J.E.N. 569Sp ISSN 0081-3397

SÍNTESIS DE N - A C E T 1 L - 3 H - O ¿ - A S P A R T I L - G L U T A M I C O

A ESCALA DE MICROMOLES

por

C. Suárez

JUNTA DE ENERGÍA NUCLEAR

MADRID, 1984

CLASIFICACIÓN INIS Y DESCRIPTORES

B14CHEMICAL PREPARATIONGLÜTAMIC ACIDACETYLATIONACETYL RADICALSASPARTIC ACIDORGANIC COMPOUNDSTRITIUM COMPOUNDS

Toda correspondencia en relación con este traba-jo debe dirigirse al Servicio de Documentación Bibliotecay Publicaciones, Junta de Energía Nuclear, Ciudad Uni-versitaria, Madrid-3, ESPAÑA,

Las solicitudes de ejemplares deben dirigirse aeste mismo Servicio.

Los descriptores se aan seleccionado del Thesaurodel INIS para-describir las materias que contiene este in-forme con vistas^ a 3u recuperación. Para más detalles con_sultese el informe IXSA-lÑlS-12 (INIS: Manual de Indiza-cion) y IAEA-INIS-13 (INIS: Tlaesauro) publicado por el Or-ganismo Internacional de Energía Atómica.

Se autoriza la reproducción de los resúmenes ana-líticos que aparecen en esta -publicación.

Este trabajo se ha recibido para su impresión enNoviembre - d.e 1.984.

Depósito legal ns M-12133-1985 I.S.B.W. 84-505-1 331.-6

SÍNTESIS DE N-ACETIL- H-a-ASPARTIL-GLUTAMICO

A ESCALA DE MICROMOLES

C. Suárez

El ácido N-Acetil- H-a-Aspartil-Glutámico se ha pre_

parado de acuerdo con el método de Le Quesne y Young [l] , t e -

niendo en cuenta las indicaciones de J.K. Whitehead [2] y de

Miyamoto y otros \_3~] . El método de s ín tes is se ha adaptado a

una escala de 22 micromoles.

1 - - MATERIALES Y PRODUCTOS QUÍMICOS

Materiales

. Placas de celulosa y de gel de s í l i ce Merck.

. Radiocromatógrafo Berthold.

Productos Químicos

. Acido L-a-Aspartil-L-Glutámico de la Senn Chemi-

cal{ ' .

. Anhídrido acét ico- H, procedente del Radiochemi-

cal Centre (Amersham) l .

Abreviaturas utilizadas:

(*) Acido L-a-Aspartil-L-Glutámico: NA-AsP-Glu; N-Acetil- H-a-Aspartil-Glutámico: NA-3H-Asp-Glu.

(**) El anhídrido acético- H empleado en la acetilación respondía a lassiguientes especificaciones:

As: 8,74 C/ymol.Líquido, bajo vacío, almacenado a -20°C.

En estas condiciones el producto se autoradioliza a un ritmo del 1%durante las seis primeras semanas, pero a partir de ahí el procesopuede acelerarse. Ademas en ausencia de disolvente suele observarseformación de ácido acético, ya que 1 mg de anhídrido se hidrolizacompletamente con 0,18 mg de agua.

L MÉTODO

2.1.- Procedimiento de o_btención de N- H- -Aspartil-Glutámico

Se disuelven .22,7 pinoles -5,95 mg- del dipéptido

L-ct-Aspartil-L-Glutámico en 2 mi de agua, y se agrega hidróxi_

do potásico 0,1 N hasta alcanzar un pH comprendido entre 8,5-9.

Se enfría la solución con hielo y se incorporan bajo enérgica

agitación 22,7 ymoles de anhídrido acético- H disueltos en 1 mi

de tolueno redestilado. (En la agitación se ha de conseguir la

formación de pequeñas gotitas de tolueno con objeto de que el

paso del anhídrido acético- H a la solución acuosa sea inmedia_

to) . Baja "el pH del medio; por lo que es necesario agregar gota

a gota más hidróxido potásico hasta lograr que se mantenga en-

tre 8,5-9. La agitación y el enfriamiento se continúan durante

una hora, transcurrida la cual, se enfría a -20°C, a fin de que

se congele la solución acuosa, y se pueda separar por decanta-

ción el tolueno sobrenadante.

Para eliminar el ion K y el dipéptido no acetila-

do se pasa la solución por una columna de 1x5 cm de Dowex 50*8,

200-400 mallas (forma H ) en donde quedan fijados. La columna

se lava a continuación con S mi de agua.

El eluido junto con las aguas de lavado se evaporan

a sequedad a vacío a 35°C. Es necesario añadir dos veces un po_

co de agua y evaporar a sequedad seguidamente con el fin de eli_

minar las trazas del ácido acético radiactivo que puedan aún

permanecer en el residuo. Se obtiene un aceite que pesa 5,8 mg.

