Jurnal Ion Exchange Chromatografi

7/24/2019 Jurnal Ion Exchange Chromatografi

1/6

Disampaikan pada Kongres Ilmiah ISFI XVII di Jakarta, 7-8 Desember 2009

UJI AKTIVITAS BIOLOGI SECARA BSLT DAN UJI SITOTOKSIK DENGAN

METODE MTT DARI EKSTRAK n-HEKSANA DAN EKSTRAK METANOL DAUN

KELADI TIKUS (Typhonium divaricatum(L) Decne)

Yunahara Farida1, Titiek Martati

1, Bernard Edward

1

1Fakultas Farmasi Universitas Pancasila, Jagakarsa Jakarta 12640

Email : [email protected]

ABSTRAK

Tanaman keladi tikus (Typhonium divaricatum(L) Decne), familia Araceae. merupakan jenis tanaman

liar yang belum banyak dikenal oleh masyarakat. Beberapa hasil penelitian menyebutkan bahwa

ekstraknya telah dibuktikan dapat menyembuhkan beberapa kasus penyakit antara lain kanker.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah ekstrak n-heksana dan metanol dari daun keladitikus mempunyai aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker payudara T-47D. Penelitian yang dilakukan

meliputi penapisan fitokimia, uji aktivitas biologi secara Brine Shrimp Lethality Test(BSLT) dan uji

aktivitas sitotoksik dengan metode MTT. Hasil penapisan fitokimia terhadap serbuk dan ekstrak daun

menunjukkan adanya flavonoid dan steroid/triterpenoid. Hasil penelitian uji aktivitas biologi secara

BSLT menunjukkan bahwa ekstrak metanol yang paling aktif dengan nilai IC 50 = 32,91 g/mL

sedangkan n-heksana =126,21 g/mL. Hasil uji aktivitas sitotoksik secara MTT, ekstrak n-heksana

memiliki aktivitas terhadap sel kanker payudara T-47D yang lebih tinggi dibandingkan ekstrak

metanol.dengan nilai IC50 = 32,50 g/mL dan ekstrak metanol = 345,40 g/mL. Apabila

dibandingkan dengan cisplatin (IC50 3,07 g/mL) maka aktivitas sitotoksik cisplatin terhadap sel

kanker payudara T-47 D masih jauh lebih tinggi.

Kata kunci: Keladi tikus, Typhonium divaricatum (L) Decne), BSLT, sel kanker payudara T-47 D,MTT

.

PENDAHULUAN

Saat ini pemanfaatan tumbuhan obat untuk

mengobati berbagai jenis penyakit

semakin disukai masyarakat karena jarang

menimbulkan efek samping yang tidak

diinginkan, salah satunya adalah untuk

terapi kanker. Penyakit kanker dikenal

sebagai penyakit yang sukar disembuhkan

dan dapat menyebabkan kematian,

sehingga hal mi merupakan masalah yang

sulit dalam bidang pengobatan. Walaupun

telah cukup banyak ditemukan obat

kemoterapi untuk terapi kanker. namun

hasilnya belum memuaskan, disamping

kurang selektif dalam penggunaan obat

yang ada, juga ditemukan efek samping

yang cukup besar dan obat tersebut.

Akibatnya mendorong masyarakat banyak

melakukan pengobatan denganmenggunakan bahan alam atau obat

tradisional. salah satunya adalah tanaman

keladi tikus (Typhonium divaricatum (L)

Decne).

Tanaman keladi tikus (Typhonium

divaricatum (L) Decne), familia Araceae.

merupakan salah satu jenis tanaman liar


2/6


yang belum banyak dikenal oleh

masyarakat. Secara empiris, masyarakat

Indonesia menggunakannya untuk

mengobati penyakit kanker/tumor.

Beberapa hasil penelitian menyebutkanbahwa ekstraknya telah dibuktikan dapat

menyembuhkan beberapa kasus penyakit

antara lain kanker. Selain itu ekstrak etanol

dan kloroform dan daun dan umbi keladi

tikus ternyata mempunvai aktivitas

penghambatan pertumbuhan sel lestari

tumor. Mengingat potensi tanaman obat

asli Indonesia yang cukup besar maka

penelitian terhddap tanaman keladi tikus

(Typhonium divaricatum(L) Decne) perlu

dikembangkan dengan cara melakukan

ekstraksi dan diuji toksisitas, dan aktivitas

sitotoksik terhadap sel kanker payudara.

BAHAN DAN METODE

BAHAN. Bahan yang digunakan dalam

penelitian ini adalah daun keladi tikus

yang diperoleh dari Balittro, Bogor dan

dideterminasi di Herbarium Bogoriense,

Pusat Penelitian Biologi, LIPI, Bogor.

