Chrng no
nuacutecleo accumbens Neste mesmo estudo Santoro et al natildeo conseguiram formular uma
hipoacutetese para o achado devido ao lack de informaccedilotildees na literatura com o foco em ND
ou performance cognitiva 153
Haacute algumas limitaccedilotildees no estudo Primeira o ensaio da anaacutelise de expressatildeo
gecircnica foi realizado com amostras de sangue perifeacuterico e natildeo no SNC o que poderia nos
mostrar uma relaccedilatildeo mais clara e direta do faacutermaco com a via de resposta No entanto a
obtenccedilatildeo desta amostra eacute inviaacutevel Em contrapartida estudos jaacute demonstraram que haacute
similaridade entre a expressatildeo gecircnica de ceacutelulas do SNC e de ceacutelulas de sangue
perifeacuterico para alguns destes genes de receptores nicotiacutenicos 102 Segunda natildeo foi
realizado ensaio de expressatildeo gecircnica para amostras de indiviacuteduos natildeo fumantes o que
80
poderia fornecer mais paracircmetros de comparaccedilatildeo com os grupos resistente e sucesso
Terceira natildeo conseguimos qualidade necessaacuteria nas anaacutelises de genes potencialmente
importantes
62 Para os dados da mensuraccedilatildeo dos analitos
Um dos maiores desafios em anaacutelises de amostras bioloacutegicas eacute eliminar os
interferentes de sua matriz sem alterar substancialmente as quantidades dos analitos
presentes A matriz de amostras de soro e plasma satildeo complexas e envolve a presenccedila
de inuacutemeras macromoleacuteculas como lipiacutedios e proteiacutenas que obstruem colunas anaacuteliticas
diminuem o tempo de duraccedilatildeo de equipamentos e inviabilizam a interpretaccedilatildeo dos
dados devido a imensos picos e ruiacutedos formados nos cromatogramas e espectros de
massa Inumeros trabalhos executam uma preparaccedilatildeo preacutevia das amostras que envolve
processos como a extraccedilatildeo com uso de solventes preciptaccedilatildeo de proteiacutenas entre outros
os quais podem promover uma baixa recuperaccedilatildeo dos analitos tempo prolongado de
bancada e gasto de materiais 51 104-106
Devido agrave esse fato inuacutemeros estudos propuseram o uso de materiais de acesso
restrito (RAMs) para a purificaccedilatildeo da amostra sem tanto manuseio dentre eles estatildeo os
nanotubos de carbono (CNTs) modificados 109 110 114-116
O presente estudo desenvolveu uma coluna extratora composta por nanotubos
hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados quimicamente com a adiccedilatildeo de grupos
hidrofiacuteficos Essa coluna permitiu uma oacutetima exclusatildeo de macromoleacuteculas (98) A
aacutegua ultra pura foi o suficiente para ser utilizada como fase moacutevel de carregamento o
que eacute sustentaacutevel aleacutem de natildeo causar danos ao meio ambiente e o uacutenico preparo da
amostra foi uma diluiacuteccedilatildeo 11 tambeacutem em aacutegua O novo RAM desenvolvido foi
81
encaminhado para pedido de patente (Anexo 5) e portanto os processos para o seu
desenvolvimento foram mantidos em sigilo
Os CNTs possuem uma grande aacuterea superfiacutecial e oacutetima estabilidade em anaacutelise
de compostos no entanto o material natildeo promove a remoccedilatildeo de proteiacutenas com
eficiecircncia 110 115 Os poros dos CNTs formam uma barreira fiacutesica excluindo ou
permitindo a entrada de moleacuteculas por tamanho e os grupos hidrofiacutelicos adicionados ao
RAM desenvolvido natildeo permitem a ligaccedilatildeo de proteiacutenas de forma irreversiacutevel
formando uma barreira fiacutesico-quiacutemica Os demais CNTs natildeo modificados disponiacuteveis
natildeo promovem a exclusatildeo de macromoleacuteculas com tanta efetividade quanto o material
desenvolvido aleacutem disso o novo RAM apoacutes limpeza pode ser reutilizado cerca de 400
vezes (valor calculado durante os experimentos com amostras controle)
Quanto a otimizaccedilatildeo do meacutetodo de mensuraccedilatildeo a anaacutelise multidimensional
atraveacutes de equipamentos conectados por vaacutelvulas comutadoras promoveu a realizaccedilatildeo
da extraccedilatildeo eluiccedilatildeo anaacutelise limpeza e recondicionamento do sistema automaacuteticamente
A anaacutelise completa de uma amostra foi realizada em apenas 15 minutos O sistema
permitiu a mensuraccedilatildeo conjunta de diversos analitos com caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas
diferentes de uma mesma amostra mostrando bons sinais analiacuteticos e perfis
cromatograacuteficos
Quanto aos dados de validaccedilatildeo o meacutetodo permitiu uma oacutetima recuperaccedilatildeo dos
analitos com valores proacuteximos a 100 semelhante a outros estudos 104 117 154 155 A
maior dificuldade encontrada neste estudo foi a configuraccedilatildeo de paracircmetros
espectromeacutetricos e cromatograacuteficos que pudessem obter o maacuteximo de recuperaccedilatildeo e o
menor LQ possiacutevel para a anaacutelise de vareniclina ainda em um contexto de anaacutelise
multianalito
82
A dose posoloacutegica da vareniclina eacute muito baixa (1mg 2 vezes ao dia a partir do
8deg dia de tratamento) em comparaccedilatildeo com a da bupropiona (150 mg 2 vezes ao dia a
partir do 8deg dia de tratamento) dessa forma as concentraccedilotildees plasmaacuteticas de
vareniclina satildeo muito baixas Apesar do valor de LQ obtido (5 μg L-1) estar entre as
meacutedias plasmaacuteticas de intervalo terapecircutico (40 -70 μg L-1 de vareniclina em plasma e
soro) 51 118 ao mensurar amostras de pacientes em um cenaacuterio real de tratamento de 74
pacientes apenas 3 amostras apresentaram concentraccedilatildeo plasmaacutetica de vareniclina
abaixo do limite de quantificaccedilatildeo
Quanto a recuperaccedilatildeo do analito da matriz a vareniclina tambeacutem mostrou menor
taxa (883) em relaccedilatildeo aos outros analitos (valores proacuteximos ao 100) no entanto
essa taxa de recuperaccedilatildeo eacute considerada alta e foi semelhante ao estudo de Dobrinas et al
156 o qual realizou a extraccedilatildeo da amostra atraveacutes de coluna extratora de fase soacutelida
(SPE) disponiacutevel no mercado e a mensuraccedilatildeo tambeacutem foi realizada em um contexto
multianalito E ainda a recuperaccedilatildeo de vareniclina no presente estudo foi maior do que
a obtida pelo trabalho de Al-Haj et al 105 o qual realizou a preparaccedilatildeo preacutevia da amostra
por extraccedilatildeo liacutequido-liacutequido (LLE) e a mensuraccedilatildeo foi realizada para somente um
analito (4759 - 4872) e obteve recuperaccedilatildeo semelhante ao estudo de os qual
tambeacutem realizou a anaacutelise de vareniclina em um cenaacuterio multianalito (830 ndash 920)
Para nicotina e cotinina os valores de LQ obtidos no presente estudo (50 μg L-1)
se assemelham aos obtidos nos estudos de Abdallah et al 104 (70 μg L-1 para cotinina)
Onoue et al 157 (50 μg L-1 para nicotina e cotinina) Petersen et al 117 (50 μg L-1) Para
bupropiona e hidroxibupropiona o meacutetodo proposto eacute capaz de mensurar pequenas
quantidades do faacutermaco e de seu metaboacutelito (LQ 10 μg L-1 para ambos) quantidades
menores do que os LQs obtidos nos estudos de 158 (55 para bupropiona e 60 μgL para
83
hidroxibupropiona) e de 155 (100 μg L-1 para hidroxibupropiona) apesar das
concentraccedilotildees de metaboacutelitos em estado de equiliacutebrio em pacientes tratados com doses
terapecircuticas do faacutermaco serem bem maiores (45 ndash 75 μg L-1 e de 500 ndash 1500 μg L-1)
respectivamente para bupropiona e hidroxibupropiona 118
O Quadro 6 mostra os paracircmetros analiacuteticos do presente estudo comparados com
outros estudos presentes na literatura
Quanto agraves mensuraccedilotildees das amostras dos pacientes natildeo encontramos associaccedilatildeo
dos faacutermacos e seus metaboacutelitos com desfecho de tratamento Esse fato poderia ser
explicado pelo pequeno nuacutemero amostral do presente estudo
Encontramos diferenccedila significativa entre os grupos resistente e sucesso ao
tratamento quanto aos paracircmetros relacionados ao fumo e agrave DN Os pacientes do grupo
resistente tratados com vareniclina (ainda antes do iniacutecio do tratamento) fumavam um
maior nuacutemero de cigarrosdia em comparaccedilatildeo com os pacientes que obtiveram sucesso
O grupo resistente ao tratamento com bupropiona apresentou maior frequecircncia de
pacientes com alta DN (antes do tratamento) e de pacientes que fumavam no dia da
coleta em comparaccedilatildeo ao grupo sucesso Os dados tambeacutem mostraram que os pacientes
resistentes tratados com ambos os faacutermacos no dia da coleta apresentaram maiores
concentraccedilotildees dos metaboacutelitos da nicotina Esses dados podem indicar maior exposiccedilatildeo
ao fumo e maior DN podendo implicar na resposta ao tratamento antitabagismo
Haacute algumas limitaccedilotildees nesse estudo Primeira os pacientes natildeo fizeram exames
de funccedilatildeo hepaacutetica antes da inclusatildeo no entudo no entanto a presenccedila de comorbidades
hepaacuteticas foram questionadas Segunda natildeo podemos obter total rigor nos horaacuterios de
tomada dos medicamentos por parte dos pacientes no entanto os pacientes foram
84
orientados agrave tomar o medicamento sempre no mesmo horaacuterio e foram questionados
quanto ao cumprimento do protocolo Terceira o nuacutemero amostral para a anaacutelise dos
analitos e de NRM em estudos de associaccedilatildeo com desfecho de tratamento eacute considerado
modesto e consequentemente pode ter implicado nos resultados de natildeo associaccedilatildeo
85
Quadro 6 ndash Comparaccedilatildeo dos dados de validaccedilatildeo com outros estudos
Analitos Purificaccedilatildeo da
amostraextraccedilatildeo Meacutetodo Amostra Intervalo Linear (μg L-1) Recuperaccedilatildeo () LD μg L-1 LQ μg L-1 Referecircncia
Vareniclina
Bupropiona
Hidroxibupropiona
Nicotina
Cotinina
Hidroxicotinina
CS ndash SPE (novo
RAM) HPLC-MSMS Soro humano
50 ndash 1000
10 ndash 10000
10 ndash 20000
50 ndash 10000
50 ndash 10000
50 ndash 10000
883
1101
945
1098
941
1167
25
07
06
19
24
37
50
10
10
50
50
50
Presente
estudo
Nicotitna
Cotinina LLE (LCndashMSMS) Soro humano
03 ndash 525
70 ndash15000
978 ndash 1114
973 ndash1156 -
03
70
Abdalla et al 104
Bupropiona
Hidroxibupropiona PP + SPE online TFCndashMSMS) Soro humano 50 ndash 10000
1580
1160
13
45
55
60
Petrides et
al 158
Vareniclina LLE HPLCndashMSMS
(API) Plasma humano 01ndash100 4759 - 4872 005 01
Al-Haj et al 105
Vareniclina LLE HPLC-
APIMSMS
Plasma
Urina
01 - 500
10 ndash 5000 - -
lt01
100
Faessel et al 51
Nicotina
cotinina
trans-3 ndash
hidroxicotinina
vareniclina
SPE (Oasis MCX 10
mg 96-well extraction
plate)
UPLCndashMSMS
Soro humano
100 ndash 5000
100 ndash 5000
100 - 5000
100 ndash 2500
860 ndash 940
700 ndash 870
490 ndash 540
830 ndash 920
-
20
10
20
10
Dobrinas et
al 156
86
Nicotina
Cotinina Centrifugaccedilatildeo
Diluiccedilatildeo
isotoacutepica estaacutevel
ndash UPLC-
MSMS
Urina 50 ndash 350000 968ndash1051
943ndash992
07
04
17
11
Kuhn et al 154
Nicotina e Cotinina LLE PP SPE
(UPLC-
MSMS)
Sangue urina e
outros tecidos de
rato
100 ndash 6000 (plasma)
80 (nicotina e
cotininacom
precipitaccedilatildeo)
25 50 Onoue et al
157
Cotinina LL SPE (coluna
Zorbaxs XDB C8) HPLCUV Soro e urina 50 ndash 5000 978 ndash 102 018 50
Petersen et
al 117
hidroxibupropiona PP + SPE online RP‐HPLCUV Plasma humano 1000 - 25000 6118 1000 1000
Scherf-
Clavel et al 155
CS ndash SPE= Extraccedilatildeo em fase soacutelida no modo column switching LLE= extraccedilatildeo liacutequido-liacutequido PP=precipitaccedilatildeo de proteiacutenas SPE=extraccedilatildeo em fase soacutelida HPLC= cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia
UPLC=cromatografia liacutequida de ultra eficiecircncia RP‐HPLC=Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia em fase reversa TFC=Cromatografia liacutequida turbulenta API=ionizaccedilatildeo em pressatildeo atmosfeacutericaUV=
detector ultravioleta MSMS= espectometria de massas em tandem
87
7 CONCLUSOtildeES
Para a anaacutelise da expressatildeo gecircnica este estudo exploratoacuterio mostra a associaccedilatildeo
das subunidades α7 e γ com a efetividade do tratamento com vareniclina Estes
resultados poderiam contribuir ao menos em parte para o desenvolvimento de uma
terapecircutica individualizada
Para a mensuraccedilatildeo de analitos o novo RAM sintetizado eacute um produto de
extremo valor cientiacutefico podendo apresentar diversas aplicaccedilotildees em anaacutelise de amostras
de matrizes complexas sem muita preparaccedilatildeo preacutevia Para a associaccedilatildeo das
concentraccedilotildees dos faacutermacos e seus metaboacutelitos com o desfecho de tratamento satildeo
necessaacuterios estudos com um maior nuacutemero amostral
88
8 SUGESTOtildeES PARA ESTUDOS FUTUROS
Sugerimos estudos que promovam maior entendimento das subunidades α7 e γ
dos nAChRs nos processos de dependecircncia agrave nicotina e no tratamento com vareniclina
Sugerimos tambeacutem estudos de investigaccedilatildeo para novas aplicabilidades do novo RAM
desenvolvido
89
9 REFEREcircNCIAS
1 WHO Tobacco WHO Media Centre 2015
2 Oliveira AF Valente JG Leite IC [Aspects of tobacco attributable mortality
systematic review] Rev Saude Publica 200842(2)335-345
3 Koshiaris C Aveyard P Oke J Ryan R Szatkowski L Stevens R Farley A
Smoking cessation and survival in lung upper aero-digestive tract and bladder
cancer cohort study Br J Cancer 2017117(8)1224-1232
4 Leppanen T Toyras J Mervaala E Penzel T Kulkas A Severity of individual
obstruction events increases with age in patients with obstructive sleep apnea
Sleep Med 20173732-37
5 Cerda J Bambs C Vera C Infant morbidity and mortality attributable to
prenatal smoking in Chile Rev Panam Salud Publica 201741e106
6 Vigitel Brasil - Vigilacircncia de fatores de risco e proteccedilatildeo para doenccedilas crocircnicas
por inqueacuterito telefocircnico Estimativas sobre frequecircncia e distribuiccedilatildeo
sociodemograacutefica de fatores de risco e proteccedilatildeo para doenccedilas crocircnicas nas
capitais dos 26 estados brasileiros e no Distrito Federal em 2018 Brasiacutelia 2019
7 Rosemberg J Nicotina Droga Universal Instituto Nacional de Cacircncer
(wwwincagovbr) 2004
8 Kirchenchtein C Chatkin JM Dependecircncia da Nicotina In Diretrizes para
Cessaccedilatildeo do Tabagismo Jornal Brasileiro de Pneumologia Brasiacutelia DF 2004
9 Fagerstoumlm K Uma breve apresentaccedilatildeo da neurofarmacologia e fisiologia da
dependecircncia agrave nicotina In Gigliotti AP Presman S (Eds) Atualizaccedilatildeo no
Tratamento do Tabagismo ABP Sauacutede 2006
10 Gigliotti A Lemos T Quais satildeo os mecanismos da dependecircncia de nicotina
In Manual de Condutas e Praacuteticas em Tabagismo Sociedade Brasileira de
Pneumologia e Tisiologia 2012
11 Divisatildeo de Controle do Tabagismo Coordenaccedilatildeo de Accedilotildees Estrateacutegicas
Instituto Nacional de Cacircncer Silva AG Ministeacuterio da Sauacutede Protocolo cliacutenico
e diretrizes terapecircuticas dependecircncia agrave nicotina 2013
12 Schultz W Multiple reward signals in the brain Nat Rev Neurosci
20001(3)199-207
13 Stolerman IP Jarvis MJ The scientific case that nicotine is addictive
Psychopharmacology (Berl) 1995117(1)2-10 discussion 14-20
90
14 Koob GF Volkow ND Neurocircuitry of addiction Neuropsychopharmacology
200935(1)217-238
15 Martin-Soelch C Neuroadaptive changes associated with smoking structural
and functional neural changes in nicotine dependence Brain Sci 20133(1)159-
176
16 Boening JA Neurobiology of an addiction memory J Neural Transm (Vienna)
2001108(6)755-765
17 Robbins TW Everitt BJ Limbic-striatal memory systems and drug addiction
Neurobiol Learn Mem 200278(3)625-636
18 Everitt BJ Belin D Economidou D Pelloux Y Dalley JW Robbins TW
Review Neural mechanisms underlying the vulnerability to develop compulsive
drug-seeking habits and addiction Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci
2008363(1507)3125-3135
19 Fuentes RM Notkola IL Shemeikka S Tuomilehto J Nissinen A Familial
aggregation of blood pressure a population-based family study in eastern
Finland J Hum Hypertens 200014(7)441-445
20 Gotti C Zoli M Clementi F Brain nicotinic acetylcholine receptors native
subtypes and their relevance Trends Pharmacol Sci 200627(9)482-491
21 Benowitz NL Pharmacology of nicotine addiction smoking-induced disease
and therapeutics Annu Rev Pharmacol Toxicol 20094957-71
22 Benowitz NL Clinical pharmacology of inhaled drugs of abuse implications in
understanding nicotine dependence NIDA Res Monogr 19909912-29
23 Picciotto MR Zoli M Rimondini R Lena C Marubio LM Pich EM Fuxe K
Changeux JP Acetylcholine receptors containing the beta2 subunit are involved
in the reinforcing properties of nicotine Nature 1998391(6663)173-177
24 Maskos U Molles BE Pons S Besson M Guiard BP Guilloux JP Evrard A
Cazala P Cormier A Mameli-Engvall M Dufour N Cloez-Tayarani I
Bemelmans AP Mallet J Gardier AM David V Faure P Granon S Changeux
JP Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of
nicotinic receptors Nature 2005436(7047)103-107
25 Tapper AR McKinney SL Nashmi R Schwarz J Deshpande P Labarca C
Whiteaker P Marks MJ Collins AC Lester HA Nicotine activation of alpha4
receptors sufficient for reward tolerance and sensitization Science
2004306(5698)1029-1032
26 Aberger K Chitravanshi VC Sapru HN Cardiovascular responses to
microinjections of nicotine into the caudal ventrolateral medulla of the rat Brain
Res 2001892(1)138-146
91
27 Levin ED Bettegowda C Blosser J Gordon J AR-R17779 and alpha7
nicotinic agonist improves learning and memory in rats Behav Pharmacol
199910(6-7)675-680
28 Hajos M Hurst RS Hoffmann WE Krause M Wall TM Higdon NR Groppi
VE The selective alpha7 nicotinic acetylcholine receptor agonist PNU-282987
[N-[(3R)-1-Azabicyclo[222]oct-3-yl]-4-chlorobenzamide hydrochloride]
enhances GABAergic synaptic activity in brain slices and restores auditory
gating deficits in anesthetized rats J Pharmacol Exp Ther 2005312(3)1213-
1222
29 Salas R Orr-Urtreger A Broide RS Beaudet A Paylor R De Biasi M The
nicotinic acetylcholine receptor subunit alpha 5 mediates short-term effects of
nicotine in vivo Mol Pharmacol 200363(5)1059-1066
30 Henningfield JE Stapleton JM Benowitz NL Grayson RF London ED Higher
levels of nicotine in arterial than in venous blood after cigarette smoking Drug
Alcohol Depend 199333(1)23-29
31 Hukkanen J Jacob P 3rd Benowitz NL Metabolism and disposition kinetics of
nicotine Pharmacol Rev 200557(1)79-115
32 Dempsey D Tutka P Jacob P 3rd Allen F Schoedel K Tyndale RF Benowitz
NL Nicotine metabolite ratio as an index of cytochrome P450 2A6 metabolic
activity Clin Pharmacol Ther 200476(1)64-72
33 Allenby CE Boylan KA Lerman C Falcone M Precision Medicine for
Tobacco Dependence Development and Validation of the Nicotine Metabolite
Ratio J Neuroimmune Pharmacol 201611(3)471-483
34 Llaquet H Pichini S Joya X Papaseit E Vall O Klein J Garcia-Algar O
Biological matrices for the evaluation of exposure to environmental tobacco
smoke during prenatal life and childhood Anal Bioanal Chem 2010396(1)379-
399
35 Reichert J AA Gonccedilalves CMC Godoy I Chatkin JM Sales MPU et al
Diretrizes da Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisologia Diretrizes para
cessaccedilatildeo do tabagismo ndash 2008 J Bras Pneumol 200834(10)845-880
36 Fiore MC Jaeacuten C R Baker TB Treating tobacco use and dependence 2008
update Clinical Practice Guideline In services USDohah ed Public Health
Service Rockville (md) 2008
37 Kassem MG Al Hossaini AM Varenicline Profiles Drug Subst Excip Relat
Methodol 201237389-411
38 Zoli M Lena C Picciotto MR Changeux JP Identification of four classes of
brain nicotinic receptors using beta2 mutant mice J Neurosci
199818(12)4461-4472
92
39 Hogg RC Raggenbass M Bertrand D Nicotinic acetylcholine receptors from
structure to brain function Rev Physiol Biochem Pharmacol 20031471-46
40 Mihalak KB Carroll FI Luetje CW Varenicline is a partial agonist at
alpha4beta2 and a full agonist at alpha7 neuronal nicotinic receptors Mol
Pharmacol 200670(3)801-805
41 Swan GE Javitz HS Jack LM Wessel J Michel M Hinds DA Stokowksi RP
McClure JB Catz SL Richards J Zbikowski SM Deprey M McAfee T Conti
DV Bergen AW Varenicline for smoking cessation nausea severity and
variation in nicotinic receptor genes Pharmacogenomics J 201212(4)349-358
42 Kaur K Kaushal S Chopra SC Varenicline for smoking cessation A review of
the literature Curr Ther Res Clin Exp 200970(1)35-54
43 Catz SL Jack LM McClure JB Javitz HS Deprey M Zbikowski SM McAfee
T Richards J Swan GE Adherence to varenicline in the COMPASS smoking
cessation intervention trial Nicotine Tob Res 201113(5)361-368
44 Faessel HM Burstein AH Troutman MD Willavize SA Rohrbacher KD Clark
DJ Lack of a pharmacokinetic interaction between a new smoking cessation
therapy varenicline and digoxin in adult smokers Eur J Clin Pharmacol
200864(11)1101-1109
45 Mohanasundaram UM Chitkara R Krishna G Smoking cessation therapy with
varenicline Int J Chron Obstruct Pulmon Dis 20083(2)239-251
46 Faessel HM Smith BJ Gibbs MA Gobey JS Clark DJ Burstein AH Single-
dose pharmacokinetics of varenicline a selective nicotinic receptor partial
agonist in healthy smokers and nonsmokers J Clin Pharmacol 200646(9)991-
998
47 Faessel HM Obach RS Rollema H Ravva P Williams KE Burstein AH A
review of the clinical pharmacokinetics and pharmacodynamics of varenicline
for smoking cessation Clin Pharmacokinet 201049(12)799-816
48 Ravva P Gastonguay MR Tensfeldt TG Faessel HM Population
pharmacokinetic analysis of varenicline in adult smokers Br J Clin Pharmacol
200968(5)669-681
49 Obach RS Reed-Hagen AE Krueger SS Obach BJ OConnell TN Zandi KS
Miller S Coe JW Metabolism and disposition of varenicline a selective
alpha4beta2 acetylcholine receptor partial agonist in vivo and in vitro Drug
Metab Dispos 200634(1)121-130
50 Feng B Obach RS Burstein AH Clark DJ de Morais SM Faessel HM Effect
of human renal cationic transporter inhibition on the pharmacokinetics of
varenicline a new therapy for smoking cessation an in vitro-in vivo study Clin
Pharmacol Ther 200883(4)567-576
93
51 Faessel HM Gibbs MA Clark DJ Rohrbacher K Stolar M Burstein AH
Multiple-dose pharmacokinetics of the selective nicotinic receptor partial
agonist varenicline in healthy smokers J Clin Pharmacol 200646(12)1439-
1448
52 Slemmer JE Martin BR Damaj MI Bupropion is a nicotinic antagonist J
Pharmacol Exp Ther 2000295(1)321-327
53 Hughes JR Stead LF Lancaster T Antidepressants for smoking cessation
Cochrane Database Syst Rev 2007(1)CD000031
54 Goodnick PJ Pharmacokinetics of second generation antidepressants
bupropion Psychopharmacol Bull 199127(4)513-519
55 Hesse LM Venkatakrishnan K Court MH von Moltke LL Duan SX Shader
RI Greenblatt DJ CYP2B6 mediates the in vitro hydroxylation of bupropion
potential drug interactions with other antidepressants Drug Metab Dispos
200028(10)1176-1183
56 Faucette SR Hawke RL Lecluyse EL Shord SS Yan B Laethem RM Lindley
CM Validation of bupropion hydroxylation as a selective marker of human
cytochrome P450 2B6 catalytic activity Drug Metab Dispos 200028(10)1222-
1230
57 Walsky RL Astuccio AV Obach RS Evaluation of 227 drugs for in vitro
inhibition of cytochrome P450 2B6 J Clin Pharmacol 200646(12)1426-1438
58 Walsky RL Obach RS A comparison of 2-phenyl-2-(1-piperidinyl)propane
(ppp) 111-phosphinothioylidynetrisaziridine (thioTEPA) clopidogrel and
ticlopidine as selective inactivators of human cytochrome P450 2B6 Drug
Metab Dispos 200735(11)2053-2059
59 Quaak M van Schooten FJ van Schayck CP Pharmacogenetics of smoking
how far to the clinic Pharmacogenomics 201415(6)723-726
60 Swan GE Lessov-Schlaggar CN Tobacco addiction and pharmacogenetics of
nicotine metabolism J Neurogenet 200923(3)262-271
61 Tomaz PRX Kajita MS Santos JR Scholz J Abe TO Gaya PV Krieger JE
Pereira AC Santos P Cytochrome P450 2A6 and 2B6 polymorphisms and
smoking cessation success in patients treated with varenicline Eur J Clin
Pharmacol201975(11)1541-1545
62 Tomaz PRX Santos JR Scholz J Abe TO Gaya PV Negrao AB Krieger JE
Pereira AC Santos P Cholinergic receptor nicotinic alpha 5 subunit
polymorphisms are associated with smoking cessation success in women BMC
Med Genet201819(1)55
94
63 Scholz J Santos PC Buzo CG Lopes NH Abe TO Gaya PV Pierri H Amorim
C Pereira AC Effects of aging on the effectiveness of smoking cessation
medication Oncotarget 20167(21)30032-30036
64 Issa JS Santos PC Vieira LP Abe TO Kuperszmidt CS Nakasato M Cardoso
E Amorim C Pereira AC Smoking cessation and weight gain in patients with
cardiovascular disease or risk factor Int J Cardiol 2014172(2)485-487
65 King DP Paciga S Pickering E Benowitz NL Bierut LJ Conti DV Kaprio J
Lerman C Park PW Smoking cessation pharmacogenetics analysis of
varenicline and bupropion in placebo-controlled clinical trials
Neuropsychopharmacology 201237(3)641-650
66 Saccone NL Baurley JW Bergen AW David SP Elliott HR Foreman MG
Kaprio J Piasecki TM Relton CL Zawertailo L Bierut LJ Tyndale RF Chen
LS The Value of Biosamples in Smoking Cessation Trials A Review of
Genetic Metabolomic and Epigenetic Findings Nicotine Tob Res
201820(4)403-413
67 Rocha Santos J Tomaz PR Issa JS Abe TO Krieger JE Pereira AC Santos
PC CHRNA4 rs1044396 is associated with smoking cessation in varenicline
therapy Front Genet 2015646
68 Tomaz PR Santos JR Issa JS Abe TO Gaya PV Krieger JE Pereira AC
Santos PC CYP2B6 rs2279343 polymorphism is associated with smoking
cessation success in bupropion therapy Eur J Clin Pharmacol 2015
71(9)1067-73
69 David SP Brown RA Papandonatos GD Kahler CW Lloyd-Richardson EE
Munafo MR Shields PG Lerman C Strong D McCaffery J Niaura R
Pharmacogenetic clinical trial of sustained-release bupropion for smoking
cessation Nicotine Tob Res 20079(8)821-833
70 Lerman C Shields PG Wileyto EP Audrain J Pinto A Hawk L Krishnan S
Niaura R Epstein L Pharmacogenetic investigation of smoking cessation
treatment Pharmacogenetics 200212(8)627-634
71 Han DH Joe KH Na C Lee YS Effect of genetic polymorphisms on smoking
cessation a trial of bupropion in Korean male smokers Psychiatr Genet
200818(1)11-16
72 Zanger UM Klein K Pharmacogenetics of cytochrome P450 2B6 (CYP2B6)
advances on polymorphisms mechanisms and clinical relevance Front Genet
2013424
73 Zhu AZ Cox LS Nollen N Faseru B Okuyemi KS Ahluwalia JS Benowitz
NL Tyndale RF CYP2B6 and bupropions smoking-cessation pharmacology
the role of hydroxybupropion Clin Pharmacol Ther 201292(6)771-777
95
74 Laib AK Brunen S Pfeifer P Vincent P Hiemke C Serum concentrations of
hydroxybupropion for dose optimization of depressed patients treated with
bupropion Ther Drug Monit 201436(4)473-479
75 Hutchison KE Allen DL Filbey FM Jepson C Lerman C Benowitz NL Stitzel
J Bryan A McGeary J Haughey HM CHRNA4 and tobacco dependence from
gene regulation to treatment outcome Arch Gen Psychiatry 200764(9)1078-
1086
76 Smith RC Zhubi A Maloku E Sershen H Lajtha A Davis JM Costa E
Guidotti A Varenicline treatment decreases DNMT1 mRNA expression in
lymphocytes of schizophrenic patients who are cigarette smokers Schizophr
Res 2010119(1-3)269-270
77 Marks MJ ONeill HC Wynalda-Camozzi KM Ortiz NC Simmons EE Short
CA Butt CM McIntosh JM Grady SR Chronic treatment with varenicline
changes expression of four nAChR binding sites in mice Neuropharmacology
201599142-155
78 Middleton FA Pato CN Gentile KL McGann L Brown AM Trauzzi M Diab
H Morley CP Medeiros H Macedo A Azevedo MH Pato MT Gene
expression analysis of peripheral blood leukocytes from discordant sib-pairs
with schizophrenia and bipolar disorder reveals points of convergence between
genetic and functional genomic approaches Am J Med Genet B Neuropsychiatr
Genet 2005136B(1)12-25
79 Takahashi M Hayashi H Watanabe Y Sawamura K Fukui N Watanabe J
Kitajima T Yamanouchi Y Iwata N Mizukami K Hori T Shimoda K Ujike H
Ozaki N Iijima K Takemura K Aoshima H Someya T Diagnostic
classification of schizophrenia by neural network analysis of blood-based gene
expression signatures Schizophr Res 2010119(1-3)210-218
80 Lee J Goh LK Chen G Verma S Tan CH Lee TS Analysis of blood-based
gene expression signature in first-episode psychosis Psychiatry Res
2012200(1)52-54
81 Sullivan PF Fan C Perou CM Evaluating the comparability of gene expression
in blood and brain Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet
2006141B(3)261-268
82 Hennings JM Uhr M Klengel T Weber P Putz B Touma C Czamara D Ising
M Holsboer F Lucae S RNA expression profiling in depressed patients
suggests retinoid-related orphan receptor alpha as a biomarker for antidepressant
response Transl Psychiatry 20155e538
83 Ota VK Noto C Gadelha A Santoro ML Silva PN Melaragno MI Smith Mde
A Cordeiro Q Bressan RA Belangero SI Neurotransmitter receptor and
regulatory gene expression in peripheral blood of Brazilian drug-naive first-
96
episode psychosis patients before and after antipsychotic treatment Psychiatry
Res2013210(3)1290-1292
84 Kordi-Tamandani DM Tajoddini S Salimi F Promoter Methylation and BDNF
and DAT1 Gene Expression Profiles in Patients with Drug Addiction
Pathobiology 201582(2)94-99
85 Wongsriraksa A Parsons ME Whelan CJ Characterisation of nicotine receptors
on human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) Inflamm Res
200958(1)38-44
86 Kawashima K Fujii T Expression of non-neuronal acetylcholine in
lymphocytes and its contribution to the regulation of immune function Front
Biosci 200492063-2085
87 St-Pierre S Jiang W Roy P Champigny C LeBlanc E Morley BJ Hao J
Simard AR Nicotinic Acetylcholine Receptors Modulate Bone Marrow-Derived
Pro-Inflammatory Monocyte Production and Survival PLoS One
201611(2)e0150230
88 Zdanowski R Krzyzowska M Ujazdowska D Lewicka A Lewicki S Role of
alpha7 nicotinic receptor in the immune system and intracellular signaling
pathways Cent Eur J Immunol 201540(3)373-379
89 Baez-Pagan CA Delgado-Velez M Lasalde-Dominicci JA Activation of the
Macrophage alpha7 Nicotinic Acetylcholine Receptor and Control of
Inflammation J Neuroimmune Pharmacol 201510(3)468-476
90 Kalkman HO Feuerbach D Modulatory effects of alpha7 nAChRs on the
immune system and its relevance for CNS disorders Cell Mol Life Sci
201673(13)2511-2530
91 Zakrzewicz A Richter K Agne A Wilker S Siebers K Fink B Krasteva-Christ
G Althaus M Padberg W Hone AJ McIntosh JM Grau V Canonical and
Novel Non-Canonical Cholinergic Agonists Inhibit ATP-Induced Release of
Monocytic Interleukin-1beta via Different Combinations of Nicotinic
Acetylcholine Receptor Subunits alpha7 alpha9 and alpha10 Front Cell
Neurosci201711189
92 Arreola R Alvarez-Herrera S Perez-Sanchez G Becerril-Villanueva E Cruz-
Fuentes C Flores-Gutierrez EO Garces-Alvarez ME de la Cruz-Aguilera DL
Medina-Rivero E Hurtado-Alvarado G Quintero-Fabian S Pavon L
Immunomodulatory Effects Mediated by Dopamine J Immunol
Res20163160486
93 Nakajima M Yamamoto T Nunoya K Yokoi T Nagashima K Inoue K Funae
Y Shimada N Kamataki T Kuroiwa Y Role of human cytochrome P4502A6 in
C-oxidation of nicotine Drug Metab Dispos 199624(11)1212-1217
97
94 Messina ES Tyndale RF Sellers EM A major role for CYP2A6 in nicotine C-
oxidation by human liver microsomes J Pharmacol Exp Ther
1997282(3)1608-1614
95 Chen A Krebs NM Zhu J Muscat JE Nicotine metabolite ratio predicts
smoking topography The Pennsylvania Adult Smoking Study Drug Alcohol
Depend201819089-93
96 Shahab L BL McNeill Tyndale RF Does the nicotine metabolite ratio
moderate smoking cessation treatment outcomes in real-world settings A
prospective study Addiction 2019114(2)304-314 doi 101111add14450
97 Lea RA Dickson S Benowitz NL Within-subject variation of the salivary
3HCCOT ratio in regular daily smokers prospects for estimating CYP2A6
enzyme activity in large-scale surveys of nicotine metabolic rate J Anal Toxicol
200630(6)386-389
98 Mooney ME Li ZZ Murphy SE Pentel PR Le C Hatsukami DK Stability of
the nicotine metabolite ratio in ad libitum and reducing smokers Cancer
Epidemiol Biomarkers Prev 200817(6)1396-1400
99 Piestansky J Marakova K Veizerova L Galba J Mikus P On-line column
coupled isotachophoresis-capillary zone electrophoresis hyphenated with
tandem mass spectrometry in drug analysis varenicline and its metabolite in
human urine Anal Chim Acta 201482684-93
100 Fagerstrom KO Heatherton TF Kozlowski LT Nicotine addiction and its
assessment Ear Nose Throat J 199069(11)763-765
101 Issa JS A new nicotine dependence score and a new scale assessing patient
comfort during smoking cessation treatment J Bras Pneumol 201238(6)761-
765
102 Mexal S Berger R Logel J Ross RG Freedman R Leonard S Differential
regulation of alpha7 nicotinic receptor gene (CHRNA7) expression in
schizophrenic smokers J Mol Neurosci 201040(1-2)185-195
103 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-
time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods
200125(4)402-408
104 Abdallah IA Hammell DC Stinchcomb AL Hassan HE A fully validated LC-
MSMS method for simultaneous determination of nicotine and its metabolite
cotinine in human serum and its application to a pharmacokinetic study after
using nicotine transdermal delivery systems with standard heat application in
adult smokers J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2016102067-
77
98
105 Al-Haj A Alawi M Arafat T Hourani MK Method development validation
and bioequivalence of varenicline in human plasma by liquid chromatography
tandem mass spectrometry J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci
2013931134-139
106 Hegstad S Stray-Pedersen A Olsen L Vege A Rognum TO Morland J
Christophersen AS Determination of cotinine in pericardial fluid and whole
blood by liquid chromatography-tandem mass spectrometry J Anal Toxicol
200933(4)218-222
107 Santos MG Moraes Gde O Nakamura MG dos Santos-Neto AJ Figueiredo
EC Restricted access molecularly imprinted polymers obtained by bovine serum
albumin andor hydrophilic monomers external layers a comparison related to
physical and chemical properties Analyst 2015140(22)7768-7775
108 de Lima MM Vieira AC Martins I Boralli VB Borges KB Figueiredo EC
On-line restricted access molecularly imprinted solid phase extraction of
ivermectin in meat samples followed by HPLC-UV analysis Food Chem
2015197(Pt A)7-13
109 Barbosa AF Barbosa VM Bettini J Luccas PO Figueiredo EC Restricted
access carbon nanotubes for direct extraction of cadmium from human serum
samples followed by atomic absorption spectrometry analysis Talanta
2016131213-220
110 de Faria HD Abrao LC Santos MG Barbosa AF Figueiredo EC New
advances in restricted access materials for sample preparation A review Anal
Chim Acta 201795943-65
111 FRANQUI L S et al Synthesis and characterization of a magnetic molecularly
imprinted polymer for the selective extraction of nicotine and cotinine from
urine samples followed by GC-MS analysis Anal Methods 2015 7(21) 9237ndash
9244 2015
112 Santos MG Tavares IM Barbosa AF Bettini J Figueiredo EC Analysis of
tricyclic antidepressants in human plasma using online-restricted access
molecularly imprinted solid phase extraction followed by direct mass
spectrometry identificationquantification Talanta 20171638-16
113 US Department of Health and Human Services Food and Drug Administration
(FDA) Center for Drug Evaluation and Research (CDER)Center for Veterinary
Medicine (CVM) Guidance for IndustryBioanalytical method validation
Biopharmaceutics 2013
114 GOMES Raphael A B et al Evaluation of the pH influence on protein
exclusion by restricted access carbono nanotubes coated with bovine serum
albumin Journal Of Materials Science 2016 51(16)7407-7414
99
115 de Faria HD Rosa MA Silveira AT Figueiredo EC Direct extraction of
tetracyclines from bovine milk using restricted access carbon nanotubes in a
column switching liquid chromatography system Food Chem 201722598-106
116 de Faria HD Bueno CT Krieger JE Krieger EM Pereira AC Santos P
Figueiredo EC Online extraction of antihypertensive drugs and their metabolites
from untreated human serum samples using restricted access carbon nanotubes
in a column switching liquid chromatography system J Chromatogr A
2017152841-52
117 Petersen GO Leite CE Chatkin JM Thiesen FV Cotinine as a biomarker of
tobacco exposure development of a HPLC method and comparison of matrices
J Sep Sci 201033(4-5)516-521
118 Brunen S Vincent PD Baumann P Hiemke C Havemann-Reinecke U
Therapeutic drug monitoring for drugs used in the treatment of substance-related
disorders literature review using a therapeutic drug monitoring appropriateness
rating scale Ther Drug Monit 201133(5)561-572
119 Ryan RE Loiacono RE Nicotine regulates alpha7 nicotinic receptor subunit
mRNA implications for nicotine dependence Neuroreport 200112(3)569-
572
120 Cameli C Bacchelli E De Paola M Giucastro G Cifiello S Collo G Cainazzo
MM Pini LA Maestrini E Zoli M Genetic variation in CHRNA7 and
CHRFAM7A is associated with nicotine dependence and response to varenicline
treatment Eur J Hum Genet 201826(12)1824-1831
121 Wallace TL Bertrand D Importance of the nicotinic acetylcholine receptor
system in the prefrontal cortex Biochem Pharmacol 201385(12)1713-1720
122 Dempster EL Toulopoulou T McDonald C Bramon E Walshe M Wickham H
Sham PC Murray RM Collier DA Episodic memory performance predicted by
the 2bp deletion in exon 6 of the alpha 7-like nicotinic receptor subunit gene
Am J Psychiatry 2006163(10)1832-1834
123 Enioutina EY Myers EJ Tvrdik P Hoidal JR Rogers SW Gahring LC The
nicotinic receptor Alpha7 impacts the mouse lung response to LPS through
multiple mechanisms PLoS One 201510(3)e0121128
124 Sinkus ML Graw S Freedman R Ross RG Lester HA Leonard S The human
CHRNA7 and CHRFAM7A genes A review of the genetics regulation and
function Neuropharmacology 201596(Pt B)274-288
125 Gault J Robinson M Berger R Drebing C Logel J Hopkins J Moore T Jacobs
S Meriwether J Choi MJ Kim EJ Walton K Buiting K Davis A Breese C
Freedman R Leonard S Genomic organization and partial duplication of the
human alpha7 neuronal nicotinic acetylcholine receptor gene (CHRNA7)
Genomics 199852(2)173-185
100
126 Riley B Williamson M Collier D Wilkie H Makoff A A 3-Mb map of a large
Segmental duplication overlapping the alpha7-nicotinic acetylcholine receptor
gene (CHRNA7) at human 15q13-q14 Genomics 200279(2)197-209
127 Benhammou K Lee M Strook M Sullivan B Logel J Raschen K Gotti C
Leonard S [(3)H]Nicotine binding in peripheral blood cells of smokers is
correlated with the number of cigarettes smoked per day Neuropharmacology
200039(13)2818-2829
128 Kunii Y Zhang W Xu Q Hyde TM McFadden W Shin JH Deep-Soboslay A
Ye T Li C Kleinman JE Wang KH Lipska BK CHRNA7 and CHRFAM7A
mRNAs co-localized and their expression levels altered in the postmortem
dorsolateral prefrontal cortex in major psychiatric disorders Am J Psychiatry
2015172(11)1122-1130
129 Breese CR Lee MJ Adams CE Sullivan B Logel J Gillen KM Marks MJ
Collins AC Leonard S Abnormal regulation of high affinity nicotinic receptors
in subjects with schizophrenia Neuropsychopharmacology 200023(4)351-
364
130 Freedman R Hall M Adler LE Leonard S Evidence in postmortem brain tissue
for decreased numbers of hippocampal nicotinic receptors in schizophrenia Biol
Psychiatry 199538(1)22-33
131 Guan ZZ Zhang X Blennow K Nordberg A Decreased protein level of
nicotinic receptor alpha7 subunit in the frontal cortex from schizophrenic brain
Neuroreport 199910(8)1779-1782
132 Martin-Ruiz CM Haroutunian VH Long P Young AH Davis KL Perry EK
Court JA Dementia rating and nicotinic receptor expression in the prefrontal
cortex in schizophrenia Biol Psychiatry 200354(11)1222-1233
133 Marutle A Zhang X Court J Piggott M Johnson M Perry R Perry E
Nordberg A Laminar distribution of nicotinic receptor subtypes in cortical
regions in schizophrenia J Chem Neuroanat 200122(1-2)115-126
134 Leonard S Breese C Adams C Benhammou K Gault J Stevens K Lee M
Adler L Olincy A Ross R Freedman R Smoking and schizophrenia abnormal
nicotinic receptor expression Eur J Pharmacol 2000393(1-3)237-242
135 Kumari V Postma P Nicotine use in schizophrenia the self medication
hypotheses Neurosci Biobehav Rev 200529(6)1021-1034
136 de Leon J Diaz FJ A meta-analysis of worldwide studies demonstrates an
association between schizophrenia and tobacco smoking behaviors Schizophr
Res 200576(2-3)135-157
101
137 Flomen RH Collier DA Osborne S Munro J Breen G St Clair D Makoff AJ
Association study of CHRFAM7A copy number and 2 bp deletion
polymorphisms with schizophrenia and bipolar affective disorder Am J Med
Genet B Neuropsychiatr Genet 2006141B(6)571-575
138 Gault J Hopkins J Berger R Drebing C Logel J Walton C Short M Vianzon
R Olincy A Ross RG Adler LE Freedman R Leonard S Comparison of
polymorphisms in the alpha7 nicotinic receptor gene and its partial duplication
in schizophrenic and control subjects Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet
2003123B(1)39-49
139 Perl O Strous RD Dranikov A Chen R Fuchs S Low levels of alpha7-
nicotinic acetylcholine receptor mRNA on peripheral blood lymphocytes in
schizophrenia and its association with illness severity Neuropsychobiology
200653(2)88-93
140 Raux G Bonnet-Brilhault F Louchart S Houy E Gantier R Levillain D Allio
G Haouzir S Petit M Martinez M Frebourg T Thibaut F Campion D The -2
bp deletion in exon 6 of the alpha 7-like nicotinic receptor subunit gene is a risk
factor for the P50 sensory gating deficit Mol Psychiatry 20027(9)1006-1011
141 Leonard S Gault J Hopkins J Logel J Vianzon R Short M Drebing C Berger
R Venn D Sirota P Zerbe G Olincy A Ross RG Adler LE Freedman R
Association of promoter variants in the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor
subunit gene with an inhibitory deficit found in schizophrenia Arch Gen
Psychiatry 200259(12)1085-1096
142 Mathew SV Law AJ Lipska BK Davila-Garcia MI Zamora ED Mitkus SN
Vakkalanka R Straub RE Weinberger DR Kleinman JE Hyde TM Alpha7
nicotinic acetylcholine receptor mRNA expression and binding in postmortem
human brain are associated with genetic variation in neuregulin 1 Hum Mol
Genet 200716(23)2921-2932
143 Severance EG Yolken RH Novel alpha7 nicotinic receptor isoforms and
deficient cholinergic transcription in schizophrenia Genes Brain Behav
20087(1)37-45
144 Severance EG Dickerson FB Stallings CR Origoni AE Sullens A Monson
ET Yolken RH Differentiating nicotine- versus schizophrenia-associated
decreases of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor transcript CHRFAM7A
in peripheral blood lymphocytes J Neural Transm (Vienna) 2009116(2)213-
220
145 Olincy A Freedman R Nicotinic mechanisms in the treatment of psychotic
disorders a focus on the alpha7 nicotinic receptor Handb Exp Pharmacol
2012 (213)211-232
146 Kariminejad A Almadani N Khoshaeen A Olsson B Moslemi AR Tajsharghi
H Truncating CHRNG mutations associated with interfamilial variability of the
102
severity of the Escobar variant of multiple pterygium syndrome BMC
Genet201617(1)71
147 Liu Y Wang L Yang YK Liang Y Zhang TJ Liang N Yang LM Li SJ Shan
D Wu QQ Prenatal diagnosis of fetal skeletal dysplasia using targeted next-
generation sequencing an analysis of 30 cases Diagn Pathol 201914(1)76
148 Natera-de Benito D Topf A Vilchez JJ Gonzalez-Quereda L Dominguez-
Carral J Diaz-Manera J Ortez C Bestue M Gallano P Dusl M Abicht A
Muller JS Senderek J Garcia-Ribes A Muelas N Evangelista T Azuma Y
McMacken G Paipa Merchan A Rodriguez Cruz PM Camacho A Jimenez E
Miranda-Herrero MC Santana-Artiles A Garcia-Campos O Dominguez-Rubio
R Olive M Colomer J Beeson D Lochmuller H Nascimento A Molecular
characterization of congenital myasthenic syndromes in Spain Neuromuscul
Disord 201727(12)1087-1098
149 Seo J Choi IH Lee JS Yoo Y Kim NK Choi M Ko JM Shin YB Rare cases
of congenital arthrogryposis multiplex caused by novel recurrent CHRNG
mutations J Hum Genet 201560(4)213-215
150 Keskitalo-Vuokko K Pitkaniemi J Broms U Heliovaara M Aromaa A Perola
M Ripatti S Salminen O Salomaa V Loukola A Kaprio J Associations of
nicotine intake measures with CHRN genes in Finnish smokers Nicotine Tob
Res201113(8)686-690
151 Saccone NL Saccone SF Hinrichs AL Stitzel JA Duan W Pergadia ML
Agrawal A Breslau N Grucza RA Hatsukami D Johnson EO Madden PA
Swan GE Wang JC Goate AM Rice JP Bierut LJ Multiple distinct risk loci
for nicotine dependence identified by dense coverage of the complete family of
nicotinic receptor subunit (CHRN) genes Am J Med Genet B Neuropsychiatr
Genet 2009150B(4)453-466
152 Saccone NL Schwantes-An TH Wang JC Grucza RA Breslau N Hatsukami
D Johnson EO Rice JP Goate AM Bierut LJ Multiple cholinergic nicotinic
receptor genes affect nicotine dependence risk in African and European
Americans Genes Brain Behav 20109(7)741-750
153 Santoro ML Ota VK Stilhano RS Silva PN Santos CM Diana MC Gadelha
A Bressan RA Melaragno MI Han SW Abilio VC Belangero SI Effect of
antipsychotic drugs on gene expression in the prefrontal cortex and nucleus
accumbens in the spontaneously hypertensive rat (SHR) Schizophr Res
2014157(1-3)163-168
154 Kuhn J Vollmer T Martin C Hendig D Knabbe C Fast and sample cleanup-
free measurement of nicotine and cotinine by stable isotope dilution ultra-
performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry J Pharm
Biomed Anal 201267-68137-143
103
155 Scherf-Clavel M Wahl O Menke A Unterecker S Determination of
hydroxybupropion in human serum for routine therapeutic drug monitoring in
psychiatry A tool for dose-individualization in treatment with bupropion
Biomed Chromatogr 201933(10)e4609
156 Dobrinas M Choong E Noetzli M Cornuz J Ansermot N Eap CB
Quantification of nicotine cotinine trans-3-hydroxycotinine and varenicline in
human plasma by a sensitive and specific UPLC-tandem mass-spectrometry
procedure for a clinical study on smoking cessation J Chromatogr B Analyt
Technol Biomed Life Sci 2011879(30)3574-3582
157 Onoue S Yamamoto N Seto Y Yamada S Pharmacokinetic study of nicotine
and its metabolite cotinine to clarify possible association between smoking and
voiding dysfunction in rats using UPLCESI-MS Drug Metab Pharmacokinet
201126(4)416-422
158 Petrides AK Moskowitz J Johnson-Davis KL Jannetto PJ Langman LJ Clarke
W Marzinke MA The development and validation of a turbulent flow-liquid
chromatography-tandem mass spectrometric method for the simultaneous
quantification of citalopram sertraline bupropion and hydroxybupropion in
serum Clin Biochem 201447(15)73-79
Rubrica participante Rubrica pesquisador
APEcircNDICE - TCLE
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
HOSPITAL DAS CLIacuteNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SAtildeO
PAULO-HCFMUSP
Registro das explicaccedilotildees do pesquisador ao paciente ou seu representante legal sobre a pesquisa consignando
Vocecirc estaacute sendo convidado (a) a participar de um projeto de pesquisa Este projeto tem
como objetivos principais para os indiviacuteduos fumantes submetidos aos tratamentos
farmacoloacutegicos antitabagismo associar o efeito das caracteriacutesticas geneacuteticas (DNA ou RNA) e do
metabolismo (concentraccedilatildeo dos produtos de metabolismo dos medicamentos no sangue) com a
eficiecircncia do tratamento antitabagismo O objetivo do estudo eacute saber por que algumas pessoas
respondem bem aos medicamentos antitabagismo enquanto outras pessoas natildeo respondem e
consequentemente natildeo conseguem parar de fumar Para isto precisaremos de amostras de
sangue cuja quantidade eacute comumente solicitada em exames laboratoriais de rotina (2 tubos a
cada visita = 20mL) Precisaremos tambeacutem do seu consentimento para que dados de seu
prontuaacuterio meacutedico sejam consultados Para os pacientes que utilizaratildeo o medicamento
bupropiona precisaremos de amostras de sangue na primeira consulta (visita T-1) e duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento medicamentoso (visita T2) Para os pacientes que utilizaratildeo
o medicamento vareniclina precisaremos de uma amostra de sangue na primeira consulta (visita
T-1) na segunda consulta ndash ainda antes de iniciar o tratamento com medicamento (visita T0) duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento medicamentoso (visita T2) e quatro semanas apoacutes o iniacutecio
do tratamento medicamentoso (visita T4) Os desconfortos mais comuns que podem ocorrer com
sua participaccedilatildeo neste estudo satildeo os mesmos de uma coleta de sangue no braccedilo por exemplo
leve dor no local da punccedilatildeo e eventualmente hematoma local Este sangue seraacute encaminhado
ao Laboratoacuterio de Geneacutetica e Cardiologia Molecular do Instituto do Coraccedilatildeo onde seraacute
armazenado somente para a pesquisa Sua participaccedilatildeo eacute totalmente voluntaacuteria Apoacutes ler
entender e esclarecer suas duacutevidas vocecirc assinaraacute 2 vias de igual teor desse documento (termo de
consentimento Livre e Esclarecido) Ainda vocecirc poderaacute solicitar o seu desligamento deste projeto
a qualquer momento bastando para tal entrar em contato os pesquisadores no tel (11) 2661-5592
ou 2661-5995 Em qualquer etapa do estudo vocecirc teraacute acesso aos profissionais responsaacuteveis
pela pesquisa para esclarecimento de eventuais duacutevidas O pesquisador responsaacutevel eacute a Dra
Jaqueline Scholz que pode ser encontrada no endereccedilo Av Dr Eneacuteas de Carvalho Aguiar 44
Instituto do Coraccedilatildeo Bloco 2 andar 1 Programa Ambulatorial de Tratamento Tabagismo
INCOR-HCFMUSP telefone (11) 2661-5592 Se vocecirc tiver alguma consideraccedilatildeo ou duacutevida sobre
a eacutetica da pesquisa entre em contato com o Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa (CEP) ndash Rua Oviacutedio
Pires de Campos 225 ndash 5ordm andar ndash tel (11) 2661-7585 FAX (011) 2661-7585 ndash e-mail
Rubrica participante Rubrica pesquisador
cappesqadmhcfmuspbr Poderaacute tambeacutem solicitar a destruiccedilatildeo das amostras que estaratildeo
armazenadas no mesmo laboratoacuterio
As informaccedilotildees obtidas seratildeo analisadas em conjunto com outros pacientes natildeo sendo
divulgada a identificaccedilatildeo de nenhum paciente Natildeo haveraacute nenhuma despesa por parte do
participante Tambeacutem natildeo haacute compensaccedilatildeo financeira relacionada agrave sua participaccedilatildeo
Benefiacutecio direto para o participante eacute a possibilidade de parar de fumar e ser bem monitorado
durante todo o processo de 12 semanas
Estas informaccedilotildees poderatildeo auxiliar na elaboraccedilatildeo de programas eficazes para o uso
da informaccedilatildeo das caracteriacutesticas individuais em usuaacuterios de medicamentos antitabagismo
Acredito ter sido suficientemente informado a respeito das informaccedilotildees que li ou que
foram lidas para mim descrevendo o estudo ldquoAnaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de
expressatildeo gecircnica dos genoacutetipos preditores de metabolizaccedilatildeo e das concentraccedilotildees de
metaboacutelitos com a resposta ao tratamento antitabagismordquo Eu discuti com o Dra Jaqueline
Scholz com a Juliana da Rocha dos Santos eou Paulo Roberto Xavier Tomaz sobre a minha
decisatildeo em participar nesse estudo Ficaram claros para mim quais satildeo os propoacutesitos do
estudo os procedimentos a serem realizados seus desconfortos e riscos as garantias de
confidencialidade e de esclarecimentos permanentes Concordo voluntariamente em participar
deste estudo e poderei retirar o meu consentimento a qualquer momento antes ou durante o
mesmo sem penalidades ou prejuiacutezo ou perda de qualquer benefiacutecio que eu possa ter
adquirido ou no meu atendimento neste Serviccedilo
_____________________________________________________________________________________
Assinatura do pacienterepresentante legal Data
____________________________________________________________________________
Assinatura da testemunha Data
para casos de pacientes menores de 18 anos analfabetos semi-analfabetos ou portadores de deficiecircncia auditiva ou visual
(Somente para o responsaacutevel do projeto)
Declaro que obtive de forma apropriada e voluntaacuteria o Consentimento Livre e Esclarecido deste
paciente ou representante legal para a participaccedilatildeo neste estudo
____________________________________________________________________________
Assinatura do pesquisador Data
Rubrica participante Rubrica pesquisador
DADOS DE IDENTIFICACcedilAtildeO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSAacuteVEL LEGAL
1NOME
DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nordm SEXO M F
DATA NASCIMENTO
ENDERECcedilO NordmAPTO
BAIRROCIDADE
ESTADOCEPTELEFONE()
2RESPONSAacuteVEL LEGAL
NATUREZA (grau de parentesco tutor curador etc)
DOCUMENTO DE IDENTIDADE SEXO M F
DATA DE NASCIMENTOENDERECcedilO
Nordm APTO
BAIRROCIDADE ESTADOCEPTELEFONE() ___________________________________________________________________________________________________________________________
DADOS SOBRE A PESQUISA
1 TIacuteTULO DO SUBPROJETO DE PESQUISA ldquoAnaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de expressatildeo gecircnica dos genoacutetipos
preditores de metabolizaccedilatildeo e das concentraccedilotildees de metaboacutelitos com a resposta ao tratamento antitabagismordquo
PESQUISADOR RESPONSAacuteVEL Dr Jaqueline Scholz
CARGOFUNCcedilAtildeO Meacutedico Assistente Meacutedico Pesquisador ndash InCor ndash HCFMUSP CRM SP nordm 60179
UNIDADE DO HCFMUSP Programa Ambulatorial de Tratamento Tabagismo InCor-HCFMUSP
PESQUISADOR EXECUTANTE Juliana da Rocha dos Santos CRF SP nordm 62776
CARGOFUNCcedilAtildeO POacuteS-GRADUANDAndash InCor ndash HCFMUSP
UNIDADE DO HC-FMUSP Laboratoacuterio de Geneacutetica e Cardiologia Molecular InCor-HCFMUSP
3 AVALIACcedilAtildeO DO RISCO DA PESQUISA
RISCO MIacuteNIMO RISCO MEacuteDIO
RISCO BAIXO x RISCO MAIOR
4 DURACcedilAtildeO DA PESQUISA 4 anos
ANEXO 1 ndash Aprovaccedilatildeo no Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa
ANEXO 2 - Teste de Fagerstroumlm para a dependecircncia agrave nicotina (versatildeo em Portuguecircs)
Fonte Pietrobon RC Barbisan JN Manfroi WC Utilizaccedilatildeo do teste de dependecircncia agrave nicotina de
Fagerstroumlm como um instrumento de medida do grau de dependecircncia Versatildeo em Portuguecircs Rev HCPA
200727(3)31-6
ANEXO 3 - Escore de consumo situacional Issa
Fonte Issa J S Um novo escore para dependecircncia a nicotina e uma nova escala de conforto do paciente durante
o tratamento do tabagismo J Bras Pneumol 38(6) 761-5
ANEXO 4 ndash Desenho de estudo do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticos na escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismordquo
Desenho do estudo Seraacute randomizado em dois braccedilos um nuacutemero amostral total de 300 pacientes No braccedilo da esquerda 150 pacientes seratildeo tratados com base em teste geneacutetico para os
polimorfismos CYP2B6 (rs2279343) e CHRNA4 (rs1044396) No braccedilo da direita 150 pacientes faratildeo o tratamento tradicional com vareniclina (o faacutermaco de maior efetividade no tratamento
antitabagismo) Em um estudo anterior nosso grupo de pesquisadores 5152 mostrou maior sucesso terapecircutico nos pacientes portadores dos genoacutetipos AA para o gene CYP2B6 nos pacientes
tratados com bupropiona e nos portadores dos genoacutetipos CT e TT para o gene CHRNA4 nos pacientes tratados com vareniclina A escolha do tratamento no braccedilo farmacogeneacutetico prioriza o
tratamento mais barato (bupropiona) dessa forma primeiramente eacute analisado o genoacutetipo para o rs2279343 se o paciente apresentar o genoacutetipo AA o mesmo eacute tratado com bupropiona se ele tiver
o genoacutetipo AG ou GG eacute analisado o genoacutetipo para o polimorfismo rs1044396 Se o paciente apresentar o genoacutetipo CT ou TT para o rs1044396 ele eacute tratado com vareniclina se ele apresentar o
genoacutetipo CC (natildeo favoraacutevel a nenhum dos faacutermacos) ele eacute tratado com vareniclina e bupropiona em uso concomitante Seraacute comparado o custo-efetividade do tratamento baseado em
farmacogeneacutetica em relaccedilatildeo ao tratamento com vareniclina Os pacientes satildeo acompanhados por 12 semanas durante o tratamento farmacoloacutegico visita inicial (T-1) antes do iniacutecio da terapecircutica
(T0) 2 4 6 8 e 12 semanas apoacutes o tratamento (T2 T4 T6 T8 T12) Obs Os pacientes que natildeo conseguirem parar de fumar ateacute a 4 ordf semana de tratamento em monoterapia eacute adicionada a
segunda medicaccedilatildeo Fonte Eficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticos na escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismo InCor-HCFMUSP Projeto de doutorado da Dra Patriacutecia Viviane Gaya
sob a orientaccedilatildeo da Dr Jaqueline R Scholz desenvolvido a partir dos resultados dos estudos da nossa equipe de pesquisadores Rocha Santos et al 2015 67 e Tomaz et al 2015 68
ANEXO 5 ndash Pedido de depoacutesito de patente na Agecircncia de Inovaccedilatildeo e Empreendedorismo da
Universidade Federal de Alfenas-MG
ldquoPorque os meus pensamentos natildeo satildeo os vossos pensamentos nem os vossos
caminhos os meus caminhos diz o Senhor Porque assim como os ceacuteus satildeo mais
altos do que a terra assim satildeo os meus caminhos mais altos do que os vossos
caminhos e os meus pensamentos mais altos do que os vossos pensamentos rdquo
Isaiacuteas 5589
Esta tese estaacute de acordo com as seguintes normas em vigor no momento desta
publicaccedilatildeo
Referecircncias adaptado de International Committee of Medical Journals Editors
(Vancouver)
Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Medicina Divisatildeo de Biblioteca e
Documentaccedilatildeo Guia de apresentaccedilatildeo de dissertaccedilotildees teses e monografias Elaborado
por Anneliese Carneiro da Cunha Maria Julia de A L Freddi Maria F Crestana
Marinalva de Souza Aragatildeo Suely Campos Cardoso Valeacuteria Vilhena 3a ed Satildeo Paulo
Divisatildeo de Biblioteca e Documentaccedilatildeo 2011 Abreviaturas dos tiacutetulos dos perioacutedicos
de acordo com List of Journals Indexed in Index Medicus
SUMAacuteRIO
LISTA DE ABREVIATURAS SIacuteMBOLOS E SIGLAS
LISTA DE EQUACcedilOtildeES
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE QUADROS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
11 Nicotina farmacodinacircmica e farmacocineacutetica 3
12 Faacutermacos antitabagismo 5
121 Vareniclina 6
1211 Farmacodinacircmica 6
1212 Farmacocineacutetica 7
122 Bupropiona 9
1221 Farmacodinacircmica 9
1222 Farmacocineacutetica 10
13 Pesquisa de biomarcadores 11
131 Estudos farmacogeneacuteticos e de expressatildeo gecircnica para vareniclina e bupropiona 12
132 Mensuraccedilatildeo de nicotina bupropiona vareniclina e seus metaboacutelitos em amostras
bioloacutegicas 15
2 JUSTIFICATIVA 17
3 OBJETIVOS 19
4 METODOLOGIA 20
41 Casuiacutestica 20
42 Fluxo de procedimentos adotados no atendimento aos pacientes 23
43 Coleta e armazenamento das amostras dos pacientes tratados com vareniclina e
bupropiona 26
44 Nuacutemero amostral 27
45 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica para amostras de pacientes tratados com vareniclina 28
451 Concentraccedilatildeo purificaccedilatildeo e extraccedilatildeo de RNA 28
452 Siacutentese de cDNA 31
453 Ensaio de controle de qualidade das amostras para o ensaio de expressatildeo gecircnica 31
454 Ensaio de expressatildeo gecircnica 35
455 Anaacutelise dos dados de expressatildeo gecircnica 37
46 Mensuraccedilatildeo de bupropiona vareniclina e de seus metaboacutelitos por HPLC-MSMS 38
461 Materiais equipamentos e condiccedilotildees adotadas para a mensuraccedilatildeo dos analitos apoacutes
validaccedilatildeo do meacutetodo 38
462 Visatildeo geral do desenvolvimento da coluna e padronizaccedilatildeo da anaacutelise 41
463 Desenvolvimento da coluna RAM para a purificaccedilatildeo da amostra 43
464 Caracterizaccedilatildeo do novo RAM 46
4641 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA 46
4642 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas no soro 46
4643 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA em diferentes pHs 47
465 Paracircmetros espectromeacutetricos 47
466 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatograacutefico multidimensional 48
467 validaccedilatildeo analiacutetica 49
47 Anaacutelise estatiacutestica 49
5 RESULTADOS 51
51 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica 51
511 Dados cliacutenicos e demograacuteficos 51
512 Dados de expressatildeo gecircnica 53
513 Anaacutelise de associaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica entre os desfechos e os tempos de
tratamento 54
52 Mensuraccedilatildeo dos analitos 58
521 Caracterizaccedilatildeo da coluna teste exclusatildeo de proteiacutenas e interferentes da matriz 58
522 Otimizaccedilatildeo dos paracircmetros espectromeacutetricos 60
523 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatrograacutefico multidimensional 61
524 Validaccedilatildeo analiacutetica 64
525 Dados cliacutenicos e demograacuteficos dos pacientes submetidos a mensuraccedilatildeo dos analitos
69
526 Anaacutelise de associaccedilatildeo dos analitos com desfecho de tratamento 72
6 DISCUSSAtildeO 75
61 Para os dados da anaacutelise de expressatildeo gecircnica 75
62 Para os dados da mensuraccedilatildeo dos analitos 80
7 CONCLUSOtildeES 87
8 SUGESTOtildeES PARA ESTUDOS FUTUROS 88
9 REFEREcircNCIAS 89
APEcircNDICE ndash TCLE
ANEXO 1 ndash Aprovaccedilatildeo no Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa
ANEXO 2 ndash Teste de Fagerstroumlm para a dependecircncia agrave nicotina (versatildeo em Portuguecircs)
ANEXO 3 - Escore de consumo situacional Issa
ANEXO 4 - Desenho de estudo do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticos na
escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismordquo
ANEXO 5 -Pedido de depoacutesito de patente na Agecircncia de Inovaccedilatildeo e Empreendedorismo
da Universidade Federal de Alfenas-MG
LISTA DE ABREVIATURAS SIacuteMBOLOS E SIGLAS
API Ionizaccedilatildeo em pressatildeo atmosfeacuterica - Atmospheric pressure ionization
ACTB Gene que codifica a proteiacutena β actina
ANKK1 Gene codificador da proteiacutena quinase envolvida em vias de transduccedilatildeo de sinal
B2M Gene que codifica a microbulina subunidade β2
BC3 Tampatildeo de reaccedilao de transcriptase reversa
BR1 Tampatildeo de ressuspensatildeo
BR2 Tampatildeo de ligaccedilatildeo
BR3 Tampatildeo de lavagem 1
BR4 Tampatildeo de lavagem 2
BR5 Tampatildeo de eluiccedilatildeo
BRT Tubos PAXgene
BSA Albumina de soro bovino
[C14] Carbono 14 (isoacutetopo radioativo do carbono de massa atocircmica 14)
cDNA DNA complementar sintetizado a partir de uma moleacutecula de RNA
CHRNA3 Gene codificador do receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α3
CHRNA4 Gene codificador da subunidade α4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNA5 Gene codificador da subunidade α5 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNA6 Gene codificador da subunidade α6 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNA7 Gene codificador da subunidade α7 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNB2 Gene codificador da subunidade β2 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNB3 Gene codificador da subunidade β3 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNB4 Gene codificador da subunidade β4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNG Gene codificador do receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade δ
CNTs Nanotubos de carbono - Carbon nanotubes
COMT Gene codificador da enzima catecol-O-metiltransferase (metaboliza dopamina)
CS ndash SPE Extraccedilatildeo em fase soacutelida no modo column switching
CT Ciclo de linha de base ndash threshold cicle (nuacutemero de ciclo em que a amostra
amplificou)
CYP2B6 Gene codificador do receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade γ
CYP2B6 Gene codificador da isoenzima CYP2B6
Disco QC Disco para a realizaccedilatildeo do controle de qualidade de amostras que seratildeo utilizadas
para o ensaio de expressatildeo gecircnica
DN Dependecircncia agrave nicotina
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
DNAse Enzima que degrada moleacuteculas de DNA
dNTP Dinucleotiacutedeos dATP dCTP dGTP e dTTP
DRD1 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 1
DRD2 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 2
DRD3 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 3
DRD4 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 4
E Erro relativo
EDTA Aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico
Escore Issa Escore de consumo situacional Issa
ESI+ Ionizaccedilatildeo positiva por electrospray - positive Electrospray ionization
FDA Orgatildeo de controle de alimentos e medicamentos americano ndash Food and drug
administration
FTND Teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fargestroumlm test for nicotine
dependence
g Velocidade de rotaccedilatildeo em forccedila g a qual considera a aceleraccedilatildeo da gravidade
GDC Controle de contaminaccedilatildeo de DNA genocircmico do disco QC
GE Tampatildeo de degradaccedilatildeo de DNA genocircmico
HGDC Controle de contaminaccedilatildeo de DNA genocircmico do ensaio de expressatildeo gecircnica
HPLC Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia ndash High Performance Liquid
Cromatograph
HPLC-MSMS Cromatografica liacutequida de alta eficiecircncia seguida por espectrometria de massas
em tandem ndash High Performance Liquid Cromatograph fowed by tandem Mass
Spectrometric
HPRT1 Gene que codifica a enzima hipoxantina fosforribosiltransferase 1
HTR3A Gene codificador da subunidade 3A do receptor de serotonina
HTR3B Gene codificador da subunidade 3B do receptor de serotonina
KV Energia de colisatildeo em quilovolt
LC-MS Cromatografia liacutequida seguida de espectrometria de massas - Liquid
Cromatograph fowed by Mass Spectrometric
LD Limite de detecccedilatildeo
LLE Extraccedilatildeo liacutequido-liacutequido (com o uso de solvente)
LQ Limite de quantificaccedilatildeo
LogP Coeficiente de particcedilatildeo relaccedilatildeo das concentraccedilotildees da substacircncia em um solvente
orgacircnico e em aacutegua dado que ambos os solventes satildeo necessariamente imisciacuteveis
MCT Microtubos de 15 mL
MS Espectrometria de massas - Mass Spectrometric
MRM Muacuteltiplas transiccedilotildees de monitoramento de reaccedilatildeo - multiple reaction monitoring
MSMS Espectrometria de massas em tandem
mz Relaccedilatildeo massacarga dos analitos
nAChR(s) Receptor(es) acetilcoliacutenico (s) nicotiacutenico (s)
NMR Taxa de metabolizaccedilatildeo da nicotina ndash Nicotine metabolite ratio
NTC Controle negativo
NTR Controle de natildeo transcriccedilatildeo reversa
OCT2 Transportador catiocircnico orgacircnico
P2 Controle externo de RNA
PAF Programa de Assistecircncia ao Fumante
PBMC Ceacutelulas mononucleares de sangue perifeacuterico - Peripheral blood mononuclear cell
PCR Amplificaccedilatildeo em cadeia da polimerase
PIs Padrotildees internos
PK Enzima proteinase K
pKa Valor negativo do logaritmo da constante de dissociaccedilatildeo de um aacutecido
pKb Valor negativo do logaritmo da constante de dissociaccedilatildeo de uma base
PP Extraccedilatildeo por preciptaccedilatildeo de proteiacutenas
PPC Controle positivo de PCR
PRC Coluna de rotaccedilatildeo de RNA vermelho
PSC Coluna de rotaccedilatildeo do homogeneizador lilaacutes
PT Tubo de processamento
RAM Material de acesso restrito ndash restrict access material
Rcf Forccedila centriacutefuga relativa ndash Relative centrifugal force
RDD Tampatildeo de digestatildeo de DNA
RE3 Mix de transcriptase reversa
RNA Aacutecido ribonucleico
RNase Enzima ribonuclease a qual degrada as moleacuteculas de RNA
RNFD Soluccedilatildeo matildee de DNase
RNFW Aacutegua livre de RNase
RFLP Restriccedilatildeo enzimaacutetica - Restriction fragment length polymorphism
RP‐HPLC Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia em fase reversa ndash Reverse-Phase High
Performance Liquid Cromatograph
Rpm Rotaccedilatildeo por minuto
RSD Desvio padratildeo relativo
SLC6A3 Gene codificador da proteiacutena transportadora de dopamina
SLC22A2 Gene codificador da proteiacutena OCT2 transportadora de caacutetions orgacircnicos
(transporta vareniclina)
SNC Sistema nervoso central
SPE Extraccedilatildeo em fase soacutelida
Sty I Enzima de restriccedilatildeo proveniente da Salmonella Typhi
TAE Tampatildeo formado com Tris Acetato e EDTA
TRN Terapia de reposiccedilatildeo nicotiacutenica
UGT2B7 Gene codificador da enzima UGT2B7 a qual metaboliza a vareniclina
UPLC Cromatografica liacutequida de ultra eficiecircncia - Ultra Performance Liquid
Cromatograph
UV Detector ultravioleta
α3 Subunidade alfa 3 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α4 Subunidade alfa 4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α5 Subunidade alfa 5 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α6 Subunidade alfa 6 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α7 Subunidade alfa 7 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
β2 Subunidade beta 2 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
β4 Subunidade beta 4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
T-1 Visita inicial
T0 Visita de iniacutecio do tratamento (coleta realizada antes de comeccedilar o tratamento no
mesmo dia)
T2 Visita de 2 semanas apoacutes tratamento farmacoloacutegico
T4 Visita de 4 semanas apoacutes tratamento farmacoloacutegico
T12 Visita de 12 semanas apoacutes tratamento farmacoloacutegico
TFC Cromatografia liacutequida turbulenta - Turbulent flow-liquid chromatography
LISTA DE EQUACcedilOtildeES
∆CT= (CTamostra ndash a meacutedia de CThousekeeping genes) Normalizaccedilatildeo da expressatildeo
gecircnica dos genes alvo atraveacutes de valores de expressatildeo de genes fisioloacutegicos
2-∆CT Transformaccedilatildeo dos valores de ∆CT em escala logariacutetmica para a realizaccedilatildeo
dos testes de hipoacutetese
∆∆CT= (mediana de ∆CTgrupo teste ndash mediana de ∆CT grupo referecircncia) Foacutermula
utilizada para posterior caacutelculo de fold change Considera-se os dois grupos
envolvidos no teste de hipoacutetese
2-∆∆CT Transformaccedilatildeo dos dados de ∆∆CT em escala logariacutetmica Atraveacutes dessa
foacutermula se obteacutem o fold change (diferenccedila de expressatildeo entre dois grupos)
NMR=(trans-3-hidroxicotininacotinina) Taxa de metabolizaccedilatildeo da nicotina
NMRlt031=metabolizador lento NMRgt031 metabolizador normal ou raacutepido
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Analitos precursores fragmentos e energias de colisatildeo
otimizados
40
Tabela 2 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina selecionados para os ensaios de expressatildeo gecircnica
52
Tabela 3 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina submetidos aos ensaios de expressatildeo gecircnica de acordo
com o desfecho de tratamento
52
Tabela 4 - Valores de mediana de ∆CT dos genes de acordo com os
tempos de tratamento e grupos de desfecho
53
Tabela 5 - Fold change e anaacutelise de associaccedilatildeo entre os tempos de
tratamento e grupos de desfecho
54
Tabela 6 - Paracircmetros de validaccedilatildeo obtidos na determinaccedilatildeo de faacutermacos
antitabagismo em soro humano
68
Tabela 7 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos
69
Tabela 8 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de
acordo com o desfecho de tratamento
70
Tabela 9 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos
71
Tabela 10 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes
tratados com bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos
analitos de acordo com o desfecho de tratamento
71
Tabela 11 ndash Frequecircncia do desfecho de tratamento nos pacientes
submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com os
medicamentos antitabagismo
72
Tabela 12 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos
pacientes tratados com vareniclina
73
Tabela 13 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de
tratamento com vareniclina
73
Tabela 14 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos
pacientes tratados com bupropiona
74
Tabela 15 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de
tratamento com bupropiona
74
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Aacutereas estimuladas atraveacutes de vias dopamineacutergicas e
serotonineacutergicas e sistema de recompensa
2
Figura 2 - Receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico 4
Figura 3 - Via primaacuteria do metabolismo da nicotina 5
Figura 4 - Mecanismo de accedilatildeo da vareniclina 7
Figura 5 - Metabolismo da vareniclina em humanos 8
Figura 6 - Mecanismo de accedilatildeo da bupropiona 9
Figura 7 - Metabolismo da bupropiona em seus principais metaboacutelitos ativo 11
Figura 8 - Desenho do estudo 22
Figura 9 - Representaccedilatildeo do Rotor-Disc100 33
Figura 10 - Mapa do disco QC (representaccedilatildeo planilhada) 33
Figura 11 - Exemplo de ajuste de Threshold 34
Figura 12 - Mapa do disco do ensaio RT2 profiler PCR array (representaccedilatildeo
planilhada)
37
Figura 13 - Representaccedilatildeo da composiccedilatildeo da coluna extratora (Novo RAM) 45
Figura 14 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNA7 entre os tempos de
tratamento e desfecho
56
Figura 15 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNG entre os tempos de
tratamento e desfecho
57
Figura 16 - Heat map de expressatildeo gecircnica 58
Figura 17 ndash Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com soluccedilatildeo de
BSA
59
Figura 18 - Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com amostra de
soro diluiacuteda
59
Figura 19 - Influecircncia do pH na exclusatildeo de proteiacutenas 60
Figura 20 - Ilustraccedilatildeo do sistema de columm switching na configuraccedilatildeo de
backflush
62
Figura 21 - Cromatograma obtido de amostras de soro branco diluiacutedas em
aacutegua ultra pura
65
Figura 22 - Cromatograma obtido apoacutes anaacutelise de soro diluiacutedo e dopado com
os analitos no niacutevel meacutedio de calibraccedilatildeo e mais os padrotildees internos deuterados
65
Figura 23 - Cromatograma obtido atraveacutes da anaacutelise das amostras de soro dos
pacientes tratados com bupropiona
67
Figura 24 - Cromatograma obtido atraveacutes da analise de amostras de soro de
pacientes tratados com vareniclina
67
LISTA DE QUADROS
Quadro 1- Procedimentos do protocolo em relaccedilatildeo aos pacientes 25
Quadro 2 - Paracircmetros de qualidade do ensaio QC 34
Quadro 3 - Genes escolhidos para o ensaio de expressatildeo 36
Quadro 4 - Housekeeping genes 36
Quadro 5 - Propriedades fiacutesico-quiacutemicas dos analitos 42
Quadro 6 ndash Comparaccedilatildeo dos dados de validaccedilatildeo com outros estudos 85
RESUMO
Santos JR Anaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de expressatildeo gecircnica e das concentraccedilotildees
de metaboacutelitos com a resposta ao tratamento antitabagismo [tese] Satildeo Paulo
Faculdade de Medicina Universidade de Satildeo Paulo 2020
Introduccedilatildeo O tabagismo eacute considerado a maior causa de morbidade e mortalidade
evitaacutevel no mundo Estudos tecircm buscado a identificaccedilatildeo de preditores de resposta aos
tratamentos de cessaccedilatildeo tabaacutegica Os principais objetivos deste estudo foram analisar a
possiacutevel associaccedilatildeo da expressatildeo de genes alvo e das concentraccedilotildees de analitos
(faacutermacos antitabagismo nicotina e seus metaboacutelitos) com a resposta ao tratamento
Meacutetodos Foram incluiacutedos 105 pacientes fumantes que iniciariam o tratamento com
vareniclina (n=74) ou bupropiona (n=31) As anaacutelises de expressatildeo gecircnica foram
realizadas atraveacutes do ensaio customizado RTsup2 Profiler PCR Array com a inclusatildeo de 17
genes para a anaacutelise em ceacutelulas mononucleares de sangue perifeacuterico (PBMC) A
preparaccedilatildeo das amostras de soro para a mensuraccedilatildeo dos analitos foi realizada atraveacutes de
uma coluna extratora composta por nanotubos hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados
com a adiccedilatildeo de grupos hidrofiacutelicos (material de acesso restrito - RAM) desenvolvida
no LATF Unifal MG A mensuraccedilatildeo dos analitos foi realizada por cromatografia
liacutequida de alta eficiecircncia em modo column switching seguida de espectrometria de
massa em tandem (HPLC-MSMS) Os tempos para a coleta de amostras foram para as
anaacutelises de expressatildeo gecircnica (sangue total) antes de iniciar o tratamento (T0) duas e
quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento (T2 e T4 respectivamente) e para a
mensuraccedilatildeo dos analitos (soro) as amostras foram coletadas na T2 Resultados Para as
anaacutelises de expressatildeo gecircnica selecionamos 14 pacientes que obtiveram sucesso e 13
pacientes resistentes ao tratamento com vareniclina Foi considerado sucesso quando o
paciente alcanccedilava abstinecircncia ao tabaco ateacute a 4 ordf semana de tratamento e resistente
quando o paciente natildeo conseguia parar de fumar ateacute a 4ordf semana de tratamento Foi
observada diferenccedila significativa para a expressatildeo do gene CHRNA7 no grupo
resistente amostras dos tempos T2 e T4 apresentaram menor expressatildeo comparadas ao
tempo T0 (fold change 038 P=0007 fold change 067 P=0004 respectivamente)
Para a mensuraccedilatildeo dos analitos a coluna RAM desenvolvida mostrou alta capacidade
para a remoccedilatildeo de macromoleacuteculas e de anaacutelise conjunta dos diferentes analitos aleacutem
de poder ser reutilizada diversas vezes (cerca de 400 ciclos) Os pacientes do grupo
resistente tratados com ambos os faacutermacos apresentaram maior concentraccedilatildeo de
metaboacutelitos da nicotina na T2 No entanto natildeo houve associaccedilatildeo dos faacutermacos e seus
metaboacutelitos com desfecho de tratamento Conclusotildees Para as anaacutelises de expressatildeo
gecircnica este estudo exploratoacuterio mostrou um possiacutevel preditor de efetividade no
tratamento com vareniclina reafirmando a associaccedilatildeo da subunidade α7 para os
processos de dependecircncia agrave nicotina e tratamento antitabagismo Estes resultados
podem contribuir ao menos em parte para o desenvolvimento de uma terapia
individualizada Contudo estudos futuros satildeo necessaacuterios para o entendimento do papel
da subunidade α7 dos receptores acetilcoliacutenicos-nicotiacutenicos no tratamento com
vareniclina Para a mensuraccedilatildeo dos analitos o novo RAM sintetizado eacute um produto de
extremo valor cientiacutefico podendo apresentar diversas aplicaccedilotildees em anaacutelise de amostras
com matrizes complexas sem muita preparaccedilatildeo preacutevia Para a associaccedilatildeo das
concentraccedilotildees dos faacutermacos e seus metaboacutelitos com o desfecho de tratamento satildeo
necessaacuterios estudos com um maior nuacutemero amostral
Descritores Vareniclina Bupropiona Nicotina Abandono do haacutebito de fumar
Expressatildeo gecircnica Biomarcadores farmacoloacutegicos
ABSTRACT
Santos JR Association analysis of gene expression profiles and metabolite
concentrations with response for smoking cessation treatment [thesis] Satildeo Paulo
ldquoFaculdade de Medicina Universidade de Satildeo Paulordquo 2020
Introduction Smoking is considered the largest cause of preventable morbidity and
mortality in the worldwide Studies have sought to identify predictors of responses to
smoking cessation treatments The main objectives of this study were to analyze the
possible association of the expression of target genes and concentrations of analytes
(drugs for smoking cessation nicotine and their metabolites) with the response to
treatment Methods We included 105 smoker patients who would start treatment with
varenicline (n=74) or bupropion (n=31) Gene expression analysis was performed
through custom RTsup2 Profiler PCR array assay including 17 genes for analysis in
peripheral blood mononuclear cells (PBMC) Serum sample preparation for the
measurement of analytes was performed by an extraction column composed of hybrid
carbon and silica nanotubes modified with the addition of hydrophilic groups (restricted
access material - RAM) developed by LATF Unifal MG The measurement of analytes
was performed by high efficient liquid chromatography in column switching mode
followed by tandem mass spectrometry (HPLC-MSMS) Times for sample collection
were for gene expression analysis (total blood) before start of therapy (T0) two and
four weeks after start of treatment (T2 and T4 respectively) and for measurement of
analytes (serum) the samples were collected at T2 Results For gene expression
analysis we selected 14 patients who had success and 13 patients resistant to the
varenicline treatment Success was considered to be when a patient achieved tobacco
abstinence until the 4th week of treatment and resistant was when a patient had not
stopped smoking as of the 4th week of treatment We observed a significant difference
for CHRNA7 gene expression in the resistant group samples from T2 and T4 had lower
expression compared with T0 (fold change 038 P=0007 fold change 067 P=0004
respectively) For measurement of analytes the developed RAM column showed high
capacity to remove macromolecules and joint analyzes of different analytes besides
being able to be reuse manny times (about 400 cycles) Patients from resistant group of
the both drugs treatment had a higher concentration of nicotine metabolites in T2
However there was no association of drugs for smoking cessation and their metabolites
with outcome treatment Conclusions For gene expression analysis this exploratory
study showed a possible predictor of effectiveness in the treatment with varenicline
reaffirming the association of the α7 subunit for nicotine dependence and smoking
therapy processes These results may contribute at least in part to the development of
individualized therapy However further studies are needed to understand the role of the
α7 subunit of acetylcholinic-nicotinic receptors in varenicline treatment For the
measurement of analytes the new synthesized RAM is a product of extreme scientific
value being able of several applications in the analysis of samples with complex
matrices without much prior preparation For an association of drugs for smoking
cessation and their metabolites with outcome treatment studies with a larger sample
size are needed
Descriptors Varenicline Bupropion Nicotine Smoking cessation Gene expression
Biomarkers pharmacological
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
O tabagismo eacute considerado a maior causa de morbidade e mortalidade evitaacutevel
em todo o mundo 1 Doenccedilas cardiacuteacas cerebrovasculares cerca de um quinto de todos
os tipos de cacircnceres doenccedilas pulmonares como apneia e enfisema aleacutem de distuacuterbios
preacute-natais estatildeo associadas ao consumo do tabaco 2-5
Dados recentes da Vigitel mostraram que no conjunto das 27 capitais brasileiras
a frequecircncia de adultos fumantes foi de 93 com valores duas vezes maior no sexo
masculino (121) do que no feminino (69) As menores frequecircncias foram
encontradas na populaccedilatildeo de jovens adultos (antes dos 25 anos) e em pessoas de mais
de 65 anos As maiores frequecircncias foram encontradas entre homens em Porto Alegre
(173) Campo Grande e Satildeo Paulo (156) 6
A nicotina eacute o principal componente do tabaco causador de dependecircncia Esta
age nos receptores acetilcoliacutenicos-nicotiacutenicos (nAChRs) promovendo a liberaccedilatildeo de
diversos neurotransmissores e neuroreguladores tais como dopamina acetilcolina
epinefrina norepinefrina serotonina beta-endorfina vasopressina e GABA O principal
neurotransmissor estudado eacute a dopamina pois a nicotina promove aumento de seus
niacuteveis na regiatildeo mesocorticoliacutembica cerebral principalmente em um circuito conhecido
como ldquosistema de recompensardquo (aacuterea tegmental ventral nuacutecleo accumbens e coacutertex preacute-
frontal) gerando sensaccedilotildees de prazer e bem-estar 7-15
O processo de adiccedilatildeo agrave nicotina eacute complexo e nem todos os mecanismos estatildeo
elucidados Aleacutem da ativaccedilatildeo do sistema de recompensa haacute a formaccedilatildeo de memoacuterias
associativas do efeito hedocircnico com os ambientes e situaccedilotildees de disponibilidade e uso
do tabaco resultando em reforccedilo positivo apoacutes o fumante entrar em contato com fatores
relacionados ao seu consumo Este tipo de memoacuteria aprendida envolve a amigdala o
hipocampo o coacutertex preacute-frontal e o coacutertex parietal 15-17 Evidecircncias tambeacutem satildeo
2
consistentes com a hipoacutetese da ativaccedilatildeo do estriado dorsal o qual estaacute envolvido no
processamento de memoacuterias de formaccedilatildeo de haacutebito em processos motores o que
poderia automatizar o ato de fumar 15 18 (Figura 1)
O uso continuado do tabaco promove a desensibilizaccedilatildeo e adaptaccedilatildeo dos
nAChRs causando toleracircncia e diminuiccedilatildeo dos efeitos de recompensa naturais Como
resultado o indiviacuteduo experimenta fissura ansiedade humor deprimido e irritabilidade
na ausecircncia da nicotina Estes sintomas acabam promovendo um reforccedilo negativo para o
fumo e o nuacutemero de cigarros consumidos aumenta cada vez mais 14 15
Todos os fatores acima mencionados contribuem para o mecanismo de
dependecircncia agrave nicotina (DN) Os efeitos hedocircnicos estatildeo relacionados com o processo
de iniciaccedilatildeo do tabagismo enquanto os efeitos negativos da falta da nicotina estatildeo mais
associados agrave manutenccedilatildeo do fumo 15
Para os indiviacuteduos que desejam parar de fumar o tratamento farmacoloacutegico
antitabagismo eacute o que apresenta maior eficaacutecia na reduccedilatildeo da prevalecircncia de fumantes
19
Figura 1 - Aacutereas estimuladas atraveacutes de vias dopamineacutergicas e serotonineacutergicas e sistema de recompensa A
Principais vias ativadas na dependecircncia como a aacuterea tegmental ventral nuacutecleos accumbens e da rafe coacutertex-frontal
estriado susbstacircncia negra e hipocampo As setas em rosa indicam aacutereas estimuladas pelas vias serotonineacutergicas de
transmissatildeo e em azul pelas vias dopamineacutergicas gerando diversos comportamentos B Sistema de recompensa
(composto pela VTA nuacutecleo accumbeacutens e coacutertex preacute-frontal) A nicotina age nos nAChRs no SNC gerando uma
3
descarga de dopamina no sistema de recompensa Haacute uma adaptaccedilatildeo desses receptores com o fumo continuado
fazendo com que haja a necessidade de maior consumo de nicotina e o desenvolvimento da dependecircncia VTA= aacuterea
tegmental ventral SNC sistema nervoso central nAChR= receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico Fonte adaptado de
Habermann A Brain awareness week addiction and the brainrsquos reward system Sovereign Health Group 2016 e de
Koob amp Volkow 2009 14
11 Nicotina farmacodinacircmica e farmacocineacutetica
O fumo permite uma titulaccedilatildeo precisa da dose de nicotina por parte do fumante
Sua absorccedilatildeo eacute raacutepida chegando em cerca de 10 segundos em todo o sistema nervoso