El NA- H-Asp-Glu obtenido se identifica por compara

ción con un patrón de NA-Asp-Glu por cromatografía en lámina

delgada, de celulosa, o gel de sílice, utilizando como eluyen-

tes n-Butanol/AcH/EUO, 12:3:5 y n-Butanol/Piridina/H20 1:1:1.

Como revelador se ha empleado verde de bromocresol; el compues

to aparece como mancha amarilla sobre un fondo verde azulado.

La pureza radioquímica se verificó mediante an torra,

diografía y radiocromatografía.

2.2.- Purificación del NA-3H-Asp-Glu

Si bien no se detectó en la cromatografía del pro-

ducto bruto ningún otro ácido tal como el dipéptido Asp-Glu, o

los aminoácidos aspártico o glutámico, apareciendo únicamente

la mancha amarilla con Rf correspondiente al NA-Asp-Glu, la ra

diocromatografía muestra la presencia de un alto contenido de

impurezas radiactivas que rebajan la pureza radioquímica del

producto a-un 60% (Fig. 1 y Fig. 2a) . La purificación se reali_

za recristalizando el producto de etanol-acetona-éter de petró_

leo. En las figuras 2a, 2b y 2c se aprecia el progreso de la pu_

rificación por recristalización. Una segunda recristalización

condujo a un producto cuya pureza radioquímica era superior al

95% (Figs. 3 y 4).

Como la escala de trabajo no permitía ulteriores re_

recristalizaciones, la purificación final hasta el 99% se rea-

lizó mediante cromatografía de intercambio iónico. Para ello se

fijó la solución acuosa del producto recristalizado en una co-

lumna 1x5 era, con resina aniónica Dowex 1x8, 200-400 mallas, que

se encontraba como formiato. Se pasaron a su través 20 mi de

agua, y seguidamente 20 mi de ácido fórmico 0,1 M con el fin

de eliminar posibles aminoácidos ácidos. A continuación se des_

cargó el NA- H-Asp-Glu con fórmico 1M £A] i recogiéndose frac-

ciones de 1 mi cuya radiactividad se midió. En la Fig. 5 se

muestra el transcurso de la elución del NA-H-Asp-Glu. Se jun-

taron las fracciones correspondientes a los tubos 25 a 40 y se

concentraron a sequedad bajo vacío. La radiactividad del pico

de elución representa el 95,5% de la radiactividad total -dato

que confirma la pureza radioquímica determinada previamente por

radiocromatografía- y su pureza radioquímica, superior al 99%

(Fig. 6).

2.3.- Recuperación de NA- H- -Asp-Glu procedente de las aguas

madres de la recristalizacion

Se realiza también separándolo de las impurezas me-

diante cromatografía de intercambio iónico. El producto de pa£

tida es el representado en la figura 2c. Las condiciones para

la elución ya se señalaron más arriba. Solamente se recogieron

como fracciones de 1 mi las correspondientes a la elución con

ácido fórmico 1 M (Fig. 7) . El paso previo de agua y ácido fór_

mico 0,1 M se realizó recogiendo el eluido en matraces afora-

dos de 25 mi. Las actividades de los matraces representaban el

18% y el 27% respectivamente del total. El pico de NA- H-Asp-

Glu eluido con ácido fórmico 1 M representa el 50% de la acti-

vidad y contiene un 5% de impurezas (Fig. 8 ) . El resto de lara

diactividad se eluyó con ácido fórmico 5 M. No se identifica-

ron las impurezas salvo las que descargan junto con el NA- H-

Asp-Glu, y que fundamentalmente consisten en Acetilaspártico-

H, el cual se elimina volviéndolo a pasar nuevamente por la co(*) ~

lumna aniónica (Fig. 8 ) .

3.- ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD

Hemos seguido las recomendaciones de E.A. Evans [5],

según las cuales los aminoácidos de alta actividad específica

(por encima de los 500 mCi/mmol) deben almacenarse en solucio-

nes acuosas a una concentración radiactiva máxima de 1 mCi/ml,

utilizando como "scavenger", etanol en una proporción del 2%.

En estas condiciones y bajo una temperatura de +2°C, los amino_

ácidos presentan en general una descomposición inferior al 1%

mensual.

(*) Dada la eficacia y sencillez de purificación del NA- H-Asp-Glu con columna de intercambio aniónico, consideramos innecesaria la etapa pre-via de purificación por recristalización, máxime cuando se opera auna escala tan pequeña (0,02 mmoles).

No hemos constatado si en estas condiciones de al-

macenamiento en solución se produce racemizacion, lo que a ve

ees ocurre en algunos aminoácidos tritiados ópticamente acti-

vos, a diferencia de los correspondientes compuestos marcados

con C-14.