Bahan kimia: n-heksana, metanol, HCl,amil alkohol, eter, asam asetat anhidrat,

H2SO4, telur Artemia salina Leach, garam

tanpa iodium, DMSO, Sel kanker payudara

T-47D, cisplatin, RPMI (Roswell Park

Memorial Institute) 1640, FBS (Fetal

Bovine Serum), penisilin-streptomisin,

MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-

2,5diphenyl-tetrazolium bromide), PBS

(Phosphat Bufferd Salina), SDS (Sodium

Dodesil Sulfat), biru tripan, tripsin, air

suling steril, etanol.

Rotary evaporator, Orbital shaker, tempatpenetasan telur artemia, Lampu TL, Labu

kultur jaringan 25 mL, pelat kultur

jaringan 96 sumuran, LAF cabinet

(Laminar Air Flow Biological Safety

Cabinet), inkubator sel dengan aliran CO2

5%, tangki nitrogen cair, alat sentrifuge,

mikropipet (Eppendorf), timbangan

analitik, mikroskop, hemositometer,

ELISAplate reader, alat-alat gelas.

METODE. Daun keladi tikus dibuat

serbuk, kemudian di maserasimenggunakan metanol dan di partisi

menggunakan n-heksana sehingga di dapat

ekstrak n-heksana. Sisa hasil partisi

diuapkan dan didapatkan ekstrak metanol.

Penapisan fitokimia dilakukan dengan cara

mengidentifikasi senyawa kimia yang

terdapat dalam serbuk dan ekstrak.

Pengujian aktivitas biologi secara BSLT

(Brine Shrimp Lethality Test). Terhadap

ekstrak n-heksana dan metanol dilakukan

uji toksisitas berdasarkan metode Meyer

et.al. (1982) menggunakan telur Artemia

salina Leach. Mula-mula telur Artemia

salina ditetaskan didalam air laut buatan

(38 g garam tanpa iodium dalam 1000

mL air biasa) di bawah lampu TL 18 watt.

Media penetasan telur diberi aerasi udara.

Setelah 48 jam larva menetas menjadi

naupliidan siap untuk digunakan. Nauplii

dimasukkan ke dalam vial yang berisi

larutan ekstrak sampel dengan konsentrasi

10,100 dan 1000 bpj dengan 3 kaliulangan. Semua vial di inkubasi pada suhu

kamar selama 24 jam di bawah penerangan

lampu TL 18 watt. Pengamatan dilakukan

setelah 24 jam dengan melihat jumlah

Artemia salina yang mati pada setiap

konsentrasi. Penentuan harga LC50 dalam

g/mL dilakukan menggunakan analisis

probit. Hasil uji lethalitas LC50selanjutnya digunakan sebagai dasar

penentuan konsentrasi untuk pengujian

terhadap sel kanker payudara T-47D.

Pengujian aktivitas sitotoksik.Pembuatan larutan uji.Ekstrak bahan uji

ditimbang sebanyak 10 mg, kemudian

dilarutkan dalam 20 L DMSO dan 80 L

medium RPMI 1640 sehingga diperoleh

konsentrasi larutan induk 100000 bpj. Dari

larutan induk diencerkan hingga diperoleh


3/6


satu seri konsentrasi 10, 25, 50, 100, 250

dan 500 bpj.

Pembuatan larutan kontrol positif.

Larutan induk cisplatin ditimbangsebanyak 10 mg, kemudian dilarutkan

dalam 20mL medium RPMI 1640

sehingga diperoleh konsentrasi larutan

induk 500 bpj. Dari larutan tersebut

diencerkan hingga diperoleh satu seri

konsentrasi 3, 6, 9, 12, 15 dan 18 bpj,

sedangkan kontrol negatif adalah medium

RPMI 1640.

Pembuatan media kultur. media kultur

yang digunakan adalah medium RPMI cair

untuk sel T-47D yang ditambahkan 10%FBS dan antibiotik penisilin-streptomisin

0,1%. Medium disterilkan secara filtrasi

dan disimpan pada suhu 2-80C.

Pencairan sel kanker (cell thawing).Tabung berisi sel dikeluarkan dari tangki

nitrogen cair dan dibenamkan dalam

pemanas air bersuhu 370C selama 3 menit.

Seluruh cairan sel dipipet dan dimasukkan

ke dalam tabung sentrifugasi dan

ditambahkan 5 mL medium RPMI 1640

lalu disentrifugasi dengan kecepatan 1000rpm selama 3-5 menit. setelah itu

supernatant dibuang dan pelet yang

diperoleh disuspensikan dalam 6 mL yang

mengandung 20% FBS. suspensi sel

dipipet dan dimasukkan kedalam labu

kultur lalu diinkubasi pada suhu 370 C

dalam inkubator sel 5% CO2 sampai 80%

di inkubasi selama 3 hari yaitu sampai sel

tumbuh di hampir seluruh permukaan labu

kultur.