central (SNC) onde se liga nos nAChRs 20 21 22
Os nAChRs satildeo receptores de canais iocircnicos compostos por cinco subunidades
que podem estar combinadas de diferentes formas (Figura 2) 20 Os subtipos desses
receptores mais abundantes no ceacuterebro humano satildeo os α4β2 α3β4 e α7 (homomeacuterico)
Os receptores compostos pelas subunidades α4β2 (o asterisco indica que outras
subunidades podem estar presentes) possuem um papel fundamental na DN O nocaute
da subunidade β2 em ratos resultou na eliminaccedilatildeo dos efeitos comportamentais da
nicotina 23 Quanto agrave subunidade α4 parece estar envolvida na sensibilidade agrave nicotina
o que pode impactar nos efeitos de recompensa dessensibilizaccedilatildeo e toleracircncia24 25 Os
receptores compostos pelas subunidades α3β4 acredita-se mediar os efeitos
cardiovasculares 26 Os nAChRs α7 homomeacuterico estatildeo envolvidos na velocidade de
sinapses em processos de aprendizagem e controle sensorial 27 28 Os receptores
compostos pelas subunidades α4β2lowast podem conter outras subunidades como por
exemplo α5 α6 eou β3 as quais podem modificar a sensibilidade e funccedilatildeo do receptor
21 29
Como um agonista desses receptores a nicotina promove a sua abertura
permitindo a entrada de soacutedio e caacutelcio despolarizando assim a membrana dos
neurocircnios Aleacutem da entrada de caacutelcio atraveacutes dos nAChRs haacute tambeacutem a abertura de
4
canais de caacutelcio voltagem dependentes fazendo com que as vesiacuteculas que armazenam
os neurotransmissores sejam liberadas 20 21 O resultado da ativaccedilatildeo dos nAChRs em
neurocircnios poacutes-sinaacutepticos eacute a liberaccedilatildeo de diversos neurotransmissores ativando vaacuterias
aacutereas como jaacute mencionado
Figura 2 - Receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico O receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico funciona como um
canal iocircnico transmembracircnico Sua composiccedilatildeo eacute pentacircmera ou seja eacute formada por 5 subunidades que
podem se combinar de diferentes formas As subunidades satildeo classificadas de acordo com diferenccedilas nos
domiacutenios da sua estrutura proteiacuteca A acetilcolina e a nicotina satildeo agonistas desses receptores fazendo
com que os mesmos sejam abertos Assim ocorre a entrada de soacutedio despolarizando a membrana
gerando o potencial de accedilatildeo ACh= acetilcolina Nicot= Nicotina Na+= soacutedio K+= potaacutessio α =
subunidade alfa β= subunidade beta δ= subunidade delta γ= subunidade gama Fonte adaptado de Rang
amp Dale Farmacologia 5 ed Elsevier 2012
Haacute oscilaccedilatildeo dos picos de nicotina entre um cigarro e outro mas as quantidades
se acumulam entre 6 e 9 horas em um fumo regular saturando os nAChR causando
desensibilizaccedilatildeo adaptaccedilatildeo toleracircncia sintomas de abstinecircncia na falta do fumo e DN
30
A nicotina eacute rapidamente e extensivamente metabolizada pelo fiacutegado atraveacutes da
isoenzima CYP2A6 (e em menor grau pelas isoenzimas CYP2B6 e CYP2E1) agrave nicotina
-iacuteon iacuteminio e apoacutes pela enzima aldeiacutedo oxidase agrave cotinina O tempo de meia vida da
nicotina eacute de aproximadamente 2 horas e da cotinina 16 horas Posteriormente a
5
cotinina eacute metabolizada em trans-3-hidroxicotinina quase que exclusivamente pela
CYP2A6 (outros isocircmeros da hidroxicotina representam menos de 2 da dose) 31 32
(Figura 3) Esta eacute a maior via de metabolizaccedilatildeo da nicotina (70 - 80 do metabolismo
da nicotina em todo o corpo) 33 no entanto haacute vias menores como por exemplo a
glucoronidaccedilatildeo que pode ser a maior determinante no clearence da nicotina em
indiviacuteduos com menor atividade da CYP2A6 31
Figura 3 - Via primaacuteria do metabolismo da nicotina A nicotina eacute
metabolizada marjoritaramente pela isoenzima CYP2A6 em nicotina-
iacuteon imiacutenio e atraveacutes da enzima aldeiacutedo oxidase eacute convertida em
cotinina A cotinina eacute posteriomente metabolizada em trans-3-
hidroxicotinina novamente pela isoenzima CYP2A6 Fonte adaptado
de Llaquet et al 2010 34
12 Faacutermacos antitabagismo
Os medicamentos de primeira escolha aprovados pela Agecircncia Nacional de
Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) incluem tratamentos com base na terapia de reposiccedilatildeo
nicotiacutenica (TRN) como adesivo goma e pastilha e tambeacutem satildeo utilizados vareniclina e
bupropiona Estes uacuteltimos possuem maior eficaacutecia terapecircutica na cessaccedilatildeo tabaacutegica 35 36
6
121 Vareniclina
1211 Farmacodinacircmica
A vareniclina eacute o faacutermaco mais recentemente utilizado para a interrupccedilatildeo do
tabagismo este foi desenvolvido especificamente para atuar nos nAChRs A sua
farmacodinacircmica estaacute mais associada agrave atuaccedilatildeo como um agonista parcial nos nAChRs
compostos pelas subunidades α4β2 37 os quais satildeo importantes alvos de accedilatildeo da
nicotina pois satildeo necessaacuterios e suficientes para a recompensa toleracircncia e
sensibilizaccedilatildeo 25 38 39 (Figura 4)
Estudos mostraram que em relaccedilatildeo agrave nicotina a vareniclina possui 15 vezes
maior afinidade pelas subunidades α4β2 e ativa em torno de 50 a liberaccedilatildeo de
dopamina no sistema mesocorticoliacutembico 37 O faacutermaco atua tambeacutem em outros
nAChR como nos nAChRs (α3β4) age fracamente nos receptores contendo a
subunidade α6 e em nAChRs (α3β2) aleacutem de exercer atividade agonista total nos
receptores α7 40
Quanto agraves reaccedilotildees adversas no uso do faacutermaco a naacuteusea eacute a mais comum (cerca
de 10 a 45 dos indiviacuteduos tratados) a qual muitas vezes leva agrave natildeo aderecircncia ao
tratatamento 41-43
7
Figura 4 - Mecanismo de accedilatildeo da vareniclina A Na ausecircncia da vareniclina a nicotina se liga aos
nAChRs aumentando a ativaccedilatildeo nesses receptores Aleacutem disso haacute o estiacutemulo endoacutegeno (promovido
pela acetilcolina) B A vareniclina eacute um agonista parcial de nAChR (α4β2) ou seja tambeacutem estimula
os nAChRs mas em menor niacutevel do que a nicotina e ao mesmo tempo eacute antagonista na presenccedila de
nicotina fazendo com que ela natildeo consiga se ligar ao receptor Fonte do autor baseado nas
informaccedilotildees de Kassem et al 2012 37
1212 Farmacocineacutetica
A vareniclina eacute rapidamente absorvida pelo trato intestinal com absorccedilatildeo gt90
logo apoacutes a administraccedilatildeo oral As concentraccedilotildees plasmaacuteticas maacuteximas satildeo alcanccediladas
no periacuteodo entre 3 e 4 horas 44 e o estado de equiliacutebrio da sua concentraccedilatildeo ocorre
dentro de 4 dias 37 44-46 O faacutermaco possui baixa ligaccedilatildeo com proteiacutenas plasmaacuteticas
sendo que de acordo com ensaios in vitro a fraccedilatildeo de vareniclina (100 ngmL) livre foi
de 797 47 A sua biodisponibilidade natildeo eacute afetada pelo tempo de administraccedilatildeo ou
ingestatildeo de alimentos 37 45 46 Aleacutem disso a vareniclina possui ampla distribuiccedilatildeo nos
tecidos sendo que o volume meacutedio de distribuiccedilatildeo aparente eacute de 415 litros
apresentando um coeficiente de variaccedilatildeo (CV) de 50 48
Na circulaccedilatildeo humana a vareniclina se encontra em quantidade marjoritaacuteria satildeo
tambeacutem encontrados os metaboacutelitos conjugados vareniclina N-carbomoil glucoroniacutedeo
8
N-formilvareniclina e oxovareniclina O tempo de meia vida da vareniclina eacute em torno
de 24 horas independente da dose administrada
A eliminaccedilatildeo do faacutermaco e metaboacutelitos se daacute principalmente pela urina (99) 49
A eliminaccedilatildeo renal exibe cineacutetica linear e a sua excreccedilatildeo ocorre pela filtraccedilatildeo
glomerular na qual estaacute associada agrave secreccedilatildeo tubular realizada pelo transportador
catiocircnico orgacircnico OCT2 O clearence estimado da vareniclina eacute de 88 a 155 mLmin
apoacutes administraccedilatildeo de dose uacutenica e 92 a 143 mLmin apoacutes doses repetidas A
depuraccedilatildeo de vareniclina eacute reduzida na presenccedila de doenccedila renal Na urina cerca de
90 do produto eliminado eacute encontrado como vareniclina em sua forma inalterada e
menos de 10 eacute encontrado na forma de 2 metaboacutelitos a hidroxivareniclina e a
vareniclina-N-carbomoil glucoroniacutedeo 37 49-51
Nenhum dos metaboacutelitos da vareniclina eacute acreditado ser farmacologicamente
ativo Aleacutem disso esses metaboacutelitos estatildeo presentes em concentraccedilotildees muito baixas 37
46-49 A Figura 5 mostra os metaboacutelitos provenientes da vareniclina
A formaccedilatildeo dos metaboacutelitos da vareniclina natildeo eacute catalisada pelo complexo
enzimaacutetico CYP450 Ensaios realizados com microssoma hepaacutetico humano mostraram
que a formaccedilatildeo do conjugado vareniclina N-carbomilglucoroniacutedeo eacute provavelmente
catalisado pela enzima UGT2B7 37 49
Figura 5 ndash Metabolismo da vareniclina em humanos Fonte adaptado de Obach et al 2006 49
9
122 Bupropiona
1221 Farmacodinacircmica
A bupropiona eacute um antidepressivo no entanto tem sido utilizado como faacutermaco
antitabagismo devido o seu potencial em diminuir o desejo de fumar (o qual foi
percebido durante o tramento de iacutendiviacuteduos fumantes) Como mecanismo de accedilatildeo a
bupropiona atua como um inibidor relativamente se
letivo da recaptaccedilatildeo de norepinefrina e dopamina com pequeno efeito na
recaptaccedilatildeo de serotonina (Figura 6) aleacutem de ser um antagonista de nAChR natildeo
competitivo Essas propriedades minimizam os sintomas de retirada da nicotina
aumentando a probabilidade do indiviacuteduo se abster do fumo 52
Insocircnia e boca seca satildeo as reaccedilotildees adversas mais comumente relatadas ao uso da
bupropiona (30-40 e 10 dos pacientes respectivamente) 53
Figura 6 - Mecanismo de accedilatildeo da bupropiona A Na ausecircncia da bupropiona neurotransmissores
como a noradrenalina serotonina e a dopamina satildeo recaptados endogenamente pela bomba de
recaptaccedilatildeo B Na presenccedila da bupropiona a qual eacute inibidora da bomba de recaptaccedilatildeo desses
neurotransmissores haacute a estimulaccedilatildeo do sistema de recompensa mais especificamente atraveacutes do
aumento da concentraccedilatildeo de dopamina Dessa forma o sistema continua sendo estimulado mas em
menor grau que a nicotina e as chances de abstinecircncia ao tabaco satildeo aumentadas Fonte do autor
baseado nas informaccedilotildees de Slemmer et al 2000 52
10
1222 Farmacocineacutetica
Conforme ensaios em voluntaacuterios sadios os picos maacuteximos de concentraccedilatildeo
plasmaacutetica de bupropiona satildeo alcanccedilados aproximadamente 3 horas apoacutes a sua
administraccedilatildeo oral O volume de distribuiccedilatildeo aparente eacute de aproximadamente 2000L e
a ligaccedilatildeo com proteiacutenas plasmaacuteticas eacute de 84 para a bupropiona e de 77 para a
hidroxibupropiona (o seu principal metaboacutelito ativo) 54
A bupropiona eacute metabolizada primariamente em uma seacuterie de metaboacutelitos ativos
como a hidroxibupropiona a threohidrobupropiona e a eritrohidrobupropiona (Figura
7) A CYP2B6 eacute a principal enzima que converte a bupropiona em hidroxibupropiona
em humanos No entanto a formaccedilatildeo de threohidrobupropiona e a
eritrohidrobupropiona que ocorre atraveacutes de reaccedilatildeo redutiva natildeo eacute mediada pela
CYP2B6 55 56 A eritroidrobupropiona natildeo pode ser mensurada no plasma apoacutes a
administraccedilatildeo de uma uacutenica dose de bupropiona Os metaboacutelitos ativos satildeo
posteriormente metabolizados em inativos e estes satildeo excretados na urina 54
Inibidores da CYP2B6 como por exemplo a ticlodipina um agente
antiplaquetaacuterio derivado da tienopiridina interagem com a bupropiona diminuindo a sua
hidroxilaccedilatildeo 57 58
Apoacutes a administraccedilatildeo crocircnica de doses de 150 a 300 mgdia a bupropiona e seus
metaboacutelitos assumem cineacutetica linear A bupropiona possui meia vida de 20 horas
aproximadamente e apresenta clearence meacutedio aparente correspondente a cerca de
200Lh A eliminaccedilatildeo da bupropiona ocorre principalmente atraveacutes da urina (87) e das
fezes (10) e eacute excretada em apenas 05 de forma inalterada nos mostrando um
extenso metabolismo 54
11
Figura 7 - Metabolismo da bupropiona em seus principais metaboacutelitos ativos A bupropiona eacute
extensamente metabolizada em hidroxibupropiona pela isoenzima CYP2B6 Os demais metaboacutelitos ativos
aatildeo metabolizados por outras enzimas Fonte adaptado de Hesse et al 2000 55
13 Pesquisa de biomarcadores
A variabilidade interindividual em resposta a faacutermacos antitabagismo sugere que
os tratamentos podem ser mais efetivos em subgrupos de fumantes 59-64 No contexto de
medicina personalizada diversos pesquisadores tecircm buscado a identificaccedilatildeo de
preditores de resposta aos tratamentos de cessaccedilatildeo tabaacutegica os quais geralmente estatildeo
envolvidos em aspectos farmacocineacuteticos e farmacodinacircmicos ou via de atuaccedilatildeo do
faacutermaco como por exemplo os fatores geneacuteticos o perfil de expressatildeo gecircnica de
proteiacutenas e de metaboacutelitos 65-68
Aleacutem de refletir a efetividade do tratamento estes biomarcadores tambeacutem
poderiam indicar a toxicidade ou a ocorrecircncia de efeitos adversos A combinaccedilatildeo
desses fatores com outras variaacuteveis individuais pode ser utilizada para adequar as
estrateacutegias preventivas e terapecircuticas 65-68
12
131 Estudos farmacogeneacuteticos e de expressatildeo gecircnica para vareniclina e
bupropiona
Diversos polimorfismos geneacuteticos tecircm sido associados com resposta agrave
vareniclina e agrave bupropiona 41 65 67-71
King et al 65 mostraram a associaccedilatildeo de polimorfismos de nucleotiacutedeos uacutenicos
(SNPs - single nucletide polimorfisms) nos genes CHRNA4 CHRNA5 CHRNA7
CHRNB2 (codificadores das subunidades α4 α5 α7 e β2 dos nAChRs
respectivamente) com abstinecircncia contiacutenua em resposta agrave vareniclina O mesmo
trabalho tambeacutem encontrou associaccedilatildeo dos polimorfismos nos genes CHRNA3
CHRNA5 CHRNB4 CHRNG (codificam as subunidades α3 α5 β4 e γ dos nAChR
respectivamente) Aleacutem disso os autores demonstraram a associaccedilatildeo de polimorfismos
nos genes HTR3A e HTR3B (codificadores dos receptores serotonineacutergicos) com a
frequecircncia de recaiacuteda no tratamento antitabagismo
Swan et al 41 verificaram a associaccedilatildeo de polimorfismos no gene CHRNB2 com
naacuteusea severa em pacientes tratados com vareniclina
Nosso grupo de pesquisadores encontrou a associaccedilatildeo do polimorfismo
rs10443196 no gene CHRNA4 e do polimorfismo 785AgtG no gene CYP2B6
(codificador da principal isoenzima metabolizadora da bupropiona) com uma maior taxa
de sucesso no tratamento com vareniclina e bupropiona respectivamente 67 68
O gene CYP2B6 eacute um dos alvos mais importantes de estudos farmacogeneacuteticos
no tratamento com bupropiona Diversos polimorfismos neste gene satildeo preditores de
metabolizaccedilatildeo lenta ou raacutepida os quais foram associados com as diferenccedilas de
concentraccedilotildees do faacutermaco e de seu principal metaboacutelito ativo hidroxibupropiona em
amostras bioloacutegicas Essas concentraccedilotildees tambeacutem se associaram agrave variabilidade na
resposta ao tratamento com bupropiona 72-74
13
Polimorfismos podem implicar em diversos mecanismos moleculares como por
exemplo alteraccedilatildeo constituiccedilatildeo ou conformaccedilatildeo de proteiacutenas mudanccedilas poacutes-
traducionais e a regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica gerando variabilidade interindividual
nos niacuteveis de RNA transcrito o que poderiam explicar as diferenccedilas de resposta aos
faacutermacos antitabagismo 72
O polimorfismo CHRNA4 (rs2236196) assim como diversos polimorfismos
presentes no gene CYP2B6 os quais foram associados agrave resposta ao tratamento com
vareniclina e bupropiona respectivamente foram tambeacutem associados a maiores e
menores niacuteveis de expressatildeo gecircnica 72-75 Tambeacutem vale salientar que assim como a
expressatildeo gecircnica pode afetar a resposta ao tratamento a expressatildeo gecircnica tambeacutem pode
ser alterada em resposta aos faacutermacos 76 Neste sentido Smith et al 76 mostraram que a
vareniclina pode afetar a expressatildeo gecircnica da enzima DNA metiltransferase-1 (DNMT)
que mostrou estar envolvida em mecanismos epigeneacuteticos em neurocircnios corticais
GABaeacutergicos os quais estatildeo relacionados a processos cognitivos em indiviacuteduos
esquizofrecircnicos fumantes
O tratamento crocircnico com vareniclina modificou a expressatildeo dos nAChRs em
ceacuterebros de camundongos O upregulation dos nAChRs (α4β2) pelo uso crocircnico da
vareniclina foi similar ao promovido ao uso crocircnico da nicotina Similar dowregulation
foi visto para os nAChRs (α6β2) A vareniclina aumentou significantemente ambos
nAChRs (α3β4) e α7 enquanto a nicotina teve menor efeito nestes siacutetios 77
Em estudos com pacientes voluntaacuterios a obtenccedilatildeo de amostras do sistema
nervoso central eacute inviaacutevel Como alternativa a esse problema estudos tecircm proposto a
anaacutelise de expressatildeo gecircnica em sangue perifeacuterico 78-80 Embora natildeo seja o tecido alvo da
farmacodinacircmica dos medicamentos antitabagismo o sangue possui muitas
similaridades a niacutevel transcricional com muacuteltiplas regiotildees cerebrais 81
14
Hennings et al 82 mostraram diferenccedilas no perfil de expressatildeo gecircnica em ceacutelulas
mononucleares de sangue perifeacuterico (PBMCs) de pacientes respondedores e natildeo
respondedores a tratamentos com antidepressivos e muitos dos genes diferentemente
expressos satildeo codificadores de receptores tambeacutem presentes no SNC
Ota et al 83 mostraram que os genes GABRR2 (codificador de receptor
GABAeacutergico) e CHRNA3 (codificador da subunidade α3 de nAChR) foram
diferentemente expressos em sangue perifeacuterico em resposta ao tratamento com
risperidona em pacientes com esquizofrenia
Em outro estudo Kordi-Tamandani et al 84 mostraram que os niacuteveis de
expressatildeo gecircnica de SLC6A3 em leucoacutecitos diferiram entre indiviacuteduos dependentes de
opioacuteides e voluntaacuterios saacutedios Este gene eacute codificador de uma importante proteiacutena
recaptadora de dopamina em neurocircnios chamada DAT
Wongsriraksa et al 85 mostraram a expressatildeo das subunidades α4 α5 α7 β1 e
β2 em um estudo de caracterizaccedilatildeo de nAChRs em amostras de PBMC de humanos
atraveacutes de nicotina radioligante sugerindo conter as subunidades α4β2 α4β2α5 eou α7
Por fim diversos estudos tecircm mostrado que os nAChRs satildeo importantes para processos
imunoloacutegicos 86-91
Estudos tecircm evidenciado a expressatildeo de receptores dopamineacutergicos em
leucoacutecitos humanos Embora a dopamina natildeo ultrapasse a barreira hematoencefaacutelica as
diferenccedilas nos niacuteveis de dopamina do sistema nervoso central poderiam alterar a
expressatildeo desses receptores em leucoacutecitos ainda durante a sua formaccedilatildeo via inervaccedilatildeo
da coluna espinal doenccedilas como Parkinson Alzheimer e adiccedilatildeo agraves substacircncias
psicoativas poderiam influenciar na expressatildeo desses receptores em sangue perifeacuterico 92
15
132 Mensuraccedilatildeo de nicotina bupropiona vareniclina e seus metaboacutelitos em
amostras bioloacutegicas
A nicotina possui um baixo tempo de meia-vida e a isoenzima CYP2A6 eacute
predominante responsaacutevel pelo metabolismo da nicotina em cotinina e trans-3-
hidroxicotinina (seus principais metaboacutelitos) 93 94 Estes e a nicotina satildeo marcadores de
exposiccedilatildeo ao tabaco e indicativo de fumo 95
A taxa de metabolizaccedilatildeo da nicotina (NMR) obtida pela relaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de trans-3-hidroxicotininacotinina tem sido associada com DN com
desfecho e com escolha farmacoloacutegica de tratamento antitabagismo 95 96 Os valores
contiacutenuos e categoacutericos de NMR (metabolizadores lentos vs normais e raacutepidos) se
mostraram estaacuteveis em fumantes independente da carga tabaacutegica 32 97 98
A bupropiona eacute um faacutermaco extensamente metabolizado e a principal isoenzima
envolvida em seu metabolismo eacute a CYP2B6 a qual medeia quase que exclusivamente o
processo de hidroxilaccedilatildeo desse faacutermaco formando o metaboacutelito hidroxibupropiona 55
Diversos estudos tecircm associado as concentraccedilotildees de bupropiona e de hidroxibupropiona
em amostras de soro plasma e urina com a resposta ao faacutermaco 73 74
Zhu et al 73 em um estudo cliacutenico duplo-cego e placebo controlado os
indiviacuteduos foram tratados com bupropiona ou placebo por 6 meses Na terceira semana
de tratamento foram colhidas amostras de plasma para mensuraccedilatildeo de bupropiona e seu
principal metaboacutelito ativo a hidroxibupropiona As concentraccedilotildees mais elevadas de
hidroxibupropiona resultaram em melhores resultados de cessaccedilatildeo do tabagismo
Laib et al 74 apresentaram que as concentraccedilotildees de hidroxibupropiona em soro
foram correlacionadas com as diferentes respostas agrave bupropiona em pacientes com
depressatildeo analisadas atraveacutes de uma escala de impressatildeo clinica global
16
Quanto agrave vareniclina este eacute um faacutermaco pouco metabolizado sendo que 5 a
10 da dose pode ser encontrada na forma metaboacutelitos (soro plasma e urina) 49 Os
metaboacutelitos de vareniclina jaacute identificados em humanos em estudos preacutevios satildeo
hidroxivareniclina vareniclina N-carbomoilglucoroniacutedeo oxovareniclina N-
glicosilvareniclina e N-formilvareniclina 47 49 99 Pouco se conhece sobre as enzimas
que metabolizam a vareniclina Obach et al 49 mostrou o envolvimento da enzima
UG2B7 com o processo de glucoronidaccedilatildeo do faacutermaco Ainda natildeo haacute estudos que
associam os metaboacutelitos de vareniclina com resultados de desfecho de tratamento
17
2 JUSTIFICATIVA
Considerando a elevada prevalecircncia do tabagismo e a dificuldade dos indiviacuteduos
fumantes em se abster do tabaco estudos que apontem uma terapecircutica farmacoloacutegica
mais efetiva podem contribuir enormemente para o processo de cessaccedilatildeo tabaacutegica
Neste cenaacuterio a anaacutelise da expressatildeo de genes de interesse e a mensuraccedilatildeo de analitos
podem ser ferramentas uacuteteis na identificaccedilatildeo de marcadores e de subgrupos de resposta
ao tratamento antitabagismo
Escolhemos a realizaccedilatildeo da mensuraccedilatildeo de analitos nas amostras de soro dos
pacientes tratados com ambos os faacutermacos antitabagismo (vareniclina e bupropiona) e
especialmente para os pacientes tratados com vareniclina foram realizadas anaacutelises de
expressatildeo gecircnica de ceacutelulas mononucleares provenientes de amostras de sangue
perifeacuterico (do inglecircs Peripheral Blood Mononuclear Cell - PBMC) O ensaio
customizado para as anaacutelises da expressatildeo de 17 genes foi um grande investimento
financeiro nesta pesquisa e portanto o priorizamos para analisar as amostras dos
pacientes tratados com vareniclina jaacute que eacute o faacutermaco mais novo eficaz e custoso no
tratamento antitabagismo
As anaacutelises de expressatildeo gecircnica em amostras de PBMC satildeo de grande valia pois
seria importante encontrar em amostras de tatildeo faacutecil obtenccedilatildeo como amostras de sangue
um marcador de resposta que poderia ter correlaccedilatildeo com a expressatildeo gecircnica do sistema
nervoso central
Identificar um possiacutevel marcador preditivo de sucesso na utilizaccedilatildeo de um
determinado faacutermaco no iniacutecio da sua administraccedilatildeo foi uma das investigaccedilotildees deste
protocolo Os resultados desse estudo exploratoacuterio podem ser uacuteteis no entendimento do
comportamento de expressatildeo dos genes escolhidos (mais comumente expressos no
18
SNC) em amostras de sangue e na elaboraccedilatildeo de pesquisas mais amplas para a
identificaccedilatildeo de biomarcadores de resposta ao tratamento antitabagismo
19
3 OBJETIVOS
31 Analisar a possiacutevel associaccedilatildeo da expressatildeo de genes de interesse em amostras de
sangue perifeacuterico com a resposta ao tratamento com vareniclina
32 Analisar a possiacutevel associaccedilatildeo das concentraccedilotildees de faacutermacos antibagismo nicotina
e seus metaboacutelitos com a resposta ao tratamento com vareniclina e bupropiona
20
4 METODOLOGIA
41 Casuiacutestica
Foi realizado um estudo de coorte prospectivo no qual foram incluiacutedos 105
pacientes homens e mulheres fumantes provenientes do Programa de Assistecircncia ao
Fumante (PAF) do Instituto do Coraccedilatildeo do Hospital das Cliacutenicas da Faculdade de
Medicina da Universidade de Satildeo Paulo (InCor) com idade ge 18 anos IMC ge 185 e lt
30 kgm2 e que iniciariam o tratamento com vareniclina (n=74 para a mensuraccedilatildeo dos
analitos destes n=27 para as anaacutelises de expressatildeo gecircnica) ou com bupropiona (n=31
para a mensuraccedilatildeo dos analitos) (Figura 8)
A inclusatildeo dos pacientes ocorreu atraveacutes do protocolo de pesquisa ldquoEficaacutecia do
uso de marcadores geneacuteticos na escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismordquo o
qual foi aprovado no processo de submissatildeo ao Comitecirc de Eacutetica Institucional (CAAE
60133816000000068) - SDC 434116007 (Anexo 4) O presente estudo foi aprovado
como subprojeto do anterior atraveacutes do parecer nordm 2118913 (Anexo 1) Os pacientes
foram informados do estudo e consentiram a sua participaccedilatildeo ao assinar o termo de
consentimento livre e esclarecido (Apecircndice)
Foram excluiacutedos do estudo os pacientes que possuiacutessem desordens hepaacutetica
renal e gastrointestinal que comprometessem o metabolismo e eliminaccedilatildeo dos faacutermacos
os pacientes que faziam uso de medicamentos indutores ou inibidores das enzimas do
citocromo P450 nas uacuteltimas 6 semanas os pacientes etilistas e usuaacuterios de droga os
pacientes com doenccedilas psiquiaacutetricas instaacuteveis as mulheres em risco de gravidez e os
pacientes com contra-indicaccedilatildeo ao tratamento com bupropiona ou vareniclina
mencionados acima
21
Os pacientes foram acompanhados pela equipe do PAF e o tratamento
farmacoloacutegico foi conduzido por 12 semanas Foram considerados os seguintes
desfechos no tratamento ldquosucessordquo se o paciente parasse de fumar ateacute a 4ordf semana de
tratamento (T4) e ldquoresistenterdquo se o paciente natildeo conseguisse parar de fumar ateacute a 4ordf
semana de tratamento
22
Bupropiona
n=31
Visita T-1 Visita T0
(iniacutecio da medicaccedilatildeo)
Visita T2 Visita T4
Desfecho
Vareniclina
n=74
RNA Basal Vareniclina
n= 27
RNA RNA
Mensuraccedilatildeo de analitos vs Desfecho (T2)
vareniclina nicotina cotinina e hidroxicotinina
Mensuraccedilatildeo de analitos vs Desfecho (T2)
bupropiona hidroxibupropiona nicotina cotinina e hidroxicotinina
Soro
Soro
Figura 8 - Desenho do estudo O nuacutemero amostral total do estudo foi de 105 pacientes Foram incluiacutedos 74 pacientes tratados com vareniclina e 31 pacientes tratados com bupropiona Esses foram
submetidos agrave coleta de amostras de sangue no periacuteodo de 2 semanas (T2) apoacutes o iniacutecio da terapecircutica Apoacutes foi realizada a mensuraccedilatildeo de analitos e a anaacutelise de associaccedilatildeo com os desfechos de
tratamento Aleacutem disso os pacientes tratados com vareniclina tambeacutem foram submetidos agrave coleta de amostras para a obtenccedilatildeo de RNA em trecircs distintos periacuteodos de tempo antes de iniciar a
terapecircutica (T0) 2 semanas (T2) e 4 semanas apoacutes iniciar a terapecircutica farmacocoloacutegica (T4) Amostras de 14 pacientes que obtiveram sucesso no tratamento e de 13 que obtiveram resistecircncia (n=27)
foram analisadas quanto agrave expressatildeo de 17 genes candidatos (52 amostras ao todo 9 resistentes do tempo T0 7 resistentes do T2 8 resistente do T4 9 sucessos do T0 8 sucessos do T2 e 11 sucessos
do T4 vide toacutepico 42 Nuacutemero amostral) Apoacutes foram realizadas as anaacutelises de associaccedilatildeo entre os niacuteveis dos transcritos e os desfechos e tempos de tratamento Os pacientes foram acompanhados por
12 semanas durante o tratamento farmacoloacutegico no entanto o desfecho foi definido na 4 ordf semana (T4) pois apoacutes esse periacuteodo o tratamento seria reavaliado e poderia haver mudanccedila na medicaccedilatildeo T-
1= visita inicial T0= antes do iniacutecio da terapecircutica T2= 2 semanas apoacutes o iacutenicio do tratamento T4= 4 semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento T12= 12 semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento Desfecho na
visita T4 = ldquosucessordquo se o paciente parasse de fumar ateacute a 4ordf semana de tratamento (T4) e ldquoresistenterdquo se o paciente natildeo conseguisse parar de fumar ateacute a 4ordf semana de tratamento Fonte do autor
Visita T12
Final do tratamento farmacoloacutegico
RNA vs Desfecho (T0 T2 e T4)
14 sucessos e 13 resistentes
CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2
CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3 DRD4
HTR3A HTR3B COMT e SLC6A3
23
42 Fluxo de procedimentos adotados no atendimento aos pacientes
O tratamento farmacoloacutegico antitabagismo possui a duraccedilatildeo de 3 meses (12
semanas) No estudo de ldquoEficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticosrdquo foram coletados
dados cliacutenicos em 7 visitas T-1 (visita inicial) T0 (visita de iniacutecio do tratamento) T2
T4 T6 T8 e T12 (2 4 6 8 e 12 semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico)
Neste projeto foram utilizados os tempos de visita dos pacientes nas consultas
para a realizaccedilatildeo da coleta de amostras Dessa forma foi facilitado o comparecimento
desses pacientes ao procedimento Os pacientes precisavam estar comprometidos em
administrar os medicamentos todos os dias no horaacuterio combinado e terem
disponibilidade de tempo para as coletas as quais natildeo necessariamente coincidiram
com o horaacuterio das consultas pois as coletas foram realizadas no mesmo horaacuterio de
tomada do medicamento para que as anaacutelises de todos os pacientes pudessem ser
comparaacuteveis
Na visita T-1 foi aplicado o TCLE do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores
geneacuteticosrdquo bem como o questionaacuterio para coletar informaccedilotildees cliacutenicas Aleacutem disso os
pacientes foram avaliados quanto agrave DN atraveacutes do teste de Fagerstroumlm para DN (FTND)
100 e do escore de consumo situacional Issa (escore Issa) 101 (Anexos 2 e 3
respectivamente) O escore Issa eacute utilizado pelo PAF para a reclassificaccedilatildeo como
moderados ou altamente dependentes os pacientes que obteacutem o escore de FTND abaixo
de 5 mas que no entanto possuem niacutevel de DN consideraacutevel em relaccedilatildeo aos efeitos
psicoativos da nicotina A reclassificaccedilatildeo ocorre quando os pacientes obtecircm escore Issa
ge3 Apoacutes os pacientes foram randomizados em dois braccedilos do estudo tratamento com
vareniclina ou tratamento baseado na farmacogeneacutetica Os pacientes realizaram coleta
de sangue com o objetivo de obtenccedilatildeo do DNA para o estudo ldquoEficaacutecia do uso de
marcadores geneacuteticosrdquo
24
Apoacutes a genotipagem das amostras e escolha da medicaccedilatildeo dos pacientes
(vareniclina ou conforme geneacutetica) foi realizada ligaccedilatildeo telefocircnica para o paciente
informando o medicamento que iria tomar Nesta mesma ligaccedilatildeo o paciente tambeacutem foi
convidado a participar do presente estudo e todas as informaccedilotildees quanto agrave necessidade
de tomar o medicamento antitabagismo sempre no mesmo horaacuterio quanto aos dias das
coletas bem como as informaccedilotildees de preparaccedilatildeo para os procedimentos foram
transmitidas aos pacientes
Para os pacientes que seriam tratados com vareniclina ainda foi importante levar
em consideraccedilatildeo o horaacuterio que o paciente costumava tomar cafeacute da manhatilde para entatildeo
decidir o horaacuterio de administraccedilatildeo do faacutermaco pois o mesmo precisava ser
administrado apoacutes refeiccedilatildeo generosa com o intuito de diminuir o risco de naacuteusea
As coletas foram padronizadas para serem realizadas agraves manhatildes no mesmo
horaacuterio que o paciente tomaria a primeira dose do dia do medicamento antitabaacutegico O
horaacuterio de coleta entre os pacientes foi fixado entre 7 e 10 horas da manhatilde para evitar
variaccedilatildeo circadiana interpacientes No entanto entre as coletas do mesmo paciente o
horaacuterio de coleta e de administraccedilatildeo do medicamento foi sempre o mesmo com
variaccedilatildeo natildeo superior agrave 1 hora (esta variaccedilatildeo foi registrada)
Os pacientes foram orientados a realizar jejum de 10 horas (sendo liberada a
ingestatildeo de aacutegua e outros medicamentos ateacute 1 hora antes da coleta) e trazer o
medicamento antitabaacutegico para tomar apoacutes o procedimento A dose diurna dos
medicamentos antitabagismo natildeo foi administrada antes da coleta para evitar efeitos
agudos nas anaacutelises O periacuteodo de jejum foi realizado para que a amostra tivesse menor
quantidade de interferentes possiacutevel e tambeacutem para natildeo promover efeitos agudos dos
alimentos na expressatildeo gecircnica Um dia antes de cada coleta foi realizada ligaccedilatildeo
telefocircnica ou envio de mensagem para os pacientes com o objetivo de lembraacute-los do
25
procedimento das orientaccedilotildees de preparo e confirmar o uso e o cumprimento do horaacuterio
de administraccedilatildeo do medicamento antitabagismo (essa confirmaccedilatildeo da adesatildeo foi
realizada para as coletas nas visitas T2 e T4 quando os pacientes jaacute haviam iniciado o
tratamento farmacoloacutegico)
Na visita T0 para os pacientes que iniciariam o tratamento com vareniclina foi
aplicado o TCLE do presente projeto e colheu-se uma amostra de sangue para a
obtenccedilatildeo do RNA ainda antes de iniciarem o tratamento Foram fornecidas aos
pacientes as orientaccedilotildees de como tomar o medicamento e informaccedilotildees para a proacutexima
coleta Os pacientes foram orientados agrave tomarem o medicamento neste mesmo dia ou no
dia seguinte
Na visita T2 foram coletadas amostras de soro dos pacientes tratados com
bupropiona e amostras de soro e RNA dos pacientes tratados com vareniclina
Na visita T4 foram coletadas amostras de RNA dos pacientes tratados com
vareniclina
No Quadro 1 abaixo estatildeo resumidos os procedimentos orientaccedilotildees e coletas de
amostras
Quadro 1 - Procedimentos do protocolo em relaccedilatildeo aos pacientes
T-1 Aplicaccedilatildeo do TCLE do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores
geneacuteticosrdquo
Aplicaccedilatildeo de questionaacuterios
Coleta de DNA
1 dia antes de T0 Ligaccedilatildeo para informar o medicamento que o paciente iria tomar
Convite para participar do presente estudo
Determinar com o paciente qual era o melhor horaacuterio para
26
administraccedilatildeo do medicamento antibagismo (neste mesmo horaacuterio
que foram realizadas todas as coletas)
Orientaccedilotildees para a coleta em T0
T0 Aplicaccedilatildeo do TCLE do presente estudo
Coleta de amostra de RNA (para os pacientes que seriam tratados
com vareniclina)
Orientaccedilotildees para iniciar o tratamento no mesmo dia ou dia
seguinte
1 dia antes de T2 Orientaccedilotildees para coleta em T2
Confirmaccedilatildeo se o paciente estava tomando o medicamento e no
horaacuterio combinado
T2 Aplicaccedilatildeo do TCLE do presente estudo para os pacientes tratados
com bupropiona
Coleta de soro para os pacientes tratados com bupropiona e coleta
de RNA e soro dos pacientes tratados com vareniclina
1 dia antes de T4 Orientaccedilotildees para coleta em T2
Confirmaccedilatildeo se o paciente estava tomando o medicamento e no
horaacuterio combinado
T4 Coleta de RNA dos pacientes tratados com vareniclina
43 Coleta e armazenamento das amostras dos pacientes tratados com vareniclina e
bupropiona
Os pacientes tratados com vareniclina foram submetidos agrave coleta de sangue para
a obtenccedilatildeo de RNA em 3 periacuteodos de tempo T0 (ainda antes de iniciar o tratamento T2
27
e T4 Para isto foram utilizados os tubos PAXgene Blood RNA Tubes BRT (Qiagen
USA) para a obtenccedilatildeo de RNA Apoacutes a coleta os tubos PAXgene foram encubados em
bancada por 2 horas agrave temperatura ambiente para garantir a lise completa das ceacutelulas
sanguiacuteneas e apoacutes os tubos foram armazenados a -20degC ateacute a extraccedilatildeo do RNA das
amostras
No periacuteodo T2 tambeacutem foram coletadas amostras para a obtenccedilatildeo do soro dos
pacientes tratados com vareniclina e bupropiona Neste periacuteodo as concentraccedilotildees dos
metaboacutelitos dos faacutermacos jaacute se encontravam em estado de equiliacutebrio Para isto foram
utilizados tubos sem aditivo (Vacuette Greiner Bio-one) Os tubos foram mantidos a
temperatura ambiente ateacute a formaccedilatildeo de coaacutegulo Apoacutes os tubos foram centrifugados a
4degC a 3000 rpm por 10 min para se obter amostras de soro As amostras foram entatildeo
aliquotadas em 4 criotubos de soro e armazenadas em freezer a -80ordmC ateacute o momento
das anaacutelises
44 Nuacutemero amostral
Quanto ao nuacutemero amostral para o ensaio de expressatildeo gecircnica dos 74 pacientes
tratados com vareniclina foram escolhidas amostras de 27 pacientes (14 do grupo
sucesso e 13 do grupo resistente) baseado em estudos anteriores 83 102 que seguiram
corretamente o jejum que realizaram a tomada do medicamento nos horaacuterios
combinados e compareceram em todos e tempos de coleta Sendo ao todo 81 amostras
devido aos de 3 tempos de tratamento (T0 T2 e T4)
No entanto algumas amostras natildeo apresentaram bons resultados para a anaacutelise
de expressatildeo gecircnica e realizamos o ensaio de expressatildeo para 60 amostras de diversos
tempos Oito amostras natildeo apresentaram resultados de amplificaccedilatildeo e finalizamos com
52 amostras ao todo (9 resistentes do tempo T0 7 resistentes do T2 8 resistentes do T4
28
9 sucessos do T0 8 sucessos do T2 e 11 sucessos do T4) provenientes de 14 pacientes
do grupo sucesso e 13 do grupo resistente Esse tamanho amostral para cada grupo de
anaacutelise eacute comparaacutevel agrave estudos anteriores 102
Quanto ao nuacutemero amostral para a mensuraccedilatildeo dos analitos houve a inclusatildeo de
74 pacientes tratados com vareniclina e 31 tratados com bupropiona Nuacutemero amostral
semelhante foi utilizado no estudo de Laib et al 74 Das 105 amostras 3 amostras dos
pacientes tratados com vareniclina e 1 de paciente tratado com bupropiona apresentaram
concentraccedilotildees abaixo do limite de quantificaccedilatildeo (LQ) e estas foram excluiacutedas das
anaacutelises de concentraccedilatildeo dos analitos ficando com nuacutemero amostral final de 71 para
vareniclina e 30 para bupropiona
45 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica para amostras de pacientes tratados com
vareniclina
451 Concentraccedilatildeo purificaccedilatildeo e extraccedilatildeo de RNA
O processo de purificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo do RNA foi realizado atraveacutes do
PAXgene Blood RNA Kit (Qiagen USA) Antes de iniciar o procedimento a
temperatura dos tubos PAXgene Blood tubes (BRT) (Qiagen USA) os quais estavam
armazenados em freezer -20degC foi estabilizada mantendo os tubos em temperatura
ambiente em torno de 4 horas ou over night
Para o processo de purificaccedilatildeo do RNA primeiramente realizou-se a
homogeneizaccedilatildeo do sangue total contido no tubo PAXgene Blood tubes (BRT) e a
centrifugaccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos por 10 min em 3000 rcf havendo a formaccedilatildeo de um
pellet e o sobrenadante foi desprezado Apoacutes foi realizada a lavagem do pellet
adicionando-se 4 mL de aacutegua livre de RNase (RNFW) mistura foi submetida ao voacutertex
ateacute a dissoluccedilatildeo visiacutevel do pellet e o conteuacutedo foi centrifugado por 10 minutos a 3000
29
rcf sendo descartado o sobrenadante O pellet foi ressuspendido com 350 μL de tampatildeo
de ressuspensatildeo (BR1) atraveacutes de voacutertex ateacute a sua dissoluccedilatildeo e transferido para o tubo
de microcentrifugaccedilatildeo (15 mL MCT) Foram adicionados no tubo MCT 300 μL de
tampatildeo de ligaccedilatildeo (BR2) e 40 μL de proteinase K (PK) a mistura foi submetida ao
voacutertex durante 5 segundos e incubada durante 10 minutos a 55degC com agitaccedilatildeo de 1400
rpm provocando dessa forma a digestatildeo de proteiacutenas
Apoacutes o processo de incubaccedilatildeo foram realizados diversos processos de remoccedilatildeo
de impurezas em colunas de rotaccedilatildeo O lisado foi transferido para a coluna de rotaccedilatildeo
do homogeneizador PAXgene (PSC lilaacutes) a qual foi colocada em um tubo de
processamento (PT) de 2 mL e centrifugado durante 3 minutos agrave velocidade de 16100
rcf dessa forma foi realizada a homogeneizaccedilatildeo do lisado de ceacutelulas e remoccedilatildeo dos
detritos celulares residuais Em seguida o sobrenadante da fraccedilatildeo residual foi
transferido para o tubo de microcentrifugaccedilatildeo (15 mL MCT) novo (sem interferir no
pellet) e foram adicionados 350 μL de etanol (96-100 grau de pureza PA) a mistura
foi submetida ao voacutertex e centrifugada por breves instantes (1-2 segundos 500-1000 x g)
para remover as gotas presentes no interior da tampa do tubo
Foram transferidos 700 μL de amostra para a coluna de rotaccedilatildeo de RNA
PAXgene (PRC vermelho) esta foi colocada e um tubo de processamento (PT) de 2
mL no qual foi centrifugado durante 1 minuto a 12000 rcf Apoacutes a coluna de rotaccedilatildeo
foi colocada em um tubo PT novo (o tubo PT utilizado anteriormente foi descartado) O
restante da amostra foi colocado na mesma coluna de rotaccedilatildeo PRC e o processo de
centrifugaccedilatildeo foi repetido por mais 2 vezes sempre transferindo a coluna para um tubo
de processamento novo Antes da uacuteltima centrifugaccedilatildeo foram adicionados 350 μL de
tampatildeo de lavagem 1 (BR3) na coluna PRC
30
Em seguida foram adicionados 10 μL de soluccedilatildeo-matildee de DNase I (RNFD) a 70
μL de tampatildeo de digestatildeo de DNA (RDD) em um tubo de microcentrifugaccedilatildeo de 15
mL (MCT) O conteuacutedo foi misturado suavemente e centrifugado durante breves
instantes para colher o liacutequido residual dos lados do tubo Apoacutes 80 μL dessa mistura
foram transferidos diretamente para a membrana da coluna PRC e esta foi incubada agrave
temperatura ambiente (20-30degC) durante 15 minutos
Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foram adicionados 350 μL de tampatildeo de lavagem
1 (BR3) para a membrana da coluna e esta foi centrifugada durante 1 min a 12000 rcf
Apoacutes a coluna PRC foi colocada em um tubo (PT) novo e foram adicionados 500 μL de
tampatildeo de lavagem 2 (BR4) na membrana da coluna A centrifugaccedilatildeo foi repetida o
tubo PT foi descartado e a coluna PRC foi colocada em um novo tubo PT A lavagem
com 500 uL de BR4 e a centrifugaccedilatildeo foi repetida novamente (poreacutem o tempo de
centrifugaccedilatildeo foi de 3 minutos) Apoacutes foi realizada uma centrifugaccedilatildeo adicional em um
tubo PT novo durante 1 minuto a 12000 rcf (sem adiccedilatildeo de tampatildeo)
A coluna de rotaccedilatildeo (PRC) foi colocada em tubo de 15 mL (MCT) Foram
adicionados diretamente na membrana da coluna 80 μL de tampatildeo de eluiccedilatildeo (BR5) a
qual foi encubada agrave temperatura ambiente por 5 minutos e centrifugada por 1 minuto a
12000 rcf para eluir o RNA
As amostras foram quantificadas atraveacutes de leitura em espectrofotocircmetro no
comprimento de onda 260 nm (utilizando como branco o tampatildeo BR5) e foram
armazenadas a -20ordmC ateacute o momento das anaacutelises Para avaliar a qualidade do RNA
gerado foi realizada uma eletroforese em gel de agarose para a verificaccedilatildeo da
integridade do RNA ribossomal
31
452 Siacutentese de cDNA
O processo de siacutentese de cDNA foi realizado atraveacutes do RT2 First Strand Kit
(Qiagen USA) Os reagentes do kit foram descongelados e centrifugados brevemente
(10-15 segundos)
Primeiramente foi preparada uma mix para a degradaccedilatildeo do DNA genocircmico
composta por 2microL de tampatildeo GE 800 ng de RNA e quantidade variaacutevel de aacutegua livre
de RNase ateacute o volume final de 10 μL ou 8 μL de RNA (para amostras com
concentraccedilotildees abaixo de 100 ngμL) sem a aacutegua livre de RNase A mistura foi incubada
a 42ordmC por 5 minutos Apoacutes a incubaccedilatildeo a mistura foi colocada imediatamente em gelo
durante pelo menos 1 min
Apoacutes foi preparada uma mix para a realizaccedilatildeo da transcriccedilatildeo reversa esta foi
composta por 4 microL tampatildeo 5x (BC3) 1 microL de controle P2 (controle externo de RNA) 2
microL de mix de transcriptase reversa (RE3) e 3 microL de aacutegua livre de Rnase Foram
adicionados 10 μL da mix preparada em cada tubo contendo a mix de eliminaccedilatildeo de
DNA genocircmico A mistura foi homogeneizada delicadamente com a pipeta e incubada a
42 degC durante exatamente 15 min em seguida a reaccedilatildeo foi interrompida por incubaccedilatildeo
a 95 degC durante 5 min Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foram adicionados a cada reaccedilatildeo
91 μL de aacutegua livre de RNase e a mistura foi homogeneizada atraveacutes de pipeta diversas
vezes O produto final foi armazenado a -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo em cadeia da
polimerase (PCR) em tempo real
453 Ensaio de controle de qualidade das amostras para o ensaio de expressatildeo
gecircnica
Todas as amostras de cDNA foram analisadas quanto sua qualidade pelo ensaio
de controle de qualidade (disco QC Qiagen) em disco de 100 poccedilos (representaccedilatildeo do
32
disco nas Figuras 9 e 10) atraveacutes do PCR em tempo real com equipamento Rotor Gene
6000 (Corbett) Cada disco QC tem a capacidade de analisar 12 amostras sendo
necessaacuterios 5 discos para analisar 60 amostras
O disco QC eacute composto por primers especiacuteficos para a amplificaccedilatildeo de 2
Housekeeping genes ndash ACTB e HPRT1 (genes constitutivos que satildeo necessaacuterios para a
manutenccedilatildeo baacutesica da funccedilatildeo celular e satildeo expressos em todas as ceacutelulas de um
organismo em condiccedilotildees normais e fisiopatoloacutegicas) e 6 controles 1 controle de
transcriccedilatildeo reversa (RTC) 1 controle positivo de PCR (PPC) 1 controle de
contaminaccedilatildeo com DNA genocircmico (GDC) 1 controle de natildeo transcriccedilatildeo reversa
(NTR) 1 PPC (sem amostra) e 1 controle negativo NTC (mapa na Figura 10)
Foram preparadas 12 mixes para cada uma das amostras de cDNA Sendo 92 μL
de aacutegua livre de RNase e 08 μL de cDNA essas quantidades foram multiplicadas por 6
para se ter sobra e distribuir em 5 poccedilos cada mix de amostra (poccedilos que continham
pares de primers para 2 housekeeping genes e 3 controles) Foram distribuiacutedos 10 μL de
mix e 10 μL de RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR Master Mix (Qiagen USA) em cada
poccedilo (linhas A a E) Essa master mix conteacutem corante fluorescente intercalante de DNA
Apoacutes foram preparadas 12 mixes uma para cada amostra matildee de RNA (diluiacutedo
1100) Foram utilizados 963 μL de aacutegua livre de RNase e 072 μL de RNA (1100)
essas quantidades foram multiplicadas por 3 para se ter sobra Foram pipetados 1037
μL de mix de RNA e 963 μL de RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR Master Mix em
cada poccedilo da linha F para a anaacutelise do controle de transcriccedilatildeo reversa NTR
Apoacutes foram preparadas mixes sem as amostras para os 2 uacuteltimos controles PPC
e NTC compostas por 10 μL de aacutegua e 10 μL de RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR
Master Mix (multiplicados por 24) para as linhas G e H
33
O disco foi submetido agrave seguinte programaccedilatildeo 1 ciclo de 10 minutos a 95degC
(temperatura de ativaccedilatildeo da Taq polimerase) e 40 ciclos de 15 segundos a 95degC e 30
segundos a 60degC (para a amplificaccedilatildeo e realizaccedilatildeo da captura dos dados de
fluorescecircncia) Atraveacutes do software real-time cycler (Qiagen USA) foi ajustada a linha
de base (Threshold) do graacutefico de amplificaccedilatildeo logariacutetimica do cDNA para dessa
forma remover ruiacutedos na anaacutelise e verificar em qual ciclo de PCR que cada amostra
amplificou (cicle threshold ndash CT) (Figura 11) Os valores de CT foram planilhados e
analisados conforme os paracircmetros de qualidade (Quadro 2)
Figura 9 - Representaccedilatildeo do Rotor-Disc 100 Refere-se a um disco de material plaacutestico contendo 100
poccedilos Este veio de faacutebrica personalizado com primers para os ensaios QC ou RT2 profiler PCR array As
amostras e mixes satildeo pipetadas em cada poccedilo O disco eacute posteriormente colocado em um anel metaacutelico
proacuteprio para o encaixe no equipamento Rotor-Gene Cada poccedilo eacute nomeado com uma letra e um nuacutemero
iniciando no A1 ateacute o H12 Os quatro uacuteltimos poccedilos natildeo satildeo nomeados e natildeo conteacutem ensaio (no entanto
preenchemos com mix para equilibrar o peso do disco) Fonte do autor
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB
B HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1
C RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC
D PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC
E GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC
F NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR
G PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC
H NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC
Figura 10 - Mapa do disco QC (representaccedilatildeo planilhada) Do A1 ao B12 housekeeping genes para 12
amostras C1 ao H12 controles Cada grupo de cor representa a colocaccedilatildeo de uma mix Do A1 ao E1 mix de
A1
C1
E1
G1
34
cDNA da amostra 1 do A2 ao E2 mix de cDNA da amostra 2 (assim por diante ateacute A12 e E12) Linha F controle
com RNA diluiacutedo (1100) Linhas G e H controles com aacutegua livre de RNase Fonte do autor
Figura 11 - Exemplo de ajuste de Threshold A linha de base (Threshold) eacute ajustada na fase linear do ciclo
de amplificaccedilatildeo Dessa forma eacute possiacutevel remover os ruiacutedos e se obter o ciclo em que cada amostra foi
amplificada na PCR (CT) Fonte do autor imagem do equipamento Rotor Genereg
Quadro 2 - Paracircmetros de qualidade do ensaio QC
Controles Teste Passa no teste Falha no teste
Controle de transcriccedilatildeo reversa CT RTC (linha B) ndash CTPPC (linha G) lt5 gt5
Controle positivo de PCR CT PPC (linha G)
CT PPC (linha D) - CT PPC (linha G)
14 plusmn 2
lt3
gt16
gt3
Controle de contaminaccedilatildeo de DNA genocircmico CT GDC (linha E) gt33 lt33
Controle de natildeo transcriccedilatildeo reversa CT NTR (linha F) ge 33 ou NA lt33
Controle negativo CT NTC (linha H) ge 33 ou NA lt33
10-02
10-04
10-06
10-08
10-10
10-12
10-14
10-16
10-18
10-20
10-22
10-24
10-26
10-28
5 10 15 20 25 30 35 40
Ciclos
Flu
ore
scecircn
cia
No
rmal
izad
a
Fase Linear
35
De 60 amostras analisadas 52 passaram no teste quanto aos criteacuterios de
qualidade e prosseguiram para a anaacutelise de expressatildeo gecircnica do painel de genes
escolhidos
454 Ensaio de expressatildeo gecircnica
O protocolo de expressatildeo foi realizado por PCR em tempo real atraveacutes do
equipamento Rotor Gene 6000 (Corbett) com ensaio customizado RTsup2 Profiler PCR
Array em disco com capacidade de 100 poccedilos (Rotor-Disc 100 Qiagen USA) Nos 100
poccedilos de cada disco estavam distribuiacutedos primers especiacuteficos para o ensaio de expressatildeo
de 17 genes (Figuras 9 e 12 e Quadro 3) (17 pares de primers para cada gene repetidos 4
vezes na placa pois foi possiacutevel a anaacutelise de 4 amostras de cDNA por disco) 4 pares de
primers para os Housekeeping genes B2M GAPDH HPRT1 e ACTB (Quadro 4) e 3
controles 1 controle de contaminaccedilatildeo com DNA genocircmico (HGDC) 1 controle de
transcriccedilatildeo reversa (RTC) e 1 controle positivo de PCR (PPC) Os 4 Housekeeping
genes e os 3 controles tambeacutem satildeo repetidos 4 vezes no disco (Figura 5) Para as
reaccedilotildees foi utilizada a RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR Master Mix (Qiagen USA)
Primeiramente foi preparada 4 mixes (uma para cada amostra de cDNA) para um
disco de 100 poccedilos composta por 275 μL de 2X RT2 SYBR Green ROX FAST
Mastermix 2262 microL de aacutegua livre de RNase e 488 microL de amostra de cDNA cada Em
cada um dos poccedilos do disco foram adicionados 20 μL da mix preparada (utilizando
mixes de diferentes amostras a cada 24 poccedilos) Apoacutes deste processo o disco foi selado
com o Rotor-Disc Heat Sealer (Qiagen USA) e colocado no equipamento Rotor-Gene
6000 (Corbett) O real-time foi programado para ciclagem de PCR nas seguintes
condiccedilotildees 1 ciclo a 95deg C com duraccedilatildeo de 10 minutos 40 ciclos a 95degC por 15
segundos e 60degC por 30 segundos
36
Quadro 3 - Genes escolhidos para o ensaio de expressatildeo
CHRNA3 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α3
CHRNA4 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α4
CHRNA5 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α5
CHRNA6 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α6
CHRNA7 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α7
CHRNB2 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade β2
CHRNB3 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade β3
CHRNB4 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade β4
CHRNG Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade γ
DRD1 Codifica o receptor de dopamina tipo 1
DRD2 Codifica o receptor de dopamina tipo 2
DRD3 Codifica o receptor de dopamina tipo 3
DRD4 Codifica o receptor de dopamina tipo 4
HTR3A Codifica o receptor 3A de serotonina
HTR3B Codifica o receptor 3B de serotonina
COMT Codifica a enzima catecol-O-metiltransferase (metaboliza dopamina)
SLC6A3 Codifica a proteiacutena DAT que promove a recaptaccedilatildeo de dopamina DAT
Quadro 4 - Housekeeping genes
B2M Codifica a microbulina subunidade β2
GAPDH Codifica a enzima gliceraldeiacutedo ndash 3 fosfato desidrogenase
HPRT1 Codifica a enzima hipoxantina fosforribosiltransferase 1
ACTB Codifica a β actina
37
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
B DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
C CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
D DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
E CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
F DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
G CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
H DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
Figura 12 - Mapa do disco do ensaio RT2 profiler PCR array (representaccedilatildeo planilhada) O disco conteacutem 100 poccedilos no
entanto apenas 96 poccedilos contecircm ensaios sendo que 4 poccedilos ficam vazios A1 ao B5 = genes escolhidos para anaacutelise de
expressatildeo Do B6 ao B9= Housekeeping genes Do B10 ao B12= controles C1 ao D12 E1 ao F12 e G1 ao H12= repeticcedilatildeo dos
ensaios permitindo a anaacutelise completa de 4 amostra Cada cor diferente (a cada 2 linhas) representam a anaacutelise de uma
amostra Fonte do autor
455 Anaacutelise dos dados de expressatildeo gecircnica
Para a anaacutelise de expressatildeo gecircnica foi utilizado o meacutetodo de 2-∆∆CT 103 Apoacutes o
teacutermino da corrida do ensaio de expressatildeo gecircnica atraveacutes do software real-time cycler
(Qiagen USA) foi ajustada a linha de base (threshold) no graacutefico de amplificaccedilatildeo em
escala logariacutetmica (Figura 11) Todos os discos (total de 13) foram analisados com o
mesmo valor de threshold (010869) para que os valores de CT de todas as amostras
fossem comparaacuteveis
Os dados de CT tambeacutem foram inseridos no programa SPSS para as anaacutelises
estatiacutesticas Os valores de CT foram normalizados atraveacutes da expressatildeo dos
housekeeping genes utilizando a seguinte foacutermula ∆CT= (CTamostra ndash a meacutedia de
CThousekeeping genes) Os valores de mediana de 2-∆CT (em escala logariacutetmica) de cada grupo
foram utilizados para os testes de hipoacutetese Apoacutes foram obtidos os valores de ∆∆CT
(mediana de ∆CTgrupo teste ndash mediana de ∆CT grupo referecircncia) e o fold change (aumento ou
diminuiccedilatildeo da expressatildeo dos genes em relaccedilatildeo ao grupo referecircncia) foi calculado
atraveacutes da foacutermula 2-∆∆CT
38
46 Mensuraccedilatildeo de bupropiona vareniclina e de seus metaboacutelitos por HPLC-
MSMS
461 Materiais equipamentos e condiccedilotildees adotadas para a mensuraccedilatildeo dos
analitos apoacutes validaccedilatildeo do meacutetodo
Padrotildees analiacuteticos e padrotildees internos (PIs) deuterados bupropiona
hidroxibupropiona vareniclina (Santa Cruzreg) vareniclina d4 (TRCreg) nicotina
(ChemCruzreg) cotinina (Sigma-Aldrichreg) hidroxicotinina (Torontoreg) e
hidroxibupropiona d6 nicotina d4 cotinina d3 hidroxicotinina d3 (Cerilliantreg)
Solventes orgacircnicos Metanol acetonitrila (JT Baker) e sais acetato de amocircnio
fosfato de soacutedio (Vetecreg) fosfato de soacutedio monobaacutesico (Proquimiosreg) fosfato
de amocircnio (Reagenreg) formiato de amocircnio (Sigma-Aldrichreg)
Equipamentos e acessoacuterios
o HPLC Shimadzureg (Kyoto Japatildeo) equipado com uma vaacutelvula comutadora
de 6 vias automaacutetica
o Auto-amostrador Shimadzureg (Kyoto Japatildeo)
o Vaacutelvula comutadora de 6 vias 11R-0016H (Valcoreg Houston TX USA)
o Espectrocircmetro de massas LCMS-8030 Shimadzureg (Kyoto Japatildeo)
o Analisador de massa triplo quadrupolo (Shimadzureg Kyoto Japatildeo)
o Coluna analiacutetica ACEreg C18 (100 mm x 21 mm x 3 microm comprimento
diacircmetro interno e tamanho de partiacutecula)
o Preacute-coluna ACEreg C18 (21mm x 3 microm diacircmetro tamanho de partiacutecula)
39
o Coluna de extraccedilatildeo coluna contendo aproximadamente 70 mg do novo
RAM
Software
o LabSolutionsreg para anaacutelise dos dados e programaccedilatildeo do meacutetodo no
HPLC-MSMS
Condiccedilotildees espectrometricas e cromatograacuteficas
o Temperatura da forno da coluna 40ordmC
o Temperatura da linha de dessolvataccedilatildeo 250ordmC
o Temperatura do bloco de aquecimento 400ordmC
o Fluxo do gaacutes de nebulizaccedilatildeo 20 ml min-1
o Fluxo de gaacutes para secagem 150 ml min-1
o Energias de colisatildeo precursores e fragmentos dos analitos (Tabela 1)
o Fase moacutevel de carregamento (liberada pela bomba A) Aacutegua ultra pura
em um fluxo de 04 mL min-1
o Fase moacutevel de eluiccedilatildeoseparaccedilatildeoionizaccedilatildeo (liberada pela bomba C)
metanol tampatildeo formiato de amocircnio 001 mol L-1 pH=42 (9010 vv)
em um fluxo de 04 mL min-1
o Fase moacutevel de limpeza (liberada pela bomba B) acetonitrila aacutegua ultra
pura isopropanol (751510 vvv) em um fluxo de 10 mL min -1
o Sistema de anaacutelise ULPC-MSMS no modo columns switching em
configuraccedilatildeo backflush modo de ionizaccedilatildeo positiva por electrospray
(ESI+)
40
Tempos
o Fase de carregamento e condionamento do sistema (vaacutelvula na posiccedilatildeo
1) 0 - 30 min
o Fase de eluiccedilatildeo (vaacutelvula na posiccedilatildeo 2) 03 min
o Fase de limpeza separaccedilatildeo e anaacutelise por MS (vaacutelvula na posiccedilatildeo 1) 67
min
o Recondiocionamento do sistema (vaacutelvula na posiccedilatildeo 1) 50 min
o Tempo total incluindo todos os processos 15 min
o
Tabela 1 - Analitos precursores fragmentos e energias de colisatildeo otimizados
Analitos Precursor (mz) Fragmentos (mz) Energia de colisatildeo
(KV)
Vareniclina 212 169 -23
183 -24
141 -43
Bupropiona 240 131 -28
139 -26
103 -39
Hidroxibupropiona 256 139 -29
131 -29
167 -29
Nicotina 163 117 -28
130 -22
77 -44
Cotinina 177 80 -24
98 -21
70 -34
Hidroxicotinina 193 80 -30
134 -19
118 -21
Fragmentos quantificados
41
462 Visatildeo geral do desenvolvimento da coluna e padronizaccedilatildeo da anaacutelise
Todos os padrotildees para as anaacutelises dos analitos foram adquiridos e armazenados
conforme recomendaccedilatildeo do fabricante ateacute o momento da padronizaccedilatildeo das anaacutelises As
anaacutelises foram realizadas atraveacutes da colaboraccedilatildeo com o Prof Dr Eduardo Costa de
Figueiredo Dr Henrique Dipe Faria e Prof Dra Isarita Martins do Laboratoacuterio de
Anaacutelises de Toxicantes e Faacutermacos ndash LATF da Faculdade de Ciecircncias Farmacecircuticas da
Universidade Federal de Alfenas (Unifal MG) A escolha de cada analito foi
determinada atraveacutes de sua importacircncia cliacutenica e tambeacutem devido agrave disponibilidade dos
padrotildees dos analitos no mercado Os analitos mensurados para as amostras provenientes
dos pacientes tratados com os faacutermacos antitabagismo foram bupropiona
hidroxibupropiona vareniclina nicotina cotinina e hidroxicotinina (os trecircs uacuteltimos satildeo
proveninentes do fumo) Foi realizado um levantamento das propriedades fiacutesico-
quiacutemicas dos metaboacutelitos conforme Quadro 5
Para a remoccedilatildeo das macromoleacuteculas (como proteiacutenas) presentes na matriz de
soro foi desenvolvida uma coluna extratora de acesso restrito a partir de nanotubos
hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados com ligaccedilotildees hidrofiacutelicas (novo RAM) O
material foi desenvolvido e caracterizado antes mesmo da padronizaccedilatildeo das condiccedilotildees
de anaacutelise nos equipamentos
Foram obtidas as condiccedilotildees espectomeacutetricas (modo de ionizaccedilatildeo e as condiccedilotildees
de sua fonte temperatura do bloco de calor fluxo de gaacutes nebulizador e fluxo do gaacutes
secante) e cromatograacuteficas (tempo de retenccedilatildeo e separaccedilatildeo e aacutereas obtidas dos picos de
cada analito) Apoacutes as condiccedilotildees foram otimizadas em sistema de cromatografia liacutequida
de alta eficiecircncia multidimensional seguida por espectrometria de massa (HPLC-
MSMS) O sistema multimensional constituiacutedo por vaacutelvulas comutadoras permite a
anaacutelise online e automatizada com configuraccedilatildeo via software As vaacutelvulas permitem
42
diferentes posiccedilotildees promovendo a ocorrecircncia de eventos distintos no sistema como a
concentraccedilatildeo dos analitos e remoccedilatildeo de macromoleacuteculas atraveacutes da coluna extratora
(posiccedilatildeo 1) a eluiccedilatildeo dos analitos da coluna extratora para a coluna analiacutetica (posiccedilatildeo 2)
e novamente na posiccedilatildeo 1 ocorre a eluiccedilatildeo dos analitos da coluna analiacutetica para o
espectrocircmetro de massas a limpeza da coluna extratora e o recondionamento do
sistema
Quadro 5 - Propriedades fiacutesico-quiacutemicas dos analitos
Bupropiona
Peso molecular 27620 gmol
Ponto de fusatildeo 243-246deg C
Solubilidade em aacutegua 00693 mgmL
pKa (aacutecido forte) 1829
pKa (mais forte baacutesico) 822
Aacuterea da superfiacutecie polar 291 Aring2
Log P 36
Hidroxibupropiona
Peso molecular 25574 gmol
Ponto de fusatildeo 121-123degC
Solubilidade em aacutegua 02 mgmL
pKa (aacutecido forte) 1479
pKa (mais forte baacutesico) 765
Aacuterea da superfiacutecie polar 4933 Aring2
Log P 222
Vareniclina
Peso molecular 21127 gmol
Pressatildeo de vapor 25degC
Solubilidade em aacutegua 877 x 10-2 gL
pKa1 182 pKa2 = 973
Aacuterea da superfiacutecie polar 378 Aring2
Log P 103
43
Nicotina
Peso molecular 16223 gmol
Pressatildeo de vapor 618 degC
Solubilidade em aacutegua 100 mM
pKa 85 pKb1 616 a 15degC e pKb2 1096
Aacuterea da superfiacutecie polar 378 Aring2
Log P 117
Cotinina
Peso molecular 176215 gmol
Solubilidade em aacutegua 10 x10-6 mgL a 25degC
Aacuterea da superfiacutecie polar 332 Åsup2
Log P 007
Hidroxicotinina
Peso molecular 192214 gmol
Aacuterea da superfiacutecie polar 53 Å2
ACDLog P -148
Fonte Banco de dados Pubchem e ChemSpider Obs Algumas informaccedilotildees referentes agraves
propriedades fiacutesico-quiacutemicas dos analitos ainda natildeo estatildeo disponiacuteveis na literatura pKa= valor
negativo do logaritmo da constante de dissociaccedilatildeo de um aacutecido pKb= valor negativo do logaritmo
da constante de dissociaccedilatildeo de uma base LogP= coeficiente de particcedilatildeo
463 Desenvolvimento da coluna RAM para a purificaccedilatildeo da amostra
As amostras de soro e plasma satildeo matrizes ricas em moleacuteculas que interferem na
mensuraccedilatildeo dos analitos como lipiacutedios e principalmente proteiacutenas Estas podem
obstruir colunas analiacuteticas e diminuir a concentraccedilatildeo dos analitos jaacute que muitos destes
estatildeo ligados a essas proteiacutenas Devido a esse fato geralmente eacute realizada uma
preparaccedilatildeo das amostras antes de sua mensuraccedilatildeo Essa preparaccedilatildeo envolve processos
como a extraccedilatildeo com o uso de solventes precipitaccedilatildeo entre outros os quais geram
custo de materiais aumento do tempo de trabalho e de erros 104 105 51 106 Dessa forma
44
diversos estudos vecircm tentando desenvolver meacutetodos que natildeo exijam tanta manipulaccedilatildeo
das amostras Os materiais de acesso restrito (RAMs) estatildeo sendo utilizados para a
menor preparaccedilatildeo da amostra e sua injeccedilatildeo direta Dentre os RAMs estatildeo os nanotubos
de carbono (CNTs) modificados 107-109 Nesta colaboraccedilatildeo foi desenvolvida a coluna
extratora composta por nanotubos hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados com a
adiccedilatildeo de grupos hidrofiacutelicos Esse material entrou com pedido de patente na Agecircncia
de Inovaccedilatildeo e Empreendedorismo da Universidade Federal de Alfenas-MG atraveacutes do
Processo 230870001282019-84 e portanto a sua composiccedilatildeo e os resultados de
alguns testes da sua caracterizaccedilatildeo seratildeo mantidos em sigilo (vide declaraccedilatildeo Anexo
5)
Diferentes RAMs foram sintetizados a partir de CNTs para que fosse obtido o
melhor desempenho na remoccedilatildeo de macromoleacuteculas e retenccedilatildeo dos analitos da amostra
Os CNTs utilizados foram compostos por paredes muacuteltiplas pois apresentam uma
elevada aacuterea superficial e consequentemente uma maior capacidade de adsorccedilatildeo Os
CNTs foram adquiridos comercialmente e inicialmente foram funcionalizados a partir
de reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo aacutecida com aacutecido niacutetrico como desenvolvido por Barbosa et al 109
Os CNTs oxidados foram utilizados em etapas de siacutentese posteriores
adicionando grupos quiacutemicos hidrofiacutelicos que fossem capazes de realizar a exclusatildeo de
proteiacutenas e permitir a adsorccedilatildeo dos analitos As reaccedilotildees de siacutentese posteriores foram
semelhantes as promovidas para a realizaccedilatildeo de revestimento externo de poliacutemeros
poliacutemeros biomimeacuteticos nanomagneacuteticos com e sem acesso restrito 107 110-112 poreacutem
foram utilizadas estrateacutegias e proporccedilotildees de reagentes distintas na tentativa de obter o
RAM mais eficiente Aleacutem disso tambeacutem foi priorizada a siacutentese mais simples e
reprodutiacutevel bem como o material que apresentar maior vida uacutetil Os diferentes
materiais sintetizados foram testados em relaccedilatildeo agrave exclusatildeo de proteiacutenas e adsorccedilatildeo dos
45
analitos e tambeacutem foram realizados testes de caracterizaccedilatildeo para determinar suas
propriedades fiacutesico-quiacutemicas e confirmar a estrutura originada
A anaacutelise termogravimeacutetrica foi realizada com a finalidade de determinar a
variaccedilatildeo de massa (ganho ou perda) do RAM em funccedilatildeo de emprego de temperatura
programada proporcionando informaccedilotildees importantes a respeito da estabilidade do
material e de sua composiccedilatildeo Outras teacutecnicas tambeacutem foram utilizadas com o objetivo
de obter dados relacionados agrave estrutura e composiccedilatildeo do novo RAM como o
infravermelho e anaacutelise elementar Anaacutelises de microscopias eletrocircnicas de varredura e
de transmissatildeo tambeacutem foram realizadas para a determinaccedilatildeo da composiccedilatildeo da
superfiacutecie externa e arranjo estrutural do material com as modificaccedilotildees realizadas
Apoacutes o teacutermino do preparo do novo RAM eles foram colocados dentro de uma
coluna (aproximadamente 70 mg) conforme (Figura 13) A coluna foi posteriormente
empregada no preparo de amostras online no sistema cromatograacutefico
Figura 13 ndash Representaccedilatildeo da composiccedilatildeo da coluna extratora (Novo RAM) O novo RAM formado
a partir de nanotubos hiacutedridos de carbono e siacutelica dotado de muacuteltiplas camadas e modificados com grupos
hidrofiacutelicos promovem a retenccedilatildeo de analitos e exclusatildeo de macromoleacuteculas como proteiacutenas O RAM foi
posteriormente empacotado em coluna para a utilizaccedilatildeo em sistema cromatograacutefico Fonte adaptado do
colaborador Dr Henrique Dipe de Faria Unifal-MG
46
464 Caracterizaccedilatildeo do novo RAM
4641 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA
Na ausecircncia da coluna extratora foi preparada primeiramente uma soluccedilatildeo
aquosa de albumina de soro bovino (BSA) em uma concentraccedilatildeo de 44 mgmL-1
(semelhante agrave concentraccedilatildeo de proteiacutenas presentes no plasma humano) Foram injetados
10 microl desta soluccedilatildeo em triplicata diretamente em sistema cromatograacutefico com detector
UV ajustado a 255 nm utilizando como fase moacutevel o tampatildeo formiato de amocircnio 10
mM pH=42 em um fluxo de 04 mL min-1 O sinal detectado foi de 100 BSA
Posteriormente a coluna preenchida com 70 mg do novo RAM foi inserida no sistema
cromatograacutefico entre o injetor e o detector A soluccedilatildeo de BSA foi analisada em triplicata
novamente no entanto com a presenccedila da coluna extratora desenvolvida (novo RAM)
A aacuterea do sinal obtido nesta segunda anaacutelise dividida pela aacuterea do sinal de 100 BSA
obtida na primeira anaacutelise foi correspondente agrave porcentagem de BSA excluiacuteda pela
coluna
4642 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas no soro
Para analisar a exclusatildeo total de macromoleacuteculas (como lipiacutedios proteiacutenas e
sacariacutedeos) agora nas amostras de soro foi utilizado procedimento semelhante Na
ausecircncia da coluna extratora injetou-se no sistema cromatograacutefico em triplicata 100 μL
de amostra de soro humano branco foram testados pools de soro puros e diluiacutedos 14 A
aacutegua ultra pura foi utilizada como fase moacutevel em um fluxo de 04 mL min-1 e o sinal
obtido foi relacionado a 100 dos interferentes Apoacutes a coluna extratora (o novo
RAM) foi adionado ao sistema e a amostra foi inserida novamente A divisatildeo entre a
aacuterea do pico na primeira anaacutelise pelo pico da segunda anaacutelise refere-se agrave porcentagem
de exclusatildeo de interferentes As condiccedilotildees cromatograacuteficas foram as mesmas do teste
com BSA
47
4643 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA em diferentes pHs
O teste de exclusatildeo de proteiacutenas tambeacutem foi realizado nas mesmas condiccedilotildees
cromatograacuteficas que a anaacutelise anterior utilizando soluccedilatildeo de BSA em triplicata no
entanto diferentes soluccedilotildees como fase moacutevel (variaccedilatildeo de pH de 22 a 70) foram
testadas pois o pH pode influenciar na ionizaccedilatildeo dos analitos dos grupos funcionais
presentes na superfiacutecie do novo RAM e na interaccedilatildeo entre eles o que pode resultar em
diferentes taxas de exclusatildeo de proteiacutenas Estas soluccedilotildees foram os tampotildees fosfato de
soacutedio 10 mM (pHs 22 e 26) formiato de amocircnio 10 mM (pHs 30 a 46) acetato de
amocircnio 5 mM (pHs 52 a 66) e fosfato de soacutedio 5mM (pH 70)
465 Paracircmetros espectromeacutetricos
Com a finalidade de se obter um meacutetodo de anaacutelise capaz de detectar e
quantificar menores niacuteveis possiacuteveis de concentraccedilatildeo dos analitos foram otimizados os
paracircmetros espectromeacutetricos fluxos dos gases secantes e nebulizador modo de
ionizaccedilatildeo temperaturas da linha de dessolvataccedilatildeo e de bloco de aquecimento e as
energias de colisotildees utilizadas para fragmentar os iacuteons precursores para originar os
fragmentos iocircnicos de cada analito Foram realizadas soluccedilotildees padrotildees de cada analito e
dos padrotildees internos (PIs) deuterados (vareniclina d-4 hidroxibupropiona d6 nicotina
d4 cotinina d3 e hidroxicotinina d3) na concentraccedilatildeo de 1 mg L-1 em metanol Cada
uma destas soluccedilotildees foram injetadas separadamente no sistema em um volume de 5 microL
A fase moacutevel utilizada foi constituiacuteda por metanol tampatildeo formiato de amocircnio 001
mol L-1 pH=42 (9010 vv) em um fluxo de 04 mL min-1 e o modo de ionizaccedilatildeo
positiva (ESI+) foi utilizado pois demonstrou ser mais eficiente para ionizar as
moleacuteculas analisadas Essa otimizaccedilatildeo foi obtida utilizando o software Labsolutionsreg
48
466 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatograacutefico multidimensional
Para esta otimizaccedilatildeo foi utilizado um HPLC de dotado de vaacutelvula comutadora
automaacutetica de 6 vias e um injetor automaacutetico de amostras o que permitiu a
automatizaccedilatildeo do processo Ainda o sistema cromatograacutefico foi acoplado a um
espectrocircmetro de massas em tandem (HPLC-MSMS) dotado de um analisador de
massa triplo quadrupolo o qual possui alta sensibilidade e seletividade Incorporou-se
neste sistema uma coluna extratora preenchida com o RAM desenvolvido
O forno foi mantido a 40ordmC e o detector UV operando em um comprimento de
onda de 255 nm A fim de padronizar a anaacutelise foram testadas colunas anaacuteliticas de
diversos tamanhos e composiccedilotildees e variadas proporccedilotildees de fases de moacuteveis
Atraveacutes da anaacutelise do cromatograma foram avaliados o tempo de retenccedilatildeo e
separaccedilatildeo e as aacutereas obtidas dos picos de cada analito O sistema foi utilizado no modo
columns switching na configuraccedilatildeo backflush e as condiccedilotildees da anaacutelise foram
otimizadas como os tempos de exclusatildeo de proteiacutenas de adsorccedilatildeo e eluiccedilatildeo dos
analitos de separaccedilatildeo cromatograacutefica de limpeza da coluna extratora e de
recondicionamento do sistema bem como a composiccedilatildeo das fases moacuteveis de
carregamento de eluiccedilatildeoseparaccedilatildeo e de limpeza
Para a otimizaccedilatildeo dos paracircmetros de anaacutelise foi utilizado um pool de amostras
de soro humano branco em sexplicata Este soro foi dopado com os analitos vareniclina
bupropiona hidroxibupropiona nicotina cotinina e hidroxicotinina em 3 concentraccedilotildees
01 100 e 1000 microg L -1 e com os PIs deuterados na concentraccedilatildeo de 500 microg L -1 Como
o soro eacute uma matriz com alta concentraccedilatildeo de interferentes foram testados pools de
soro branco dopados e injetados sem diluiccedilatildeo diretamente no sistema e diluiacutedos em aacutegua
ultra pura (11) e os perfis analiacuteticos foram entatildeo avaliados
49
467 validaccedilatildeo analiacutetica
Testes para a validaccedilatildeo da anaacutelise otimizada foram realizadas conforme
diretrizes do US Department of Health and Human Services e do Food and Drug
Administration (FDA) 2013 113 Os paracircmetros avaliados foram a seletividade limite
de detecccedilatildeo (LD) limite de quantificaccedilatildeo (LQ) linearidade estabilidade dos analitos
efeito residual e de matriz e recuperaccedilatildeo da extraccedilatildeo
Os ensaios foram realizados em seis repeticcedilotildees (n=6) exceto o ensaio de
recuperaccedilatildeo (n=3) e foi utilizado um pool de amostras de soro branco dopadas com cada
um dos analitos nas concentraccedilotildees de 5 10 20 50 75 100 μg L-1 para vareniclina 1 5
50 250 500 1000 μg L-1 para bupropiona 1 10 100 500 1000 2000 para
hidroxibupropiona 5 10 50 250 500 1000 μg L-1 para nicotina cotinina e
hidroxicotinina Os PIs deuterados foram utilizados na concentraccedilatildeo de 200 μg L-1
47 Anaacutelise estatiacutestica
Em relaccedilatildeo agraves caracteriacutesticas demograacuteficas as variaacuteveis contiacutenuas foram
apresentadas como meacutedia e desvio padratildeo e as categoacutericas como frequecircncias Os testes
Shapiro-Wilk e KolmogorovndashSmirnov foram realizados para verificar a normalidade da
distribuiccedilatildeo das variaacuteveis quantitativas e assim escolher testes parameacutetricos ou natildeo
parameacutetricos Foram realizados os testes Qui-quadrado Exato de Fisher t de Student ou
Mann-Whitney para as anaacutelises comparativas de caracteriacutesticas gerais entre os grupos
de desfecho dos pacientes tanto no ensaio de expressatildeo como de mensuraccedilatildeo dos
analitos Para as anaacutelises de expressatildeo gecircnica o meacutetodo 2-∆∆CT foi utilizado 103 Como os
dados de expressatildeo natildeo apresentaram distribuiccedilatildeo normal foi realizado o teste natildeo
parameacutetrico de Mann-Whitney para testar a hipoacutetese de diferenccedila (valores de 2-∆CT)
intra e entre os grupos de desfechos (sucesso e resistente e tempos de tratamento
50
farmacoloacutegico T0 T2 e T4) Os valores de ∆∆CT (mediana de ∆CTgrupo teste ndash mediana
de ∆CTgrupo referecircncia) foram obtidos para o caacutelculo do fold change O fold-change (2-∆∆CT)
foi calculado para verificar o aumento ou diminuiccedilatildeo de expressatildeo gecircnica entre os
grupos analisados O graacutefico heat map foi construiacutedo atraveacutes do software Gene-globe
(Qiagen USA) para verificar as diferenccedilas no perfil de expressatildeo dos genes estudados
de acordo com os tempos (T0 T2 e T4) e de acordo com a efetividade de tratamento
com vareniclina (sucesso e resistente) O teste de Manny-Whitney foi utilizado para
analisar os niacuteveis de concentraccedilotildees de vareniclina de bupropiona de nicotina e de seus
metaboacutelitos de acordo com os desfechos de tratamento (sucesso e resistente) pois natildeo
apresentaram distribuiccedilatildeo normal A taxa de metabolizaccedilatildeo de nicotina (NRM) foi
calculada pela seguinte foacutermula NMR= trans-3-hidroxicotininacotinina A
hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3- hidroxicotinina
para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros da hidroxicotinina satildeo
irrelevantes 31 32 Os pacientes foram classificados em metabolizadores lentos se
NMRlt031 e normais ou raacutepidos se NMRgt031 Todas as anaacutelises estatiacutesticas foram
realizadas utilizando o software SPSS (versatildeo 20 IBM New York NY) considerando
o niacutevel de significacircncia de P lt005
51
5 RESULTADOS
Este projeto incluiu 105 pacientes sendo 74 tratados com vareniclina e 31
com bupropiona Dos 74 pacientes tratados com vareniclina amostras de 27 pacientes
foram analisadas quanto agrave expressatildeo gecircnica (14 pacientes do grupo de desfecho sucesso
e 13 do grupo resistente) Sendo provenientes destes pacientes 52 amostras ao todo (de
diversos tempos) 9 resistentes do tempo T0 7 resistentes do T2 8 resistente do T4 9
sucessos do T0 8 sucessos do T2 e 11 sucessos do T4 (vide toacutepico 42 Nuacutemero
amostral)
Quanto a mensuraccedilatildeo dos analitos foi desenvolvida uma coluna extratora para a
purificaccedilatildeo da amostra agrave base de nanotubos hiacutedridos de carbono e siacutelica modificados
com a adiccedilatildeo de grupos hidrofiacutelicos (novo RAM) o meacutetodo HPLC-MSMS
multidimensional no modo column switching e na configuraccedilatildeo backflush foi
otimizado e validado Setenta e quatro pacientes tratados com vareniclina e 31 tratados
com bupropiona foram submetidos agrave anaacutelise Apenas 4 amostras das 105 apresentaram
valores abaixo do LQ (3 de pacientes tratados com vareniclina e 1 de paciente tratado
com bupropiona) e estas foram excluiacutedas das anaacutelises dos analitos (vide toacutepico 42
Nuacutemero amostral)
51 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica
511 Dados cliacutenicos e demograacuteficos
As Tabelas 2 e 3 mostram as caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes
selecionados para o ensaio de expressatildeo gecircnica do grupo total e por grupo de desfecho
respectivamente A variaacutevel idade apresentou diferenccedila significativa entre os grupos
resistente e sucesso
52
Tabela 2 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina selecionados para os ensaios de expressatildeo gecircnica (n=27)
Idade (anos) 50 plusmn 13
Gecircnero mulheres () 464
Etnia autodeclarada brancos () 740
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 271 plusmn 50
Cigarrosdia 17 plusmn 7
FTND 62 plusmn 20
FTND ge 6 () 607
Escore Issa ge 3 () 857
Hipertensatildeo () 179
Dislipidemia () 250
Diabetes melito tipo 2 () 107
Depressatildeo () 71
Ansiedade () 286
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash
Fagerstroumlm test for nicotine dependence (escala de 0 a 10
pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
Tabela 3 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina submetidos aos ensaios de expressatildeo gecircnica de acordo com o desfecho
de tratamento
Resistente (n=13) Sucesso (n=14) Valor de P
Idade (anos) 55 plusmn 11 45 plusmn 12 0045
Gecircnero mulheres () 538 357 045
Etnia autodeclarada brancos () 769 786 100
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 271 plusmn 46 273 plusmn 54 092
Cigarrosdia 20 plusmn 6 15 plusmn 6 006
FTND 63 plusmn 22 59 plusmn 19 058
FTND ge 6 () 538 643 070
Escore Issa ge 3 () 846 857 100
Hipertensatildeo () 231 71 033
Dislipidemia () 231 286 100
Diabetes melito tipo 2 () 231 00 010
Depressatildeo () 77 71 100
53
Ansiedade () 308 357 100
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fagerstroumlm test for nicotine
dependence (escala de 0 a 10 pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
512 Dados de expressatildeo gecircnica
Dos 17 genes escolhidos para testar com a resposta ao tratamento apenas 4
apresentaram valores de amplificaccedilatildeo aceitaacuteveis para uma interpretaccedilatildeo de qualidade
mais especificamente valores de CT lt 33 Os valores das expressotildees dos genes (CTs)
foram normalizados atraveacutes das meacutedias de CT dos housekeeping genes para cada
amostra obtendo-se os valores de ∆CT = (CTgene alvo ndash meacutedia CT housekeepings genes) A
Tabela 4 mostra os valores de mediana de ∆CT dos genes analisaacuteveis de acordo com os
tempos de tratamento e grupos de desfecho
Tabela 4 - Valores de mediana de ∆CT dos genes de acordo com os tempos de
tratamento e grupos de desfecho
∆CT = (CTgene alvo ndash meacutedia CThousekeepings genes) T0= Tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico
T2= Duas semanas apoacutes o iacutenicio do tratamento farmacoloacutegico T4= Quatro semanas apoacutes o iniacutecio do
tratamento farmacoloacutegico IC 95 = Intervalo de confianccedila de 95
Resistente T0 Resistente T2 Resistente T4
∆CT IC 95 ∆CT IC 95 ∆CT IC 95
CHRNA5 818 (732 ndash 870) 845 (748 ndash 887) 767 (727 ndash 905)
CHRNA7 662 (617 ndash 697) 802 (707 ndash 848) 719 (696 ndash 786)
CHRNG 620 (579 ndash 695) 647 (601 ndash 668) 663 (602 ndash 702)
COMT 467 (440ndash 501) 480 (443 ndash 503) 487 (452 ndash 524)
Sucesso T0 Sucesso T2 Sucesso T4
∆CT IC 95 ∆CT IC 95 ∆CT IC 95
CHRNA5 832 (738 ndash 917) 707 (653 ndash 896) 837 (754 ndash 882)
CHRNA7 726 (611 ndash 842) 704 (640 ndash 779) 738 (676 ndash 820)
CHRNG 682 (619 ndash 774) 683 (656 ndash 733) 659 (625 ndash 703)
COMT 488 (430 ndash 511) 458 (433 -515) 481 (448 ndash 516)
54
513 Anaacutelise de associaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica entre os desfechos e os tempos de
tratamento
A Tabela 5 mostra o fold change e anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos de
tempos de tratamento e grupos de desfecho Foi observada diferenccedila significativa para a
expressatildeo do gene CHRNA7 no grupo resistente amostras dos tempos T2 e T4
apresentaram menor expressatildeo comparadas com amostras do T0 (fold change 038
P=0007 fold change 067 P=0004 respectivamente) Para a expressatildeo do gene
CHRNG amostras do grupo sucesso mostraram menor expressatildeo comparadas com
amostras do grupo resistente no tempo T2 (fold change= 077 P=0006)
Tabela 5 - Fold change e anaacutelise de associaccedilatildeo entre os tempos de tratamento e
grupos de desfecho
Resistente T2 vs T0 Resistente T4 vs T0 Resistente T4 vs T2
Genes 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P
CHRNA5 083 (034 ndash 233) 057 142 (030 ndash 269) 095 172 (034 ndash 303) 089
CHRNA7 038 (020 ndash 093) 0007 067 (031 ndash 101) 0004 178 (058 ndash 287) 037
CHRNG 083 (054 ndash 192) 037 074 (043 ndash 190) 044 090 (050 ndash 158) 036
COMT 091 (065 ndash 149) 092 087 (056 ndash 140) 063 095 (057 ndash 142) 073
Sucesso T2 vs T0 Sucesso T4 vs T0 Sucesso T4 vs T2
Genes 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P
CHRNA5 238 (033 ndash 623) 037 097 (037 ndash 310) 061 041 (020 ndash 268) 069
CHRNA7 116 (031 ndash 406) 064 092 (023 ndash 316) 091 079 (029 ndash 204) 055
CHRNG 099 (045 ndash 227) 049 117 (056 ndash 281) 062 118 (072 ndash 211) 033
COMT 123 (055 ndash 172) 092 105 (055 ndash 155) 068 085 (056 ndash 159) 041
Sucesso vs resistente T0 Sucesso vs resistente T2 Sucesso vs resistente T4
Genes 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P
CHRNA5 091 (028 ndash 250) 075 260 (036 ndash 506) 047 062 (034 ndash 285) 085
CHRNA7 064 (021 ndash 182) 013 197 (061 ndash 423) 009 088 (042 ndash 214) 074
CHRNG 065 (026 ndash 169) 012 077 (040 ndash 109) 0006 103 (050 ndash 171) 079
55
T0= Tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico T2= Duas semanas apoacutes o iacutenicio do tratamento
farmacoloacutegico T4= Quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico 2-∆∆CT = Fold change (diferenccedila de
expressatildeo) P valor (anaacutelise de associaccedilatildeo entre as medianas de 2-∆CT dos grupos) IC 95 = Intervalo de confianccedila
de 95
As Figura 14 e 15 mostram graacuteficos de barras das diferenccedilas de expressatildeo dos