4.- RESUMEN

Se ha sintetizado N-Acetil- H-L-a-Aspartil-L-Glutá_

mico de alta actividad específica a escala de micrornoles ace-

tilando con anhídrido acético- H disuelto en tolueno redesti-

lado el dipéptido L-ct-Aspartil-L-Glutámico. La purificación se

realiza mediante columnas de intercambio catiónico y aniónico.

La pureza radioquímica en el momento de la preparación es supe_

rior al 99%.

-6-

BIBLI0GRAF1A

[1] W.J. Le Quesne y G.T. Young.- J.Chem.Soc. 1_, 24 (1952).

[2j J.K. Whitehead.- Biochem.J. 6_8_, 662 (1958) .

[3] E. Miyamoto, Y. Kakimoto e I. Sano.- J.Neurochem. 1_3,

999-1003 (1966).

[4J M. Miyake, Y. Kakimoto y M. Sorimachi.- J.Neurochem. 3 6_,

(3) 804-810 (1981) .

[5] E.A. Evans.- "Self-Descomposition of Radiochemicas".- Re_

view 16.- The Radiochemical Centre. Amersham, England.

P . I N I C I A L

Fig. 1.- Radiocroraatograina del producto de acetilación del

Asp-Glu con anhidrido acético- H (placa de celulosa

lierck, Butanol/AcH/II20, 12.-3:5)

LIQUIDO 2 - c SOLIDO 2 - b P. IN ICIAL 2 - a

3

b'IG. 2.~ Rad iocromatócjraraas de l producto de a c e t i l a c i ó n del Asp-Glu con anh ídr ido a c é t i c o - II,

(Placas-de gel de s í l i c e Ilerck; Dutanol/Acll/II20, 12:3:5)

2-a Producto i n i c i a l2-b Producto r e c r i t a l i z a d o2-c Aguas de r e c r i s t a l i z a c i o n

jií^íhf í.'«:íf . '+*•"• ••«**'•'

wr o -v

L IQUIDO 3 - b SOLIDO 3 - a

FIG.3.- Radicromatógrama de Ac- H-Asp-Glu recristalizado 2 veces, (gel de sílice)3-a. Producto recristalizado

: 3-b. Aguas de recristalización

FIG. 4.- Radiocromatograma 3-a, con arapliación de impurezas.

(El pico rallado corresponde a una actividad 100 veces menor,

1 7 -

1 6 -

<§

s

8 -

7 -

2 6~*

5 -

4 -

3 -

2 -

1 -

0 20 40Y- AGUA4FORMICO1 0,1 M

1 I60 80- FÓRMICO 1M

100V(ml)

FIG. 5.- Elución de Ac- H-Asp-Glu procedente de las aguas de

recristalización.

H

<

FIG. 6.- Radiocroraatograma del Ac- H-Asp-Glu, recristalizado

y purificado en colunna Dowex 1x8.

1 -

SiO

x0 , 5 -

a.

O 20 40

FÓRMICO 1M

60V(ml)

FIG. 7.- Elución de Ac- H-AspGlu procedente de las aguas de

recristalización.

J. f.

8-b 8- a

FIG. G. 3.Radiocromatogramas del Ac- II-Asp-Glu contenido en las aguas de recristalización, trasla elución con fórmico 1 M, en columna Dowex 1x8.8a.- I a Elución (Gel de sílice)9b.- 2 a Elución (celulosa)

J.E.N. 569

Junta do Energía Nuclear. Tecnología, Nuclear. Madrid.

"High specific activity N-Acetyl-3n-tyl-L-Glutámic at micromole seale".

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INI6 CLASSIFICATION AND DESCRIPTORSi D14. Chemical Preparatlon. ClutamicAcid. Acetylation. Acetyl Radicáis. Aapartic Acid. Organic Compounds.Trltlum Compounds.

J.E.N. 569

Junta de Energía Nuclear. Tecnología, Nuclear. Madrid.

"High specific activity N-Acetyl-3H- ©< -Aspartyl-L-Glutamic at micromole scale"..

SUAREZ, C. (1904) 14 pp. 0 flga. 5 refo.Illgh opeclfla activity N-AcQtyl-3|l- °< -Aspartyl-Ij-Glutamlc aclc at

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J.E.N. 569Junta da Energía Nuclear. Tecnología Nuclear. Madrid

"High specific activity N-Acetyl-3n- o< -Aspar;tyl-L-Glutamic at micromole scale".

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J.E.N. 569Junta de Energía Nuclear. Tecnología Nuclear. Madrid.

"High specific activity N-Acetyl-3H-tyl-L-Glutamic at micromole scale".

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SUAREZ, C. (1904) 14 pp. 8 fig.n. 5 refs.High speclfio nofcivlty N-Acot.yl-3u- o< -Aspartyl-I(-Gl\itamia noid at

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