Sub kultur. Labu kultur berisi sel yangtelah diinkubasi selama 3 hari dikeluarkan

dari inkubator sel. Seluruh medium dalam

labu kultur dipipet dan dibuang, kultur sel

dicuci sebanyak 2 kali, dengan 5 mL PBS.

Ke dalam labu kultur ditambahkan 2 mL

tripsin, kemudian sel didiamkan selama 5

menit dalam inkubator, Ditambahkan 3

mL RPMI 1640 yang mengandung 10%

FBS, cairan sel dipipet dan dipindahkan ke

dalam tabung sentrifugasi lalu

disentrifugasi pada kecepatan 1000 rpm

selama 5 menit. Supernatan dibuang dan

pelet yang diperoleh disuspensikan dalam12 mL RPMI 1640 yang mengandung 10%

FBS. Suspensi sel dibagi menjadi dua

bagian, masing-masing dipipet sebanyak 6

mL dan dimasukkan ke dalam 2 buah labu

kultur baru kemudian diinkubasi pada 370

C dalam inkubator sel. Sel diperiksa setiap

hari dibawah mikroskop untuk memeriksa

kemungkinan pencemaran oleh jamur atau

bakteri. Apabila medium kultur telah

berubah warna maka diganti dengan

medium RPMI yang mengandung serum

baru.

Perhitungan kepadatan sel T-47D.

Kultur yang telah diinkubasi selama 3 hari

diamati dengan mikroskop untuk

mengetahui tingkat kepadatannya. Jika

tumbuh baik maka sel dapat digunakan

dan jika tidak maka sel harus diinkubasi

kembali hingga kepadatannya optimal.

Medium dalam labu kultur dipipet dan

dibuang, kultur sel dicuci sebanyak 2

kali, masing-masing dengan 5 mL PBS.

Ke dalam labu kultur ditambahkan 2 mL

tripsin dan sel didiamkan selama 5 menit

dalam inkubator, kemudian dikeluarkan

dari inkubator dan dilihat dibawah

mikroskop untuk memastikan sel sudah

tidak melekat pada dasar labu.

Ditambahkan 1 mL RPMI, dipipet cairan

sel dan dipindahkan ke dalam tabung

sentrifugasi kemudian disentrifugasi

dengan kecepatan 1000 rpm selama 5

menit. Supernatan dibuang dan pelet yang

diperoleh disuspensikan dalam 1 mLRPMI. Suspensi dipipet sebanyak 10 L

dan ditambahkan 90 L biru tripan 0,4%.

Kepadatan sel dihitung menggunakan

hemositometer yaitu lebih kurang 20 L

dari suspensi sel dalam larutan biru tripan

dipipet lalu ujung pipet disentuhkan

dengan sudut 300 pada permukaan

hemositometer dibiarkan terisi perlahan


4/6


dengan daya kapilaritas. Kepadatan sel

dihitung dari jumlah sel rata-rata dalam

keempat bidang besar dikalikan faktor

pengenceran dan dibagi dengan volume

satu bidang besar

Kepadatan sel atau jumlah sel per ml

= n/4 x 2 x 104

n = jumlah rata-rata sel dalam keempat

bidang besar

Penyiapan kultur kanker (T-47D).Setelah kepadatan sel diketahui, sisa

suspensi sel yang tidak digunakan dalam

perhitungan kepadatan sel, yaitu sebanyak

990 l digunakan untuk pengujiansitotoksisitas dan diencerkan dengan

medium RPMI 1640 yang mengandung

10% FBS dengan perhitungan sebagai

berikut :

P1V1= P2V2

P1adalah kepadatan hasil penghitungan,

V1 adalah volume suspensi sel yang

dibutuhkan untuk pengenceran, P2

adalah kepadatan sel yang dikehendaki

dalam sumur uji dan V2

adalah totalsuspensi sel yang akan diisikan kedalam

sumur uji.

Pengujian sitotoksisitas ekstrakterhadap sel T-47D. Kedalam pelat

kultur jaringan 96 sumuran dimasukkan

suspensi sel sebanyak 100 l kemudian

diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator

sel pada suhu 370C. Setelah 24 jam, ke

dalam masing-masing sumur ditambahkan

100 l masing-masing ekstrak dengan

berbagai konsentrasi untuk kontrol negatifditambah 100 l medium kultur sel RPMI

1640. Kemudian pelat kultur jaringan

diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C

dalam inkubator sel. Pada akhir periode

inkubasi, ke dalam setiap sumur

ditambahkan 100 l MTT (50mg MTT

dalam 10ml PBS steril), kemudian

diinkubasi kembali dalam inkubator CO2

selama 4 jam pada 370C. Kemudian

ditambahkan 100 l SDS dicampur secara

merata, kemudian isi tiap-tiap sumur dan

ukur serapannya menggunakan ELISA

plate readerpada 570 nm.