genes CHRNA7 e CHRNG entre os tempos de tratamento e desfecho respectivamente
O heat map (Figura 16) mostra que natildeo houve diferenciaccedilatildeo nos perfis de expressatildeo
gecircnica em uma anaacutelise conjunta dos genes de acordo com os desfechos e tempos de
tratamento
Devido agrave diferenccedila significativa nas meacutedias de idade entre os grupos sucesso e
resistente foi realizada regressatildeo linear multipla na anaacutelise de expressatildeo dos quatro
genes analisaacuteveis A regressatildeo foi ajustada por idade e tambeacutem gecircnero e cigarros por
dia No entanto os resultados de expressatildeo dos genes natildeo foram impactados por estas
covariaacuteveis
COMT 086 (061 ndash 164) 090 116 (061 ndash 162) 049 104 (064 ndash 169) 093
56
Figura 14 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNA7 entre os tempos de tratamento e desfecho A Anaacutelise intragrupo do
desfecho resistente B Anaacutelise intragrupo do desfecho sucesso T0= tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico T2= duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico T4= quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico P= 0007
(resistente T2 vs T0 fold change de 038) P=0004 (resistente T4 vs T0 fold change de 067) Valor de P (anaacuteliacutese de
associaccedilatildeo entre as medianas de 2-∆CT dos grupos em uma comparaccedilatildeo dois a dois) Fonte do autor
57
Figura 15 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNG entre os tempos de tratamento e desfecho A Anaacutelise intragrupo do
desfecho resistente B Anaacutelise intragrupo do desfecho sucesso T0= tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico T2= duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico T4= quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico P= 0006
(sucesso vs resistente T2 fold change de 077) Valor de P (anaacuteliacutese de associaccedilatildeo entre as medianas de 2-∆CT dos grupos em uma
comparaccedilatildeo dois a dois) Fonte do autor
58
Figura 16 - Heat map de expressatildeo gecircnica A figura mostra a magnitude de expressatildeo gecircnica entre os grupos A cor mais clara
(verde) nos indica menor expressatildeo e a cor mais escura (vermelho) indica maior expressatildeoT0= tempo inicial antes do tratamento
farmacoloacutegico T2= duas semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico T4= quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento
farmacoloacutegico Fonte do autor gerada pelo software Gene Globe QIAGENreg
52 Mensuraccedilatildeo dos analitos
521 Caracterizaccedilatildeo da coluna teste exclusatildeo de proteiacutenas e interferentes da
matriz
Em relaccedilatildeo ao teste de capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas o pico de BSA sem
e com a nova coluna extratora apresentou tempo de retenccedilatildeo semelhante no entando a
aacuterea da curva do BSA na presenccedila do novo RAM foi bem menor do que na sua
ausecircncia conforme a Figura 17 A reduccedilatildeo de proteiacutenas (da soluccedilatildeo de BSA) pela
coluna foi de aproximadamente 98 e nas amostras de pools soro diluiacutedas (14) a
remoccedilatildeo foi de 99 (Figura 18)
A Figura 19 mostra a influecircncia do pH (escala de de 22 a 70) na exclusatildeo de
proteiacutenas fato que estaacute diretamente relacionado com a estrutura fiacutesico-quiacutemica do
RAM Diferentes pHs influenciaram na taxa de exclusatildeo de proteiacutenas esse
comportamento pode ser explicado devido agrave interaccedilotildees eletrostaacuteticas do novo RAM
com as proteiacutenas Valores de pH menores que o do ponto isoeleacutetrico das proteiacutenas
59
podem promover a prevalecircncia de proteiacutenas carregadas positivamente enquanto que
valores de pH superiores podem promover proteiacutenas carregadas negativamente 114
Dessa forma acredita-se que o comportamento de exclusatildeo de proteiacutenas do novo
material eacute semelhante ao descrito em outros estudos 108 109 115 116
Figura 17 - Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com soluccedilatildeo de BSA Graacuteficos obtidos apoacutes injeccedilatildeo de 10 microL de uma soluccedilatildeo aquosa de BSA (44 mg mL-1) no
sistema sem coluna (A) e com coluna extratora (B) A - aacuterea do pico 10142590 B - aacuterea
do pico 9713614 Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF
Unifal-MG
Figura 18 - Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com amostra de soro
diluiacuteda Graacuteficos obtidos apoacutes injeccedilatildeo de 100 microL de soro diluiacutedo em aacutegua ultra pura
(14 vv) no sistema sem coluna (A) e com coluna extratora (B) A aacuterea do pico
53981550 B - aacuterea do pico 53552824 Fonte do autor e do colaborador DrHenrique
Dipe de Faria LATF Unifal-MG
60
Figura 19 - Influecircncia do pH na exclusatildeo de proteiacutenas Fonte do autor e do colaborador Dr
Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
522 Otimizaccedilatildeo dos paracircmetros espectromeacutetricos
No processo de otimizaccedilatildeo das condiccedilotildees espectromeacutetricas foi adotado o modo
de ionizaccedilatildeo positivo (ESI+) isto eacute a ionizaccedilatildeo promove a protonaccedilatildeo (adiccedilatildeo de H+)
dos analitos e de seus fragmentos As energias de colisatildeo ideais e as muacuteltiplas transiccedilotildees
de monitoramento de reaccedilatildeo (MRM) foram otimizadas para cada analito separadamente
vide valores de energia de colisatildeo e fragmentos obtidos jaacute mostrados na Tabela 1 (no
toacutepico 461) A presenccedila de 3 fragmentos de cada analito foi necessaacuteria para a
identicaccedilatildeo qualitativa e a quantificaccedilatildeo foi dependente da concentraccedilatildeo do fragmento
mais abundante
As seguintes temperaturas foram utilizadas 40ordmC para o forno da coluna 250ordmC
para a linha de dessolvataccedilatildeo e 400ordmC para o bloco de aquecimento Foram utilizadas as
taxas de 20 ml min-1 de fluxo de gaacutes de nebulizaccedilatildeo e 150 ml min-1 de fluxo de gaacutes
para a secagem
61
523 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatrograacutefico multidimensional
Quanto a composiccedilatildeo e proporccedilatildeo da fase moacutevel responsaacutevel pela eluiccedilatildeo
separaccedilatildeo e ionizaccedilatildeo dos analitos (fase moacutevel de eluiccedilatildeo) testes foram realizados com
os solventes orgacircnicos acetonitrila ou metanol combinados com o tampatildeo formiato de
amocircnio 10 mM em diferentes pHs com proporccedilotildees que variaram de 973 vv a 7525
vv (fase orgacircnica fase aquosa) Os solventes orgacircnicos utilizados satildeo menos viscosos
em relaccedilatildeo agrave aacutegua por isso fluem mais facilmente no sistema e por serem volaacuteteis
favorecem tambeacutem a ionizaccedilatildeo dos analitos e evaporaccedilatildeo do solvente A fase moacutevel que
apresentou melhores resultados foi a composiccedilatildeo de metanol formiato de amocircnio 001
mol L-1 pH 42 (9010 vv)
Variados tipos de colunas analiacuteticas foram testadas sendo elas A NSTreg (150
mm 46 mm e 5 microm) a ACEreg (150 mm x 46 mm x 5 microm) a Phenomenexreg (250 x 46
mm x 5 microm) e a Atlantis T3 e da Watersreg (100 mm x 21 mm x 3 microm) (comprimento x
diacircmetro interno x tamanho de partiacutecula) no entanto essas colunas aumentaram o
tempo de retenccedilatildeo dos analitos pioraram o perfil cromatograacutefico gerando picos largos e
fragmentados Portanto os testes foram realizados com uma nova coluna analiacutetica a
ACEreg C18 (100 mm x 21 mm x 3 microm comprimento diacircmetro interno e tamanho de
partiacutecula) com preacute-coluna ACEreg C18 (21mm x 3 microm diacircmetro tamanho de partiacutecula)
obtendo-se um menor tempo de anaacutelise (maior frequecircncia analiacutetica) e melhor perfil
cromatograacutefico (picos simeacutetricos) para os analitos
Trecircs volumes de injeccedilatildeo de amostra foram testados (5 10 e 100 microL) devido a
baixa concentraccedilatildeo dos analitos foi adotada a maior quantidade (100 μL) pois forneceu
melhores sinais analiacuteticos Tambeacutem foi avaliado o uso do pool de soro sem diluiccedilatildeo e
diluiacutedo (11 vv) os perfis cromatograacuteficos de ambos foram oacutetimos no entanto
62
escolheu-se trabalhar com a amostra diluiacuteda para diminuir a presenccedila de interferentes e
consequentemente diminuir efeito matriz e aumentar o tempo de durabilidade da coluna
analiacutetica
Jaacute obtidas as melhores condiccedilotildees espectromeacutetricas e cromatograacuteficas foi
otimizado o sistema columm switching na configuraccedilatildeo de backflush o qual apresenta
trecircs eventos como mostrado na Figura 20
Figura 20 - Ilustraccedilatildeo do sistema de columm switching na configuraccedilatildeo de backflush Na posiccedilatildeo 1
correspondente ao evento 1 ocorre exclusatildeo dos interferentes e adsorccedilatildeo dos analitos a coluna extratora Na
posiccedilatildeo 2 durante o evento 2 ocorre a eluiccedilatildeo dos analitos adsorvidos No retorno para a posiccedilatildeo 1
correspondente ao evento 3 ocorre limpeza da coluna extratora separaccedilatildeo e detecccedilatildeo dos analitos e por fim
o recondicionamento do sistema BA = bomba A BB = bomba B BC = bomba C MS = espectrocircmetro de
massas UV = detector UV e W = descarte Fonte Traduzido de (De Faria et al 2017)
Com as vaacutelvulas do sistema na posiccedilatildeo 1 (evento 1) a bomba A promoveu a
liberaccedilatildeo da fase moacutevel de carregamento (aacutegua ultra pura) em um fluxo de 04 mL min-1 O
tempo de 3 minutos foi o necessaacuterio para a adsorccedilatildeo dos analitos e sua preacute-concentraccedilatildeo
aleacutem da eliminaccedilatildeo de macromoleacuteculas A aacutegua mostrou ser um solvente oacutetimo como fase
moacutevel de carregamento aleacutem de ser um recurso barato e natildeo causar danos ao meio
ambiente De forma simultacircnea a fase moacutevel de eluiccedilatildeo fornecida pela bomba C passa
para a coluna analiacutetica de forma a condionaacute-la ainda na ausecircncia dos analitos Ambas as
bombas operaram com uma taxa de fluxo inicial de 04 mL min -1
63
Na posiccedilatildeo 2 da vaacutelvula (evento 2) a bomba C liberou a fase moacutevel de eluiccedilatildeo
(metanol formiato de amocircnio 001 mol L-1 pH 42 (9010 vv) em direccedilatildeo agrave coluna
analiacutetica em fluxo contraacuterio ao que a fase moacutevel de carregamento percorreu (backflush) A
velocidade do fluxo da bomba C foi aumentada para 08 mL min -1 e o tempo determinado
para esta etapa foi de 03 minutos o qual promoveu um oacutetimo perfil cromatograacutefico dos
analitos
No evento 3 as vaacutelvulas foram colocadas na posiccedilatildeo 1 novamente A fase moacutevel
de eluiccedilatildeo (vinda da bomba C) novamente com um fluxo de 04 mL min-1 passou pela
coluna analiacutetica promovendo a separaccedilatildeo dos analitos e sua chegada no detector de
massas De forma simultacircnea a bomba B em um fluxo de 10 mL min -1 liberou a fase
moacutevel de limpeza (acetonitrila aacutegua ultra pura isopropanol 751510 vvv) a qual
passou pela coluna extratora (RAM) promovendo a remoccedilatildeo de resiacuteduos proveniente da
anaacutelise anterior tornando-a pronta para a reutilizaccedilatildeo em uma nova anaacutelise A fase de
limpeza ocorreu no tempo de 33 a 10 min O recondionamento do sistema agraves condiccedilotildees
iniciais de anaacutelise ocorreu nos uacuteltimos 5 min em que a fase moacutevel de limpeza foi
substituiacuteda pela fase moacutevel de carregamento O tempo total para cada anaacutelise foi de 15
minutos
Para a avaliaccedilatildeo da capacidade da fase moacutevel de limpeza (acetonitrila aacutegua
ultra pura isopropanol 751510 vvv) pools de soro branco dopado na maior
concentraccedilatildeo foram injetados no sistema (com a posiccedilatildeo 1 das vaacutelvulas mantida) e apoacutes
a realizaccedilatildeo da fase de limpeza foram injetados pools de soro branco diluiacutedos (11 vv)
O experimento foi realizado em triplicata O cromatograma do soro branco natildeo
apresentou sinal analiacutetico no mesmo tempo de retenccedilatildeo dos analitos o que mostra que a
fase moacutevel de limpeza foi eficiente em seu propoacutesito evitando o chamado efeito
residual (carry-over) De Faria et al 110
64
524 Validaccedilatildeo analiacutetica
Para os testes de validaccedilatildeo foram utilizados pools de amostras de soro branco
dopadas com cada um dos analitos nas concentraccedilotildees conforme o toacutepico 467
concentraccedilotildees menores foram utilizadas no entanto essas natildeo apresentaram bons sinais
analiacuteticos precisatildeo e exatidatildeo Os resultados dos testes de validaccedilatildeo estatildeo demonstrados
na Tabela 6
O teste de linearidade foi expresso como coeficiente de determinaccedilatildeo (r2)
calculado a partir das curvas de calibraccedilatildeo intra-ensaio Para esse teste foram utilizados
os analitos em diferentes concentraccedilotildees em soro branco conforme jaacute citado as
repeticcedilotildees geraram 6 curvas de calibraccedilatildeo para cada analito Os intervalos lineares
foram baseados nos intervalos terapecircuticos 51 117 118
As mesmas concentraccedilotildees dos analitos em soro no ensaio de linearidade foram
utilizadas no ensaio dos LD e LQ Estes foram calculados atraveacutes das 6 curvas de
calibraccedilatildeo e foram definidos como 3 e 10 vezes a relaccedilatildeo sinalruiacutedo respectivamente
para o LD e LQ
Para avaliar a precisatildeo e a exatidatildeo intra e inter-ensaios foram realizados 6
repeticcedilotildees de concentraccedilotildees de calibraccedilatildeo dos analitos Os testes intra-ensaio foram
realizados no mesmo dia e os testes inter-ensaios foram realizados em dias diferentes A
exatidatildeo foi calculada atraveacutes do erro relatico (E) e a precisatildeo atraveacutes do desvio
padratildeo relativo (RSD)
No teste de seletividade foi avaliado se houve a presenccedila picos de interferentes
nos mesmos tempos de retenccedilatildeo dos analitos e dos PIs deuterados As Figuras 21 e 22
mostram os cromatogramas obtidos apoacutes a injeccedilatildeo de soro branco e de soro dopado com
os analitos respectivamente mostrando que natildeo houve a presenccedila de interferentes nos
tempos de retenccedilatildeo dos analitos e PIs deuterados
65
Figura 21 - Cromatograma obtido de amostras de soro branco diluiacutedas em aacutegua ultra pura
Volume de injeccedilatildeo = 100 microL A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz 240rarr mz 131) C-
Hidroxibup (mz 256rarr mz 238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz 80) F-
Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G- Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr mz
244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz 134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz 196rarr
mz 80) Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
Figura 22 - Cromatograma obtido apoacutes anaacutelise de soro diluiacutedo e dopado com os analitos no niacutevel
meacutedio de calibraccedilatildeo e mais os padrotildees internos deuterados A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz
240rarr mz 131) C- Hidroxibup (mz 256rarr mz 238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz
80) F- Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G- Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr
mz 244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz 134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz 196rarr
mz 80) Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
Foram realizados os testes de estabilidade de bancada longo prazo e de
congelamento e descongelamento Para a anaacutelise de estabilidade de bancada soluccedilotildees de
soro dopada com os analitos foram analisadas imediatamente apoacutes a sua preparaccedilatildeo e
apoacutes 4 e 24 horas verificando assim a estabilidade da amostra a curto prazo Para uma
66
anaacutelise a longo prazo as amostras foram armazenadas a -20degC por 30 dias e apoacutes foram
avaliadas Quanto anaacutelises de congelamento e descongelamento foram realizados 3
ciclos de congelamento -20degC e posterior descongelamento e as amostras foram
avaliadas
O ensaio de recuperaccedilatildeo da extraccedilatildeo foi realizado em triplicata A anaacutelise
avaliou a recuperaccedilatildeo relativa comparando-se a extraccedilatildeo dos analitos a partir da matriz
de soro com a de aacutegua atraveacutes da passagem da amostra pela coluna de extraccedilatildeo (RAM)
A recuperaccedilatildeo relativa se daacute pela relaccedilatildeo das concentraccedilotildees nas duas matrizes
(concentraccedilatildeo no soro concentraccedilatildeo na aacutegua) x 100
O efeito residual (carry-over) foi avaliado injetando-se uma amostra de soro
branco antes de uma amostra de soro dopado na maior concentraccedilatildeo e apoacutes foi injetada
novamente uma amostra de soro branco foram inferior a 20 daqueles obtidos no LQ
Para avaliar o efeito matriz foram comparados os resultados da anaacutelise das
amostras de soro dopadas com os analitos em diferentes concentraccedilotildees em matrizes
diferentes (aacutegua e soro) O resultado para ser aceito precisava ser inferior a 15
Posteriormente foi realizada a mensuraccedilatildeo dos analitos em amostras reais de
soro provenientes de pacientes submetidos ao tratamento antitabagismo com doses
conforme bula As Figuras 23 e 24 mostram os cromatogramas de amostras de pacientes
submetidos ao tratamento com bupropiona e vareniclina respectivamente No momento
da coleta das amostras os pacientes estavam fumando e aleacutem de apresentarem os
analitos provenientes dos faacutermacos tambeacutem mostraram a presenccedila de analitos
provenientes da nicotina
67
Figura 23 - Cromatograma obtido atraveacutes da anaacutelise das amostras de soro dos pacientes
tratados com bupropiona (150 mg 2xdia) Os pacientes estavam fumando em torno de 10
cigarrosdia no dia da coleta A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz 240rarr mz 131) C-
hidroxibup (mz 256rarr mz 238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz 80) F-
Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G- Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr mz
244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz 134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz
196rarr mz 80) Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
Figura 24 - Cromatograma obtido atraveacutes da analise de amostras de soro de pacientes tratados
com vareniclina (10 mg 2xdia) Os pacientes fumavam em torno de 10 cigarrosdia no dia da
coleta A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz 240rarr mz 131) C- hidroxibup (mz 256rarr mz
238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz 80) F- Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G-
Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr mz 244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz
134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz 196rarr mz 80) Fonte do autor e do
colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
68
Tabela 6 - Paracircmetros de validaccedilatildeo obtidos na determinaccedilatildeo de faacutermacos antitabagismo em soro humano
Meacutedia plusmn Desvio padratildeo (n=6) amenor bmeacutedio e calto niacutevel de calibraccedilatildeo 1Estabilidade de bancada (4 a 24 horas) Precisatildeo RSD = [Desvio padratildeomeacutedia] x 100 E = [(Meacutedia experimental da
concentraccedilatildeo Concentraccedilatildeo nominal) x 100] ndash 100 2Efeito matriz E= [(Meacutedia da concentraccedilatildeo experimental no solventeMeacutedia experimental da concentraccedilatildeo no soro) x 100] ndash 100
Paracircmetros de validaccedilatildeo Vareniclina Bupropiona Hidroxibupropiona Nicotina Cotinina Hidroxicotinina
Intervalo linear (microg L-1) 5-100 1-1000 1-2000 5-1000 5-1000 5-1000
r2 ( n=6) 09952 09998 09998 09997 09998 09999
Decliacutenio (α) ( n=6) 00196plusmn 00095 00045plusmn00059 00051plusmn00057 00087plusmn00012 00073plusmn00048 00075plusmn00074
Intercepto ( n=6) -00316plusmn00004 -00022plusmn00020 00230plusmn00025 -00046plusmn00065 00767plusmn00012 01918plusmn00013
Tempo de retenccedilatildeo (min) 521 501 485 497 446 441
LD (microg L-1) 25 07 06 19 24 37
LQ (microg L-1) 50 10 10 50 50 50
Precisatildeo intra-ensaio RSD ( n=6) 93a
30a
100c
153a
37b
21c
140a
06b
06c
90a
26b
11c
117a
34b
61c
128a
138b
92c
Precisatildeo inter-ensaio RSD ( n=18 trecircs dias) 185a
115b
66c
82a
27b
20c
109a
17b
10c
83a
27b
14c
158a
41b
31c
161a
44b
92c
Acuraacutecia intra-ensaio E ( n=6) 196a
54b
-30c
-55a
-24b
-11c
-65a
19b
-04c
158a
09b
-26c
-87a
47b
-24c
71a
18b
05c
Acuraacutecia inter-ensaio E ( n=18 trecircs dias) 82a
-16b
035c
41a
-01b
-01c
-87a
27b
-20c
146a
40b
018c
-120a
25b
-110c
58a
-35b
30c
Recuperaccedilatildeo da extraccedilatildeo ( n=3) 883a
1104b
1014c
1101a
1009b
1028c
945a
1094b
1078c
1098a
1088b
1146c
941a
1093b
1116c
1167a
1112b
1141c
Estabilidade1 E
( n=6)
98a
11b
-50c
71a
-32b
-38c
140a
-16b
-79c
40a
-79b
-110c
-132a
-94b
-32c
86a
125b
-54c
Efeito matriz2 E
( n=6)
-117a
104b
14c
101a
09b
28c
-55a
94b
78c
98a
88b
146c
-59a
93b
116c
167a
112b
141c
69
525 Dados cliacutenicos e demograacuteficos dos pacientes submetidos a mensuraccedilatildeo dos
analitos
As Tabelas 7 a 10 mostram as caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos
pacientes submetidos agraves anaacutelises de concentraccedilatildeo dos analitos
As Tabelas 7 e 8 referem-se aos pacientes tratados com vareniclina sendo
considerado o grupo total e os grupos de desfecho respectivamente Os pacientes do
grupo resistente agrave vareniclina fumavam um maior nuacutemero de cigarrosdia (antes do
tratamento) em comparaccedilatildeo com os pacientes que obtiveram sucesso (21 vs 17
cigarrosdia P= 005)
As Tabelas 9 e 10 referem-se aos pacientes tratados com bupropiona no grupo
total e de acordo com desfecho respectivamente O grupo resistente ao tratamento com
bupropiona apresentou maior frequecircncia de pacientes com alta DN (atraveacutes dos escores
FTND e Issa categorizados) e de pacientes que fumavam no dia da coleta em
comparaccedilatildeo ao grupo sucesso (FTNDge6= 833 vs 429 P= 005 Escore Issage3=
1000 vs 429 P= 0001 fumo no dia da coleta= 1000 vs 429 P= 0001
respectivamente)
Tabela 7 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos (n= 74)
Idade (anos) 51 plusmn 12
Gecircnero mulheres () 500
Etnia autodeclarada brancos () 730
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 263 plusmn 49
10 1 4 1
7 1 3 1
8 1 3 1
9 1 3 1
8 1 4 1
5 0 3 1
8 1 4 1
8 1 4 1
7 1 4 1
7 1 3 1
9 1 3 1
7 1 4 1
Cigarrosdia inicial 19 plusmn 10
Fumo no dia da coleta () 919
FTND 62 plusmn 23
FTND ge 6 () 644
70
Escore Issa ge 3 () 851
Hipertensatildeo () 311
Dislipidemia () 392
Diabetes melito tipo 2 () 95
Depressatildeo () 135
Ansiedade () 176
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash
Fagerstroumlm test for nicotine dependence (escala de 0 a 10 pontos)
Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala de 0 a 4
pontos)
Tabela 8 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com o
desfecho de tratamento
Resistente (n=41) Sucesso (n=33) P valor
Idade (anos) 53 plusmn 11 49 plusmn 13 023
Gecircnero mulheres () 561 424 024
Etnia autodeclarada brancos () 683 788 031
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 270 plusmn 40 255 plusmn 58 028
Cigarrosdia 21 plusmn 11 17 plusmn 7 005
Fumo no dia da coleta () 976 848 008
FTND 65 plusmn 22 57 plusmn 23 019
FTND ge 6 () 659 625 077
Escore Issa ge 3 () 829 879 075
Hipertensatildeo () 390 212 010
Dislipidemia () 341 455 032
Diabetes melito tipo 2 () 73 121 069
Depressatildeo () 122 152 071
Ansiedade () 146 212 046
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fagerstroumlm test for nicotine
dependence (escala de 0 a 10 pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
71
Tabela 9 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos (n= 31)
Idade (anos) 52 plusmn 11
Gecircnero mulheres () 71
Etnia autodeclarada brancos () 931
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 258 plusmn 57
Cigarrosdia inicial 21 plusmn 7
Fumo no dia da coleta () 871
FTND 68 plusmn 21
FTND ge 6 () 742
Escore Issa ge 3 () 871
Hipertensatildeo () 226
Dislipidemia () 323
Diabetes melito tipo 2 () 32
Depressatildeo () 65
Ansiedade () 194
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash
Fagerstroumlm test for nicotine dependence (escala de 0 a 10
pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
Tabela 10 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com
o desfecho de tratamento
Resistente (n=24) Sucesso (n=7) Valor de P
Idade (anos) 53 plusmn 11 50 plusmn 11 054
Gecircnero mulheres () 708 714 100
Etnia autodeclarada brancos () 957 833 038
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 252 plusmn 61 278 plusmn 35 015
Cigarrosdia 21 plusmn 7 23 plusmn 7 071
Fumo no dia da coleta () 1000 429 0001
FTND 73 plusmn 15 54 plusmn 32 011
FTND ge 6 () 833 429 005
Escore Issa ge 3 () 1000 429 0001
Hipertensatildeo () 292 00 016
72
Dislipidemia () 375 143 038
Diabetes melito tipo 2 () 42 00 100
Depressatildeo () 83 00 100
Ansiedade () 250 00 029
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fagerstroumlm test for nicotine
dependence (escala de 0 a 10 pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
526 Anaacutelise de associaccedilatildeo dos analitos com desfecho de tratamento
A Tabela 11 mostra a frequecircncia do desfecho de tratamento de acordo com os
medicamentos antitabagismo pacientes estes cujas amostras de soro foram submetidas agrave
mensuraccedilatildeo dos analitos
Tabela 11 ndash Frequecircncia do desfecho de tratamento nos pacientes submetidos agraves
anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com os medicamentos
antitabagismo
Medicamento Resistente () Sucesso ()
Vareniclina (n=74) 544 446
Bupropiona (n=31) 774 226
As Tabelas de 12 a 15 mostram as concentraccedilotildees dos analitos nas amostras de
soro dos pacientes tratados com vareniclina e bupropiona no grupo total e de acordo
com o desfecho de tratamento
Os pacientes do grupo resistente tanto os pacientes tratados com vareniclina
(Tabela 13) quanto com bupropiona (Tabela 15) apresentaram concentraccedilatildeo
significativamente maior de cotinina e hidroxicotinina do que os grupos sucesso
(tratamento com vareniclina cotinina= 1182 vs 706 μgL P= 0009 hidroxicotinina=
845 vs 516 μgL P= 002 Tratamento com bupropiona cotinina= 1346 vs 160 μgL
P= 0005 hidroxicotinina= 972 vs 374 μgL P= 0004) No entanto quanto ao NMR
natildeo houve diferenccedila entre os desfechos de tratamento de ambos os faacutermacos Aleacutem
73
disso somente o grupo de pacientes tratados com vareniclina continha pacientes com
NMRlt031 (metabolizadores lentos para nicotina) e ainda sua frequecircncia foi baixa
(100 e 43 para os grupos de desfecho resistente e sucesso respectivamente)
Tabela 12 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos pacientes tratados
com vareniclina
Vareniclina μgL n=71 83 (81 ndash 95)
Nicotina μgL n=31 75 (76 ndash 112)
Cotinina μgL n=65 1007 (923 ndash 1225)
Hidroxicotinina μgL n=65 681 (638 ndash 874)
NMR n=63 069 (067 ndash 102)
NMR lt031 () n=63 79
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de
95) NMR=trans-3-hidroxicotininacotinina NMR lt031=
metabolizador lento NMR ge031= metabolizador normal e raacutepido A
hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo
trans-3- hidroxicotinina para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade
de outros isocircmeros satildeo irrelevantes
Tabela 13 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de tratamento
com vareniclina
Resistente Sucesso P
valor Vareniclina μgL n=71 84 (78 ndash 99) 83 (77 ndash 97) 096
Nicotina μgL n=31 83 (74 ndash 127) 70 (59 ndash 105) 032
Cotinina μgL n=65 1182 (1012 ndash 1426)
111114143ndash
1421426)
706 (643 ndash 1037) 0009
Hidroxicotinina μgL n=65 845 (702 ndash 1032) 516 (434 ndash 721) 002
NMR n=63 074 (062 ndash 107) 061 (055 ndash 113) 064
NMR lt031 () n=63 100 43 064
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de 95) NMR=trans-3-
hidroxicotininacotinina NMR lt031= metabolizador lento NMR ge031= metabolizador normal e
raacutepido A hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3- hidroxicotinina
para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros satildeo irrelevantes
74
Tabela 14 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos pacientes tratados
com bupropiona
Bupropiona μgL n=30 369 (332 ndash 493)
Hidroxibupropiona μgL n=23 7368 (5860 ndash 7824)
Nicotina μgL n=13 71 (62 ndash 109)
Cotinina μgL n=27 1159 (971 ndash 1648)
Hidroxicotinina μgL n=28 931 (838 ndash 1387)
NMR n=27 090 (074 ndash 149)
NMR lt031 () n=27 0
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de 95) NMR=
trans-3-hidroxicotininacotinina NMR lt031= metabolizador lento NMR
ge031= metabolizador normal e raacutepido Natildeo houve pacientes com NRM lt031 A
hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3-
hidroxicotinina para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros
satildeo irrelevantes
Tabela 15 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de tratamento
com bupropiona
Resistente Sucesso P
valor Bupropiona μgL n=30 372 (331 ndash 533) 300 (214 ndash 481) 048
Hidroxibupropiona μgL n=23 7795 (6078 ndash 8308) 5128 (2957 ndash 8195) 012
Nicotina μgL n=13 71 (62 ndash 109) - -
Cotinina μgL n=27 1346 (1097 ndash 1784) 160 (-195 ndash 712) 0005
Hidroxicotinina μgL n=28 972 (929 ndash 1520) 374 (33 ndash 847) 0004
NMR n=27 084 (076 ndash 109) 132 (-371 ndash 884) 014
NMR lt031 () n=27 0 0 -
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de 95) NMR= trans-3-
hidroxicotininacotinina NMR lt031= metabolizador lento NMR ge031= metabolizador normal e raacutepido
No grupo sucesso somente 1 paciente apresentou concentraccedilatildeo de nicotina Natildeo houve pacientes com NRM
lt031 A hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3- hidroxicotinina para o
caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros satildeo irrelevantes
75
6 DISCUSSAtildeO
61 Para os dados da anaacutelise de expressatildeo gecircnica
O presente estudo cliacutenico e exploratoacuterio identificou resultados significativos para
expressatildeo dos genes CHRNA7 e CHRNG de acordo com os tempos de coleta e o
desfecho de tratamento com vareniclina Amostras do grupo resistente nos tempos T2 e
T4 isto eacute jaacute com o uso da vareniclina apresentaram menores niacuteveis de expressatildeo
gecircnica do CHRNA7 comparado agraves amostras do T0 (antes de iniciar o tratamento
farmacoloacutegico) Estes resultados sugerem que o downregulation de α7 pode ter sido
responsaacutevel pela natildeo cessaccedilatildeo do fumo nos indiviacuteduos do grupo resistente o que natildeo foi
observado nas amostras do grupo sucesso
O gene CHRNA7 codifica a subunidade α7 dos nAChRs Esta possui grande
importacircncia estaacute presente em diversos tecidos e possui associaccedilatildeo consistente em
vaacuterios estudos com o processo de dependecircncia agrave nicotina processos cognitivos e
imunoloacutegicos 119-124 Estudos tambeacutem mostraram que haacute um locus contendo duplicaccedilatildeo
do gene CHRNA7 truncada composta pelos exons 5-10 do gene CHRNA7 precidida de
4 exons uacutenicos e uma deleccedilatildeo de dois pares de bases no eacutexon 6 o qual nomearam como
CHRNFAN7 A maioria dos indiviacuteduos possui uma ou duas coacutepias deste gene e satildeo
raros os casos em que esta coacutepia natildeo estaacute presente 125 126
No ceacuterebro de ratos Sprague-Dawley Ryan e Loiacono 119 detectaram niacuteveis de
α7 transcritos em diversos locais como na substacircncia negra compacta (SNpc) na
substacircncia negra reticular (SNpr) na aacuterea tegmental ventral (VTA) no coacutertex e no
hipocampo Os ratos submetidos ao tratamento crocircnico com nicotina mostraram maiores
niacuteveis de mRNA da subunidade α7 em SNpc SNpr e VTA em comparaccedilatildeo ao grupo
controle A VTA faz parte do sistema de recompensa mesoliacutembico o qual eacute muito
estudado nos processos de ND 12 15 No presente estudo (em amostras de PBMC) o
76
grupo de pacientes resistentes tambeacutem apresentou maior expressatildeo de α7 no momento
em que somente a nicotina estava presente no fumo crocircnico Ao introduzir a vareniclina
as expressotildees foram diminuiacutedas nos tempos T2 e T4 provavelmente devido ao
antagonismo competitivo da vareniclina com a nicotina no receptor
Benhammou et al 127 realizaram um estudo com amostras de ceacuterebro post mortem
de fumantes e com amostras de sangue de voluntaacuterios fumantes e natildeo fumantes Atraveacutes
do uso de nicotina radiomarcada nas amostras de ceacuterebro mostraram que os siacutetios de
ligaccedilatildeo agrave nicotina foram aumentados proporcionamente conforme o nuacutemero de cigarros
por dia O mesmo estudo ao analizar a expressatildeo gecircnica e proteiacutenas em linfoacutecitos e
ceacutelulas polimorfonucleares para um subconjunto de subunidades de receptores
nicotiacutenicos essas ceacutelulas assim como no tecido cerebral exibiram maiores nuacutemeros de
siacutetios de ligaccedilatildeo de alta afinidade agrave nicotina em fumantes em comparaccedilatildeo com natildeo
fumantes
A vareniclina em estudos funcionais mostrou ter atividade agonista total nos
receptores α7 40 Em um estudo realizou-se o tratamento crocircnico com vareniclina eou
nicotina em camundongos (10 dias) os niacuteveis das drogas no ceacuterebro e no plasma e a
toleracircncia e a expressatildeo de 4 subtipos de nAChR apoacutes dose aguda de nicotina foram
checados usando autoradiografia O upregulation de receptores α4β2 devido ao
tratamento crocircnico com vareniclina foi similar ao promovido pela nicotina e tambeacutem
ocorreu dowregulation de α6β2 assim como ocorreu com o uso de nicotina A
vareniclina aumentou significantemente os siacutetios de α3β4 e α7 enquanto a nicotina teve
menor efeito nestes siacutetios A combinaccedilatildeo da nicotina com a vareniclina foi similar agrave
vareniclina sozinha para os siacutetios de α3β4 enquanto para o siacutetio de α7 a combinaccedilatildeo
promoveu upregulation em menos regiotildees cerebrais em comparaccedilatildeo com a vareniclina
em monoterapia 77
77
No presente estudo os pacientes do grupo resistente apresentaram efeito
semelhante associado ao uso combinado de vareniclina e nicotina (devido ao fumo) os
niacuteveis de expressatildeo de CHRNA7 natildeo foram mantidos como nos pacientes que obtiveram
sucesso no tratamento No entanto o grupo sucesso soacute estava utilizando a vareniclina na
ausecircncia de nicotina entre os tempos T2 e T4 o que sugere que esse dowregulation
pode ocorrer em subgrupo de resposta
Diversos estudos mostraram diferenccedilas na expressatildeo gecircnica de a7 em
amostras de pacientes com diagnoacutesticos psiquiaacutetricos em comparaccedilatildeo com indiviacuteduos
sadios 102 128-134
Kunii et al 128 mostraram diferenccedila na expressatildeo de a7 em coacutertex preacute-frontal
dorsolateral post mortem de pacientes com depressatildeo ansiedade e transtorno bipolar e
inuacutemeros estudos mostraram menores niacuteveis de expressatildeo de α7 em pacientes com
esquizofrenia 102 129-134
Estudos de indiviacuteduos com esquizofrenia satildeo oacutetimos modelos para o
entendimento da importacircncia do receptor a7 em processos cognitivos em ND e em
como esses mecanismos estatildeo intimamente relacionados Diversos estudos mostraram
que haacute uma maior prevalecircncia de tabagismo em indiviacuteduos com esquizofrenia
comparados agrave populaccedilatildeo geral 135 136
Mexal el al 102 realizaram um estudo com amostras de ceacuterebro post mortem
provenientes de indiviacuteduos de 4 grupos distintos controle natildeo fumante controle
fumante pacientes com esquizofrenia natildeo fumantes e pacientes com esquizofrenia
fumantes O estudo realizou ensaio de expressatildeo de mRNA e de proteiacutena atraveacutes de
PCR quantitativo em tempo real e western blot As sondas da PCR foram desenhadas
para amplificar o gene completo CHRNA7 e sua coacutepia duplicada o CHRFAM7A Natildeo
fumantes com esquizofrecircnia apresentaram expressatildeo reduzida de mRNA e de proteiacutena
78
em relaccedilatildeo aos pacientes com esquizofrenia fumantes Natildeo fumantes com esquizofrenia
apresentaram menor expressatildeo em relaccedilatildeo ao controle natildeo fumante mas essa diferenccedila
foi estatisticamente significativa apenas no niacutevel do mRNA Outros estudos post
mortem cerebral mostraram menor expressatildeo dos receptores nicotiacutenicos no coacutertex e no
hipocampo de indiviacuteduos com esquizofrecircnia comparado aos controles saudaacuteveis 129-134
O CHRFAM7A assim como o CHRNA7 eacute polimoacuterfico e variantes neste gene
foram associadas agrave patologia auditoacuteria em casos de esquizofrenia Processos
diferenciados nos mecanismos de transcriccedilatildeo podem contribuir para um funcionamento
anormal de a7 como variaccedilotildees em promotor splicing alternativo eou desequiliacutebrio de
ligaccedilatildeo com o SNP do gene de neuroregulina -1 (gene que codifica moleacutecula de adesatildeo
celular envolvida em processos de neuroplasticidade sinaacuteptica) Estes processos podem
estar envonvidos em endofenoacutetipos da doenccedila 122 126 137-144
A nicotina parece melhorar a audiccedilatildeo em indiviacuteduos com deacuteficit auditoacuterio na
esquizofrenia associado ao α7 permitindo uma melhor filtragem dos estiacutemulos
auditivos estranhos A nicotina melhora a cogniccedilatildeo na esquizofrenia e agentes
alternativos que ativam o receptor nicotiacutenico foram testados e esses compostos
melhoraram a atenccedilatildeo a memoacuteria de trabalho e os sintomas negativos em um estudo
complementar de pacientes natildeo fumantes com esquizofrenia 145
Os estudos citados nos mostram grandes evidecircncias da associaccedilatildeo do α7 com
ND processos cognitivos e de resposta agrave vareniclina Esses achados podem explicar
nossos resultados em relaccedilatildeo agrave diminuiccedilatildeo da expressatildeo de 7 no grupo de pacientes
resistentes ao tratamento Os pacientes do grupo sucesso mantiveram os niacuteveis de
expressatildeo gecircnica em resposta agrave vareniclina jaacute no grupo resistente houve um
dowregulation Sugerimos que essa diminuiccedilatildeo pode ter sido a responsaacutevel ao menos
em parte pelos indiviacuteduos natildeo terem conseguido deixar de fumar A nicotina pode estar
79
compensando um deacuteficit de α7 que os indiviacuteduos resistentes podem apresentar No
entanto natildeo sabemos como seria a expressatildeo de α7 nestes indiviacuteduos na ausecircncia do
fumo
Quanto ao gene CHNRG natildeo haacute muitos resultados na literatura Este codifica
a subunidade γ dos receptores nicotiacutenicos A maioria dos estudos aponta associaccedilatildeo da
subunidade com distuacuterbios esqueleacutetico-musculares 146-149
No entanto King et al 65 encontraram a associaccedilatildeo de polimorfismos neste
gene com nausea no tratamento com vareniclina E Keskitalo-Vuokko 150 et al
encontraram associaccedilatildeo de SNPs em loci do cluster de genes CHRNGCHRND (genes
muitos proacuteximos o uacuteltimo codifica a subunidade delta dos nAChRs) com o niacutevel de
cotinina Saccone et al 151 encontraram a associaccedilatildeo de 4 loci no cluster
CHRNDCHRNG com ND Em outro estudo variantes nos genes CHRNDCHRNG
mostraram associaccedilatildeo modesta com o risco de ND em amostras de afro-americanos 152
Em um estudo o qual foi utilizado um modelo de esquizofrenia em ratos no
grupo de animais tratados com clozapina foi encontrado downregulation do Chrng no
nuacutecleo accumbens Neste mesmo estudo Santoro et al natildeo conseguiram formular uma
hipoacutetese para o achado devido ao lack de informaccedilotildees na literatura com o foco em ND
ou performance cognitiva 153
Haacute algumas limitaccedilotildees no estudo Primeira o ensaio da anaacutelise de expressatildeo
gecircnica foi realizado com amostras de sangue perifeacuterico e natildeo no SNC o que poderia nos
mostrar uma relaccedilatildeo mais clara e direta do faacutermaco com a via de resposta No entanto a
obtenccedilatildeo desta amostra eacute inviaacutevel Em contrapartida estudos jaacute demonstraram que haacute
similaridade entre a expressatildeo gecircnica de ceacutelulas do SNC e de ceacutelulas de sangue
perifeacuterico para alguns destes genes de receptores nicotiacutenicos 102 Segunda natildeo foi
realizado ensaio de expressatildeo gecircnica para amostras de indiviacuteduos natildeo fumantes o que
80
poderia fornecer mais paracircmetros de comparaccedilatildeo com os grupos resistente e sucesso
Terceira natildeo conseguimos qualidade necessaacuteria nas anaacutelises de genes potencialmente
importantes
62 Para os dados da mensuraccedilatildeo dos analitos
Um dos maiores desafios em anaacutelises de amostras bioloacutegicas eacute eliminar os
interferentes de sua matriz sem alterar substancialmente as quantidades dos analitos
presentes A matriz de amostras de soro e plasma satildeo complexas e envolve a presenccedila
de inuacutemeras macromoleacuteculas como lipiacutedios e proteiacutenas que obstruem colunas anaacuteliticas
diminuem o tempo de duraccedilatildeo de equipamentos e inviabilizam a interpretaccedilatildeo dos
dados devido a imensos picos e ruiacutedos formados nos cromatogramas e espectros de
massa Inumeros trabalhos executam uma preparaccedilatildeo preacutevia das amostras que envolve
processos como a extraccedilatildeo com uso de solventes preciptaccedilatildeo de proteiacutenas entre outros
os quais podem promover uma baixa recuperaccedilatildeo dos analitos tempo prolongado de
bancada e gasto de materiais 51 104-106
Devido agrave esse fato inuacutemeros estudos propuseram o uso de materiais de acesso
restrito (RAMs) para a purificaccedilatildeo da amostra sem tanto manuseio dentre eles estatildeo os
nanotubos de carbono (CNTs) modificados 109 110 114-116
O presente estudo desenvolveu uma coluna extratora composta por nanotubos
hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados quimicamente com a adiccedilatildeo de grupos
hidrofiacuteficos Essa coluna permitiu uma oacutetima exclusatildeo de macromoleacuteculas (98) A
aacutegua ultra pura foi o suficiente para ser utilizada como fase moacutevel de carregamento o
que eacute sustentaacutevel aleacutem de natildeo causar danos ao meio ambiente e o uacutenico preparo da
amostra foi uma diluiacuteccedilatildeo 11 tambeacutem em aacutegua O novo RAM desenvolvido foi
81
encaminhado para pedido de patente (Anexo 5) e portanto os processos para o seu
desenvolvimento foram mantidos em sigilo
Os CNTs possuem uma grande aacuterea superfiacutecial e oacutetima estabilidade em anaacutelise
de compostos no entanto o material natildeo promove a remoccedilatildeo de proteiacutenas com
eficiecircncia 110 115 Os poros dos CNTs formam uma barreira fiacutesica excluindo ou
permitindo a entrada de moleacuteculas por tamanho e os grupos hidrofiacutelicos adicionados ao
RAM desenvolvido natildeo permitem a ligaccedilatildeo de proteiacutenas de forma irreversiacutevel
formando uma barreira fiacutesico-quiacutemica Os demais CNTs natildeo modificados disponiacuteveis
natildeo promovem a exclusatildeo de macromoleacuteculas com tanta efetividade quanto o material
desenvolvido aleacutem disso o novo RAM apoacutes limpeza pode ser reutilizado cerca de 400
vezes (valor calculado durante os experimentos com amostras controle)
Quanto a otimizaccedilatildeo do meacutetodo de mensuraccedilatildeo a anaacutelise multidimensional
atraveacutes de equipamentos conectados por vaacutelvulas comutadoras promoveu a realizaccedilatildeo
da extraccedilatildeo eluiccedilatildeo anaacutelise limpeza e recondicionamento do sistema automaacuteticamente
A anaacutelise completa de uma amostra foi realizada em apenas 15 minutos O sistema
permitiu a mensuraccedilatildeo conjunta de diversos analitos com caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas
diferentes de uma mesma amostra mostrando bons sinais analiacuteticos e perfis
cromatograacuteficos
Quanto aos dados de validaccedilatildeo o meacutetodo permitiu uma oacutetima recuperaccedilatildeo dos
analitos com valores proacuteximos a 100 semelhante a outros estudos 104 117 154 155 A
maior dificuldade encontrada neste estudo foi a configuraccedilatildeo de paracircmetros
espectromeacutetricos e cromatograacuteficos que pudessem obter o maacuteximo de recuperaccedilatildeo e o
menor LQ possiacutevel para a anaacutelise de vareniclina ainda em um contexto de anaacutelise
multianalito
82
A dose posoloacutegica da vareniclina eacute muito baixa (1mg 2 vezes ao dia a partir do
8deg dia de tratamento) em comparaccedilatildeo com a da bupropiona (150 mg 2 vezes ao dia a
partir do 8deg dia de tratamento) dessa forma as concentraccedilotildees plasmaacuteticas de
vareniclina satildeo muito baixas Apesar do valor de LQ obtido (5 μg L-1) estar entre as
meacutedias plasmaacuteticas de intervalo terapecircutico (40 -70 μg L-1 de vareniclina em plasma e
soro) 51 118 ao mensurar amostras de pacientes em um cenaacuterio real de tratamento de 74
pacientes apenas 3 amostras apresentaram concentraccedilatildeo plasmaacutetica de vareniclina
abaixo do limite de quantificaccedilatildeo
Quanto a recuperaccedilatildeo do analito da matriz a vareniclina tambeacutem mostrou menor
taxa (883) em relaccedilatildeo aos outros analitos (valores proacuteximos ao 100) no entanto
essa taxa de recuperaccedilatildeo eacute considerada alta e foi semelhante ao estudo de Dobrinas et al
156 o qual realizou a extraccedilatildeo da amostra atraveacutes de coluna extratora de fase soacutelida
(SPE) disponiacutevel no mercado e a mensuraccedilatildeo tambeacutem foi realizada em um contexto
multianalito E ainda a recuperaccedilatildeo de vareniclina no presente estudo foi maior do que
a obtida pelo trabalho de Al-Haj et al 105 o qual realizou a preparaccedilatildeo preacutevia da amostra
por extraccedilatildeo liacutequido-liacutequido (LLE) e a mensuraccedilatildeo foi realizada para somente um
analito (4759 - 4872) e obteve recuperaccedilatildeo semelhante ao estudo de os qual
tambeacutem realizou a anaacutelise de vareniclina em um cenaacuterio multianalito (830 ndash 920)
Para nicotina e cotinina os valores de LQ obtidos no presente estudo (50 μg L-1)
se assemelham aos obtidos nos estudos de Abdallah et al 104 (70 μg L-1 para cotinina)
Onoue et al 157 (50 μg L-1 para nicotina e cotinina) Petersen et al 117 (50 μg L-1) Para
bupropiona e hidroxibupropiona o meacutetodo proposto eacute capaz de mensurar pequenas
quantidades do faacutermaco e de seu metaboacutelito (LQ 10 μg L-1 para ambos) quantidades
menores do que os LQs obtidos nos estudos de 158 (55 para bupropiona e 60 μgL para
83
hidroxibupropiona) e de 155 (100 μg L-1 para hidroxibupropiona) apesar das
concentraccedilotildees de metaboacutelitos em estado de equiliacutebrio em pacientes tratados com doses
terapecircuticas do faacutermaco serem bem maiores (45 ndash 75 μg L-1 e de 500 ndash 1500 μg L-1)
respectivamente para bupropiona e hidroxibupropiona 118
O Quadro 6 mostra os paracircmetros analiacuteticos do presente estudo comparados com
outros estudos presentes na literatura
Quanto agraves mensuraccedilotildees das amostras dos pacientes natildeo encontramos associaccedilatildeo
dos faacutermacos e seus metaboacutelitos com desfecho de tratamento Esse fato poderia ser
explicado pelo pequeno nuacutemero amostral do presente estudo
Encontramos diferenccedila significativa entre os grupos resistente e sucesso ao
tratamento quanto aos paracircmetros relacionados ao fumo e agrave DN Os pacientes do grupo
resistente tratados com vareniclina (ainda antes do iniacutecio do tratamento) fumavam um
maior nuacutemero de cigarrosdia em comparaccedilatildeo com os pacientes que obtiveram sucesso
O grupo resistente ao tratamento com bupropiona apresentou maior frequecircncia de
pacientes com alta DN (antes do tratamento) e de pacientes que fumavam no dia da
coleta em comparaccedilatildeo ao grupo sucesso Os dados tambeacutem mostraram que os pacientes
resistentes tratados com ambos os faacutermacos no dia da coleta apresentaram maiores
concentraccedilotildees dos metaboacutelitos da nicotina Esses dados podem indicar maior exposiccedilatildeo
ao fumo e maior DN podendo implicar na resposta ao tratamento antitabagismo
Haacute algumas limitaccedilotildees nesse estudo Primeira os pacientes natildeo fizeram exames
de funccedilatildeo hepaacutetica antes da inclusatildeo no entudo no entanto a presenccedila de comorbidades
hepaacuteticas foram questionadas Segunda natildeo podemos obter total rigor nos horaacuterios de
tomada dos medicamentos por parte dos pacientes no entanto os pacientes foram
84
orientados agrave tomar o medicamento sempre no mesmo horaacuterio e foram questionados
quanto ao cumprimento do protocolo Terceira o nuacutemero amostral para a anaacutelise dos
analitos e de NRM em estudos de associaccedilatildeo com desfecho de tratamento eacute considerado
modesto e consequentemente pode ter implicado nos resultados de natildeo associaccedilatildeo
85
Quadro 6 ndash Comparaccedilatildeo dos dados de validaccedilatildeo com outros estudos
Analitos Purificaccedilatildeo da
amostraextraccedilatildeo Meacutetodo Amostra Intervalo Linear (μg L-1) Recuperaccedilatildeo () LD μg L-1 LQ μg L-1 Referecircncia
Vareniclina
Bupropiona
Hidroxibupropiona
Nicotina
Cotinina
Hidroxicotinina
CS ndash SPE (novo
RAM) HPLC-MSMS Soro humano
50 ndash 1000
10 ndash 10000
10 ndash 20000
50 ndash 10000
50 ndash 10000
50 ndash 10000
883
1101
945
1098
941
1167
25
07
06
19
24
37
50
10
10
50
50
50
Presente
estudo
Nicotitna
Cotinina LLE (LCndashMSMS) Soro humano
03 ndash 525
70 ndash15000
978 ndash 1114
973 ndash1156 -
03
70
Abdalla et al 104
Bupropiona
Hidroxibupropiona PP + SPE online TFCndashMSMS) Soro humano 50 ndash 10000
1580
1160
13
45
55
60
Petrides et
al 158
Vareniclina LLE HPLCndashMSMS
(API) Plasma humano 01ndash100 4759 - 4872 005 01
Al-Haj et al 105
Vareniclina LLE HPLC-
APIMSMS
Plasma
Urina
01 - 500
10 ndash 5000 - -
lt01
100
Faessel et al 51
Nicotina
cotinina
trans-3 ndash
hidroxicotinina
vareniclina
SPE (Oasis MCX 10
mg 96-well extraction
plate)
UPLCndashMSMS
Soro humano
100 ndash 5000
100 ndash 5000
100 - 5000
100 ndash 2500
860 ndash 940
700 ndash 870
490 ndash 540
830 ndash 920
-
20
10
20
10
Dobrinas et
al 156
86
Nicotina
Cotinina Centrifugaccedilatildeo
Diluiccedilatildeo
isotoacutepica estaacutevel
ndash UPLC-
MSMS
Urina 50 ndash 350000 968ndash1051
943ndash992
07
04
17
11
Kuhn et al 154
Nicotina e Cotinina LLE PP SPE
(UPLC-
MSMS)
Sangue urina e
outros tecidos de
rato
100 ndash 6000 (plasma)
80 (nicotina e
cotininacom
precipitaccedilatildeo)
25 50 Onoue et al
157
Cotinina LL SPE (coluna
Zorbaxs XDB C8) HPLCUV Soro e urina 50 ndash 5000 978 ndash 102 018 50
Petersen et
al 117
hidroxibupropiona PP + SPE online RP‐HPLCUV Plasma humano 1000 - 25000 6118 1000 1000
Scherf-
Clavel et al 155
CS ndash SPE= Extraccedilatildeo em fase soacutelida no modo column switching LLE= extraccedilatildeo liacutequido-liacutequido PP=precipitaccedilatildeo de proteiacutenas SPE=extraccedilatildeo em fase soacutelida HPLC= cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia
UPLC=cromatografia liacutequida de ultra eficiecircncia RP‐HPLC=Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia em fase reversa TFC=Cromatografia liacutequida turbulenta API=ionizaccedilatildeo em pressatildeo atmosfeacutericaUV=
detector ultravioleta MSMS= espectometria de massas em tandem
87
7 CONCLUSOtildeES
Para a anaacutelise da expressatildeo gecircnica este estudo exploratoacuterio mostra a associaccedilatildeo
das subunidades α7 e γ com a efetividade do tratamento com vareniclina Estes
resultados poderiam contribuir ao menos em parte para o desenvolvimento de uma
terapecircutica individualizada
Para a mensuraccedilatildeo de analitos o novo RAM sintetizado eacute um produto de
extremo valor cientiacutefico podendo apresentar diversas aplicaccedilotildees em anaacutelise de amostras
de matrizes complexas sem muita preparaccedilatildeo preacutevia Para a associaccedilatildeo das
concentraccedilotildees dos faacutermacos e seus metaboacutelitos com o desfecho de tratamento satildeo
necessaacuterios estudos com um maior nuacutemero amostral
88
8 SUGESTOtildeES PARA ESTUDOS FUTUROS
Sugerimos estudos que promovam maior entendimento das subunidades α7 e γ
dos nAChRs nos processos de dependecircncia agrave nicotina e no tratamento com vareniclina
Sugerimos tambeacutem estudos de investigaccedilatildeo para novas aplicabilidades do novo RAM
desenvolvido
89
9 REFEREcircNCIAS
1 WHO Tobacco WHO Media Centre 2015
2 Oliveira AF Valente JG Leite IC [Aspects of tobacco attributable mortality
systematic review] Rev Saude Publica 200842(2)335-345
3 Koshiaris C Aveyard P Oke J Ryan R Szatkowski L Stevens R Farley A
Smoking cessation and survival in lung upper aero-digestive tract and bladder
cancer cohort study Br J Cancer 2017117(8)1224-1232
4 Leppanen T Toyras J Mervaala E Penzel T Kulkas A Severity of individual
obstruction events increases with age in patients with obstructive sleep apnea
Sleep Med 20173732-37
5 Cerda J Bambs C Vera C Infant morbidity and mortality attributable to
prenatal smoking in Chile Rev Panam Salud Publica 201741e106
6 Vigitel Brasil - Vigilacircncia de fatores de risco e proteccedilatildeo para doenccedilas crocircnicas
por inqueacuterito telefocircnico Estimativas sobre frequecircncia e distribuiccedilatildeo
sociodemograacutefica de fatores de risco e proteccedilatildeo para doenccedilas crocircnicas nas
capitais dos 26 estados brasileiros e no Distrito Federal em 2018 Brasiacutelia 2019
7 Rosemberg J Nicotina Droga Universal Instituto Nacional de Cacircncer
(wwwincagovbr) 2004
8 Kirchenchtein C Chatkin JM Dependecircncia da Nicotina In Diretrizes para
Cessaccedilatildeo do Tabagismo Jornal Brasileiro de Pneumologia Brasiacutelia DF 2004
9 Fagerstoumlm K Uma breve apresentaccedilatildeo da neurofarmacologia e fisiologia da
dependecircncia agrave nicotina In Gigliotti AP Presman S (Eds) Atualizaccedilatildeo no
Tratamento do Tabagismo ABP Sauacutede 2006
10 Gigliotti A Lemos T Quais satildeo os mecanismos da dependecircncia de nicotina
In Manual de Condutas e Praacuteticas em Tabagismo Sociedade Brasileira de
Pneumologia e Tisiologia 2012
11 Divisatildeo de Controle do Tabagismo Coordenaccedilatildeo de Accedilotildees Estrateacutegicas
Instituto Nacional de Cacircncer Silva AG Ministeacuterio da Sauacutede Protocolo cliacutenico
e diretrizes terapecircuticas dependecircncia agrave nicotina 2013
12 Schultz W Multiple reward signals in the brain Nat Rev Neurosci
20001(3)199-207
13 Stolerman IP Jarvis MJ The scientific case that nicotine is addictive
Psychopharmacology (Berl) 1995117(1)2-10 discussion 14-20
90
14 Koob GF Volkow ND Neurocircuitry of addiction Neuropsychopharmacology
200935(1)217-238
15 Martin-Soelch C Neuroadaptive changes associated with smoking structural
and functional neural changes in nicotine dependence Brain Sci 20133(1)159-
176
16 Boening JA Neurobiology of an addiction memory J Neural Transm (Vienna)
2001108(6)755-765
17 Robbins TW Everitt BJ Limbic-striatal memory systems and drug addiction
Neurobiol Learn Mem 200278(3)625-636
18 Everitt BJ Belin D Economidou D Pelloux Y Dalley JW Robbins TW
Review Neural mechanisms underlying the vulnerability to develop compulsive
drug-seeking habits and addiction Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci
2008363(1507)3125-3135
19 Fuentes RM Notkola IL Shemeikka S Tuomilehto J Nissinen A Familial
aggregation of blood pressure a population-based family study in eastern
Finland J Hum Hypertens 200014(7)441-445
20 Gotti C Zoli M Clementi F Brain nicotinic acetylcholine receptors native
subtypes and their relevance Trends Pharmacol Sci 200627(9)482-491
21 Benowitz NL Pharmacology of nicotine addiction smoking-induced disease
and therapeutics Annu Rev Pharmacol Toxicol 20094957-71
22 Benowitz NL Clinical pharmacology of inhaled drugs of abuse implications in
understanding nicotine dependence NIDA Res Monogr 19909912-29
23 Picciotto MR Zoli M Rimondini R Lena C Marubio LM Pich EM Fuxe K
Changeux JP Acetylcholine receptors containing the beta2 subunit are involved
in the reinforcing properties of nicotine Nature 1998391(6663)173-177
24 Maskos U Molles BE Pons S Besson M Guiard BP Guilloux JP Evrard A
Cazala P Cormier A Mameli-Engvall M Dufour N Cloez-Tayarani I
Bemelmans AP Mallet J Gardier AM David V Faure P Granon S Changeux
JP Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of
nicotinic receptors Nature 2005436(7047)103-107
25 Tapper AR McKinney SL Nashmi R Schwarz J Deshpande P Labarca C
Whiteaker P Marks MJ Collins AC Lester HA Nicotine activation of alpha4
receptors sufficient for reward tolerance and sensitization Science
2004306(5698)1029-1032
26 Aberger K Chitravanshi VC Sapru HN Cardiovascular responses to
microinjections of nicotine into the caudal ventrolateral medulla of the rat Brain
Res 2001892(1)138-146
91
27 Levin ED Bettegowda C Blosser J Gordon J AR-R17779 and alpha7
nicotinic agonist improves learning and memory in rats Behav Pharmacol
199910(6-7)675-680
28 Hajos M Hurst RS Hoffmann WE Krause M Wall TM Higdon NR Groppi
VE The selective alpha7 nicotinic acetylcholine receptor agonist PNU-282987
[N-[(3R)-1-Azabicyclo[222]oct-3-yl]-4-chlorobenzamide hydrochloride]
enhances GABAergic synaptic activity in brain slices and restores auditory
gating deficits in anesthetized rats J Pharmacol Exp Ther 2005312(3)1213-
1222
29 Salas R Orr-Urtreger A Broide RS Beaudet A Paylor R De Biasi M The
nicotinic acetylcholine receptor subunit alpha 5 mediates short-term effects of
nicotine in vivo Mol Pharmacol 200363(5)1059-1066
30 Henningfield JE Stapleton JM Benowitz NL Grayson RF London ED Higher
levels of nicotine in arterial than in venous blood after cigarette smoking Drug
Alcohol Depend 199333(1)23-29
31 Hukkanen J Jacob P 3rd Benowitz NL Metabolism and disposition kinetics of
nicotine Pharmacol Rev 200557(1)79-115
32 Dempsey D Tutka P Jacob P 3rd Allen F Schoedel K Tyndale RF Benowitz
NL Nicotine metabolite ratio as an index of cytochrome P450 2A6 metabolic
activity Clin Pharmacol Ther 200476(1)64-72
33 Allenby CE Boylan KA Lerman C Falcone M Precision Medicine for
Tobacco Dependence Development and Validation of the Nicotine Metabolite
Ratio J Neuroimmune Pharmacol 201611(3)471-483
34 Llaquet H Pichini S Joya X Papaseit E Vall O Klein J Garcia-Algar O
Biological matrices for the evaluation of exposure to environmental tobacco
smoke during prenatal life and childhood Anal Bioanal Chem 2010396(1)379-
399
35 Reichert J AA Gonccedilalves CMC Godoy I Chatkin JM Sales MPU et al
Diretrizes da Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisologia Diretrizes para
cessaccedilatildeo do tabagismo ndash 2008 J Bras Pneumol 200834(10)845-880
36 Fiore MC Jaeacuten C R Baker TB Treating tobacco use and dependence 2008
update Clinical Practice Guideline In services USDohah ed Public Health
Service Rockville (md) 2008
37 Kassem MG Al Hossaini AM Varenicline Profiles Drug Subst Excip Relat
Methodol 201237389-411
38 Zoli M Lena C Picciotto MR Changeux JP Identification of four classes of
brain nicotinic receptors using beta2 mutant mice J Neurosci
199818(12)4461-4472
92
39 Hogg RC Raggenbass M Bertrand D Nicotinic acetylcholine receptors from
structure to brain function Rev Physiol Biochem Pharmacol 20031471-46
40 Mihalak KB Carroll FI Luetje CW Varenicline is a partial agonist at
alpha4beta2 and a full agonist at alpha7 neuronal nicotinic receptors Mol
Pharmacol 200670(3)801-805
41 Swan GE Javitz HS Jack LM Wessel J Michel M Hinds DA Stokowksi RP
McClure JB Catz SL Richards J Zbikowski SM Deprey M McAfee T Conti
DV Bergen AW Varenicline for smoking cessation nausea severity and
variation in nicotinic receptor genes Pharmacogenomics J 201212(4)349-358
42 Kaur K Kaushal S Chopra SC Varenicline for smoking cessation A review of
the literature Curr Ther Res Clin Exp 200970(1)35-54
43 Catz SL Jack LM McClure JB Javitz HS Deprey M Zbikowski SM McAfee
T Richards J Swan GE Adherence to varenicline in the COMPASS smoking
cessation intervention trial Nicotine Tob Res 201113(5)361-368
44 Faessel HM Burstein AH Troutman MD Willavize SA Rohrbacher KD Clark
DJ Lack of a pharmacokinetic interaction between a new smoking cessation
therapy varenicline and digoxin in adult smokers Eur J Clin Pharmacol
200864(11)1101-1109
45 Mohanasundaram UM Chitkara R Krishna G Smoking cessation therapy with
varenicline Int J Chron Obstruct Pulmon Dis 20083(2)239-251
46 Faessel HM Smith BJ Gibbs MA Gobey JS Clark DJ Burstein AH Single-
dose pharmacokinetics of varenicline a selective nicotinic receptor partial
agonist in healthy smokers and nonsmokers J Clin Pharmacol 200646(9)991-
998
47 Faessel HM Obach RS Rollema H Ravva P Williams KE Burstein AH A
review of the clinical pharmacokinetics and pharmacodynamics of varenicline
for smoking cessation Clin Pharmacokinet 201049(12)799-816
48 Ravva P Gastonguay MR Tensfeldt TG Faessel HM Population
pharmacokinetic analysis of varenicline in adult smokers Br J Clin Pharmacol
200968(5)669-681
49 Obach RS Reed-Hagen AE Krueger SS Obach BJ OConnell TN Zandi KS
Miller S Coe JW Metabolism and disposition of varenicline a selective
alpha4beta2 acetylcholine receptor partial agonist in vivo and in vitro Drug
Metab Dispos 200634(1)121-130
50 Feng B Obach RS Burstein AH Clark DJ de Morais SM Faessel HM Effect
of human renal cationic transporter inhibition on the pharmacokinetics of
varenicline a new therapy for smoking cessation an in vitro-in vivo study Clin
Pharmacol Ther 200883(4)567-576
93
51 Faessel HM Gibbs MA Clark DJ Rohrbacher K Stolar M Burstein AH
Multiple-dose pharmacokinetics of the selective nicotinic receptor partial
agonist varenicline in healthy smokers J Clin Pharmacol 200646(12)1439-
1448
52 Slemmer JE Martin BR Damaj MI Bupropion is a nicotinic antagonist J
Pharmacol Exp Ther 2000295(1)321-327
53 Hughes JR Stead LF Lancaster T Antidepressants for smoking cessation
Cochrane Database Syst Rev 2007(1)CD000031
54 Goodnick PJ Pharmacokinetics of second generation antidepressants
bupropion Psychopharmacol Bull 199127(4)513-519
55 Hesse LM Venkatakrishnan K Court MH von Moltke LL Duan SX Shader
RI Greenblatt DJ CYP2B6 mediates the in vitro hydroxylation of bupropion
potential drug interactions with other antidepressants Drug Metab Dispos
200028(10)1176-1183
56 Faucette SR Hawke RL Lecluyse EL Shord SS Yan B Laethem RM Lindley
CM Validation of bupropion hydroxylation as a selective marker of human
cytochrome P450 2B6 catalytic activity Drug Metab Dispos 200028(10)1222-
1230
57 Walsky RL Astuccio AV Obach RS Evaluation of 227 drugs for in vitro
inhibition of cytochrome P450 2B6 J Clin Pharmacol 200646(12)1426-1438
58 Walsky RL Obach RS A comparison of 2-phenyl-2-(1-piperidinyl)propane
(ppp) 111-phosphinothioylidynetrisaziridine (thioTEPA) clopidogrel and
ticlopidine as selective inactivators of human cytochrome P450 2B6 Drug
Metab Dispos 200735(11)2053-2059
59 Quaak M van Schooten FJ van Schayck CP Pharmacogenetics of smoking
how far to the clinic Pharmacogenomics 201415(6)723-726
60 Swan GE Lessov-Schlaggar CN Tobacco addiction and pharmacogenetics of
nicotine metabolism J Neurogenet 200923(3)262-271
61 Tomaz PRX Kajita MS Santos JR Scholz J Abe TO Gaya PV Krieger JE
Pereira AC Santos P Cytochrome P450 2A6 and 2B6 polymorphisms and
smoking cessation success in patients treated with varenicline Eur J Clin
Pharmacol201975(11)1541-1545
62 Tomaz PRX Santos JR Scholz J Abe TO Gaya PV Negrao AB Krieger JE
Pereira AC Santos P Cholinergic receptor nicotinic alpha 5 subunit
polymorphisms are associated with smoking cessation success in women BMC
Med Genet201819(1)55
94
63 Scholz J Santos PC Buzo CG Lopes NH Abe TO Gaya PV Pierri H Amorim
C Pereira AC Effects of aging on the effectiveness of smoking cessation
medication Oncotarget 20167(21)30032-30036
64 Issa JS Santos PC Vieira LP Abe TO Kuperszmidt CS Nakasato M Cardoso
E Amorim C Pereira AC Smoking cessation and weight gain in patients with
cardiovascular disease or risk factor Int J Cardiol 2014172(2)485-487
65 King DP Paciga S Pickering E Benowitz NL Bierut LJ Conti DV Kaprio J
Lerman C Park PW Smoking cessation pharmacogenetics analysis of
varenicline and bupropion in placebo-controlled clinical trials
Neuropsychopharmacology 201237(3)641-650
66 Saccone NL Baurley JW Bergen AW David SP Elliott HR Foreman MG
Kaprio J Piasecki TM Relton CL Zawertailo L Bierut LJ Tyndale RF Chen
LS The Value of Biosamples in Smoking Cessation Trials A Review of
Genetic Metabolomic and Epigenetic Findings Nicotine Tob Res
201820(4)403-413
67 Rocha Santos J Tomaz PR Issa JS Abe TO Krieger JE Pereira AC Santos
PC CHRNA4 rs1044396 is associated with smoking cessation in varenicline
therapy Front Genet 2015646
68 Tomaz PR Santos JR Issa JS Abe TO Gaya PV Krieger JE Pereira AC
Santos PC CYP2B6 rs2279343 polymorphism is associated with smoking
cessation success in bupropion therapy Eur J Clin Pharmacol 2015
71(9)1067-73
69 David SP Brown RA Papandonatos GD Kahler CW Lloyd-Richardson EE
Munafo MR Shields PG Lerman C Strong D McCaffery J Niaura R
Pharmacogenetic clinical trial of sustained-release bupropion for smoking
cessation Nicotine Tob Res 20079(8)821-833
70 Lerman C Shields PG Wileyto EP Audrain J Pinto A Hawk L Krishnan S
Niaura R Epstein L Pharmacogenetic investigation of smoking cessation
treatment Pharmacogenetics 200212(8)627-634
71 Han DH Joe KH Na C Lee YS Effect of genetic polymorphisms on smoking
cessation a trial of bupropion in Korean male smokers Psychiatr Genet
200818(1)11-16
72 Zanger UM Klein K Pharmacogenetics of cytochrome P450 2B6 (CYP2B6)
advances on polymorphisms mechanisms and clinical relevance Front Genet
2013424
73 Zhu AZ Cox LS Nollen N Faseru B Okuyemi KS Ahluwalia JS Benowitz
NL Tyndale RF CYP2B6 and bupropions smoking-cessation pharmacology
the role of hydroxybupropion Clin Pharmacol Ther 201292(6)771-777
95
74 Laib AK Brunen S Pfeifer P Vincent P Hiemke C Serum concentrations of
hydroxybupropion for dose optimization of depressed patients treated with
bupropion Ther Drug Monit 201436(4)473-479
75 Hutchison KE Allen DL Filbey FM Jepson C Lerman C Benowitz NL Stitzel
J Bryan A McGeary J Haughey HM CHRNA4 and tobacco dependence from
gene regulation to treatment outcome Arch Gen Psychiatry 200764(9)1078-
1086
76 Smith RC Zhubi A Maloku E Sershen H Lajtha A Davis JM Costa E
Guidotti A Varenicline treatment decreases DNMT1 mRNA expression in
lymphocytes of schizophrenic patients who are cigarette smokers Schizophr
Res 2010119(1-3)269-270
77 Marks MJ ONeill HC Wynalda-Camozzi KM Ortiz NC Simmons EE Short
CA Butt CM McIntosh JM Grady SR Chronic treatment with varenicline
changes expression of four nAChR binding sites in mice Neuropharmacology
201599142-155
78 Middleton FA Pato CN Gentile KL McGann L Brown AM Trauzzi M Diab
H Morley CP Medeiros H Macedo A Azevedo MH Pato MT Gene
expression analysis of peripheral blood leukocytes from discordant sib-pairs
with schizophrenia and bipolar disorder reveals points of convergence between
genetic and functional genomic approaches Am J Med Genet B Neuropsychiatr
Genet 2005136B(1)12-25
79 Takahashi M Hayashi H Watanabe Y Sawamura K Fukui N Watanabe J
Kitajima T Yamanouchi Y Iwata N Mizukami K Hori T Shimoda K Ujike H
Ozaki N Iijima K Takemura K Aoshima H Someya T Diagnostic
classification of schizophrenia by neural network analysis of blood-based gene
expression signatures Schizophr Res 2010119(1-3)210-218
80 Lee J Goh LK Chen G Verma S Tan CH Lee TS Analysis of blood-based
gene expression signature in first-episode psychosis Psychiatry Res
2012200(1)52-54
81 Sullivan PF Fan C Perou CM Evaluating the comparability of gene expression
in blood and brain Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet
2006141B(3)261-268
82 Hennings JM Uhr M Klengel T Weber P Putz B Touma C Czamara D Ising
M Holsboer F Lucae S RNA expression profiling in depressed patients
suggests retinoid-related orphan receptor alpha as a biomarker for antidepressant
response Transl Psychiatry 20155e538
83 Ota VK Noto C Gadelha A Santoro ML Silva PN Melaragno MI Smith Mde
A Cordeiro Q Bressan RA Belangero SI Neurotransmitter receptor and
regulatory gene expression in peripheral blood of Brazilian drug-naive first-
96
episode psychosis patients before and after antipsychotic treatment Psychiatry
Res2013210(3)1290-1292
84 Kordi-Tamandani DM Tajoddini S Salimi F Promoter Methylation and BDNF
and DAT1 Gene Expression Profiles in Patients with Drug Addiction
Pathobiology 201582(2)94-99
85 Wongsriraksa A Parsons ME Whelan CJ Characterisation of nicotine receptors
on human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) Inflamm Res
200958(1)38-44
86 Kawashima K Fujii T Expression of non-neuronal acetylcholine in
lymphocytes and its contribution to the regulation of immune function Front
Biosci 200492063-2085
87 St-Pierre S Jiang W Roy P Champigny C LeBlanc E Morley BJ Hao J
Simard AR Nicotinic Acetylcholine Receptors Modulate Bone Marrow-Derived
Pro-Inflammatory Monocyte Production and Survival PLoS One
201611(2)e0150230
88 Zdanowski R Krzyzowska M Ujazdowska D Lewicka A Lewicki S Role of
alpha7 nicotinic receptor in the immune system and intracellular signaling
pathways Cent Eur J Immunol 201540(3)373-379
89 Baez-Pagan CA Delgado-Velez M Lasalde-Dominicci JA Activation of the
Macrophage alpha7 Nicotinic Acetylcholine Receptor and Control of
Inflammation J Neuroimmune Pharmacol 201510(3)468-476
90 Kalkman HO Feuerbach D Modulatory effects of alpha7 nAChRs on the
immune system and its relevance for CNS disorders Cell Mol Life Sci
201673(13)2511-2530
91 Zakrzewicz A Richter K Agne A Wilker S Siebers K Fink B Krasteva-Christ
G Althaus M Padberg W Hone AJ McIntosh JM Grau V Canonical and
Novel Non-Canonical Cholinergic Agonists Inhibit ATP-Induced Release of
Monocytic Interleukin-1beta via Different Combinations of Nicotinic
Acetylcholine Receptor Subunits alpha7 alpha9 and alpha10 Front Cell
Neurosci201711189
92 Arreola R Alvarez-Herrera S Perez-Sanchez G Becerril-Villanueva E Cruz-
Fuentes C Flores-Gutierrez EO Garces-Alvarez ME de la Cruz-Aguilera DL
Medina-Rivero E Hurtado-Alvarado G Quintero-Fabian S Pavon L
Immunomodulatory Effects Mediated by Dopamine J Immunol
Res20163160486
93 Nakajima M Yamamoto T Nunoya K Yokoi T Nagashima K Inoue K Funae
Y Shimada N Kamataki T Kuroiwa Y Role of human cytochrome P4502A6 in
C-oxidation of nicotine Drug Metab Dispos 199624(11)1212-1217
97
94 Messina ES Tyndale RF Sellers EM A major role for CYP2A6 in nicotine C-
oxidation by human liver microsomes J Pharmacol Exp Ther
1997282(3)1608-1614
95 Chen A Krebs NM Zhu J Muscat JE Nicotine metabolite ratio predicts
smoking topography The Pennsylvania Adult Smoking Study Drug Alcohol
Depend201819089-93
96 Shahab L BL McNeill Tyndale RF Does the nicotine metabolite ratio
moderate smoking cessation treatment outcomes in real-world settings A
prospective study Addiction 2019114(2)304-314 doi 101111add14450
97 Lea RA Dickson S Benowitz NL Within-subject variation of the salivary
3HCCOT ratio in regular daily smokers prospects for estimating CYP2A6
enzyme activity in large-scale surveys of nicotine metabolic rate J Anal Toxicol
200630(6)386-389
98 Mooney ME Li ZZ Murphy SE Pentel PR Le C Hatsukami DK Stability of
the nicotine metabolite ratio in ad libitum and reducing smokers Cancer
Epidemiol Biomarkers Prev 200817(6)1396-1400
99 Piestansky J Marakova K Veizerova L Galba J Mikus P On-line column
coupled isotachophoresis-capillary zone electrophoresis hyphenated with
tandem mass spectrometry in drug analysis varenicline and its metabolite in
human urine Anal Chim Acta 201482684-93
100 Fagerstrom KO Heatherton TF Kozlowski LT Nicotine addiction and its
assessment Ear Nose Throat J 199069(11)763-765
101 Issa JS A new nicotine dependence score and a new scale assessing patient
comfort during smoking cessation treatment J Bras Pneumol 201238(6)761-
765
102 Mexal S Berger R Logel J Ross RG Freedman R Leonard S Differential
regulation of alpha7 nicotinic receptor gene (CHRNA7) expression in
schizophrenic smokers J Mol Neurosci 201040(1-2)185-195
103 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-
time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods
200125(4)402-408
104 Abdallah IA Hammell DC Stinchcomb AL Hassan HE A fully validated LC-
MSMS method for simultaneous determination of nicotine and its metabolite
cotinine in human serum and its application to a pharmacokinetic study after
using nicotine transdermal delivery systems with standard heat application in
adult smokers J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2016102067-
77
98
105 Al-Haj A Alawi M Arafat T Hourani MK Method development validation
and bioequivalence of varenicline in human plasma by liquid chromatography
tandem mass spectrometry J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci
2013931134-139
106 Hegstad S Stray-Pedersen A Olsen L Vege A Rognum TO Morland J
Christophersen AS Determination of cotinine in pericardial fluid and whole
blood by liquid chromatography-tandem mass spectrometry J Anal Toxicol
200933(4)218-222
107 Santos MG Moraes Gde O Nakamura MG dos Santos-Neto AJ Figueiredo
EC Restricted access molecularly imprinted polymers obtained by bovine serum
albumin andor hydrophilic monomers external layers a comparison related to
physical and chemical properties Analyst 2015140(22)7768-7775
108 de Lima MM Vieira AC Martins I Boralli VB Borges KB Figueiredo EC
On-line restricted access molecularly imprinted solid phase extraction of
ivermectin in meat samples followed by HPLC-UV analysis Food Chem
2015197(Pt A)7-13
109 Barbosa AF Barbosa VM Bettini J Luccas PO Figueiredo EC Restricted
access carbon nanotubes for direct extraction of cadmium from human serum
samples followed by atomic absorption spectrometry analysis Talanta
2016131213-220
110 de Faria HD Abrao LC Santos MG Barbosa AF Figueiredo EC New
advances in restricted access materials for sample preparation A review Anal
Chim Acta 201795943-65
111 FRANQUI L S et al Synthesis and characterization of a magnetic molecularly
imprinted polymer for the selective extraction of nicotine and cotinine from
urine samples followed by GC-MS analysis Anal Methods 2015 7(21) 9237ndash
9244 2015
112 Santos MG Tavares IM Barbosa AF Bettini J Figueiredo EC Analysis of
tricyclic antidepressants in human plasma using online-restricted access
molecularly imprinted solid phase extraction followed by direct mass
spectrometry identificationquantification Talanta 20171638-16
113 US Department of Health and Human Services Food and Drug Administration
(FDA) Center for Drug Evaluation and Research (CDER)Center for Veterinary
Medicine (CVM) Guidance for IndustryBioanalytical method validation
Biopharmaceutics 2013
114 GOMES Raphael A B et al Evaluation of the pH influence on protein
exclusion by restricted access carbono nanotubes coated with bovine serum
albumin Journal Of Materials Science 2016 51(16)7407-7414
99
115 de Faria HD Rosa MA Silveira AT Figueiredo EC Direct extraction of
tetracyclines from bovine milk using restricted access carbon nanotubes in a
column switching liquid chromatography system Food Chem 201722598-106
116 de Faria HD Bueno CT Krieger JE Krieger EM Pereira AC Santos P
Figueiredo EC Online extraction of antihypertensive drugs and their metabolites
from untreated human serum samples using restricted access carbon nanotubes
in a column switching liquid chromatography system J Chromatogr A
2017152841-52
117 Petersen GO Leite CE Chatkin JM Thiesen FV Cotinine as a biomarker of
tobacco exposure development of a HPLC method and comparison of matrices
J Sep Sci 201033(4-5)516-521
118 Brunen S Vincent PD Baumann P Hiemke C Havemann-Reinecke U
Therapeutic drug monitoring for drugs used in the treatment of substance-related
disorders literature review using a therapeutic drug monitoring appropriateness
rating scale Ther Drug Monit 201133(5)561-572
119 Ryan RE Loiacono RE Nicotine regulates alpha7 nicotinic receptor subunit
mRNA implications for nicotine dependence Neuroreport 200112(3)569-
572
120 Cameli C Bacchelli E De Paola M Giucastro G Cifiello S Collo G Cainazzo
MM Pini LA Maestrini E Zoli M Genetic variation in CHRNA7 and
CHRFAM7A is associated with nicotine dependence and response to varenicline
treatment Eur J Hum Genet 201826(12)1824-1831
121 Wallace TL Bertrand D Importance of the nicotinic acetylcholine receptor
system in the prefrontal cortex Biochem Pharmacol 201385(12)1713-1720
122 Dempster EL Toulopoulou T McDonald C Bramon E Walshe M Wickham H
Sham PC Murray RM Collier DA Episodic memory performance predicted by
the 2bp deletion in exon 6 of the alpha 7-like nicotinic receptor subunit gene
Am J Psychiatry 2006163(10)1832-1834
123 Enioutina EY Myers EJ Tvrdik P Hoidal JR Rogers SW Gahring LC The
nicotinic receptor Alpha7 impacts the mouse lung response to LPS through
multiple mechanisms PLoS One 201510(3)e0121128
124 Sinkus ML Graw S Freedman R Ross RG Lester HA Leonard S The human
CHRNA7 and CHRFAM7A genes A review of the genetics regulation and
function Neuropharmacology 201596(Pt B)274-288
125 Gault J Robinson M Berger R Drebing C Logel J Hopkins J Moore T Jacobs
S Meriwether J Choi MJ Kim EJ Walton K Buiting K Davis A Breese C
Freedman R Leonard S Genomic organization and partial duplication of the
human alpha7 neuronal nicotinic acetylcholine receptor gene (CHRNA7)
Genomics 199852(2)173-185
100
126 Riley B Williamson M Collier D Wilkie H Makoff A A 3-Mb map of a large
Segmental duplication overlapping the alpha7-nicotinic acetylcholine receptor
gene (CHRNA7) at human 15q13-q14 Genomics 200279(2)197-209
127 Benhammou K Lee M Strook M Sullivan B Logel J Raschen K Gotti C
Leonard S [(3)H]Nicotine binding in peripheral blood cells of smokers is
correlated with the number of cigarettes smoked per day Neuropharmacology
200039(13)2818-2829
128 Kunii Y Zhang W Xu Q Hyde TM McFadden W Shin JH Deep-Soboslay A
Ye T Li C Kleinman JE Wang KH Lipska BK CHRNA7 and CHRFAM7A
mRNAs co-localized and their expression levels altered in the postmortem
dorsolateral prefrontal cortex in major psychiatric disorders Am J Psychiatry
2015172(11)1122-1130
129 Breese CR Lee MJ Adams CE Sullivan B Logel J Gillen KM Marks MJ
Collins AC Leonard S Abnormal regulation of high affinity nicotinic receptors
in subjects with schizophrenia Neuropsychopharmacology 200023(4)351-
364
130 Freedman R Hall M Adler LE Leonard S Evidence in postmortem brain tissue
for decreased numbers of hippocampal nicotinic receptors in schizophrenia Biol
Psychiatry 199538(1)22-33
131 Guan ZZ Zhang X Blennow K Nordberg A Decreased protein level of
nicotinic receptor alpha7 subunit in the frontal cortex from schizophrenic brain
Neuroreport 199910(8)1779-1782
132 Martin-Ruiz CM Haroutunian VH Long P Young AH Davis KL Perry EK
Court JA Dementia rating and nicotinic receptor expression in the prefrontal
cortex in schizophrenia Biol Psychiatry 200354(11)1222-1233
133 Marutle A Zhang X Court J Piggott M Johnson M Perry R Perry E
Nordberg A Laminar distribution of nicotinic receptor subtypes in cortical
regions in schizophrenia J Chem Neuroanat 200122(1-2)115-126
134 Leonard S Breese C Adams C Benhammou K Gault J Stevens K Lee M
Adler L Olincy A Ross R Freedman R Smoking and schizophrenia abnormal
nicotinic receptor expression Eur J Pharmacol 2000393(1-3)237-242
135 Kumari V Postma P Nicotine use in schizophrenia the self medication
hypotheses Neurosci Biobehav Rev 200529(6)1021-1034
136 de Leon J Diaz FJ A meta-analysis of worldwide studies demonstrates an
association between schizophrenia and tobacco smoking behaviors Schizophr
Res 200576(2-3)135-157
101
137 Flomen RH Collier DA Osborne S Munro J Breen G St Clair D Makoff AJ
Association study of CHRFAM7A copy number and 2 bp deletion
polymorphisms with schizophrenia and bipolar affective disorder Am J Med
Genet B Neuropsychiatr Genet 2006141B(6)571-575
138 Gault J Hopkins J Berger R Drebing C Logel J Walton C Short M Vianzon
R Olincy A Ross RG Adler LE Freedman R Leonard S Comparison of
polymorphisms in the alpha7 nicotinic receptor gene and its partial duplication
in schizophrenic and control subjects Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet
2003123B(1)39-49
139 Perl O Strous RD Dranikov A Chen R Fuchs S Low levels of alpha7-
nicotinic acetylcholine receptor mRNA on peripheral blood lymphocytes in
schizophrenia and its association with illness severity Neuropsychobiology
200653(2)88-93
140 Raux G Bonnet-Brilhault F Louchart S Houy E Gantier R Levillain D Allio
G Haouzir S Petit M Martinez M Frebourg T Thibaut F Campion D The -2
bp deletion in exon 6 of the alpha 7-like nicotinic receptor subunit gene is a risk
factor for the P50 sensory gating deficit Mol Psychiatry 20027(9)1006-1011
141 Leonard S Gault J Hopkins J Logel J Vianzon R Short M Drebing C Berger
R Venn D Sirota P Zerbe G Olincy A Ross RG Adler LE Freedman R
Association of promoter variants in the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor
subunit gene with an inhibitory deficit found in schizophrenia Arch Gen
Psychiatry 200259(12)1085-1096
142 Mathew SV Law AJ Lipska BK Davila-Garcia MI Zamora ED Mitkus SN
Vakkalanka R Straub RE Weinberger DR Kleinman JE Hyde TM Alpha7
nicotinic acetylcholine receptor mRNA expression and binding in postmortem
human brain are associated with genetic variation in neuregulin 1 Hum Mol
Genet 200716(23)2921-2932
143 Severance EG Yolken RH Novel alpha7 nicotinic receptor isoforms and
deficient cholinergic transcription in schizophrenia Genes Brain Behav
20087(1)37-45
144 Severance EG Dickerson FB Stallings CR Origoni AE Sullens A Monson
ET Yolken RH Differentiating nicotine- versus schizophrenia-associated
decreases of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor transcript CHRFAM7A
in peripheral blood lymphocytes J Neural Transm (Vienna) 2009116(2)213-
220
145 Olincy A Freedman R Nicotinic mechanisms in the treatment of psychotic
disorders a focus on the alpha7 nicotinic receptor Handb Exp Pharmacol
2012 (213)211-232
146 Kariminejad A Almadani N Khoshaeen A Olsson B Moslemi AR Tajsharghi
H Truncating CHRNG mutations associated with interfamilial variability of the
102
severity of the Escobar variant of multiple pterygium syndrome BMC
Genet201617(1)71
147 Liu Y Wang L Yang YK Liang Y Zhang TJ Liang N Yang LM Li SJ Shan
D Wu QQ Prenatal diagnosis of fetal skeletal dysplasia using targeted next-
generation sequencing an analysis of 30 cases Diagn Pathol 201914(1)76
148 Natera-de Benito D Topf A Vilchez JJ Gonzalez-Quereda L Dominguez-
Carral J Diaz-Manera J Ortez C Bestue M Gallano P Dusl M Abicht A
Muller JS Senderek J Garcia-Ribes A Muelas N Evangelista T Azuma Y
McMacken G Paipa Merchan A Rodriguez Cruz PM Camacho A Jimenez E
Miranda-Herrero MC Santana-Artiles A Garcia-Campos O Dominguez-Rubio
R Olive M Colomer J Beeson D Lochmuller H Nascimento A Molecular
characterization of congenital myasthenic syndromes in Spain Neuromuscul
Disord 201727(12)1087-1098
149 Seo J Choi IH Lee JS Yoo Y Kim NK Choi M Ko JM Shin YB Rare cases
of congenital arthrogryposis multiplex caused by novel recurrent CHRNG
mutations J Hum Genet 201560(4)213-215
150 Keskitalo-Vuokko K Pitkaniemi J Broms U Heliovaara M Aromaa A Perola
M Ripatti S Salminen O Salomaa V Loukola A Kaprio J Associations of
nicotine intake measures with CHRN genes in Finnish smokers Nicotine Tob
Res201113(8)686-690
151 Saccone NL Saccone SF Hinrichs AL Stitzel JA Duan W Pergadia ML
Agrawal A Breslau N Grucza RA Hatsukami D Johnson EO Madden PA
Swan GE Wang JC Goate AM Rice JP Bierut LJ Multiple distinct risk loci
for nicotine dependence identified by dense coverage of the complete family of
nicotinic receptor subunit (CHRN) genes Am J Med Genet B Neuropsychiatr
Genet 2009150B(4)453-466
152 Saccone NL Schwantes-An TH Wang JC Grucza RA Breslau N Hatsukami
D Johnson EO Rice JP Goate AM Bierut LJ Multiple cholinergic nicotinic
receptor genes affect nicotine dependence risk in African and European
Americans Genes Brain Behav 20109(7)741-750
153 Santoro ML Ota VK Stilhano RS Silva PN Santos CM Diana MC Gadelha
A Bressan RA Melaragno MI Han SW Abilio VC Belangero SI Effect of
antipsychotic drugs on gene expression in the prefrontal cortex and nucleus
accumbens in the spontaneously hypertensive rat (SHR) Schizophr Res
2014157(1-3)163-168
154 Kuhn J Vollmer T Martin C Hendig D Knabbe C Fast and sample cleanup-
free measurement of nicotine and cotinine by stable isotope dilution ultra-
performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry J Pharm
Biomed Anal 201267-68137-143
103
155 Scherf-Clavel M Wahl O Menke A Unterecker S Determination of
hydroxybupropion in human serum for routine therapeutic drug monitoring in
psychiatry A tool for dose-individualization in treatment with bupropion
Biomed Chromatogr 201933(10)e4609
156 Dobrinas M Choong E Noetzli M Cornuz J Ansermot N Eap CB
Quantification of nicotine cotinine trans-3-hydroxycotinine and varenicline in
human plasma by a sensitive and specific UPLC-tandem mass-spectrometry
procedure for a clinical study on smoking cessation J Chromatogr B Analyt
Technol Biomed Life Sci 2011879(30)3574-3582
157 Onoue S Yamamoto N Seto Y Yamada S Pharmacokinetic study of nicotine
and its metabolite cotinine to clarify possible association between smoking and
voiding dysfunction in rats using UPLCESI-MS Drug Metab Pharmacokinet
201126(4)416-422
158 Petrides AK Moskowitz J Johnson-Davis KL Jannetto PJ Langman LJ Clarke
W Marzinke MA The development and validation of a turbulent flow-liquid
chromatography-tandem mass spectrometric method for the simultaneous
quantification of citalopram sertraline bupropion and hydroxybupropion in
serum Clin Biochem 201447(15)73-79
Rubrica participante Rubrica pesquisador
APEcircNDICE - TCLE
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
HOSPITAL DAS CLIacuteNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SAtildeO
PAULO-HCFMUSP
Registro das explicaccedilotildees do pesquisador ao paciente ou seu representante legal sobre a pesquisa consignando
Vocecirc estaacute sendo convidado (a) a participar de um projeto de pesquisa Este projeto tem
como objetivos principais para os indiviacuteduos fumantes submetidos aos tratamentos
farmacoloacutegicos antitabagismo associar o efeito das caracteriacutesticas geneacuteticas (DNA ou RNA) e do
metabolismo (concentraccedilatildeo dos produtos de metabolismo dos medicamentos no sangue) com a
eficiecircncia do tratamento antitabagismo O objetivo do estudo eacute saber por que algumas pessoas
respondem bem aos medicamentos antitabagismo enquanto outras pessoas natildeo respondem e
consequentemente natildeo conseguem parar de fumar Para isto precisaremos de amostras de
sangue cuja quantidade eacute comumente solicitada em exames laboratoriais de rotina (2 tubos a
cada visita = 20mL) Precisaremos tambeacutem do seu consentimento para que dados de seu
prontuaacuterio meacutedico sejam consultados Para os pacientes que utilizaratildeo o medicamento
bupropiona precisaremos de amostras de sangue na primeira consulta (visita T-1) e duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento medicamentoso (visita T2) Para os pacientes que utilizaratildeo
o medicamento vareniclina precisaremos de uma amostra de sangue na primeira consulta (visita
T-1) na segunda consulta ndash ainda antes de iniciar o tratamento com medicamento (visita T0) duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento medicamentoso (visita T2) e quatro semanas apoacutes o iniacutecio
do tratamento medicamentoso (visita T4) Os desconfortos mais comuns que podem ocorrer com
sua participaccedilatildeo neste estudo satildeo os mesmos de uma coleta de sangue no braccedilo por exemplo
leve dor no local da punccedilatildeo e eventualmente hematoma local Este sangue seraacute encaminhado
ao Laboratoacuterio de Geneacutetica e Cardiologia Molecular do Instituto do Coraccedilatildeo onde seraacute
armazenado somente para a pesquisa Sua participaccedilatildeo eacute totalmente voluntaacuteria Apoacutes ler
entender e esclarecer suas duacutevidas vocecirc assinaraacute 2 vias de igual teor desse documento (termo de
consentimento Livre e Esclarecido) Ainda vocecirc poderaacute solicitar o seu desligamento deste projeto
a qualquer momento bastando para tal entrar em contato os pesquisadores no tel (11) 2661-5592
ou 2661-5995 Em qualquer etapa do estudo vocecirc teraacute acesso aos profissionais responsaacuteveis
pela pesquisa para esclarecimento de eventuais duacutevidas O pesquisador responsaacutevel eacute a Dra
Jaqueline Scholz que pode ser encontrada no endereccedilo Av Dr Eneacuteas de Carvalho Aguiar 44
Instituto do Coraccedilatildeo Bloco 2 andar 1 Programa Ambulatorial de Tratamento Tabagismo
INCOR-HCFMUSP telefone (11) 2661-5592 Se vocecirc tiver alguma consideraccedilatildeo ou duacutevida sobre
a eacutetica da pesquisa entre em contato com o Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa (CEP) ndash Rua Oviacutedio
Pires de Campos 225 ndash 5ordm andar ndash tel (11) 2661-7585 FAX (011) 2661-7585 ndash e-mail
Rubrica participante Rubrica pesquisador
cappesqadmhcfmuspbr Poderaacute tambeacutem solicitar a destruiccedilatildeo das amostras que estaratildeo
armazenadas no mesmo laboratoacuterio
As informaccedilotildees obtidas seratildeo analisadas em conjunto com outros pacientes natildeo sendo
divulgada a identificaccedilatildeo de nenhum paciente Natildeo haveraacute nenhuma despesa por parte do
participante Tambeacutem natildeo haacute compensaccedilatildeo financeira relacionada agrave sua participaccedilatildeo
Benefiacutecio direto para o participante eacute a possibilidade de parar de fumar e ser bem monitorado
durante todo o processo de 12 semanas
Estas informaccedilotildees poderatildeo auxiliar na elaboraccedilatildeo de programas eficazes para o uso
da informaccedilatildeo das caracteriacutesticas individuais em usuaacuterios de medicamentos antitabagismo
Acredito ter sido suficientemente informado a respeito das informaccedilotildees que li ou que
foram lidas para mim descrevendo o estudo ldquoAnaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de
expressatildeo gecircnica dos genoacutetipos preditores de metabolizaccedilatildeo e das concentraccedilotildees de
metaboacutelitos com a resposta ao tratamento antitabagismordquo Eu discuti com o Dra Jaqueline
Scholz com a Juliana da Rocha dos Santos eou Paulo Roberto Xavier Tomaz sobre a minha
decisatildeo em participar nesse estudo Ficaram claros para mim quais satildeo os propoacutesitos do
estudo os procedimentos a serem realizados seus desconfortos e riscos as garantias de
confidencialidade e de esclarecimentos permanentes Concordo voluntariamente em participar
deste estudo e poderei retirar o meu consentimento a qualquer momento antes ou durante o
mesmo sem penalidades ou prejuiacutezo ou perda de qualquer benefiacutecio que eu possa ter
adquirido ou no meu atendimento neste Serviccedilo
_____________________________________________________________________________________
Assinatura do pacienterepresentante legal Data
____________________________________________________________________________
Assinatura da testemunha Data
para casos de pacientes menores de 18 anos analfabetos semi-analfabetos ou portadores de deficiecircncia auditiva ou visual
(Somente para o responsaacutevel do projeto)
Declaro que obtive de forma apropriada e voluntaacuteria o Consentimento Livre e Esclarecido deste
paciente ou representante legal para a participaccedilatildeo neste estudo
____________________________________________________________________________
Assinatura do pesquisador Data
Rubrica participante Rubrica pesquisador
DADOS DE IDENTIFICACcedilAtildeO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSAacuteVEL LEGAL
1NOME
DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nordm SEXO M F
DATA NASCIMENTO
ENDERECcedilO NordmAPTO
BAIRROCIDADE
ESTADOCEPTELEFONE()
2RESPONSAacuteVEL LEGAL
NATUREZA (grau de parentesco tutor curador etc)
DOCUMENTO DE IDENTIDADE SEXO M F
DATA DE NASCIMENTOENDERECcedilO
Nordm APTO
BAIRROCIDADE ESTADOCEPTELEFONE() ___________________________________________________________________________________________________________________________
DADOS SOBRE A PESQUISA
1 TIacuteTULO DO SUBPROJETO DE PESQUISA ldquoAnaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de expressatildeo gecircnica dos genoacutetipos
preditores de metabolizaccedilatildeo e das concentraccedilotildees de metaboacutelitos com a resposta ao tratamento antitabagismordquo
PESQUISADOR RESPONSAacuteVEL Dr Jaqueline Scholz
CARGOFUNCcedilAtildeO Meacutedico Assistente Meacutedico Pesquisador ndash InCor ndash HCFMUSP CRM SP nordm 60179
UNIDADE DO HCFMUSP Programa Ambulatorial de Tratamento Tabagismo InCor-HCFMUSP
PESQUISADOR EXECUTANTE Juliana da Rocha dos Santos CRF SP nordm 62776
CARGOFUNCcedilAtildeO POacuteS-GRADUANDAndash InCor ndash HCFMUSP
UNIDADE DO HC-FMUSP Laboratoacuterio de Geneacutetica e Cardiologia Molecular InCor-HCFMUSP
3 AVALIACcedilAtildeO DO RISCO DA PESQUISA
RISCO MIacuteNIMO RISCO MEacuteDIO
RISCO BAIXO x RISCO MAIOR
4 DURACcedilAtildeO DA PESQUISA 4 anos
ANEXO 1 ndash Aprovaccedilatildeo no Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa
ANEXO 2 - Teste de Fagerstroumlm para a dependecircncia agrave nicotina (versatildeo em Portuguecircs)
Fonte Pietrobon RC Barbisan JN Manfroi WC Utilizaccedilatildeo do teste de dependecircncia agrave nicotina de
Fagerstroumlm como um instrumento de medida do grau de dependecircncia Versatildeo em Portuguecircs Rev HCPA
200727(3)31-6
ANEXO 3 - Escore de consumo situacional Issa
Fonte Issa J S Um novo escore para dependecircncia a nicotina e uma nova escala de conforto do paciente durante
o tratamento do tabagismo J Bras Pneumol 38(6) 761-5
ANEXO 4 ndash Desenho de estudo do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticos na escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismordquo
Desenho do estudo Seraacute randomizado em dois braccedilos um nuacutemero amostral total de 300 pacientes No braccedilo da esquerda 150 pacientes seratildeo tratados com base em teste geneacutetico para os
polimorfismos CYP2B6 (rs2279343) e CHRNA4 (rs1044396) No braccedilo da direita 150 pacientes faratildeo o tratamento tradicional com vareniclina (o faacutermaco de maior efetividade no tratamento
antitabagismo) Em um estudo anterior nosso grupo de pesquisadores 5152 mostrou maior sucesso terapecircutico nos pacientes portadores dos genoacutetipos AA para o gene CYP2B6 nos pacientes
tratados com bupropiona e nos portadores dos genoacutetipos CT e TT para o gene CHRNA4 nos pacientes tratados com vareniclina A escolha do tratamento no braccedilo farmacogeneacutetico prioriza o
tratamento mais barato (bupropiona) dessa forma primeiramente eacute analisado o genoacutetipo para o rs2279343 se o paciente apresentar o genoacutetipo AA o mesmo eacute tratado com bupropiona se ele tiver
o genoacutetipo AG ou GG eacute analisado o genoacutetipo para o polimorfismo rs1044396 Se o paciente apresentar o genoacutetipo CT ou TT para o rs1044396 ele eacute tratado com vareniclina se ele apresentar o
genoacutetipo CC (natildeo favoraacutevel a nenhum dos faacutermacos) ele eacute tratado com vareniclina e bupropiona em uso concomitante Seraacute comparado o custo-efetividade do tratamento baseado em
farmacogeneacutetica em relaccedilatildeo ao tratamento com vareniclina Os pacientes satildeo acompanhados por 12 semanas durante o tratamento farmacoloacutegico visita inicial (T-1) antes do iniacutecio da terapecircutica
(T0) 2 4 6 8 e 12 semanas apoacutes o tratamento (T2 T4 T6 T8 T12) Obs Os pacientes que natildeo conseguirem parar de fumar ateacute a 4 ordf semana de tratamento em monoterapia eacute adicionada a
segunda medicaccedilatildeo Fonte Eficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticos na escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismo InCor-HCFMUSP Projeto de doutorado da Dra Patriacutecia Viviane Gaya
sob a orientaccedilatildeo da Dr Jaqueline R Scholz desenvolvido a partir dos resultados dos estudos da nossa equipe de pesquisadores Rocha Santos et al 2015 67 e Tomaz et al 2015 68
ANEXO 5 ndash Pedido de depoacutesito de patente na Agecircncia de Inovaccedilatildeo e Empreendedorismo da
Universidade Federal de Alfenas-MG
Esta tese estaacute de acordo com as seguintes normas em vigor no momento desta
publicaccedilatildeo
Referecircncias adaptado de International Committee of Medical Journals Editors
(Vancouver)
Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Medicina Divisatildeo de Biblioteca e
Documentaccedilatildeo Guia de apresentaccedilatildeo de dissertaccedilotildees teses e monografias Elaborado
por Anneliese Carneiro da Cunha Maria Julia de A L Freddi Maria F Crestana
Marinalva de Souza Aragatildeo Suely Campos Cardoso Valeacuteria Vilhena 3a ed Satildeo Paulo
Divisatildeo de Biblioteca e Documentaccedilatildeo 2011 Abreviaturas dos tiacutetulos dos perioacutedicos
de acordo com List of Journals Indexed in Index Medicus
SUMAacuteRIO
LISTA DE ABREVIATURAS SIacuteMBOLOS E SIGLAS
LISTA DE EQUACcedilOtildeES
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE QUADROS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
11 Nicotina farmacodinacircmica e farmacocineacutetica 3
12 Faacutermacos antitabagismo 5
121 Vareniclina 6
1211 Farmacodinacircmica 6
1212 Farmacocineacutetica 7
122 Bupropiona 9
1221 Farmacodinacircmica 9
1222 Farmacocineacutetica 10
13 Pesquisa de biomarcadores 11
131 Estudos farmacogeneacuteticos e de expressatildeo gecircnica para vareniclina e bupropiona 12
132 Mensuraccedilatildeo de nicotina bupropiona vareniclina e seus metaboacutelitos em amostras
bioloacutegicas 15
2 JUSTIFICATIVA 17
3 OBJETIVOS 19
4 METODOLOGIA 20
41 Casuiacutestica 20
42 Fluxo de procedimentos adotados no atendimento aos pacientes 23
43 Coleta e armazenamento das amostras dos pacientes tratados com vareniclina e
bupropiona 26
44 Nuacutemero amostral 27
45 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica para amostras de pacientes tratados com vareniclina 28
451 Concentraccedilatildeo purificaccedilatildeo e extraccedilatildeo de RNA 28
452 Siacutentese de cDNA 31
453 Ensaio de controle de qualidade das amostras para o ensaio de expressatildeo gecircnica 31
454 Ensaio de expressatildeo gecircnica 35
455 Anaacutelise dos dados de expressatildeo gecircnica 37
46 Mensuraccedilatildeo de bupropiona vareniclina e de seus metaboacutelitos por HPLC-MSMS 38
461 Materiais equipamentos e condiccedilotildees adotadas para a mensuraccedilatildeo dos analitos apoacutes
validaccedilatildeo do meacutetodo 38
462 Visatildeo geral do desenvolvimento da coluna e padronizaccedilatildeo da anaacutelise 41
463 Desenvolvimento da coluna RAM para a purificaccedilatildeo da amostra 43
464 Caracterizaccedilatildeo do novo RAM 46
4641 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA 46
4642 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas no soro 46
4643 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA em diferentes pHs 47
465 Paracircmetros espectromeacutetricos 47
466 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatograacutefico multidimensional 48
467 validaccedilatildeo analiacutetica 49
47 Anaacutelise estatiacutestica 49
5 RESULTADOS 51
51 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica 51
511 Dados cliacutenicos e demograacuteficos 51
512 Dados de expressatildeo gecircnica 53
513 Anaacutelise de associaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica entre os desfechos e os tempos de
tratamento 54
52 Mensuraccedilatildeo dos analitos 58
521 Caracterizaccedilatildeo da coluna teste exclusatildeo de proteiacutenas e interferentes da matriz 58
522 Otimizaccedilatildeo dos paracircmetros espectromeacutetricos 60
523 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatrograacutefico multidimensional 61
524 Validaccedilatildeo analiacutetica 64
525 Dados cliacutenicos e demograacuteficos dos pacientes submetidos a mensuraccedilatildeo dos analitos
69
526 Anaacutelise de associaccedilatildeo dos analitos com desfecho de tratamento 72
6 DISCUSSAtildeO 75
61 Para os dados da anaacutelise de expressatildeo gecircnica 75
62 Para os dados da mensuraccedilatildeo dos analitos 80
7 CONCLUSOtildeES 87
8 SUGESTOtildeES PARA ESTUDOS FUTUROS 88
9 REFEREcircNCIAS 89
APEcircNDICE ndash TCLE
ANEXO 1 ndash Aprovaccedilatildeo no Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa
ANEXO 2 ndash Teste de Fagerstroumlm para a dependecircncia agrave nicotina (versatildeo em Portuguecircs)
ANEXO 3 - Escore de consumo situacional Issa
ANEXO 4 - Desenho de estudo do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticos na
escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismordquo
ANEXO 5 -Pedido de depoacutesito de patente na Agecircncia de Inovaccedilatildeo e Empreendedorismo
da Universidade Federal de Alfenas-MG
LISTA DE ABREVIATURAS SIacuteMBOLOS E SIGLAS
API Ionizaccedilatildeo em pressatildeo atmosfeacuterica - Atmospheric pressure ionization
ACTB Gene que codifica a proteiacutena β actina
ANKK1 Gene codificador da proteiacutena quinase envolvida em vias de transduccedilatildeo de sinal
B2M Gene que codifica a microbulina subunidade β2
BC3 Tampatildeo de reaccedilao de transcriptase reversa
BR1 Tampatildeo de ressuspensatildeo
BR2 Tampatildeo de ligaccedilatildeo
BR3 Tampatildeo de lavagem 1
BR4 Tampatildeo de lavagem 2
BR5 Tampatildeo de eluiccedilatildeo
BRT Tubos PAXgene
BSA Albumina de soro bovino
[C14] Carbono 14 (isoacutetopo radioativo do carbono de massa atocircmica 14)
cDNA DNA complementar sintetizado a partir de uma moleacutecula de RNA
CHRNA3 Gene codificador do receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α3
CHRNA4 Gene codificador da subunidade α4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNA5 Gene codificador da subunidade α5 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNA6 Gene codificador da subunidade α6 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNA7 Gene codificador da subunidade α7 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNB2 Gene codificador da subunidade β2 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNB3 Gene codificador da subunidade β3 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNB4 Gene codificador da subunidade β4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNG Gene codificador do receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade δ
CNTs Nanotubos de carbono - Carbon nanotubes
COMT Gene codificador da enzima catecol-O-metiltransferase (metaboliza dopamina)
CS ndash SPE Extraccedilatildeo em fase soacutelida no modo column switching
CT Ciclo de linha de base ndash threshold cicle (nuacutemero de ciclo em que a amostra
amplificou)
CYP2B6 Gene codificador do receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade γ
CYP2B6 Gene codificador da isoenzima CYP2B6
Disco QC Disco para a realizaccedilatildeo do controle de qualidade de amostras que seratildeo utilizadas
para o ensaio de expressatildeo gecircnica
DN Dependecircncia agrave nicotina
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
DNAse Enzima que degrada moleacuteculas de DNA
dNTP Dinucleotiacutedeos dATP dCTP dGTP e dTTP
DRD1 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 1
DRD2 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 2
DRD3 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 3
DRD4 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 4
E Erro relativo
EDTA Aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico
Escore Issa Escore de consumo situacional Issa
ESI+ Ionizaccedilatildeo positiva por electrospray - positive Electrospray ionization
FDA Orgatildeo de controle de alimentos e medicamentos americano ndash Food and drug
administration
FTND Teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fargestroumlm test for nicotine
dependence
g Velocidade de rotaccedilatildeo em forccedila g a qual considera a aceleraccedilatildeo da gravidade
GDC Controle de contaminaccedilatildeo de DNA genocircmico do disco QC
GE Tampatildeo de degradaccedilatildeo de DNA genocircmico
HGDC Controle de contaminaccedilatildeo de DNA genocircmico do ensaio de expressatildeo gecircnica
HPLC Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia ndash High Performance Liquid
Cromatograph
HPLC-MSMS Cromatografica liacutequida de alta eficiecircncia seguida por espectrometria de massas
em tandem ndash High Performance Liquid Cromatograph fowed by tandem Mass
Spectrometric
HPRT1 Gene que codifica a enzima hipoxantina fosforribosiltransferase 1
HTR3A Gene codificador da subunidade 3A do receptor de serotonina
HTR3B Gene codificador da subunidade 3B do receptor de serotonina
KV Energia de colisatildeo em quilovolt
LC-MS Cromatografia liacutequida seguida de espectrometria de massas - Liquid
Cromatograph fowed by Mass Spectrometric
LD Limite de detecccedilatildeo
LLE Extraccedilatildeo liacutequido-liacutequido (com o uso de solvente)
LQ Limite de quantificaccedilatildeo
LogP Coeficiente de particcedilatildeo relaccedilatildeo das concentraccedilotildees da substacircncia em um solvente
orgacircnico e em aacutegua dado que ambos os solventes satildeo necessariamente imisciacuteveis
MCT Microtubos de 15 mL
MS Espectrometria de massas - Mass Spectrometric
MRM Muacuteltiplas transiccedilotildees de monitoramento de reaccedilatildeo - multiple reaction monitoring
MSMS Espectrometria de massas em tandem
mz Relaccedilatildeo massacarga dos analitos
nAChR(s) Receptor(es) acetilcoliacutenico (s) nicotiacutenico (s)
NMR Taxa de metabolizaccedilatildeo da nicotina ndash Nicotine metabolite ratio
NTC Controle negativo
NTR Controle de natildeo transcriccedilatildeo reversa
OCT2 Transportador catiocircnico orgacircnico
P2 Controle externo de RNA
PAF Programa de Assistecircncia ao Fumante
PBMC Ceacutelulas mononucleares de sangue perifeacuterico - Peripheral blood mononuclear cell
PCR Amplificaccedilatildeo em cadeia da polimerase
PIs Padrotildees internos
PK Enzima proteinase K
pKa Valor negativo do logaritmo da constante de dissociaccedilatildeo de um aacutecido
pKb Valor negativo do logaritmo da constante de dissociaccedilatildeo de uma base
PP Extraccedilatildeo por preciptaccedilatildeo de proteiacutenas
PPC Controle positivo de PCR
PRC Coluna de rotaccedilatildeo de RNA vermelho
PSC Coluna de rotaccedilatildeo do homogeneizador lilaacutes
PT Tubo de processamento
RAM Material de acesso restrito ndash restrict access material
Rcf Forccedila centriacutefuga relativa ndash Relative centrifugal force
RDD Tampatildeo de digestatildeo de DNA
RE3 Mix de transcriptase reversa
RNA Aacutecido ribonucleico
RNase Enzima ribonuclease a qual degrada as moleacuteculas de RNA
RNFD Soluccedilatildeo matildee de DNase
RNFW Aacutegua livre de RNase
RFLP Restriccedilatildeo enzimaacutetica - Restriction fragment length polymorphism
RP‐HPLC Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia em fase reversa ndash Reverse-Phase High
Performance Liquid Cromatograph
Rpm Rotaccedilatildeo por minuto
RSD Desvio padratildeo relativo
SLC6A3 Gene codificador da proteiacutena transportadora de dopamina
SLC22A2 Gene codificador da proteiacutena OCT2 transportadora de caacutetions orgacircnicos
(transporta vareniclina)
SNC Sistema nervoso central
SPE Extraccedilatildeo em fase soacutelida
Sty I Enzima de restriccedilatildeo proveniente da Salmonella Typhi
TAE Tampatildeo formado com Tris Acetato e EDTA
TRN Terapia de reposiccedilatildeo nicotiacutenica
UGT2B7 Gene codificador da enzima UGT2B7 a qual metaboliza a vareniclina
UPLC Cromatografica liacutequida de ultra eficiecircncia - Ultra Performance Liquid
Cromatograph
UV Detector ultravioleta
α3 Subunidade alfa 3 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α4 Subunidade alfa 4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α5 Subunidade alfa 5 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α6 Subunidade alfa 6 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α7 Subunidade alfa 7 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
β2 Subunidade beta 2 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
β4 Subunidade beta 4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
T-1 Visita inicial
T0 Visita de iniacutecio do tratamento (coleta realizada antes de comeccedilar o tratamento no
mesmo dia)
T2 Visita de 2 semanas apoacutes tratamento farmacoloacutegico
T4 Visita de 4 semanas apoacutes tratamento farmacoloacutegico
T12 Visita de 12 semanas apoacutes tratamento farmacoloacutegico
TFC Cromatografia liacutequida turbulenta - Turbulent flow-liquid chromatography
LISTA DE EQUACcedilOtildeES
∆CT= (CTamostra ndash a meacutedia de CThousekeeping genes) Normalizaccedilatildeo da expressatildeo
gecircnica dos genes alvo atraveacutes de valores de expressatildeo de genes fisioloacutegicos
2-∆CT Transformaccedilatildeo dos valores de ∆CT em escala logariacutetmica para a realizaccedilatildeo
dos testes de hipoacutetese
∆∆CT= (mediana de ∆CTgrupo teste ndash mediana de ∆CT grupo referecircncia) Foacutermula
utilizada para posterior caacutelculo de fold change Considera-se os dois grupos
envolvidos no teste de hipoacutetese
2-∆∆CT Transformaccedilatildeo dos dados de ∆∆CT em escala logariacutetmica Atraveacutes dessa
foacutermula se obteacutem o fold change (diferenccedila de expressatildeo entre dois grupos)
NMR=(trans-3-hidroxicotininacotinina) Taxa de metabolizaccedilatildeo da nicotina
NMRlt031=metabolizador lento NMRgt031 metabolizador normal ou raacutepido
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Analitos precursores fragmentos e energias de colisatildeo
otimizados
40
Tabela 2 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina selecionados para os ensaios de expressatildeo gecircnica
52
Tabela 3 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina submetidos aos ensaios de expressatildeo gecircnica de acordo
com o desfecho de tratamento
52
Tabela 4 - Valores de mediana de ∆CT dos genes de acordo com os
tempos de tratamento e grupos de desfecho
53
Tabela 5 - Fold change e anaacutelise de associaccedilatildeo entre os tempos de
tratamento e grupos de desfecho
54
Tabela 6 - Paracircmetros de validaccedilatildeo obtidos na determinaccedilatildeo de faacutermacos
antitabagismo em soro humano
68
Tabela 7 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos
69
Tabela 8 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de
acordo com o desfecho de tratamento
70
Tabela 9 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos
71
Tabela 10 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes
tratados com bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos
analitos de acordo com o desfecho de tratamento
71
Tabela 11 ndash Frequecircncia do desfecho de tratamento nos pacientes
submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com os
medicamentos antitabagismo
72
Tabela 12 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos
pacientes tratados com vareniclina
73
Tabela 13 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de
tratamento com vareniclina
73
Tabela 14 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos
pacientes tratados com bupropiona
74
Tabela 15 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de
tratamento com bupropiona
74
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Aacutereas estimuladas atraveacutes de vias dopamineacutergicas e
serotonineacutergicas e sistema de recompensa
2
Figura 2 - Receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico 4
Figura 3 - Via primaacuteria do metabolismo da nicotina 5
Figura 4 - Mecanismo de accedilatildeo da vareniclina 7
Figura 5 - Metabolismo da vareniclina em humanos 8
Figura 6 - Mecanismo de accedilatildeo da bupropiona 9
Figura 7 - Metabolismo da bupropiona em seus principais metaboacutelitos ativo 11
Figura 8 - Desenho do estudo 22
Figura 9 - Representaccedilatildeo do Rotor-Disc100 33
Figura 10 - Mapa do disco QC (representaccedilatildeo planilhada) 33
Figura 11 - Exemplo de ajuste de Threshold 34
Figura 12 - Mapa do disco do ensaio RT2 profiler PCR array (representaccedilatildeo
planilhada)
37
Figura 13 - Representaccedilatildeo da composiccedilatildeo da coluna extratora (Novo RAM) 45
Figura 14 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNA7 entre os tempos de
tratamento e desfecho
56
Figura 15 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNG entre os tempos de
tratamento e desfecho
57
Figura 16 - Heat map de expressatildeo gecircnica 58
Figura 17 ndash Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com soluccedilatildeo de
BSA
59
Figura 18 - Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com amostra de
soro diluiacuteda
59
Figura 19 - Influecircncia do pH na exclusatildeo de proteiacutenas 60
Figura 20 - Ilustraccedilatildeo do sistema de columm switching na configuraccedilatildeo de
backflush
62
Figura 21 - Cromatograma obtido de amostras de soro branco diluiacutedas em
aacutegua ultra pura
65
Figura 22 - Cromatograma obtido apoacutes anaacutelise de soro diluiacutedo e dopado com
os analitos no niacutevel meacutedio de calibraccedilatildeo e mais os padrotildees internos deuterados
65
Figura 23 - Cromatograma obtido atraveacutes da anaacutelise das amostras de soro dos
pacientes tratados com bupropiona
67
Figura 24 - Cromatograma obtido atraveacutes da analise de amostras de soro de
pacientes tratados com vareniclina
67
LISTA DE QUADROS
Quadro 1- Procedimentos do protocolo em relaccedilatildeo aos pacientes 25
Quadro 2 - Paracircmetros de qualidade do ensaio QC 34
Quadro 3 - Genes escolhidos para o ensaio de expressatildeo 36
Quadro 4 - Housekeeping genes 36
Quadro 5 - Propriedades fiacutesico-quiacutemicas dos analitos 42
Quadro 6 ndash Comparaccedilatildeo dos dados de validaccedilatildeo com outros estudos 85
RESUMO
Santos JR Anaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de expressatildeo gecircnica e das concentraccedilotildees
de metaboacutelitos com a resposta ao tratamento antitabagismo [tese] Satildeo Paulo
Faculdade de Medicina Universidade de Satildeo Paulo 2020
Introduccedilatildeo O tabagismo eacute considerado a maior causa de morbidade e mortalidade
evitaacutevel no mundo Estudos tecircm buscado a identificaccedilatildeo de preditores de resposta aos
tratamentos de cessaccedilatildeo tabaacutegica Os principais objetivos deste estudo foram analisar a
possiacutevel associaccedilatildeo da expressatildeo de genes alvo e das concentraccedilotildees de analitos
(faacutermacos antitabagismo nicotina e seus metaboacutelitos) com a resposta ao tratamento
Meacutetodos Foram incluiacutedos 105 pacientes fumantes que iniciariam o tratamento com
vareniclina (n=74) ou bupropiona (n=31) As anaacutelises de expressatildeo gecircnica foram
realizadas atraveacutes do ensaio customizado RTsup2 Profiler PCR Array com a inclusatildeo de 17
genes para a anaacutelise em ceacutelulas mononucleares de sangue perifeacuterico (PBMC) A
preparaccedilatildeo das amostras de soro para a mensuraccedilatildeo dos analitos foi realizada atraveacutes de
uma coluna extratora composta por nanotubos hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados
com a adiccedilatildeo de grupos hidrofiacutelicos (material de acesso restrito - RAM) desenvolvida
no LATF Unifal MG A mensuraccedilatildeo dos analitos foi realizada por cromatografia
liacutequida de alta eficiecircncia em modo column switching seguida de espectrometria de
massa em tandem (HPLC-MSMS) Os tempos para a coleta de amostras foram para as
anaacutelises de expressatildeo gecircnica (sangue total) antes de iniciar o tratamento (T0) duas e
quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento (T2 e T4 respectivamente) e para a
mensuraccedilatildeo dos analitos (soro) as amostras foram coletadas na T2 Resultados Para as
anaacutelises de expressatildeo gecircnica selecionamos 14 pacientes que obtiveram sucesso e 13
pacientes resistentes ao tratamento com vareniclina Foi considerado sucesso quando o
paciente alcanccedilava abstinecircncia ao tabaco ateacute a 4 ordf semana de tratamento e resistente
quando o paciente natildeo conseguia parar de fumar ateacute a 4ordf semana de tratamento Foi
observada diferenccedila significativa para a expressatildeo do gene CHRNA7 no grupo
resistente amostras dos tempos T2 e T4 apresentaram menor expressatildeo comparadas ao
tempo T0 (fold change 038 P=0007 fold change 067 P=0004 respectivamente)
Para a mensuraccedilatildeo dos analitos a coluna RAM desenvolvida mostrou alta capacidade
para a remoccedilatildeo de macromoleacuteculas e de anaacutelise conjunta dos diferentes analitos aleacutem
de poder ser reutilizada diversas vezes (cerca de 400 ciclos) Os pacientes do grupo
resistente tratados com ambos os faacutermacos apresentaram maior concentraccedilatildeo de
metaboacutelitos da nicotina na T2 No entanto natildeo houve associaccedilatildeo dos faacutermacos e seus
metaboacutelitos com desfecho de tratamento Conclusotildees Para as anaacutelises de expressatildeo
gecircnica este estudo exploratoacuterio mostrou um possiacutevel preditor de efetividade no
tratamento com vareniclina reafirmando a associaccedilatildeo da subunidade α7 para os
processos de dependecircncia agrave nicotina e tratamento antitabagismo Estes resultados
podem contribuir ao menos em parte para o desenvolvimento de uma terapia
individualizada Contudo estudos futuros satildeo necessaacuterios para o entendimento do papel
da subunidade α7 dos receptores acetilcoliacutenicos-nicotiacutenicos no tratamento com
vareniclina Para a mensuraccedilatildeo dos analitos o novo RAM sintetizado eacute um produto de
extremo valor cientiacutefico podendo apresentar diversas aplicaccedilotildees em anaacutelise de amostras
com matrizes complexas sem muita preparaccedilatildeo preacutevia Para a associaccedilatildeo das
concentraccedilotildees dos faacutermacos e seus metaboacutelitos com o desfecho de tratamento satildeo
necessaacuterios estudos com um maior nuacutemero amostral
Descritores Vareniclina Bupropiona Nicotina Abandono do haacutebito de fumar
Expressatildeo gecircnica Biomarcadores farmacoloacutegicos
ABSTRACT
Santos JR Association analysis of gene expression profiles and metabolite
concentrations with response for smoking cessation treatment [thesis] Satildeo Paulo
ldquoFaculdade de Medicina Universidade de Satildeo Paulordquo 2020
Introduction Smoking is considered the largest cause of preventable morbidity and
mortality in the worldwide Studies have sought to identify predictors of responses to
smoking cessation treatments The main objectives of this study were to analyze the
possible association of the expression of target genes and concentrations of analytes
(drugs for smoking cessation nicotine and their metabolites) with the response to
treatment Methods We included 105 smoker patients who would start treatment with
varenicline (n=74) or bupropion (n=31) Gene expression analysis was performed
through custom RTsup2 Profiler PCR array assay including 17 genes for analysis in
peripheral blood mononuclear cells (PBMC) Serum sample preparation for the
measurement of analytes was performed by an extraction column composed of hybrid
carbon and silica nanotubes modified with the addition of hydrophilic groups (restricted
access material - RAM) developed by LATF Unifal MG The measurement of analytes
was performed by high efficient liquid chromatography in column switching mode
followed by tandem mass spectrometry (HPLC-MSMS) Times for sample collection
were for gene expression analysis (total blood) before start of therapy (T0) two and
four weeks after start of treatment (T2 and T4 respectively) and for measurement of
analytes (serum) the samples were collected at T2 Results For gene expression
analysis we selected 14 patients who had success and 13 patients resistant to the
varenicline treatment Success was considered to be when a patient achieved tobacco
abstinence until the 4th week of treatment and resistant was when a patient had not
stopped smoking as of the 4th week of treatment We observed a significant difference
for CHRNA7 gene expression in the resistant group samples from T2 and T4 had lower
expression compared with T0 (fold change 038 P=0007 fold change 067 P=0004
respectively) For measurement of analytes the developed RAM column showed high
capacity to remove macromolecules and joint analyzes of different analytes besides
being able to be reuse manny times (about 400 cycles) Patients from resistant group of
the both drugs treatment had a higher concentration of nicotine metabolites in T2
However there was no association of drugs for smoking cessation and their metabolites
with outcome treatment Conclusions For gene expression analysis this exploratory
study showed a possible predictor of effectiveness in the treatment with varenicline
reaffirming the association of the α7 subunit for nicotine dependence and smoking
therapy processes These results may contribute at least in part to the development of
individualized therapy However further studies are needed to understand the role of the
α7 subunit of acetylcholinic-nicotinic receptors in varenicline treatment For the
measurement of analytes the new synthesized RAM is a product of extreme scientific
value being able of several applications in the analysis of samples with complex
matrices without much prior preparation For an association of drugs for smoking
cessation and their metabolites with outcome treatment studies with a larger sample
size are needed
Descriptors Varenicline Bupropion Nicotine Smoking cessation Gene expression
Biomarkers pharmacological
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
O tabagismo eacute considerado a maior causa de morbidade e mortalidade evitaacutevel
em todo o mundo 1 Doenccedilas cardiacuteacas cerebrovasculares cerca de um quinto de todos
os tipos de cacircnceres doenccedilas pulmonares como apneia e enfisema aleacutem de distuacuterbios
preacute-natais estatildeo associadas ao consumo do tabaco 2-5
Dados recentes da Vigitel mostraram que no conjunto das 27 capitais brasileiras
a frequecircncia de adultos fumantes foi de 93 com valores duas vezes maior no sexo
masculino (121) do que no feminino (69) As menores frequecircncias foram
encontradas na populaccedilatildeo de jovens adultos (antes dos 25 anos) e em pessoas de mais
de 65 anos As maiores frequecircncias foram encontradas entre homens em Porto Alegre
(173) Campo Grande e Satildeo Paulo (156) 6
A nicotina eacute o principal componente do tabaco causador de dependecircncia Esta
age nos receptores acetilcoliacutenicos-nicotiacutenicos (nAChRs) promovendo a liberaccedilatildeo de
diversos neurotransmissores e neuroreguladores tais como dopamina acetilcolina
epinefrina norepinefrina serotonina beta-endorfina vasopressina e GABA O principal
neurotransmissor estudado eacute a dopamina pois a nicotina promove aumento de seus
niacuteveis na regiatildeo mesocorticoliacutembica cerebral principalmente em um circuito conhecido
como ldquosistema de recompensardquo (aacuterea tegmental ventral nuacutecleo accumbens e coacutertex preacute-
frontal) gerando sensaccedilotildees de prazer e bem-estar 7-15
O processo de adiccedilatildeo agrave nicotina eacute complexo e nem todos os mecanismos estatildeo
elucidados Aleacutem da ativaccedilatildeo do sistema de recompensa haacute a formaccedilatildeo de memoacuterias
associativas do efeito hedocircnico com os ambientes e situaccedilotildees de disponibilidade e uso
do tabaco resultando em reforccedilo positivo apoacutes o fumante entrar em contato com fatores
relacionados ao seu consumo Este tipo de memoacuteria aprendida envolve a amigdala o
hipocampo o coacutertex preacute-frontal e o coacutertex parietal 15-17 Evidecircncias tambeacutem satildeo
2
consistentes com a hipoacutetese da ativaccedilatildeo do estriado dorsal o qual estaacute envolvido no
processamento de memoacuterias de formaccedilatildeo de haacutebito em processos motores o que
poderia automatizar o ato de fumar 15 18 (Figura 1)
O uso continuado do tabaco promove a desensibilizaccedilatildeo e adaptaccedilatildeo dos
nAChRs causando toleracircncia e diminuiccedilatildeo dos efeitos de recompensa naturais Como
resultado o indiviacuteduo experimenta fissura ansiedade humor deprimido e irritabilidade
na ausecircncia da nicotina Estes sintomas acabam promovendo um reforccedilo negativo para o
fumo e o nuacutemero de cigarros consumidos aumenta cada vez mais 14 15
Todos os fatores acima mencionados contribuem para o mecanismo de
dependecircncia agrave nicotina (DN) Os efeitos hedocircnicos estatildeo relacionados com o processo
de iniciaccedilatildeo do tabagismo enquanto os efeitos negativos da falta da nicotina estatildeo mais
associados agrave manutenccedilatildeo do fumo 15
Para os indiviacuteduos que desejam parar de fumar o tratamento farmacoloacutegico
antitabagismo eacute o que apresenta maior eficaacutecia na reduccedilatildeo da prevalecircncia de fumantes
19
Figura 1 - Aacutereas estimuladas atraveacutes de vias dopamineacutergicas e serotonineacutergicas e sistema de recompensa A
Principais vias ativadas na dependecircncia como a aacuterea tegmental ventral nuacutecleos accumbens e da rafe coacutertex-frontal
estriado susbstacircncia negra e hipocampo As setas em rosa indicam aacutereas estimuladas pelas vias serotonineacutergicas de
transmissatildeo e em azul pelas vias dopamineacutergicas gerando diversos comportamentos B Sistema de recompensa
(composto pela VTA nuacutecleo accumbeacutens e coacutertex preacute-frontal) A nicotina age nos nAChRs no SNC gerando uma
3
descarga de dopamina no sistema de recompensa Haacute uma adaptaccedilatildeo desses receptores com o fumo continuado
fazendo com que haja a necessidade de maior consumo de nicotina e o desenvolvimento da dependecircncia VTA= aacuterea
tegmental ventral SNC sistema nervoso central nAChR= receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico Fonte adaptado de
Habermann A Brain awareness week addiction and the brainrsquos reward system Sovereign Health Group 2016 e de
Koob amp Volkow 2009 14
11 Nicotina farmacodinacircmica e farmacocineacutetica
O fumo permite uma titulaccedilatildeo precisa da dose de nicotina por parte do fumante
Sua absorccedilatildeo eacute raacutepida chegando em cerca de 10 segundos em todo o sistema nervoso
central (SNC) onde se liga nos nAChRs 20 21 22
Os nAChRs satildeo receptores de canais iocircnicos compostos por cinco subunidades
que podem estar combinadas de diferentes formas (Figura 2) 20 Os subtipos desses
receptores mais abundantes no ceacuterebro humano satildeo os α4β2 α3β4 e α7 (homomeacuterico)
Os receptores compostos pelas subunidades α4β2 (o asterisco indica que outras
subunidades podem estar presentes) possuem um papel fundamental na DN O nocaute
da subunidade β2 em ratos resultou na eliminaccedilatildeo dos efeitos comportamentais da
nicotina 23 Quanto agrave subunidade α4 parece estar envolvida na sensibilidade agrave nicotina
o que pode impactar nos efeitos de recompensa dessensibilizaccedilatildeo e toleracircncia24 25 Os
receptores compostos pelas subunidades α3β4 acredita-se mediar os efeitos
cardiovasculares 26 Os nAChRs α7 homomeacuterico estatildeo envolvidos na velocidade de
sinapses em processos de aprendizagem e controle sensorial 27 28 Os receptores
compostos pelas subunidades α4β2lowast podem conter outras subunidades como por
exemplo α5 α6 eou β3 as quais podem modificar a sensibilidade e funccedilatildeo do receptor
21 29
Como um agonista desses receptores a nicotina promove a sua abertura
permitindo a entrada de soacutedio e caacutelcio despolarizando assim a membrana dos
neurocircnios Aleacutem da entrada de caacutelcio atraveacutes dos nAChRs haacute tambeacutem a abertura de
4
canais de caacutelcio voltagem dependentes fazendo com que as vesiacuteculas que armazenam
os neurotransmissores sejam liberadas 20 21 O resultado da ativaccedilatildeo dos nAChRs em
neurocircnios poacutes-sinaacutepticos eacute a liberaccedilatildeo de diversos neurotransmissores ativando vaacuterias
aacutereas como jaacute mencionado
Figura 2 - Receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico O receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico funciona como um
canal iocircnico transmembracircnico Sua composiccedilatildeo eacute pentacircmera ou seja eacute formada por 5 subunidades que
podem se combinar de diferentes formas As subunidades satildeo classificadas de acordo com diferenccedilas nos
domiacutenios da sua estrutura proteiacuteca A acetilcolina e a nicotina satildeo agonistas desses receptores fazendo
com que os mesmos sejam abertos Assim ocorre a entrada de soacutedio despolarizando a membrana
gerando o potencial de accedilatildeo ACh= acetilcolina Nicot= Nicotina Na+= soacutedio K+= potaacutessio α =
subunidade alfa β= subunidade beta δ= subunidade delta γ= subunidade gama Fonte adaptado de Rang
amp Dale Farmacologia 5 ed Elsevier 2012
Haacute oscilaccedilatildeo dos picos de nicotina entre um cigarro e outro mas as quantidades
se acumulam entre 6 e 9 horas em um fumo regular saturando os nAChR causando
desensibilizaccedilatildeo adaptaccedilatildeo toleracircncia sintomas de abstinecircncia na falta do fumo e DN
30
A nicotina eacute rapidamente e extensivamente metabolizada pelo fiacutegado atraveacutes da
isoenzima CYP2A6 (e em menor grau pelas isoenzimas CYP2B6 e CYP2E1) agrave nicotina
-iacuteon iacuteminio e apoacutes pela enzima aldeiacutedo oxidase agrave cotinina O tempo de meia vida da
nicotina eacute de aproximadamente 2 horas e da cotinina 16 horas Posteriormente a
5
cotinina eacute metabolizada em trans-3-hidroxicotinina quase que exclusivamente pela
CYP2A6 (outros isocircmeros da hidroxicotina representam menos de 2 da dose) 31 32
(Figura 3) Esta eacute a maior via de metabolizaccedilatildeo da nicotina (70 - 80 do metabolismo
da nicotina em todo o corpo) 33 no entanto haacute vias menores como por exemplo a
glucoronidaccedilatildeo que pode ser a maior determinante no clearence da nicotina em
indiviacuteduos com menor atividade da CYP2A6 31
Figura 3 - Via primaacuteria do metabolismo da nicotina A nicotina eacute
metabolizada marjoritaramente pela isoenzima CYP2A6 em nicotina-
iacuteon imiacutenio e atraveacutes da enzima aldeiacutedo oxidase eacute convertida em
cotinina A cotinina eacute posteriomente metabolizada em trans-3-
hidroxicotinina novamente pela isoenzima CYP2A6 Fonte adaptado
de Llaquet et al 2010 34
12 Faacutermacos antitabagismo
Os medicamentos de primeira escolha aprovados pela Agecircncia Nacional de
Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) incluem tratamentos com base na terapia de reposiccedilatildeo
nicotiacutenica (TRN) como adesivo goma e pastilha e tambeacutem satildeo utilizados vareniclina e
bupropiona Estes uacuteltimos possuem maior eficaacutecia terapecircutica na cessaccedilatildeo tabaacutegica 35 36
6
121 Vareniclina
1211 Farmacodinacircmica
A vareniclina eacute o faacutermaco mais recentemente utilizado para a interrupccedilatildeo do
tabagismo este foi desenvolvido especificamente para atuar nos nAChRs A sua
farmacodinacircmica estaacute mais associada agrave atuaccedilatildeo como um agonista parcial nos nAChRs
compostos pelas subunidades α4β2 37 os quais satildeo importantes alvos de accedilatildeo da
nicotina pois satildeo necessaacuterios e suficientes para a recompensa toleracircncia e
sensibilizaccedilatildeo 25 38 39 (Figura 4)
Estudos mostraram que em relaccedilatildeo agrave nicotina a vareniclina possui 15 vezes
maior afinidade pelas subunidades α4β2 e ativa em torno de 50 a liberaccedilatildeo de
dopamina no sistema mesocorticoliacutembico 37 O faacutermaco atua tambeacutem em outros
nAChR como nos nAChRs (α3β4) age fracamente nos receptores contendo a
subunidade α6 e em nAChRs (α3β2) aleacutem de exercer atividade agonista total nos
receptores α7 40
Quanto agraves reaccedilotildees adversas no uso do faacutermaco a naacuteusea eacute a mais comum (cerca
de 10 a 45 dos indiviacuteduos tratados) a qual muitas vezes leva agrave natildeo aderecircncia ao
tratatamento 41-43
7
Figura 4 - Mecanismo de accedilatildeo da vareniclina A Na ausecircncia da vareniclina a nicotina se liga aos
nAChRs aumentando a ativaccedilatildeo nesses receptores Aleacutem disso haacute o estiacutemulo endoacutegeno (promovido
pela acetilcolina) B A vareniclina eacute um agonista parcial de nAChR (α4β2) ou seja tambeacutem estimula
os nAChRs mas em menor niacutevel do que a nicotina e ao mesmo tempo eacute antagonista na presenccedila de
nicotina fazendo com que ela natildeo consiga se ligar ao receptor Fonte do autor baseado nas
informaccedilotildees de Kassem et al 2012 37
1212 Farmacocineacutetica
A vareniclina eacute rapidamente absorvida pelo trato intestinal com absorccedilatildeo gt90
logo apoacutes a administraccedilatildeo oral As concentraccedilotildees plasmaacuteticas maacuteximas satildeo alcanccediladas
no periacuteodo entre 3 e 4 horas 44 e o estado de equiliacutebrio da sua concentraccedilatildeo ocorre
dentro de 4 dias 37 44-46 O faacutermaco possui baixa ligaccedilatildeo com proteiacutenas plasmaacuteticas
sendo que de acordo com ensaios in vitro a fraccedilatildeo de vareniclina (100 ngmL) livre foi
de 797 47 A sua biodisponibilidade natildeo eacute afetada pelo tempo de administraccedilatildeo ou
ingestatildeo de alimentos 37 45 46 Aleacutem disso a vareniclina possui ampla distribuiccedilatildeo nos
tecidos sendo que o volume meacutedio de distribuiccedilatildeo aparente eacute de 415 litros
apresentando um coeficiente de variaccedilatildeo (CV) de 50 48
Na circulaccedilatildeo humana a vareniclina se encontra em quantidade marjoritaacuteria satildeo
tambeacutem encontrados os metaboacutelitos conjugados vareniclina N-carbomoil glucoroniacutedeo
8
N-formilvareniclina e oxovareniclina O tempo de meia vida da vareniclina eacute em torno
de 24 horas independente da dose administrada
A eliminaccedilatildeo do faacutermaco e metaboacutelitos se daacute principalmente pela urina (99) 49
A eliminaccedilatildeo renal exibe cineacutetica linear e a sua excreccedilatildeo ocorre pela filtraccedilatildeo
glomerular na qual estaacute associada agrave secreccedilatildeo tubular realizada pelo transportador
catiocircnico orgacircnico OCT2 O clearence estimado da vareniclina eacute de 88 a 155 mLmin
apoacutes administraccedilatildeo de dose uacutenica e 92 a 143 mLmin apoacutes doses repetidas A
depuraccedilatildeo de vareniclina eacute reduzida na presenccedila de doenccedila renal Na urina cerca de
90 do produto eliminado eacute encontrado como vareniclina em sua forma inalterada e
menos de 10 eacute encontrado na forma de 2 metaboacutelitos a hidroxivareniclina e a
vareniclina-N-carbomoil glucoroniacutedeo 37 49-51
Nenhum dos metaboacutelitos da vareniclina eacute acreditado ser farmacologicamente
ativo Aleacutem disso esses metaboacutelitos estatildeo presentes em concentraccedilotildees muito baixas 37
46-49 A Figura 5 mostra os metaboacutelitos provenientes da vareniclina
A formaccedilatildeo dos metaboacutelitos da vareniclina natildeo eacute catalisada pelo complexo
enzimaacutetico CYP450 Ensaios realizados com microssoma hepaacutetico humano mostraram
que a formaccedilatildeo do conjugado vareniclina N-carbomilglucoroniacutedeo eacute provavelmente
catalisado pela enzima UGT2B7 37 49
Figura 5 ndash Metabolismo da vareniclina em humanos Fonte adaptado de Obach et al 2006 49
9
122 Bupropiona
1221 Farmacodinacircmica
A bupropiona eacute um antidepressivo no entanto tem sido utilizado como faacutermaco
antitabagismo devido o seu potencial em diminuir o desejo de fumar (o qual foi
percebido durante o tramento de iacutendiviacuteduos fumantes) Como mecanismo de accedilatildeo a
bupropiona atua como um inibidor relativamente se
letivo da recaptaccedilatildeo de norepinefrina e dopamina com pequeno efeito na
recaptaccedilatildeo de serotonina (Figura 6) aleacutem de ser um antagonista de nAChR natildeo
competitivo Essas propriedades minimizam os sintomas de retirada da nicotina
aumentando a probabilidade do indiviacuteduo se abster do fumo 52
Insocircnia e boca seca satildeo as reaccedilotildees adversas mais comumente relatadas ao uso da
bupropiona (30-40 e 10 dos pacientes respectivamente) 53
Figura 6 - Mecanismo de accedilatildeo da bupropiona A Na ausecircncia da bupropiona neurotransmissores
como a noradrenalina serotonina e a dopamina satildeo recaptados endogenamente pela bomba de
recaptaccedilatildeo B Na presenccedila da bupropiona a qual eacute inibidora da bomba de recaptaccedilatildeo desses
neurotransmissores haacute a estimulaccedilatildeo do sistema de recompensa mais especificamente atraveacutes do
aumento da concentraccedilatildeo de dopamina Dessa forma o sistema continua sendo estimulado mas em
menor grau que a nicotina e as chances de abstinecircncia ao tabaco satildeo aumentadas Fonte do autor
baseado nas informaccedilotildees de Slemmer et al 2000 52
10
1222 Farmacocineacutetica
Conforme ensaios em voluntaacuterios sadios os picos maacuteximos de concentraccedilatildeo
plasmaacutetica de bupropiona satildeo alcanccedilados aproximadamente 3 horas apoacutes a sua
administraccedilatildeo oral O volume de distribuiccedilatildeo aparente eacute de aproximadamente 2000L e
a ligaccedilatildeo com proteiacutenas plasmaacuteticas eacute de 84 para a bupropiona e de 77 para a
hidroxibupropiona (o seu principal metaboacutelito ativo) 54
A bupropiona eacute metabolizada primariamente em uma seacuterie de metaboacutelitos ativos
como a hidroxibupropiona a threohidrobupropiona e a eritrohidrobupropiona (Figura
7) A CYP2B6 eacute a principal enzima que converte a bupropiona em hidroxibupropiona
em humanos No entanto a formaccedilatildeo de threohidrobupropiona e a
eritrohidrobupropiona que ocorre atraveacutes de reaccedilatildeo redutiva natildeo eacute mediada pela
CYP2B6 55 56 A eritroidrobupropiona natildeo pode ser mensurada no plasma apoacutes a
administraccedilatildeo de uma uacutenica dose de bupropiona Os metaboacutelitos ativos satildeo
posteriormente metabolizados em inativos e estes satildeo excretados na urina 54
Inibidores da CYP2B6 como por exemplo a ticlodipina um agente
antiplaquetaacuterio derivado da tienopiridina interagem com a bupropiona diminuindo a sua
hidroxilaccedilatildeo 57 58
Apoacutes a administraccedilatildeo crocircnica de doses de 150 a 300 mgdia a bupropiona e seus
metaboacutelitos assumem cineacutetica linear A bupropiona possui meia vida de 20 horas
aproximadamente e apresenta clearence meacutedio aparente correspondente a cerca de
200Lh A eliminaccedilatildeo da bupropiona ocorre principalmente atraveacutes da urina (87) e das
fezes (10) e eacute excretada em apenas 05 de forma inalterada nos mostrando um
extenso metabolismo 54
11
Figura 7 - Metabolismo da bupropiona em seus principais metaboacutelitos ativos A bupropiona eacute
extensamente metabolizada em hidroxibupropiona pela isoenzima CYP2B6 Os demais metaboacutelitos ativos
aatildeo metabolizados por outras enzimas Fonte adaptado de Hesse et al 2000 55
13 Pesquisa de biomarcadores
A variabilidade interindividual em resposta a faacutermacos antitabagismo sugere que
os tratamentos podem ser mais efetivos em subgrupos de fumantes 59-64 No contexto de
medicina personalizada diversos pesquisadores tecircm buscado a identificaccedilatildeo de
preditores de resposta aos tratamentos de cessaccedilatildeo tabaacutegica os quais geralmente estatildeo
envolvidos em aspectos farmacocineacuteticos e farmacodinacircmicos ou via de atuaccedilatildeo do
faacutermaco como por exemplo os fatores geneacuteticos o perfil de expressatildeo gecircnica de
proteiacutenas e de metaboacutelitos 65-68
Aleacutem de refletir a efetividade do tratamento estes biomarcadores tambeacutem
poderiam indicar a toxicidade ou a ocorrecircncia de efeitos adversos A combinaccedilatildeo
desses fatores com outras variaacuteveis individuais pode ser utilizada para adequar as
estrateacutegias preventivas e terapecircuticas 65-68
12
131 Estudos farmacogeneacuteticos e de expressatildeo gecircnica para vareniclina e
bupropiona
Diversos polimorfismos geneacuteticos tecircm sido associados com resposta agrave
vareniclina e agrave bupropiona 41 65 67-71
King et al 65 mostraram a associaccedilatildeo de polimorfismos de nucleotiacutedeos uacutenicos
(SNPs - single nucletide polimorfisms) nos genes CHRNA4 CHRNA5 CHRNA7
CHRNB2 (codificadores das subunidades α4 α5 α7 e β2 dos nAChRs
respectivamente) com abstinecircncia contiacutenua em resposta agrave vareniclina O mesmo
trabalho tambeacutem encontrou associaccedilatildeo dos polimorfismos nos genes CHRNA3
CHRNA5 CHRNB4 CHRNG (codificam as subunidades α3 α5 β4 e γ dos nAChR
respectivamente) Aleacutem disso os autores demonstraram a associaccedilatildeo de polimorfismos
nos genes HTR3A e HTR3B (codificadores dos receptores serotonineacutergicos) com a
frequecircncia de recaiacuteda no tratamento antitabagismo
Swan et al 41 verificaram a associaccedilatildeo de polimorfismos no gene CHRNB2 com
naacuteusea severa em pacientes tratados com vareniclina
Nosso grupo de pesquisadores encontrou a associaccedilatildeo do polimorfismo
rs10443196 no gene CHRNA4 e do polimorfismo 785AgtG no gene CYP2B6
(codificador da principal isoenzima metabolizadora da bupropiona) com uma maior taxa
de sucesso no tratamento com vareniclina e bupropiona respectivamente 67 68
O gene CYP2B6 eacute um dos alvos mais importantes de estudos farmacogeneacuteticos
no tratamento com bupropiona Diversos polimorfismos neste gene satildeo preditores de
metabolizaccedilatildeo lenta ou raacutepida os quais foram associados com as diferenccedilas de
concentraccedilotildees do faacutermaco e de seu principal metaboacutelito ativo hidroxibupropiona em
amostras bioloacutegicas Essas concentraccedilotildees tambeacutem se associaram agrave variabilidade na
resposta ao tratamento com bupropiona 72-74
13
Polimorfismos podem implicar em diversos mecanismos moleculares como por
exemplo alteraccedilatildeo constituiccedilatildeo ou conformaccedilatildeo de proteiacutenas mudanccedilas poacutes-
traducionais e a regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica gerando variabilidade interindividual
nos niacuteveis de RNA transcrito o que poderiam explicar as diferenccedilas de resposta aos
faacutermacos antitabagismo 72
O polimorfismo CHRNA4 (rs2236196) assim como diversos polimorfismos
presentes no gene CYP2B6 os quais foram associados agrave resposta ao tratamento com
vareniclina e bupropiona respectivamente foram tambeacutem associados a maiores e
menores niacuteveis de expressatildeo gecircnica 72-75 Tambeacutem vale salientar que assim como a
expressatildeo gecircnica pode afetar a resposta ao tratamento a expressatildeo gecircnica tambeacutem pode
ser alterada em resposta aos faacutermacos 76 Neste sentido Smith et al 76 mostraram que a
vareniclina pode afetar a expressatildeo gecircnica da enzima DNA metiltransferase-1 (DNMT)
que mostrou estar envolvida em mecanismos epigeneacuteticos em neurocircnios corticais
GABaeacutergicos os quais estatildeo relacionados a processos cognitivos em indiviacuteduos
esquizofrecircnicos fumantes
O tratamento crocircnico com vareniclina modificou a expressatildeo dos nAChRs em
ceacuterebros de camundongos O upregulation dos nAChRs (α4β2) pelo uso crocircnico da
vareniclina foi similar ao promovido ao uso crocircnico da nicotina Similar dowregulation
foi visto para os nAChRs (α6β2) A vareniclina aumentou significantemente ambos
nAChRs (α3β4) e α7 enquanto a nicotina teve menor efeito nestes siacutetios 77
Em estudos com pacientes voluntaacuterios a obtenccedilatildeo de amostras do sistema
nervoso central eacute inviaacutevel Como alternativa a esse problema estudos tecircm proposto a
anaacutelise de expressatildeo gecircnica em sangue perifeacuterico 78-80 Embora natildeo seja o tecido alvo da
farmacodinacircmica dos medicamentos antitabagismo o sangue possui muitas
similaridades a niacutevel transcricional com muacuteltiplas regiotildees cerebrais 81
14
Hennings et al 82 mostraram diferenccedilas no perfil de expressatildeo gecircnica em ceacutelulas
mononucleares de sangue perifeacuterico (PBMCs) de pacientes respondedores e natildeo
respondedores a tratamentos com antidepressivos e muitos dos genes diferentemente
expressos satildeo codificadores de receptores tambeacutem presentes no SNC
Ota et al 83 mostraram que os genes GABRR2 (codificador de receptor
GABAeacutergico) e CHRNA3 (codificador da subunidade α3 de nAChR) foram
diferentemente expressos em sangue perifeacuterico em resposta ao tratamento com
risperidona em pacientes com esquizofrenia
Em outro estudo Kordi-Tamandani et al 84 mostraram que os niacuteveis de
expressatildeo gecircnica de SLC6A3 em leucoacutecitos diferiram entre indiviacuteduos dependentes de
opioacuteides e voluntaacuterios saacutedios Este gene eacute codificador de uma importante proteiacutena
recaptadora de dopamina em neurocircnios chamada DAT
Wongsriraksa et al 85 mostraram a expressatildeo das subunidades α4 α5 α7 β1 e
β2 em um estudo de caracterizaccedilatildeo de nAChRs em amostras de PBMC de humanos
atraveacutes de nicotina radioligante sugerindo conter as subunidades α4β2 α4β2α5 eou α7
Por fim diversos estudos tecircm mostrado que os nAChRs satildeo importantes para processos
imunoloacutegicos 86-91
Estudos tecircm evidenciado a expressatildeo de receptores dopamineacutergicos em
leucoacutecitos humanos Embora a dopamina natildeo ultrapasse a barreira hematoencefaacutelica as
diferenccedilas nos niacuteveis de dopamina do sistema nervoso central poderiam alterar a
expressatildeo desses receptores em leucoacutecitos ainda durante a sua formaccedilatildeo via inervaccedilatildeo
da coluna espinal doenccedilas como Parkinson Alzheimer e adiccedilatildeo agraves substacircncias
psicoativas poderiam influenciar na expressatildeo desses receptores em sangue perifeacuterico 92
15
132 Mensuraccedilatildeo de nicotina bupropiona vareniclina e seus metaboacutelitos em
amostras bioloacutegicas
A nicotina possui um baixo tempo de meia-vida e a isoenzima CYP2A6 eacute
predominante responsaacutevel pelo metabolismo da nicotina em cotinina e trans-3-
hidroxicotinina (seus principais metaboacutelitos) 93 94 Estes e a nicotina satildeo marcadores de
exposiccedilatildeo ao tabaco e indicativo de fumo 95
A taxa de metabolizaccedilatildeo da nicotina (NMR) obtida pela relaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de trans-3-hidroxicotininacotinina tem sido associada com DN com
desfecho e com escolha farmacoloacutegica de tratamento antitabagismo 95 96 Os valores
contiacutenuos e categoacutericos de NMR (metabolizadores lentos vs normais e raacutepidos) se
mostraram estaacuteveis em fumantes independente da carga tabaacutegica 32 97 98
A bupropiona eacute um faacutermaco extensamente metabolizado e a principal isoenzima
envolvida em seu metabolismo eacute a CYP2B6 a qual medeia quase que exclusivamente o
processo de hidroxilaccedilatildeo desse faacutermaco formando o metaboacutelito hidroxibupropiona 55
Diversos estudos tecircm associado as concentraccedilotildees de bupropiona e de hidroxibupropiona
em amostras de soro plasma e urina com a resposta ao faacutermaco 73 74
Zhu et al 73 em um estudo cliacutenico duplo-cego e placebo controlado os
indiviacuteduos foram tratados com bupropiona ou placebo por 6 meses Na terceira semana
de tratamento foram colhidas amostras de plasma para mensuraccedilatildeo de bupropiona e seu
principal metaboacutelito ativo a hidroxibupropiona As concentraccedilotildees mais elevadas de
hidroxibupropiona resultaram em melhores resultados de cessaccedilatildeo do tabagismo
Laib et al 74 apresentaram que as concentraccedilotildees de hidroxibupropiona em soro
foram correlacionadas com as diferentes respostas agrave bupropiona em pacientes com
depressatildeo analisadas atraveacutes de uma escala de impressatildeo clinica global
16
Quanto agrave vareniclina este eacute um faacutermaco pouco metabolizado sendo que 5 a
10 da dose pode ser encontrada na forma metaboacutelitos (soro plasma e urina) 49 Os
metaboacutelitos de vareniclina jaacute identificados em humanos em estudos preacutevios satildeo
hidroxivareniclina vareniclina N-carbomoilglucoroniacutedeo oxovareniclina N-
glicosilvareniclina e N-formilvareniclina 47 49 99 Pouco se conhece sobre as enzimas
que metabolizam a vareniclina Obach et al 49 mostrou o envolvimento da enzima
UG2B7 com o processo de glucoronidaccedilatildeo do faacutermaco Ainda natildeo haacute estudos que
associam os metaboacutelitos de vareniclina com resultados de desfecho de tratamento
17
2 JUSTIFICATIVA
Considerando a elevada prevalecircncia do tabagismo e a dificuldade dos indiviacuteduos
fumantes em se abster do tabaco estudos que apontem uma terapecircutica farmacoloacutegica
mais efetiva podem contribuir enormemente para o processo de cessaccedilatildeo tabaacutegica
Neste cenaacuterio a anaacutelise da expressatildeo de genes de interesse e a mensuraccedilatildeo de analitos
podem ser ferramentas uacuteteis na identificaccedilatildeo de marcadores e de subgrupos de resposta
ao tratamento antitabagismo
Escolhemos a realizaccedilatildeo da mensuraccedilatildeo de analitos nas amostras de soro dos
pacientes tratados com ambos os faacutermacos antitabagismo (vareniclina e bupropiona) e
especialmente para os pacientes tratados com vareniclina foram realizadas anaacutelises de
expressatildeo gecircnica de ceacutelulas mononucleares provenientes de amostras de sangue
perifeacuterico (do inglecircs Peripheral Blood Mononuclear Cell - PBMC) O ensaio
customizado para as anaacutelises da expressatildeo de 17 genes foi um grande investimento
financeiro nesta pesquisa e portanto o priorizamos para analisar as amostras dos
pacientes tratados com vareniclina jaacute que eacute o faacutermaco mais novo eficaz e custoso no
tratamento antitabagismo
As anaacutelises de expressatildeo gecircnica em amostras de PBMC satildeo de grande valia pois
seria importante encontrar em amostras de tatildeo faacutecil obtenccedilatildeo como amostras de sangue
um marcador de resposta que poderia ter correlaccedilatildeo com a expressatildeo gecircnica do sistema
nervoso central
Identificar um possiacutevel marcador preditivo de sucesso na utilizaccedilatildeo de um
determinado faacutermaco no iniacutecio da sua administraccedilatildeo foi uma das investigaccedilotildees deste
protocolo Os resultados desse estudo exploratoacuterio podem ser uacuteteis no entendimento do
comportamento de expressatildeo dos genes escolhidos (mais comumente expressos no
18
SNC) em amostras de sangue e na elaboraccedilatildeo de pesquisas mais amplas para a
identificaccedilatildeo de biomarcadores de resposta ao tratamento antitabagismo
19
3 OBJETIVOS
31 Analisar a possiacutevel associaccedilatildeo da expressatildeo de genes de interesse em amostras de
sangue perifeacuterico com a resposta ao tratamento com vareniclina
32 Analisar a possiacutevel associaccedilatildeo das concentraccedilotildees de faacutermacos antibagismo nicotina
e seus metaboacutelitos com a resposta ao tratamento com vareniclina e bupropiona
20
4 METODOLOGIA
41 Casuiacutestica
Foi realizado um estudo de coorte prospectivo no qual foram incluiacutedos 105
pacientes homens e mulheres fumantes provenientes do Programa de Assistecircncia ao
Fumante (PAF) do Instituto do Coraccedilatildeo do Hospital das Cliacutenicas da Faculdade de
Medicina da Universidade de Satildeo Paulo (InCor) com idade ge 18 anos IMC ge 185 e lt
30 kgm2 e que iniciariam o tratamento com vareniclina (n=74 para a mensuraccedilatildeo dos
analitos destes n=27 para as anaacutelises de expressatildeo gecircnica) ou com bupropiona (n=31
para a mensuraccedilatildeo dos analitos) (Figura 8)
A inclusatildeo dos pacientes ocorreu atraveacutes do protocolo de pesquisa ldquoEficaacutecia do
uso de marcadores geneacuteticos na escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismordquo o
qual foi aprovado no processo de submissatildeo ao Comitecirc de Eacutetica Institucional (CAAE
60133816000000068) - SDC 434116007 (Anexo 4) O presente estudo foi aprovado
como subprojeto do anterior atraveacutes do parecer nordm 2118913 (Anexo 1) Os pacientes
foram informados do estudo e consentiram a sua participaccedilatildeo ao assinar o termo de
consentimento livre e esclarecido (Apecircndice)
Foram excluiacutedos do estudo os pacientes que possuiacutessem desordens hepaacutetica
renal e gastrointestinal que comprometessem o metabolismo e eliminaccedilatildeo dos faacutermacos
os pacientes que faziam uso de medicamentos indutores ou inibidores das enzimas do
citocromo P450 nas uacuteltimas 6 semanas os pacientes etilistas e usuaacuterios de droga os
pacientes com doenccedilas psiquiaacutetricas instaacuteveis as mulheres em risco de gravidez e os
pacientes com contra-indicaccedilatildeo ao tratamento com bupropiona ou vareniclina
mencionados acima
21
Os pacientes foram acompanhados pela equipe do PAF e o tratamento
farmacoloacutegico foi conduzido por 12 semanas Foram considerados os seguintes
desfechos no tratamento ldquosucessordquo se o paciente parasse de fumar ateacute a 4ordf semana de
tratamento (T4) e ldquoresistenterdquo se o paciente natildeo conseguisse parar de fumar ateacute a 4ordf
semana de tratamento
22
Bupropiona
n=31
Visita T-1 Visita T0
(iniacutecio da medicaccedilatildeo)
Visita T2 Visita T4
Desfecho
Vareniclina
n=74
RNA Basal Vareniclina
n= 27
RNA RNA
Mensuraccedilatildeo de analitos vs Desfecho (T2)
vareniclina nicotina cotinina e hidroxicotinina
Mensuraccedilatildeo de analitos vs Desfecho (T2)
bupropiona hidroxibupropiona nicotina cotinina e hidroxicotinina
Soro
Soro
Figura 8 - Desenho do estudo O nuacutemero amostral total do estudo foi de 105 pacientes Foram incluiacutedos 74 pacientes tratados com vareniclina e 31 pacientes tratados com bupropiona Esses foram
submetidos agrave coleta de amostras de sangue no periacuteodo de 2 semanas (T2) apoacutes o iniacutecio da terapecircutica Apoacutes foi realizada a mensuraccedilatildeo de analitos e a anaacutelise de associaccedilatildeo com os desfechos de
tratamento Aleacutem disso os pacientes tratados com vareniclina tambeacutem foram submetidos agrave coleta de amostras para a obtenccedilatildeo de RNA em trecircs distintos periacuteodos de tempo antes de iniciar a
terapecircutica (T0) 2 semanas (T2) e 4 semanas apoacutes iniciar a terapecircutica farmacocoloacutegica (T4) Amostras de 14 pacientes que obtiveram sucesso no tratamento e de 13 que obtiveram resistecircncia (n=27)
foram analisadas quanto agrave expressatildeo de 17 genes candidatos (52 amostras ao todo 9 resistentes do tempo T0 7 resistentes do T2 8 resistente do T4 9 sucessos do T0 8 sucessos do T2 e 11 sucessos
do T4 vide toacutepico 42 Nuacutemero amostral) Apoacutes foram realizadas as anaacutelises de associaccedilatildeo entre os niacuteveis dos transcritos e os desfechos e tempos de tratamento Os pacientes foram acompanhados por
12 semanas durante o tratamento farmacoloacutegico no entanto o desfecho foi definido na 4 ordf semana (T4) pois apoacutes esse periacuteodo o tratamento seria reavaliado e poderia haver mudanccedila na medicaccedilatildeo T-
1= visita inicial T0= antes do iniacutecio da terapecircutica T2= 2 semanas apoacutes o iacutenicio do tratamento T4= 4 semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento T12= 12 semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento Desfecho na
visita T4 = ldquosucessordquo se o paciente parasse de fumar ateacute a 4ordf semana de tratamento (T4) e ldquoresistenterdquo se o paciente natildeo conseguisse parar de fumar ateacute a 4ordf semana de tratamento Fonte do autor
Visita T12
Final do tratamento farmacoloacutegico
RNA vs Desfecho (T0 T2 e T4)
14 sucessos e 13 resistentes
CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2
CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3 DRD4
HTR3A HTR3B COMT e SLC6A3
23
42 Fluxo de procedimentos adotados no atendimento aos pacientes
O tratamento farmacoloacutegico antitabagismo possui a duraccedilatildeo de 3 meses (12
semanas) No estudo de ldquoEficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticosrdquo foram coletados
dados cliacutenicos em 7 visitas T-1 (visita inicial) T0 (visita de iniacutecio do tratamento) T2
T4 T6 T8 e T12 (2 4 6 8 e 12 semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico)
Neste projeto foram utilizados os tempos de visita dos pacientes nas consultas
para a realizaccedilatildeo da coleta de amostras Dessa forma foi facilitado o comparecimento
desses pacientes ao procedimento Os pacientes precisavam estar comprometidos em
administrar os medicamentos todos os dias no horaacuterio combinado e terem
disponibilidade de tempo para as coletas as quais natildeo necessariamente coincidiram
com o horaacuterio das consultas pois as coletas foram realizadas no mesmo horaacuterio de
tomada do medicamento para que as anaacutelises de todos os pacientes pudessem ser
comparaacuteveis
Na visita T-1 foi aplicado o TCLE do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores
geneacuteticosrdquo bem como o questionaacuterio para coletar informaccedilotildees cliacutenicas Aleacutem disso os
pacientes foram avaliados quanto agrave DN atraveacutes do teste de Fagerstroumlm para DN (FTND)
100 e do escore de consumo situacional Issa (escore Issa) 101 (Anexos 2 e 3
respectivamente) O escore Issa eacute utilizado pelo PAF para a reclassificaccedilatildeo como
moderados ou altamente dependentes os pacientes que obteacutem o escore de FTND abaixo
de 5 mas que no entanto possuem niacutevel de DN consideraacutevel em relaccedilatildeo aos efeitos
psicoativos da nicotina A reclassificaccedilatildeo ocorre quando os pacientes obtecircm escore Issa
ge3 Apoacutes os pacientes foram randomizados em dois braccedilos do estudo tratamento com
vareniclina ou tratamento baseado na farmacogeneacutetica Os pacientes realizaram coleta
de sangue com o objetivo de obtenccedilatildeo do DNA para o estudo ldquoEficaacutecia do uso de
marcadores geneacuteticosrdquo
24
Apoacutes a genotipagem das amostras e escolha da medicaccedilatildeo dos pacientes
(vareniclina ou conforme geneacutetica) foi realizada ligaccedilatildeo telefocircnica para o paciente
informando o medicamento que iria tomar Nesta mesma ligaccedilatildeo o paciente tambeacutem foi
convidado a participar do presente estudo e todas as informaccedilotildees quanto agrave necessidade
de tomar o medicamento antitabagismo sempre no mesmo horaacuterio quanto aos dias das
coletas bem como as informaccedilotildees de preparaccedilatildeo para os procedimentos foram
transmitidas aos pacientes
Para os pacientes que seriam tratados com vareniclina ainda foi importante levar
em consideraccedilatildeo o horaacuterio que o paciente costumava tomar cafeacute da manhatilde para entatildeo
decidir o horaacuterio de administraccedilatildeo do faacutermaco pois o mesmo precisava ser
administrado apoacutes refeiccedilatildeo generosa com o intuito de diminuir o risco de naacuteusea
As coletas foram padronizadas para serem realizadas agraves manhatildes no mesmo
horaacuterio que o paciente tomaria a primeira dose do dia do medicamento antitabaacutegico O
horaacuterio de coleta entre os pacientes foi fixado entre 7 e 10 horas da manhatilde para evitar
variaccedilatildeo circadiana interpacientes No entanto entre as coletas do mesmo paciente o
horaacuterio de coleta e de administraccedilatildeo do medicamento foi sempre o mesmo com
variaccedilatildeo natildeo superior agrave 1 hora (esta variaccedilatildeo foi registrada)
Os pacientes foram orientados a realizar jejum de 10 horas (sendo liberada a
ingestatildeo de aacutegua e outros medicamentos ateacute 1 hora antes da coleta) e trazer o
medicamento antitabaacutegico para tomar apoacutes o procedimento A dose diurna dos
medicamentos antitabagismo natildeo foi administrada antes da coleta para evitar efeitos
agudos nas anaacutelises O periacuteodo de jejum foi realizado para que a amostra tivesse menor
quantidade de interferentes possiacutevel e tambeacutem para natildeo promover efeitos agudos dos
alimentos na expressatildeo gecircnica Um dia antes de cada coleta foi realizada ligaccedilatildeo
telefocircnica ou envio de mensagem para os pacientes com o objetivo de lembraacute-los do
25
procedimento das orientaccedilotildees de preparo e confirmar o uso e o cumprimento do horaacuterio
de administraccedilatildeo do medicamento antitabagismo (essa confirmaccedilatildeo da adesatildeo foi
realizada para as coletas nas visitas T2 e T4 quando os pacientes jaacute haviam iniciado o
tratamento farmacoloacutegico)
Na visita T0 para os pacientes que iniciariam o tratamento com vareniclina foi
aplicado o TCLE do presente projeto e colheu-se uma amostra de sangue para a
obtenccedilatildeo do RNA ainda antes de iniciarem o tratamento Foram fornecidas aos
pacientes as orientaccedilotildees de como tomar o medicamento e informaccedilotildees para a proacutexima
coleta Os pacientes foram orientados agrave tomarem o medicamento neste mesmo dia ou no
dia seguinte
Na visita T2 foram coletadas amostras de soro dos pacientes tratados com
bupropiona e amostras de soro e RNA dos pacientes tratados com vareniclina
Na visita T4 foram coletadas amostras de RNA dos pacientes tratados com
vareniclina
No Quadro 1 abaixo estatildeo resumidos os procedimentos orientaccedilotildees e coletas de
amostras
Quadro 1 - Procedimentos do protocolo em relaccedilatildeo aos pacientes
T-1 Aplicaccedilatildeo do TCLE do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores
geneacuteticosrdquo
Aplicaccedilatildeo de questionaacuterios
Coleta de DNA
1 dia antes de T0 Ligaccedilatildeo para informar o medicamento que o paciente iria tomar
Convite para participar do presente estudo
Determinar com o paciente qual era o melhor horaacuterio para
26
administraccedilatildeo do medicamento antibagismo (neste mesmo horaacuterio
que foram realizadas todas as coletas)
Orientaccedilotildees para a coleta em T0
T0 Aplicaccedilatildeo do TCLE do presente estudo
Coleta de amostra de RNA (para os pacientes que seriam tratados
com vareniclina)
Orientaccedilotildees para iniciar o tratamento no mesmo dia ou dia
seguinte
1 dia antes de T2 Orientaccedilotildees para coleta em T2
Confirmaccedilatildeo se o paciente estava tomando o medicamento e no
horaacuterio combinado
T2 Aplicaccedilatildeo do TCLE do presente estudo para os pacientes tratados
com bupropiona
Coleta de soro para os pacientes tratados com bupropiona e coleta
de RNA e soro dos pacientes tratados com vareniclina
1 dia antes de T4 Orientaccedilotildees para coleta em T2
Confirmaccedilatildeo se o paciente estava tomando o medicamento e no
horaacuterio combinado
T4 Coleta de RNA dos pacientes tratados com vareniclina
43 Coleta e armazenamento das amostras dos pacientes tratados com vareniclina e
bupropiona
Os pacientes tratados com vareniclina foram submetidos agrave coleta de sangue para
a obtenccedilatildeo de RNA em 3 periacuteodos de tempo T0 (ainda antes de iniciar o tratamento T2
27
e T4 Para isto foram utilizados os tubos PAXgene Blood RNA Tubes BRT (Qiagen
USA) para a obtenccedilatildeo de RNA Apoacutes a coleta os tubos PAXgene foram encubados em
bancada por 2 horas agrave temperatura ambiente para garantir a lise completa das ceacutelulas
sanguiacuteneas e apoacutes os tubos foram armazenados a -20degC ateacute a extraccedilatildeo do RNA das
amostras
No periacuteodo T2 tambeacutem foram coletadas amostras para a obtenccedilatildeo do soro dos
pacientes tratados com vareniclina e bupropiona Neste periacuteodo as concentraccedilotildees dos
metaboacutelitos dos faacutermacos jaacute se encontravam em estado de equiliacutebrio Para isto foram
utilizados tubos sem aditivo (Vacuette Greiner Bio-one) Os tubos foram mantidos a
temperatura ambiente ateacute a formaccedilatildeo de coaacutegulo Apoacutes os tubos foram centrifugados a
4degC a 3000 rpm por 10 min para se obter amostras de soro As amostras foram entatildeo
aliquotadas em 4 criotubos de soro e armazenadas em freezer a -80ordmC ateacute o momento
das anaacutelises
44 Nuacutemero amostral
Quanto ao nuacutemero amostral para o ensaio de expressatildeo gecircnica dos 74 pacientes
tratados com vareniclina foram escolhidas amostras de 27 pacientes (14 do grupo
sucesso e 13 do grupo resistente) baseado em estudos anteriores 83 102 que seguiram
corretamente o jejum que realizaram a tomada do medicamento nos horaacuterios
combinados e compareceram em todos e tempos de coleta Sendo ao todo 81 amostras
devido aos de 3 tempos de tratamento (T0 T2 e T4)
No entanto algumas amostras natildeo apresentaram bons resultados para a anaacutelise
de expressatildeo gecircnica e realizamos o ensaio de expressatildeo para 60 amostras de diversos
tempos Oito amostras natildeo apresentaram resultados de amplificaccedilatildeo e finalizamos com
52 amostras ao todo (9 resistentes do tempo T0 7 resistentes do T2 8 resistentes do T4
28
9 sucessos do T0 8 sucessos do T2 e 11 sucessos do T4) provenientes de 14 pacientes
do grupo sucesso e 13 do grupo resistente Esse tamanho amostral para cada grupo de
anaacutelise eacute comparaacutevel agrave estudos anteriores 102
Quanto ao nuacutemero amostral para a mensuraccedilatildeo dos analitos houve a inclusatildeo de
74 pacientes tratados com vareniclina e 31 tratados com bupropiona Nuacutemero amostral
semelhante foi utilizado no estudo de Laib et al 74 Das 105 amostras 3 amostras dos
pacientes tratados com vareniclina e 1 de paciente tratado com bupropiona apresentaram
concentraccedilotildees abaixo do limite de quantificaccedilatildeo (LQ) e estas foram excluiacutedas das
anaacutelises de concentraccedilatildeo dos analitos ficando com nuacutemero amostral final de 71 para
vareniclina e 30 para bupropiona
45 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica para amostras de pacientes tratados com
vareniclina
451 Concentraccedilatildeo purificaccedilatildeo e extraccedilatildeo de RNA
O processo de purificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo do RNA foi realizado atraveacutes do
PAXgene Blood RNA Kit (Qiagen USA) Antes de iniciar o procedimento a
temperatura dos tubos PAXgene Blood tubes (BRT) (Qiagen USA) os quais estavam
armazenados em freezer -20degC foi estabilizada mantendo os tubos em temperatura
ambiente em torno de 4 horas ou over night
Para o processo de purificaccedilatildeo do RNA primeiramente realizou-se a
homogeneizaccedilatildeo do sangue total contido no tubo PAXgene Blood tubes (BRT) e a
centrifugaccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos por 10 min em 3000 rcf havendo a formaccedilatildeo de um
pellet e o sobrenadante foi desprezado Apoacutes foi realizada a lavagem do pellet
adicionando-se 4 mL de aacutegua livre de RNase (RNFW) mistura foi submetida ao voacutertex
ateacute a dissoluccedilatildeo visiacutevel do pellet e o conteuacutedo foi centrifugado por 10 minutos a 3000
29
rcf sendo descartado o sobrenadante O pellet foi ressuspendido com 350 μL de tampatildeo
de ressuspensatildeo (BR1) atraveacutes de voacutertex ateacute a sua dissoluccedilatildeo e transferido para o tubo
de microcentrifugaccedilatildeo (15 mL MCT) Foram adicionados no tubo MCT 300 μL de
tampatildeo de ligaccedilatildeo (BR2) e 40 μL de proteinase K (PK) a mistura foi submetida ao
voacutertex durante 5 segundos e incubada durante 10 minutos a 55degC com agitaccedilatildeo de 1400
rpm provocando dessa forma a digestatildeo de proteiacutenas
Apoacutes o processo de incubaccedilatildeo foram realizados diversos processos de remoccedilatildeo
de impurezas em colunas de rotaccedilatildeo O lisado foi transferido para a coluna de rotaccedilatildeo
do homogeneizador PAXgene (PSC lilaacutes) a qual foi colocada em um tubo de
processamento (PT) de 2 mL e centrifugado durante 3 minutos agrave velocidade de 16100
rcf dessa forma foi realizada a homogeneizaccedilatildeo do lisado de ceacutelulas e remoccedilatildeo dos
detritos celulares residuais Em seguida o sobrenadante da fraccedilatildeo residual foi
transferido para o tubo de microcentrifugaccedilatildeo (15 mL MCT) novo (sem interferir no
pellet) e foram adicionados 350 μL de etanol (96-100 grau de pureza PA) a mistura
foi submetida ao voacutertex e centrifugada por breves instantes (1-2 segundos 500-1000 x g)
para remover as gotas presentes no interior da tampa do tubo
Foram transferidos 700 μL de amostra para a coluna de rotaccedilatildeo de RNA
PAXgene (PRC vermelho) esta foi colocada e um tubo de processamento (PT) de 2
mL no qual foi centrifugado durante 1 minuto a 12000 rcf Apoacutes a coluna de rotaccedilatildeo
foi colocada em um tubo PT novo (o tubo PT utilizado anteriormente foi descartado) O
restante da amostra foi colocado na mesma coluna de rotaccedilatildeo PRC e o processo de
centrifugaccedilatildeo foi repetido por mais 2 vezes sempre transferindo a coluna para um tubo
de processamento novo Antes da uacuteltima centrifugaccedilatildeo foram adicionados 350 μL de
tampatildeo de lavagem 1 (BR3) na coluna PRC
30
Em seguida foram adicionados 10 μL de soluccedilatildeo-matildee de DNase I (RNFD) a 70
μL de tampatildeo de digestatildeo de DNA (RDD) em um tubo de microcentrifugaccedilatildeo de 15
mL (MCT) O conteuacutedo foi misturado suavemente e centrifugado durante breves
instantes para colher o liacutequido residual dos lados do tubo Apoacutes 80 μL dessa mistura
foram transferidos diretamente para a membrana da coluna PRC e esta foi incubada agrave
temperatura ambiente (20-30degC) durante 15 minutos
Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foram adicionados 350 μL de tampatildeo de lavagem
1 (BR3) para a membrana da coluna e esta foi centrifugada durante 1 min a 12000 rcf
Apoacutes a coluna PRC foi colocada em um tubo (PT) novo e foram adicionados 500 μL de
tampatildeo de lavagem 2 (BR4) na membrana da coluna A centrifugaccedilatildeo foi repetida o
tubo PT foi descartado e a coluna PRC foi colocada em um novo tubo PT A lavagem
com 500 uL de BR4 e a centrifugaccedilatildeo foi repetida novamente (poreacutem o tempo de
centrifugaccedilatildeo foi de 3 minutos) Apoacutes foi realizada uma centrifugaccedilatildeo adicional em um
tubo PT novo durante 1 minuto a 12000 rcf (sem adiccedilatildeo de tampatildeo)
A coluna de rotaccedilatildeo (PRC) foi colocada em tubo de 15 mL (MCT) Foram
adicionados diretamente na membrana da coluna 80 μL de tampatildeo de eluiccedilatildeo (BR5) a
qual foi encubada agrave temperatura ambiente por 5 minutos e centrifugada por 1 minuto a
12000 rcf para eluir o RNA
As amostras foram quantificadas atraveacutes de leitura em espectrofotocircmetro no
comprimento de onda 260 nm (utilizando como branco o tampatildeo BR5) e foram
armazenadas a -20ordmC ateacute o momento das anaacutelises Para avaliar a qualidade do RNA
gerado foi realizada uma eletroforese em gel de agarose para a verificaccedilatildeo da
integridade do RNA ribossomal
31
452 Siacutentese de cDNA
O processo de siacutentese de cDNA foi realizado atraveacutes do RT2 First Strand Kit
(Qiagen USA) Os reagentes do kit foram descongelados e centrifugados brevemente
(10-15 segundos)
Primeiramente foi preparada uma mix para a degradaccedilatildeo do DNA genocircmico
composta por 2microL de tampatildeo GE 800 ng de RNA e quantidade variaacutevel de aacutegua livre
de RNase ateacute o volume final de 10 μL ou 8 μL de RNA (para amostras com
concentraccedilotildees abaixo de 100 ngμL) sem a aacutegua livre de RNase A mistura foi incubada
a 42ordmC por 5 minutos Apoacutes a incubaccedilatildeo a mistura foi colocada imediatamente em gelo
durante pelo menos 1 min
Apoacutes foi preparada uma mix para a realizaccedilatildeo da transcriccedilatildeo reversa esta foi
composta por 4 microL tampatildeo 5x (BC3) 1 microL de controle P2 (controle externo de RNA) 2
microL de mix de transcriptase reversa (RE3) e 3 microL de aacutegua livre de Rnase Foram
adicionados 10 μL da mix preparada em cada tubo contendo a mix de eliminaccedilatildeo de
DNA genocircmico A mistura foi homogeneizada delicadamente com a pipeta e incubada a
42 degC durante exatamente 15 min em seguida a reaccedilatildeo foi interrompida por incubaccedilatildeo
a 95 degC durante 5 min Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foram adicionados a cada reaccedilatildeo
91 μL de aacutegua livre de RNase e a mistura foi homogeneizada atraveacutes de pipeta diversas
vezes O produto final foi armazenado a -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo em cadeia da
polimerase (PCR) em tempo real
453 Ensaio de controle de qualidade das amostras para o ensaio de expressatildeo
gecircnica
Todas as amostras de cDNA foram analisadas quanto sua qualidade pelo ensaio
de controle de qualidade (disco QC Qiagen) em disco de 100 poccedilos (representaccedilatildeo do
32
disco nas Figuras 9 e 10) atraveacutes do PCR em tempo real com equipamento Rotor Gene
6000 (Corbett) Cada disco QC tem a capacidade de analisar 12 amostras sendo
necessaacuterios 5 discos para analisar 60 amostras
O disco QC eacute composto por primers especiacuteficos para a amplificaccedilatildeo de 2
Housekeeping genes ndash ACTB e HPRT1 (genes constitutivos que satildeo necessaacuterios para a
manutenccedilatildeo baacutesica da funccedilatildeo celular e satildeo expressos em todas as ceacutelulas de um
organismo em condiccedilotildees normais e fisiopatoloacutegicas) e 6 controles 1 controle de
transcriccedilatildeo reversa (RTC) 1 controle positivo de PCR (PPC) 1 controle de
contaminaccedilatildeo com DNA genocircmico (GDC) 1 controle de natildeo transcriccedilatildeo reversa
(NTR) 1 PPC (sem amostra) e 1 controle negativo NTC (mapa na Figura 10)
Foram preparadas 12 mixes para cada uma das amostras de cDNA Sendo 92 μL
de aacutegua livre de RNase e 08 μL de cDNA essas quantidades foram multiplicadas por 6
para se ter sobra e distribuir em 5 poccedilos cada mix de amostra (poccedilos que continham
pares de primers para 2 housekeeping genes e 3 controles) Foram distribuiacutedos 10 μL de
mix e 10 μL de RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR Master Mix (Qiagen USA) em cada
poccedilo (linhas A a E) Essa master mix conteacutem corante fluorescente intercalante de DNA
Apoacutes foram preparadas 12 mixes uma para cada amostra matildee de RNA (diluiacutedo
1100) Foram utilizados 963 μL de aacutegua livre de RNase e 072 μL de RNA (1100)
essas quantidades foram multiplicadas por 3 para se ter sobra Foram pipetados 1037
μL de mix de RNA e 963 μL de RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR Master Mix em
cada poccedilo da linha F para a anaacutelise do controle de transcriccedilatildeo reversa NTR
Apoacutes foram preparadas mixes sem as amostras para os 2 uacuteltimos controles PPC
e NTC compostas por 10 μL de aacutegua e 10 μL de RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR
Master Mix (multiplicados por 24) para as linhas G e H
33
O disco foi submetido agrave seguinte programaccedilatildeo 1 ciclo de 10 minutos a 95degC
(temperatura de ativaccedilatildeo da Taq polimerase) e 40 ciclos de 15 segundos a 95degC e 30
segundos a 60degC (para a amplificaccedilatildeo e realizaccedilatildeo da captura dos dados de
fluorescecircncia) Atraveacutes do software real-time cycler (Qiagen USA) foi ajustada a linha
de base (Threshold) do graacutefico de amplificaccedilatildeo logariacutetimica do cDNA para dessa
forma remover ruiacutedos na anaacutelise e verificar em qual ciclo de PCR que cada amostra
amplificou (cicle threshold ndash CT) (Figura 11) Os valores de CT foram planilhados e
analisados conforme os paracircmetros de qualidade (Quadro 2)
Figura 9 - Representaccedilatildeo do Rotor-Disc 100 Refere-se a um disco de material plaacutestico contendo 100
poccedilos Este veio de faacutebrica personalizado com primers para os ensaios QC ou RT2 profiler PCR array As
amostras e mixes satildeo pipetadas em cada poccedilo O disco eacute posteriormente colocado em um anel metaacutelico
proacuteprio para o encaixe no equipamento Rotor-Gene Cada poccedilo eacute nomeado com uma letra e um nuacutemero
iniciando no A1 ateacute o H12 Os quatro uacuteltimos poccedilos natildeo satildeo nomeados e natildeo conteacutem ensaio (no entanto
preenchemos com mix para equilibrar o peso do disco) Fonte do autor
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB
B HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1
C RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC
D PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC
E GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC
F NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR
G PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC
H NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC
Figura 10 - Mapa do disco QC (representaccedilatildeo planilhada) Do A1 ao B12 housekeeping genes para 12
amostras C1 ao H12 controles Cada grupo de cor representa a colocaccedilatildeo de uma mix Do A1 ao E1 mix de
A1
C1
E1
G1
34
cDNA da amostra 1 do A2 ao E2 mix de cDNA da amostra 2 (assim por diante ateacute A12 e E12) Linha F controle
com RNA diluiacutedo (1100) Linhas G e H controles com aacutegua livre de RNase Fonte do autor
Figura 11 - Exemplo de ajuste de Threshold A linha de base (Threshold) eacute ajustada na fase linear do ciclo
de amplificaccedilatildeo Dessa forma eacute possiacutevel remover os ruiacutedos e se obter o ciclo em que cada amostra foi
amplificada na PCR (CT) Fonte do autor imagem do equipamento Rotor Genereg
Quadro 2 - Paracircmetros de qualidade do ensaio QC
Controles Teste Passa no teste Falha no teste
Controle de transcriccedilatildeo reversa CT RTC (linha B) ndash CTPPC (linha G) lt5 gt5
Controle positivo de PCR CT PPC (linha G)
CT PPC (linha D) - CT PPC (linha G)
14 plusmn 2
lt3
gt16
gt3
Controle de contaminaccedilatildeo de DNA genocircmico CT GDC (linha E) gt33 lt33
Controle de natildeo transcriccedilatildeo reversa CT NTR (linha F) ge 33 ou NA lt33
Controle negativo CT NTC (linha H) ge 33 ou NA lt33
10-02
10-04
10-06
10-08
10-10
10-12
10-14
10-16
10-18
10-20
10-22
10-24
10-26
10-28
5 10 15 20 25 30 35 40
Ciclos
Flu
ore
scecircn
cia
No
rmal
izad
a
Fase Linear
35
De 60 amostras analisadas 52 passaram no teste quanto aos criteacuterios de
qualidade e prosseguiram para a anaacutelise de expressatildeo gecircnica do painel de genes
escolhidos
454 Ensaio de expressatildeo gecircnica
O protocolo de expressatildeo foi realizado por PCR em tempo real atraveacutes do
equipamento Rotor Gene 6000 (Corbett) com ensaio customizado RTsup2 Profiler PCR
Array em disco com capacidade de 100 poccedilos (Rotor-Disc 100 Qiagen USA) Nos 100
poccedilos de cada disco estavam distribuiacutedos primers especiacuteficos para o ensaio de expressatildeo
de 17 genes (Figuras 9 e 12 e Quadro 3) (17 pares de primers para cada gene repetidos 4
vezes na placa pois foi possiacutevel a anaacutelise de 4 amostras de cDNA por disco) 4 pares de
primers para os Housekeeping genes B2M GAPDH HPRT1 e ACTB (Quadro 4) e 3
controles 1 controle de contaminaccedilatildeo com DNA genocircmico (HGDC) 1 controle de
transcriccedilatildeo reversa (RTC) e 1 controle positivo de PCR (PPC) Os 4 Housekeeping
genes e os 3 controles tambeacutem satildeo repetidos 4 vezes no disco (Figura 5) Para as
reaccedilotildees foi utilizada a RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR Master Mix (Qiagen USA)
Primeiramente foi preparada 4 mixes (uma para cada amostra de cDNA) para um
disco de 100 poccedilos composta por 275 μL de 2X RT2 SYBR Green ROX FAST
Mastermix 2262 microL de aacutegua livre de RNase e 488 microL de amostra de cDNA cada Em
cada um dos poccedilos do disco foram adicionados 20 μL da mix preparada (utilizando
mixes de diferentes amostras a cada 24 poccedilos) Apoacutes deste processo o disco foi selado
com o Rotor-Disc Heat Sealer (Qiagen USA) e colocado no equipamento Rotor-Gene
6000 (Corbett) O real-time foi programado para ciclagem de PCR nas seguintes
condiccedilotildees 1 ciclo a 95deg C com duraccedilatildeo de 10 minutos 40 ciclos a 95degC por 15
segundos e 60degC por 30 segundos
36
Quadro 3 - Genes escolhidos para o ensaio de expressatildeo
CHRNA3 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α3
CHRNA4 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α4
CHRNA5 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α5
CHRNA6 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α6
CHRNA7 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α7
CHRNB2 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade β2
CHRNB3 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade β3
CHRNB4 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade β4
CHRNG Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade γ
DRD1 Codifica o receptor de dopamina tipo 1
DRD2 Codifica o receptor de dopamina tipo 2
DRD3 Codifica o receptor de dopamina tipo 3
DRD4 Codifica o receptor de dopamina tipo 4
HTR3A Codifica o receptor 3A de serotonina
HTR3B Codifica o receptor 3B de serotonina
COMT Codifica a enzima catecol-O-metiltransferase (metaboliza dopamina)
SLC6A3 Codifica a proteiacutena DAT que promove a recaptaccedilatildeo de dopamina DAT
Quadro 4 - Housekeeping genes
B2M Codifica a microbulina subunidade β2
GAPDH Codifica a enzima gliceraldeiacutedo ndash 3 fosfato desidrogenase
HPRT1 Codifica a enzima hipoxantina fosforribosiltransferase 1
ACTB Codifica a β actina
37
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
B DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
C CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
D DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
E CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
F DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
G CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
H DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
Figura 12 - Mapa do disco do ensaio RT2 profiler PCR array (representaccedilatildeo planilhada) O disco conteacutem 100 poccedilos no
entanto apenas 96 poccedilos contecircm ensaios sendo que 4 poccedilos ficam vazios A1 ao B5 = genes escolhidos para anaacutelise de
expressatildeo Do B6 ao B9= Housekeeping genes Do B10 ao B12= controles C1 ao D12 E1 ao F12 e G1 ao H12= repeticcedilatildeo dos
ensaios permitindo a anaacutelise completa de 4 amostra Cada cor diferente (a cada 2 linhas) representam a anaacutelise de uma
amostra Fonte do autor
455 Anaacutelise dos dados de expressatildeo gecircnica
Para a anaacutelise de expressatildeo gecircnica foi utilizado o meacutetodo de 2-∆∆CT 103 Apoacutes o
teacutermino da corrida do ensaio de expressatildeo gecircnica atraveacutes do software real-time cycler
(Qiagen USA) foi ajustada a linha de base (threshold) no graacutefico de amplificaccedilatildeo em
escala logariacutetmica (Figura 11) Todos os discos (total de 13) foram analisados com o
mesmo valor de threshold (010869) para que os valores de CT de todas as amostras
fossem comparaacuteveis
Os dados de CT tambeacutem foram inseridos no programa SPSS para as anaacutelises
estatiacutesticas Os valores de CT foram normalizados atraveacutes da expressatildeo dos
housekeeping genes utilizando a seguinte foacutermula ∆CT= (CTamostra ndash a meacutedia de
CThousekeeping genes) Os valores de mediana de 2-∆CT (em escala logariacutetmica) de cada grupo
foram utilizados para os testes de hipoacutetese Apoacutes foram obtidos os valores de ∆∆CT
(mediana de ∆CTgrupo teste ndash mediana de ∆CT grupo referecircncia) e o fold change (aumento ou
diminuiccedilatildeo da expressatildeo dos genes em relaccedilatildeo ao grupo referecircncia) foi calculado
atraveacutes da foacutermula 2-∆∆CT
38
46 Mensuraccedilatildeo de bupropiona vareniclina e de seus metaboacutelitos por HPLC-
MSMS
461 Materiais equipamentos e condiccedilotildees adotadas para a mensuraccedilatildeo dos
analitos apoacutes validaccedilatildeo do meacutetodo
Padrotildees analiacuteticos e padrotildees internos (PIs) deuterados bupropiona
hidroxibupropiona vareniclina (Santa Cruzreg) vareniclina d4 (TRCreg) nicotina
(ChemCruzreg) cotinina (Sigma-Aldrichreg) hidroxicotinina (Torontoreg) e
hidroxibupropiona d6 nicotina d4 cotinina d3 hidroxicotinina d3 (Cerilliantreg)
Solventes orgacircnicos Metanol acetonitrila (JT Baker) e sais acetato de amocircnio
fosfato de soacutedio (Vetecreg) fosfato de soacutedio monobaacutesico (Proquimiosreg) fosfato
de amocircnio (Reagenreg) formiato de amocircnio (Sigma-Aldrichreg)
Equipamentos e acessoacuterios
o HPLC Shimadzureg (Kyoto Japatildeo) equipado com uma vaacutelvula comutadora
de 6 vias automaacutetica
o Auto-amostrador Shimadzureg (Kyoto Japatildeo)
o Vaacutelvula comutadora de 6 vias 11R-0016H (Valcoreg Houston TX USA)
o Espectrocircmetro de massas LCMS-8030 Shimadzureg (Kyoto Japatildeo)
o Analisador de massa triplo quadrupolo (Shimadzureg Kyoto Japatildeo)
o Coluna analiacutetica ACEreg C18 (100 mm x 21 mm x 3 microm comprimento
diacircmetro interno e tamanho de partiacutecula)
o Preacute-coluna ACEreg C18 (21mm x 3 microm diacircmetro tamanho de partiacutecula)
39
o Coluna de extraccedilatildeo coluna contendo aproximadamente 70 mg do novo
RAM
Software
o LabSolutionsreg para anaacutelise dos dados e programaccedilatildeo do meacutetodo no
HPLC-MSMS
Condiccedilotildees espectrometricas e cromatograacuteficas
o Temperatura da forno da coluna 40ordmC
o Temperatura da linha de dessolvataccedilatildeo 250ordmC
o Temperatura do bloco de aquecimento 400ordmC
o Fluxo do gaacutes de nebulizaccedilatildeo 20 ml min-1
o Fluxo de gaacutes para secagem 150 ml min-1
o Energias de colisatildeo precursores e fragmentos dos analitos (Tabela 1)
o Fase moacutevel de carregamento (liberada pela bomba A) Aacutegua ultra pura
em um fluxo de 04 mL min-1
o Fase moacutevel de eluiccedilatildeoseparaccedilatildeoionizaccedilatildeo (liberada pela bomba C)
metanol tampatildeo formiato de amocircnio 001 mol L-1 pH=42 (9010 vv)
em um fluxo de 04 mL min-1
o Fase moacutevel de limpeza (liberada pela bomba B) acetonitrila aacutegua ultra
pura isopropanol (751510 vvv) em um fluxo de 10 mL min -1
o Sistema de anaacutelise ULPC-MSMS no modo columns switching em
configuraccedilatildeo backflush modo de ionizaccedilatildeo positiva por electrospray
(ESI+)
40
Tempos
o Fase de carregamento e condionamento do sistema (vaacutelvula na posiccedilatildeo
1) 0 - 30 min
o Fase de eluiccedilatildeo (vaacutelvula na posiccedilatildeo 2) 03 min
o Fase de limpeza separaccedilatildeo e anaacutelise por MS (vaacutelvula na posiccedilatildeo 1) 67
min
o Recondiocionamento do sistema (vaacutelvula na posiccedilatildeo 1) 50 min
o Tempo total incluindo todos os processos 15 min
o
Tabela 1 - Analitos precursores fragmentos e energias de colisatildeo otimizados
Analitos Precursor (mz) Fragmentos (mz) Energia de colisatildeo
(KV)
Vareniclina 212 169 -23
183 -24
141 -43
Bupropiona 240 131 -28
139 -26
103 -39
Hidroxibupropiona 256 139 -29
131 -29
167 -29
Nicotina 163 117 -28
130 -22
77 -44
Cotinina 177 80 -24
98 -21
70 -34
Hidroxicotinina 193 80 -30
134 -19
118 -21
Fragmentos quantificados
41
462 Visatildeo geral do desenvolvimento da coluna e padronizaccedilatildeo da anaacutelise
Todos os padrotildees para as anaacutelises dos analitos foram adquiridos e armazenados
conforme recomendaccedilatildeo do fabricante ateacute o momento da padronizaccedilatildeo das anaacutelises As
anaacutelises foram realizadas atraveacutes da colaboraccedilatildeo com o Prof Dr Eduardo Costa de
Figueiredo Dr Henrique Dipe Faria e Prof Dra Isarita Martins do Laboratoacuterio de
Anaacutelises de Toxicantes e Faacutermacos ndash LATF da Faculdade de Ciecircncias Farmacecircuticas da
Universidade Federal de Alfenas (Unifal MG) A escolha de cada analito foi
determinada atraveacutes de sua importacircncia cliacutenica e tambeacutem devido agrave disponibilidade dos
padrotildees dos analitos no mercado Os analitos mensurados para as amostras provenientes
dos pacientes tratados com os faacutermacos antitabagismo foram bupropiona
hidroxibupropiona vareniclina nicotina cotinina e hidroxicotinina (os trecircs uacuteltimos satildeo
proveninentes do fumo) Foi realizado um levantamento das propriedades fiacutesico-
quiacutemicas dos metaboacutelitos conforme Quadro 5
Para a remoccedilatildeo das macromoleacuteculas (como proteiacutenas) presentes na matriz de
soro foi desenvolvida uma coluna extratora de acesso restrito a partir de nanotubos
hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados com ligaccedilotildees hidrofiacutelicas (novo RAM) O
material foi desenvolvido e caracterizado antes mesmo da padronizaccedilatildeo das condiccedilotildees
de anaacutelise nos equipamentos
Foram obtidas as condiccedilotildees espectomeacutetricas (modo de ionizaccedilatildeo e as condiccedilotildees
de sua fonte temperatura do bloco de calor fluxo de gaacutes nebulizador e fluxo do gaacutes
secante) e cromatograacuteficas (tempo de retenccedilatildeo e separaccedilatildeo e aacutereas obtidas dos picos de
cada analito) Apoacutes as condiccedilotildees foram otimizadas em sistema de cromatografia liacutequida
de alta eficiecircncia multidimensional seguida por espectrometria de massa (HPLC-
MSMS) O sistema multimensional constituiacutedo por vaacutelvulas comutadoras permite a
anaacutelise online e automatizada com configuraccedilatildeo via software As vaacutelvulas permitem
42
diferentes posiccedilotildees promovendo a ocorrecircncia de eventos distintos no sistema como a
concentraccedilatildeo dos analitos e remoccedilatildeo de macromoleacuteculas atraveacutes da coluna extratora
(posiccedilatildeo 1) a eluiccedilatildeo dos analitos da coluna extratora para a coluna analiacutetica (posiccedilatildeo 2)
e novamente na posiccedilatildeo 1 ocorre a eluiccedilatildeo dos analitos da coluna analiacutetica para o
espectrocircmetro de massas a limpeza da coluna extratora e o recondionamento do
sistema
Quadro 5 - Propriedades fiacutesico-quiacutemicas dos analitos
Bupropiona
Peso molecular 27620 gmol
Ponto de fusatildeo 243-246deg C
Solubilidade em aacutegua 00693 mgmL
pKa (aacutecido forte) 1829
pKa (mais forte baacutesico) 822
Aacuterea da superfiacutecie polar 291 Aring2
Log P 36
Hidroxibupropiona
Peso molecular 25574 gmol
Ponto de fusatildeo 121-123degC
Solubilidade em aacutegua 02 mgmL
pKa (aacutecido forte) 1479
pKa (mais forte baacutesico) 765
Aacuterea da superfiacutecie polar 4933 Aring2
Log P 222
Vareniclina
Peso molecular 21127 gmol
Pressatildeo de vapor 25degC
Solubilidade em aacutegua 877 x 10-2 gL
pKa1 182 pKa2 = 973
Aacuterea da superfiacutecie polar 378 Aring2
Log P 103
43
Nicotina
Peso molecular 16223 gmol
Pressatildeo de vapor 618 degC
Solubilidade em aacutegua 100 mM
pKa 85 pKb1 616 a 15degC e pKb2 1096
Aacuterea da superfiacutecie polar 378 Aring2
Log P 117
Cotinina
Peso molecular 176215 gmol
Solubilidade em aacutegua 10 x10-6 mgL a 25degC
Aacuterea da superfiacutecie polar 332 Åsup2
Log P 007
Hidroxicotinina
Peso molecular 192214 gmol
Aacuterea da superfiacutecie polar 53 Å2
ACDLog P -148
Fonte Banco de dados Pubchem e ChemSpider Obs Algumas informaccedilotildees referentes agraves
propriedades fiacutesico-quiacutemicas dos analitos ainda natildeo estatildeo disponiacuteveis na literatura pKa= valor
negativo do logaritmo da constante de dissociaccedilatildeo de um aacutecido pKb= valor negativo do logaritmo
da constante de dissociaccedilatildeo de uma base LogP= coeficiente de particcedilatildeo
463 Desenvolvimento da coluna RAM para a purificaccedilatildeo da amostra
As amostras de soro e plasma satildeo matrizes ricas em moleacuteculas que interferem na
mensuraccedilatildeo dos analitos como lipiacutedios e principalmente proteiacutenas Estas podem
obstruir colunas analiacuteticas e diminuir a concentraccedilatildeo dos analitos jaacute que muitos destes
estatildeo ligados a essas proteiacutenas Devido a esse fato geralmente eacute realizada uma
preparaccedilatildeo das amostras antes de sua mensuraccedilatildeo Essa preparaccedilatildeo envolve processos
como a extraccedilatildeo com o uso de solventes precipitaccedilatildeo entre outros os quais geram
custo de materiais aumento do tempo de trabalho e de erros 104 105 51 106 Dessa forma
44
diversos estudos vecircm tentando desenvolver meacutetodos que natildeo exijam tanta manipulaccedilatildeo
das amostras Os materiais de acesso restrito (RAMs) estatildeo sendo utilizados para a
menor preparaccedilatildeo da amostra e sua injeccedilatildeo direta Dentre os RAMs estatildeo os nanotubos
de carbono (CNTs) modificados 107-109 Nesta colaboraccedilatildeo foi desenvolvida a coluna
extratora composta por nanotubos hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados com a
adiccedilatildeo de grupos hidrofiacutelicos Esse material entrou com pedido de patente na Agecircncia
de Inovaccedilatildeo e Empreendedorismo da Universidade Federal de Alfenas-MG atraveacutes do
Processo 230870001282019-84 e portanto a sua composiccedilatildeo e os resultados de
alguns testes da sua caracterizaccedilatildeo seratildeo mantidos em sigilo (vide declaraccedilatildeo Anexo
5)
Diferentes RAMs foram sintetizados a partir de CNTs para que fosse obtido o
melhor desempenho na remoccedilatildeo de macromoleacuteculas e retenccedilatildeo dos analitos da amostra
Os CNTs utilizados foram compostos por paredes muacuteltiplas pois apresentam uma
elevada aacuterea superficial e consequentemente uma maior capacidade de adsorccedilatildeo Os
CNTs foram adquiridos comercialmente e inicialmente foram funcionalizados a partir
de reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo aacutecida com aacutecido niacutetrico como desenvolvido por Barbosa et al 109
Os CNTs oxidados foram utilizados em etapas de siacutentese posteriores
adicionando grupos quiacutemicos hidrofiacutelicos que fossem capazes de realizar a exclusatildeo de
proteiacutenas e permitir a adsorccedilatildeo dos analitos As reaccedilotildees de siacutentese posteriores foram
semelhantes as promovidas para a realizaccedilatildeo de revestimento externo de poliacutemeros
poliacutemeros biomimeacuteticos nanomagneacuteticos com e sem acesso restrito 107 110-112 poreacutem
foram utilizadas estrateacutegias e proporccedilotildees de reagentes distintas na tentativa de obter o
RAM mais eficiente Aleacutem disso tambeacutem foi priorizada a siacutentese mais simples e
reprodutiacutevel bem como o material que apresentar maior vida uacutetil Os diferentes
materiais sintetizados foram testados em relaccedilatildeo agrave exclusatildeo de proteiacutenas e adsorccedilatildeo dos
45
analitos e tambeacutem foram realizados testes de caracterizaccedilatildeo para determinar suas
propriedades fiacutesico-quiacutemicas e confirmar a estrutura originada
A anaacutelise termogravimeacutetrica foi realizada com a finalidade de determinar a
variaccedilatildeo de massa (ganho ou perda) do RAM em funccedilatildeo de emprego de temperatura
programada proporcionando informaccedilotildees importantes a respeito da estabilidade do
material e de sua composiccedilatildeo Outras teacutecnicas tambeacutem foram utilizadas com o objetivo
de obter dados relacionados agrave estrutura e composiccedilatildeo do novo RAM como o
infravermelho e anaacutelise elementar Anaacutelises de microscopias eletrocircnicas de varredura e
de transmissatildeo tambeacutem foram realizadas para a determinaccedilatildeo da composiccedilatildeo da
superfiacutecie externa e arranjo estrutural do material com as modificaccedilotildees realizadas
Apoacutes o teacutermino do preparo do novo RAM eles foram colocados dentro de uma
coluna (aproximadamente 70 mg) conforme (Figura 13) A coluna foi posteriormente
empregada no preparo de amostras online no sistema cromatograacutefico
Figura 13 ndash Representaccedilatildeo da composiccedilatildeo da coluna extratora (Novo RAM) O novo RAM formado
a partir de nanotubos hiacutedridos de carbono e siacutelica dotado de muacuteltiplas camadas e modificados com grupos
hidrofiacutelicos promovem a retenccedilatildeo de analitos e exclusatildeo de macromoleacuteculas como proteiacutenas O RAM foi
posteriormente empacotado em coluna para a utilizaccedilatildeo em sistema cromatograacutefico Fonte adaptado do
colaborador Dr Henrique Dipe de Faria Unifal-MG
46
464 Caracterizaccedilatildeo do novo RAM
4641 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA
Na ausecircncia da coluna extratora foi preparada primeiramente uma soluccedilatildeo
aquosa de albumina de soro bovino (BSA) em uma concentraccedilatildeo de 44 mgmL-1
(semelhante agrave concentraccedilatildeo de proteiacutenas presentes no plasma humano) Foram injetados
10 microl desta soluccedilatildeo em triplicata diretamente em sistema cromatograacutefico com detector
UV ajustado a 255 nm utilizando como fase moacutevel o tampatildeo formiato de amocircnio 10
mM pH=42 em um fluxo de 04 mL min-1 O sinal detectado foi de 100 BSA
Posteriormente a coluna preenchida com 70 mg do novo RAM foi inserida no sistema
cromatograacutefico entre o injetor e o detector A soluccedilatildeo de BSA foi analisada em triplicata
novamente no entanto com a presenccedila da coluna extratora desenvolvida (novo RAM)
A aacuterea do sinal obtido nesta segunda anaacutelise dividida pela aacuterea do sinal de 100 BSA
obtida na primeira anaacutelise foi correspondente agrave porcentagem de BSA excluiacuteda pela
coluna
4642 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas no soro
Para analisar a exclusatildeo total de macromoleacuteculas (como lipiacutedios proteiacutenas e
sacariacutedeos) agora nas amostras de soro foi utilizado procedimento semelhante Na
ausecircncia da coluna extratora injetou-se no sistema cromatograacutefico em triplicata 100 μL
de amostra de soro humano branco foram testados pools de soro puros e diluiacutedos 14 A
aacutegua ultra pura foi utilizada como fase moacutevel em um fluxo de 04 mL min-1 e o sinal
obtido foi relacionado a 100 dos interferentes Apoacutes a coluna extratora (o novo
RAM) foi adionado ao sistema e a amostra foi inserida novamente A divisatildeo entre a
aacuterea do pico na primeira anaacutelise pelo pico da segunda anaacutelise refere-se agrave porcentagem
de exclusatildeo de interferentes As condiccedilotildees cromatograacuteficas foram as mesmas do teste
com BSA
47
4643 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA em diferentes pHs
O teste de exclusatildeo de proteiacutenas tambeacutem foi realizado nas mesmas condiccedilotildees
cromatograacuteficas que a anaacutelise anterior utilizando soluccedilatildeo de BSA em triplicata no
entanto diferentes soluccedilotildees como fase moacutevel (variaccedilatildeo de pH de 22 a 70) foram
testadas pois o pH pode influenciar na ionizaccedilatildeo dos analitos dos grupos funcionais
presentes na superfiacutecie do novo RAM e na interaccedilatildeo entre eles o que pode resultar em
diferentes taxas de exclusatildeo de proteiacutenas Estas soluccedilotildees foram os tampotildees fosfato de
soacutedio 10 mM (pHs 22 e 26) formiato de amocircnio 10 mM (pHs 30 a 46) acetato de
amocircnio 5 mM (pHs 52 a 66) e fosfato de soacutedio 5mM (pH 70)
465 Paracircmetros espectromeacutetricos
Com a finalidade de se obter um meacutetodo de anaacutelise capaz de detectar e
quantificar menores niacuteveis possiacuteveis de concentraccedilatildeo dos analitos foram otimizados os
paracircmetros espectromeacutetricos fluxos dos gases secantes e nebulizador modo de
ionizaccedilatildeo temperaturas da linha de dessolvataccedilatildeo e de bloco de aquecimento e as
energias de colisotildees utilizadas para fragmentar os iacuteons precursores para originar os
fragmentos iocircnicos de cada analito Foram realizadas soluccedilotildees padrotildees de cada analito e
dos padrotildees internos (PIs) deuterados (vareniclina d-4 hidroxibupropiona d6 nicotina
d4 cotinina d3 e hidroxicotinina d3) na concentraccedilatildeo de 1 mg L-1 em metanol Cada
uma destas soluccedilotildees foram injetadas separadamente no sistema em um volume de 5 microL
A fase moacutevel utilizada foi constituiacuteda por metanol tampatildeo formiato de amocircnio 001
mol L-1 pH=42 (9010 vv) em um fluxo de 04 mL min-1 e o modo de ionizaccedilatildeo
positiva (ESI+) foi utilizado pois demonstrou ser mais eficiente para ionizar as
moleacuteculas analisadas Essa otimizaccedilatildeo foi obtida utilizando o software Labsolutionsreg
48
466 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatograacutefico multidimensional
Para esta otimizaccedilatildeo foi utilizado um HPLC de dotado de vaacutelvula comutadora
automaacutetica de 6 vias e um injetor automaacutetico de amostras o que permitiu a
automatizaccedilatildeo do processo Ainda o sistema cromatograacutefico foi acoplado a um
espectrocircmetro de massas em tandem (HPLC-MSMS) dotado de um analisador de
massa triplo quadrupolo o qual possui alta sensibilidade e seletividade Incorporou-se
neste sistema uma coluna extratora preenchida com o RAM desenvolvido
O forno foi mantido a 40ordmC e o detector UV operando em um comprimento de
onda de 255 nm A fim de padronizar a anaacutelise foram testadas colunas anaacuteliticas de
diversos tamanhos e composiccedilotildees e variadas proporccedilotildees de fases de moacuteveis
Atraveacutes da anaacutelise do cromatograma foram avaliados o tempo de retenccedilatildeo e
separaccedilatildeo e as aacutereas obtidas dos picos de cada analito O sistema foi utilizado no modo
columns switching na configuraccedilatildeo backflush e as condiccedilotildees da anaacutelise foram
otimizadas como os tempos de exclusatildeo de proteiacutenas de adsorccedilatildeo e eluiccedilatildeo dos
analitos de separaccedilatildeo cromatograacutefica de limpeza da coluna extratora e de
recondicionamento do sistema bem como a composiccedilatildeo das fases moacuteveis de
carregamento de eluiccedilatildeoseparaccedilatildeo e de limpeza
Para a otimizaccedilatildeo dos paracircmetros de anaacutelise foi utilizado um pool de amostras
de soro humano branco em sexplicata Este soro foi dopado com os analitos vareniclina
bupropiona hidroxibupropiona nicotina cotinina e hidroxicotinina em 3 concentraccedilotildees
01 100 e 1000 microg L -1 e com os PIs deuterados na concentraccedilatildeo de 500 microg L -1 Como
o soro eacute uma matriz com alta concentraccedilatildeo de interferentes foram testados pools de
soro branco dopados e injetados sem diluiccedilatildeo diretamente no sistema e diluiacutedos em aacutegua
ultra pura (11) e os perfis analiacuteticos foram entatildeo avaliados
49
467 validaccedilatildeo analiacutetica
Testes para a validaccedilatildeo da anaacutelise otimizada foram realizadas conforme
diretrizes do US Department of Health and Human Services e do Food and Drug
Administration (FDA) 2013 113 Os paracircmetros avaliados foram a seletividade limite
de detecccedilatildeo (LD) limite de quantificaccedilatildeo (LQ) linearidade estabilidade dos analitos
efeito residual e de matriz e recuperaccedilatildeo da extraccedilatildeo
Os ensaios foram realizados em seis repeticcedilotildees (n=6) exceto o ensaio de
recuperaccedilatildeo (n=3) e foi utilizado um pool de amostras de soro branco dopadas com cada
um dos analitos nas concentraccedilotildees de 5 10 20 50 75 100 μg L-1 para vareniclina 1 5
50 250 500 1000 μg L-1 para bupropiona 1 10 100 500 1000 2000 para
hidroxibupropiona 5 10 50 250 500 1000 μg L-1 para nicotina cotinina e
hidroxicotinina Os PIs deuterados foram utilizados na concentraccedilatildeo de 200 μg L-1
47 Anaacutelise estatiacutestica
Em relaccedilatildeo agraves caracteriacutesticas demograacuteficas as variaacuteveis contiacutenuas foram
apresentadas como meacutedia e desvio padratildeo e as categoacutericas como frequecircncias Os testes
Shapiro-Wilk e KolmogorovndashSmirnov foram realizados para verificar a normalidade da
distribuiccedilatildeo das variaacuteveis quantitativas e assim escolher testes parameacutetricos ou natildeo
parameacutetricos Foram realizados os testes Qui-quadrado Exato de Fisher t de Student ou
Mann-Whitney para as anaacutelises comparativas de caracteriacutesticas gerais entre os grupos
de desfecho dos pacientes tanto no ensaio de expressatildeo como de mensuraccedilatildeo dos
analitos Para as anaacutelises de expressatildeo gecircnica o meacutetodo 2-∆∆CT foi utilizado 103 Como os
dados de expressatildeo natildeo apresentaram distribuiccedilatildeo normal foi realizado o teste natildeo
parameacutetrico de Mann-Whitney para testar a hipoacutetese de diferenccedila (valores de 2-∆CT)
intra e entre os grupos de desfechos (sucesso e resistente e tempos de tratamento
50
farmacoloacutegico T0 T2 e T4) Os valores de ∆∆CT (mediana de ∆CTgrupo teste ndash mediana
de ∆CTgrupo referecircncia) foram obtidos para o caacutelculo do fold change O fold-change (2-∆∆CT)
foi calculado para verificar o aumento ou diminuiccedilatildeo de expressatildeo gecircnica entre os
grupos analisados O graacutefico heat map foi construiacutedo atraveacutes do software Gene-globe
(Qiagen USA) para verificar as diferenccedilas no perfil de expressatildeo dos genes estudados
de acordo com os tempos (T0 T2 e T4) e de acordo com a efetividade de tratamento
com vareniclina (sucesso e resistente) O teste de Manny-Whitney foi utilizado para
analisar os niacuteveis de concentraccedilotildees de vareniclina de bupropiona de nicotina e de seus
metaboacutelitos de acordo com os desfechos de tratamento (sucesso e resistente) pois natildeo
apresentaram distribuiccedilatildeo normal A taxa de metabolizaccedilatildeo de nicotina (NRM) foi
calculada pela seguinte foacutermula NMR= trans-3-hidroxicotininacotinina A
hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3- hidroxicotinina
para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros da hidroxicotinina satildeo
irrelevantes 31 32 Os pacientes foram classificados em metabolizadores lentos se
NMRlt031 e normais ou raacutepidos se NMRgt031 Todas as anaacutelises estatiacutesticas foram
realizadas utilizando o software SPSS (versatildeo 20 IBM New York NY) considerando
o niacutevel de significacircncia de P lt005
51
5 RESULTADOS
Este projeto incluiu 105 pacientes sendo 74 tratados com vareniclina e 31
com bupropiona Dos 74 pacientes tratados com vareniclina amostras de 27 pacientes
foram analisadas quanto agrave expressatildeo gecircnica (14 pacientes do grupo de desfecho sucesso
e 13 do grupo resistente) Sendo provenientes destes pacientes 52 amostras ao todo (de
diversos tempos) 9 resistentes do tempo T0 7 resistentes do T2 8 resistente do T4 9
sucessos do T0 8 sucessos do T2 e 11 sucessos do T4 (vide toacutepico 42 Nuacutemero
amostral)
Quanto a mensuraccedilatildeo dos analitos foi desenvolvida uma coluna extratora para a
purificaccedilatildeo da amostra agrave base de nanotubos hiacutedridos de carbono e siacutelica modificados
com a adiccedilatildeo de grupos hidrofiacutelicos (novo RAM) o meacutetodo HPLC-MSMS
multidimensional no modo column switching e na configuraccedilatildeo backflush foi
otimizado e validado Setenta e quatro pacientes tratados com vareniclina e 31 tratados
com bupropiona foram submetidos agrave anaacutelise Apenas 4 amostras das 105 apresentaram
valores abaixo do LQ (3 de pacientes tratados com vareniclina e 1 de paciente tratado
com bupropiona) e estas foram excluiacutedas das anaacutelises dos analitos (vide toacutepico 42
Nuacutemero amostral)
51 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica
511 Dados cliacutenicos e demograacuteficos
As Tabelas 2 e 3 mostram as caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes
selecionados para o ensaio de expressatildeo gecircnica do grupo total e por grupo de desfecho
respectivamente A variaacutevel idade apresentou diferenccedila significativa entre os grupos
resistente e sucesso
52
Tabela 2 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina selecionados para os ensaios de expressatildeo gecircnica (n=27)
Idade (anos) 50 plusmn 13
Gecircnero mulheres () 464
Etnia autodeclarada brancos () 740
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 271 plusmn 50
Cigarrosdia 17 plusmn 7
FTND 62 plusmn 20
FTND ge 6 () 607
Escore Issa ge 3 () 857
Hipertensatildeo () 179
Dislipidemia () 250
Diabetes melito tipo 2 () 107
Depressatildeo () 71
Ansiedade () 286
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash
Fagerstroumlm test for nicotine dependence (escala de 0 a 10
pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
Tabela 3 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina submetidos aos ensaios de expressatildeo gecircnica de acordo com o desfecho
de tratamento
Resistente (n=13) Sucesso (n=14) Valor de P
Idade (anos) 55 plusmn 11 45 plusmn 12 0045
Gecircnero mulheres () 538 357 045
Etnia autodeclarada brancos () 769 786 100
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 271 plusmn 46 273 plusmn 54 092
Cigarrosdia 20 plusmn 6 15 plusmn 6 006
FTND 63 plusmn 22 59 plusmn 19 058
FTND ge 6 () 538 643 070
Escore Issa ge 3 () 846 857 100
Hipertensatildeo () 231 71 033
Dislipidemia () 231 286 100
Diabetes melito tipo 2 () 231 00 010
Depressatildeo () 77 71 100
53
Ansiedade () 308 357 100
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fagerstroumlm test for nicotine
dependence (escala de 0 a 10 pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
512 Dados de expressatildeo gecircnica
Dos 17 genes escolhidos para testar com a resposta ao tratamento apenas 4
apresentaram valores de amplificaccedilatildeo aceitaacuteveis para uma interpretaccedilatildeo de qualidade
mais especificamente valores de CT lt 33 Os valores das expressotildees dos genes (CTs)
foram normalizados atraveacutes das meacutedias de CT dos housekeeping genes para cada
amostra obtendo-se os valores de ∆CT = (CTgene alvo ndash meacutedia CT housekeepings genes) A
Tabela 4 mostra os valores de mediana de ∆CT dos genes analisaacuteveis de acordo com os
tempos de tratamento e grupos de desfecho
Tabela 4 - Valores de mediana de ∆CT dos genes de acordo com os tempos de
tratamento e grupos de desfecho
∆CT = (CTgene alvo ndash meacutedia CThousekeepings genes) T0= Tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico
T2= Duas semanas apoacutes o iacutenicio do tratamento farmacoloacutegico T4= Quatro semanas apoacutes o iniacutecio do
tratamento farmacoloacutegico IC 95 = Intervalo de confianccedila de 95
Resistente T0 Resistente T2 Resistente T4
∆CT IC 95 ∆CT IC 95 ∆CT IC 95
CHRNA5 818 (732 ndash 870) 845 (748 ndash 887) 767 (727 ndash 905)
CHRNA7 662 (617 ndash 697) 802 (707 ndash 848) 719 (696 ndash 786)
CHRNG 620 (579 ndash 695) 647 (601 ndash 668) 663 (602 ndash 702)
COMT 467 (440ndash 501) 480 (443 ndash 503) 487 (452 ndash 524)
Sucesso T0 Sucesso T2 Sucesso T4
∆CT IC 95 ∆CT IC 95 ∆CT IC 95
CHRNA5 832 (738 ndash 917) 707 (653 ndash 896) 837 (754 ndash 882)
CHRNA7 726 (611 ndash 842) 704 (640 ndash 779) 738 (676 ndash 820)
CHRNG 682 (619 ndash 774) 683 (656 ndash 733) 659 (625 ndash 703)
COMT 488 (430 ndash 511) 458 (433 -515) 481 (448 ndash 516)
54
513 Anaacutelise de associaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica entre os desfechos e os tempos de
tratamento
A Tabela 5 mostra o fold change e anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos de
tempos de tratamento e grupos de desfecho Foi observada diferenccedila significativa para a
expressatildeo do gene CHRNA7 no grupo resistente amostras dos tempos T2 e T4
apresentaram menor expressatildeo comparadas com amostras do T0 (fold change 038
P=0007 fold change 067 P=0004 respectivamente) Para a expressatildeo do gene
CHRNG amostras do grupo sucesso mostraram menor expressatildeo comparadas com
amostras do grupo resistente no tempo T2 (fold change= 077 P=0006)
Tabela 5 - Fold change e anaacutelise de associaccedilatildeo entre os tempos de tratamento e
grupos de desfecho
Resistente T2 vs T0 Resistente T4 vs T0 Resistente T4 vs T2
Genes 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P
CHRNA5 083 (034 ndash 233) 057 142 (030 ndash 269) 095 172 (034 ndash 303) 089
CHRNA7 038 (020 ndash 093) 0007 067 (031 ndash 101) 0004 178 (058 ndash 287) 037
CHRNG 083 (054 ndash 192) 037 074 (043 ndash 190) 044 090 (050 ndash 158) 036
COMT 091 (065 ndash 149) 092 087 (056 ndash 140) 063 095 (057 ndash 142) 073
Sucesso T2 vs T0 Sucesso T4 vs T0 Sucesso T4 vs T2
Genes 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P
CHRNA5 238 (033 ndash 623) 037 097 (037 ndash 310) 061 041 (020 ndash 268) 069
CHRNA7 116 (031 ndash 406) 064 092 (023 ndash 316) 091 079 (029 ndash 204) 055
CHRNG 099 (045 ndash 227) 049 117 (056 ndash 281) 062 118 (072 ndash 211) 033
COMT 123 (055 ndash 172) 092 105 (055 ndash 155) 068 085 (056 ndash 159) 041
Sucesso vs resistente T0 Sucesso vs resistente T2 Sucesso vs resistente T4
Genes 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P
CHRNA5 091 (028 ndash 250) 075 260 (036 ndash 506) 047 062 (034 ndash 285) 085
CHRNA7 064 (021 ndash 182) 013 197 (061 ndash 423) 009 088 (042 ndash 214) 074
CHRNG 065 (026 ndash 169) 012 077 (040 ndash 109) 0006 103 (050 ndash 171) 079
55
T0= Tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico T2= Duas semanas apoacutes o iacutenicio do tratamento
farmacoloacutegico T4= Quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico 2-∆∆CT = Fold change (diferenccedila de
expressatildeo) P valor (anaacutelise de associaccedilatildeo entre as medianas de 2-∆CT dos grupos) IC 95 = Intervalo de confianccedila
de 95
As Figura 14 e 15 mostram graacuteficos de barras das diferenccedilas de expressatildeo dos
genes CHRNA7 e CHRNG entre os tempos de tratamento e desfecho respectivamente
O heat map (Figura 16) mostra que natildeo houve diferenciaccedilatildeo nos perfis de expressatildeo
gecircnica em uma anaacutelise conjunta dos genes de acordo com os desfechos e tempos de
tratamento
Devido agrave diferenccedila significativa nas meacutedias de idade entre os grupos sucesso e
resistente foi realizada regressatildeo linear multipla na anaacutelise de expressatildeo dos quatro
genes analisaacuteveis A regressatildeo foi ajustada por idade e tambeacutem gecircnero e cigarros por
dia No entanto os resultados de expressatildeo dos genes natildeo foram impactados por estas
covariaacuteveis
COMT 086 (061 ndash 164) 090 116 (061 ndash 162) 049 104 (064 ndash 169) 093
56
Figura 14 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNA7 entre os tempos de tratamento e desfecho A Anaacutelise intragrupo do
desfecho resistente B Anaacutelise intragrupo do desfecho sucesso T0= tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico T2= duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico T4= quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico P= 0007
(resistente T2 vs T0 fold change de 038) P=0004 (resistente T4 vs T0 fold change de 067) Valor de P (anaacuteliacutese de
associaccedilatildeo entre as medianas de 2-∆CT dos grupos em uma comparaccedilatildeo dois a dois) Fonte do autor
57
Figura 15 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNG entre os tempos de tratamento e desfecho A Anaacutelise intragrupo do
desfecho resistente B Anaacutelise intragrupo do desfecho sucesso T0= tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico T2= duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico T4= quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico P= 0006
(sucesso vs resistente T2 fold change de 077) Valor de P (anaacuteliacutese de associaccedilatildeo entre as medianas de 2-∆CT dos grupos em uma
comparaccedilatildeo dois a dois) Fonte do autor
58
Figura 16 - Heat map de expressatildeo gecircnica A figura mostra a magnitude de expressatildeo gecircnica entre os grupos A cor mais clara
(verde) nos indica menor expressatildeo e a cor mais escura (vermelho) indica maior expressatildeoT0= tempo inicial antes do tratamento
farmacoloacutegico T2= duas semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico T4= quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento
farmacoloacutegico Fonte do autor gerada pelo software Gene Globe QIAGENreg
52 Mensuraccedilatildeo dos analitos
521 Caracterizaccedilatildeo da coluna teste exclusatildeo de proteiacutenas e interferentes da
matriz
Em relaccedilatildeo ao teste de capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas o pico de BSA sem
e com a nova coluna extratora apresentou tempo de retenccedilatildeo semelhante no entando a
aacuterea da curva do BSA na presenccedila do novo RAM foi bem menor do que na sua
ausecircncia conforme a Figura 17 A reduccedilatildeo de proteiacutenas (da soluccedilatildeo de BSA) pela
coluna foi de aproximadamente 98 e nas amostras de pools soro diluiacutedas (14) a
remoccedilatildeo foi de 99 (Figura 18)
A Figura 19 mostra a influecircncia do pH (escala de de 22 a 70) na exclusatildeo de
proteiacutenas fato que estaacute diretamente relacionado com a estrutura fiacutesico-quiacutemica do
RAM Diferentes pHs influenciaram na taxa de exclusatildeo de proteiacutenas esse
comportamento pode ser explicado devido agrave interaccedilotildees eletrostaacuteticas do novo RAM
com as proteiacutenas Valores de pH menores que o do ponto isoeleacutetrico das proteiacutenas
59
podem promover a prevalecircncia de proteiacutenas carregadas positivamente enquanto que
valores de pH superiores podem promover proteiacutenas carregadas negativamente 114
Dessa forma acredita-se que o comportamento de exclusatildeo de proteiacutenas do novo
material eacute semelhante ao descrito em outros estudos 108 109 115 116
Figura 17 - Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com soluccedilatildeo de BSA Graacuteficos obtidos apoacutes injeccedilatildeo de 10 microL de uma soluccedilatildeo aquosa de BSA (44 mg mL-1) no
sistema sem coluna (A) e com coluna extratora (B) A - aacuterea do pico 10142590 B - aacuterea
do pico 9713614 Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF
Unifal-MG
Figura 18 - Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com amostra de soro
diluiacuteda Graacuteficos obtidos apoacutes injeccedilatildeo de 100 microL de soro diluiacutedo em aacutegua ultra pura
(14 vv) no sistema sem coluna (A) e com coluna extratora (B) A aacuterea do pico
53981550 B - aacuterea do pico 53552824 Fonte do autor e do colaborador DrHenrique
Dipe de Faria LATF Unifal-MG
60
Figura 19 - Influecircncia do pH na exclusatildeo de proteiacutenas Fonte do autor e do colaborador Dr
Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
522 Otimizaccedilatildeo dos paracircmetros espectromeacutetricos
No processo de otimizaccedilatildeo das condiccedilotildees espectromeacutetricas foi adotado o modo
de ionizaccedilatildeo positivo (ESI+) isto eacute a ionizaccedilatildeo promove a protonaccedilatildeo (adiccedilatildeo de H+)
dos analitos e de seus fragmentos As energias de colisatildeo ideais e as muacuteltiplas transiccedilotildees
de monitoramento de reaccedilatildeo (MRM) foram otimizadas para cada analito separadamente
vide valores de energia de colisatildeo e fragmentos obtidos jaacute mostrados na Tabela 1 (no
toacutepico 461) A presenccedila de 3 fragmentos de cada analito foi necessaacuteria para a
identicaccedilatildeo qualitativa e a quantificaccedilatildeo foi dependente da concentraccedilatildeo do fragmento
mais abundante
As seguintes temperaturas foram utilizadas 40ordmC para o forno da coluna 250ordmC
para a linha de dessolvataccedilatildeo e 400ordmC para o bloco de aquecimento Foram utilizadas as
taxas de 20 ml min-1 de fluxo de gaacutes de nebulizaccedilatildeo e 150 ml min-1 de fluxo de gaacutes
para a secagem
61
523 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatrograacutefico multidimensional
Quanto a composiccedilatildeo e proporccedilatildeo da fase moacutevel responsaacutevel pela eluiccedilatildeo
separaccedilatildeo e ionizaccedilatildeo dos analitos (fase moacutevel de eluiccedilatildeo) testes foram realizados com
os solventes orgacircnicos acetonitrila ou metanol combinados com o tampatildeo formiato de
amocircnio 10 mM em diferentes pHs com proporccedilotildees que variaram de 973 vv a 7525
vv (fase orgacircnica fase aquosa) Os solventes orgacircnicos utilizados satildeo menos viscosos
em relaccedilatildeo agrave aacutegua por isso fluem mais facilmente no sistema e por serem volaacuteteis
favorecem tambeacutem a ionizaccedilatildeo dos analitos e evaporaccedilatildeo do solvente A fase moacutevel que
apresentou melhores resultados foi a composiccedilatildeo de metanol formiato de amocircnio 001
mol L-1 pH 42 (9010 vv)
Variados tipos de colunas analiacuteticas foram testadas sendo elas A NSTreg (150
mm 46 mm e 5 microm) a ACEreg (150 mm x 46 mm x 5 microm) a Phenomenexreg (250 x 46
mm x 5 microm) e a Atlantis T3 e da Watersreg (100 mm x 21 mm x 3 microm) (comprimento x
diacircmetro interno x tamanho de partiacutecula) no entanto essas colunas aumentaram o
tempo de retenccedilatildeo dos analitos pioraram o perfil cromatograacutefico gerando picos largos e
fragmentados Portanto os testes foram realizados com uma nova coluna analiacutetica a
ACEreg C18 (100 mm x 21 mm x 3 microm comprimento diacircmetro interno e tamanho de
partiacutecula) com preacute-coluna ACEreg C18 (21mm x 3 microm diacircmetro tamanho de partiacutecula)
obtendo-se um menor tempo de anaacutelise (maior frequecircncia analiacutetica) e melhor perfil
cromatograacutefico (picos simeacutetricos) para os analitos
Trecircs volumes de injeccedilatildeo de amostra foram testados (5 10 e 100 microL) devido a
baixa concentraccedilatildeo dos analitos foi adotada a maior quantidade (100 μL) pois forneceu
melhores sinais analiacuteticos Tambeacutem foi avaliado o uso do pool de soro sem diluiccedilatildeo e
diluiacutedo (11 vv) os perfis cromatograacuteficos de ambos foram oacutetimos no entanto
62
escolheu-se trabalhar com a amostra diluiacuteda para diminuir a presenccedila de interferentes e
consequentemente diminuir efeito matriz e aumentar o tempo de durabilidade da coluna
analiacutetica
Jaacute obtidas as melhores condiccedilotildees espectromeacutetricas e cromatograacuteficas foi
otimizado o sistema columm switching na configuraccedilatildeo de backflush o qual apresenta
trecircs eventos como mostrado na Figura 20
Figura 20 - Ilustraccedilatildeo do sistema de columm switching na configuraccedilatildeo de backflush Na posiccedilatildeo 1
correspondente ao evento 1 ocorre exclusatildeo dos interferentes e adsorccedilatildeo dos analitos a coluna extratora Na
posiccedilatildeo 2 durante o evento 2 ocorre a eluiccedilatildeo dos analitos adsorvidos No retorno para a posiccedilatildeo 1
correspondente ao evento 3 ocorre limpeza da coluna extratora separaccedilatildeo e detecccedilatildeo dos analitos e por fim
o recondicionamento do sistema BA = bomba A BB = bomba B BC = bomba C MS = espectrocircmetro de
massas UV = detector UV e W = descarte Fonte Traduzido de (De Faria et al 2017)
Com as vaacutelvulas do sistema na posiccedilatildeo 1 (evento 1) a bomba A promoveu a
liberaccedilatildeo da fase moacutevel de carregamento (aacutegua ultra pura) em um fluxo de 04 mL min-1 O
tempo de 3 minutos foi o necessaacuterio para a adsorccedilatildeo dos analitos e sua preacute-concentraccedilatildeo
aleacutem da eliminaccedilatildeo de macromoleacuteculas A aacutegua mostrou ser um solvente oacutetimo como fase
moacutevel de carregamento aleacutem de ser um recurso barato e natildeo causar danos ao meio
ambiente De forma simultacircnea a fase moacutevel de eluiccedilatildeo fornecida pela bomba C passa
para a coluna analiacutetica de forma a condionaacute-la ainda na ausecircncia dos analitos Ambas as
bombas operaram com uma taxa de fluxo inicial de 04 mL min -1
63
Na posiccedilatildeo 2 da vaacutelvula (evento 2) a bomba C liberou a fase moacutevel de eluiccedilatildeo
(metanol formiato de amocircnio 001 mol L-1 pH 42 (9010 vv) em direccedilatildeo agrave coluna
analiacutetica em fluxo contraacuterio ao que a fase moacutevel de carregamento percorreu (backflush) A
velocidade do fluxo da bomba C foi aumentada para 08 mL min -1 e o tempo determinado
para esta etapa foi de 03 minutos o qual promoveu um oacutetimo perfil cromatograacutefico dos
analitos
No evento 3 as vaacutelvulas foram colocadas na posiccedilatildeo 1 novamente A fase moacutevel
de eluiccedilatildeo (vinda da bomba C) novamente com um fluxo de 04 mL min-1 passou pela
coluna analiacutetica promovendo a separaccedilatildeo dos analitos e sua chegada no detector de
massas De forma simultacircnea a bomba B em um fluxo de 10 mL min -1 liberou a fase
moacutevel de limpeza (acetonitrila aacutegua ultra pura isopropanol 751510 vvv) a qual
passou pela coluna extratora (RAM) promovendo a remoccedilatildeo de resiacuteduos proveniente da
anaacutelise anterior tornando-a pronta para a reutilizaccedilatildeo em uma nova anaacutelise A fase de
limpeza ocorreu no tempo de 33 a 10 min O recondionamento do sistema agraves condiccedilotildees
iniciais de anaacutelise ocorreu nos uacuteltimos 5 min em que a fase moacutevel de limpeza foi
substituiacuteda pela fase moacutevel de carregamento O tempo total para cada anaacutelise foi de 15
minutos
Para a avaliaccedilatildeo da capacidade da fase moacutevel de limpeza (acetonitrila aacutegua
ultra pura isopropanol 751510 vvv) pools de soro branco dopado na maior
concentraccedilatildeo foram injetados no sistema (com a posiccedilatildeo 1 das vaacutelvulas mantida) e apoacutes
a realizaccedilatildeo da fase de limpeza foram injetados pools de soro branco diluiacutedos (11 vv)
O experimento foi realizado em triplicata O cromatograma do soro branco natildeo
apresentou sinal analiacutetico no mesmo tempo de retenccedilatildeo dos analitos o que mostra que a
fase moacutevel de limpeza foi eficiente em seu propoacutesito evitando o chamado efeito
residual (carry-over) De Faria et al 110
64
524 Validaccedilatildeo analiacutetica
Para os testes de validaccedilatildeo foram utilizados pools de amostras de soro branco
dopadas com cada um dos analitos nas concentraccedilotildees conforme o toacutepico 467
concentraccedilotildees menores foram utilizadas no entanto essas natildeo apresentaram bons sinais
analiacuteticos precisatildeo e exatidatildeo Os resultados dos testes de validaccedilatildeo estatildeo demonstrados
na Tabela 6
O teste de linearidade foi expresso como coeficiente de determinaccedilatildeo (r2)
calculado a partir das curvas de calibraccedilatildeo intra-ensaio Para esse teste foram utilizados
os analitos em diferentes concentraccedilotildees em soro branco conforme jaacute citado as
repeticcedilotildees geraram 6 curvas de calibraccedilatildeo para cada analito Os intervalos lineares
foram baseados nos intervalos terapecircuticos 51 117 118
As mesmas concentraccedilotildees dos analitos em soro no ensaio de linearidade foram
utilizadas no ensaio dos LD e LQ Estes foram calculados atraveacutes das 6 curvas de
calibraccedilatildeo e foram definidos como 3 e 10 vezes a relaccedilatildeo sinalruiacutedo respectivamente
para o LD e LQ
Para avaliar a precisatildeo e a exatidatildeo intra e inter-ensaios foram realizados 6
repeticcedilotildees de concentraccedilotildees de calibraccedilatildeo dos analitos Os testes intra-ensaio foram
realizados no mesmo dia e os testes inter-ensaios foram realizados em dias diferentes A
exatidatildeo foi calculada atraveacutes do erro relatico (E) e a precisatildeo atraveacutes do desvio
padratildeo relativo (RSD)
No teste de seletividade foi avaliado se houve a presenccedila picos de interferentes
nos mesmos tempos de retenccedilatildeo dos analitos e dos PIs deuterados As Figuras 21 e 22
mostram os cromatogramas obtidos apoacutes a injeccedilatildeo de soro branco e de soro dopado com
os analitos respectivamente mostrando que natildeo houve a presenccedila de interferentes nos
tempos de retenccedilatildeo dos analitos e PIs deuterados
65
Figura 21 - Cromatograma obtido de amostras de soro branco diluiacutedas em aacutegua ultra pura
Volume de injeccedilatildeo = 100 microL A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz 240rarr mz 131) C-
Hidroxibup (mz 256rarr mz 238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz 80) F-
Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G- Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr mz
244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz 134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz 196rarr
mz 80) Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
Figura 22 - Cromatograma obtido apoacutes anaacutelise de soro diluiacutedo e dopado com os analitos no niacutevel
meacutedio de calibraccedilatildeo e mais os padrotildees internos deuterados A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz
240rarr mz 131) C- Hidroxibup (mz 256rarr mz 238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz
80) F- Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G- Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr
mz 244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz 134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz 196rarr
mz 80) Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
Foram realizados os testes de estabilidade de bancada longo prazo e de
congelamento e descongelamento Para a anaacutelise de estabilidade de bancada soluccedilotildees de
soro dopada com os analitos foram analisadas imediatamente apoacutes a sua preparaccedilatildeo e
apoacutes 4 e 24 horas verificando assim a estabilidade da amostra a curto prazo Para uma
66
anaacutelise a longo prazo as amostras foram armazenadas a -20degC por 30 dias e apoacutes foram
avaliadas Quanto anaacutelises de congelamento e descongelamento foram realizados 3
ciclos de congelamento -20degC e posterior descongelamento e as amostras foram
avaliadas
O ensaio de recuperaccedilatildeo da extraccedilatildeo foi realizado em triplicata A anaacutelise
avaliou a recuperaccedilatildeo relativa comparando-se a extraccedilatildeo dos analitos a partir da matriz
de soro com a de aacutegua atraveacutes da passagem da amostra pela coluna de extraccedilatildeo (RAM)
A recuperaccedilatildeo relativa se daacute pela relaccedilatildeo das concentraccedilotildees nas duas matrizes
(concentraccedilatildeo no soro concentraccedilatildeo na aacutegua) x 100
O efeito residual (carry-over) foi avaliado injetando-se uma amostra de soro
branco antes de uma amostra de soro dopado na maior concentraccedilatildeo e apoacutes foi injetada
novamente uma amostra de soro branco foram inferior a 20 daqueles obtidos no LQ
Para avaliar o efeito matriz foram comparados os resultados da anaacutelise das
amostras de soro dopadas com os analitos em diferentes concentraccedilotildees em matrizes
diferentes (aacutegua e soro) O resultado para ser aceito precisava ser inferior a 15
Posteriormente foi realizada a mensuraccedilatildeo dos analitos em amostras reais de
soro provenientes de pacientes submetidos ao tratamento antitabagismo com doses
conforme bula As Figuras 23 e 24 mostram os cromatogramas de amostras de pacientes
submetidos ao tratamento com bupropiona e vareniclina respectivamente No momento
da coleta das amostras os pacientes estavam fumando e aleacutem de apresentarem os
analitos provenientes dos faacutermacos tambeacutem mostraram a presenccedila de analitos
provenientes da nicotina
67
Figura 23 - Cromatograma obtido atraveacutes da anaacutelise das amostras de soro dos pacientes
tratados com bupropiona (150 mg 2xdia) Os pacientes estavam fumando em torno de 10
cigarrosdia no dia da coleta A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz 240rarr mz 131) C-
hidroxibup (mz 256rarr mz 238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz 80) F-
Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G- Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr mz
244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz 134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz
196rarr mz 80) Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
Figura 24 - Cromatograma obtido atraveacutes da analise de amostras de soro de pacientes tratados
com vareniclina (10 mg 2xdia) Os pacientes fumavam em torno de 10 cigarrosdia no dia da
coleta A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz 240rarr mz 131) C- hidroxibup (mz 256rarr mz
238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz 80) F- Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G-
Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr mz 244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz
134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz 196rarr mz 80) Fonte do autor e do
colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
68
Tabela 6 - Paracircmetros de validaccedilatildeo obtidos na determinaccedilatildeo de faacutermacos antitabagismo em soro humano
Meacutedia plusmn Desvio padratildeo (n=6) amenor bmeacutedio e calto niacutevel de calibraccedilatildeo 1Estabilidade de bancada (4 a 24 horas) Precisatildeo RSD = [Desvio padratildeomeacutedia] x 100 E = [(Meacutedia experimental da
concentraccedilatildeo Concentraccedilatildeo nominal) x 100] ndash 100 2Efeito matriz E= [(Meacutedia da concentraccedilatildeo experimental no solventeMeacutedia experimental da concentraccedilatildeo no soro) x 100] ndash 100
Paracircmetros de validaccedilatildeo Vareniclina Bupropiona Hidroxibupropiona Nicotina Cotinina Hidroxicotinina
Intervalo linear (microg L-1) 5-100 1-1000 1-2000 5-1000 5-1000 5-1000
r2 ( n=6) 09952 09998 09998 09997 09998 09999
Decliacutenio (α) ( n=6) 00196plusmn 00095 00045plusmn00059 00051plusmn00057 00087plusmn00012 00073plusmn00048 00075plusmn00074
Intercepto ( n=6) -00316plusmn00004 -00022plusmn00020 00230plusmn00025 -00046plusmn00065 00767plusmn00012 01918plusmn00013
Tempo de retenccedilatildeo (min) 521 501 485 497 446 441
LD (microg L-1) 25 07 06 19 24 37
LQ (microg L-1) 50 10 10 50 50 50
Precisatildeo intra-ensaio RSD ( n=6) 93a
30a
100c
153a
37b
21c
140a
06b
06c
90a
26b
11c
117a
34b
61c
128a
138b
92c
Precisatildeo inter-ensaio RSD ( n=18 trecircs dias) 185a
115b
66c
82a
27b
20c
109a
17b
10c
83a
27b
14c
158a
41b
31c
161a
44b
92c
Acuraacutecia intra-ensaio E ( n=6) 196a
54b
-30c
-55a
-24b
-11c
-65a
19b
-04c
158a
09b
-26c
-87a
47b
-24c
71a
18b
05c
Acuraacutecia inter-ensaio E ( n=18 trecircs dias) 82a
-16b
035c
41a
-01b
-01c
-87a
27b
-20c
146a
40b
018c
-120a
25b
-110c
58a
-35b
30c
Recuperaccedilatildeo da extraccedilatildeo ( n=3) 883a
1104b
1014c
1101a
1009b
1028c
945a
1094b
1078c
1098a
1088b
1146c
941a
1093b
1116c
1167a
1112b
1141c
Estabilidade1 E
( n=6)
98a
11b
-50c
71a
-32b
-38c
140a
-16b
-79c
40a
-79b
-110c
-132a
-94b
-32c
86a
125b
-54c
Efeito matriz2 E
( n=6)
-117a
104b
14c
101a
09b
28c
-55a
94b
78c
98a
88b
146c
-59a
93b
116c
167a
112b
141c
69
525 Dados cliacutenicos e demograacuteficos dos pacientes submetidos a mensuraccedilatildeo dos
analitos
As Tabelas 7 a 10 mostram as caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos
pacientes submetidos agraves anaacutelises de concentraccedilatildeo dos analitos
As Tabelas 7 e 8 referem-se aos pacientes tratados com vareniclina sendo
considerado o grupo total e os grupos de desfecho respectivamente Os pacientes do
grupo resistente agrave vareniclina fumavam um maior nuacutemero de cigarrosdia (antes do
tratamento) em comparaccedilatildeo com os pacientes que obtiveram sucesso (21 vs 17
cigarrosdia P= 005)
As Tabelas 9 e 10 referem-se aos pacientes tratados com bupropiona no grupo
total e de acordo com desfecho respectivamente O grupo resistente ao tratamento com
bupropiona apresentou maior frequecircncia de pacientes com alta DN (atraveacutes dos escores
FTND e Issa categorizados) e de pacientes que fumavam no dia da coleta em
comparaccedilatildeo ao grupo sucesso (FTNDge6= 833 vs 429 P= 005 Escore Issage3=
1000 vs 429 P= 0001 fumo no dia da coleta= 1000 vs 429 P= 0001
respectivamente)
Tabela 7 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos (n= 74)
Idade (anos) 51 plusmn 12
Gecircnero mulheres () 500
Etnia autodeclarada brancos () 730
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 263 plusmn 49
10 1 4 1
7 1 3 1
8 1 3 1
9 1 3 1
8 1 4 1
5 0 3 1
8 1 4 1
8 1 4 1
7 1 4 1
7 1 3 1
9 1 3 1
7 1 4 1
Cigarrosdia inicial 19 plusmn 10
Fumo no dia da coleta () 919
FTND 62 plusmn 23
FTND ge 6 () 644
70
Escore Issa ge 3 () 851
Hipertensatildeo () 311
Dislipidemia () 392
Diabetes melito tipo 2 () 95
Depressatildeo () 135
Ansiedade () 176
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash
Fagerstroumlm test for nicotine dependence (escala de 0 a 10 pontos)
Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala de 0 a 4
pontos)
Tabela 8 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com o
desfecho de tratamento
Resistente (n=41) Sucesso (n=33) P valor
Idade (anos) 53 plusmn 11 49 plusmn 13 023
Gecircnero mulheres () 561 424 024
Etnia autodeclarada brancos () 683 788 031
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 270 plusmn 40 255 plusmn 58 028
Cigarrosdia 21 plusmn 11 17 plusmn 7 005
Fumo no dia da coleta () 976 848 008
FTND 65 plusmn 22 57 plusmn 23 019
FTND ge 6 () 659 625 077
Escore Issa ge 3 () 829 879 075
Hipertensatildeo () 390 212 010
Dislipidemia () 341 455 032
Diabetes melito tipo 2 () 73 121 069
Depressatildeo () 122 152 071
Ansiedade () 146 212 046
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fagerstroumlm test for nicotine
dependence (escala de 0 a 10 pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
71
Tabela 9 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos (n= 31)
Idade (anos) 52 plusmn 11
Gecircnero mulheres () 71
Etnia autodeclarada brancos () 931
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 258 plusmn 57
Cigarrosdia inicial 21 plusmn 7
Fumo no dia da coleta () 871
FTND 68 plusmn 21
FTND ge 6 () 742
Escore Issa ge 3 () 871
Hipertensatildeo () 226
Dislipidemia () 323
Diabetes melito tipo 2 () 32
Depressatildeo () 65
Ansiedade () 194
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash
Fagerstroumlm test for nicotine dependence (escala de 0 a 10
pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
Tabela 10 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com
o desfecho de tratamento
Resistente (n=24) Sucesso (n=7) Valor de P
Idade (anos) 53 plusmn 11 50 plusmn 11 054
Gecircnero mulheres () 708 714 100
Etnia autodeclarada brancos () 957 833 038
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 252 plusmn 61 278 plusmn 35 015
Cigarrosdia 21 plusmn 7 23 plusmn 7 071
Fumo no dia da coleta () 1000 429 0001
FTND 73 plusmn 15 54 plusmn 32 011
FTND ge 6 () 833 429 005
Escore Issa ge 3 () 1000 429 0001
Hipertensatildeo () 292 00 016
72
Dislipidemia () 375 143 038
Diabetes melito tipo 2 () 42 00 100
Depressatildeo () 83 00 100
Ansiedade () 250 00 029
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fagerstroumlm test for nicotine
dependence (escala de 0 a 10 pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
526 Anaacutelise de associaccedilatildeo dos analitos com desfecho de tratamento
A Tabela 11 mostra a frequecircncia do desfecho de tratamento de acordo com os
medicamentos antitabagismo pacientes estes cujas amostras de soro foram submetidas agrave
mensuraccedilatildeo dos analitos
Tabela 11 ndash Frequecircncia do desfecho de tratamento nos pacientes submetidos agraves
anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com os medicamentos
antitabagismo
Medicamento Resistente () Sucesso ()
Vareniclina (n=74) 544 446
Bupropiona (n=31) 774 226
As Tabelas de 12 a 15 mostram as concentraccedilotildees dos analitos nas amostras de
soro dos pacientes tratados com vareniclina e bupropiona no grupo total e de acordo
com o desfecho de tratamento
Os pacientes do grupo resistente tanto os pacientes tratados com vareniclina
(Tabela 13) quanto com bupropiona (Tabela 15) apresentaram concentraccedilatildeo
significativamente maior de cotinina e hidroxicotinina do que os grupos sucesso
(tratamento com vareniclina cotinina= 1182 vs 706 μgL P= 0009 hidroxicotinina=
845 vs 516 μgL P= 002 Tratamento com bupropiona cotinina= 1346 vs 160 μgL
P= 0005 hidroxicotinina= 972 vs 374 μgL P= 0004) No entanto quanto ao NMR
natildeo houve diferenccedila entre os desfechos de tratamento de ambos os faacutermacos Aleacutem
73
disso somente o grupo de pacientes tratados com vareniclina continha pacientes com
NMRlt031 (metabolizadores lentos para nicotina) e ainda sua frequecircncia foi baixa
(100 e 43 para os grupos de desfecho resistente e sucesso respectivamente)
Tabela 12 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos pacientes tratados
com vareniclina
Vareniclina μgL n=71 83 (81 ndash 95)
Nicotina μgL n=31 75 (76 ndash 112)
Cotinina μgL n=65 1007 (923 ndash 1225)
Hidroxicotinina μgL n=65 681 (638 ndash 874)
NMR n=63 069 (067 ndash 102)
NMR lt031 () n=63 79
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de
95) NMR=trans-3-hidroxicotininacotinina NMR lt031=
metabolizador lento NMR ge031= metabolizador normal e raacutepido A
hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo
trans-3- hidroxicotinina para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade
de outros isocircmeros satildeo irrelevantes
Tabela 13 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de tratamento
com vareniclina
Resistente Sucesso P
valor Vareniclina μgL n=71 84 (78 ndash 99) 83 (77 ndash 97) 096
Nicotina μgL n=31 83 (74 ndash 127) 70 (59 ndash 105) 032
Cotinina μgL n=65 1182 (1012 ndash 1426)
111114143ndash
1421426)
706 (643 ndash 1037) 0009
Hidroxicotinina μgL n=65 845 (702 ndash 1032) 516 (434 ndash 721) 002
NMR n=63 074 (062 ndash 107) 061 (055 ndash 113) 064
NMR lt031 () n=63 100 43 064
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de 95) NMR=trans-3-
hidroxicotininacotinina NMR lt031= metabolizador lento NMR ge031= metabolizador normal e
raacutepido A hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3- hidroxicotinina
para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros satildeo irrelevantes
74
Tabela 14 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos pacientes tratados
com bupropiona
Bupropiona μgL n=30 369 (332 ndash 493)
Hidroxibupropiona μgL n=23 7368 (5860 ndash 7824)
Nicotina μgL n=13 71 (62 ndash 109)
Cotinina μgL n=27 1159 (971 ndash 1648)
Hidroxicotinina μgL n=28 931 (838 ndash 1387)
NMR n=27 090 (074 ndash 149)
NMR lt031 () n=27 0
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de 95) NMR=
trans-3-hidroxicotininacotinina NMR lt031= metabolizador lento NMR
ge031= metabolizador normal e raacutepido Natildeo houve pacientes com NRM lt031 A
hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3-
hidroxicotinina para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros
satildeo irrelevantes
Tabela 15 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de tratamento
com bupropiona
Resistente Sucesso P
valor Bupropiona μgL n=30 372 (331 ndash 533) 300 (214 ndash 481) 048
Hidroxibupropiona μgL n=23 7795 (6078 ndash 8308) 5128 (2957 ndash 8195) 012
Nicotina μgL n=13 71 (62 ndash 109) - -
Cotinina μgL n=27 1346 (1097 ndash 1784) 160 (-195 ndash 712) 0005
Hidroxicotinina μgL n=28 972 (929 ndash 1520) 374 (33 ndash 847) 0004
NMR n=27 084 (076 ndash 109) 132 (-371 ndash 884) 014
NMR lt031 () n=27 0 0 -
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de 95) NMR= trans-3-
hidroxicotininacotinina NMR lt031= metabolizador lento NMR ge031= metabolizador normal e raacutepido
No grupo sucesso somente 1 paciente apresentou concentraccedilatildeo de nicotina Natildeo houve pacientes com NRM
lt031 A hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3- hidroxicotinina para o
caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros satildeo irrelevantes
75
6 DISCUSSAtildeO
61 Para os dados da anaacutelise de expressatildeo gecircnica
O presente estudo cliacutenico e exploratoacuterio identificou resultados significativos para
expressatildeo dos genes CHRNA7 e CHRNG de acordo com os tempos de coleta e o
desfecho de tratamento com vareniclina Amostras do grupo resistente nos tempos T2 e
T4 isto eacute jaacute com o uso da vareniclina apresentaram menores niacuteveis de expressatildeo
gecircnica do CHRNA7 comparado agraves amostras do T0 (antes de iniciar o tratamento
farmacoloacutegico) Estes resultados sugerem que o downregulation de α7 pode ter sido
responsaacutevel pela natildeo cessaccedilatildeo do fumo nos indiviacuteduos do grupo resistente o que natildeo foi
observado nas amostras do grupo sucesso
O gene CHRNA7 codifica a subunidade α7 dos nAChRs Esta possui grande
importacircncia estaacute presente em diversos tecidos e possui associaccedilatildeo consistente em
vaacuterios estudos com o processo de dependecircncia agrave nicotina processos cognitivos e
imunoloacutegicos 119-124 Estudos tambeacutem mostraram que haacute um locus contendo duplicaccedilatildeo
do gene CHRNA7 truncada composta pelos exons 5-10 do gene CHRNA7 precidida de
4 exons uacutenicos e uma deleccedilatildeo de dois pares de bases no eacutexon 6 o qual nomearam como
CHRNFAN7 A maioria dos indiviacuteduos possui uma ou duas coacutepias deste gene e satildeo
raros os casos em que esta coacutepia natildeo estaacute presente 125 126
No ceacuterebro de ratos Sprague-Dawley Ryan e Loiacono 119 detectaram niacuteveis de
α7 transcritos em diversos locais como na substacircncia negra compacta (SNpc) na
substacircncia negra reticular (SNpr) na aacuterea tegmental ventral (VTA) no coacutertex e no
hipocampo Os ratos submetidos ao tratamento crocircnico com nicotina mostraram maiores
niacuteveis de mRNA da subunidade α7 em SNpc SNpr e VTA em comparaccedilatildeo ao grupo
controle A VTA faz parte do sistema de recompensa mesoliacutembico o qual eacute muito
estudado nos processos de ND 12 15 No presente estudo (em amostras de PBMC) o
76
grupo de pacientes resistentes tambeacutem apresentou maior expressatildeo de α7 no momento
em que somente a nicotina estava presente no fumo crocircnico Ao introduzir a vareniclina
as expressotildees foram diminuiacutedas nos tempos T2 e T4 provavelmente devido ao
antagonismo competitivo da vareniclina com a nicotina no receptor
Benhammou et al 127 realizaram um estudo com amostras de ceacuterebro post mortem
de fumantes e com amostras de sangue de voluntaacuterios fumantes e natildeo fumantes Atraveacutes
do uso de nicotina radiomarcada nas amostras de ceacuterebro mostraram que os siacutetios de
ligaccedilatildeo agrave nicotina foram aumentados proporcionamente conforme o nuacutemero de cigarros
por dia O mesmo estudo ao analizar a expressatildeo gecircnica e proteiacutenas em linfoacutecitos e
ceacutelulas polimorfonucleares para um subconjunto de subunidades de receptores
nicotiacutenicos essas ceacutelulas assim como no tecido cerebral exibiram maiores nuacutemeros de
siacutetios de ligaccedilatildeo de alta afinidade agrave nicotina em fumantes em comparaccedilatildeo com natildeo
fumantes
A vareniclina em estudos funcionais mostrou ter atividade agonista total nos
receptores α7 40 Em um estudo realizou-se o tratamento crocircnico com vareniclina eou
nicotina em camundongos (10 dias) os niacuteveis das drogas no ceacuterebro e no plasma e a
toleracircncia e a expressatildeo de 4 subtipos de nAChR apoacutes dose aguda de nicotina foram
checados usando autoradiografia O upregulation de receptores α4β2 devido ao
tratamento crocircnico com vareniclina foi similar ao promovido pela nicotina e tambeacutem
ocorreu dowregulation de α6β2 assim como ocorreu com o uso de nicotina A
vareniclina aumentou significantemente os siacutetios de α3β4 e α7 enquanto a nicotina teve
menor efeito nestes siacutetios A combinaccedilatildeo da nicotina com a vareniclina foi similar agrave
vareniclina sozinha para os siacutetios de α3β4 enquanto para o siacutetio de α7 a combinaccedilatildeo
promoveu upregulation em menos regiotildees cerebrais em comparaccedilatildeo com a vareniclina
em monoterapia 77
77
No presente estudo os pacientes do grupo resistente apresentaram efeito
semelhante associado ao uso combinado de vareniclina e nicotina (devido ao fumo) os
niacuteveis de expressatildeo de CHRNA7 natildeo foram mantidos como nos pacientes que obtiveram
sucesso no tratamento No entanto o grupo sucesso soacute estava utilizando a vareniclina na
ausecircncia de nicotina entre os tempos T2 e T4 o que sugere que esse dowregulation
pode ocorrer em subgrupo de resposta
Diversos estudos mostraram diferenccedilas na expressatildeo gecircnica de a7 em
amostras de pacientes com diagnoacutesticos psiquiaacutetricos em comparaccedilatildeo com indiviacuteduos
sadios 102 128-134
Kunii et al 128 mostraram diferenccedila na expressatildeo de a7 em coacutertex preacute-frontal
dorsolateral post mortem de pacientes com depressatildeo ansiedade e transtorno bipolar e
inuacutemeros estudos mostraram menores niacuteveis de expressatildeo de α7 em pacientes com
esquizofrenia 102 129-134
Estudos de indiviacuteduos com esquizofrenia satildeo oacutetimos modelos para o
entendimento da importacircncia do receptor a7 em processos cognitivos em ND e em
como esses mecanismos estatildeo intimamente relacionados Diversos estudos mostraram
que haacute uma maior prevalecircncia de tabagismo em indiviacuteduos com esquizofrenia
comparados agrave populaccedilatildeo geral 135 136
Mexal el al 102 realizaram um estudo com amostras de ceacuterebro post mortem
provenientes de indiviacuteduos de 4 grupos distintos controle natildeo fumante controle
fumante pacientes com esquizofrenia natildeo fumantes e pacientes com esquizofrenia
fumantes O estudo realizou ensaio de expressatildeo de mRNA e de proteiacutena atraveacutes de
PCR quantitativo em tempo real e western blot As sondas da PCR foram desenhadas
para amplificar o gene completo CHRNA7 e sua coacutepia duplicada o CHRFAM7A Natildeo
fumantes com esquizofrecircnia apresentaram expressatildeo reduzida de mRNA e de proteiacutena
78
em relaccedilatildeo aos pacientes com esquizofrenia fumantes Natildeo fumantes com esquizofrenia
apresentaram menor expressatildeo em relaccedilatildeo ao controle natildeo fumante mas essa diferenccedila
foi estatisticamente significativa apenas no niacutevel do mRNA Outros estudos post
mortem cerebral mostraram menor expressatildeo dos receptores nicotiacutenicos no coacutertex e no
hipocampo de indiviacuteduos com esquizofrecircnia comparado aos controles saudaacuteveis 129-134
O CHRFAM7A assim como o CHRNA7 eacute polimoacuterfico e variantes neste gene
foram associadas agrave patologia auditoacuteria em casos de esquizofrenia Processos
diferenciados nos mecanismos de transcriccedilatildeo podem contribuir para um funcionamento
anormal de a7 como variaccedilotildees em promotor splicing alternativo eou desequiliacutebrio de
ligaccedilatildeo com o SNP do gene de neuroregulina -1 (gene que codifica moleacutecula de adesatildeo
celular envolvida em processos de neuroplasticidade sinaacuteptica) Estes processos podem
estar envonvidos em endofenoacutetipos da doenccedila 122 126 137-144
A nicotina parece melhorar a audiccedilatildeo em indiviacuteduos com deacuteficit auditoacuterio na
esquizofrenia associado ao α7 permitindo uma melhor filtragem dos estiacutemulos
auditivos estranhos A nicotina melhora a cogniccedilatildeo na esquizofrenia e agentes
alternativos que ativam o receptor nicotiacutenico foram testados e esses compostos
melhoraram a atenccedilatildeo a memoacuteria de trabalho e os sintomas negativos em um estudo
complementar de pacientes natildeo fumantes com esquizofrenia 145
Os estudos citados nos mostram grandes evidecircncias da associaccedilatildeo do α7 com
ND processos cognitivos e de resposta agrave vareniclina Esses achados podem explicar
nossos resultados em relaccedilatildeo agrave diminuiccedilatildeo da expressatildeo de 7 no grupo de pacientes
resistentes ao tratamento Os pacientes do grupo sucesso mantiveram os niacuteveis de
expressatildeo gecircnica em resposta agrave vareniclina jaacute no grupo resistente houve um
dowregulation Sugerimos que essa diminuiccedilatildeo pode ter sido a responsaacutevel ao menos
em parte pelos indiviacuteduos natildeo terem conseguido deixar de fumar A nicotina pode estar
79
compensando um deacuteficit de α7 que os indiviacuteduos resistentes podem apresentar No
entanto natildeo sabemos como seria a expressatildeo de α7 nestes indiviacuteduos na ausecircncia do
fumo
Quanto ao gene CHNRG natildeo haacute muitos resultados na literatura Este codifica
a subunidade γ dos receptores nicotiacutenicos A maioria dos estudos aponta associaccedilatildeo da
subunidade com distuacuterbios esqueleacutetico-musculares 146-149
No entanto King et al 65 encontraram a associaccedilatildeo de polimorfismos neste
gene com nausea no tratamento com vareniclina E Keskitalo-Vuokko 150 et al
encontraram associaccedilatildeo de SNPs em loci do cluster de genes CHRNGCHRND (genes
muitos proacuteximos o uacuteltimo codifica a subunidade delta dos nAChRs) com o niacutevel de
cotinina Saccone et al 151 encontraram a associaccedilatildeo de 4 loci no cluster
CHRNDCHRNG com ND Em outro estudo variantes nos genes CHRNDCHRNG
mostraram associaccedilatildeo modesta com o risco de ND em amostras de afro-americanos 152
Em um estudo o qual foi utilizado um modelo de esquizofrenia em ratos no
grupo de animais tratados com clozapina foi encontrado downregulation do Chrng no
nuacutecleo accumbens Neste mesmo estudo Santoro et al natildeo conseguiram formular uma
hipoacutetese para o achado devido ao lack de informaccedilotildees na literatura com o foco em ND
ou performance cognitiva 153
Haacute algumas limitaccedilotildees no estudo Primeira o ensaio da anaacutelise de expressatildeo
gecircnica foi realizado com amostras de sangue perifeacuterico e natildeo no SNC o que poderia nos
mostrar uma relaccedilatildeo mais clara e direta do faacutermaco com a via de resposta No entanto a
obtenccedilatildeo desta amostra eacute inviaacutevel Em contrapartida estudos jaacute demonstraram que haacute
similaridade entre a expressatildeo gecircnica de ceacutelulas do SNC e de ceacutelulas de sangue
perifeacuterico para alguns destes genes de receptores nicotiacutenicos 102 Segunda natildeo foi
realizado ensaio de expressatildeo gecircnica para amostras de indiviacuteduos natildeo fumantes o que
80
poderia fornecer mais paracircmetros de comparaccedilatildeo com os grupos resistente e sucesso
Terceira natildeo conseguimos qualidade necessaacuteria nas anaacutelises de genes potencialmente
importantes
62 Para os dados da mensuraccedilatildeo dos analitos
Um dos maiores desafios em anaacutelises de amostras bioloacutegicas eacute eliminar os
interferentes de sua matriz sem alterar substancialmente as quantidades dos analitos
presentes A matriz de amostras de soro e plasma satildeo complexas e envolve a presenccedila
de inuacutemeras macromoleacuteculas como lipiacutedios e proteiacutenas que obstruem colunas anaacuteliticas
diminuem o tempo de duraccedilatildeo de equipamentos e inviabilizam a interpretaccedilatildeo dos
dados devido a imensos picos e ruiacutedos formados nos cromatogramas e espectros de
massa Inumeros trabalhos executam uma preparaccedilatildeo preacutevia das amostras que envolve
processos como a extraccedilatildeo com uso de solventes preciptaccedilatildeo de proteiacutenas entre outros
os quais podem promover uma baixa recuperaccedilatildeo dos analitos tempo prolongado de
bancada e gasto de materiais 51 104-106
Devido agrave esse fato inuacutemeros estudos propuseram o uso de materiais de acesso
restrito (RAMs) para a purificaccedilatildeo da amostra sem tanto manuseio dentre eles estatildeo os
nanotubos de carbono (CNTs) modificados 109 110 114-116
O presente estudo desenvolveu uma coluna extratora composta por nanotubos
hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados quimicamente com a adiccedilatildeo de grupos
hidrofiacuteficos Essa coluna permitiu uma oacutetima exclusatildeo de macromoleacuteculas (98) A
aacutegua ultra pura foi o suficiente para ser utilizada como fase moacutevel de carregamento o
que eacute sustentaacutevel aleacutem de natildeo causar danos ao meio ambiente e o uacutenico preparo da
amostra foi uma diluiacuteccedilatildeo 11 tambeacutem em aacutegua O novo RAM desenvolvido foi
81
encaminhado para pedido de patente (Anexo 5) e portanto os processos para o seu
desenvolvimento foram mantidos em sigilo
Os CNTs possuem uma grande aacuterea superfiacutecial e oacutetima estabilidade em anaacutelise
de compostos no entanto o material natildeo promove a remoccedilatildeo de proteiacutenas com
eficiecircncia 110 115 Os poros dos CNTs formam uma barreira fiacutesica excluindo ou
permitindo a entrada de moleacuteculas por tamanho e os grupos hidrofiacutelicos adicionados ao
RAM desenvolvido natildeo permitem a ligaccedilatildeo de proteiacutenas de forma irreversiacutevel
formando uma barreira fiacutesico-quiacutemica Os demais CNTs natildeo modificados disponiacuteveis
natildeo promovem a exclusatildeo de macromoleacuteculas com tanta efetividade quanto o material
desenvolvido aleacutem disso o novo RAM apoacutes limpeza pode ser reutilizado cerca de 400
vezes (valor calculado durante os experimentos com amostras controle)
Quanto a otimizaccedilatildeo do meacutetodo de mensuraccedilatildeo a anaacutelise multidimensional
atraveacutes de equipamentos conectados por vaacutelvulas comutadoras promoveu a realizaccedilatildeo
da extraccedilatildeo eluiccedilatildeo anaacutelise limpeza e recondicionamento do sistema automaacuteticamente
A anaacutelise completa de uma amostra foi realizada em apenas 15 minutos O sistema
permitiu a mensuraccedilatildeo conjunta de diversos analitos com caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas
diferentes de uma mesma amostra mostrando bons sinais analiacuteticos e perfis
cromatograacuteficos
Quanto aos dados de validaccedilatildeo o meacutetodo permitiu uma oacutetima recuperaccedilatildeo dos
analitos com valores proacuteximos a 100 semelhante a outros estudos 104 117 154 155 A
maior dificuldade encontrada neste estudo foi a configuraccedilatildeo de paracircmetros
espectromeacutetricos e cromatograacuteficos que pudessem obter o maacuteximo de recuperaccedilatildeo e o
menor LQ possiacutevel para a anaacutelise de vareniclina ainda em um contexto de anaacutelise
multianalito
82
A dose posoloacutegica da vareniclina eacute muito baixa (1mg 2 vezes ao dia a partir do
8deg dia de tratamento) em comparaccedilatildeo com a da bupropiona (150 mg 2 vezes ao dia a
partir do 8deg dia de tratamento) dessa forma as concentraccedilotildees plasmaacuteticas de
vareniclina satildeo muito baixas Apesar do valor de LQ obtido (5 μg L-1) estar entre as
meacutedias plasmaacuteticas de intervalo terapecircutico (40 -70 μg L-1 de vareniclina em plasma e
soro) 51 118 ao mensurar amostras de pacientes em um cenaacuterio real de tratamento de 74
pacientes apenas 3 amostras apresentaram concentraccedilatildeo plasmaacutetica de vareniclina
abaixo do limite de quantificaccedilatildeo
Quanto a recuperaccedilatildeo do analito da matriz a vareniclina tambeacutem mostrou menor
taxa (883) em relaccedilatildeo aos outros analitos (valores proacuteximos ao 100) no entanto
essa taxa de recuperaccedilatildeo eacute considerada alta e foi semelhante ao estudo de Dobrinas et al
156 o qual realizou a extraccedilatildeo da amostra atraveacutes de coluna extratora de fase soacutelida
(SPE) disponiacutevel no mercado e a mensuraccedilatildeo tambeacutem foi realizada em um contexto
multianalito E ainda a recuperaccedilatildeo de vareniclina no presente estudo foi maior do que
a obtida pelo trabalho de Al-Haj et al 105 o qual realizou a preparaccedilatildeo preacutevia da amostra
por extraccedilatildeo liacutequido-liacutequido (LLE) e a mensuraccedilatildeo foi realizada para somente um
analito (4759 - 4872) e obteve recuperaccedilatildeo semelhante ao estudo de os qual
tambeacutem realizou a anaacutelise de vareniclina em um cenaacuterio multianalito (830 ndash 920)
Para nicotina e cotinina os valores de LQ obtidos no presente estudo (50 μg L-1)
se assemelham aos obtidos nos estudos de Abdallah et al 104 (70 μg L-1 para cotinina)
Onoue et al 157 (50 μg L-1 para nicotina e cotinina) Petersen et al 117 (50 μg L-1) Para
bupropiona e hidroxibupropiona o meacutetodo proposto eacute capaz de mensurar pequenas
quantidades do faacutermaco e de seu metaboacutelito (LQ 10 μg L-1 para ambos) quantidades
menores do que os LQs obtidos nos estudos de 158 (55 para bupropiona e 60 μgL para
83
hidroxibupropiona) e de 155 (100 μg L-1 para hidroxibupropiona) apesar das
concentraccedilotildees de metaboacutelitos em estado de equiliacutebrio em pacientes tratados com doses
terapecircuticas do faacutermaco serem bem maiores (45 ndash 75 μg L-1 e de 500 ndash 1500 μg L-1)
respectivamente para bupropiona e hidroxibupropiona 118
O Quadro 6 mostra os paracircmetros analiacuteticos do presente estudo comparados com
outros estudos presentes na literatura
Quanto agraves mensuraccedilotildees das amostras dos pacientes natildeo encontramos associaccedilatildeo
dos faacutermacos e seus metaboacutelitos com desfecho de tratamento Esse fato poderia ser
explicado pelo pequeno nuacutemero amostral do presente estudo
Encontramos diferenccedila significativa entre os grupos resistente e sucesso ao
tratamento quanto aos paracircmetros relacionados ao fumo e agrave DN Os pacientes do grupo
resistente tratados com vareniclina (ainda antes do iniacutecio do tratamento) fumavam um
maior nuacutemero de cigarrosdia em comparaccedilatildeo com os pacientes que obtiveram sucesso
O grupo resistente ao tratamento com bupropiona apresentou maior frequecircncia de
pacientes com alta DN (antes do tratamento) e de pacientes que fumavam no dia da
coleta em comparaccedilatildeo ao grupo sucesso Os dados tambeacutem mostraram que os pacientes
resistentes tratados com ambos os faacutermacos no dia da coleta apresentaram maiores
concentraccedilotildees dos metaboacutelitos da nicotina Esses dados podem indicar maior exposiccedilatildeo
ao fumo e maior DN podendo implicar na resposta ao tratamento antitabagismo
Haacute algumas limitaccedilotildees nesse estudo Primeira os pacientes natildeo fizeram exames
de funccedilatildeo hepaacutetica antes da inclusatildeo no entudo no entanto a presenccedila de comorbidades
hepaacuteticas foram questionadas Segunda natildeo podemos obter total rigor nos horaacuterios de
tomada dos medicamentos por parte dos pacientes no entanto os pacientes foram
84
orientados agrave tomar o medicamento sempre no mesmo horaacuterio e foram questionados
quanto ao cumprimento do protocolo Terceira o nuacutemero amostral para a anaacutelise dos
analitos e de NRM em estudos de associaccedilatildeo com desfecho de tratamento eacute considerado
modesto e consequentemente pode ter implicado nos resultados de natildeo associaccedilatildeo
85
Quadro 6 ndash Comparaccedilatildeo dos dados de validaccedilatildeo com outros estudos
Analitos Purificaccedilatildeo da
amostraextraccedilatildeo Meacutetodo Amostra Intervalo Linear (μg L-1) Recuperaccedilatildeo () LD μg L-1 LQ μg L-1 Referecircncia
Vareniclina
Bupropiona
Hidroxibupropiona
Nicotina
Cotinina
Hidroxicotinina
CS ndash SPE (novo
RAM) HPLC-MSMS Soro humano
50 ndash 1000
10 ndash 10000
10 ndash 20000
50 ndash 10000
50 ndash 10000
50 ndash 10000
883
1101
945
1098
941
1167
25
07
06
19
24
37
50
10
10
50
50
50
Presente
estudo
Nicotitna
Cotinina LLE (LCndashMSMS) Soro humano
03 ndash 525
70 ndash15000
978 ndash 1114
973 ndash1156 -
03
70
Abdalla et al 104
Bupropiona
Hidroxibupropiona PP + SPE online TFCndashMSMS) Soro humano 50 ndash 10000
1580
1160
13
45
55
60
Petrides et
al 158
Vareniclina LLE HPLCndashMSMS
(API) Plasma humano 01ndash100 4759 - 4872 005 01
Al-Haj et al 105
Vareniclina LLE HPLC-
APIMSMS
Plasma
Urina
01 - 500
10 ndash 5000 - -
lt01
100
Faessel et al 51
Nicotina
cotinina
trans-3 ndash
hidroxicotinina
vareniclina
SPE (Oasis MCX 10
mg 96-well extraction
plate)
UPLCndashMSMS
Soro humano
100 ndash 5000
100 ndash 5000
100 - 5000
100 ndash 2500
860 ndash 940
700 ndash 870
490 ndash 540
830 ndash 920
-
20
10
20
10
Dobrinas et
al 156
86
Nicotina
Cotinina Centrifugaccedilatildeo
Diluiccedilatildeo
isotoacutepica estaacutevel
ndash UPLC-
MSMS
Urina 50 ndash 350000 968ndash1051
943ndash992
07
04
17
11
Kuhn et al 154
Nicotina e Cotinina LLE PP SPE
(UPLC-
MSMS)
Sangue urina e
outros tecidos de
rato
100 ndash 6000 (plasma)
80 (nicotina e
cotininacom
precipitaccedilatildeo)
25 50 Onoue et al
157
Cotinina LL SPE (coluna
Zorbaxs XDB C8) HPLCUV Soro e urina 50 ndash 5000 978 ndash 102 018 50
Petersen et
al 117
hidroxibupropiona PP + SPE online RP‐HPLCUV Plasma humano 1000 - 25000 6118 1000 1000
Scherf-
Clavel et al 155
CS ndash SPE= Extraccedilatildeo em fase soacutelida no modo column switching LLE= extraccedilatildeo liacutequido-liacutequido PP=precipitaccedilatildeo de proteiacutenas SPE=extraccedilatildeo em fase soacutelida HPLC= cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia
UPLC=cromatografia liacutequida de ultra eficiecircncia RP‐HPLC=Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia em fase reversa TFC=Cromatografia liacutequida turbulenta API=ionizaccedilatildeo em pressatildeo atmosfeacutericaUV=
detector ultravioleta MSMS= espectometria de massas em tandem
87
7 CONCLUSOtildeES
Para a anaacutelise da expressatildeo gecircnica este estudo exploratoacuterio mostra a associaccedilatildeo
das subunidades α7 e γ com a efetividade do tratamento com vareniclina Estes
resultados poderiam contribuir ao menos em parte para o desenvolvimento de uma
terapecircutica individualizada
Para a mensuraccedilatildeo de analitos o novo RAM sintetizado eacute um produto de
extremo valor cientiacutefico podendo apresentar diversas aplicaccedilotildees em anaacutelise de amostras
de matrizes complexas sem muita preparaccedilatildeo preacutevia Para a associaccedilatildeo das
concentraccedilotildees dos faacutermacos e seus metaboacutelitos com o desfecho de tratamento satildeo
necessaacuterios estudos com um maior nuacutemero amostral
88
8 SUGESTOtildeES PARA ESTUDOS FUTUROS
Sugerimos estudos que promovam maior entendimento das subunidades α7 e γ
dos nAChRs nos processos de dependecircncia agrave nicotina e no tratamento com vareniclina
Sugerimos tambeacutem estudos de investigaccedilatildeo para novas aplicabilidades do novo RAM
desenvolvido
89
9 REFEREcircNCIAS
1 WHO Tobacco WHO Media Centre 2015
2 Oliveira AF Valente JG Leite IC [Aspects of tobacco attributable mortality
systematic review] Rev Saude Publica 200842(2)335-345
3 Koshiaris C Aveyard P Oke J Ryan R Szatkowski L Stevens R Farley A
Smoking cessation and survival in lung upper aero-digestive tract and bladder
cancer cohort study Br J Cancer 2017117(8)1224-1232
4 Leppanen T Toyras J Mervaala E Penzel T Kulkas A Severity of individual
obstruction events increases with age in patients with obstructive sleep apnea
Sleep Med 20173732-37
5 Cerda J Bambs C Vera C Infant morbidity and mortality attributable to
prenatal smoking in Chile Rev Panam Salud Publica 201741e106
6 Vigitel Brasil - Vigilacircncia de fatores de risco e proteccedilatildeo para doenccedilas crocircnicas
por inqueacuterito telefocircnico Estimativas sobre frequecircncia e distribuiccedilatildeo
sociodemograacutefica de fatores de risco e proteccedilatildeo para doenccedilas crocircnicas nas
capitais dos 26 estados brasileiros e no Distrito Federal em 2018 Brasiacutelia 2019
7 Rosemberg J Nicotina Droga Universal Instituto Nacional de Cacircncer
(wwwincagovbr) 2004
8 Kirchenchtein C Chatkin JM Dependecircncia da Nicotina In Diretrizes para
Cessaccedilatildeo do Tabagismo Jornal Brasileiro de Pneumologia Brasiacutelia DF 2004
9 Fagerstoumlm K Uma breve apresentaccedilatildeo da neurofarmacologia e fisiologia da
dependecircncia agrave nicotina In Gigliotti AP Presman S (Eds) Atualizaccedilatildeo no
Tratamento do Tabagismo ABP Sauacutede 2006
10 Gigliotti A Lemos T Quais satildeo os mecanismos da dependecircncia de nicotina
In Manual de Condutas e Praacuteticas em Tabagismo Sociedade Brasileira de
Pneumologia e Tisiologia 2012
11 Divisatildeo de Controle do Tabagismo Coordenaccedilatildeo de Accedilotildees Estrateacutegicas
Instituto Nacional de Cacircncer Silva AG Ministeacuterio da Sauacutede Protocolo cliacutenico
e diretrizes terapecircuticas dependecircncia agrave nicotina 2013
12 Schultz W Multiple reward signals in the brain Nat Rev Neurosci
20001(3)199-207
13 Stolerman IP Jarvis MJ The scientific case that nicotine is addictive
Psychopharmacology (Berl) 1995117(1)2-10 discussion 14-20
90
14 Koob GF Volkow ND Neurocircuitry of addiction Neuropsychopharmacology
200935(1)217-238
15 Martin-Soelch C Neuroadaptive changes associated with smoking structural
and functional neural changes in nicotine dependence Brain Sci 20133(1)159-
176
16 Boening JA Neurobiology of an addiction memory J Neural Transm (Vienna)
2001108(6)755-765
17 Robbins TW Everitt BJ Limbic-striatal memory systems and drug addiction
Neurobiol Learn Mem 200278(3)625-636
18 Everitt BJ Belin D Economidou D Pelloux Y Dalley JW Robbins TW
Review Neural mechanisms underlying the vulnerability to develop compulsive
drug-seeking habits and addiction Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci
2008363(1507)3125-3135
19 Fuentes RM Notkola IL Shemeikka S Tuomilehto J Nissinen A Familial
aggregation of blood pressure a population-based family study in eastern
Finland J Hum Hypertens 200014(7)441-445
20 Gotti C Zoli M Clementi F Brain nicotinic acetylcholine receptors native
subtypes and their relevance Trends Pharmacol Sci 200627(9)482-491
21 Benowitz NL Pharmacology of nicotine addiction smoking-induced disease
and therapeutics Annu Rev Pharmacol Toxicol 20094957-71
22 Benowitz NL Clinical pharmacology of inhaled drugs of abuse implications in
understanding nicotine dependence NIDA Res Monogr 19909912-29
23 Picciotto MR Zoli M Rimondini R Lena C Marubio LM Pich EM Fuxe K
Changeux JP Acetylcholine receptors containing the beta2 subunit are involved
in the reinforcing properties of nicotine Nature 1998391(6663)173-177
24 Maskos U Molles BE Pons S Besson M Guiard BP Guilloux JP Evrard A
Cazala P Cormier A Mameli-Engvall M Dufour N Cloez-Tayarani I
Bemelmans AP Mallet J Gardier AM David V Faure P Granon S Changeux
JP Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of
nicotinic receptors Nature 2005436(7047)103-107
25 Tapper AR McKinney SL Nashmi R Schwarz J Deshpande P Labarca C
Whiteaker P Marks MJ Collins AC Lester HA Nicotine activation of alpha4
receptors sufficient for reward tolerance and sensitization Science
2004306(5698)1029-1032
26 Aberger K Chitravanshi VC Sapru HN Cardiovascular responses to
microinjections of nicotine into the caudal ventrolateral medulla of the rat Brain
Res 2001892(1)138-146
91
27 Levin ED Bettegowda C Blosser J Gordon J AR-R17779 and alpha7
nicotinic agonist improves learning and memory in rats Behav Pharmacol
199910(6-7)675-680
28 Hajos M Hurst RS Hoffmann WE Krause M Wall TM Higdon NR Groppi
VE The selective alpha7 nicotinic acetylcholine receptor agonist PNU-282987
[N-[(3R)-1-Azabicyclo[222]oct-3-yl]-4-chlorobenzamide hydrochloride]
enhances GABAergic synaptic activity in brain slices and restores auditory
gating deficits in anesthetized rats J Pharmacol Exp Ther 2005312(3)1213-
1222
29 Salas R Orr-Urtreger A Broide RS Beaudet A Paylor R De Biasi M The
nicotinic acetylcholine receptor subunit alpha 5 mediates short-term effects of
nicotine in vivo Mol Pharmacol 200363(5)1059-1066
30 Henningfield JE Stapleton JM Benowitz NL Grayson RF London ED Higher
levels of nicotine in arterial than in venous blood after cigarette smoking Drug
Alcohol Depend 199333(1)23-29
31 Hukkanen J Jacob P 3rd Benowitz NL Metabolism and disposition kinetics of
nicotine Pharmacol Rev 200557(1)79-115
32 Dempsey D Tutka P Jacob P 3rd Allen F Schoedel K Tyndale RF Benowitz
NL Nicotine metabolite ratio as an index of cytochrome P450 2A6 metabolic
activity Clin Pharmacol Ther 200476(1)64-72
33 Allenby CE Boylan KA Lerman C Falcone M Precision Medicine for
Tobacco Dependence Development and Validation of the Nicotine Metabolite
Ratio J Neuroimmune Pharmacol 201611(3)471-483
34 Llaquet H Pichini S Joya X Papaseit E Vall O Klein J Garcia-Algar O
Biological matrices for the evaluation of exposure to environmental tobacco
smoke during prenatal life and childhood Anal Bioanal Chem 2010396(1)379-
399
35 Reichert J AA Gonccedilalves CMC Godoy I Chatkin JM Sales MPU et al
Diretrizes da Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisologia Diretrizes para
cessaccedilatildeo do tabagismo ndash 2008 J Bras Pneumol 200834(10)845-880
36 Fiore MC Jaeacuten C R Baker TB Treating tobacco use and dependence 2008
update Clinical Practice Guideline In services USDohah ed Public Health
Service Rockville (md) 2008
37 Kassem MG Al Hossaini AM Varenicline Profiles Drug Subst Excip Relat
Methodol 201237389-411
38 Zoli M Lena C Picciotto MR Changeux JP Identification of four classes of
brain nicotinic receptors using beta2 mutant mice J Neurosci
199818(12)4461-4472
92
39 Hogg RC Raggenbass M Bertrand D Nicotinic acetylcholine receptors from
structure to brain function Rev Physiol Biochem Pharmacol 20031471-46
40 Mihalak KB Carroll FI Luetje CW Varenicline is a partial agonist at
alpha4beta2 and a full agonist at alpha7 neuronal nicotinic receptors Mol
Pharmacol 200670(3)801-805
41 Swan GE Javitz HS Jack LM Wessel J Michel M Hinds DA Stokowksi RP
McClure JB Catz SL Richards J Zbikowski SM Deprey M McAfee T Conti
DV Bergen AW Varenicline for smoking cessation nausea severity and
variation in nicotinic receptor genes Pharmacogenomics J 201212(4)349-358
42 Kaur K Kaushal S Chopra SC Varenicline for smoking cessation A review of
the literature Curr Ther Res Clin Exp 200970(1)35-54
43 Catz SL Jack LM McClure JB Javitz HS Deprey M Zbikowski SM McAfee
T Richards J Swan GE Adherence to varenicline in the COMPASS smoking
cessation intervention trial Nicotine Tob Res 201113(5)361-368
44 Faessel HM Burstein AH Troutman MD Willavize SA Rohrbacher KD Clark
DJ Lack of a pharmacokinetic interaction between a new smoking cessation
therapy varenicline and digoxin in adult smokers Eur J Clin Pharmacol
200864(11)1101-1109
45 Mohanasundaram UM Chitkara R Krishna G Smoking cessation therapy with
varenicline Int J Chron Obstruct Pulmon Dis 20083(2)239-251
46 Faessel HM Smith BJ Gibbs MA Gobey JS Clark DJ Burstein AH Single-
dose pharmacokinetics of varenicline a selective nicotinic receptor partial
agonist in healthy smokers and nonsmokers J Clin Pharmacol 200646(9)991-
998
47 Faessel HM Obach RS Rollema H Ravva P Williams KE Burstein AH A
review of the clinical pharmacokinetics and pharmacodynamics of varenicline
for smoking cessation Clin Pharmacokinet 201049(12)799-816
48 Ravva P Gastonguay MR Tensfeldt TG Faessel HM Population
pharmacokinetic analysis of varenicline in adult smokers Br J Clin Pharmacol
200968(5)669-681
49 Obach RS Reed-Hagen AE Krueger SS Obach BJ OConnell TN Zandi KS
Miller S Coe JW Metabolism and disposition of varenicline a selective
alpha4beta2 acetylcholine receptor partial agonist in vivo and in vitro Drug
Metab Dispos 200634(1)121-130
50 Feng B Obach RS Burstein AH Clark DJ de Morais SM Faessel HM Effect
of human renal cationic transporter inhibition on the pharmacokinetics of
varenicline a new therapy for smoking cessation an in vitro-in vivo study Clin
Pharmacol Ther 200883(4)567-576
93
51 Faessel HM Gibbs MA Clark DJ Rohrbacher K Stolar M Burstein AH
Multiple-dose pharmacokinetics of the selective nicotinic receptor partial
agonist varenicline in healthy smokers J Clin Pharmacol 200646(12)1439-
1448
52 Slemmer JE Martin BR Damaj MI Bupropion is a nicotinic antagonist J
Pharmacol Exp Ther 2000295(1)321-327
53 Hughes JR Stead LF Lancaster T Antidepressants for smoking cessation
Cochrane Database Syst Rev 2007(1)CD000031
54 Goodnick PJ Pharmacokinetics of second generation antidepressants
bupropion Psychopharmacol Bull 199127(4)513-519
55 Hesse LM Venkatakrishnan K Court MH von Moltke LL Duan SX Shader
RI Greenblatt DJ CYP2B6 mediates the in vitro hydroxylation of bupropion
potential drug interactions with other antidepressants Drug Metab Dispos
200028(10)1176-1183
56 Faucette SR Hawke RL Lecluyse EL Shord SS Yan B Laethem RM Lindley
CM Validation of bupropion hydroxylation as a selective marker of human
cytochrome P450 2B6 catalytic activity Drug Metab Dispos 200028(10)1222-
1230
57 Walsky RL Astuccio AV Obach RS Evaluation of 227 drugs for in vitro
inhibition of cytochrome P450 2B6 J Clin Pharmacol 200646(12)1426-1438
58 Walsky RL Obach RS A comparison of 2-phenyl-2-(1-piperidinyl)propane
(ppp) 111-phosphinothioylidynetrisaziridine (thioTEPA) clopidogrel and
ticlopidine as selective inactivators of human cytochrome P450 2B6 Drug
Metab Dispos 200735(11)2053-2059
59 Quaak M van Schooten FJ van Schayck CP Pharmacogenetics of smoking
how far to the clinic Pharmacogenomics 201415(6)723-726
60 Swan GE Lessov-Schlaggar CN Tobacco addiction and pharmacogenetics of
nicotine metabolism J Neurogenet 200923(3)262-271
61 Tomaz PRX Kajita MS Santos JR Scholz J Abe TO Gaya PV Krieger JE
Pereira AC Santos P Cytochrome P450 2A6 and 2B6 polymorphisms and
smoking cessation success in patients treated with varenicline Eur J Clin
Pharmacol201975(11)1541-1545
62 Tomaz PRX Santos JR Scholz J Abe TO Gaya PV Negrao AB Krieger JE
Pereira AC Santos P Cholinergic receptor nicotinic alpha 5 subunit
polymorphisms are associated with smoking cessation success in women BMC
Med Genet201819(1)55
94
63 Scholz J Santos PC Buzo CG Lopes NH Abe TO Gaya PV Pierri H Amorim
C Pereira AC Effects of aging on the effectiveness of smoking cessation
medication Oncotarget 20167(21)30032-30036
64 Issa JS Santos PC Vieira LP Abe TO Kuperszmidt CS Nakasato M Cardoso
E Amorim C Pereira AC Smoking cessation and weight gain in patients with
cardiovascular disease or risk factor Int J Cardiol 2014172(2)485-487
65 King DP Paciga S Pickering E Benowitz NL Bierut LJ Conti DV Kaprio J
Lerman C Park PW Smoking cessation pharmacogenetics analysis of
varenicline and bupropion in placebo-controlled clinical trials
Neuropsychopharmacology 201237(3)641-650
66 Saccone NL Baurley JW Bergen AW David SP Elliott HR Foreman MG
Kaprio J Piasecki TM Relton CL Zawertailo L Bierut LJ Tyndale RF Chen
LS The Value of Biosamples in Smoking Cessation Trials A Review of
Genetic Metabolomic and Epigenetic Findings Nicotine Tob Res
201820(4)403-413
67 Rocha Santos J Tomaz PR Issa JS Abe TO Krieger JE Pereira AC Santos
PC CHRNA4 rs1044396 is associated with smoking cessation in varenicline
therapy Front Genet 2015646
68 Tomaz PR Santos JR Issa JS Abe TO Gaya PV Krieger JE Pereira AC
Santos PC CYP2B6 rs2279343 polymorphism is associated with smoking
cessation success in bupropion therapy Eur J Clin Pharmacol 2015
71(9)1067-73
69 David SP Brown RA Papandonatos GD Kahler CW Lloyd-Richardson EE
Munafo MR Shields PG Lerman C Strong D McCaffery J Niaura R
Pharmacogenetic clinical trial of sustained-release bupropion for smoking
cessation Nicotine Tob Res 20079(8)821-833
70 Lerman C Shields PG Wileyto EP Audrain J Pinto A Hawk L Krishnan S
Niaura R Epstein L Pharmacogenetic investigation of smoking cessation
treatment Pharmacogenetics 200212(8)627-634
71 Han DH Joe KH Na C Lee YS Effect of genetic polymorphisms on smoking
cessation a trial of bupropion in Korean male smokers Psychiatr Genet
200818(1)11-16
72 Zanger UM Klein K Pharmacogenetics of cytochrome P450 2B6 (CYP2B6)
advances on polymorphisms mechanisms and clinical relevance Front Genet
2013424
73 Zhu AZ Cox LS Nollen N Faseru B Okuyemi KS Ahluwalia JS Benowitz
NL Tyndale RF CYP2B6 and bupropions smoking-cessation pharmacology
the role of hydroxybupropion Clin Pharmacol Ther 201292(6)771-777
95
74 Laib AK Brunen S Pfeifer P Vincent P Hiemke C Serum concentrations of
hydroxybupropion for dose optimization of depressed patients treated with
bupropion Ther Drug Monit 201436(4)473-479
75 Hutchison KE Allen DL Filbey FM Jepson C Lerman C Benowitz NL Stitzel
J Bryan A McGeary J Haughey HM CHRNA4 and tobacco dependence from
gene regulation to treatment outcome Arch Gen Psychiatry 200764(9)1078-
1086
76 Smith RC Zhubi A Maloku E Sershen H Lajtha A Davis JM Costa E
Guidotti A Varenicline treatment decreases DNMT1 mRNA expression in
lymphocytes of schizophrenic patients who are cigarette smokers Schizophr
Res 2010119(1-3)269-270
77 Marks MJ ONeill HC Wynalda-Camozzi KM Ortiz NC Simmons EE Short
CA Butt CM McIntosh JM Grady SR Chronic treatment with varenicline
changes expression of four nAChR binding sites in mice Neuropharmacology
201599142-155
78 Middleton FA Pato CN Gentile KL McGann L Brown AM Trauzzi M Diab
H Morley CP Medeiros H Macedo A Azevedo MH Pato MT Gene
expression analysis of peripheral blood leukocytes from discordant sib-pairs
with schizophrenia and bipolar disorder reveals points of convergence between
genetic and functional genomic approaches Am J Med Genet B Neuropsychiatr
Genet 2005136B(1)12-25
79 Takahashi M Hayashi H Watanabe Y Sawamura K Fukui N Watanabe J
Kitajima T Yamanouchi Y Iwata N Mizukami K Hori T Shimoda K Ujike H
Ozaki N Iijima K Takemura K Aoshima H Someya T Diagnostic
classification of schizophrenia by neural network analysis of blood-based gene
expression signatures Schizophr Res 2010119(1-3)210-218
80 Lee J Goh LK Chen G Verma S Tan CH Lee TS Analysis of blood-based
gene expression signature in first-episode psychosis Psychiatry Res
2012200(1)52-54
81 Sullivan PF Fan C Perou CM Evaluating the comparability of gene expression
in blood and brain Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet
2006141B(3)261-268
82 Hennings JM Uhr M Klengel T Weber P Putz B Touma C Czamara D Ising
M Holsboer F Lucae S RNA expression profiling in depressed patients
suggests retinoid-related orphan receptor alpha as a biomarker for antidepressant
response Transl Psychiatry 20155e538
83 Ota VK Noto C Gadelha A Santoro ML Silva PN Melaragno MI Smith Mde
A Cordeiro Q Bressan RA Belangero SI Neurotransmitter receptor and
regulatory gene expression in peripheral blood of Brazilian drug-naive first-
96
episode psychosis patients before and after antipsychotic treatment Psychiatry
Res2013210(3)1290-1292
84 Kordi-Tamandani DM Tajoddini S Salimi F Promoter Methylation and BDNF
and DAT1 Gene Expression Profiles in Patients with Drug Addiction
Pathobiology 201582(2)94-99
85 Wongsriraksa A Parsons ME Whelan CJ Characterisation of nicotine receptors
on human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) Inflamm Res
200958(1)38-44
86 Kawashima K Fujii T Expression of non-neuronal acetylcholine in
lymphocytes and its contribution to the regulation of immune function Front
Biosci 200492063-2085
87 St-Pierre S Jiang W Roy P Champigny C LeBlanc E Morley BJ Hao J
Simard AR Nicotinic Acetylcholine Receptors Modulate Bone Marrow-Derived
Pro-Inflammatory Monocyte Production and Survival PLoS One
201611(2)e0150230
88 Zdanowski R Krzyzowska M Ujazdowska D Lewicka A Lewicki S Role of
alpha7 nicotinic receptor in the immune system and intracellular signaling
pathways Cent Eur J Immunol 201540(3)373-379
89 Baez-Pagan CA Delgado-Velez M Lasalde-Dominicci JA Activation of the
Macrophage alpha7 Nicotinic Acetylcholine Receptor and Control of
Inflammation J Neuroimmune Pharmacol 201510(3)468-476
90 Kalkman HO Feuerbach D Modulatory effects of alpha7 nAChRs on the
immune system and its relevance for CNS disorders Cell Mol Life Sci
201673(13)2511-2530
91 Zakrzewicz A Richter K Agne A Wilker S Siebers K Fink B Krasteva-Christ
G Althaus M Padberg W Hone AJ McIntosh JM Grau V Canonical and
Novel Non-Canonical Cholinergic Agonists Inhibit ATP-Induced Release of
Monocytic Interleukin-1beta via Different Combinations of Nicotinic
Acetylcholine Receptor Subunits alpha7 alpha9 and alpha10 Front Cell
Neurosci201711189
92 Arreola R Alvarez-Herrera S Perez-Sanchez G Becerril-Villanueva E Cruz-
Fuentes C Flores-Gutierrez EO Garces-Alvarez ME de la Cruz-Aguilera DL
Medina-Rivero E Hurtado-Alvarado G Quintero-Fabian S Pavon L
Immunomodulatory Effects Mediated by Dopamine J Immunol
Res20163160486
93 Nakajima M Yamamoto T Nunoya K Yokoi T Nagashima K Inoue K Funae
Y Shimada N Kamataki T Kuroiwa Y Role of human cytochrome P4502A6 in
C-oxidation of nicotine Drug Metab Dispos 199624(11)1212-1217
97
94 Messina ES Tyndale RF Sellers EM A major role for CYP2A6 in nicotine C-
oxidation by human liver microsomes J Pharmacol Exp Ther
1997282(3)1608-1614
95 Chen A Krebs NM Zhu J Muscat JE Nicotine metabolite ratio predicts
smoking topography The Pennsylvania Adult Smoking Study Drug Alcohol
Depend201819089-93
96 Shahab L BL McNeill Tyndale RF Does the nicotine metabolite ratio
moderate smoking cessation treatment outcomes in real-world settings A
prospective study Addiction 2019114(2)304-314 doi 101111add14450
97 Lea RA Dickson S Benowitz NL Within-subject variation of the salivary
3HCCOT ratio in regular daily smokers prospects for estimating CYP2A6
enzyme activity in large-scale surveys of nicotine metabolic rate J Anal Toxicol
200630(6)386-389
98 Mooney ME Li ZZ Murphy SE Pentel PR Le C Hatsukami DK Stability of
the nicotine metabolite ratio in ad libitum and reducing smokers Cancer
Epidemiol Biomarkers Prev 200817(6)1396-1400
99 Piestansky J Marakova K Veizerova L Galba J Mikus P On-line column
coupled isotachophoresis-capillary zone electrophoresis hyphenated with
tandem mass spectrometry in drug analysis varenicline and its metabolite in
human urine Anal Chim Acta 201482684-93
100 Fagerstrom KO Heatherton TF Kozlowski LT Nicotine addiction and its
assessment Ear Nose Throat J 199069(11)763-765
101 Issa JS A new nicotine dependence score and a new scale assessing patient
comfort during smoking cessation treatment J Bras Pneumol 201238(6)761-
765
102 Mexal S Berger R Logel J Ross RG Freedman R Leonard S Differential
regulation of alpha7 nicotinic receptor gene (CHRNA7) expression in
schizophrenic smokers J Mol Neurosci 201040(1-2)185-195
103 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-
time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods
200125(4)402-408
104 Abdallah IA Hammell DC Stinchcomb AL Hassan HE A fully validated LC-
MSMS method for simultaneous determination of nicotine and its metabolite
cotinine in human serum and its application to a pharmacokinetic study after
using nicotine transdermal delivery systems with standard heat application in
adult smokers J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2016102067-
77
98
105 Al-Haj A Alawi M Arafat T Hourani MK Method development validation
and bioequivalence of varenicline in human plasma by liquid chromatography
tandem mass spectrometry J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci
2013931134-139
106 Hegstad S Stray-Pedersen A Olsen L Vege A Rognum TO Morland J
Christophersen AS Determination of cotinine in pericardial fluid and whole
blood by liquid chromatography-tandem mass spectrometry J Anal Toxicol
200933(4)218-222
107 Santos MG Moraes Gde O Nakamura MG dos Santos-Neto AJ Figueiredo
EC Restricted access molecularly imprinted polymers obtained by bovine serum
albumin andor hydrophilic monomers external layers a comparison related to
physical and chemical properties Analyst 2015140(22)7768-7775
108 de Lima MM Vieira AC Martins I Boralli VB Borges KB Figueiredo EC
On-line restricted access molecularly imprinted solid phase extraction of
ivermectin in meat samples followed by HPLC-UV analysis Food Chem
2015197(Pt A)7-13
109 Barbosa AF Barbosa VM Bettini J Luccas PO Figueiredo EC Restricted
access carbon nanotubes for direct extraction of cadmium from human serum
samples followed by atomic absorption spectrometry analysis Talanta
2016131213-220
110 de Faria HD Abrao LC Santos MG Barbosa AF Figueiredo EC New
advances in restricted access materials for sample preparation A review Anal
Chim Acta 201795943-65
111 FRANQUI L S et al Synthesis and characterization of a magnetic molecularly
imprinted polymer for the selective extraction of nicotine and cotinine from
urine samples followed by GC-MS analysis Anal Methods 2015 7(21) 9237ndash
9244 2015
112 Santos MG Tavares IM Barbosa AF Bettini J Figueiredo EC Analysis of
tricyclic antidepressants in human plasma using online-restricted access
molecularly imprinted solid phase extraction followed by direct mass
spectrometry identificationquantification Talanta 20171638-16
113 US Department of Health and Human Services Food and Drug Administration
(FDA) Center for Drug Evaluation and Research (CDER)Center for Veterinary
Medicine (CVM) Guidance for IndustryBioanalytical method validation
Biopharmaceutics 2013
114 GOMES Raphael A B et al Evaluation of the pH influence on protein
exclusion by restricted access carbono nanotubes coated with bovine serum
albumin Journal Of Materials Science 2016 51(16)7407-7414
99
115 de Faria HD Rosa MA Silveira AT Figueiredo EC Direct extraction of
tetracyclines from bovine milk using restricted access carbon nanotubes in a
column switching liquid chromatography system Food Chem 201722598-106
116 de Faria HD Bueno CT Krieger JE Krieger EM Pereira AC Santos P
Figueiredo EC Online extraction of antihypertensive drugs and their metabolites
from untreated human serum samples using restricted access carbon nanotubes
in a column switching liquid chromatography system J Chromatogr A
2017152841-52
117 Petersen GO Leite CE Chatkin JM Thiesen FV Cotinine as a biomarker of
tobacco exposure development of a HPLC method and comparison of matrices
J Sep Sci 201033(4-5)516-521
118 Brunen S Vincent PD Baumann P Hiemke C Havemann-Reinecke U
Therapeutic drug monitoring for drugs used in the treatment of substance-related
disorders literature review using a therapeutic drug monitoring appropriateness
rating scale Ther Drug Monit 201133(5)561-572
119 Ryan RE Loiacono RE Nicotine regulates alpha7 nicotinic receptor subunit
mRNA implications for nicotine dependence Neuroreport 200112(3)569-
572
120 Cameli C Bacchelli E De Paola M Giucastro G Cifiello S Collo G Cainazzo
MM Pini LA Maestrini E Zoli M Genetic variation in CHRNA7 and
CHRFAM7A is associated with nicotine dependence and response to varenicline
treatment Eur J Hum Genet 201826(12)1824-1831
121 Wallace TL Bertrand D Importance of the nicotinic acetylcholine receptor
system in the prefrontal cortex Biochem Pharmacol 201385(12)1713-1720
122 Dempster EL Toulopoulou T McDonald C Bramon E Walshe M Wickham H
Sham PC Murray RM Collier DA Episodic memory performance predicted by
the 2bp deletion in exon 6 of the alpha 7-like nicotinic receptor subunit gene
Am J Psychiatry 2006163(10)1832-1834
123 Enioutina EY Myers EJ Tvrdik P Hoidal JR Rogers SW Gahring LC The
nicotinic receptor Alpha7 impacts the mouse lung response to LPS through
multiple mechanisms PLoS One 201510(3)e0121128
124 Sinkus ML Graw S Freedman R Ross RG Lester HA Leonard S The human
CHRNA7 and CHRFAM7A genes A review of the genetics regulation and
function Neuropharmacology 201596(Pt B)274-288
125 Gault J Robinson M Berger R Drebing C Logel J Hopkins J Moore T Jacobs
S Meriwether J Choi MJ Kim EJ Walton K Buiting K Davis A Breese C
Freedman R Leonard S Genomic organization and partial duplication of the
human alpha7 neuronal nicotinic acetylcholine receptor gene (CHRNA7)
Genomics 199852(2)173-185
100
126 Riley B Williamson M Collier D Wilkie H Makoff A A 3-Mb map of a large
Segmental duplication overlapping the alpha7-nicotinic acetylcholine receptor
gene (CHRNA7) at human 15q13-q14 Genomics 200279(2)197-209
127 Benhammou K Lee M Strook M Sullivan B Logel J Raschen K Gotti C
Leonard S [(3)H]Nicotine binding in peripheral blood cells of smokers is
correlated with the number of cigarettes smoked per day Neuropharmacology
200039(13)2818-2829
128 Kunii Y Zhang W Xu Q Hyde TM McFadden W Shin JH Deep-Soboslay A
Ye T Li C Kleinman JE Wang KH Lipska BK CHRNA7 and CHRFAM7A
mRNAs co-localized and their expression levels altered in the postmortem
dorsolateral prefrontal cortex in major psychiatric disorders Am J Psychiatry
2015172(11)1122-1130
129 Breese CR Lee MJ Adams CE Sullivan B Logel J Gillen KM Marks MJ
Collins AC Leonard S Abnormal regulation of high affinity nicotinic receptors
in subjects with schizophrenia Neuropsychopharmacology 200023(4)351-
364
130 Freedman R Hall M Adler LE Leonard S Evidence in postmortem brain tissue
for decreased numbers of hippocampal nicotinic receptors in schizophrenia Biol
Psychiatry 199538(1)22-33
131 Guan ZZ Zhang X Blennow K Nordberg A Decreased protein level of
nicotinic receptor alpha7 subunit in the frontal cortex from schizophrenic brain
Neuroreport 199910(8)1779-1782
132 Martin-Ruiz CM Haroutunian VH Long P Young AH Davis KL Perry EK
Court JA Dementia rating and nicotinic receptor expression in the prefrontal
cortex in schizophrenia Biol Psychiatry 200354(11)1222-1233
133 Marutle A Zhang X Court J Piggott M Johnson M Perry R Perry E
Nordberg A Laminar distribution of nicotinic receptor subtypes in cortical
regions in schizophrenia J Chem Neuroanat 200122(1-2)115-126
134 Leonard S Breese C Adams C Benhammou K Gault J Stevens K Lee M
Adler L Olincy A Ross R Freedman R Smoking and schizophrenia abnormal
nicotinic receptor expression Eur J Pharmacol 2000393(1-3)237-242
135 Kumari V Postma P Nicotine use in schizophrenia the self medication
hypotheses Neurosci Biobehav Rev 200529(6)1021-1034
136 de Leon J Diaz FJ A meta-analysis of worldwide studies demonstrates an
association between schizophrenia and tobacco smoking behaviors Schizophr
Res 200576(2-3)135-157
101
137 Flomen RH Collier DA Osborne S Munro J Breen G St Clair D Makoff AJ
Association study of CHRFAM7A copy number and 2 bp deletion
polymorphisms with schizophrenia and bipolar affective disorder Am J Med
Genet B Neuropsychiatr Genet 2006141B(6)571-575
138 Gault J Hopkins J Berger R Drebing C Logel J Walton C Short M Vianzon
R Olincy A Ross RG Adler LE Freedman R Leonard S Comparison of
polymorphisms in the alpha7 nicotinic receptor gene and its partial duplication
in schizophrenic and control subjects Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet
2003123B(1)39-49
139 Perl O Strous RD Dranikov A Chen R Fuchs S Low levels of alpha7-
nicotinic acetylcholine receptor mRNA on peripheral blood lymphocytes in
schizophrenia and its association with illness severity Neuropsychobiology
200653(2)88-93
140 Raux G Bonnet-Brilhault F Louchart S Houy E Gantier R Levillain D Allio
G Haouzir S Petit M Martinez M Frebourg T Thibaut F Campion D The -2
bp deletion in exon 6 of the alpha 7-like nicotinic receptor subunit gene is a risk
factor for the P50 sensory gating deficit Mol Psychiatry 20027(9)1006-1011
141 Leonard S Gault J Hopkins J Logel J Vianzon R Short M Drebing C Berger
R Venn D Sirota P Zerbe G Olincy A Ross RG Adler LE Freedman R
Association of promoter variants in the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor
subunit gene with an inhibitory deficit found in schizophrenia Arch Gen
Psychiatry 200259(12)1085-1096
142 Mathew SV Law AJ Lipska BK Davila-Garcia MI Zamora ED Mitkus SN
Vakkalanka R Straub RE Weinberger DR Kleinman JE Hyde TM Alpha7
nicotinic acetylcholine receptor mRNA expression and binding in postmortem
human brain are associated with genetic variation in neuregulin 1 Hum Mol
Genet 200716(23)2921-2932
143 Severance EG Yolken RH Novel alpha7 nicotinic receptor isoforms and
deficient cholinergic transcription in schizophrenia Genes Brain Behav
20087(1)37-45
144 Severance EG Dickerson FB Stallings CR Origoni AE Sullens A Monson
ET Yolken RH Differentiating nicotine- versus schizophrenia-associated
decreases of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor transcript CHRFAM7A
in peripheral blood lymphocytes J Neural Transm (Vienna) 2009116(2)213-
220
145 Olincy A Freedman R Nicotinic mechanisms in the treatment of psychotic
disorders a focus on the alpha7 nicotinic receptor Handb Exp Pharmacol
2012 (213)211-232
146 Kariminejad A Almadani N Khoshaeen A Olsson B Moslemi AR Tajsharghi
H Truncating CHRNG mutations associated with interfamilial variability of the
102
severity of the Escobar variant of multiple pterygium syndrome BMC
Genet201617(1)71
147 Liu Y Wang L Yang YK Liang Y Zhang TJ Liang N Yang LM Li SJ Shan
D Wu QQ Prenatal diagnosis of fetal skeletal dysplasia using targeted next-
generation sequencing an analysis of 30 cases Diagn Pathol 201914(1)76
148 Natera-de Benito D Topf A Vilchez JJ Gonzalez-Quereda L Dominguez-
Carral J Diaz-Manera J Ortez C Bestue M Gallano P Dusl M Abicht A
Muller JS Senderek J Garcia-Ribes A Muelas N Evangelista T Azuma Y
McMacken G Paipa Merchan A Rodriguez Cruz PM Camacho A Jimenez E
Miranda-Herrero MC Santana-Artiles A Garcia-Campos O Dominguez-Rubio
R Olive M Colomer J Beeson D Lochmuller H Nascimento A Molecular
characterization of congenital myasthenic syndromes in Spain Neuromuscul
Disord 201727(12)1087-1098
149 Seo J Choi IH Lee JS Yoo Y Kim NK Choi M Ko JM Shin YB Rare cases
of congenital arthrogryposis multiplex caused by novel recurrent CHRNG
mutations J Hum Genet 201560(4)213-215
150 Keskitalo-Vuokko K Pitkaniemi J Broms U Heliovaara M Aromaa A Perola
M Ripatti S Salminen O Salomaa V Loukola A Kaprio J Associations of
nicotine intake measures with CHRN genes in Finnish smokers Nicotine Tob
Res201113(8)686-690
151 Saccone NL Saccone SF Hinrichs AL Stitzel JA Duan W Pergadia ML
Agrawal A Breslau N Grucza RA Hatsukami D Johnson EO Madden PA
Swan GE Wang JC Goate AM Rice JP Bierut LJ Multiple distinct risk loci
for nicotine dependence identified by dense coverage of the complete family of
nicotinic receptor subunit (CHRN) genes Am J Med Genet B Neuropsychiatr
Genet 2009150B(4)453-466
152 Saccone NL Schwantes-An TH Wang JC Grucza RA Breslau N Hatsukami
D Johnson EO Rice JP Goate AM Bierut LJ Multiple cholinergic nicotinic
receptor genes affect nicotine dependence risk in African and European
Americans Genes Brain Behav 20109(7)741-750
153 Santoro ML Ota VK Stilhano RS Silva PN Santos CM Diana MC Gadelha
A Bressan RA Melaragno MI Han SW Abilio VC Belangero SI Effect of
antipsychotic drugs on gene expression in the prefrontal cortex and nucleus
accumbens in the spontaneously hypertensive rat (SHR) Schizophr Res
2014157(1-3)163-168
154 Kuhn J Vollmer T Martin C Hendig D Knabbe C Fast and sample cleanup-
free measurement of nicotine and cotinine by stable isotope dilution ultra-
performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry J Pharm
Biomed Anal 201267-68137-143
103
155 Scherf-Clavel M Wahl O Menke A Unterecker S Determination of
hydroxybupropion in human serum for routine therapeutic drug monitoring in
psychiatry A tool for dose-individualization in treatment with bupropion
Biomed Chromatogr 201933(10)e4609
156 Dobrinas M Choong E Noetzli M Cornuz J Ansermot N Eap CB
Quantification of nicotine cotinine trans-3-hydroxycotinine and varenicline in
human plasma by a sensitive and specific UPLC-tandem mass-spectrometry
procedure for a clinical study on smoking cessation J Chromatogr B Analyt
Technol Biomed Life Sci 2011879(30)3574-3582
157 Onoue S Yamamoto N Seto Y Yamada S Pharmacokinetic study of nicotine
and its metabolite cotinine to clarify possible association between smoking and
voiding dysfunction in rats using UPLCESI-MS Drug Metab Pharmacokinet
201126(4)416-422
158 Petrides AK Moskowitz J Johnson-Davis KL Jannetto PJ Langman LJ Clarke
W Marzinke MA The development and validation of a turbulent flow-liquid
chromatography-tandem mass spectrometric method for the simultaneous
quantification of citalopram sertraline bupropion and hydroxybupropion in
serum Clin Biochem 201447(15)73-79
Rubrica participante Rubrica pesquisador
APEcircNDICE - TCLE
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
HOSPITAL DAS CLIacuteNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SAtildeO
PAULO-HCFMUSP
Registro das explicaccedilotildees do pesquisador ao paciente ou seu representante legal sobre a pesquisa consignando
Vocecirc estaacute sendo convidado (a) a participar de um projeto de pesquisa Este projeto tem
como objetivos principais para os indiviacuteduos fumantes submetidos aos tratamentos
farmacoloacutegicos antitabagismo associar o efeito das caracteriacutesticas geneacuteticas (DNA ou RNA) e do
metabolismo (concentraccedilatildeo dos produtos de metabolismo dos medicamentos no sangue) com a
eficiecircncia do tratamento antitabagismo O objetivo do estudo eacute saber por que algumas pessoas
respondem bem aos medicamentos antitabagismo enquanto outras pessoas natildeo respondem e
consequentemente natildeo conseguem parar de fumar Para isto precisaremos de amostras de
sangue cuja quantidade eacute comumente solicitada em exames laboratoriais de rotina (2 tubos a
cada visita = 20mL) Precisaremos tambeacutem do seu consentimento para que dados de seu
prontuaacuterio meacutedico sejam consultados Para os pacientes que utilizaratildeo o medicamento
bupropiona precisaremos de amostras de sangue na primeira consulta (visita T-1) e duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento medicamentoso (visita T2) Para os pacientes que utilizaratildeo
o medicamento vareniclina precisaremos de uma amostra de sangue na primeira consulta (visita
T-1) na segunda consulta ndash ainda antes de iniciar o tratamento com medicamento (visita T0) duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento medicamentoso (visita T2) e quatro semanas apoacutes o iniacutecio
do tratamento medicamentoso (visita T4) Os desconfortos mais comuns que podem ocorrer com
sua participaccedilatildeo neste estudo satildeo os mesmos de uma coleta de sangue no braccedilo por exemplo
leve dor no local da punccedilatildeo e eventualmente hematoma local Este sangue seraacute encaminhado
ao Laboratoacuterio de Geneacutetica e Cardiologia Molecular do Instituto do Coraccedilatildeo onde seraacute
armazenado somente para a pesquisa Sua participaccedilatildeo eacute totalmente voluntaacuteria Apoacutes ler
entender e esclarecer suas duacutevidas vocecirc assinaraacute 2 vias de igual teor desse documento (termo de
consentimento Livre e Esclarecido) Ainda vocecirc poderaacute solicitar o seu desligamento deste projeto
a qualquer momento bastando para tal entrar em contato os pesquisadores no tel (11) 2661-5592
ou 2661-5995 Em qualquer etapa do estudo vocecirc teraacute acesso aos profissionais responsaacuteveis
pela pesquisa para esclarecimento de eventuais duacutevidas O pesquisador responsaacutevel eacute a Dra
Jaqueline Scholz que pode ser encontrada no endereccedilo Av Dr Eneacuteas de Carvalho Aguiar 44
Instituto do Coraccedilatildeo Bloco 2 andar 1 Programa Ambulatorial de Tratamento Tabagismo
INCOR-HCFMUSP telefone (11) 2661-5592 Se vocecirc tiver alguma consideraccedilatildeo ou duacutevida sobre
a eacutetica da pesquisa entre em contato com o Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa (CEP) ndash Rua Oviacutedio
Pires de Campos 225 ndash 5ordm andar ndash tel (11) 2661-7585 FAX (011) 2661-7585 ndash e-mail
Rubrica participante Rubrica pesquisador
cappesqadmhcfmuspbr Poderaacute tambeacutem solicitar a destruiccedilatildeo das amostras que estaratildeo
armazenadas no mesmo laboratoacuterio
As informaccedilotildees obtidas seratildeo analisadas em conjunto com outros pacientes natildeo sendo
divulgada a identificaccedilatildeo de nenhum paciente Natildeo haveraacute nenhuma despesa por parte do
participante Tambeacutem natildeo haacute compensaccedilatildeo financeira relacionada agrave sua participaccedilatildeo
Benefiacutecio direto para o participante eacute a possibilidade de parar de fumar e ser bem monitorado
durante todo o processo de 12 semanas
Estas informaccedilotildees poderatildeo auxiliar na elaboraccedilatildeo de programas eficazes para o uso
da informaccedilatildeo das caracteriacutesticas individuais em usuaacuterios de medicamentos antitabagismo
Acredito ter sido suficientemente informado a respeito das informaccedilotildees que li ou que
foram lidas para mim descrevendo o estudo ldquoAnaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de
expressatildeo gecircnica dos genoacutetipos preditores de metabolizaccedilatildeo e das concentraccedilotildees de
metaboacutelitos com a resposta ao tratamento antitabagismordquo Eu discuti com o Dra Jaqueline
Scholz com a Juliana da Rocha dos Santos eou Paulo Roberto Xavier Tomaz sobre a minha
decisatildeo em participar nesse estudo Ficaram claros para mim quais satildeo os propoacutesitos do
estudo os procedimentos a serem realizados seus desconfortos e riscos as garantias de
confidencialidade e de esclarecimentos permanentes Concordo voluntariamente em participar
deste estudo e poderei retirar o meu consentimento a qualquer momento antes ou durante o
mesmo sem penalidades ou prejuiacutezo ou perda de qualquer benefiacutecio que eu possa ter
adquirido ou no meu atendimento neste Serviccedilo
_____________________________________________________________________________________
Assinatura do pacienterepresentante legal Data
____________________________________________________________________________
Assinatura da testemunha Data
para casos de pacientes menores de 18 anos analfabetos semi-analfabetos ou portadores de deficiecircncia auditiva ou visual
(Somente para o responsaacutevel do projeto)
Declaro que obtive de forma apropriada e voluntaacuteria o Consentimento Livre e Esclarecido deste
paciente ou representante legal para a participaccedilatildeo neste estudo
____________________________________________________________________________
Assinatura do pesquisador Data
Rubrica participante Rubrica pesquisador
DADOS DE IDENTIFICACcedilAtildeO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSAacuteVEL LEGAL
1NOME
DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nordm SEXO M F
DATA NASCIMENTO
ENDERECcedilO NordmAPTO
BAIRROCIDADE
ESTADOCEPTELEFONE()
2RESPONSAacuteVEL LEGAL
NATUREZA (grau de parentesco tutor curador etc)
DOCUMENTO DE IDENTIDADE SEXO M F
DATA DE NASCIMENTOENDERECcedilO
Nordm APTO
BAIRROCIDADE ESTADOCEPTELEFONE() ___________________________________________________________________________________________________________________________
DADOS SOBRE A PESQUISA
1 TIacuteTULO DO SUBPROJETO DE PESQUISA ldquoAnaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de expressatildeo gecircnica dos genoacutetipos
preditores de metabolizaccedilatildeo e das concentraccedilotildees de metaboacutelitos com a resposta ao tratamento antitabagismordquo
PESQUISADOR RESPONSAacuteVEL Dr Jaqueline Scholz
CARGOFUNCcedilAtildeO Meacutedico Assistente Meacutedico Pesquisador ndash InCor ndash HCFMUSP CRM SP nordm 60179
UNIDADE DO HCFMUSP Programa Ambulatorial de Tratamento Tabagismo InCor-HCFMUSP
PESQUISADOR EXECUTANTE Juliana da Rocha dos Santos CRF SP nordm 62776
CARGOFUNCcedilAtildeO POacuteS-GRADUANDAndash InCor ndash HCFMUSP
UNIDADE DO HC-FMUSP Laboratoacuterio de Geneacutetica e Cardiologia Molecular InCor-HCFMUSP
3 AVALIACcedilAtildeO DO RISCO DA PESQUISA
RISCO MIacuteNIMO RISCO MEacuteDIO
RISCO BAIXO x RISCO MAIOR
4 DURACcedilAtildeO DA PESQUISA 4 anos
ANEXO 1 ndash Aprovaccedilatildeo no Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa
ANEXO 2 - Teste de Fagerstroumlm para a dependecircncia agrave nicotina (versatildeo em Portuguecircs)
Fonte Pietrobon RC Barbisan JN Manfroi WC Utilizaccedilatildeo do teste de dependecircncia agrave nicotina de
Fagerstroumlm como um instrumento de medida do grau de dependecircncia Versatildeo em Portuguecircs Rev HCPA
200727(3)31-6
ANEXO 3 - Escore de consumo situacional Issa
Fonte Issa J S Um novo escore para dependecircncia a nicotina e uma nova escala de conforto do paciente durante
o tratamento do tabagismo J Bras Pneumol 38(6) 761-5
ANEXO 4 ndash Desenho de estudo do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticos na escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismordquo
Desenho do estudo Seraacute randomizado em dois braccedilos um nuacutemero amostral total de 300 pacientes No braccedilo da esquerda 150 pacientes seratildeo tratados com base em teste geneacutetico para os
polimorfismos CYP2B6 (rs2279343) e CHRNA4 (rs1044396) No braccedilo da direita 150 pacientes faratildeo o tratamento tradicional com vareniclina (o faacutermaco de maior efetividade no tratamento
antitabagismo) Em um estudo anterior nosso grupo de pesquisadores 5152 mostrou maior sucesso terapecircutico nos pacientes portadores dos genoacutetipos AA para o gene CYP2B6 nos pacientes
tratados com bupropiona e nos portadores dos genoacutetipos CT e TT para o gene CHRNA4 nos pacientes tratados com vareniclina A escolha do tratamento no braccedilo farmacogeneacutetico prioriza o
tratamento mais barato (bupropiona) dessa forma primeiramente eacute analisado o genoacutetipo para o rs2279343 se o paciente apresentar o genoacutetipo AA o mesmo eacute tratado com bupropiona se ele tiver
o genoacutetipo AG ou GG eacute analisado o genoacutetipo para o polimorfismo rs1044396 Se o paciente apresentar o genoacutetipo CT ou TT para o rs1044396 ele eacute tratado com vareniclina se ele apresentar o
genoacutetipo CC (natildeo favoraacutevel a nenhum dos faacutermacos) ele eacute tratado com vareniclina e bupropiona em uso concomitante Seraacute comparado o custo-efetividade do tratamento baseado em
farmacogeneacutetica em relaccedilatildeo ao tratamento com vareniclina Os pacientes satildeo acompanhados por 12 semanas durante o tratamento farmacoloacutegico visita inicial (T-1) antes do iniacutecio da terapecircutica
(T0) 2 4 6 8 e 12 semanas apoacutes o tratamento (T2 T4 T6 T8 T12) Obs Os pacientes que natildeo conseguirem parar de fumar ateacute a 4 ordf semana de tratamento em monoterapia eacute adicionada a
segunda medicaccedilatildeo Fonte Eficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticos na escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismo InCor-HCFMUSP Projeto de doutorado da Dra Patriacutecia Viviane Gaya
sob a orientaccedilatildeo da Dr Jaqueline R Scholz desenvolvido a partir dos resultados dos estudos da nossa equipe de pesquisadores Rocha Santos et al 2015 67 e Tomaz et al 2015 68
ANEXO 5 ndash Pedido de depoacutesito de patente na Agecircncia de Inovaccedilatildeo e Empreendedorismo da
Universidade Federal de Alfenas-MG
SUMAacuteRIO
LISTA DE ABREVIATURAS SIacuteMBOLOS E SIGLAS
LISTA DE EQUACcedilOtildeES
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE QUADROS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
11 Nicotina farmacodinacircmica e farmacocineacutetica 3
12 Faacutermacos antitabagismo 5
121 Vareniclina 6
1211 Farmacodinacircmica 6
1212 Farmacocineacutetica 7
122 Bupropiona 9
1221 Farmacodinacircmica 9
1222 Farmacocineacutetica 10
13 Pesquisa de biomarcadores 11
131 Estudos farmacogeneacuteticos e de expressatildeo gecircnica para vareniclina e bupropiona 12
132 Mensuraccedilatildeo de nicotina bupropiona vareniclina e seus metaboacutelitos em amostras
bioloacutegicas 15
2 JUSTIFICATIVA 17
3 OBJETIVOS 19
4 METODOLOGIA 20
41 Casuiacutestica 20
42 Fluxo de procedimentos adotados no atendimento aos pacientes 23
43 Coleta e armazenamento das amostras dos pacientes tratados com vareniclina e
bupropiona 26
44 Nuacutemero amostral 27
45 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica para amostras de pacientes tratados com vareniclina 28
451 Concentraccedilatildeo purificaccedilatildeo e extraccedilatildeo de RNA 28
452 Siacutentese de cDNA 31
453 Ensaio de controle de qualidade das amostras para o ensaio de expressatildeo gecircnica 31
454 Ensaio de expressatildeo gecircnica 35
455 Anaacutelise dos dados de expressatildeo gecircnica 37
46 Mensuraccedilatildeo de bupropiona vareniclina e de seus metaboacutelitos por HPLC-MSMS 38
461 Materiais equipamentos e condiccedilotildees adotadas para a mensuraccedilatildeo dos analitos apoacutes
validaccedilatildeo do meacutetodo 38
462 Visatildeo geral do desenvolvimento da coluna e padronizaccedilatildeo da anaacutelise 41
463 Desenvolvimento da coluna RAM para a purificaccedilatildeo da amostra 43
464 Caracterizaccedilatildeo do novo RAM 46
4641 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA 46
4642 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas no soro 46
4643 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA em diferentes pHs 47
465 Paracircmetros espectromeacutetricos 47
466 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatograacutefico multidimensional 48
467 validaccedilatildeo analiacutetica 49
47 Anaacutelise estatiacutestica 49
5 RESULTADOS 51
51 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica 51
511 Dados cliacutenicos e demograacuteficos 51
512 Dados de expressatildeo gecircnica 53
513 Anaacutelise de associaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica entre os desfechos e os tempos de
tratamento 54
52 Mensuraccedilatildeo dos analitos 58
521 Caracterizaccedilatildeo da coluna teste exclusatildeo de proteiacutenas e interferentes da matriz 58
522 Otimizaccedilatildeo dos paracircmetros espectromeacutetricos 60
523 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatrograacutefico multidimensional 61
524 Validaccedilatildeo analiacutetica 64
525 Dados cliacutenicos e demograacuteficos dos pacientes submetidos a mensuraccedilatildeo dos analitos
69
526 Anaacutelise de associaccedilatildeo dos analitos com desfecho de tratamento 72
6 DISCUSSAtildeO 75
61 Para os dados da anaacutelise de expressatildeo gecircnica 75
62 Para os dados da mensuraccedilatildeo dos analitos 80
7 CONCLUSOtildeES 87
8 SUGESTOtildeES PARA ESTUDOS FUTUROS 88
9 REFEREcircNCIAS 89
APEcircNDICE ndash TCLE
ANEXO 1 ndash Aprovaccedilatildeo no Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa
ANEXO 2 ndash Teste de Fagerstroumlm para a dependecircncia agrave nicotina (versatildeo em Portuguecircs)
ANEXO 3 - Escore de consumo situacional Issa
ANEXO 4 - Desenho de estudo do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticos na
escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismordquo
ANEXO 5 -Pedido de depoacutesito de patente na Agecircncia de Inovaccedilatildeo e Empreendedorismo
da Universidade Federal de Alfenas-MG
LISTA DE ABREVIATURAS SIacuteMBOLOS E SIGLAS
API Ionizaccedilatildeo em pressatildeo atmosfeacuterica - Atmospheric pressure ionization
ACTB Gene que codifica a proteiacutena β actina
ANKK1 Gene codificador da proteiacutena quinase envolvida em vias de transduccedilatildeo de sinal
B2M Gene que codifica a microbulina subunidade β2
BC3 Tampatildeo de reaccedilao de transcriptase reversa
BR1 Tampatildeo de ressuspensatildeo
BR2 Tampatildeo de ligaccedilatildeo
BR3 Tampatildeo de lavagem 1
BR4 Tampatildeo de lavagem 2
BR5 Tampatildeo de eluiccedilatildeo
BRT Tubos PAXgene
BSA Albumina de soro bovino
[C14] Carbono 14 (isoacutetopo radioativo do carbono de massa atocircmica 14)
cDNA DNA complementar sintetizado a partir de uma moleacutecula de RNA
CHRNA3 Gene codificador do receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α3
CHRNA4 Gene codificador da subunidade α4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNA5 Gene codificador da subunidade α5 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNA6 Gene codificador da subunidade α6 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNA7 Gene codificador da subunidade α7 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNB2 Gene codificador da subunidade β2 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNB3 Gene codificador da subunidade β3 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNB4 Gene codificador da subunidade β4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos
CHRNG Gene codificador do receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade δ
CNTs Nanotubos de carbono - Carbon nanotubes
COMT Gene codificador da enzima catecol-O-metiltransferase (metaboliza dopamina)
CS ndash SPE Extraccedilatildeo em fase soacutelida no modo column switching
CT Ciclo de linha de base ndash threshold cicle (nuacutemero de ciclo em que a amostra
amplificou)
CYP2B6 Gene codificador do receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade γ
CYP2B6 Gene codificador da isoenzima CYP2B6
Disco QC Disco para a realizaccedilatildeo do controle de qualidade de amostras que seratildeo utilizadas
para o ensaio de expressatildeo gecircnica
DN Dependecircncia agrave nicotina
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
DNAse Enzima que degrada moleacuteculas de DNA
dNTP Dinucleotiacutedeos dATP dCTP dGTP e dTTP
DRD1 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 1
DRD2 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 2
DRD3 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 3
DRD4 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 4
E Erro relativo
EDTA Aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico
Escore Issa Escore de consumo situacional Issa
ESI+ Ionizaccedilatildeo positiva por electrospray - positive Electrospray ionization
FDA Orgatildeo de controle de alimentos e medicamentos americano ndash Food and drug
administration
FTND Teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fargestroumlm test for nicotine
dependence
g Velocidade de rotaccedilatildeo em forccedila g a qual considera a aceleraccedilatildeo da gravidade
GDC Controle de contaminaccedilatildeo de DNA genocircmico do disco QC
GE Tampatildeo de degradaccedilatildeo de DNA genocircmico
HGDC Controle de contaminaccedilatildeo de DNA genocircmico do ensaio de expressatildeo gecircnica
HPLC Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia ndash High Performance Liquid
Cromatograph
HPLC-MSMS Cromatografica liacutequida de alta eficiecircncia seguida por espectrometria de massas
em tandem ndash High Performance Liquid Cromatograph fowed by tandem Mass
Spectrometric
HPRT1 Gene que codifica a enzima hipoxantina fosforribosiltransferase 1
HTR3A Gene codificador da subunidade 3A do receptor de serotonina
HTR3B Gene codificador da subunidade 3B do receptor de serotonina
KV Energia de colisatildeo em quilovolt
LC-MS Cromatografia liacutequida seguida de espectrometria de massas - Liquid
Cromatograph fowed by Mass Spectrometric
LD Limite de detecccedilatildeo
LLE Extraccedilatildeo liacutequido-liacutequido (com o uso de solvente)
LQ Limite de quantificaccedilatildeo
LogP Coeficiente de particcedilatildeo relaccedilatildeo das concentraccedilotildees da substacircncia em um solvente
orgacircnico e em aacutegua dado que ambos os solventes satildeo necessariamente imisciacuteveis
MCT Microtubos de 15 mL
MS Espectrometria de massas - Mass Spectrometric
MRM Muacuteltiplas transiccedilotildees de monitoramento de reaccedilatildeo - multiple reaction monitoring
MSMS Espectrometria de massas em tandem
mz Relaccedilatildeo massacarga dos analitos
nAChR(s) Receptor(es) acetilcoliacutenico (s) nicotiacutenico (s)
NMR Taxa de metabolizaccedilatildeo da nicotina ndash Nicotine metabolite ratio
NTC Controle negativo
NTR Controle de natildeo transcriccedilatildeo reversa
OCT2 Transportador catiocircnico orgacircnico
P2 Controle externo de RNA
PAF Programa de Assistecircncia ao Fumante
PBMC Ceacutelulas mononucleares de sangue perifeacuterico - Peripheral blood mononuclear cell
PCR Amplificaccedilatildeo em cadeia da polimerase
PIs Padrotildees internos
PK Enzima proteinase K
pKa Valor negativo do logaritmo da constante de dissociaccedilatildeo de um aacutecido
pKb Valor negativo do logaritmo da constante de dissociaccedilatildeo de uma base
PP Extraccedilatildeo por preciptaccedilatildeo de proteiacutenas
PPC Controle positivo de PCR
PRC Coluna de rotaccedilatildeo de RNA vermelho
PSC Coluna de rotaccedilatildeo do homogeneizador lilaacutes
PT Tubo de processamento
RAM Material de acesso restrito ndash restrict access material
Rcf Forccedila centriacutefuga relativa ndash Relative centrifugal force
RDD Tampatildeo de digestatildeo de DNA
RE3 Mix de transcriptase reversa
RNA Aacutecido ribonucleico
RNase Enzima ribonuclease a qual degrada as moleacuteculas de RNA
RNFD Soluccedilatildeo matildee de DNase
RNFW Aacutegua livre de RNase
RFLP Restriccedilatildeo enzimaacutetica - Restriction fragment length polymorphism
RP‐HPLC Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia em fase reversa ndash Reverse-Phase High
Performance Liquid Cromatograph
Rpm Rotaccedilatildeo por minuto
RSD Desvio padratildeo relativo
SLC6A3 Gene codificador da proteiacutena transportadora de dopamina
SLC22A2 Gene codificador da proteiacutena OCT2 transportadora de caacutetions orgacircnicos
(transporta vareniclina)
SNC Sistema nervoso central
SPE Extraccedilatildeo em fase soacutelida
Sty I Enzima de restriccedilatildeo proveniente da Salmonella Typhi
TAE Tampatildeo formado com Tris Acetato e EDTA
TRN Terapia de reposiccedilatildeo nicotiacutenica
UGT2B7 Gene codificador da enzima UGT2B7 a qual metaboliza a vareniclina
UPLC Cromatografica liacutequida de ultra eficiecircncia - Ultra Performance Liquid
Cromatograph
UV Detector ultravioleta
α3 Subunidade alfa 3 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α4 Subunidade alfa 4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α5 Subunidade alfa 5 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α6 Subunidade alfa 6 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
α7 Subunidade alfa 7 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
β2 Subunidade beta 2 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
β4 Subunidade beta 4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais
T-1 Visita inicial
T0 Visita de iniacutecio do tratamento (coleta realizada antes de comeccedilar o tratamento no
mesmo dia)
T2 Visita de 2 semanas apoacutes tratamento farmacoloacutegico
T4 Visita de 4 semanas apoacutes tratamento farmacoloacutegico
T12 Visita de 12 semanas apoacutes tratamento farmacoloacutegico
TFC Cromatografia liacutequida turbulenta - Turbulent flow-liquid chromatography
LISTA DE EQUACcedilOtildeES
∆CT= (CTamostra ndash a meacutedia de CThousekeeping genes) Normalizaccedilatildeo da expressatildeo
gecircnica dos genes alvo atraveacutes de valores de expressatildeo de genes fisioloacutegicos
2-∆CT Transformaccedilatildeo dos valores de ∆CT em escala logariacutetmica para a realizaccedilatildeo
dos testes de hipoacutetese
∆∆CT= (mediana de ∆CTgrupo teste ndash mediana de ∆CT grupo referecircncia) Foacutermula
utilizada para posterior caacutelculo de fold change Considera-se os dois grupos
envolvidos no teste de hipoacutetese
2-∆∆CT Transformaccedilatildeo dos dados de ∆∆CT em escala logariacutetmica Atraveacutes dessa
foacutermula se obteacutem o fold change (diferenccedila de expressatildeo entre dois grupos)
NMR=(trans-3-hidroxicotininacotinina) Taxa de metabolizaccedilatildeo da nicotina
NMRlt031=metabolizador lento NMRgt031 metabolizador normal ou raacutepido
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Analitos precursores fragmentos e energias de colisatildeo
otimizados
40
Tabela 2 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina selecionados para os ensaios de expressatildeo gecircnica
52
Tabela 3 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina submetidos aos ensaios de expressatildeo gecircnica de acordo
com o desfecho de tratamento
52
Tabela 4 - Valores de mediana de ∆CT dos genes de acordo com os
tempos de tratamento e grupos de desfecho
53
Tabela 5 - Fold change e anaacutelise de associaccedilatildeo entre os tempos de
tratamento e grupos de desfecho
54
Tabela 6 - Paracircmetros de validaccedilatildeo obtidos na determinaccedilatildeo de faacutermacos
antitabagismo em soro humano
68
Tabela 7 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos
69
Tabela 8 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de
acordo com o desfecho de tratamento
70
Tabela 9 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados
com bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos
71
Tabela 10 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes
tratados com bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos
analitos de acordo com o desfecho de tratamento
71
Tabela 11 ndash Frequecircncia do desfecho de tratamento nos pacientes
submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com os
medicamentos antitabagismo
72
Tabela 12 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos
pacientes tratados com vareniclina
73
Tabela 13 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de
tratamento com vareniclina
73
Tabela 14 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos
pacientes tratados com bupropiona
74
Tabela 15 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de
tratamento com bupropiona
74
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Aacutereas estimuladas atraveacutes de vias dopamineacutergicas e
serotonineacutergicas e sistema de recompensa
2
Figura 2 - Receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico 4
Figura 3 - Via primaacuteria do metabolismo da nicotina 5
Figura 4 - Mecanismo de accedilatildeo da vareniclina 7
Figura 5 - Metabolismo da vareniclina em humanos 8
Figura 6 - Mecanismo de accedilatildeo da bupropiona 9
Figura 7 - Metabolismo da bupropiona em seus principais metaboacutelitos ativo 11
Figura 8 - Desenho do estudo 22
Figura 9 - Representaccedilatildeo do Rotor-Disc100 33
Figura 10 - Mapa do disco QC (representaccedilatildeo planilhada) 33
Figura 11 - Exemplo de ajuste de Threshold 34
Figura 12 - Mapa do disco do ensaio RT2 profiler PCR array (representaccedilatildeo
planilhada)
37
Figura 13 - Representaccedilatildeo da composiccedilatildeo da coluna extratora (Novo RAM) 45
Figura 14 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNA7 entre os tempos de
tratamento e desfecho
56
Figura 15 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNG entre os tempos de
tratamento e desfecho
57
Figura 16 - Heat map de expressatildeo gecircnica 58
Figura 17 ndash Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com soluccedilatildeo de
BSA
59
Figura 18 - Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com amostra de
soro diluiacuteda
59
Figura 19 - Influecircncia do pH na exclusatildeo de proteiacutenas 60
Figura 20 - Ilustraccedilatildeo do sistema de columm switching na configuraccedilatildeo de
backflush
62
Figura 21 - Cromatograma obtido de amostras de soro branco diluiacutedas em
aacutegua ultra pura
65
Figura 22 - Cromatograma obtido apoacutes anaacutelise de soro diluiacutedo e dopado com
os analitos no niacutevel meacutedio de calibraccedilatildeo e mais os padrotildees internos deuterados
65
Figura 23 - Cromatograma obtido atraveacutes da anaacutelise das amostras de soro dos
pacientes tratados com bupropiona
67
Figura 24 - Cromatograma obtido atraveacutes da analise de amostras de soro de
pacientes tratados com vareniclina
67
LISTA DE QUADROS
Quadro 1- Procedimentos do protocolo em relaccedilatildeo aos pacientes 25
Quadro 2 - Paracircmetros de qualidade do ensaio QC 34
Quadro 3 - Genes escolhidos para o ensaio de expressatildeo 36
Quadro 4 - Housekeeping genes 36
Quadro 5 - Propriedades fiacutesico-quiacutemicas dos analitos 42
Quadro 6 ndash Comparaccedilatildeo dos dados de validaccedilatildeo com outros estudos 85
RESUMO
Santos JR Anaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de expressatildeo gecircnica e das concentraccedilotildees
de metaboacutelitos com a resposta ao tratamento antitabagismo [tese] Satildeo Paulo
Faculdade de Medicina Universidade de Satildeo Paulo 2020
Introduccedilatildeo O tabagismo eacute considerado a maior causa de morbidade e mortalidade
evitaacutevel no mundo Estudos tecircm buscado a identificaccedilatildeo de preditores de resposta aos
tratamentos de cessaccedilatildeo tabaacutegica Os principais objetivos deste estudo foram analisar a
possiacutevel associaccedilatildeo da expressatildeo de genes alvo e das concentraccedilotildees de analitos
(faacutermacos antitabagismo nicotina e seus metaboacutelitos) com a resposta ao tratamento
Meacutetodos Foram incluiacutedos 105 pacientes fumantes que iniciariam o tratamento com
vareniclina (n=74) ou bupropiona (n=31) As anaacutelises de expressatildeo gecircnica foram
realizadas atraveacutes do ensaio customizado RTsup2 Profiler PCR Array com a inclusatildeo de 17
genes para a anaacutelise em ceacutelulas mononucleares de sangue perifeacuterico (PBMC) A
preparaccedilatildeo das amostras de soro para a mensuraccedilatildeo dos analitos foi realizada atraveacutes de
uma coluna extratora composta por nanotubos hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados
com a adiccedilatildeo de grupos hidrofiacutelicos (material de acesso restrito - RAM) desenvolvida
no LATF Unifal MG A mensuraccedilatildeo dos analitos foi realizada por cromatografia
liacutequida de alta eficiecircncia em modo column switching seguida de espectrometria de
massa em tandem (HPLC-MSMS) Os tempos para a coleta de amostras foram para as
anaacutelises de expressatildeo gecircnica (sangue total) antes de iniciar o tratamento (T0) duas e
quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento (T2 e T4 respectivamente) e para a
mensuraccedilatildeo dos analitos (soro) as amostras foram coletadas na T2 Resultados Para as
anaacutelises de expressatildeo gecircnica selecionamos 14 pacientes que obtiveram sucesso e 13
pacientes resistentes ao tratamento com vareniclina Foi considerado sucesso quando o
paciente alcanccedilava abstinecircncia ao tabaco ateacute a 4 ordf semana de tratamento e resistente
quando o paciente natildeo conseguia parar de fumar ateacute a 4ordf semana de tratamento Foi
observada diferenccedila significativa para a expressatildeo do gene CHRNA7 no grupo
resistente amostras dos tempos T2 e T4 apresentaram menor expressatildeo comparadas ao
tempo T0 (fold change 038 P=0007 fold change 067 P=0004 respectivamente)
Para a mensuraccedilatildeo dos analitos a coluna RAM desenvolvida mostrou alta capacidade
para a remoccedilatildeo de macromoleacuteculas e de anaacutelise conjunta dos diferentes analitos aleacutem
de poder ser reutilizada diversas vezes (cerca de 400 ciclos) Os pacientes do grupo
resistente tratados com ambos os faacutermacos apresentaram maior concentraccedilatildeo de
metaboacutelitos da nicotina na T2 No entanto natildeo houve associaccedilatildeo dos faacutermacos e seus
metaboacutelitos com desfecho de tratamento Conclusotildees Para as anaacutelises de expressatildeo
gecircnica este estudo exploratoacuterio mostrou um possiacutevel preditor de efetividade no
tratamento com vareniclina reafirmando a associaccedilatildeo da subunidade α7 para os
processos de dependecircncia agrave nicotina e tratamento antitabagismo Estes resultados
podem contribuir ao menos em parte para o desenvolvimento de uma terapia
individualizada Contudo estudos futuros satildeo necessaacuterios para o entendimento do papel
da subunidade α7 dos receptores acetilcoliacutenicos-nicotiacutenicos no tratamento com
vareniclina Para a mensuraccedilatildeo dos analitos o novo RAM sintetizado eacute um produto de
extremo valor cientiacutefico podendo apresentar diversas aplicaccedilotildees em anaacutelise de amostras
com matrizes complexas sem muita preparaccedilatildeo preacutevia Para a associaccedilatildeo das
concentraccedilotildees dos faacutermacos e seus metaboacutelitos com o desfecho de tratamento satildeo
necessaacuterios estudos com um maior nuacutemero amostral
Descritores Vareniclina Bupropiona Nicotina Abandono do haacutebito de fumar
Expressatildeo gecircnica Biomarcadores farmacoloacutegicos
ABSTRACT
Santos JR Association analysis of gene expression profiles and metabolite
concentrations with response for smoking cessation treatment [thesis] Satildeo Paulo
ldquoFaculdade de Medicina Universidade de Satildeo Paulordquo 2020
Introduction Smoking is considered the largest cause of preventable morbidity and
mortality in the worldwide Studies have sought to identify predictors of responses to
smoking cessation treatments The main objectives of this study were to analyze the
possible association of the expression of target genes and concentrations of analytes
(drugs for smoking cessation nicotine and their metabolites) with the response to
treatment Methods We included 105 smoker patients who would start treatment with
varenicline (n=74) or bupropion (n=31) Gene expression analysis was performed
through custom RTsup2 Profiler PCR array assay including 17 genes for analysis in
peripheral blood mononuclear cells (PBMC) Serum sample preparation for the
measurement of analytes was performed by an extraction column composed of hybrid
carbon and silica nanotubes modified with the addition of hydrophilic groups (restricted
access material - RAM) developed by LATF Unifal MG The measurement of analytes
was performed by high efficient liquid chromatography in column switching mode
followed by tandem mass spectrometry (HPLC-MSMS) Times for sample collection
were for gene expression analysis (total blood) before start of therapy (T0) two and
four weeks after start of treatment (T2 and T4 respectively) and for measurement of
analytes (serum) the samples were collected at T2 Results For gene expression
analysis we selected 14 patients who had success and 13 patients resistant to the
varenicline treatment Success was considered to be when a patient achieved tobacco
abstinence until the 4th week of treatment and resistant was when a patient had not
stopped smoking as of the 4th week of treatment We observed a significant difference
for CHRNA7 gene expression in the resistant group samples from T2 and T4 had lower
expression compared with T0 (fold change 038 P=0007 fold change 067 P=0004
respectively) For measurement of analytes the developed RAM column showed high
capacity to remove macromolecules and joint analyzes of different analytes besides
being able to be reuse manny times (about 400 cycles) Patients from resistant group of
the both drugs treatment had a higher concentration of nicotine metabolites in T2
However there was no association of drugs for smoking cessation and their metabolites
with outcome treatment Conclusions For gene expression analysis this exploratory
study showed a possible predictor of effectiveness in the treatment with varenicline
reaffirming the association of the α7 subunit for nicotine dependence and smoking
therapy processes These results may contribute at least in part to the development of
individualized therapy However further studies are needed to understand the role of the
α7 subunit of acetylcholinic-nicotinic receptors in varenicline treatment For the
measurement of analytes the new synthesized RAM is a product of extreme scientific
value being able of several applications in the analysis of samples with complex
matrices without much prior preparation For an association of drugs for smoking
cessation and their metabolites with outcome treatment studies with a larger sample
size are needed
Descriptors Varenicline Bupropion Nicotine Smoking cessation Gene expression
Biomarkers pharmacological
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
O tabagismo eacute considerado a maior causa de morbidade e mortalidade evitaacutevel
em todo o mundo 1 Doenccedilas cardiacuteacas cerebrovasculares cerca de um quinto de todos
os tipos de cacircnceres doenccedilas pulmonares como apneia e enfisema aleacutem de distuacuterbios
preacute-natais estatildeo associadas ao consumo do tabaco 2-5
Dados recentes da Vigitel mostraram que no conjunto das 27 capitais brasileiras
a frequecircncia de adultos fumantes foi de 93 com valores duas vezes maior no sexo
masculino (121) do que no feminino (69) As menores frequecircncias foram
encontradas na populaccedilatildeo de jovens adultos (antes dos 25 anos) e em pessoas de mais
de 65 anos As maiores frequecircncias foram encontradas entre homens em Porto Alegre
(173) Campo Grande e Satildeo Paulo (156) 6
A nicotina eacute o principal componente do tabaco causador de dependecircncia Esta
age nos receptores acetilcoliacutenicos-nicotiacutenicos (nAChRs) promovendo a liberaccedilatildeo de
diversos neurotransmissores e neuroreguladores tais como dopamina acetilcolina
epinefrina norepinefrina serotonina beta-endorfina vasopressina e GABA O principal
neurotransmissor estudado eacute a dopamina pois a nicotina promove aumento de seus
niacuteveis na regiatildeo mesocorticoliacutembica cerebral principalmente em um circuito conhecido
como ldquosistema de recompensardquo (aacuterea tegmental ventral nuacutecleo accumbens e coacutertex preacute-
frontal) gerando sensaccedilotildees de prazer e bem-estar 7-15
O processo de adiccedilatildeo agrave nicotina eacute complexo e nem todos os mecanismos estatildeo
elucidados Aleacutem da ativaccedilatildeo do sistema de recompensa haacute a formaccedilatildeo de memoacuterias
associativas do efeito hedocircnico com os ambientes e situaccedilotildees de disponibilidade e uso
do tabaco resultando em reforccedilo positivo apoacutes o fumante entrar em contato com fatores
relacionados ao seu consumo Este tipo de memoacuteria aprendida envolve a amigdala o
hipocampo o coacutertex preacute-frontal e o coacutertex parietal 15-17 Evidecircncias tambeacutem satildeo
2
consistentes com a hipoacutetese da ativaccedilatildeo do estriado dorsal o qual estaacute envolvido no
processamento de memoacuterias de formaccedilatildeo de haacutebito em processos motores o que
poderia automatizar o ato de fumar 15 18 (Figura 1)
O uso continuado do tabaco promove a desensibilizaccedilatildeo e adaptaccedilatildeo dos
nAChRs causando toleracircncia e diminuiccedilatildeo dos efeitos de recompensa naturais Como
resultado o indiviacuteduo experimenta fissura ansiedade humor deprimido e irritabilidade
na ausecircncia da nicotina Estes sintomas acabam promovendo um reforccedilo negativo para o
fumo e o nuacutemero de cigarros consumidos aumenta cada vez mais 14 15
Todos os fatores acima mencionados contribuem para o mecanismo de
dependecircncia agrave nicotina (DN) Os efeitos hedocircnicos estatildeo relacionados com o processo
de iniciaccedilatildeo do tabagismo enquanto os efeitos negativos da falta da nicotina estatildeo mais
associados agrave manutenccedilatildeo do fumo 15
Para os indiviacuteduos que desejam parar de fumar o tratamento farmacoloacutegico
antitabagismo eacute o que apresenta maior eficaacutecia na reduccedilatildeo da prevalecircncia de fumantes
19
Figura 1 - Aacutereas estimuladas atraveacutes de vias dopamineacutergicas e serotonineacutergicas e sistema de recompensa A
Principais vias ativadas na dependecircncia como a aacuterea tegmental ventral nuacutecleos accumbens e da rafe coacutertex-frontal
estriado susbstacircncia negra e hipocampo As setas em rosa indicam aacutereas estimuladas pelas vias serotonineacutergicas de
transmissatildeo e em azul pelas vias dopamineacutergicas gerando diversos comportamentos B Sistema de recompensa
(composto pela VTA nuacutecleo accumbeacutens e coacutertex preacute-frontal) A nicotina age nos nAChRs no SNC gerando uma
3
descarga de dopamina no sistema de recompensa Haacute uma adaptaccedilatildeo desses receptores com o fumo continuado
fazendo com que haja a necessidade de maior consumo de nicotina e o desenvolvimento da dependecircncia VTA= aacuterea
tegmental ventral SNC sistema nervoso central nAChR= receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico Fonte adaptado de
Habermann A Brain awareness week addiction and the brainrsquos reward system Sovereign Health Group 2016 e de
Koob amp Volkow 2009 14
11 Nicotina farmacodinacircmica e farmacocineacutetica
O fumo permite uma titulaccedilatildeo precisa da dose de nicotina por parte do fumante
Sua absorccedilatildeo eacute raacutepida chegando em cerca de 10 segundos em todo o sistema nervoso
central (SNC) onde se liga nos nAChRs 20 21 22
Os nAChRs satildeo receptores de canais iocircnicos compostos por cinco subunidades
que podem estar combinadas de diferentes formas (Figura 2) 20 Os subtipos desses
receptores mais abundantes no ceacuterebro humano satildeo os α4β2 α3β4 e α7 (homomeacuterico)
Os receptores compostos pelas subunidades α4β2 (o asterisco indica que outras
subunidades podem estar presentes) possuem um papel fundamental na DN O nocaute
da subunidade β2 em ratos resultou na eliminaccedilatildeo dos efeitos comportamentais da
nicotina 23 Quanto agrave subunidade α4 parece estar envolvida na sensibilidade agrave nicotina
o que pode impactar nos efeitos de recompensa dessensibilizaccedilatildeo e toleracircncia24 25 Os
receptores compostos pelas subunidades α3β4 acredita-se mediar os efeitos
cardiovasculares 26 Os nAChRs α7 homomeacuterico estatildeo envolvidos na velocidade de
sinapses em processos de aprendizagem e controle sensorial 27 28 Os receptores
compostos pelas subunidades α4β2lowast podem conter outras subunidades como por
exemplo α5 α6 eou β3 as quais podem modificar a sensibilidade e funccedilatildeo do receptor
21 29
Como um agonista desses receptores a nicotina promove a sua abertura
permitindo a entrada de soacutedio e caacutelcio despolarizando assim a membrana dos
neurocircnios Aleacutem da entrada de caacutelcio atraveacutes dos nAChRs haacute tambeacutem a abertura de
4
canais de caacutelcio voltagem dependentes fazendo com que as vesiacuteculas que armazenam
os neurotransmissores sejam liberadas 20 21 O resultado da ativaccedilatildeo dos nAChRs em
neurocircnios poacutes-sinaacutepticos eacute a liberaccedilatildeo de diversos neurotransmissores ativando vaacuterias
aacutereas como jaacute mencionado
Figura 2 - Receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico O receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico funciona como um
canal iocircnico transmembracircnico Sua composiccedilatildeo eacute pentacircmera ou seja eacute formada por 5 subunidades que
podem se combinar de diferentes formas As subunidades satildeo classificadas de acordo com diferenccedilas nos
domiacutenios da sua estrutura proteiacuteca A acetilcolina e a nicotina satildeo agonistas desses receptores fazendo
com que os mesmos sejam abertos Assim ocorre a entrada de soacutedio despolarizando a membrana
gerando o potencial de accedilatildeo ACh= acetilcolina Nicot= Nicotina Na+= soacutedio K+= potaacutessio α =
subunidade alfa β= subunidade beta δ= subunidade delta γ= subunidade gama Fonte adaptado de Rang
amp Dale Farmacologia 5 ed Elsevier 2012
Haacute oscilaccedilatildeo dos picos de nicotina entre um cigarro e outro mas as quantidades
se acumulam entre 6 e 9 horas em um fumo regular saturando os nAChR causando
desensibilizaccedilatildeo adaptaccedilatildeo toleracircncia sintomas de abstinecircncia na falta do fumo e DN
30
A nicotina eacute rapidamente e extensivamente metabolizada pelo fiacutegado atraveacutes da
isoenzima CYP2A6 (e em menor grau pelas isoenzimas CYP2B6 e CYP2E1) agrave nicotina
-iacuteon iacuteminio e apoacutes pela enzima aldeiacutedo oxidase agrave cotinina O tempo de meia vida da
nicotina eacute de aproximadamente 2 horas e da cotinina 16 horas Posteriormente a
5
cotinina eacute metabolizada em trans-3-hidroxicotinina quase que exclusivamente pela
CYP2A6 (outros isocircmeros da hidroxicotina representam menos de 2 da dose) 31 32
(Figura 3) Esta eacute a maior via de metabolizaccedilatildeo da nicotina (70 - 80 do metabolismo
da nicotina em todo o corpo) 33 no entanto haacute vias menores como por exemplo a
glucoronidaccedilatildeo que pode ser a maior determinante no clearence da nicotina em
indiviacuteduos com menor atividade da CYP2A6 31
Figura 3 - Via primaacuteria do metabolismo da nicotina A nicotina eacute
metabolizada marjoritaramente pela isoenzima CYP2A6 em nicotina-
iacuteon imiacutenio e atraveacutes da enzima aldeiacutedo oxidase eacute convertida em
cotinina A cotinina eacute posteriomente metabolizada em trans-3-
hidroxicotinina novamente pela isoenzima CYP2A6 Fonte adaptado
de Llaquet et al 2010 34
12 Faacutermacos antitabagismo
Os medicamentos de primeira escolha aprovados pela Agecircncia Nacional de
Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) incluem tratamentos com base na terapia de reposiccedilatildeo
nicotiacutenica (TRN) como adesivo goma e pastilha e tambeacutem satildeo utilizados vareniclina e
bupropiona Estes uacuteltimos possuem maior eficaacutecia terapecircutica na cessaccedilatildeo tabaacutegica 35 36
6
121 Vareniclina
1211 Farmacodinacircmica
A vareniclina eacute o faacutermaco mais recentemente utilizado para a interrupccedilatildeo do
tabagismo este foi desenvolvido especificamente para atuar nos nAChRs A sua
farmacodinacircmica estaacute mais associada agrave atuaccedilatildeo como um agonista parcial nos nAChRs
compostos pelas subunidades α4β2 37 os quais satildeo importantes alvos de accedilatildeo da
nicotina pois satildeo necessaacuterios e suficientes para a recompensa toleracircncia e
sensibilizaccedilatildeo 25 38 39 (Figura 4)
Estudos mostraram que em relaccedilatildeo agrave nicotina a vareniclina possui 15 vezes
maior afinidade pelas subunidades α4β2 e ativa em torno de 50 a liberaccedilatildeo de
dopamina no sistema mesocorticoliacutembico 37 O faacutermaco atua tambeacutem em outros
nAChR como nos nAChRs (α3β4) age fracamente nos receptores contendo a
subunidade α6 e em nAChRs (α3β2) aleacutem de exercer atividade agonista total nos
receptores α7 40
Quanto agraves reaccedilotildees adversas no uso do faacutermaco a naacuteusea eacute a mais comum (cerca
de 10 a 45 dos indiviacuteduos tratados) a qual muitas vezes leva agrave natildeo aderecircncia ao
tratatamento 41-43
7
Figura 4 - Mecanismo de accedilatildeo da vareniclina A Na ausecircncia da vareniclina a nicotina se liga aos
nAChRs aumentando a ativaccedilatildeo nesses receptores Aleacutem disso haacute o estiacutemulo endoacutegeno (promovido
pela acetilcolina) B A vareniclina eacute um agonista parcial de nAChR (α4β2) ou seja tambeacutem estimula
os nAChRs mas em menor niacutevel do que a nicotina e ao mesmo tempo eacute antagonista na presenccedila de
nicotina fazendo com que ela natildeo consiga se ligar ao receptor Fonte do autor baseado nas
informaccedilotildees de Kassem et al 2012 37
1212 Farmacocineacutetica
A vareniclina eacute rapidamente absorvida pelo trato intestinal com absorccedilatildeo gt90
logo apoacutes a administraccedilatildeo oral As concentraccedilotildees plasmaacuteticas maacuteximas satildeo alcanccediladas
no periacuteodo entre 3 e 4 horas 44 e o estado de equiliacutebrio da sua concentraccedilatildeo ocorre
dentro de 4 dias 37 44-46 O faacutermaco possui baixa ligaccedilatildeo com proteiacutenas plasmaacuteticas
sendo que de acordo com ensaios in vitro a fraccedilatildeo de vareniclina (100 ngmL) livre foi
de 797 47 A sua biodisponibilidade natildeo eacute afetada pelo tempo de administraccedilatildeo ou
ingestatildeo de alimentos 37 45 46 Aleacutem disso a vareniclina possui ampla distribuiccedilatildeo nos
tecidos sendo que o volume meacutedio de distribuiccedilatildeo aparente eacute de 415 litros
apresentando um coeficiente de variaccedilatildeo (CV) de 50 48
Na circulaccedilatildeo humana a vareniclina se encontra em quantidade marjoritaacuteria satildeo
tambeacutem encontrados os metaboacutelitos conjugados vareniclina N-carbomoil glucoroniacutedeo
8
N-formilvareniclina e oxovareniclina O tempo de meia vida da vareniclina eacute em torno
de 24 horas independente da dose administrada
A eliminaccedilatildeo do faacutermaco e metaboacutelitos se daacute principalmente pela urina (99) 49
A eliminaccedilatildeo renal exibe cineacutetica linear e a sua excreccedilatildeo ocorre pela filtraccedilatildeo
glomerular na qual estaacute associada agrave secreccedilatildeo tubular realizada pelo transportador
catiocircnico orgacircnico OCT2 O clearence estimado da vareniclina eacute de 88 a 155 mLmin
apoacutes administraccedilatildeo de dose uacutenica e 92 a 143 mLmin apoacutes doses repetidas A
depuraccedilatildeo de vareniclina eacute reduzida na presenccedila de doenccedila renal Na urina cerca de
90 do produto eliminado eacute encontrado como vareniclina em sua forma inalterada e
menos de 10 eacute encontrado na forma de 2 metaboacutelitos a hidroxivareniclina e a
vareniclina-N-carbomoil glucoroniacutedeo 37 49-51
Nenhum dos metaboacutelitos da vareniclina eacute acreditado ser farmacologicamente
ativo Aleacutem disso esses metaboacutelitos estatildeo presentes em concentraccedilotildees muito baixas 37
46-49 A Figura 5 mostra os metaboacutelitos provenientes da vareniclina
A formaccedilatildeo dos metaboacutelitos da vareniclina natildeo eacute catalisada pelo complexo
enzimaacutetico CYP450 Ensaios realizados com microssoma hepaacutetico humano mostraram
que a formaccedilatildeo do conjugado vareniclina N-carbomilglucoroniacutedeo eacute provavelmente
catalisado pela enzima UGT2B7 37 49
Figura 5 ndash Metabolismo da vareniclina em humanos Fonte adaptado de Obach et al 2006 49
9
122 Bupropiona
1221 Farmacodinacircmica
A bupropiona eacute um antidepressivo no entanto tem sido utilizado como faacutermaco
antitabagismo devido o seu potencial em diminuir o desejo de fumar (o qual foi
percebido durante o tramento de iacutendiviacuteduos fumantes) Como mecanismo de accedilatildeo a
bupropiona atua como um inibidor relativamente se
letivo da recaptaccedilatildeo de norepinefrina e dopamina com pequeno efeito na
recaptaccedilatildeo de serotonina (Figura 6) aleacutem de ser um antagonista de nAChR natildeo
competitivo Essas propriedades minimizam os sintomas de retirada da nicotina
aumentando a probabilidade do indiviacuteduo se abster do fumo 52
Insocircnia e boca seca satildeo as reaccedilotildees adversas mais comumente relatadas ao uso da
bupropiona (30-40 e 10 dos pacientes respectivamente) 53
Figura 6 - Mecanismo de accedilatildeo da bupropiona A Na ausecircncia da bupropiona neurotransmissores
como a noradrenalina serotonina e a dopamina satildeo recaptados endogenamente pela bomba de
recaptaccedilatildeo B Na presenccedila da bupropiona a qual eacute inibidora da bomba de recaptaccedilatildeo desses
neurotransmissores haacute a estimulaccedilatildeo do sistema de recompensa mais especificamente atraveacutes do
aumento da concentraccedilatildeo de dopamina Dessa forma o sistema continua sendo estimulado mas em
menor grau que a nicotina e as chances de abstinecircncia ao tabaco satildeo aumentadas Fonte do autor
baseado nas informaccedilotildees de Slemmer et al 2000 52
10
1222 Farmacocineacutetica
Conforme ensaios em voluntaacuterios sadios os picos maacuteximos de concentraccedilatildeo
plasmaacutetica de bupropiona satildeo alcanccedilados aproximadamente 3 horas apoacutes a sua
administraccedilatildeo oral O volume de distribuiccedilatildeo aparente eacute de aproximadamente 2000L e
a ligaccedilatildeo com proteiacutenas plasmaacuteticas eacute de 84 para a bupropiona e de 77 para a
hidroxibupropiona (o seu principal metaboacutelito ativo) 54
A bupropiona eacute metabolizada primariamente em uma seacuterie de metaboacutelitos ativos
como a hidroxibupropiona a threohidrobupropiona e a eritrohidrobupropiona (Figura
7) A CYP2B6 eacute a principal enzima que converte a bupropiona em hidroxibupropiona
em humanos No entanto a formaccedilatildeo de threohidrobupropiona e a
eritrohidrobupropiona que ocorre atraveacutes de reaccedilatildeo redutiva natildeo eacute mediada pela
CYP2B6 55 56 A eritroidrobupropiona natildeo pode ser mensurada no plasma apoacutes a
administraccedilatildeo de uma uacutenica dose de bupropiona Os metaboacutelitos ativos satildeo
posteriormente metabolizados em inativos e estes satildeo excretados na urina 54
Inibidores da CYP2B6 como por exemplo a ticlodipina um agente
antiplaquetaacuterio derivado da tienopiridina interagem com a bupropiona diminuindo a sua
hidroxilaccedilatildeo 57 58
Apoacutes a administraccedilatildeo crocircnica de doses de 150 a 300 mgdia a bupropiona e seus
metaboacutelitos assumem cineacutetica linear A bupropiona possui meia vida de 20 horas
aproximadamente e apresenta clearence meacutedio aparente correspondente a cerca de
200Lh A eliminaccedilatildeo da bupropiona ocorre principalmente atraveacutes da urina (87) e das
fezes (10) e eacute excretada em apenas 05 de forma inalterada nos mostrando um
extenso metabolismo 54
11
Figura 7 - Metabolismo da bupropiona em seus principais metaboacutelitos ativos A bupropiona eacute
extensamente metabolizada em hidroxibupropiona pela isoenzima CYP2B6 Os demais metaboacutelitos ativos
aatildeo metabolizados por outras enzimas Fonte adaptado de Hesse et al 2000 55
13 Pesquisa de biomarcadores
A variabilidade interindividual em resposta a faacutermacos antitabagismo sugere que
os tratamentos podem ser mais efetivos em subgrupos de fumantes 59-64 No contexto de
medicina personalizada diversos pesquisadores tecircm buscado a identificaccedilatildeo de
preditores de resposta aos tratamentos de cessaccedilatildeo tabaacutegica os quais geralmente estatildeo
envolvidos em aspectos farmacocineacuteticos e farmacodinacircmicos ou via de atuaccedilatildeo do
faacutermaco como por exemplo os fatores geneacuteticos o perfil de expressatildeo gecircnica de
proteiacutenas e de metaboacutelitos 65-68
Aleacutem de refletir a efetividade do tratamento estes biomarcadores tambeacutem
poderiam indicar a toxicidade ou a ocorrecircncia de efeitos adversos A combinaccedilatildeo
desses fatores com outras variaacuteveis individuais pode ser utilizada para adequar as
estrateacutegias preventivas e terapecircuticas 65-68
12
131 Estudos farmacogeneacuteticos e de expressatildeo gecircnica para vareniclina e
bupropiona
Diversos polimorfismos geneacuteticos tecircm sido associados com resposta agrave
vareniclina e agrave bupropiona 41 65 67-71
King et al 65 mostraram a associaccedilatildeo de polimorfismos de nucleotiacutedeos uacutenicos
(SNPs - single nucletide polimorfisms) nos genes CHRNA4 CHRNA5 CHRNA7
CHRNB2 (codificadores das subunidades α4 α5 α7 e β2 dos nAChRs
respectivamente) com abstinecircncia contiacutenua em resposta agrave vareniclina O mesmo
trabalho tambeacutem encontrou associaccedilatildeo dos polimorfismos nos genes CHRNA3
CHRNA5 CHRNB4 CHRNG (codificam as subunidades α3 α5 β4 e γ dos nAChR
respectivamente) Aleacutem disso os autores demonstraram a associaccedilatildeo de polimorfismos
nos genes HTR3A e HTR3B (codificadores dos receptores serotonineacutergicos) com a
frequecircncia de recaiacuteda no tratamento antitabagismo
Swan et al 41 verificaram a associaccedilatildeo de polimorfismos no gene CHRNB2 com
naacuteusea severa em pacientes tratados com vareniclina
Nosso grupo de pesquisadores encontrou a associaccedilatildeo do polimorfismo
rs10443196 no gene CHRNA4 e do polimorfismo 785AgtG no gene CYP2B6
(codificador da principal isoenzima metabolizadora da bupropiona) com uma maior taxa
de sucesso no tratamento com vareniclina e bupropiona respectivamente 67 68
O gene CYP2B6 eacute um dos alvos mais importantes de estudos farmacogeneacuteticos
no tratamento com bupropiona Diversos polimorfismos neste gene satildeo preditores de
metabolizaccedilatildeo lenta ou raacutepida os quais foram associados com as diferenccedilas de
concentraccedilotildees do faacutermaco e de seu principal metaboacutelito ativo hidroxibupropiona em
amostras bioloacutegicas Essas concentraccedilotildees tambeacutem se associaram agrave variabilidade na
resposta ao tratamento com bupropiona 72-74
13
Polimorfismos podem implicar em diversos mecanismos moleculares como por
exemplo alteraccedilatildeo constituiccedilatildeo ou conformaccedilatildeo de proteiacutenas mudanccedilas poacutes-
traducionais e a regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica gerando variabilidade interindividual
nos niacuteveis de RNA transcrito o que poderiam explicar as diferenccedilas de resposta aos
faacutermacos antitabagismo 72
O polimorfismo CHRNA4 (rs2236196) assim como diversos polimorfismos
presentes no gene CYP2B6 os quais foram associados agrave resposta ao tratamento com
vareniclina e bupropiona respectivamente foram tambeacutem associados a maiores e
menores niacuteveis de expressatildeo gecircnica 72-75 Tambeacutem vale salientar que assim como a
expressatildeo gecircnica pode afetar a resposta ao tratamento a expressatildeo gecircnica tambeacutem pode
ser alterada em resposta aos faacutermacos 76 Neste sentido Smith et al 76 mostraram que a
vareniclina pode afetar a expressatildeo gecircnica da enzima DNA metiltransferase-1 (DNMT)
que mostrou estar envolvida em mecanismos epigeneacuteticos em neurocircnios corticais
GABaeacutergicos os quais estatildeo relacionados a processos cognitivos em indiviacuteduos
esquizofrecircnicos fumantes
O tratamento crocircnico com vareniclina modificou a expressatildeo dos nAChRs em
ceacuterebros de camundongos O upregulation dos nAChRs (α4β2) pelo uso crocircnico da
vareniclina foi similar ao promovido ao uso crocircnico da nicotina Similar dowregulation
foi visto para os nAChRs (α6β2) A vareniclina aumentou significantemente ambos
nAChRs (α3β4) e α7 enquanto a nicotina teve menor efeito nestes siacutetios 77
Em estudos com pacientes voluntaacuterios a obtenccedilatildeo de amostras do sistema
nervoso central eacute inviaacutevel Como alternativa a esse problema estudos tecircm proposto a
anaacutelise de expressatildeo gecircnica em sangue perifeacuterico 78-80 Embora natildeo seja o tecido alvo da
farmacodinacircmica dos medicamentos antitabagismo o sangue possui muitas
similaridades a niacutevel transcricional com muacuteltiplas regiotildees cerebrais 81
14
Hennings et al 82 mostraram diferenccedilas no perfil de expressatildeo gecircnica em ceacutelulas
mononucleares de sangue perifeacuterico (PBMCs) de pacientes respondedores e natildeo
respondedores a tratamentos com antidepressivos e muitos dos genes diferentemente
expressos satildeo codificadores de receptores tambeacutem presentes no SNC
Ota et al 83 mostraram que os genes GABRR2 (codificador de receptor
GABAeacutergico) e CHRNA3 (codificador da subunidade α3 de nAChR) foram
diferentemente expressos em sangue perifeacuterico em resposta ao tratamento com
risperidona em pacientes com esquizofrenia
Em outro estudo Kordi-Tamandani et al 84 mostraram que os niacuteveis de
expressatildeo gecircnica de SLC6A3 em leucoacutecitos diferiram entre indiviacuteduos dependentes de
opioacuteides e voluntaacuterios saacutedios Este gene eacute codificador de uma importante proteiacutena
recaptadora de dopamina em neurocircnios chamada DAT
Wongsriraksa et al 85 mostraram a expressatildeo das subunidades α4 α5 α7 β1 e
β2 em um estudo de caracterizaccedilatildeo de nAChRs em amostras de PBMC de humanos
atraveacutes de nicotina radioligante sugerindo conter as subunidades α4β2 α4β2α5 eou α7
Por fim diversos estudos tecircm mostrado que os nAChRs satildeo importantes para processos
imunoloacutegicos 86-91
Estudos tecircm evidenciado a expressatildeo de receptores dopamineacutergicos em
leucoacutecitos humanos Embora a dopamina natildeo ultrapasse a barreira hematoencefaacutelica as
diferenccedilas nos niacuteveis de dopamina do sistema nervoso central poderiam alterar a
expressatildeo desses receptores em leucoacutecitos ainda durante a sua formaccedilatildeo via inervaccedilatildeo
da coluna espinal doenccedilas como Parkinson Alzheimer e adiccedilatildeo agraves substacircncias
psicoativas poderiam influenciar na expressatildeo desses receptores em sangue perifeacuterico 92
15
132 Mensuraccedilatildeo de nicotina bupropiona vareniclina e seus metaboacutelitos em
amostras bioloacutegicas
A nicotina possui um baixo tempo de meia-vida e a isoenzima CYP2A6 eacute
predominante responsaacutevel pelo metabolismo da nicotina em cotinina e trans-3-
hidroxicotinina (seus principais metaboacutelitos) 93 94 Estes e a nicotina satildeo marcadores de
exposiccedilatildeo ao tabaco e indicativo de fumo 95
A taxa de metabolizaccedilatildeo da nicotina (NMR) obtida pela relaccedilatildeo da
concentraccedilatildeo de trans-3-hidroxicotininacotinina tem sido associada com DN com
desfecho e com escolha farmacoloacutegica de tratamento antitabagismo 95 96 Os valores
contiacutenuos e categoacutericos de NMR (metabolizadores lentos vs normais e raacutepidos) se
mostraram estaacuteveis em fumantes independente da carga tabaacutegica 32 97 98
A bupropiona eacute um faacutermaco extensamente metabolizado e a principal isoenzima
envolvida em seu metabolismo eacute a CYP2B6 a qual medeia quase que exclusivamente o
processo de hidroxilaccedilatildeo desse faacutermaco formando o metaboacutelito hidroxibupropiona 55
Diversos estudos tecircm associado as concentraccedilotildees de bupropiona e de hidroxibupropiona
em amostras de soro plasma e urina com a resposta ao faacutermaco 73 74
Zhu et al 73 em um estudo cliacutenico duplo-cego e placebo controlado os
indiviacuteduos foram tratados com bupropiona ou placebo por 6 meses Na terceira semana
de tratamento foram colhidas amostras de plasma para mensuraccedilatildeo de bupropiona e seu
principal metaboacutelito ativo a hidroxibupropiona As concentraccedilotildees mais elevadas de
hidroxibupropiona resultaram em melhores resultados de cessaccedilatildeo do tabagismo
Laib et al 74 apresentaram que as concentraccedilotildees de hidroxibupropiona em soro
foram correlacionadas com as diferentes respostas agrave bupropiona em pacientes com
depressatildeo analisadas atraveacutes de uma escala de impressatildeo clinica global
16
Quanto agrave vareniclina este eacute um faacutermaco pouco metabolizado sendo que 5 a
10 da dose pode ser encontrada na forma metaboacutelitos (soro plasma e urina) 49 Os
metaboacutelitos de vareniclina jaacute identificados em humanos em estudos preacutevios satildeo
hidroxivareniclina vareniclina N-carbomoilglucoroniacutedeo oxovareniclina N-
glicosilvareniclina e N-formilvareniclina 47 49 99 Pouco se conhece sobre as enzimas
que metabolizam a vareniclina Obach et al 49 mostrou o envolvimento da enzima
UG2B7 com o processo de glucoronidaccedilatildeo do faacutermaco Ainda natildeo haacute estudos que
associam os metaboacutelitos de vareniclina com resultados de desfecho de tratamento
17
2 JUSTIFICATIVA
Considerando a elevada prevalecircncia do tabagismo e a dificuldade dos indiviacuteduos
fumantes em se abster do tabaco estudos que apontem uma terapecircutica farmacoloacutegica
mais efetiva podem contribuir enormemente para o processo de cessaccedilatildeo tabaacutegica
Neste cenaacuterio a anaacutelise da expressatildeo de genes de interesse e a mensuraccedilatildeo de analitos
podem ser ferramentas uacuteteis na identificaccedilatildeo de marcadores e de subgrupos de resposta
ao tratamento antitabagismo
Escolhemos a realizaccedilatildeo da mensuraccedilatildeo de analitos nas amostras de soro dos
pacientes tratados com ambos os faacutermacos antitabagismo (vareniclina e bupropiona) e
especialmente para os pacientes tratados com vareniclina foram realizadas anaacutelises de
expressatildeo gecircnica de ceacutelulas mononucleares provenientes de amostras de sangue
perifeacuterico (do inglecircs Peripheral Blood Mononuclear Cell - PBMC) O ensaio
customizado para as anaacutelises da expressatildeo de 17 genes foi um grande investimento
financeiro nesta pesquisa e portanto o priorizamos para analisar as amostras dos
pacientes tratados com vareniclina jaacute que eacute o faacutermaco mais novo eficaz e custoso no
tratamento antitabagismo
As anaacutelises de expressatildeo gecircnica em amostras de PBMC satildeo de grande valia pois
seria importante encontrar em amostras de tatildeo faacutecil obtenccedilatildeo como amostras de sangue
um marcador de resposta que poderia ter correlaccedilatildeo com a expressatildeo gecircnica do sistema
nervoso central
Identificar um possiacutevel marcador preditivo de sucesso na utilizaccedilatildeo de um
determinado faacutermaco no iniacutecio da sua administraccedilatildeo foi uma das investigaccedilotildees deste
protocolo Os resultados desse estudo exploratoacuterio podem ser uacuteteis no entendimento do
comportamento de expressatildeo dos genes escolhidos (mais comumente expressos no
18
SNC) em amostras de sangue e na elaboraccedilatildeo de pesquisas mais amplas para a
identificaccedilatildeo de biomarcadores de resposta ao tratamento antitabagismo
19
3 OBJETIVOS
31 Analisar a possiacutevel associaccedilatildeo da expressatildeo de genes de interesse em amostras de
sangue perifeacuterico com a resposta ao tratamento com vareniclina
32 Analisar a possiacutevel associaccedilatildeo das concentraccedilotildees de faacutermacos antibagismo nicotina
e seus metaboacutelitos com a resposta ao tratamento com vareniclina e bupropiona
20
4 METODOLOGIA
41 Casuiacutestica
Foi realizado um estudo de coorte prospectivo no qual foram incluiacutedos 105
pacientes homens e mulheres fumantes provenientes do Programa de Assistecircncia ao
Fumante (PAF) do Instituto do Coraccedilatildeo do Hospital das Cliacutenicas da Faculdade de
Medicina da Universidade de Satildeo Paulo (InCor) com idade ge 18 anos IMC ge 185 e lt
30 kgm2 e que iniciariam o tratamento com vareniclina (n=74 para a mensuraccedilatildeo dos
analitos destes n=27 para as anaacutelises de expressatildeo gecircnica) ou com bupropiona (n=31
para a mensuraccedilatildeo dos analitos) (Figura 8)
A inclusatildeo dos pacientes ocorreu atraveacutes do protocolo de pesquisa ldquoEficaacutecia do
uso de marcadores geneacuteticos na escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismordquo o
qual foi aprovado no processo de submissatildeo ao Comitecirc de Eacutetica Institucional (CAAE
60133816000000068) - SDC 434116007 (Anexo 4) O presente estudo foi aprovado
como subprojeto do anterior atraveacutes do parecer nordm 2118913 (Anexo 1) Os pacientes
foram informados do estudo e consentiram a sua participaccedilatildeo ao assinar o termo de
consentimento livre e esclarecido (Apecircndice)
Foram excluiacutedos do estudo os pacientes que possuiacutessem desordens hepaacutetica
renal e gastrointestinal que comprometessem o metabolismo e eliminaccedilatildeo dos faacutermacos
os pacientes que faziam uso de medicamentos indutores ou inibidores das enzimas do
citocromo P450 nas uacuteltimas 6 semanas os pacientes etilistas e usuaacuterios de droga os
pacientes com doenccedilas psiquiaacutetricas instaacuteveis as mulheres em risco de gravidez e os
pacientes com contra-indicaccedilatildeo ao tratamento com bupropiona ou vareniclina
mencionados acima
21
Os pacientes foram acompanhados pela equipe do PAF e o tratamento
farmacoloacutegico foi conduzido por 12 semanas Foram considerados os seguintes
desfechos no tratamento ldquosucessordquo se o paciente parasse de fumar ateacute a 4ordf semana de
tratamento (T4) e ldquoresistenterdquo se o paciente natildeo conseguisse parar de fumar ateacute a 4ordf
semana de tratamento
22
Bupropiona
n=31
Visita T-1 Visita T0
(iniacutecio da medicaccedilatildeo)
Visita T2 Visita T4
Desfecho
Vareniclina
n=74
RNA Basal Vareniclina
n= 27
RNA RNA
Mensuraccedilatildeo de analitos vs Desfecho (T2)
vareniclina nicotina cotinina e hidroxicotinina
Mensuraccedilatildeo de analitos vs Desfecho (T2)
bupropiona hidroxibupropiona nicotina cotinina e hidroxicotinina
Soro
Soro
Figura 8 - Desenho do estudo O nuacutemero amostral total do estudo foi de 105 pacientes Foram incluiacutedos 74 pacientes tratados com vareniclina e 31 pacientes tratados com bupropiona Esses foram
submetidos agrave coleta de amostras de sangue no periacuteodo de 2 semanas (T2) apoacutes o iniacutecio da terapecircutica Apoacutes foi realizada a mensuraccedilatildeo de analitos e a anaacutelise de associaccedilatildeo com os desfechos de
tratamento Aleacutem disso os pacientes tratados com vareniclina tambeacutem foram submetidos agrave coleta de amostras para a obtenccedilatildeo de RNA em trecircs distintos periacuteodos de tempo antes de iniciar a
terapecircutica (T0) 2 semanas (T2) e 4 semanas apoacutes iniciar a terapecircutica farmacocoloacutegica (T4) Amostras de 14 pacientes que obtiveram sucesso no tratamento e de 13 que obtiveram resistecircncia (n=27)
foram analisadas quanto agrave expressatildeo de 17 genes candidatos (52 amostras ao todo 9 resistentes do tempo T0 7 resistentes do T2 8 resistente do T4 9 sucessos do T0 8 sucessos do T2 e 11 sucessos
do T4 vide toacutepico 42 Nuacutemero amostral) Apoacutes foram realizadas as anaacutelises de associaccedilatildeo entre os niacuteveis dos transcritos e os desfechos e tempos de tratamento Os pacientes foram acompanhados por
12 semanas durante o tratamento farmacoloacutegico no entanto o desfecho foi definido na 4 ordf semana (T4) pois apoacutes esse periacuteodo o tratamento seria reavaliado e poderia haver mudanccedila na medicaccedilatildeo T-
1= visita inicial T0= antes do iniacutecio da terapecircutica T2= 2 semanas apoacutes o iacutenicio do tratamento T4= 4 semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento T12= 12 semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento Desfecho na
visita T4 = ldquosucessordquo se o paciente parasse de fumar ateacute a 4ordf semana de tratamento (T4) e ldquoresistenterdquo se o paciente natildeo conseguisse parar de fumar ateacute a 4ordf semana de tratamento Fonte do autor
Visita T12
Final do tratamento farmacoloacutegico
RNA vs Desfecho (T0 T2 e T4)
14 sucessos e 13 resistentes
CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2
CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3 DRD4
HTR3A HTR3B COMT e SLC6A3
23
42 Fluxo de procedimentos adotados no atendimento aos pacientes
O tratamento farmacoloacutegico antitabagismo possui a duraccedilatildeo de 3 meses (12
semanas) No estudo de ldquoEficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticosrdquo foram coletados
dados cliacutenicos em 7 visitas T-1 (visita inicial) T0 (visita de iniacutecio do tratamento) T2
T4 T6 T8 e T12 (2 4 6 8 e 12 semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico)
Neste projeto foram utilizados os tempos de visita dos pacientes nas consultas
para a realizaccedilatildeo da coleta de amostras Dessa forma foi facilitado o comparecimento
desses pacientes ao procedimento Os pacientes precisavam estar comprometidos em
administrar os medicamentos todos os dias no horaacuterio combinado e terem
disponibilidade de tempo para as coletas as quais natildeo necessariamente coincidiram
com o horaacuterio das consultas pois as coletas foram realizadas no mesmo horaacuterio de
tomada do medicamento para que as anaacutelises de todos os pacientes pudessem ser
comparaacuteveis
Na visita T-1 foi aplicado o TCLE do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores
geneacuteticosrdquo bem como o questionaacuterio para coletar informaccedilotildees cliacutenicas Aleacutem disso os
pacientes foram avaliados quanto agrave DN atraveacutes do teste de Fagerstroumlm para DN (FTND)
100 e do escore de consumo situacional Issa (escore Issa) 101 (Anexos 2 e 3
respectivamente) O escore Issa eacute utilizado pelo PAF para a reclassificaccedilatildeo como
moderados ou altamente dependentes os pacientes que obteacutem o escore de FTND abaixo
de 5 mas que no entanto possuem niacutevel de DN consideraacutevel em relaccedilatildeo aos efeitos
psicoativos da nicotina A reclassificaccedilatildeo ocorre quando os pacientes obtecircm escore Issa
ge3 Apoacutes os pacientes foram randomizados em dois braccedilos do estudo tratamento com
vareniclina ou tratamento baseado na farmacogeneacutetica Os pacientes realizaram coleta
de sangue com o objetivo de obtenccedilatildeo do DNA para o estudo ldquoEficaacutecia do uso de
marcadores geneacuteticosrdquo
24
Apoacutes a genotipagem das amostras e escolha da medicaccedilatildeo dos pacientes
(vareniclina ou conforme geneacutetica) foi realizada ligaccedilatildeo telefocircnica para o paciente
informando o medicamento que iria tomar Nesta mesma ligaccedilatildeo o paciente tambeacutem foi
convidado a participar do presente estudo e todas as informaccedilotildees quanto agrave necessidade
de tomar o medicamento antitabagismo sempre no mesmo horaacuterio quanto aos dias das
coletas bem como as informaccedilotildees de preparaccedilatildeo para os procedimentos foram
transmitidas aos pacientes
Para os pacientes que seriam tratados com vareniclina ainda foi importante levar
em consideraccedilatildeo o horaacuterio que o paciente costumava tomar cafeacute da manhatilde para entatildeo
decidir o horaacuterio de administraccedilatildeo do faacutermaco pois o mesmo precisava ser
administrado apoacutes refeiccedilatildeo generosa com o intuito de diminuir o risco de naacuteusea
As coletas foram padronizadas para serem realizadas agraves manhatildes no mesmo
horaacuterio que o paciente tomaria a primeira dose do dia do medicamento antitabaacutegico O
horaacuterio de coleta entre os pacientes foi fixado entre 7 e 10 horas da manhatilde para evitar
variaccedilatildeo circadiana interpacientes No entanto entre as coletas do mesmo paciente o
horaacuterio de coleta e de administraccedilatildeo do medicamento foi sempre o mesmo com
variaccedilatildeo natildeo superior agrave 1 hora (esta variaccedilatildeo foi registrada)
Os pacientes foram orientados a realizar jejum de 10 horas (sendo liberada a
ingestatildeo de aacutegua e outros medicamentos ateacute 1 hora antes da coleta) e trazer o
medicamento antitabaacutegico para tomar apoacutes o procedimento A dose diurna dos
medicamentos antitabagismo natildeo foi administrada antes da coleta para evitar efeitos
agudos nas anaacutelises O periacuteodo de jejum foi realizado para que a amostra tivesse menor
quantidade de interferentes possiacutevel e tambeacutem para natildeo promover efeitos agudos dos
alimentos na expressatildeo gecircnica Um dia antes de cada coleta foi realizada ligaccedilatildeo
telefocircnica ou envio de mensagem para os pacientes com o objetivo de lembraacute-los do
25
procedimento das orientaccedilotildees de preparo e confirmar o uso e o cumprimento do horaacuterio
de administraccedilatildeo do medicamento antitabagismo (essa confirmaccedilatildeo da adesatildeo foi
realizada para as coletas nas visitas T2 e T4 quando os pacientes jaacute haviam iniciado o
tratamento farmacoloacutegico)
Na visita T0 para os pacientes que iniciariam o tratamento com vareniclina foi
aplicado o TCLE do presente projeto e colheu-se uma amostra de sangue para a
obtenccedilatildeo do RNA ainda antes de iniciarem o tratamento Foram fornecidas aos
pacientes as orientaccedilotildees de como tomar o medicamento e informaccedilotildees para a proacutexima
coleta Os pacientes foram orientados agrave tomarem o medicamento neste mesmo dia ou no
dia seguinte
Na visita T2 foram coletadas amostras de soro dos pacientes tratados com
bupropiona e amostras de soro e RNA dos pacientes tratados com vareniclina
Na visita T4 foram coletadas amostras de RNA dos pacientes tratados com
vareniclina
No Quadro 1 abaixo estatildeo resumidos os procedimentos orientaccedilotildees e coletas de
amostras
Quadro 1 - Procedimentos do protocolo em relaccedilatildeo aos pacientes
T-1 Aplicaccedilatildeo do TCLE do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores
geneacuteticosrdquo
Aplicaccedilatildeo de questionaacuterios
Coleta de DNA
1 dia antes de T0 Ligaccedilatildeo para informar o medicamento que o paciente iria tomar
Convite para participar do presente estudo
Determinar com o paciente qual era o melhor horaacuterio para
26
administraccedilatildeo do medicamento antibagismo (neste mesmo horaacuterio
que foram realizadas todas as coletas)
Orientaccedilotildees para a coleta em T0
T0 Aplicaccedilatildeo do TCLE do presente estudo
Coleta de amostra de RNA (para os pacientes que seriam tratados
com vareniclina)
Orientaccedilotildees para iniciar o tratamento no mesmo dia ou dia
seguinte
1 dia antes de T2 Orientaccedilotildees para coleta em T2
Confirmaccedilatildeo se o paciente estava tomando o medicamento e no
horaacuterio combinado
T2 Aplicaccedilatildeo do TCLE do presente estudo para os pacientes tratados
com bupropiona
Coleta de soro para os pacientes tratados com bupropiona e coleta
de RNA e soro dos pacientes tratados com vareniclina
1 dia antes de T4 Orientaccedilotildees para coleta em T2
Confirmaccedilatildeo se o paciente estava tomando o medicamento e no
horaacuterio combinado
T4 Coleta de RNA dos pacientes tratados com vareniclina
43 Coleta e armazenamento das amostras dos pacientes tratados com vareniclina e
bupropiona
Os pacientes tratados com vareniclina foram submetidos agrave coleta de sangue para
a obtenccedilatildeo de RNA em 3 periacuteodos de tempo T0 (ainda antes de iniciar o tratamento T2
27
e T4 Para isto foram utilizados os tubos PAXgene Blood RNA Tubes BRT (Qiagen
USA) para a obtenccedilatildeo de RNA Apoacutes a coleta os tubos PAXgene foram encubados em
bancada por 2 horas agrave temperatura ambiente para garantir a lise completa das ceacutelulas
sanguiacuteneas e apoacutes os tubos foram armazenados a -20degC ateacute a extraccedilatildeo do RNA das
amostras
No periacuteodo T2 tambeacutem foram coletadas amostras para a obtenccedilatildeo do soro dos
pacientes tratados com vareniclina e bupropiona Neste periacuteodo as concentraccedilotildees dos
metaboacutelitos dos faacutermacos jaacute se encontravam em estado de equiliacutebrio Para isto foram
utilizados tubos sem aditivo (Vacuette Greiner Bio-one) Os tubos foram mantidos a
temperatura ambiente ateacute a formaccedilatildeo de coaacutegulo Apoacutes os tubos foram centrifugados a
4degC a 3000 rpm por 10 min para se obter amostras de soro As amostras foram entatildeo
aliquotadas em 4 criotubos de soro e armazenadas em freezer a -80ordmC ateacute o momento
das anaacutelises
44 Nuacutemero amostral
Quanto ao nuacutemero amostral para o ensaio de expressatildeo gecircnica dos 74 pacientes
tratados com vareniclina foram escolhidas amostras de 27 pacientes (14 do grupo
sucesso e 13 do grupo resistente) baseado em estudos anteriores 83 102 que seguiram
corretamente o jejum que realizaram a tomada do medicamento nos horaacuterios
combinados e compareceram em todos e tempos de coleta Sendo ao todo 81 amostras
devido aos de 3 tempos de tratamento (T0 T2 e T4)
No entanto algumas amostras natildeo apresentaram bons resultados para a anaacutelise
de expressatildeo gecircnica e realizamos o ensaio de expressatildeo para 60 amostras de diversos
tempos Oito amostras natildeo apresentaram resultados de amplificaccedilatildeo e finalizamos com
52 amostras ao todo (9 resistentes do tempo T0 7 resistentes do T2 8 resistentes do T4
28
9 sucessos do T0 8 sucessos do T2 e 11 sucessos do T4) provenientes de 14 pacientes
do grupo sucesso e 13 do grupo resistente Esse tamanho amostral para cada grupo de
anaacutelise eacute comparaacutevel agrave estudos anteriores 102
Quanto ao nuacutemero amostral para a mensuraccedilatildeo dos analitos houve a inclusatildeo de
74 pacientes tratados com vareniclina e 31 tratados com bupropiona Nuacutemero amostral
semelhante foi utilizado no estudo de Laib et al 74 Das 105 amostras 3 amostras dos
pacientes tratados com vareniclina e 1 de paciente tratado com bupropiona apresentaram
concentraccedilotildees abaixo do limite de quantificaccedilatildeo (LQ) e estas foram excluiacutedas das
anaacutelises de concentraccedilatildeo dos analitos ficando com nuacutemero amostral final de 71 para
vareniclina e 30 para bupropiona
45 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica para amostras de pacientes tratados com
vareniclina
451 Concentraccedilatildeo purificaccedilatildeo e extraccedilatildeo de RNA
O processo de purificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo do RNA foi realizado atraveacutes do
PAXgene Blood RNA Kit (Qiagen USA) Antes de iniciar o procedimento a
temperatura dos tubos PAXgene Blood tubes (BRT) (Qiagen USA) os quais estavam
armazenados em freezer -20degC foi estabilizada mantendo os tubos em temperatura
ambiente em torno de 4 horas ou over night
Para o processo de purificaccedilatildeo do RNA primeiramente realizou-se a
homogeneizaccedilatildeo do sangue total contido no tubo PAXgene Blood tubes (BRT) e a
centrifugaccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos por 10 min em 3000 rcf havendo a formaccedilatildeo de um
pellet e o sobrenadante foi desprezado Apoacutes foi realizada a lavagem do pellet
adicionando-se 4 mL de aacutegua livre de RNase (RNFW) mistura foi submetida ao voacutertex
ateacute a dissoluccedilatildeo visiacutevel do pellet e o conteuacutedo foi centrifugado por 10 minutos a 3000
29
rcf sendo descartado o sobrenadante O pellet foi ressuspendido com 350 μL de tampatildeo
de ressuspensatildeo (BR1) atraveacutes de voacutertex ateacute a sua dissoluccedilatildeo e transferido para o tubo
de microcentrifugaccedilatildeo (15 mL MCT) Foram adicionados no tubo MCT 300 μL de
tampatildeo de ligaccedilatildeo (BR2) e 40 μL de proteinase K (PK) a mistura foi submetida ao
voacutertex durante 5 segundos e incubada durante 10 minutos a 55degC com agitaccedilatildeo de 1400
rpm provocando dessa forma a digestatildeo de proteiacutenas
Apoacutes o processo de incubaccedilatildeo foram realizados diversos processos de remoccedilatildeo
de impurezas em colunas de rotaccedilatildeo O lisado foi transferido para a coluna de rotaccedilatildeo
do homogeneizador PAXgene (PSC lilaacutes) a qual foi colocada em um tubo de
processamento (PT) de 2 mL e centrifugado durante 3 minutos agrave velocidade de 16100
rcf dessa forma foi realizada a homogeneizaccedilatildeo do lisado de ceacutelulas e remoccedilatildeo dos
detritos celulares residuais Em seguida o sobrenadante da fraccedilatildeo residual foi
transferido para o tubo de microcentrifugaccedilatildeo (15 mL MCT) novo (sem interferir no
pellet) e foram adicionados 350 μL de etanol (96-100 grau de pureza PA) a mistura
foi submetida ao voacutertex e centrifugada por breves instantes (1-2 segundos 500-1000 x g)
para remover as gotas presentes no interior da tampa do tubo
Foram transferidos 700 μL de amostra para a coluna de rotaccedilatildeo de RNA
PAXgene (PRC vermelho) esta foi colocada e um tubo de processamento (PT) de 2
mL no qual foi centrifugado durante 1 minuto a 12000 rcf Apoacutes a coluna de rotaccedilatildeo
foi colocada em um tubo PT novo (o tubo PT utilizado anteriormente foi descartado) O
restante da amostra foi colocado na mesma coluna de rotaccedilatildeo PRC e o processo de
centrifugaccedilatildeo foi repetido por mais 2 vezes sempre transferindo a coluna para um tubo
de processamento novo Antes da uacuteltima centrifugaccedilatildeo foram adicionados 350 μL de
tampatildeo de lavagem 1 (BR3) na coluna PRC
30
Em seguida foram adicionados 10 μL de soluccedilatildeo-matildee de DNase I (RNFD) a 70
μL de tampatildeo de digestatildeo de DNA (RDD) em um tubo de microcentrifugaccedilatildeo de 15
mL (MCT) O conteuacutedo foi misturado suavemente e centrifugado durante breves
instantes para colher o liacutequido residual dos lados do tubo Apoacutes 80 μL dessa mistura
foram transferidos diretamente para a membrana da coluna PRC e esta foi incubada agrave
temperatura ambiente (20-30degC) durante 15 minutos
Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foram adicionados 350 μL de tampatildeo de lavagem
1 (BR3) para a membrana da coluna e esta foi centrifugada durante 1 min a 12000 rcf
Apoacutes a coluna PRC foi colocada em um tubo (PT) novo e foram adicionados 500 μL de
tampatildeo de lavagem 2 (BR4) na membrana da coluna A centrifugaccedilatildeo foi repetida o
tubo PT foi descartado e a coluna PRC foi colocada em um novo tubo PT A lavagem
com 500 uL de BR4 e a centrifugaccedilatildeo foi repetida novamente (poreacutem o tempo de
centrifugaccedilatildeo foi de 3 minutos) Apoacutes foi realizada uma centrifugaccedilatildeo adicional em um
tubo PT novo durante 1 minuto a 12000 rcf (sem adiccedilatildeo de tampatildeo)
A coluna de rotaccedilatildeo (PRC) foi colocada em tubo de 15 mL (MCT) Foram
adicionados diretamente na membrana da coluna 80 μL de tampatildeo de eluiccedilatildeo (BR5) a
qual foi encubada agrave temperatura ambiente por 5 minutos e centrifugada por 1 minuto a
12000 rcf para eluir o RNA
As amostras foram quantificadas atraveacutes de leitura em espectrofotocircmetro no
comprimento de onda 260 nm (utilizando como branco o tampatildeo BR5) e foram
armazenadas a -20ordmC ateacute o momento das anaacutelises Para avaliar a qualidade do RNA
gerado foi realizada uma eletroforese em gel de agarose para a verificaccedilatildeo da
integridade do RNA ribossomal
31
452 Siacutentese de cDNA
O processo de siacutentese de cDNA foi realizado atraveacutes do RT2 First Strand Kit
(Qiagen USA) Os reagentes do kit foram descongelados e centrifugados brevemente
(10-15 segundos)
Primeiramente foi preparada uma mix para a degradaccedilatildeo do DNA genocircmico
composta por 2microL de tampatildeo GE 800 ng de RNA e quantidade variaacutevel de aacutegua livre
de RNase ateacute o volume final de 10 μL ou 8 μL de RNA (para amostras com
concentraccedilotildees abaixo de 100 ngμL) sem a aacutegua livre de RNase A mistura foi incubada
a 42ordmC por 5 minutos Apoacutes a incubaccedilatildeo a mistura foi colocada imediatamente em gelo
durante pelo menos 1 min
Apoacutes foi preparada uma mix para a realizaccedilatildeo da transcriccedilatildeo reversa esta foi
composta por 4 microL tampatildeo 5x (BC3) 1 microL de controle P2 (controle externo de RNA) 2
microL de mix de transcriptase reversa (RE3) e 3 microL de aacutegua livre de Rnase Foram
adicionados 10 μL da mix preparada em cada tubo contendo a mix de eliminaccedilatildeo de
DNA genocircmico A mistura foi homogeneizada delicadamente com a pipeta e incubada a
42 degC durante exatamente 15 min em seguida a reaccedilatildeo foi interrompida por incubaccedilatildeo
a 95 degC durante 5 min Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foram adicionados a cada reaccedilatildeo
91 μL de aacutegua livre de RNase e a mistura foi homogeneizada atraveacutes de pipeta diversas
vezes O produto final foi armazenado a -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo em cadeia da
polimerase (PCR) em tempo real
453 Ensaio de controle de qualidade das amostras para o ensaio de expressatildeo
gecircnica
Todas as amostras de cDNA foram analisadas quanto sua qualidade pelo ensaio
de controle de qualidade (disco QC Qiagen) em disco de 100 poccedilos (representaccedilatildeo do
32
disco nas Figuras 9 e 10) atraveacutes do PCR em tempo real com equipamento Rotor Gene
6000 (Corbett) Cada disco QC tem a capacidade de analisar 12 amostras sendo
necessaacuterios 5 discos para analisar 60 amostras
O disco QC eacute composto por primers especiacuteficos para a amplificaccedilatildeo de 2
Housekeeping genes ndash ACTB e HPRT1 (genes constitutivos que satildeo necessaacuterios para a
manutenccedilatildeo baacutesica da funccedilatildeo celular e satildeo expressos em todas as ceacutelulas de um
organismo em condiccedilotildees normais e fisiopatoloacutegicas) e 6 controles 1 controle de
transcriccedilatildeo reversa (RTC) 1 controle positivo de PCR (PPC) 1 controle de
contaminaccedilatildeo com DNA genocircmico (GDC) 1 controle de natildeo transcriccedilatildeo reversa
(NTR) 1 PPC (sem amostra) e 1 controle negativo NTC (mapa na Figura 10)
Foram preparadas 12 mixes para cada uma das amostras de cDNA Sendo 92 μL
de aacutegua livre de RNase e 08 μL de cDNA essas quantidades foram multiplicadas por 6
para se ter sobra e distribuir em 5 poccedilos cada mix de amostra (poccedilos que continham
pares de primers para 2 housekeeping genes e 3 controles) Foram distribuiacutedos 10 μL de
mix e 10 μL de RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR Master Mix (Qiagen USA) em cada
poccedilo (linhas A a E) Essa master mix conteacutem corante fluorescente intercalante de DNA
Apoacutes foram preparadas 12 mixes uma para cada amostra matildee de RNA (diluiacutedo
1100) Foram utilizados 963 μL de aacutegua livre de RNase e 072 μL de RNA (1100)
essas quantidades foram multiplicadas por 3 para se ter sobra Foram pipetados 1037
μL de mix de RNA e 963 μL de RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR Master Mix em
cada poccedilo da linha F para a anaacutelise do controle de transcriccedilatildeo reversa NTR
Apoacutes foram preparadas mixes sem as amostras para os 2 uacuteltimos controles PPC
e NTC compostas por 10 μL de aacutegua e 10 μL de RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR
Master Mix (multiplicados por 24) para as linhas G e H
33
O disco foi submetido agrave seguinte programaccedilatildeo 1 ciclo de 10 minutos a 95degC
(temperatura de ativaccedilatildeo da Taq polimerase) e 40 ciclos de 15 segundos a 95degC e 30
segundos a 60degC (para a amplificaccedilatildeo e realizaccedilatildeo da captura dos dados de
fluorescecircncia) Atraveacutes do software real-time cycler (Qiagen USA) foi ajustada a linha
de base (Threshold) do graacutefico de amplificaccedilatildeo logariacutetimica do cDNA para dessa
forma remover ruiacutedos na anaacutelise e verificar em qual ciclo de PCR que cada amostra
amplificou (cicle threshold ndash CT) (Figura 11) Os valores de CT foram planilhados e
analisados conforme os paracircmetros de qualidade (Quadro 2)
Figura 9 - Representaccedilatildeo do Rotor-Disc 100 Refere-se a um disco de material plaacutestico contendo 100
poccedilos Este veio de faacutebrica personalizado com primers para os ensaios QC ou RT2 profiler PCR array As
amostras e mixes satildeo pipetadas em cada poccedilo O disco eacute posteriormente colocado em um anel metaacutelico
proacuteprio para o encaixe no equipamento Rotor-Gene Cada poccedilo eacute nomeado com uma letra e um nuacutemero
iniciando no A1 ateacute o H12 Os quatro uacuteltimos poccedilos natildeo satildeo nomeados e natildeo conteacutem ensaio (no entanto
preenchemos com mix para equilibrar o peso do disco) Fonte do autor
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB
B HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1
C RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC
D PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC
E GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC
F NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR
G PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC
H NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC
Figura 10 - Mapa do disco QC (representaccedilatildeo planilhada) Do A1 ao B12 housekeeping genes para 12
amostras C1 ao H12 controles Cada grupo de cor representa a colocaccedilatildeo de uma mix Do A1 ao E1 mix de
A1
C1
E1
G1
34
cDNA da amostra 1 do A2 ao E2 mix de cDNA da amostra 2 (assim por diante ateacute A12 e E12) Linha F controle
com RNA diluiacutedo (1100) Linhas G e H controles com aacutegua livre de RNase Fonte do autor
Figura 11 - Exemplo de ajuste de Threshold A linha de base (Threshold) eacute ajustada na fase linear do ciclo
de amplificaccedilatildeo Dessa forma eacute possiacutevel remover os ruiacutedos e se obter o ciclo em que cada amostra foi
amplificada na PCR (CT) Fonte do autor imagem do equipamento Rotor Genereg
Quadro 2 - Paracircmetros de qualidade do ensaio QC
Controles Teste Passa no teste Falha no teste
Controle de transcriccedilatildeo reversa CT RTC (linha B) ndash CTPPC (linha G) lt5 gt5
Controle positivo de PCR CT PPC (linha G)
CT PPC (linha D) - CT PPC (linha G)
14 plusmn 2
lt3
gt16
gt3
Controle de contaminaccedilatildeo de DNA genocircmico CT GDC (linha E) gt33 lt33
Controle de natildeo transcriccedilatildeo reversa CT NTR (linha F) ge 33 ou NA lt33
Controle negativo CT NTC (linha H) ge 33 ou NA lt33
10-02
10-04
10-06
10-08
10-10
10-12
10-14
10-16
10-18
10-20
10-22
10-24
10-26
10-28
5 10 15 20 25 30 35 40
Ciclos
Flu
ore
scecircn
cia
No
rmal
izad
a
Fase Linear
35
De 60 amostras analisadas 52 passaram no teste quanto aos criteacuterios de
qualidade e prosseguiram para a anaacutelise de expressatildeo gecircnica do painel de genes
escolhidos
454 Ensaio de expressatildeo gecircnica
O protocolo de expressatildeo foi realizado por PCR em tempo real atraveacutes do
equipamento Rotor Gene 6000 (Corbett) com ensaio customizado RTsup2 Profiler PCR
Array em disco com capacidade de 100 poccedilos (Rotor-Disc 100 Qiagen USA) Nos 100
poccedilos de cada disco estavam distribuiacutedos primers especiacuteficos para o ensaio de expressatildeo
de 17 genes (Figuras 9 e 12 e Quadro 3) (17 pares de primers para cada gene repetidos 4
vezes na placa pois foi possiacutevel a anaacutelise de 4 amostras de cDNA por disco) 4 pares de
primers para os Housekeeping genes B2M GAPDH HPRT1 e ACTB (Quadro 4) e 3
controles 1 controle de contaminaccedilatildeo com DNA genocircmico (HGDC) 1 controle de
transcriccedilatildeo reversa (RTC) e 1 controle positivo de PCR (PPC) Os 4 Housekeeping
genes e os 3 controles tambeacutem satildeo repetidos 4 vezes no disco (Figura 5) Para as
reaccedilotildees foi utilizada a RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR Master Mix (Qiagen USA)
Primeiramente foi preparada 4 mixes (uma para cada amostra de cDNA) para um
disco de 100 poccedilos composta por 275 μL de 2X RT2 SYBR Green ROX FAST
Mastermix 2262 microL de aacutegua livre de RNase e 488 microL de amostra de cDNA cada Em
cada um dos poccedilos do disco foram adicionados 20 μL da mix preparada (utilizando
mixes de diferentes amostras a cada 24 poccedilos) Apoacutes deste processo o disco foi selado
com o Rotor-Disc Heat Sealer (Qiagen USA) e colocado no equipamento Rotor-Gene
6000 (Corbett) O real-time foi programado para ciclagem de PCR nas seguintes
condiccedilotildees 1 ciclo a 95deg C com duraccedilatildeo de 10 minutos 40 ciclos a 95degC por 15
segundos e 60degC por 30 segundos
36
Quadro 3 - Genes escolhidos para o ensaio de expressatildeo
CHRNA3 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α3
CHRNA4 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α4
CHRNA5 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α5
CHRNA6 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α6
CHRNA7 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α7
CHRNB2 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade β2
CHRNB3 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade β3
CHRNB4 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade β4
CHRNG Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade γ
DRD1 Codifica o receptor de dopamina tipo 1
DRD2 Codifica o receptor de dopamina tipo 2
DRD3 Codifica o receptor de dopamina tipo 3
DRD4 Codifica o receptor de dopamina tipo 4
HTR3A Codifica o receptor 3A de serotonina
HTR3B Codifica o receptor 3B de serotonina
COMT Codifica a enzima catecol-O-metiltransferase (metaboliza dopamina)
SLC6A3 Codifica a proteiacutena DAT que promove a recaptaccedilatildeo de dopamina DAT
Quadro 4 - Housekeeping genes
B2M Codifica a microbulina subunidade β2
GAPDH Codifica a enzima gliceraldeiacutedo ndash 3 fosfato desidrogenase
HPRT1 Codifica a enzima hipoxantina fosforribosiltransferase 1
ACTB Codifica a β actina
37
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
B DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
C CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
D DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
E CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
F DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
G CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3
H DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC
Figura 12 - Mapa do disco do ensaio RT2 profiler PCR array (representaccedilatildeo planilhada) O disco conteacutem 100 poccedilos no
entanto apenas 96 poccedilos contecircm ensaios sendo que 4 poccedilos ficam vazios A1 ao B5 = genes escolhidos para anaacutelise de
expressatildeo Do B6 ao B9= Housekeeping genes Do B10 ao B12= controles C1 ao D12 E1 ao F12 e G1 ao H12= repeticcedilatildeo dos
ensaios permitindo a anaacutelise completa de 4 amostra Cada cor diferente (a cada 2 linhas) representam a anaacutelise de uma
amostra Fonte do autor
455 Anaacutelise dos dados de expressatildeo gecircnica
Para a anaacutelise de expressatildeo gecircnica foi utilizado o meacutetodo de 2-∆∆CT 103 Apoacutes o
teacutermino da corrida do ensaio de expressatildeo gecircnica atraveacutes do software real-time cycler
(Qiagen USA) foi ajustada a linha de base (threshold) no graacutefico de amplificaccedilatildeo em
escala logariacutetmica (Figura 11) Todos os discos (total de 13) foram analisados com o
mesmo valor de threshold (010869) para que os valores de CT de todas as amostras
fossem comparaacuteveis
Os dados de CT tambeacutem foram inseridos no programa SPSS para as anaacutelises
estatiacutesticas Os valores de CT foram normalizados atraveacutes da expressatildeo dos
housekeeping genes utilizando a seguinte foacutermula ∆CT= (CTamostra ndash a meacutedia de
CThousekeeping genes) Os valores de mediana de 2-∆CT (em escala logariacutetmica) de cada grupo
foram utilizados para os testes de hipoacutetese Apoacutes foram obtidos os valores de ∆∆CT
(mediana de ∆CTgrupo teste ndash mediana de ∆CT grupo referecircncia) e o fold change (aumento ou
diminuiccedilatildeo da expressatildeo dos genes em relaccedilatildeo ao grupo referecircncia) foi calculado
atraveacutes da foacutermula 2-∆∆CT
38
46 Mensuraccedilatildeo de bupropiona vareniclina e de seus metaboacutelitos por HPLC-
MSMS
461 Materiais equipamentos e condiccedilotildees adotadas para a mensuraccedilatildeo dos
analitos apoacutes validaccedilatildeo do meacutetodo
Padrotildees analiacuteticos e padrotildees internos (PIs) deuterados bupropiona
hidroxibupropiona vareniclina (Santa Cruzreg) vareniclina d4 (TRCreg) nicotina
(ChemCruzreg) cotinina (Sigma-Aldrichreg) hidroxicotinina (Torontoreg) e
hidroxibupropiona d6 nicotina d4 cotinina d3 hidroxicotinina d3 (Cerilliantreg)
Solventes orgacircnicos Metanol acetonitrila (JT Baker) e sais acetato de amocircnio
fosfato de soacutedio (Vetecreg) fosfato de soacutedio monobaacutesico (Proquimiosreg) fosfato
de amocircnio (Reagenreg) formiato de amocircnio (Sigma-Aldrichreg)
Equipamentos e acessoacuterios
o HPLC Shimadzureg (Kyoto Japatildeo) equipado com uma vaacutelvula comutadora
de 6 vias automaacutetica
o Auto-amostrador Shimadzureg (Kyoto Japatildeo)
o Vaacutelvula comutadora de 6 vias 11R-0016H (Valcoreg Houston TX USA)
o Espectrocircmetro de massas LCMS-8030 Shimadzureg (Kyoto Japatildeo)
o Analisador de massa triplo quadrupolo (Shimadzureg Kyoto Japatildeo)
o Coluna analiacutetica ACEreg C18 (100 mm x 21 mm x 3 microm comprimento
diacircmetro interno e tamanho de partiacutecula)
o Preacute-coluna ACEreg C18 (21mm x 3 microm diacircmetro tamanho de partiacutecula)
39
o Coluna de extraccedilatildeo coluna contendo aproximadamente 70 mg do novo
RAM
Software
o LabSolutionsreg para anaacutelise dos dados e programaccedilatildeo do meacutetodo no
HPLC-MSMS
Condiccedilotildees espectrometricas e cromatograacuteficas
o Temperatura da forno da coluna 40ordmC
o Temperatura da linha de dessolvataccedilatildeo 250ordmC
o Temperatura do bloco de aquecimento 400ordmC
o Fluxo do gaacutes de nebulizaccedilatildeo 20 ml min-1
o Fluxo de gaacutes para secagem 150 ml min-1
o Energias de colisatildeo precursores e fragmentos dos analitos (Tabela 1)
o Fase moacutevel de carregamento (liberada pela bomba A) Aacutegua ultra pura
em um fluxo de 04 mL min-1
o Fase moacutevel de eluiccedilatildeoseparaccedilatildeoionizaccedilatildeo (liberada pela bomba C)
metanol tampatildeo formiato de amocircnio 001 mol L-1 pH=42 (9010 vv)
em um fluxo de 04 mL min-1
o Fase moacutevel de limpeza (liberada pela bomba B) acetonitrila aacutegua ultra
pura isopropanol (751510 vvv) em um fluxo de 10 mL min -1
o Sistema de anaacutelise ULPC-MSMS no modo columns switching em
configuraccedilatildeo backflush modo de ionizaccedilatildeo positiva por electrospray
(ESI+)
40
Tempos
o Fase de carregamento e condionamento do sistema (vaacutelvula na posiccedilatildeo
1) 0 - 30 min
o Fase de eluiccedilatildeo (vaacutelvula na posiccedilatildeo 2) 03 min
o Fase de limpeza separaccedilatildeo e anaacutelise por MS (vaacutelvula na posiccedilatildeo 1) 67
min
o Recondiocionamento do sistema (vaacutelvula na posiccedilatildeo 1) 50 min
o Tempo total incluindo todos os processos 15 min
o
Tabela 1 - Analitos precursores fragmentos e energias de colisatildeo otimizados
Analitos Precursor (mz) Fragmentos (mz) Energia de colisatildeo
(KV)
Vareniclina 212 169 -23
183 -24
141 -43
Bupropiona 240 131 -28
139 -26
103 -39
Hidroxibupropiona 256 139 -29
131 -29
167 -29
Nicotina 163 117 -28
130 -22
77 -44
Cotinina 177 80 -24
98 -21
70 -34
Hidroxicotinina 193 80 -30
134 -19
118 -21
Fragmentos quantificados
41
462 Visatildeo geral do desenvolvimento da coluna e padronizaccedilatildeo da anaacutelise
Todos os padrotildees para as anaacutelises dos analitos foram adquiridos e armazenados
conforme recomendaccedilatildeo do fabricante ateacute o momento da padronizaccedilatildeo das anaacutelises As
anaacutelises foram realizadas atraveacutes da colaboraccedilatildeo com o Prof Dr Eduardo Costa de
Figueiredo Dr Henrique Dipe Faria e Prof Dra Isarita Martins do Laboratoacuterio de
Anaacutelises de Toxicantes e Faacutermacos ndash LATF da Faculdade de Ciecircncias Farmacecircuticas da
Universidade Federal de Alfenas (Unifal MG) A escolha de cada analito foi
determinada atraveacutes de sua importacircncia cliacutenica e tambeacutem devido agrave disponibilidade dos
padrotildees dos analitos no mercado Os analitos mensurados para as amostras provenientes
dos pacientes tratados com os faacutermacos antitabagismo foram bupropiona
hidroxibupropiona vareniclina nicotina cotinina e hidroxicotinina (os trecircs uacuteltimos satildeo
proveninentes do fumo) Foi realizado um levantamento das propriedades fiacutesico-
quiacutemicas dos metaboacutelitos conforme Quadro 5
Para a remoccedilatildeo das macromoleacuteculas (como proteiacutenas) presentes na matriz de
soro foi desenvolvida uma coluna extratora de acesso restrito a partir de nanotubos
hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados com ligaccedilotildees hidrofiacutelicas (novo RAM) O
material foi desenvolvido e caracterizado antes mesmo da padronizaccedilatildeo das condiccedilotildees
de anaacutelise nos equipamentos
Foram obtidas as condiccedilotildees espectomeacutetricas (modo de ionizaccedilatildeo e as condiccedilotildees
de sua fonte temperatura do bloco de calor fluxo de gaacutes nebulizador e fluxo do gaacutes
secante) e cromatograacuteficas (tempo de retenccedilatildeo e separaccedilatildeo e aacutereas obtidas dos picos de
cada analito) Apoacutes as condiccedilotildees foram otimizadas em sistema de cromatografia liacutequida
de alta eficiecircncia multidimensional seguida por espectrometria de massa (HPLC-
MSMS) O sistema multimensional constituiacutedo por vaacutelvulas comutadoras permite a
anaacutelise online e automatizada com configuraccedilatildeo via software As vaacutelvulas permitem
42
diferentes posiccedilotildees promovendo a ocorrecircncia de eventos distintos no sistema como a
concentraccedilatildeo dos analitos e remoccedilatildeo de macromoleacuteculas atraveacutes da coluna extratora
(posiccedilatildeo 1) a eluiccedilatildeo dos analitos da coluna extratora para a coluna analiacutetica (posiccedilatildeo 2)
e novamente na posiccedilatildeo 1 ocorre a eluiccedilatildeo dos analitos da coluna analiacutetica para o
espectrocircmetro de massas a limpeza da coluna extratora e o recondionamento do
sistema
Quadro 5 - Propriedades fiacutesico-quiacutemicas dos analitos
Bupropiona
Peso molecular 27620 gmol
Ponto de fusatildeo 243-246deg C
Solubilidade em aacutegua 00693 mgmL
pKa (aacutecido forte) 1829
pKa (mais forte baacutesico) 822
Aacuterea da superfiacutecie polar 291 Aring2
Log P 36
Hidroxibupropiona
Peso molecular 25574 gmol
Ponto de fusatildeo 121-123degC
Solubilidade em aacutegua 02 mgmL
pKa (aacutecido forte) 1479
pKa (mais forte baacutesico) 765
Aacuterea da superfiacutecie polar 4933 Aring2
Log P 222
Vareniclina
Peso molecular 21127 gmol
Pressatildeo de vapor 25degC
Solubilidade em aacutegua 877 x 10-2 gL
pKa1 182 pKa2 = 973
Aacuterea da superfiacutecie polar 378 Aring2
Log P 103
43
Nicotina
Peso molecular 16223 gmol
Pressatildeo de vapor 618 degC
Solubilidade em aacutegua 100 mM
pKa 85 pKb1 616 a 15degC e pKb2 1096
Aacuterea da superfiacutecie polar 378 Aring2
Log P 117
Cotinina
Peso molecular 176215 gmol
Solubilidade em aacutegua 10 x10-6 mgL a 25degC
Aacuterea da superfiacutecie polar 332 Åsup2
Log P 007
Hidroxicotinina
Peso molecular 192214 gmol
Aacuterea da superfiacutecie polar 53 Å2
ACDLog P -148
Fonte Banco de dados Pubchem e ChemSpider Obs Algumas informaccedilotildees referentes agraves
propriedades fiacutesico-quiacutemicas dos analitos ainda natildeo estatildeo disponiacuteveis na literatura pKa= valor
negativo do logaritmo da constante de dissociaccedilatildeo de um aacutecido pKb= valor negativo do logaritmo
da constante de dissociaccedilatildeo de uma base LogP= coeficiente de particcedilatildeo
463 Desenvolvimento da coluna RAM para a purificaccedilatildeo da amostra
As amostras de soro e plasma satildeo matrizes ricas em moleacuteculas que interferem na
mensuraccedilatildeo dos analitos como lipiacutedios e principalmente proteiacutenas Estas podem
obstruir colunas analiacuteticas e diminuir a concentraccedilatildeo dos analitos jaacute que muitos destes
estatildeo ligados a essas proteiacutenas Devido a esse fato geralmente eacute realizada uma
preparaccedilatildeo das amostras antes de sua mensuraccedilatildeo Essa preparaccedilatildeo envolve processos
como a extraccedilatildeo com o uso de solventes precipitaccedilatildeo entre outros os quais geram
custo de materiais aumento do tempo de trabalho e de erros 104 105 51 106 Dessa forma
44
diversos estudos vecircm tentando desenvolver meacutetodos que natildeo exijam tanta manipulaccedilatildeo
das amostras Os materiais de acesso restrito (RAMs) estatildeo sendo utilizados para a
menor preparaccedilatildeo da amostra e sua injeccedilatildeo direta Dentre os RAMs estatildeo os nanotubos
de carbono (CNTs) modificados 107-109 Nesta colaboraccedilatildeo foi desenvolvida a coluna
extratora composta por nanotubos hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados com a
adiccedilatildeo de grupos hidrofiacutelicos Esse material entrou com pedido de patente na Agecircncia
de Inovaccedilatildeo e Empreendedorismo da Universidade Federal de Alfenas-MG atraveacutes do
Processo 230870001282019-84 e portanto a sua composiccedilatildeo e os resultados de
alguns testes da sua caracterizaccedilatildeo seratildeo mantidos em sigilo (vide declaraccedilatildeo Anexo
5)
Diferentes RAMs foram sintetizados a partir de CNTs para que fosse obtido o
melhor desempenho na remoccedilatildeo de macromoleacuteculas e retenccedilatildeo dos analitos da amostra
Os CNTs utilizados foram compostos por paredes muacuteltiplas pois apresentam uma
elevada aacuterea superficial e consequentemente uma maior capacidade de adsorccedilatildeo Os
CNTs foram adquiridos comercialmente e inicialmente foram funcionalizados a partir
de reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo aacutecida com aacutecido niacutetrico como desenvolvido por Barbosa et al 109
Os CNTs oxidados foram utilizados em etapas de siacutentese posteriores
adicionando grupos quiacutemicos hidrofiacutelicos que fossem capazes de realizar a exclusatildeo de
proteiacutenas e permitir a adsorccedilatildeo dos analitos As reaccedilotildees de siacutentese posteriores foram
semelhantes as promovidas para a realizaccedilatildeo de revestimento externo de poliacutemeros
poliacutemeros biomimeacuteticos nanomagneacuteticos com e sem acesso restrito 107 110-112 poreacutem
foram utilizadas estrateacutegias e proporccedilotildees de reagentes distintas na tentativa de obter o
RAM mais eficiente Aleacutem disso tambeacutem foi priorizada a siacutentese mais simples e
reprodutiacutevel bem como o material que apresentar maior vida uacutetil Os diferentes
materiais sintetizados foram testados em relaccedilatildeo agrave exclusatildeo de proteiacutenas e adsorccedilatildeo dos
45
analitos e tambeacutem foram realizados testes de caracterizaccedilatildeo para determinar suas
propriedades fiacutesico-quiacutemicas e confirmar a estrutura originada
A anaacutelise termogravimeacutetrica foi realizada com a finalidade de determinar a
variaccedilatildeo de massa (ganho ou perda) do RAM em funccedilatildeo de emprego de temperatura
programada proporcionando informaccedilotildees importantes a respeito da estabilidade do
material e de sua composiccedilatildeo Outras teacutecnicas tambeacutem foram utilizadas com o objetivo
de obter dados relacionados agrave estrutura e composiccedilatildeo do novo RAM como o
infravermelho e anaacutelise elementar Anaacutelises de microscopias eletrocircnicas de varredura e
de transmissatildeo tambeacutem foram realizadas para a determinaccedilatildeo da composiccedilatildeo da
superfiacutecie externa e arranjo estrutural do material com as modificaccedilotildees realizadas
Apoacutes o teacutermino do preparo do novo RAM eles foram colocados dentro de uma
coluna (aproximadamente 70 mg) conforme (Figura 13) A coluna foi posteriormente
empregada no preparo de amostras online no sistema cromatograacutefico
Figura 13 ndash Representaccedilatildeo da composiccedilatildeo da coluna extratora (Novo RAM) O novo RAM formado
a partir de nanotubos hiacutedridos de carbono e siacutelica dotado de muacuteltiplas camadas e modificados com grupos
hidrofiacutelicos promovem a retenccedilatildeo de analitos e exclusatildeo de macromoleacuteculas como proteiacutenas O RAM foi
posteriormente empacotado em coluna para a utilizaccedilatildeo em sistema cromatograacutefico Fonte adaptado do
colaborador Dr Henrique Dipe de Faria Unifal-MG
46
464 Caracterizaccedilatildeo do novo RAM
4641 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA
Na ausecircncia da coluna extratora foi preparada primeiramente uma soluccedilatildeo
aquosa de albumina de soro bovino (BSA) em uma concentraccedilatildeo de 44 mgmL-1
(semelhante agrave concentraccedilatildeo de proteiacutenas presentes no plasma humano) Foram injetados
10 microl desta soluccedilatildeo em triplicata diretamente em sistema cromatograacutefico com detector
UV ajustado a 255 nm utilizando como fase moacutevel o tampatildeo formiato de amocircnio 10
mM pH=42 em um fluxo de 04 mL min-1 O sinal detectado foi de 100 BSA
Posteriormente a coluna preenchida com 70 mg do novo RAM foi inserida no sistema
cromatograacutefico entre o injetor e o detector A soluccedilatildeo de BSA foi analisada em triplicata
novamente no entanto com a presenccedila da coluna extratora desenvolvida (novo RAM)
A aacuterea do sinal obtido nesta segunda anaacutelise dividida pela aacuterea do sinal de 100 BSA
obtida na primeira anaacutelise foi correspondente agrave porcentagem de BSA excluiacuteda pela
coluna
4642 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas no soro
Para analisar a exclusatildeo total de macromoleacuteculas (como lipiacutedios proteiacutenas e
sacariacutedeos) agora nas amostras de soro foi utilizado procedimento semelhante Na
ausecircncia da coluna extratora injetou-se no sistema cromatograacutefico em triplicata 100 μL
de amostra de soro humano branco foram testados pools de soro puros e diluiacutedos 14 A
aacutegua ultra pura foi utilizada como fase moacutevel em um fluxo de 04 mL min-1 e o sinal
obtido foi relacionado a 100 dos interferentes Apoacutes a coluna extratora (o novo
RAM) foi adionado ao sistema e a amostra foi inserida novamente A divisatildeo entre a
aacuterea do pico na primeira anaacutelise pelo pico da segunda anaacutelise refere-se agrave porcentagem
de exclusatildeo de interferentes As condiccedilotildees cromatograacuteficas foram as mesmas do teste
com BSA
47
4643 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA em diferentes pHs
O teste de exclusatildeo de proteiacutenas tambeacutem foi realizado nas mesmas condiccedilotildees
cromatograacuteficas que a anaacutelise anterior utilizando soluccedilatildeo de BSA em triplicata no
entanto diferentes soluccedilotildees como fase moacutevel (variaccedilatildeo de pH de 22 a 70) foram
testadas pois o pH pode influenciar na ionizaccedilatildeo dos analitos dos grupos funcionais
presentes na superfiacutecie do novo RAM e na interaccedilatildeo entre eles o que pode resultar em
diferentes taxas de exclusatildeo de proteiacutenas Estas soluccedilotildees foram os tampotildees fosfato de
soacutedio 10 mM (pHs 22 e 26) formiato de amocircnio 10 mM (pHs 30 a 46) acetato de
amocircnio 5 mM (pHs 52 a 66) e fosfato de soacutedio 5mM (pH 70)
465 Paracircmetros espectromeacutetricos
Com a finalidade de se obter um meacutetodo de anaacutelise capaz de detectar e
quantificar menores niacuteveis possiacuteveis de concentraccedilatildeo dos analitos foram otimizados os
paracircmetros espectromeacutetricos fluxos dos gases secantes e nebulizador modo de
ionizaccedilatildeo temperaturas da linha de dessolvataccedilatildeo e de bloco de aquecimento e as
energias de colisotildees utilizadas para fragmentar os iacuteons precursores para originar os
fragmentos iocircnicos de cada analito Foram realizadas soluccedilotildees padrotildees de cada analito e
dos padrotildees internos (PIs) deuterados (vareniclina d-4 hidroxibupropiona d6 nicotina
d4 cotinina d3 e hidroxicotinina d3) na concentraccedilatildeo de 1 mg L-1 em metanol Cada
uma destas soluccedilotildees foram injetadas separadamente no sistema em um volume de 5 microL
A fase moacutevel utilizada foi constituiacuteda por metanol tampatildeo formiato de amocircnio 001
mol L-1 pH=42 (9010 vv) em um fluxo de 04 mL min-1 e o modo de ionizaccedilatildeo
positiva (ESI+) foi utilizado pois demonstrou ser mais eficiente para ionizar as
moleacuteculas analisadas Essa otimizaccedilatildeo foi obtida utilizando o software Labsolutionsreg
48
466 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatograacutefico multidimensional
Para esta otimizaccedilatildeo foi utilizado um HPLC de dotado de vaacutelvula comutadora
automaacutetica de 6 vias e um injetor automaacutetico de amostras o que permitiu a
automatizaccedilatildeo do processo Ainda o sistema cromatograacutefico foi acoplado a um
espectrocircmetro de massas em tandem (HPLC-MSMS) dotado de um analisador de
massa triplo quadrupolo o qual possui alta sensibilidade e seletividade Incorporou-se
neste sistema uma coluna extratora preenchida com o RAM desenvolvido
O forno foi mantido a 40ordmC e o detector UV operando em um comprimento de
onda de 255 nm A fim de padronizar a anaacutelise foram testadas colunas anaacuteliticas de
diversos tamanhos e composiccedilotildees e variadas proporccedilotildees de fases de moacuteveis
Atraveacutes da anaacutelise do cromatograma foram avaliados o tempo de retenccedilatildeo e
separaccedilatildeo e as aacutereas obtidas dos picos de cada analito O sistema foi utilizado no modo
columns switching na configuraccedilatildeo backflush e as condiccedilotildees da anaacutelise foram
otimizadas como os tempos de exclusatildeo de proteiacutenas de adsorccedilatildeo e eluiccedilatildeo dos
analitos de separaccedilatildeo cromatograacutefica de limpeza da coluna extratora e de
recondicionamento do sistema bem como a composiccedilatildeo das fases moacuteveis de
carregamento de eluiccedilatildeoseparaccedilatildeo e de limpeza
Para a otimizaccedilatildeo dos paracircmetros de anaacutelise foi utilizado um pool de amostras
de soro humano branco em sexplicata Este soro foi dopado com os analitos vareniclina
bupropiona hidroxibupropiona nicotina cotinina e hidroxicotinina em 3 concentraccedilotildees
01 100 e 1000 microg L -1 e com os PIs deuterados na concentraccedilatildeo de 500 microg L -1 Como
o soro eacute uma matriz com alta concentraccedilatildeo de interferentes foram testados pools de
soro branco dopados e injetados sem diluiccedilatildeo diretamente no sistema e diluiacutedos em aacutegua
ultra pura (11) e os perfis analiacuteticos foram entatildeo avaliados
49
467 validaccedilatildeo analiacutetica
Testes para a validaccedilatildeo da anaacutelise otimizada foram realizadas conforme
diretrizes do US Department of Health and Human Services e do Food and Drug
Administration (FDA) 2013 113 Os paracircmetros avaliados foram a seletividade limite
de detecccedilatildeo (LD) limite de quantificaccedilatildeo (LQ) linearidade estabilidade dos analitos
efeito residual e de matriz e recuperaccedilatildeo da extraccedilatildeo
Os ensaios foram realizados em seis repeticcedilotildees (n=6) exceto o ensaio de
recuperaccedilatildeo (n=3) e foi utilizado um pool de amostras de soro branco dopadas com cada
um dos analitos nas concentraccedilotildees de 5 10 20 50 75 100 μg L-1 para vareniclina 1 5
50 250 500 1000 μg L-1 para bupropiona 1 10 100 500 1000 2000 para
hidroxibupropiona 5 10 50 250 500 1000 μg L-1 para nicotina cotinina e
hidroxicotinina Os PIs deuterados foram utilizados na concentraccedilatildeo de 200 μg L-1
47 Anaacutelise estatiacutestica
Em relaccedilatildeo agraves caracteriacutesticas demograacuteficas as variaacuteveis contiacutenuas foram
apresentadas como meacutedia e desvio padratildeo e as categoacutericas como frequecircncias Os testes
Shapiro-Wilk e KolmogorovndashSmirnov foram realizados para verificar a normalidade da
distribuiccedilatildeo das variaacuteveis quantitativas e assim escolher testes parameacutetricos ou natildeo
parameacutetricos Foram realizados os testes Qui-quadrado Exato de Fisher t de Student ou
Mann-Whitney para as anaacutelises comparativas de caracteriacutesticas gerais entre os grupos
de desfecho dos pacientes tanto no ensaio de expressatildeo como de mensuraccedilatildeo dos
analitos Para as anaacutelises de expressatildeo gecircnica o meacutetodo 2-∆∆CT foi utilizado 103 Como os
dados de expressatildeo natildeo apresentaram distribuiccedilatildeo normal foi realizado o teste natildeo
parameacutetrico de Mann-Whitney para testar a hipoacutetese de diferenccedila (valores de 2-∆CT)
intra e entre os grupos de desfechos (sucesso e resistente e tempos de tratamento
50
farmacoloacutegico T0 T2 e T4) Os valores de ∆∆CT (mediana de ∆CTgrupo teste ndash mediana
de ∆CTgrupo referecircncia) foram obtidos para o caacutelculo do fold change O fold-change (2-∆∆CT)
foi calculado para verificar o aumento ou diminuiccedilatildeo de expressatildeo gecircnica entre os
grupos analisados O graacutefico heat map foi construiacutedo atraveacutes do software Gene-globe
(Qiagen USA) para verificar as diferenccedilas no perfil de expressatildeo dos genes estudados
de acordo com os tempos (T0 T2 e T4) e de acordo com a efetividade de tratamento
com vareniclina (sucesso e resistente) O teste de Manny-Whitney foi utilizado para
analisar os niacuteveis de concentraccedilotildees de vareniclina de bupropiona de nicotina e de seus
metaboacutelitos de acordo com os desfechos de tratamento (sucesso e resistente) pois natildeo
apresentaram distribuiccedilatildeo normal A taxa de metabolizaccedilatildeo de nicotina (NRM) foi
calculada pela seguinte foacutermula NMR= trans-3-hidroxicotininacotinina A
hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3- hidroxicotinina
para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros da hidroxicotinina satildeo
irrelevantes 31 32 Os pacientes foram classificados em metabolizadores lentos se
NMRlt031 e normais ou raacutepidos se NMRgt031 Todas as anaacutelises estatiacutesticas foram
realizadas utilizando o software SPSS (versatildeo 20 IBM New York NY) considerando
o niacutevel de significacircncia de P lt005
51
5 RESULTADOS
Este projeto incluiu 105 pacientes sendo 74 tratados com vareniclina e 31
com bupropiona Dos 74 pacientes tratados com vareniclina amostras de 27 pacientes
foram analisadas quanto agrave expressatildeo gecircnica (14 pacientes do grupo de desfecho sucesso
e 13 do grupo resistente) Sendo provenientes destes pacientes 52 amostras ao todo (de
diversos tempos) 9 resistentes do tempo T0 7 resistentes do T2 8 resistente do T4 9
sucessos do T0 8 sucessos do T2 e 11 sucessos do T4 (vide toacutepico 42 Nuacutemero
amostral)
Quanto a mensuraccedilatildeo dos analitos foi desenvolvida uma coluna extratora para a
purificaccedilatildeo da amostra agrave base de nanotubos hiacutedridos de carbono e siacutelica modificados
com a adiccedilatildeo de grupos hidrofiacutelicos (novo RAM) o meacutetodo HPLC-MSMS
multidimensional no modo column switching e na configuraccedilatildeo backflush foi
otimizado e validado Setenta e quatro pacientes tratados com vareniclina e 31 tratados
com bupropiona foram submetidos agrave anaacutelise Apenas 4 amostras das 105 apresentaram
valores abaixo do LQ (3 de pacientes tratados com vareniclina e 1 de paciente tratado
com bupropiona) e estas foram excluiacutedas das anaacutelises dos analitos (vide toacutepico 42
Nuacutemero amostral)
51 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica
511 Dados cliacutenicos e demograacuteficos
As Tabelas 2 e 3 mostram as caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes
selecionados para o ensaio de expressatildeo gecircnica do grupo total e por grupo de desfecho
respectivamente A variaacutevel idade apresentou diferenccedila significativa entre os grupos
resistente e sucesso
52
Tabela 2 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina selecionados para os ensaios de expressatildeo gecircnica (n=27)
Idade (anos) 50 plusmn 13
Gecircnero mulheres () 464
Etnia autodeclarada brancos () 740
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 271 plusmn 50
Cigarrosdia 17 plusmn 7
FTND 62 plusmn 20
FTND ge 6 () 607
Escore Issa ge 3 () 857
Hipertensatildeo () 179
Dislipidemia () 250
Diabetes melito tipo 2 () 107
Depressatildeo () 71
Ansiedade () 286
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash
Fagerstroumlm test for nicotine dependence (escala de 0 a 10
pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
Tabela 3 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina submetidos aos ensaios de expressatildeo gecircnica de acordo com o desfecho
de tratamento
Resistente (n=13) Sucesso (n=14) Valor de P
Idade (anos) 55 plusmn 11 45 plusmn 12 0045
Gecircnero mulheres () 538 357 045
Etnia autodeclarada brancos () 769 786 100
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 271 plusmn 46 273 plusmn 54 092
Cigarrosdia 20 plusmn 6 15 plusmn 6 006
FTND 63 plusmn 22 59 plusmn 19 058
FTND ge 6 () 538 643 070
Escore Issa ge 3 () 846 857 100
Hipertensatildeo () 231 71 033
Dislipidemia () 231 286 100
Diabetes melito tipo 2 () 231 00 010
Depressatildeo () 77 71 100
53
Ansiedade () 308 357 100
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fagerstroumlm test for nicotine
dependence (escala de 0 a 10 pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
512 Dados de expressatildeo gecircnica
Dos 17 genes escolhidos para testar com a resposta ao tratamento apenas 4
apresentaram valores de amplificaccedilatildeo aceitaacuteveis para uma interpretaccedilatildeo de qualidade
mais especificamente valores de CT lt 33 Os valores das expressotildees dos genes (CTs)
foram normalizados atraveacutes das meacutedias de CT dos housekeeping genes para cada
amostra obtendo-se os valores de ∆CT = (CTgene alvo ndash meacutedia CT housekeepings genes) A
Tabela 4 mostra os valores de mediana de ∆CT dos genes analisaacuteveis de acordo com os
tempos de tratamento e grupos de desfecho
Tabela 4 - Valores de mediana de ∆CT dos genes de acordo com os tempos de
tratamento e grupos de desfecho
∆CT = (CTgene alvo ndash meacutedia CThousekeepings genes) T0= Tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico
T2= Duas semanas apoacutes o iacutenicio do tratamento farmacoloacutegico T4= Quatro semanas apoacutes o iniacutecio do
tratamento farmacoloacutegico IC 95 = Intervalo de confianccedila de 95
Resistente T0 Resistente T2 Resistente T4
∆CT IC 95 ∆CT IC 95 ∆CT IC 95
CHRNA5 818 (732 ndash 870) 845 (748 ndash 887) 767 (727 ndash 905)
CHRNA7 662 (617 ndash 697) 802 (707 ndash 848) 719 (696 ndash 786)
CHRNG 620 (579 ndash 695) 647 (601 ndash 668) 663 (602 ndash 702)
COMT 467 (440ndash 501) 480 (443 ndash 503) 487 (452 ndash 524)
Sucesso T0 Sucesso T2 Sucesso T4
∆CT IC 95 ∆CT IC 95 ∆CT IC 95
CHRNA5 832 (738 ndash 917) 707 (653 ndash 896) 837 (754 ndash 882)
CHRNA7 726 (611 ndash 842) 704 (640 ndash 779) 738 (676 ndash 820)
CHRNG 682 (619 ndash 774) 683 (656 ndash 733) 659 (625 ndash 703)
COMT 488 (430 ndash 511) 458 (433 -515) 481 (448 ndash 516)
54
513 Anaacutelise de associaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica entre os desfechos e os tempos de
tratamento
A Tabela 5 mostra o fold change e anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos de
tempos de tratamento e grupos de desfecho Foi observada diferenccedila significativa para a
expressatildeo do gene CHRNA7 no grupo resistente amostras dos tempos T2 e T4
apresentaram menor expressatildeo comparadas com amostras do T0 (fold change 038
P=0007 fold change 067 P=0004 respectivamente) Para a expressatildeo do gene
CHRNG amostras do grupo sucesso mostraram menor expressatildeo comparadas com
amostras do grupo resistente no tempo T2 (fold change= 077 P=0006)
Tabela 5 - Fold change e anaacutelise de associaccedilatildeo entre os tempos de tratamento e
grupos de desfecho
Resistente T2 vs T0 Resistente T4 vs T0 Resistente T4 vs T2
Genes 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P
CHRNA5 083 (034 ndash 233) 057 142 (030 ndash 269) 095 172 (034 ndash 303) 089
CHRNA7 038 (020 ndash 093) 0007 067 (031 ndash 101) 0004 178 (058 ndash 287) 037
CHRNG 083 (054 ndash 192) 037 074 (043 ndash 190) 044 090 (050 ndash 158) 036
COMT 091 (065 ndash 149) 092 087 (056 ndash 140) 063 095 (057 ndash 142) 073
Sucesso T2 vs T0 Sucesso T4 vs T0 Sucesso T4 vs T2
Genes 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P
CHRNA5 238 (033 ndash 623) 037 097 (037 ndash 310) 061 041 (020 ndash 268) 069
CHRNA7 116 (031 ndash 406) 064 092 (023 ndash 316) 091 079 (029 ndash 204) 055
CHRNG 099 (045 ndash 227) 049 117 (056 ndash 281) 062 118 (072 ndash 211) 033
COMT 123 (055 ndash 172) 092 105 (055 ndash 155) 068 085 (056 ndash 159) 041
Sucesso vs resistente T0 Sucesso vs resistente T2 Sucesso vs resistente T4
Genes 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P
CHRNA5 091 (028 ndash 250) 075 260 (036 ndash 506) 047 062 (034 ndash 285) 085
CHRNA7 064 (021 ndash 182) 013 197 (061 ndash 423) 009 088 (042 ndash 214) 074
CHRNG 065 (026 ndash 169) 012 077 (040 ndash 109) 0006 103 (050 ndash 171) 079
55
T0= Tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico T2= Duas semanas apoacutes o iacutenicio do tratamento
farmacoloacutegico T4= Quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico 2-∆∆CT = Fold change (diferenccedila de
expressatildeo) P valor (anaacutelise de associaccedilatildeo entre as medianas de 2-∆CT dos grupos) IC 95 = Intervalo de confianccedila
de 95
As Figura 14 e 15 mostram graacuteficos de barras das diferenccedilas de expressatildeo dos
genes CHRNA7 e CHRNG entre os tempos de tratamento e desfecho respectivamente
O heat map (Figura 16) mostra que natildeo houve diferenciaccedilatildeo nos perfis de expressatildeo
gecircnica em uma anaacutelise conjunta dos genes de acordo com os desfechos e tempos de
tratamento
Devido agrave diferenccedila significativa nas meacutedias de idade entre os grupos sucesso e
resistente foi realizada regressatildeo linear multipla na anaacutelise de expressatildeo dos quatro
genes analisaacuteveis A regressatildeo foi ajustada por idade e tambeacutem gecircnero e cigarros por
dia No entanto os resultados de expressatildeo dos genes natildeo foram impactados por estas
covariaacuteveis
COMT 086 (061 ndash 164) 090 116 (061 ndash 162) 049 104 (064 ndash 169) 093
56
Figura 14 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNA7 entre os tempos de tratamento e desfecho A Anaacutelise intragrupo do
desfecho resistente B Anaacutelise intragrupo do desfecho sucesso T0= tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico T2= duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico T4= quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico P= 0007
(resistente T2 vs T0 fold change de 038) P=0004 (resistente T4 vs T0 fold change de 067) Valor de P (anaacuteliacutese de
associaccedilatildeo entre as medianas de 2-∆CT dos grupos em uma comparaccedilatildeo dois a dois) Fonte do autor
57
Figura 15 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNG entre os tempos de tratamento e desfecho A Anaacutelise intragrupo do
desfecho resistente B Anaacutelise intragrupo do desfecho sucesso T0= tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico T2= duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico T4= quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico P= 0006
(sucesso vs resistente T2 fold change de 077) Valor de P (anaacuteliacutese de associaccedilatildeo entre as medianas de 2-∆CT dos grupos em uma
comparaccedilatildeo dois a dois) Fonte do autor
58
Figura 16 - Heat map de expressatildeo gecircnica A figura mostra a magnitude de expressatildeo gecircnica entre os grupos A cor mais clara
(verde) nos indica menor expressatildeo e a cor mais escura (vermelho) indica maior expressatildeoT0= tempo inicial antes do tratamento
farmacoloacutegico T2= duas semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico T4= quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento
farmacoloacutegico Fonte do autor gerada pelo software Gene Globe QIAGENreg
52 Mensuraccedilatildeo dos analitos
521 Caracterizaccedilatildeo da coluna teste exclusatildeo de proteiacutenas e interferentes da
matriz
Em relaccedilatildeo ao teste de capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas o pico de BSA sem
e com a nova coluna extratora apresentou tempo de retenccedilatildeo semelhante no entando a
aacuterea da curva do BSA na presenccedila do novo RAM foi bem menor do que na sua
ausecircncia conforme a Figura 17 A reduccedilatildeo de proteiacutenas (da soluccedilatildeo de BSA) pela
coluna foi de aproximadamente 98 e nas amostras de pools soro diluiacutedas (14) a
remoccedilatildeo foi de 99 (Figura 18)
A Figura 19 mostra a influecircncia do pH (escala de de 22 a 70) na exclusatildeo de
proteiacutenas fato que estaacute diretamente relacionado com a estrutura fiacutesico-quiacutemica do
RAM Diferentes pHs influenciaram na taxa de exclusatildeo de proteiacutenas esse
comportamento pode ser explicado devido agrave interaccedilotildees eletrostaacuteticas do novo RAM
com as proteiacutenas Valores de pH menores que o do ponto isoeleacutetrico das proteiacutenas
59
podem promover a prevalecircncia de proteiacutenas carregadas positivamente enquanto que
valores de pH superiores podem promover proteiacutenas carregadas negativamente 114
Dessa forma acredita-se que o comportamento de exclusatildeo de proteiacutenas do novo
material eacute semelhante ao descrito em outros estudos 108 109 115 116
Figura 17 - Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com soluccedilatildeo de BSA Graacuteficos obtidos apoacutes injeccedilatildeo de 10 microL de uma soluccedilatildeo aquosa de BSA (44 mg mL-1) no
sistema sem coluna (A) e com coluna extratora (B) A - aacuterea do pico 10142590 B - aacuterea
do pico 9713614 Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF
Unifal-MG
Figura 18 - Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com amostra de soro
diluiacuteda Graacuteficos obtidos apoacutes injeccedilatildeo de 100 microL de soro diluiacutedo em aacutegua ultra pura
(14 vv) no sistema sem coluna (A) e com coluna extratora (B) A aacuterea do pico
53981550 B - aacuterea do pico 53552824 Fonte do autor e do colaborador DrHenrique
Dipe de Faria LATF Unifal-MG
60
Figura 19 - Influecircncia do pH na exclusatildeo de proteiacutenas Fonte do autor e do colaborador Dr
Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
522 Otimizaccedilatildeo dos paracircmetros espectromeacutetricos
No processo de otimizaccedilatildeo das condiccedilotildees espectromeacutetricas foi adotado o modo
de ionizaccedilatildeo positivo (ESI+) isto eacute a ionizaccedilatildeo promove a protonaccedilatildeo (adiccedilatildeo de H+)
dos analitos e de seus fragmentos As energias de colisatildeo ideais e as muacuteltiplas transiccedilotildees
de monitoramento de reaccedilatildeo (MRM) foram otimizadas para cada analito separadamente
vide valores de energia de colisatildeo e fragmentos obtidos jaacute mostrados na Tabela 1 (no
toacutepico 461) A presenccedila de 3 fragmentos de cada analito foi necessaacuteria para a
identicaccedilatildeo qualitativa e a quantificaccedilatildeo foi dependente da concentraccedilatildeo do fragmento
mais abundante
As seguintes temperaturas foram utilizadas 40ordmC para o forno da coluna 250ordmC
para a linha de dessolvataccedilatildeo e 400ordmC para o bloco de aquecimento Foram utilizadas as
taxas de 20 ml min-1 de fluxo de gaacutes de nebulizaccedilatildeo e 150 ml min-1 de fluxo de gaacutes
para a secagem
61
523 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatrograacutefico multidimensional
Quanto a composiccedilatildeo e proporccedilatildeo da fase moacutevel responsaacutevel pela eluiccedilatildeo
separaccedilatildeo e ionizaccedilatildeo dos analitos (fase moacutevel de eluiccedilatildeo) testes foram realizados com
os solventes orgacircnicos acetonitrila ou metanol combinados com o tampatildeo formiato de
amocircnio 10 mM em diferentes pHs com proporccedilotildees que variaram de 973 vv a 7525
vv (fase orgacircnica fase aquosa) Os solventes orgacircnicos utilizados satildeo menos viscosos
em relaccedilatildeo agrave aacutegua por isso fluem mais facilmente no sistema e por serem volaacuteteis
favorecem tambeacutem a ionizaccedilatildeo dos analitos e evaporaccedilatildeo do solvente A fase moacutevel que
apresentou melhores resultados foi a composiccedilatildeo de metanol formiato de amocircnio 001
mol L-1 pH 42 (9010 vv)
Variados tipos de colunas analiacuteticas foram testadas sendo elas A NSTreg (150
mm 46 mm e 5 microm) a ACEreg (150 mm x 46 mm x 5 microm) a Phenomenexreg (250 x 46
mm x 5 microm) e a Atlantis T3 e da Watersreg (100 mm x 21 mm x 3 microm) (comprimento x
diacircmetro interno x tamanho de partiacutecula) no entanto essas colunas aumentaram o
tempo de retenccedilatildeo dos analitos pioraram o perfil cromatograacutefico gerando picos largos e
fragmentados Portanto os testes foram realizados com uma nova coluna analiacutetica a
ACEreg C18 (100 mm x 21 mm x 3 microm comprimento diacircmetro interno e tamanho de
partiacutecula) com preacute-coluna ACEreg C18 (21mm x 3 microm diacircmetro tamanho de partiacutecula)
obtendo-se um menor tempo de anaacutelise (maior frequecircncia analiacutetica) e melhor perfil
cromatograacutefico (picos simeacutetricos) para os analitos
Trecircs volumes de injeccedilatildeo de amostra foram testados (5 10 e 100 microL) devido a
baixa concentraccedilatildeo dos analitos foi adotada a maior quantidade (100 μL) pois forneceu
melhores sinais analiacuteticos Tambeacutem foi avaliado o uso do pool de soro sem diluiccedilatildeo e
diluiacutedo (11 vv) os perfis cromatograacuteficos de ambos foram oacutetimos no entanto
62
escolheu-se trabalhar com a amostra diluiacuteda para diminuir a presenccedila de interferentes e
consequentemente diminuir efeito matriz e aumentar o tempo de durabilidade da coluna
analiacutetica
Jaacute obtidas as melhores condiccedilotildees espectromeacutetricas e cromatograacuteficas foi
otimizado o sistema columm switching na configuraccedilatildeo de backflush o qual apresenta
trecircs eventos como mostrado na Figura 20
Figura 20 - Ilustraccedilatildeo do sistema de columm switching na configuraccedilatildeo de backflush Na posiccedilatildeo 1
correspondente ao evento 1 ocorre exclusatildeo dos interferentes e adsorccedilatildeo dos analitos a coluna extratora Na
posiccedilatildeo 2 durante o evento 2 ocorre a eluiccedilatildeo dos analitos adsorvidos No retorno para a posiccedilatildeo 1
correspondente ao evento 3 ocorre limpeza da coluna extratora separaccedilatildeo e detecccedilatildeo dos analitos e por fim
o recondicionamento do sistema BA = bomba A BB = bomba B BC = bomba C MS = espectrocircmetro de
massas UV = detector UV e W = descarte Fonte Traduzido de (De Faria et al 2017)
Com as vaacutelvulas do sistema na posiccedilatildeo 1 (evento 1) a bomba A promoveu a
liberaccedilatildeo da fase moacutevel de carregamento (aacutegua ultra pura) em um fluxo de 04 mL min-1 O
tempo de 3 minutos foi o necessaacuterio para a adsorccedilatildeo dos analitos e sua preacute-concentraccedilatildeo
aleacutem da eliminaccedilatildeo de macromoleacuteculas A aacutegua mostrou ser um solvente oacutetimo como fase
moacutevel de carregamento aleacutem de ser um recurso barato e natildeo causar danos ao meio
ambiente De forma simultacircnea a fase moacutevel de eluiccedilatildeo fornecida pela bomba C passa
para a coluna analiacutetica de forma a condionaacute-la ainda na ausecircncia dos analitos Ambas as
bombas operaram com uma taxa de fluxo inicial de 04 mL min -1
63
Na posiccedilatildeo 2 da vaacutelvula (evento 2) a bomba C liberou a fase moacutevel de eluiccedilatildeo
(metanol formiato de amocircnio 001 mol L-1 pH 42 (9010 vv) em direccedilatildeo agrave coluna
analiacutetica em fluxo contraacuterio ao que a fase moacutevel de carregamento percorreu (backflush) A
velocidade do fluxo da bomba C foi aumentada para 08 mL min -1 e o tempo determinado
para esta etapa foi de 03 minutos o qual promoveu um oacutetimo perfil cromatograacutefico dos
analitos
No evento 3 as vaacutelvulas foram colocadas na posiccedilatildeo 1 novamente A fase moacutevel
de eluiccedilatildeo (vinda da bomba C) novamente com um fluxo de 04 mL min-1 passou pela
coluna analiacutetica promovendo a separaccedilatildeo dos analitos e sua chegada no detector de
massas De forma simultacircnea a bomba B em um fluxo de 10 mL min -1 liberou a fase
moacutevel de limpeza (acetonitrila aacutegua ultra pura isopropanol 751510 vvv) a qual
passou pela coluna extratora (RAM) promovendo a remoccedilatildeo de resiacuteduos proveniente da
anaacutelise anterior tornando-a pronta para a reutilizaccedilatildeo em uma nova anaacutelise A fase de
limpeza ocorreu no tempo de 33 a 10 min O recondionamento do sistema agraves condiccedilotildees
iniciais de anaacutelise ocorreu nos uacuteltimos 5 min em que a fase moacutevel de limpeza foi
substituiacuteda pela fase moacutevel de carregamento O tempo total para cada anaacutelise foi de 15
minutos
Para a avaliaccedilatildeo da capacidade da fase moacutevel de limpeza (acetonitrila aacutegua
ultra pura isopropanol 751510 vvv) pools de soro branco dopado na maior
concentraccedilatildeo foram injetados no sistema (com a posiccedilatildeo 1 das vaacutelvulas mantida) e apoacutes
a realizaccedilatildeo da fase de limpeza foram injetados pools de soro branco diluiacutedos (11 vv)
O experimento foi realizado em triplicata O cromatograma do soro branco natildeo
apresentou sinal analiacutetico no mesmo tempo de retenccedilatildeo dos analitos o que mostra que a
fase moacutevel de limpeza foi eficiente em seu propoacutesito evitando o chamado efeito
residual (carry-over) De Faria et al 110
64
524 Validaccedilatildeo analiacutetica
Para os testes de validaccedilatildeo foram utilizados pools de amostras de soro branco
dopadas com cada um dos analitos nas concentraccedilotildees conforme o toacutepico 467
concentraccedilotildees menores foram utilizadas no entanto essas natildeo apresentaram bons sinais
analiacuteticos precisatildeo e exatidatildeo Os resultados dos testes de validaccedilatildeo estatildeo demonstrados
na Tabela 6
O teste de linearidade foi expresso como coeficiente de determinaccedilatildeo (r2)
calculado a partir das curvas de calibraccedilatildeo intra-ensaio Para esse teste foram utilizados
os analitos em diferentes concentraccedilotildees em soro branco conforme jaacute citado as
repeticcedilotildees geraram 6 curvas de calibraccedilatildeo para cada analito Os intervalos lineares
foram baseados nos intervalos terapecircuticos 51 117 118
As mesmas concentraccedilotildees dos analitos em soro no ensaio de linearidade foram
utilizadas no ensaio dos LD e LQ Estes foram calculados atraveacutes das 6 curvas de
calibraccedilatildeo e foram definidos como 3 e 10 vezes a relaccedilatildeo sinalruiacutedo respectivamente
para o LD e LQ
Para avaliar a precisatildeo e a exatidatildeo intra e inter-ensaios foram realizados 6
repeticcedilotildees de concentraccedilotildees de calibraccedilatildeo dos analitos Os testes intra-ensaio foram
realizados no mesmo dia e os testes inter-ensaios foram realizados em dias diferentes A
exatidatildeo foi calculada atraveacutes do erro relatico (E) e a precisatildeo atraveacutes do desvio
padratildeo relativo (RSD)
No teste de seletividade foi avaliado se houve a presenccedila picos de interferentes
nos mesmos tempos de retenccedilatildeo dos analitos e dos PIs deuterados As Figuras 21 e 22
mostram os cromatogramas obtidos apoacutes a injeccedilatildeo de soro branco e de soro dopado com
os analitos respectivamente mostrando que natildeo houve a presenccedila de interferentes nos
tempos de retenccedilatildeo dos analitos e PIs deuterados
65
Figura 21 - Cromatograma obtido de amostras de soro branco diluiacutedas em aacutegua ultra pura
Volume de injeccedilatildeo = 100 microL A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz 240rarr mz 131) C-
Hidroxibup (mz 256rarr mz 238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz 80) F-
Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G- Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr mz
244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz 134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz 196rarr
mz 80) Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
Figura 22 - Cromatograma obtido apoacutes anaacutelise de soro diluiacutedo e dopado com os analitos no niacutevel
meacutedio de calibraccedilatildeo e mais os padrotildees internos deuterados A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz
240rarr mz 131) C- Hidroxibup (mz 256rarr mz 238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz
80) F- Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G- Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr
mz 244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz 134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz 196rarr
mz 80) Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
Foram realizados os testes de estabilidade de bancada longo prazo e de
congelamento e descongelamento Para a anaacutelise de estabilidade de bancada soluccedilotildees de
soro dopada com os analitos foram analisadas imediatamente apoacutes a sua preparaccedilatildeo e
apoacutes 4 e 24 horas verificando assim a estabilidade da amostra a curto prazo Para uma
66
anaacutelise a longo prazo as amostras foram armazenadas a -20degC por 30 dias e apoacutes foram
avaliadas Quanto anaacutelises de congelamento e descongelamento foram realizados 3
ciclos de congelamento -20degC e posterior descongelamento e as amostras foram
avaliadas
O ensaio de recuperaccedilatildeo da extraccedilatildeo foi realizado em triplicata A anaacutelise
avaliou a recuperaccedilatildeo relativa comparando-se a extraccedilatildeo dos analitos a partir da matriz
de soro com a de aacutegua atraveacutes da passagem da amostra pela coluna de extraccedilatildeo (RAM)
A recuperaccedilatildeo relativa se daacute pela relaccedilatildeo das concentraccedilotildees nas duas matrizes
(concentraccedilatildeo no soro concentraccedilatildeo na aacutegua) x 100
O efeito residual (carry-over) foi avaliado injetando-se uma amostra de soro
branco antes de uma amostra de soro dopado na maior concentraccedilatildeo e apoacutes foi injetada
novamente uma amostra de soro branco foram inferior a 20 daqueles obtidos no LQ
Para avaliar o efeito matriz foram comparados os resultados da anaacutelise das
amostras de soro dopadas com os analitos em diferentes concentraccedilotildees em matrizes
diferentes (aacutegua e soro) O resultado para ser aceito precisava ser inferior a 15
Posteriormente foi realizada a mensuraccedilatildeo dos analitos em amostras reais de
soro provenientes de pacientes submetidos ao tratamento antitabagismo com doses
conforme bula As Figuras 23 e 24 mostram os cromatogramas de amostras de pacientes
submetidos ao tratamento com bupropiona e vareniclina respectivamente No momento
da coleta das amostras os pacientes estavam fumando e aleacutem de apresentarem os
analitos provenientes dos faacutermacos tambeacutem mostraram a presenccedila de analitos
provenientes da nicotina
67
Figura 23 - Cromatograma obtido atraveacutes da anaacutelise das amostras de soro dos pacientes
tratados com bupropiona (150 mg 2xdia) Os pacientes estavam fumando em torno de 10
cigarrosdia no dia da coleta A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz 240rarr mz 131) C-
hidroxibup (mz 256rarr mz 238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz 80) F-
Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G- Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr mz
244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz 134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz
196rarr mz 80) Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
Figura 24 - Cromatograma obtido atraveacutes da analise de amostras de soro de pacientes tratados
com vareniclina (10 mg 2xdia) Os pacientes fumavam em torno de 10 cigarrosdia no dia da
coleta A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz 240rarr mz 131) C- hidroxibup (mz 256rarr mz
238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz 80) F- Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G-
Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr mz 244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz
134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz 196rarr mz 80) Fonte do autor e do
colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG
68
Tabela 6 - Paracircmetros de validaccedilatildeo obtidos na determinaccedilatildeo de faacutermacos antitabagismo em soro humano
Meacutedia plusmn Desvio padratildeo (n=6) amenor bmeacutedio e calto niacutevel de calibraccedilatildeo 1Estabilidade de bancada (4 a 24 horas) Precisatildeo RSD = [Desvio padratildeomeacutedia] x 100 E = [(Meacutedia experimental da
concentraccedilatildeo Concentraccedilatildeo nominal) x 100] ndash 100 2Efeito matriz E= [(Meacutedia da concentraccedilatildeo experimental no solventeMeacutedia experimental da concentraccedilatildeo no soro) x 100] ndash 100
Paracircmetros de validaccedilatildeo Vareniclina Bupropiona Hidroxibupropiona Nicotina Cotinina Hidroxicotinina
Intervalo linear (microg L-1) 5-100 1-1000 1-2000 5-1000 5-1000 5-1000
r2 ( n=6) 09952 09998 09998 09997 09998 09999
Decliacutenio (α) ( n=6) 00196plusmn 00095 00045plusmn00059 00051plusmn00057 00087plusmn00012 00073plusmn00048 00075plusmn00074
Intercepto ( n=6) -00316plusmn00004 -00022plusmn00020 00230plusmn00025 -00046plusmn00065 00767plusmn00012 01918plusmn00013
Tempo de retenccedilatildeo (min) 521 501 485 497 446 441
LD (microg L-1) 25 07 06 19 24 37
LQ (microg L-1) 50 10 10 50 50 50
Precisatildeo intra-ensaio RSD ( n=6) 93a
30a
100c
153a
37b
21c
140a
06b
06c
90a
26b
11c
117a
34b
61c
128a
138b
92c
Precisatildeo inter-ensaio RSD ( n=18 trecircs dias) 185a
115b
66c
82a
27b
20c
109a
17b
10c
83a
27b
14c
158a
41b
31c
161a
44b
92c
Acuraacutecia intra-ensaio E ( n=6) 196a
54b
-30c
-55a
-24b
-11c
-65a
19b
-04c
158a
09b
-26c
-87a
47b
-24c
71a
18b
05c
Acuraacutecia inter-ensaio E ( n=18 trecircs dias) 82a
-16b
035c
41a
-01b
-01c
-87a
27b
-20c
146a
40b
018c
-120a
25b
-110c
58a
-35b
30c
Recuperaccedilatildeo da extraccedilatildeo ( n=3) 883a
1104b
1014c
1101a
1009b
1028c
945a
1094b
1078c
1098a
1088b
1146c
941a
1093b
1116c
1167a
1112b
1141c
Estabilidade1 E
( n=6)
98a
11b
-50c
71a
-32b
-38c
140a
-16b
-79c
40a
-79b
-110c
-132a
-94b
-32c
86a
125b
-54c
Efeito matriz2 E
( n=6)
-117a
104b
14c
101a
09b
28c
-55a
94b
78c
98a
88b
146c
-59a
93b
116c
167a
112b
141c
69
525 Dados cliacutenicos e demograacuteficos dos pacientes submetidos a mensuraccedilatildeo dos
analitos
As Tabelas 7 a 10 mostram as caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos
pacientes submetidos agraves anaacutelises de concentraccedilatildeo dos analitos
As Tabelas 7 e 8 referem-se aos pacientes tratados com vareniclina sendo
considerado o grupo total e os grupos de desfecho respectivamente Os pacientes do
grupo resistente agrave vareniclina fumavam um maior nuacutemero de cigarrosdia (antes do
tratamento) em comparaccedilatildeo com os pacientes que obtiveram sucesso (21 vs 17
cigarrosdia P= 005)
As Tabelas 9 e 10 referem-se aos pacientes tratados com bupropiona no grupo
total e de acordo com desfecho respectivamente O grupo resistente ao tratamento com
bupropiona apresentou maior frequecircncia de pacientes com alta DN (atraveacutes dos escores
FTND e Issa categorizados) e de pacientes que fumavam no dia da coleta em
comparaccedilatildeo ao grupo sucesso (FTNDge6= 833 vs 429 P= 005 Escore Issage3=
1000 vs 429 P= 0001 fumo no dia da coleta= 1000 vs 429 P= 0001
respectivamente)
Tabela 7 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos (n= 74)
Idade (anos) 51 plusmn 12
Gecircnero mulheres () 500
Etnia autodeclarada brancos () 730
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 263 plusmn 49
10 1 4 1
7 1 3 1
8 1 3 1
9 1 3 1
8 1 4 1
5 0 3 1
8 1 4 1
8 1 4 1
7 1 4 1
7 1 3 1
9 1 3 1
7 1 4 1
Cigarrosdia inicial 19 plusmn 10
Fumo no dia da coleta () 919
FTND 62 plusmn 23
FTND ge 6 () 644
70
Escore Issa ge 3 () 851
Hipertensatildeo () 311
Dislipidemia () 392
Diabetes melito tipo 2 () 95
Depressatildeo () 135
Ansiedade () 176
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash
Fagerstroumlm test for nicotine dependence (escala de 0 a 10 pontos)
Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala de 0 a 4
pontos)
Tabela 8 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com o
desfecho de tratamento
Resistente (n=41) Sucesso (n=33) P valor
Idade (anos) 53 plusmn 11 49 plusmn 13 023
Gecircnero mulheres () 561 424 024
Etnia autodeclarada brancos () 683 788 031
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 270 plusmn 40 255 plusmn 58 028
Cigarrosdia 21 plusmn 11 17 plusmn 7 005
Fumo no dia da coleta () 976 848 008
FTND 65 plusmn 22 57 plusmn 23 019
FTND ge 6 () 659 625 077
Escore Issa ge 3 () 829 879 075
Hipertensatildeo () 390 212 010
Dislipidemia () 341 455 032
Diabetes melito tipo 2 () 73 121 069
Depressatildeo () 122 152 071
Ansiedade () 146 212 046
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fagerstroumlm test for nicotine
dependence (escala de 0 a 10 pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
71
Tabela 9 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos (n= 31)
Idade (anos) 52 plusmn 11
Gecircnero mulheres () 71
Etnia autodeclarada brancos () 931
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 258 plusmn 57
Cigarrosdia inicial 21 plusmn 7
Fumo no dia da coleta () 871
FTND 68 plusmn 21
FTND ge 6 () 742
Escore Issa ge 3 () 871
Hipertensatildeo () 226
Dislipidemia () 323
Diabetes melito tipo 2 () 32
Depressatildeo () 65
Ansiedade () 194
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash
Fagerstroumlm test for nicotine dependence (escala de 0 a 10
pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
Tabela 10 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com
bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com
o desfecho de tratamento
Resistente (n=24) Sucesso (n=7) Valor de P
Idade (anos) 53 plusmn 11 50 plusmn 11 054
Gecircnero mulheres () 708 714 100
Etnia autodeclarada brancos () 957 833 038
Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 252 plusmn 61 278 plusmn 35 015
Cigarrosdia 21 plusmn 7 23 plusmn 7 071
Fumo no dia da coleta () 1000 429 0001
FTND 73 plusmn 15 54 plusmn 32 011
FTND ge 6 () 833 429 005
Escore Issa ge 3 () 1000 429 0001
Hipertensatildeo () 292 00 016
72
Dislipidemia () 375 143 038
Diabetes melito tipo 2 () 42 00 100
Depressatildeo () 83 00 100
Ansiedade () 250 00 029
FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fagerstroumlm test for nicotine
dependence (escala de 0 a 10 pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala
de 0 a 4 pontos)
526 Anaacutelise de associaccedilatildeo dos analitos com desfecho de tratamento
A Tabela 11 mostra a frequecircncia do desfecho de tratamento de acordo com os
medicamentos antitabagismo pacientes estes cujas amostras de soro foram submetidas agrave
mensuraccedilatildeo dos analitos
Tabela 11 ndash Frequecircncia do desfecho de tratamento nos pacientes submetidos agraves
anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com os medicamentos
antitabagismo
Medicamento Resistente () Sucesso ()
Vareniclina (n=74) 544 446
Bupropiona (n=31) 774 226
As Tabelas de 12 a 15 mostram as concentraccedilotildees dos analitos nas amostras de
soro dos pacientes tratados com vareniclina e bupropiona no grupo total e de acordo
com o desfecho de tratamento
Os pacientes do grupo resistente tanto os pacientes tratados com vareniclina
(Tabela 13) quanto com bupropiona (Tabela 15) apresentaram concentraccedilatildeo
significativamente maior de cotinina e hidroxicotinina do que os grupos sucesso
(tratamento com vareniclina cotinina= 1182 vs 706 μgL P= 0009 hidroxicotinina=
845 vs 516 μgL P= 002 Tratamento com bupropiona cotinina= 1346 vs 160 μgL
P= 0005 hidroxicotinina= 972 vs 374 μgL P= 0004) No entanto quanto ao NMR
natildeo houve diferenccedila entre os desfechos de tratamento de ambos os faacutermacos Aleacutem
73
disso somente o grupo de pacientes tratados com vareniclina continha pacientes com
NMRlt031 (metabolizadores lentos para nicotina) e ainda sua frequecircncia foi baixa
(100 e 43 para os grupos de desfecho resistente e sucesso respectivamente)
Tabela 12 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos pacientes tratados
com vareniclina
Vareniclina μgL n=71 83 (81 ndash 95)
Nicotina μgL n=31 75 (76 ndash 112)
Cotinina μgL n=65 1007 (923 ndash 1225)
Hidroxicotinina μgL n=65 681 (638 ndash 874)
NMR n=63 069 (067 ndash 102)
NMR lt031 () n=63 79
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de
95) NMR=trans-3-hidroxicotininacotinina NMR lt031=
metabolizador lento NMR ge031= metabolizador normal e raacutepido A
hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo
trans-3- hidroxicotinina para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade
de outros isocircmeros satildeo irrelevantes
Tabela 13 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de tratamento
com vareniclina
Resistente Sucesso P
valor Vareniclina μgL n=71 84 (78 ndash 99) 83 (77 ndash 97) 096
Nicotina μgL n=31 83 (74 ndash 127) 70 (59 ndash 105) 032
Cotinina μgL n=65 1182 (1012 ndash 1426)
111114143ndash
1421426)
706 (643 ndash 1037) 0009
Hidroxicotinina μgL n=65 845 (702 ndash 1032) 516 (434 ndash 721) 002
NMR n=63 074 (062 ndash 107) 061 (055 ndash 113) 064
NMR lt031 () n=63 100 43 064
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de 95) NMR=trans-3-
hidroxicotininacotinina NMR lt031= metabolizador lento NMR ge031= metabolizador normal e
raacutepido A hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3- hidroxicotinina
para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros satildeo irrelevantes
74
Tabela 14 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos pacientes tratados
com bupropiona
Bupropiona μgL n=30 369 (332 ndash 493)
Hidroxibupropiona μgL n=23 7368 (5860 ndash 7824)
Nicotina μgL n=13 71 (62 ndash 109)
Cotinina μgL n=27 1159 (971 ndash 1648)
Hidroxicotinina μgL n=28 931 (838 ndash 1387)
NMR n=27 090 (074 ndash 149)
NMR lt031 () n=27 0
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de 95) NMR=
trans-3-hidroxicotininacotinina NMR lt031= metabolizador lento NMR
ge031= metabolizador normal e raacutepido Natildeo houve pacientes com NRM lt031 A
hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3-
hidroxicotinina para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros
satildeo irrelevantes
Tabela 15 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de tratamento
com bupropiona
Resistente Sucesso P
valor Bupropiona μgL n=30 372 (331 ndash 533) 300 (214 ndash 481) 048
Hidroxibupropiona μgL n=23 7795 (6078 ndash 8308) 5128 (2957 ndash 8195) 012
Nicotina μgL n=13 71 (62 ndash 109) - -
Cotinina μgL n=27 1346 (1097 ndash 1784) 160 (-195 ndash 712) 0005
Hidroxicotinina μgL n=28 972 (929 ndash 1520) 374 (33 ndash 847) 0004
NMR n=27 084 (076 ndash 109) 132 (-371 ndash 884) 014
NMR lt031 () n=27 0 0 -
Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de 95) NMR= trans-3-
hidroxicotininacotinina NMR lt031= metabolizador lento NMR ge031= metabolizador normal e raacutepido
No grupo sucesso somente 1 paciente apresentou concentraccedilatildeo de nicotina Natildeo houve pacientes com NRM
lt031 A hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3- hidroxicotinina para o
caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros satildeo irrelevantes
75
6 DISCUSSAtildeO
61 Para os dados da anaacutelise de expressatildeo gecircnica
O presente estudo cliacutenico e exploratoacuterio identificou resultados significativos para
expressatildeo dos genes CHRNA7 e CHRNG de acordo com os tempos de coleta e o
desfecho de tratamento com vareniclina Amostras do grupo resistente nos tempos T2 e
T4 isto eacute jaacute com o uso da vareniclina apresentaram menores niacuteveis de expressatildeo
gecircnica do CHRNA7 comparado agraves amostras do T0 (antes de iniciar o tratamento
farmacoloacutegico) Estes resultados sugerem que o downregulation de α7 pode ter sido
responsaacutevel pela natildeo cessaccedilatildeo do fumo nos indiviacuteduos do grupo resistente o que natildeo foi
observado nas amostras do grupo sucesso
O gene CHRNA7 codifica a subunidade α7 dos nAChRs Esta possui grande
importacircncia estaacute presente em diversos tecidos e possui associaccedilatildeo consistente em
vaacuterios estudos com o processo de dependecircncia agrave nicotina processos cognitivos e
imunoloacutegicos 119-124 Estudos tambeacutem mostraram que haacute um locus contendo duplicaccedilatildeo
do gene CHRNA7 truncada composta pelos exons 5-10 do gene CHRNA7 precidida de
4 exons uacutenicos e uma deleccedilatildeo de dois pares de bases no eacutexon 6 o qual nomearam como
CHRNFAN7 A maioria dos indiviacuteduos possui uma ou duas coacutepias deste gene e satildeo
raros os casos em que esta coacutepia natildeo estaacute presente 125 126
No ceacuterebro de ratos Sprague-Dawley Ryan e Loiacono 119 detectaram niacuteveis de
α7 transcritos em diversos locais como na substacircncia negra compacta (SNpc) na
substacircncia negra reticular (SNpr) na aacuterea tegmental ventral (VTA) no coacutertex e no
hipocampo Os ratos submetidos ao tratamento crocircnico com nicotina mostraram maiores
niacuteveis de mRNA da subunidade α7 em SNpc SNpr e VTA em comparaccedilatildeo ao grupo
controle A VTA faz parte do sistema de recompensa mesoliacutembico o qual eacute muito
estudado nos processos de ND 12 15 No presente estudo (em amostras de PBMC) o
76
grupo de pacientes resistentes tambeacutem apresentou maior expressatildeo de α7 no momento
em que somente a nicotina estava presente no fumo crocircnico Ao introduzir a vareniclina
as expressotildees foram diminuiacutedas nos tempos T2 e T4 provavelmente devido ao
antagonismo competitivo da vareniclina com a nicotina no receptor
Benhammou et al 127 realizaram um estudo com amostras de ceacuterebro post mortem
de fumantes e com amostras de sangue de voluntaacuterios fumantes e natildeo fumantes Atraveacutes
do uso de nicotina radiomarcada nas amostras de ceacuterebro mostraram que os siacutetios de
ligaccedilatildeo agrave nicotina foram aumentados proporcionamente conforme o nuacutemero de cigarros
por dia O mesmo estudo ao analizar a expressatildeo gecircnica e proteiacutenas em linfoacutecitos e
ceacutelulas polimorfonucleares para um subconjunto de subunidades de receptores
nicotiacutenicos essas ceacutelulas assim como no tecido cerebral exibiram maiores nuacutemeros de
siacutetios de ligaccedilatildeo de alta afinidade agrave nicotina em fumantes em comparaccedilatildeo com natildeo
fumantes
A vareniclina em estudos funcionais mostrou ter atividade agonista total nos
receptores α7 40 Em um estudo realizou-se o tratamento crocircnico com vareniclina eou
nicotina em camundongos (10 dias) os niacuteveis das drogas no ceacuterebro e no plasma e a
toleracircncia e a expressatildeo de 4 subtipos de nAChR apoacutes dose aguda de nicotina foram
checados usando autoradiografia O upregulation de receptores α4β2 devido ao
tratamento crocircnico com vareniclina foi similar ao promovido pela nicotina e tambeacutem
ocorreu dowregulation de α6β2 assim como ocorreu com o uso de nicotina A
vareniclina aumentou significantemente os siacutetios de α3β4 e α7 enquanto a nicotina teve
menor efeito nestes siacutetios A combinaccedilatildeo da nicotina com a vareniclina foi similar agrave
vareniclina sozinha para os siacutetios de α3β4 enquanto para o siacutetio de α7 a combinaccedilatildeo
promoveu upregulation em menos regiotildees cerebrais em comparaccedilatildeo com a vareniclina
em monoterapia 77
77
No presente estudo os pacientes do grupo resistente apresentaram efeito
semelhante associado ao uso combinado de vareniclina e nicotina (devido ao fumo) os
niacuteveis de expressatildeo de CHRNA7 natildeo foram mantidos como nos pacientes que obtiveram
sucesso no tratamento No entanto o grupo sucesso soacute estava utilizando a vareniclina na
ausecircncia de nicotina entre os tempos T2 e T4 o que sugere que esse dowregulation
pode ocorrer em subgrupo de resposta
Diversos estudos mostraram diferenccedilas na expressatildeo gecircnica de a7 em
amostras de pacientes com diagnoacutesticos psiquiaacutetricos em comparaccedilatildeo com indiviacuteduos
sadios 102 128-134
Kunii et al 128 mostraram diferenccedila na expressatildeo de a7 em coacutertex preacute-frontal
dorsolateral post mortem de pacientes com depressatildeo ansiedade e transtorno bipolar e
inuacutemeros estudos mostraram menores niacuteveis de expressatildeo de α7 em pacientes com
esquizofrenia 102 129-134
Estudos de indiviacuteduos com esquizofrenia satildeo oacutetimos modelos para o
entendimento da importacircncia do receptor a7 em processos cognitivos em ND e em
como esses mecanismos estatildeo intimamente relacionados Diversos estudos mostraram
que haacute uma maior prevalecircncia de tabagismo em indiviacuteduos com esquizofrenia
comparados agrave populaccedilatildeo geral 135 136
Mexal el al 102 realizaram um estudo com amostras de ceacuterebro post mortem
provenientes de indiviacuteduos de 4 grupos distintos controle natildeo fumante controle
fumante pacientes com esquizofrenia natildeo fumantes e pacientes com esquizofrenia
fumantes O estudo realizou ensaio de expressatildeo de mRNA e de proteiacutena atraveacutes de
PCR quantitativo em tempo real e western blot As sondas da PCR foram desenhadas
para amplificar o gene completo CHRNA7 e sua coacutepia duplicada o CHRFAM7A Natildeo
fumantes com esquizofrecircnia apresentaram expressatildeo reduzida de mRNA e de proteiacutena
78
em relaccedilatildeo aos pacientes com esquizofrenia fumantes Natildeo fumantes com esquizofrenia
apresentaram menor expressatildeo em relaccedilatildeo ao controle natildeo fumante mas essa diferenccedila
foi estatisticamente significativa apenas no niacutevel do mRNA Outros estudos post
mortem cerebral mostraram menor expressatildeo dos receptores nicotiacutenicos no coacutertex e no
hipocampo de indiviacuteduos com esquizofrecircnia comparado aos controles saudaacuteveis 129-134
O CHRFAM7A assim como o CHRNA7 eacute polimoacuterfico e variantes neste gene
foram associadas agrave patologia auditoacuteria em casos de esquizofrenia Processos
diferenciados nos mecanismos de transcriccedilatildeo podem contribuir para um funcionamento
anormal de a7 como variaccedilotildees em promotor splicing alternativo eou desequiliacutebrio de
ligaccedilatildeo com o SNP do gene de neuroregulina -1 (gene que codifica moleacutecula de adesatildeo
celular envolvida em processos de neuroplasticidade sinaacuteptica) Estes processos podem
estar envonvidos em endofenoacutetipos da doenccedila 122 126 137-144
A nicotina parece melhorar a audiccedilatildeo em indiviacuteduos com deacuteficit auditoacuterio na
esquizofrenia associado ao α7 permitindo uma melhor filtragem dos estiacutemulos
auditivos estranhos A nicotina melhora a cogniccedilatildeo na esquizofrenia e agentes
alternativos que ativam o receptor nicotiacutenico foram testados e esses compostos
melhoraram a atenccedilatildeo a memoacuteria de trabalho e os sintomas negativos em um estudo
complementar de pacientes natildeo fumantes com esquizofrenia 145
Os estudos citados nos mostram grandes evidecircncias da associaccedilatildeo do α7 com
ND processos cognitivos e de resposta agrave vareniclina Esses achados podem explicar
nossos resultados em relaccedilatildeo agrave diminuiccedilatildeo da expressatildeo de 7 no grupo de pacientes
resistentes ao tratamento Os pacientes do grupo sucesso mantiveram os niacuteveis de
expressatildeo gecircnica em resposta agrave vareniclina jaacute no grupo resistente houve um
dowregulation Sugerimos que essa diminuiccedilatildeo pode ter sido a responsaacutevel ao menos
em parte pelos indiviacuteduos natildeo terem conseguido deixar de fumar A nicotina pode estar
79
compensando um deacuteficit de α7 que os indiviacuteduos resistentes podem apresentar No
entanto natildeo sabemos como seria a expressatildeo de α7 nestes indiviacuteduos na ausecircncia do
fumo
Quanto ao gene CHNRG natildeo haacute muitos resultados na literatura Este codifica
a subunidade γ dos receptores nicotiacutenicos A maioria dos estudos aponta associaccedilatildeo da
subunidade com distuacuterbios esqueleacutetico-musculares 146-149
No entanto King et al 65 encontraram a associaccedilatildeo de polimorfismos neste
gene com nausea no tratamento com vareniclina E Keskitalo-Vuokko 150 et al
encontraram associaccedilatildeo de SNPs em loci do cluster de genes CHRNGCHRND (genes
muitos proacuteximos o uacuteltimo codifica a subunidade delta dos nAChRs) com o niacutevel de
cotinina Saccone et al 151 encontraram a associaccedilatildeo de 4 loci no cluster
CHRNDCHRNG com ND Em outro estudo variantes nos genes CHRNDCHRNG
mostraram associaccedilatildeo modesta com o risco de ND em amostras de afro-americanos 152
Em um estudo o qual foi utilizado um modelo de esquizofrenia em ratos no
grupo de animais tratados com clozapina foi encontrado downregulation do Chrng no
nuacutecleo accumbens Neste mesmo estudo Santoro et al natildeo conseguiram formular uma
hipoacutetese para o achado devido ao lack de informaccedilotildees na literatura com o foco em ND
ou performance cognitiva 153
Haacute algumas limitaccedilotildees no estudo Primeira o ensaio da anaacutelise de expressatildeo
gecircnica foi realizado com amostras de sangue perifeacuterico e natildeo no SNC o que poderia nos
mostrar uma relaccedilatildeo mais clara e direta do faacutermaco com a via de resposta No entanto a
obtenccedilatildeo desta amostra eacute inviaacutevel Em contrapartida estudos jaacute demonstraram que haacute
similaridade entre a expressatildeo gecircnica de ceacutelulas do SNC e de ceacutelulas de sangue
perifeacuterico para alguns destes genes de receptores nicotiacutenicos 102 Segunda natildeo foi
realizado ensaio de expressatildeo gecircnica para amostras de indiviacuteduos natildeo fumantes o que
80
poderia fornecer mais paracircmetros de comparaccedilatildeo com os grupos resistente e sucesso
Terceira natildeo conseguimos qualidade necessaacuteria nas anaacutelises de genes potencialmente
importantes
62 Para os dados da mensuraccedilatildeo dos analitos
Um dos maiores desafios em anaacutelises de amostras bioloacutegicas eacute eliminar os
interferentes de sua matriz sem alterar substancialmente as quantidades dos analitos
presentes A matriz de amostras de soro e plasma satildeo complexas e envolve a presenccedila
de inuacutemeras macromoleacuteculas como lipiacutedios e proteiacutenas que obstruem colunas anaacuteliticas
diminuem o tempo de duraccedilatildeo de equipamentos e inviabilizam a interpretaccedilatildeo dos
dados devido a imensos picos e ruiacutedos formados nos cromatogramas e espectros de
massa Inumeros trabalhos executam uma preparaccedilatildeo preacutevia das amostras que envolve
processos como a extraccedilatildeo com uso de solventes preciptaccedilatildeo de proteiacutenas entre outros
os quais podem promover uma baixa recuperaccedilatildeo dos analitos tempo prolongado de
bancada e gasto de materiais 51 104-106
Devido agrave esse fato inuacutemeros estudos propuseram o uso de materiais de acesso
restrito (RAMs) para a purificaccedilatildeo da amostra sem tanto manuseio dentre eles estatildeo os
nanotubos de carbono (CNTs) modificados 109 110 114-116
O presente estudo desenvolveu uma coluna extratora composta por nanotubos
hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados quimicamente com a adiccedilatildeo de grupos
hidrofiacuteficos Essa coluna permitiu uma oacutetima exclusatildeo de macromoleacuteculas (98) A
aacutegua ultra pura foi o suficiente para ser utilizada como fase moacutevel de carregamento o
que eacute sustentaacutevel aleacutem de natildeo causar danos ao meio ambiente e o uacutenico preparo da
amostra foi uma diluiacuteccedilatildeo 11 tambeacutem em aacutegua O novo RAM desenvolvido foi
81
encaminhado para pedido de patente (Anexo 5) e portanto os processos para o seu
desenvolvimento foram mantidos em sigilo
Os CNTs possuem uma grande aacuterea superfiacutecial e oacutetima estabilidade em anaacutelise
de compostos no entanto o material natildeo promove a remoccedilatildeo de proteiacutenas com
eficiecircncia 110 115 Os poros dos CNTs formam uma barreira fiacutesica excluindo ou
permitindo a entrada de moleacuteculas por tamanho e os grupos hidrofiacutelicos adicionados ao
RAM desenvolvido natildeo permitem a ligaccedilatildeo de proteiacutenas de forma irreversiacutevel
formando uma barreira fiacutesico-quiacutemica Os demais CNTs natildeo modificados disponiacuteveis
natildeo promovem a exclusatildeo de macromoleacuteculas com tanta efetividade quanto o material
desenvolvido aleacutem disso o novo RAM apoacutes limpeza pode ser reutilizado cerca de 400
vezes (valor calculado durante os experimentos com amostras controle)
Quanto a otimizaccedilatildeo do meacutetodo de mensuraccedilatildeo a anaacutelise multidimensional
atraveacutes de equipamentos conectados por vaacutelvulas comutadoras promoveu a realizaccedilatildeo
da extraccedilatildeo eluiccedilatildeo anaacutelise limpeza e recondicionamento do sistema automaacuteticamente
A anaacutelise completa de uma amostra foi realizada em apenas 15 minutos O sistema
permitiu a mensuraccedilatildeo conjunta de diversos analitos com caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas
diferentes de uma mesma amostra mostrando bons sinais analiacuteticos e perfis
cromatograacuteficos
Quanto aos dados de validaccedilatildeo o meacutetodo permitiu uma oacutetima recuperaccedilatildeo dos
analitos com valores proacuteximos a 100 semelhante a outros estudos 104 117 154 155 A
maior dificuldade encontrada neste estudo foi a configuraccedilatildeo de paracircmetros
espectromeacutetricos e cromatograacuteficos que pudessem obter o maacuteximo de recuperaccedilatildeo e o
menor LQ possiacutevel para a anaacutelise de vareniclina ainda em um contexto de anaacutelise
multianalito
82
A dose posoloacutegica da vareniclina eacute muito baixa (1mg 2 vezes ao dia a partir do
8deg dia de tratamento) em comparaccedilatildeo com a da bupropiona (150 mg 2 vezes ao dia a
partir do 8deg dia de tratamento) dessa forma as concentraccedilotildees plasmaacuteticas de
vareniclina satildeo muito baixas Apesar do valor de LQ obtido (5 μg L-1) estar entre as
meacutedias plasmaacuteticas de intervalo terapecircutico (40 -70 μg L-1 de vareniclina em plasma e
soro) 51 118 ao mensurar amostras de pacientes em um cenaacuterio real de tratamento de 74
pacientes apenas 3 amostras apresentaram concentraccedilatildeo plasmaacutetica de vareniclina
abaixo do limite de quantificaccedilatildeo
Quanto a recuperaccedilatildeo do analito da matriz a vareniclina tambeacutem mostrou menor
taxa (883) em relaccedilatildeo aos outros analitos (valores proacuteximos ao 100) no entanto
essa taxa de recuperaccedilatildeo eacute considerada alta e foi semelhante ao estudo de Dobrinas et al
156 o qual realizou a extraccedilatildeo da amostra atraveacutes de coluna extratora de fase soacutelida
(SPE) disponiacutevel no mercado e a mensuraccedilatildeo tambeacutem foi realizada em um contexto
multianalito E ainda a recuperaccedilatildeo de vareniclina no presente estudo foi maior do que
a obtida pelo trabalho de Al-Haj et al 105 o qual realizou a preparaccedilatildeo preacutevia da amostra
por extraccedilatildeo liacutequido-liacutequido (LLE) e a mensuraccedilatildeo foi realizada para somente um
analito (4759 - 4872) e obteve recuperaccedilatildeo semelhante ao estudo de os qual
tambeacutem realizou a anaacutelise de vareniclina em um cenaacuterio multianalito (830 ndash 920)
Para nicotina e cotinina os valores de LQ obtidos no presente estudo (50 μg L-1)
se assemelham aos obtidos nos estudos de Abdallah et al 104 (70 μg L-1 para cotinina)
Onoue et al 157 (50 μg L-1 para nicotina e cotinina) Petersen et al 117 (50 μg L-1) Para
bupropiona e hidroxibupropiona o meacutetodo proposto eacute capaz de mensurar pequenas
quantidades do faacutermaco e de seu metaboacutelito (LQ 10 μg L-1 para ambos) quantidades
menores do que os LQs obtidos nos estudos de 158 (55 para bupropiona e 60 μgL para
83
hidroxibupropiona) e de 155 (100 μg L-1 para hidroxibupropiona) apesar das
concentraccedilotildees de metaboacutelitos em estado de equiliacutebrio em pacientes tratados com doses
terapecircuticas do faacutermaco serem bem maiores (45 ndash 75 μg L-1 e de 500 ndash 1500 μg L-1)
respectivamente para bupropiona e hidroxibupropiona 118
O Quadro 6 mostra os paracircmetros analiacuteticos do presente estudo comparados com
outros estudos presentes na literatura
Quanto agraves mensuraccedilotildees das amostras dos pacientes natildeo encontramos associaccedilatildeo
dos faacutermacos e seus metaboacutelitos com desfecho de tratamento Esse fato poderia ser
explicado pelo pequeno nuacutemero amostral do presente estudo
Encontramos diferenccedila significativa entre os grupos resistente e sucesso ao
tratamento quanto aos paracircmetros relacionados ao fumo e agrave DN Os pacientes do grupo
resistente tratados com vareniclina (ainda antes do iniacutecio do tratamento) fumavam um
maior nuacutemero de cigarrosdia em comparaccedilatildeo com os pacientes que obtiveram sucesso
O grupo resistente ao tratamento com bupropiona apresentou maior frequecircncia de
pacientes com alta DN (antes do tratamento) e de pacientes que fumavam no dia da
coleta em comparaccedilatildeo ao grupo sucesso Os dados tambeacutem mostraram que os pacientes
resistentes tratados com ambos os faacutermacos no dia da coleta apresentaram maiores
concentraccedilotildees dos metaboacutelitos da nicotina Esses dados podem indicar maior exposiccedilatildeo
ao fumo e maior DN podendo implicar na resposta ao tratamento antitabagismo
Haacute algumas limitaccedilotildees nesse estudo Primeira os pacientes natildeo fizeram exames
de funccedilatildeo hepaacutetica antes da inclusatildeo no entudo no entanto a presenccedila de comorbidades
hepaacuteticas foram questionadas Segunda natildeo podemos obter total rigor nos horaacuterios de
tomada dos medicamentos por parte dos pacientes no entanto os pacientes foram
84
orientados agrave tomar o medicamento sempre no mesmo horaacuterio e foram questionados
quanto ao cumprimento do protocolo Terceira o nuacutemero amostral para a anaacutelise dos
analitos e de NRM em estudos de associaccedilatildeo com desfecho de tratamento eacute considerado
modesto e consequentemente pode ter implicado nos resultados de natildeo associaccedilatildeo
85
Quadro 6 ndash Comparaccedilatildeo dos dados de validaccedilatildeo com outros estudos
Analitos Purificaccedilatildeo da
amostraextraccedilatildeo Meacutetodo Amostra Intervalo Linear (μg L-1) Recuperaccedilatildeo () LD μg L-1 LQ μg L-1 Referecircncia
Vareniclina
Bupropiona
Hidroxibupropiona
Nicotina
Cotinina
Hidroxicotinina
CS ndash SPE (novo
RAM) HPLC-MSMS Soro humano
50 ndash 1000
10 ndash 10000
10 ndash 20000
50 ndash 10000
50 ndash 10000
50 ndash 10000
883
1101
945
1098
941
1167
25
07
06
19
24
37
50
10
10
50
50
50
Presente
estudo
Nicotitna
Cotinina LLE (LCndashMSMS) Soro humano
03 ndash 525
70 ndash15000
978 ndash 1114
973 ndash1156 -
03
70
Abdalla et al 104
Bupropiona
Hidroxibupropiona PP + SPE online TFCndashMSMS) Soro humano 50 ndash 10000
1580
1160
13
45
55
60
Petrides et
al 158
Vareniclina LLE HPLCndashMSMS
(API) Plasma humano 01ndash100 4759 - 4872 005 01
Al-Haj et al 105
Vareniclina LLE HPLC-
APIMSMS
Plasma
Urina
01 - 500
10 ndash 5000 - -
lt01
100
Faessel et al 51
Nicotina
cotinina
trans-3 ndash
hidroxicotinina
vareniclina
SPE (Oasis MCX 10
mg 96-well extraction
plate)
UPLCndashMSMS
Soro humano
100 ndash 5000
100 ndash 5000
100 - 5000
100 ndash 2500
860 ndash 940
700 ndash 870
490 ndash 540
830 ndash 920
-
20
10
20
10
Dobrinas et
al 156
86
Nicotina
Cotinina Centrifugaccedilatildeo
Diluiccedilatildeo
isotoacutepica estaacutevel
ndash UPLC-
MSMS
Urina 50 ndash 350000 968ndash1051
943ndash992
07
04
17
11
Kuhn et al 154
Nicotina e Cotinina LLE PP SPE
(UPLC-
MSMS)
Sangue urina e
outros tecidos de
rato
100 ndash 6000 (plasma)
80 (nicotina e
cotininacom
precipitaccedilatildeo)
25 50 Onoue et al
157
Cotinina LL SPE (coluna
Zorbaxs XDB C8) HPLCUV Soro e urina 50 ndash 5000 978 ndash 102 018 50
Petersen et
al 117
hidroxibupropiona PP + SPE online RP‐HPLCUV Plasma humano 1000 - 25000 6118 1000 1000
Scherf-
Clavel et al 155
CS ndash SPE= Extraccedilatildeo em fase soacutelida no modo column switching LLE= extraccedilatildeo liacutequido-liacutequido PP=precipitaccedilatildeo de proteiacutenas SPE=extraccedilatildeo em fase soacutelida HPLC= cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia
UPLC=cromatografia liacutequida de ultra eficiecircncia RP‐HPLC=Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia em fase reversa TFC=Cromatografia liacutequida turbulenta API=ionizaccedilatildeo em pressatildeo atmosfeacutericaUV=
detector ultravioleta MSMS= espectometria de massas em tandem
87
7 CONCLUSOtildeES
Para a anaacutelise da expressatildeo gecircnica este estudo exploratoacuterio mostra a associaccedilatildeo
das subunidades α7 e γ com a efetividade do tratamento com vareniclina Estes
resultados poderiam contribuir ao menos em parte para o desenvolvimento de uma
terapecircutica individualizada
Para a mensuraccedilatildeo de analitos o novo RAM sintetizado eacute um produto de
extremo valor cientiacutefico podendo apresentar diversas aplicaccedilotildees em anaacutelise de amostras
de matrizes complexas sem muita preparaccedilatildeo preacutevia Para a associaccedilatildeo das
concentraccedilotildees dos faacutermacos e seus metaboacutelitos com o desfecho de tratamento satildeo
necessaacuterios estudos com um maior nuacutemero amostral
88
8 SUGESTOtildeES PARA ESTUDOS FUTUROS
Sugerimos estudos que promovam maior entendimento das subunidades α7 e γ
dos nAChRs nos processos de dependecircncia agrave nicotina e no tratamento com vareniclina
Sugerimos tambeacutem estudos de investigaccedilatildeo para novas aplicabilidades do novo RAM
desenvolvido
89
9 REFEREcircNCIAS
1 WHO Tobacco WHO Media Centre 2015
2 Oliveira AF Valente JG Leite IC [Aspects of tobacco attributable mortality
systematic review] Rev Saude Publica 200842(2)335-345
3 Koshiaris C Aveyard P Oke J Ryan R Szatkowski L Stevens R Farley A
Smoking cessation and survival in lung upper aero-digestive tract and bladder
cancer cohort study Br J Cancer 2017117(8)1224-1232
4 Leppanen T Toyras J Mervaala E Penzel T Kulkas A Severity of individual
obstruction events increases with age in patients with obstructive sleep apnea
Sleep Med 20173732-37
5 Cerda J Bambs C Vera C Infant morbidity and mortality attributable to
prenatal smoking in Chile Rev Panam Salud Publica 201741e106
6 Vigitel Brasil - Vigilacircncia de fatores de risco e proteccedilatildeo para doenccedilas crocircnicas
por inqueacuterito telefocircnico Estimativas sobre frequecircncia e distribuiccedilatildeo
sociodemograacutefica de fatores de risco e proteccedilatildeo para doenccedilas crocircnicas nas
capitais dos 26 estados brasileiros e no Distrito Federal em 2018 Brasiacutelia 2019
7 Rosemberg J Nicotina Droga Universal Instituto Nacional de Cacircncer
(wwwincagovbr) 2004
8 Kirchenchtein C Chatkin JM Dependecircncia da Nicotina In Diretrizes para
Cessaccedilatildeo do Tabagismo Jornal Brasileiro de Pneumologia Brasiacutelia DF 2004
9 Fagerstoumlm K Uma breve apresentaccedilatildeo da neurofarmacologia e fisiologia da
dependecircncia agrave nicotina In Gigliotti AP Presman S (Eds) Atualizaccedilatildeo no
Tratamento do Tabagismo ABP Sauacutede 2006
10 Gigliotti A Lemos T Quais satildeo os mecanismos da dependecircncia de nicotina
In Manual de Condutas e Praacuteticas em Tabagismo Sociedade Brasileira de
Pneumologia e Tisiologia 2012
11 Divisatildeo de Controle do Tabagismo Coordenaccedilatildeo de Accedilotildees Estrateacutegicas
Instituto Nacional de Cacircncer Silva AG Ministeacuterio da Sauacutede Protocolo cliacutenico
e diretrizes terapecircuticas dependecircncia agrave nicotina 2013
12 Schultz W Multiple reward signals in the brain Nat Rev Neurosci
20001(3)199-207
13 Stolerman IP Jarvis MJ The scientific case that nicotine is addictive
Psychopharmacology (Berl) 1995117(1)2-10 discussion 14-20
90
14 Koob GF Volkow ND Neurocircuitry of addiction Neuropsychopharmacology
200935(1)217-238
15 Martin-Soelch C Neuroadaptive changes associated with smoking structural
and functional neural changes in nicotine dependence Brain Sci 20133(1)159-
176
16 Boening JA Neurobiology of an addiction memory J Neural Transm (Vienna)
2001108(6)755-765
17 Robbins TW Everitt BJ Limbic-striatal memory systems and drug addiction
Neurobiol Learn Mem 200278(3)625-636
18 Everitt BJ Belin D Economidou D Pelloux Y Dalley JW Robbins TW
Review Neural mechanisms underlying the vulnerability to develop compulsive
drug-seeking habits and addiction Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci
2008363(1507)3125-3135
19 Fuentes RM Notkola IL Shemeikka S Tuomilehto J Nissinen A Familial
aggregation of blood pressure a population-based family study in eastern
Finland J Hum Hypertens 200014(7)441-445
20 Gotti C Zoli M Clementi F Brain nicotinic acetylcholine receptors native
subtypes and their relevance Trends Pharmacol Sci 200627(9)482-491
21 Benowitz NL Pharmacology of nicotine addiction smoking-induced disease
and therapeutics Annu Rev Pharmacol Toxicol 20094957-71
22 Benowitz NL Clinical pharmacology of inhaled drugs of abuse implications in
understanding nicotine dependence NIDA Res Monogr 19909912-29
23 Picciotto MR Zoli M Rimondini R Lena C Marubio LM Pich EM Fuxe K
Changeux JP Acetylcholine receptors containing the beta2 subunit are involved
in the reinforcing properties of nicotine Nature 1998391(6663)173-177
24 Maskos U Molles BE Pons S Besson M Guiard BP Guilloux JP Evrard A
Cazala P Cormier A Mameli-Engvall M Dufour N Cloez-Tayarani I
Bemelmans AP Mallet J Gardier AM David V Faure P Granon S Changeux
JP Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of
nicotinic receptors Nature 2005436(7047)103-107
25 Tapper AR McKinney SL Nashmi R Schwarz J Deshpande P Labarca C
Whiteaker P Marks MJ Collins AC Lester HA Nicotine activation of alpha4
receptors sufficient for reward tolerance and sensitization Science
2004306(5698)1029-1032
26 Aberger K Chitravanshi VC Sapru HN Cardiovascular responses to
microinjections of nicotine into the caudal ventrolateral medulla of the rat Brain
Res 2001892(1)138-146
91
27 Levin ED Bettegowda C Blosser J Gordon J AR-R17779 and alpha7
nicotinic agonist improves learning and memory in rats Behav Pharmacol
199910(6-7)675-680
28 Hajos M Hurst RS Hoffmann WE Krause M Wall TM Higdon NR Groppi
VE The selective alpha7 nicotinic acetylcholine receptor agonist PNU-282987
[N-[(3R)-1-Azabicyclo[222]oct-3-yl]-4-chlorobenzamide hydrochloride]
enhances GABAergic synaptic activity in brain slices and restores auditory
gating deficits in anesthetized rats J Pharmacol Exp Ther 2005312(3)1213-
1222
29 Salas R Orr-Urtreger A Broide RS Beaudet A Paylor R De Biasi M The
nicotinic acetylcholine receptor subunit alpha 5 mediates short-term effects of
nicotine in vivo Mol Pharmacol 200363(5)1059-1066
30 Henningfield JE Stapleton JM Benowitz NL Grayson RF London ED Higher
levels of nicotine in arterial than in venous blood after cigarette smoking Drug
Alcohol Depend 199333(1)23-29
31 Hukkanen J Jacob P 3rd Benowitz NL Metabolism and disposition kinetics of
nicotine Pharmacol Rev 200557(1)79-115
32 Dempsey D Tutka P Jacob P 3rd Allen F Schoedel K Tyndale RF Benowitz
NL Nicotine metabolite ratio as an index of cytochrome P450 2A6 metabolic
activity Clin Pharmacol Ther 200476(1)64-72
33 Allenby CE Boylan KA Lerman C Falcone M Precision Medicine for
Tobacco Dependence Development and Validation of the Nicotine Metabolite
Ratio J Neuroimmune Pharmacol 201611(3)471-483
34 Llaquet H Pichini S Joya X Papaseit E Vall O Klein J Garcia-Algar O
Biological matrices for the evaluation of exposure to environmental tobacco
smoke during prenatal life and childhood Anal Bioanal Chem 2010396(1)379-
399
35 Reichert J AA Gonccedilalves CMC Godoy I Chatkin JM Sales MPU et al
Diretrizes da Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisologia Diretrizes para
cessaccedilatildeo do tabagismo ndash 2008 J Bras Pneumol 200834(10)845-880
36 Fiore MC Jaeacuten C R Baker TB Treating tobacco use and dependence 2008
update Clinical Practice Guideline In services USDohah ed Public Health
Service Rockville (md) 2008
37 Kassem MG Al Hossaini AM Varenicline Profiles Drug Subst Excip Relat
Methodol 201237389-411
38 Zoli M Lena C Picciotto MR Changeux JP Identification of four classes of
brain nicotinic receptors using beta2 mutant mice J Neurosci
199818(12)4461-4472
92
39 Hogg RC Raggenbass M Bertrand D Nicotinic acetylcholine receptors from
structure to brain function Rev Physiol Biochem Pharmacol 20031471-46
40 Mihalak KB Carroll FI Luetje CW Varenicline is a partial agonist at
alpha4beta2 and a full agonist at alpha7 neuronal nicotinic receptors Mol
Pharmacol 200670(3)801-805
41 Swan GE Javitz HS Jack LM Wessel J Michel M Hinds DA Stokowksi RP
McClure JB Catz SL Richards J Zbikowski SM Deprey M McAfee T Conti
DV Bergen AW Varenicline for smoking cessation nausea severity and
variation in nicotinic receptor genes Pharmacogenomics J 201212(4)349-358
42 Kaur K Kaushal S Chopra SC Varenicline for smoking cessation A review of
the literature Curr Ther Res Clin Exp 200970(1)35-54
43 Catz SL Jack LM McClure JB Javitz HS Deprey M Zbikowski SM McAfee
T Richards J Swan GE Adherence to varenicline in the COMPASS smoking
cessation intervention trial Nicotine Tob Res 201113(5)361-368
44 Faessel HM Burstein AH Troutman MD Willavize SA Rohrbacher KD Clark
DJ Lack of a pharmacokinetic interaction between a new smoking cessation
therapy varenicline and digoxin in adult smokers Eur J Clin Pharmacol
200864(11)1101-1109
45 Mohanasundaram UM Chitkara R Krishna G Smoking cessation therapy with
varenicline Int J Chron Obstruct Pulmon Dis 20083(2)239-251
46 Faessel HM Smith BJ Gibbs MA Gobey JS Clark DJ Burstein AH Single-
dose pharmacokinetics of varenicline a selective nicotinic receptor partial
agonist in healthy smokers and nonsmokers J Clin Pharmacol 200646(9)991-
998
47 Faessel HM Obach RS Rollema H Ravva P Williams KE Burstein AH A
review of the clinical pharmacokinetics and pharmacodynamics of varenicline
for smoking cessation Clin Pharmacokinet 201049(12)799-816
48 Ravva P Gastonguay MR Tensfeldt TG Faessel HM Population
pharmacokinetic analysis of varenicline in adult smokers Br J Clin Pharmacol
200968(5)669-681
49 Obach RS Reed-Hagen AE Krueger SS Obach BJ OConnell TN Zandi KS
Miller S Coe JW Metabolism and disposition of varenicline a selective
alpha4beta2 acetylcholine receptor partial agonist in vivo and in vitro Drug
Metab Dispos 200634(1)121-130
50 Feng B Obach RS Burstein AH Clark DJ de Morais SM Faessel HM Effect
of human renal cationic transporter inhibition on the pharmacokinetics of
varenicline a new therapy for smoking cessation an in vitro-in vivo study Clin
Pharmacol Ther 200883(4)567-576
93
51 Faessel HM Gibbs MA Clark DJ Rohrbacher K Stolar M Burstein AH
Multiple-dose pharmacokinetics of the selective nicotinic receptor partial
agonist varenicline in healthy smokers J Clin Pharmacol 200646(12)1439-
1448
52 Slemmer JE Martin BR Damaj MI Bupropion is a nicotinic antagonist J
Pharmacol Exp Ther 2000295(1)321-327
53 Hughes JR Stead LF Lancaster T Antidepressants for smoking cessation
Cochrane Database Syst Rev 2007(1)CD000031
54 Goodnick PJ Pharmacokinetics of second generation antidepressants
bupropion Psychopharmacol Bull 199127(4)513-519
55 Hesse LM Venkatakrishnan K Court MH von Moltke LL Duan SX Shader
RI Greenblatt DJ CYP2B6 mediates the in vitro hydroxylation of bupropion
potential drug interactions with other antidepressants Drug Metab Dispos
200028(10)1176-1183
56 Faucette SR Hawke RL Lecluyse EL Shord SS Yan B Laethem RM Lindley
CM Validation of bupropion hydroxylation as a selective marker of human
cytochrome P450 2B6 catalytic activity Drug Metab Dispos 200028(10)1222-
1230
57 Walsky RL Astuccio AV Obach RS Evaluation of 227 drugs for in vitro
inhibition of cytochrome P450 2B6 J Clin Pharmacol 200646(12)1426-1438
58 Walsky RL Obach RS A comparison of 2-phenyl-2-(1-piperidinyl)propane
(ppp) 111-phosphinothioylidynetrisaziridine (thioTEPA) clopidogrel and
ticlopidine as selective inactivators of human cytochrome P450 2B6 Drug
Metab Dispos 200735(11)2053-2059
59 Quaak M van Schooten FJ van Schayck CP Pharmacogenetics of smoking
how far to the clinic Pharmacogenomics 201415(6)723-726
60 Swan GE Lessov-Schlaggar CN Tobacco addiction and pharmacogenetics of
nicotine metabolism J Neurogenet 200923(3)262-271
61 Tomaz PRX Kajita MS Santos JR Scholz J Abe TO Gaya PV Krieger JE
Pereira AC Santos P Cytochrome P450 2A6 and 2B6 polymorphisms and
smoking cessation success in patients treated with varenicline Eur J Clin
Pharmacol201975(11)1541-1545
62 Tomaz PRX Santos JR Scholz J Abe TO Gaya PV Negrao AB Krieger JE
Pereira AC Santos P Cholinergic receptor nicotinic alpha 5 subunit
polymorphisms are associated with smoking cessation success in women BMC
Med Genet201819(1)55
94
63 Scholz J Santos PC Buzo CG Lopes NH Abe TO Gaya PV Pierri H Amorim
C Pereira AC Effects of aging on the effectiveness of smoking cessation
medication Oncotarget 20167(21)30032-30036
64 Issa JS Santos PC Vieira LP Abe TO Kuperszmidt CS Nakasato M Cardoso
E Amorim C Pereira AC Smoking cessation and weight gain in patients with
cardiovascular disease or risk factor Int J Cardiol 2014172(2)485-487
65 King DP Paciga S Pickering E Benowitz NL Bierut LJ Conti DV Kaprio J
Lerman C Park PW Smoking cessation pharmacogenetics analysis of
varenicline and bupropion in placebo-controlled clinical trials
Neuropsychopharmacology 201237(3)641-650
66 Saccone NL Baurley JW Bergen AW David SP Elliott HR Foreman MG
Kaprio J Piasecki TM Relton CL Zawertailo L Bierut LJ Tyndale RF Chen
LS The Value of Biosamples in Smoking Cessation Trials A Review of
Genetic Metabolomic and Epigenetic Findings Nicotine Tob Res
201820(4)403-413
67 Rocha Santos J Tomaz PR Issa JS Abe TO Krieger JE Pereira AC Santos
PC CHRNA4 rs1044396 is associated with smoking cessation in varenicline
therapy Front Genet 2015646
68 Tomaz PR Santos JR Issa JS Abe TO Gaya PV Krieger JE Pereira AC
Santos PC CYP2B6 rs2279343 polymorphism is associated with smoking
cessation success in bupropion therapy Eur J Clin Pharmacol 2015
71(9)1067-73
69 David SP Brown RA Papandonatos GD Kahler CW Lloyd-Richardson EE
Munafo MR Shields PG Lerman C Strong D McCaffery J Niaura R
Pharmacogenetic clinical trial of sustained-release bupropion for smoking
cessation Nicotine Tob Res 20079(8)821-833
70 Lerman C Shields PG Wileyto EP Audrain J Pinto A Hawk L Krishnan S
Niaura R Epstein L Pharmacogenetic investigation of smoking cessation
treatment Pharmacogenetics 200212(8)627-634
71 Han DH Joe KH Na C Lee YS Effect of genetic polymorphisms on smoking
cessation a trial of bupropion in Korean male smokers Psychiatr Genet
200818(1)11-16
72 Zanger UM Klein K Pharmacogenetics of cytochrome P450 2B6 (CYP2B6)
advances on polymorphisms mechanisms and clinical relevance Front Genet
2013424
73 Zhu AZ Cox LS Nollen N Faseru B Okuyemi KS Ahluwalia JS Benowitz
NL Tyndale RF CYP2B6 and bupropions smoking-cessation pharmacology
the role of hydroxybupropion Clin Pharmacol Ther 201292(6)771-777
95
74 Laib AK Brunen S Pfeifer P Vincent P Hiemke C Serum concentrations of
hydroxybupropion for dose optimization of depressed patients treated with
bupropion Ther Drug Monit 201436(4)473-479
75 Hutchison KE Allen DL Filbey FM Jepson C Lerman C Benowitz NL Stitzel
J Bryan A McGeary J Haughey HM CHRNA4 and tobacco dependence from
gene regulation to treatment outcome Arch Gen Psychiatry 200764(9)1078-
1086
76 Smith RC Zhubi A Maloku E Sershen H Lajtha A Davis JM Costa E
Guidotti A Varenicline treatment decreases DNMT1 mRNA expression in
lymphocytes of schizophrenic patients who are cigarette smokers Schizophr
Res 2010119(1-3)269-270
77 Marks MJ ONeill HC Wynalda-Camozzi KM Ortiz NC Simmons EE Short
CA Butt CM McIntosh JM Grady SR Chronic treatment with varenicline
changes expression of four nAChR binding sites in mice Neuropharmacology
201599142-155
78 Middleton FA Pato CN Gentile KL McGann L Brown AM Trauzzi M Diab
H Morley CP Medeiros H Macedo A Azevedo MH Pato MT Gene
expression analysis of peripheral blood leukocytes from discordant sib-pairs
with schizophrenia and bipolar disorder reveals points of convergence between
genetic and functional genomic approaches Am J Med Genet B Neuropsychiatr
Genet 2005136B(1)12-25
79 Takahashi M Hayashi H Watanabe Y Sawamura K Fukui N Watanabe J
Kitajima T Yamanouchi Y Iwata N Mizukami K Hori T Shimoda K Ujike H
Ozaki N Iijima K Takemura K Aoshima H Someya T Diagnostic
classification of schizophrenia by neural network analysis of blood-based gene
expression signatures Schizophr Res 2010119(1-3)210-218
80 Lee J Goh LK Chen G Verma S Tan CH Lee TS Analysis of blood-based
gene expression signature in first-episode psychosis Psychiatry Res
2012200(1)52-54
81 Sullivan PF Fan C Perou CM Evaluating the comparability of gene expression
in blood and brain Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet
2006141B(3)261-268
82 Hennings JM Uhr M Klengel T Weber P Putz B Touma C Czamara D Ising
M Holsboer F Lucae S RNA expression profiling in depressed patients
suggests retinoid-related orphan receptor alpha as a biomarker for antidepressant
response Transl Psychiatry 20155e538
83 Ota VK Noto C Gadelha A Santoro ML Silva PN Melaragno MI Smith Mde
A Cordeiro Q Bressan RA Belangero SI Neurotransmitter receptor and
regulatory gene expression in peripheral blood of Brazilian drug-naive first-
96
episode psychosis patients before and after antipsychotic treatment Psychiatry
Res2013210(3)1290-1292
84 Kordi-Tamandani DM Tajoddini S Salimi F Promoter Methylation and BDNF
and DAT1 Gene Expression Profiles in Patients with Drug Addiction
Pathobiology 201582(2)94-99
85 Wongsriraksa A Parsons ME Whelan CJ Characterisation of nicotine receptors
on human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) Inflamm Res
200958(1)38-44
86 Kawashima K Fujii T Expression of non-neuronal acetylcholine in
lymphocytes and its contribution to the regulation of immune function Front
Biosci 200492063-2085
87 St-Pierre S Jiang W Roy P Champigny C LeBlanc E Morley BJ Hao J
Simard AR Nicotinic Acetylcholine Receptors Modulate Bone Marrow-Derived
Pro-Inflammatory Monocyte Production and Survival PLoS One
201611(2)e0150230
88 Zdanowski R Krzyzowska M Ujazdowska D Lewicka A Lewicki S Role of
alpha7 nicotinic receptor in the immune system and intracellular signaling
pathways Cent Eur J Immunol 201540(3)373-379
89 Baez-Pagan CA Delgado-Velez M Lasalde-Dominicci JA Activation of the
Macrophage alpha7 Nicotinic Acetylcholine Receptor and Control of
Inflammation J Neuroimmune Pharmacol 201510(3)468-476
90 Kalkman HO Feuerbach D Modulatory effects of alpha7 nAChRs on the
immune system and its relevance for CNS disorders Cell Mol Life Sci
201673(13)2511-2530
91 Zakrzewicz A Richter K Agne A Wilker S Siebers K Fink B Krasteva-Christ
G Althaus M Padberg W Hone AJ McIntosh JM Grau V Canonical and
Novel Non-Canonical Cholinergic Agonists Inhibit ATP-Induced Release of
Monocytic Interleukin-1beta via Different Combinations of Nicotinic
Acetylcholine Receptor Subunits alpha7 alpha9 and alpha10 Front Cell
Neurosci201711189
92 Arreola R Alvarez-Herrera S Perez-Sanchez G Becerril-Villanueva E Cruz-
Fuentes C Flores-Gutierrez EO Garces-Alvarez ME de la Cruz-Aguilera DL
Medina-Rivero E Hurtado-Alvarado G Quintero-Fabian S Pavon L
Immunomodulatory Effects Mediated by Dopamine J Immunol
Res20163160486
93 Nakajima M Yamamoto T Nunoya K Yokoi T Nagashima K Inoue K Funae
Y Shimada N Kamataki T Kuroiwa Y Role of human cytochrome P4502A6 in
C-oxidation of nicotine Drug Metab Dispos 199624(11)1212-1217
97
94 Messina ES Tyndale RF Sellers EM A major role for CYP2A6 in nicotine C-
oxidation by human liver microsomes J Pharmacol Exp Ther
1997282(3)1608-1614
95 Chen A Krebs NM Zhu J Muscat JE Nicotine metabolite ratio predicts
smoking topography The Pennsylvania Adult Smoking Study Drug Alcohol
Depend201819089-93
96 Shahab L BL McNeill Tyndale RF Does the nicotine metabolite ratio
moderate smoking cessation treatment outcomes in real-world settings A
prospective study Addiction 2019114(2)304-314 doi 101111add14450
97 Lea RA Dickson S Benowitz NL Within-subject variation of the salivary
3HCCOT ratio in regular daily smokers prospects for estimating CYP2A6
enzyme activity in large-scale surveys of nicotine metabolic rate J Anal Toxicol
200630(6)386-389
98 Mooney ME Li ZZ Murphy SE Pentel PR Le C Hatsukami DK Stability of
the nicotine metabolite ratio in ad libitum and reducing smokers Cancer
Epidemiol Biomarkers Prev 200817(6)1396-1400
99 Piestansky J Marakova K Veizerova L Galba J Mikus P On-line column
coupled isotachophoresis-capillary zone electrophoresis hyphenated with
tandem mass spectrometry in drug analysis varenicline and its metabolite in
human urine Anal Chim Acta 201482684-93
100 Fagerstrom KO Heatherton TF Kozlowski LT Nicotine addiction and its
assessment Ear Nose Throat J 199069(11)763-765
101 Issa JS A new nicotine dependence score and a new scale assessing patient
comfort during smoking cessation treatment J Bras Pneumol 201238(6)761-
765
102 Mexal S Berger R Logel J Ross RG Freedman R Leonard S Differential
regulation of alpha7 nicotinic receptor gene (CHRNA7) expression in
schizophrenic smokers J Mol Neurosci 201040(1-2)185-195
103 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-
time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods
200125(4)402-408
104 Abdallah IA Hammell DC Stinchcomb AL Hassan HE A fully validated LC-
MSMS method for simultaneous determination of nicotine and its metabolite
cotinine in human serum and its application to a pharmacokinetic study after
using nicotine transdermal delivery systems with standard heat application in
adult smokers J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2016102067-
77
98
105 Al-Haj A Alawi M Arafat T Hourani MK Method development validation
and bioequivalence of varenicline in human plasma by liquid chromatography
tandem mass spectrometry J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci
2013931134-139
106 Hegstad S Stray-Pedersen A Olsen L Vege A Rognum TO Morland J
Christophersen AS Determination of cotinine in pericardial fluid and whole
blood by liquid chromatography-tandem mass spectrometry J Anal Toxicol
200933(4)218-222
107 Santos MG Moraes Gde O Nakamura MG dos Santos-Neto AJ Figueiredo
EC Restricted access molecularly imprinted polymers obtained by bovine serum
albumin andor hydrophilic monomers external layers a comparison related to
physical and chemical properties Analyst 2015140(22)7768-7775
108 de Lima MM Vieira AC Martins I Boralli VB Borges KB Figueiredo EC
On-line restricted access molecularly imprinted solid phase extraction of
ivermectin in meat samples followed by HPLC-UV analysis Food Chem
2015197(Pt A)7-13
109 Barbosa AF Barbosa VM Bettini J Luccas PO Figueiredo EC Restricted
access carbon nanotubes for direct extraction of cadmium from human serum
samples followed by atomic absorption spectrometry analysis Talanta
2016131213-220
110 de Faria HD Abrao LC Santos MG Barbosa AF Figueiredo EC New
advances in restricted access materials for sample preparation A review Anal
Chim Acta 201795943-65
111 FRANQUI L S et al Synthesis and characterization of a magnetic molecularly
imprinted polymer for the selective extraction of nicotine and cotinine from
urine samples followed by GC-MS analysis Anal Methods 2015 7(21) 9237ndash
9244 2015
112 Santos MG Tavares IM Barbosa AF Bettini J Figueiredo EC Analysis of
tricyclic antidepressants in human plasma using online-restricted access
molecularly imprinted solid phase extraction followed by direct mass
spectrometry identificationquantification Talanta 20171638-16
113 US Department of Health and Human Services Food and Drug Administration
(FDA) Center for Drug Evaluation and Research (CDER)Center for Veterinary
Medicine (CVM) Guidance for IndustryBioanalytical method validation
Biopharmaceutics 2013
114 GOMES Raphael A B et al Evaluation of the pH influence on protein
exclusion by restricted access carbono nanotubes coated with bovine serum
albumin Journal Of Materials Science 2016 51(16)7407-7414
99
115 de Faria HD Rosa MA Silveira AT Figueiredo EC Direct extraction of
tetracyclines from bovine milk using restricted access carbon nanotubes in a
column switching liquid chromatography system Food Chem 201722598-106
116 de Faria HD Bueno CT Krieger JE Krieger EM Pereira AC Santos P
Figueiredo EC Online extraction of antihypertensive drugs and their metabolites
from untreated human serum samples using restricted access carbon nanotubes
in a column switching liquid chromatography system J Chromatogr A
2017152841-52
117 Petersen GO Leite CE Chatkin JM Thiesen FV Cotinine as a biomarker of
tobacco exposure development of a HPLC method and comparison of matrices
J Sep Sci 201033(4-5)516-521
118 Brunen S Vincent PD Baumann P Hiemke C Havemann-Reinecke U
Therapeutic drug monitoring for drugs used in the treatment of substance-related
disorders literature review using a therapeutic drug monitoring appropriateness
rating scale Ther Drug Monit 201133(5)561-572
119 Ryan RE Loiacono RE Nicotine regulates alpha7 nicotinic receptor subunit
mRNA implications for nicotine dependence Neuroreport 200112(3)569-
572
120 Cameli C Bacchelli E De Paola M Giucastro G Cifiello S Collo G Cainazzo
MM Pini LA Maestrini E Zoli M Genetic variation in CHRNA7 and
CHRFAM7A is associated with nicotine dependence and response to varenicline
treatment Eur J Hum Genet 201826(12)1824-1831
121 Wallace TL Bertrand D Importance of the nicotinic acetylcholine receptor
system in the prefrontal cortex Biochem Pharmacol 201385(12)1713-1720
122 Dempster EL Toulopoulou T McDonald C Bramon E Walshe M Wickham H
Sham PC Murray RM Collier DA Episodic memory performance predicted by
the 2bp deletion in exon 6 of the alpha 7-like nicotinic receptor subunit gene
Am J Psychiatry 2006163(10)1832-1834
123 Enioutina EY Myers EJ Tvrdik P Hoidal JR Rogers SW Gahring LC The
nicotinic receptor Alpha7 impacts the mouse lung response to LPS through
multiple mechanisms PLoS One 201510(3)e0121128
124 Sinkus ML Graw S Freedman R Ross RG Lester HA Leonard S The human
CHRNA7 and CHRFAM7A genes A review of the genetics regulation and
function Neuropharmacology 201596(Pt B)274-288
125 Gault J Robinson M Berger R Drebing C Logel J Hopkins J Moore T Jacobs
S Meriwether J Choi MJ Kim EJ Walton K Buiting K Davis A Breese C
Freedman R Leonard S Genomic organization and partial duplication of the
human alpha7 neuronal nicotinic acetylcholine receptor gene (CHRNA7)
Genomics 199852(2)173-185
100
126 Riley B Williamson M Collier D Wilkie H Makoff A A 3-Mb map of a large
Segmental duplication overlapping the alpha7-nicotinic acetylcholine receptor
gene (CHRNA7) at human 15q13-q14 Genomics 200279(2)197-209
127 Benhammou K Lee M Strook M Sullivan B Logel J Raschen K Gotti C
Leonard S [(3)H]Nicotine binding in peripheral blood cells of smokers is
correlated with the number of cigarettes smoked per day Neuropharmacology
200039(13)2818-2829
128 Kunii Y Zhang W Xu Q Hyde TM McFadden W Shin JH Deep-Soboslay A
Ye T Li C Kleinman JE Wang KH Lipska BK CHRNA7 and CHRFAM7A
mRNAs co-localized and their expression levels altered in the postmortem
dorsolateral prefrontal cortex in major psychiatric disorders Am J Psychiatry
2015172(11)1122-1130
129 Breese CR Lee MJ Adams CE Sullivan B Logel J Gillen KM Marks MJ
Collins AC Leonard S Abnormal regulation of high affinity nicotinic receptors
in subjects with schizophrenia Neuropsychopharmacology 200023(4)351-
364
130 Freedman R Hall M Adler LE Leonard S Evidence in postmortem brain tissue
for decreased numbers of hippocampal nicotinic receptors in schizophrenia Biol
Psychiatry 199538(1)22-33
131 Guan ZZ Zhang X Blennow K Nordberg A Decreased protein level of
nicotinic receptor alpha7 subunit in the frontal cortex from schizophrenic brain
Neuroreport 199910(8)1779-1782
132 Martin-Ruiz CM Haroutunian VH Long P Young AH Davis KL Perry EK
Court JA Dementia rating and nicotinic receptor expression in the prefrontal
cortex in schizophrenia Biol Psychiatry 200354(11)1222-1233
133 Marutle A Zhang X Court J Piggott M Johnson M Perry R Perry E
Nordberg A Laminar distribution of nicotinic receptor subtypes in cortical
regions in schizophrenia J Chem Neuroanat 200122(1-2)115-126
134 Leonard S Breese C Adams C Benhammou K Gault J Stevens K Lee M
Adler L Olincy A Ross R Freedman R Smoking and schizophrenia abnormal
nicotinic receptor expression Eur J Pharmacol 2000393(1-3)237-242
135 Kumari V Postma P Nicotine use in schizophrenia the self medication
hypotheses Neurosci Biobehav Rev 200529(6)1021-1034
136 de Leon J Diaz FJ A meta-analysis of worldwide studies demonstrates an
association between schizophrenia and tobacco smoking behaviors Schizophr
Res 200576(2-3)135-157
101
137 Flomen RH Collier DA Osborne S Munro J Breen G St Clair D Makoff AJ
Association study of CHRFAM7A copy number and 2 bp deletion
polymorphisms with schizophrenia and bipolar affective disorder Am J Med
Genet B Neuropsychiatr Genet 2006141B(6)571-575
138 Gault J Hopkins J Berger R Drebing C Logel J Walton C Short M Vianzon
R Olincy A Ross RG Adler LE Freedman R Leonard S Comparison of
polymorphisms in the alpha7 nicotinic receptor gene and its partial duplication
in schizophrenic and control subjects Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet
2003123B(1)39-49
139 Perl O Strous RD Dranikov A Chen R Fuchs S Low levels of alpha7-
nicotinic acetylcholine receptor mRNA on peripheral blood lymphocytes in
schizophrenia and its association with illness severity Neuropsychobiology
200653(2)88-93
140 Raux G Bonnet-Brilhault F Louchart S Houy E Gantier R Levillain D Allio
G Haouzir S Petit M Martinez M Frebourg T Thibaut F Campion D The -2
bp deletion in exon 6 of the alpha 7-like nicotinic receptor subunit gene is a risk
factor for the P50 sensory gating deficit Mol Psychiatry 20027(9)1006-1011
141 Leonard S Gault J Hopkins J Logel J Vianzon R Short M Drebing C Berger
R Venn D Sirota P Zerbe G Olincy A Ross RG Adler LE Freedman R
Association of promoter variants in the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor
subunit gene with an inhibitory deficit found in schizophrenia Arch Gen
Psychiatry 200259(12)1085-1096
142 Mathew SV Law AJ Lipska BK Davila-Garcia MI Zamora ED Mitkus SN
Vakkalanka R Straub RE Weinberger DR Kleinman JE Hyde TM Alpha7
nicotinic acetylcholine receptor mRNA expression and binding in postmortem
human brain are associated with genetic variation in neuregulin 1 Hum Mol
Genet 200716(23)2921-2932
143 Severance EG Yolken RH Novel alpha7 nicotinic receptor isoforms and
deficient cholinergic transcription in schizophrenia Genes Brain Behav
20087(1)37-45
144 Severance EG Dickerson FB Stallings CR Origoni AE Sullens A Monson
ET Yolken RH Differentiating nicotine- versus schizophrenia-associated
decreases of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor transcript CHRFAM7A
in peripheral blood lymphocytes J Neural Transm (Vienna) 2009116(2)213-
220
145 Olincy A Freedman R Nicotinic mechanisms in the treatment of psychotic
disorders a focus on the alpha7 nicotinic receptor Handb Exp Pharmacol
2012 (213)211-232
146 Kariminejad A Almadani N Khoshaeen A Olsson B Moslemi AR Tajsharghi
H Truncating CHRNG mutations associated with interfamilial variability of the
102
severity of the Escobar variant of multiple pterygium syndrome BMC
Genet201617(1)71
147 Liu Y Wang L Yang YK Liang Y Zhang TJ Liang N Yang LM Li SJ Shan
D Wu QQ Prenatal diagnosis of fetal skeletal dysplasia using targeted next-
generation sequencing an analysis of 30 cases Diagn Pathol 201914(1)76
148 Natera-de Benito D Topf A Vilchez JJ Gonzalez-Quereda L Dominguez-
Carral J Diaz-Manera J Ortez C Bestue M Gallano P Dusl M Abicht A
Muller JS Senderek J Garcia-Ribes A Muelas N Evangelista T Azuma Y
McMacken G Paipa Merchan A Rodriguez Cruz PM Camacho A Jimenez E
Miranda-Herrero MC Santana-Artiles A Garcia-Campos O Dominguez-Rubio
R Olive M Colomer J Beeson D Lochmuller H Nascimento A Molecular
characterization of congenital myasthenic syndromes in Spain Neuromuscul
Disord 201727(12)1087-1098
149 Seo J Choi IH Lee JS Yoo Y Kim NK Choi M Ko JM Shin YB Rare cases
of congenital arthrogryposis multiplex caused by novel recurrent CHRNG
mutations J Hum Genet 201560(4)213-215
150 Keskitalo-Vuokko K Pitkaniemi J Broms U Heliovaara M Aromaa A Perola
M Ripatti S Salminen O Salomaa V Loukola A Kaprio J Associations of
nicotine intake measures with CHRN genes in Finnish smokers Nicotine Tob
Res201113(8)686-690
151 Saccone NL Saccone SF Hinrichs AL Stitzel JA Duan W Pergadia ML
Agrawal A Breslau N Grucza RA Hatsukami D Johnson EO Madden PA
Swan GE Wang JC Goate AM Rice JP Bierut LJ Multiple distinct risk loci
for nicotine dependence identified by dense coverage of the complete family of
nicotinic receptor subunit (CHRN) genes Am J Med Genet B Neuropsychiatr
Genet 2009150B(4)453-466
152 Saccone NL Schwantes-An TH Wang JC Grucza RA Breslau N Hatsukami
D Johnson EO Rice JP Goate AM Bierut LJ Multiple cholinergic nicotinic
receptor genes affect nicotine dependence risk in African and European
Americans Genes Brain Behav 20109(7)741-750
153 Santoro ML Ota VK Stilhano RS Silva PN Santos CM Diana MC Gadelha
A Bressan RA Melaragno MI Han SW Abilio VC Belangero SI Effect of
antipsychotic drugs on gene expression in the prefrontal cortex and nucleus
accumbens in the spontaneously hypertensive rat (SHR) Schizophr Res
2014157(1-3)163-168
154 Kuhn J Vollmer T Martin C Hendig D Knabbe C Fast and sample cleanup-
free measurement of nicotine and cotinine by stable isotope dilution ultra-
performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry J Pharm
Biomed Anal 201267-68137-143
103
155 Scherf-Clavel M Wahl O Menke A Unterecker S Determination of
hydroxybupropion in human serum for routine therapeutic drug monitoring in
psychiatry A tool for dose-individualization in treatment with bupropion
Biomed Chromatogr 201933(10)e4609
156 Dobrinas M Choong E Noetzli M Cornuz J Ansermot N Eap CB
Quantification of nicotine cotinine trans-3-hydroxycotinine and varenicline in
human plasma by a sensitive and specific UPLC-tandem mass-spectrometry
procedure for a clinical study on smoking cessation J Chromatogr B Analyt
Technol Biomed Life Sci 2011879(30)3574-3582
157 Onoue S Yamamoto N Seto Y Yamada S Pharmacokinetic study of nicotine
and its metabolite cotinine to clarify possible association between smoking and
voiding dysfunction in rats using UPLCESI-MS Drug Metab Pharmacokinet
201126(4)416-422
158 Petrides AK Moskowitz J Johnson-Davis KL Jannetto PJ Langman LJ Clarke
W Marzinke MA The development and validation of a turbulent flow-liquid
chromatography-tandem mass spectrometric method for the simultaneous
quantification of citalopram sertraline bupropion and hydroxybupropion in
serum Clin Biochem 201447(15)73-79
Rubrica participante Rubrica pesquisador
APEcircNDICE - TCLE
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
HOSPITAL DAS CLIacuteNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SAtildeO
PAULO-HCFMUSP
Registro das explicaccedilotildees do pesquisador ao paciente ou seu representante legal sobre a pesquisa consignando
Vocecirc estaacute sendo convidado (a) a participar de um projeto de pesquisa Este projeto tem
como objetivos principais para os indiviacuteduos fumantes submetidos aos tratamentos
farmacoloacutegicos antitabagismo associar o efeito das caracteriacutesticas geneacuteticas (DNA ou RNA) e do
metabolismo (concentraccedilatildeo dos produtos de metabolismo dos medicamentos no sangue) com a
eficiecircncia do tratamento antitabagismo O objetivo do estudo eacute saber por que algumas pessoas
respondem bem aos medicamentos antitabagismo enquanto outras pessoas natildeo respondem e
consequentemente natildeo conseguem parar de fumar Para isto precisaremos de amostras de
sangue cuja quantidade eacute comumente solicitada em exames laboratoriais de rotina (2 tubos a
cada visita = 20mL) Precisaremos tambeacutem do seu consentimento para que dados de seu
prontuaacuterio meacutedico sejam consultados Para os pacientes que utilizaratildeo o medicamento
bupropiona precisaremos de amostras de sangue na primeira consulta (visita T-1) e duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento medicamentoso (visita T2) Para os pacientes que utilizaratildeo
o medicamento vareniclina precisaremos de uma amostra de sangue na primeira consulta (visita
T-1) na segunda consulta ndash ainda antes de iniciar o tratamento com medicamento (visita T0) duas
semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento medicamentoso (visita T2) e quatro semanas apoacutes o iniacutecio
do tratamento medicamentoso (visita T4) Os desconfortos mais comuns que podem ocorrer com
sua participaccedilatildeo neste estudo satildeo os mesmos de uma coleta de sangue no braccedilo por exemplo
leve dor no local da punccedilatildeo e eventualmente hematoma local Este sangue seraacute encaminhado
ao Laboratoacuterio de Geneacutetica e Cardiologia Molecular do Instituto do Coraccedilatildeo onde seraacute
armazenado somente para a pesquisa Sua participaccedilatildeo eacute totalmente voluntaacuteria Apoacutes ler
entender e esclarecer suas duacutevidas vocecirc assinaraacute 2 vias de igual teor desse documento (termo de
consentimento Livre e Esclarecido) Ainda vocecirc poderaacute solicitar o seu desligamento deste projeto
a qualquer momento bastando para tal entrar em contato os pesquisadores no tel (11) 2661-5592
ou 2661-5995 Em qualquer etapa do estudo vocecirc teraacute acesso aos profissionais responsaacuteveis
pela pesquisa para esclarecimento de eventuais duacutevidas O pesquisador responsaacutevel eacute a Dra
Jaqueline Scholz que pode ser encontrada no endereccedilo Av Dr Eneacuteas de Carvalho Aguiar 44
Instituto do Coraccedilatildeo Bloco 2 andar 1 Programa Ambulatorial de Tratamento Tabagismo
INCOR-HCFMUSP telefone (11) 2661-5592 Se vocecirc tiver alguma consideraccedilatildeo ou duacutevida sobre
a eacutetica da pesquisa entre em contato com o Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa (CEP) ndash Rua Oviacutedio
Pires de Campos 225 ndash 5ordm andar ndash tel (11) 2661-7585 FAX (011) 2661-7585 ndash e-mail
Rubrica participante Rubrica pesquisador
cappesqadmhcfmuspbr Poderaacute tambeacutem solicitar a destruiccedilatildeo das amostras que estaratildeo
armazenadas no mesmo laboratoacuterio
As informaccedilotildees obtidas seratildeo analisadas em conjunto com outros pacientes natildeo sendo
divulgada a identificaccedilatildeo de nenhum paciente Natildeo haveraacute nenhuma despesa por parte do
participante Tambeacutem natildeo haacute compensaccedilatildeo financeira relacionada agrave sua participaccedilatildeo
Benefiacutecio direto para o participante eacute a possibilidade de parar de fumar e ser bem monitorado
durante todo o processo de 12 semanas
Estas informaccedilotildees poderatildeo auxiliar na elaboraccedilatildeo de programas eficazes para o uso
da informaccedilatildeo das caracteriacutesticas individuais em usuaacuterios de medicamentos antitabagismo
Acredito ter sido suficientemente informado a respeito das informaccedilotildees que li ou que
foram lidas para mim descrevendo o estudo ldquoAnaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de
expressatildeo gecircnica dos genoacutetipos preditores de metabolizaccedilatildeo e das concentraccedilotildees de
metaboacutelitos com a resposta ao tratamento antitabagismordquo Eu discuti com o Dra Jaqueline
Scholz com a Juliana da Rocha dos Santos eou Paulo Roberto Xavier Tomaz sobre a minha
decisatildeo em participar nesse estudo Ficaram claros para mim quais satildeo os propoacutesitos do
estudo os procedimentos a serem realizados seus desconfortos e riscos as garantias de
confidencialidade e de esclarecimentos permanentes Concordo voluntariamente em participar
deste estudo e poderei retirar o meu consentimento a qualquer momento antes ou durante o
mesmo sem penalidades ou prejuiacutezo ou perda de qualquer benefiacutecio que eu possa ter
adquirido ou no meu atendimento neste Serviccedilo
_____________________________________________________________________________________
Assinatura do pacienterepresentante legal Data
____________________________________________________________________________
Assinatura da testemunha Data
para casos de pacientes menores de 18 anos analfabetos semi-analfabetos ou portadores de deficiecircncia auditiva ou visual
(Somente para o responsaacutevel do projeto)
Declaro que obtive de forma apropriada e voluntaacuteria o Consentimento Livre e Esclarecido deste
paciente ou representante legal para a participaccedilatildeo neste estudo
____________________________________________________________________________
Assinatura do pesquisador Data
Rubrica participante Rubrica pesquisador
DADOS DE IDENTIFICACcedilAtildeO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSAacuteVEL LEGAL
1NOME
DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nordm SEXO M F
DATA NASCIMENTO
ENDERECcedilO NordmAPTO
BAIRROCIDADE
ESTADOCEPTELEFONE()
2RESPONSAacuteVEL LEGAL
NATUREZA (grau de parentesco tutor curador etc)
DOCUMENTO DE IDENTIDADE SEXO M F
DATA DE NASCIMENTOENDERECcedilO
Nordm APTO
BAIRROCIDADE ESTADOCEPTELEFONE() ___________________________________________________________________________________________________________________________
DADOS SOBRE A PESQUISA
1 TIacuteTULO DO SUBPROJETO DE PESQUISA ldquoAnaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de expressatildeo gecircnica dos genoacutetipos
preditores de metabolizaccedilatildeo e das concentraccedilotildees de metaboacutelitos com a resposta ao tratamento antitabagismordquo
PESQUISADOR RESPONSAacuteVEL Dr Jaqueline Scholz
CARGOFUNCcedilAtildeO Meacutedico Assistente Meacutedico Pesquisador ndash InCor ndash HCFMUSP CRM SP nordm 60179
UNIDADE DO HCFMUSP Programa Ambulatorial de Tratamento Tabagismo InCor-HCFMUSP
PESQUISADOR EXECUTANTE Juliana da Rocha dos Santos CRF SP nordm 62776
CARGOFUNCcedilAtildeO POacuteS-GRADUANDAndash InCor ndash HCFMUSP
UNIDADE DO HC-FMUSP Laboratoacuterio de Geneacutetica e Cardiologia Molecular InCor-HCFMUSP
3 AVALIACcedilAtildeO DO RISCO DA PESQUISA
RISCO MIacuteNIMO RISCO MEacuteDIO
RISCO BAIXO x RISCO MAIOR
4 DURACcedilAtildeO DA PESQUISA 4 anos
ANEXO 1 ndash Aprovaccedilatildeo no Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa
ANEXO 2 - Teste de Fagerstroumlm para a dependecircncia agrave nicotina (versatildeo em Portuguecircs)
Fonte Pietrobon RC Barbisan JN Manfroi WC Utilizaccedilatildeo do teste de dependecircncia agrave nicotina de
Fagerstroumlm como um instrumento de medida do grau de dependecircncia Versatildeo em Portuguecircs Rev HCPA
200727(3)31-6
ANEXO 3 - Escore de consumo situacional Issa
Fonte Issa J S Um novo escore para dependecircncia a nicotina e uma nova escala de conforto do paciente durante
o tratamento do tabagismo J Bras Pneumol 38(6) 761-5
ANEXO 4 ndash Desenho de estudo do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticos na escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismordquo
Desenho do estudo Seraacute randomizado em dois braccedilos um nuacutemero amostral total de 300 pacientes No braccedilo da esquerda 150 pacientes seratildeo tratados com base em teste geneacutetico para os
polimorfismos CYP2B6 (rs2279343) e CHRNA4 (rs1044396) No braccedilo da direita 150 pacientes faratildeo o tratamento tradicional com vareniclina (o faacutermaco de maior efetividade no tratamento
antitabagismo) Em um estudo anterior nosso grupo de pesquisadores 5152 mostrou maior sucesso terapecircutico nos pacientes portadores dos genoacutetipos AA para o gene CYP2B6 nos pacientes
tratados com bupropiona e nos portadores dos genoacutetipos CT e TT para o gene CHRNA4 nos pacientes tratados com vareniclina A escolha do tratamento no braccedilo farmacogeneacutetico prioriza o
tratamento mais barato (bupropiona) dessa forma primeiramente eacute analisado o genoacutetipo para o rs2279343 se o paciente apresentar o genoacutetipo AA o mesmo eacute tratado com bupropiona se ele tiver
o genoacutetipo AG ou GG eacute analisado o genoacutetipo para o polimorfismo rs1044396 Se o paciente apresentar o genoacutetipo CT ou TT para o rs1044396 ele eacute tratado com vareniclina se ele apresentar o
genoacutetipo CC (natildeo favoraacutevel a nenhum dos faacutermacos) ele eacute tratado com vareniclina e bupropiona em uso concomitante Seraacute comparado o custo-efetividade do tratamento baseado em
farmacogeneacutetica em relaccedilatildeo ao tratamento com vareniclina Os pacientes satildeo acompanhados por 12 semanas durante o tratamento farmacoloacutegico visita inicial (T-1) antes do iniacutecio da terapecircutica
(T0) 2 4 6 8 e 12 semanas apoacutes o tratamento (T2 T4 T6 T8 T12) Obs Os pacientes que natildeo conseguirem parar de fumar ateacute a 4 ordf semana de tratamento em monoterapia eacute adicionada a
segunda medicaccedilatildeo Fonte Eficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticos na escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismo InCor-HCFMUSP Projeto de doutorado da Dra Patriacutecia Viviane Gaya
sob a orientaccedilatildeo da Dr Jaqueline R Scholz desenvolvido a partir dos resultados dos estudos da nossa equipe de pesquisadores Rocha Santos et al 2015 67 e Tomaz et al 2015 68
ANEXO 5 ndash Pedido de depoacutesito de patente na Agecircncia de Inovaccedilatildeo e Empreendedorismo da
Universidade Federal de Alfenas-MG