Perhitungan persentase kematian sel.

Untuk mengetahui berapa besar persentase

penghambatan proliferasi sel T-47D,

dihitung menggunakan rumus berikut :

Serapan perlakuan

Persen Proliferasi Sel = x 100%

Serapan kontrol

Persen penghambatan prolifersi = 100

persen proliferasi sel

Data persentase penghambatan proliferasi

sel diolah menggunakan analisis regresi

linier untuk mendapatkan nilai IC50. Suatu

ekstrak dinyatakan aktif atau memiliki

potensi sebagai anti kanker bila nilai IC5500

20 g/mL.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil penapisan fitokimia menunjukkan

bahwa serbuk dan ekstrak metanolmengandung flavonoid dan steroid/

triterpenoid sedangkan ekstrak n-heksana

mengandung steroid/ triterpenoid.

Golongan senyawa ini berpotensi

mempunyai aktivitas farmakologi. Oleh

karena itu dilanjutkan dengan uji toksisitas

secara BSLT sebagai uji pendahuluan.

Hasil uji toksisitas secara BSLT

menunjukkan bahwa ekstrak metanol 1

(hasil maserasi) memberikan nilai LC5032,91 g/mL dan ekstrak metanol 2 (hasil

partisi) 38,91 g/mL sedangkan n-heksana

126,21 g/mL (Tabel 1).

Berdasarkan Tabel 1, suatu senyawa

termasuk dalam kategori sangat aktif

apabila memiliki nilai LC50 < 30 bpj

(McLaughlin & Roger, 1998). Ekstrak

suatu tanaman dikatakan toksik apabila

nilai LC50-nya lebih kecil dari 1000 bpj


5/6


(Meyer, 1982). Dari hasil uji menunjukkan

bahwa ekstrak daun keladi tikus berpotensi

sebagai anti tumor atau anti kanker.

Ekstrak metanol dalam uji BSLT ternyata

lebih aktif dibandingkan dengan ekstrak n-heksana.

Tabel 1.Hasil uji toksisitas dari ekstrak n-

heksana dan ekstrak metanol secara BSLT

Sampel Log

konsent

%

kematian

Probit LC50

(g/mL)

Ekstrak

metanol 1

3,003

2,003

1,003

96,66

60,0

33,33

6,88

5,25

4,56

32,91

Ekstrak

n-heksana

3,002

2,002

1,002

93,33

33,33

6,66

6,48

4,56

3,52

126,21

Ekstrakmetanol 2

3,0042,004

1,004

96,6650,00

33,33

6,885,00

4,56

38,91

Hasil pengamatan terhadap aktivitas sel

kanker payudara T-47D adalah dengan

melihat aktivitas ekstrak n-heksana

maupun metanol terhadap sel kanker T-

47 D diperlihatkan dengan nilai IC50,

dimana penetapan nilai IC50 dilakukan

menggunakan regresi linier. Dari data nilai

IC50 (Tabel 2) terlihat bahwa ekstrak n-heksana menunjukkan aktivitas

penghambatan proliferasi galur sel kanker

payudara T-47D lebih tinggi dibandingkan

dengan ekstrak metanol. Grafik hubungan

antara konsentrasi dan penghambatan

proliferasi dapat dilihat pada Gambar 1.

Tabel 2. Aktivitas inhibisi ekstrak daun keladitikus terhadap strain sel T-47D

Sampel b a y x IC50

(g/mL)

Ekstrakmetanol 1 1,0753 2,5645 5 2,2649 184,06

Ekstrak

n-heksana 0,909 3,4881 5 1,5119 32,50

Ekstrakmetanol 2 3,0396

-2,6567 5 2,5383 345,40

cisplatin 0,9467 4,5126 5 0,4874 3,07

-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550

Konsentrasi (ug/mL)

PenghambatanProliferasi(%)

metanol 1 n-heksana metanol 2

Gambar 1. Grafik huungan antara konsentrasi (g/mL)

dan penghambatan proliferasi (%) dariekstrak metanol dan ekstrak n-heksana

KESIMPULAN

Dari penapisan fitokimia menunjukkan di

dalam serbuk dan ekstrak daun keladi

tikus mengandung flavonoid dan steroid

triterpenoid. Ekstrak metanol dan n-

heksana daun keladi tikus memiliki

toksisitas terhadap larva udang Artemia

salina Leach. Dari hasil uji sitotoksik,

ekstrak n-heksana memiliki aktivitas

terhadap sel kanker payudara T-47D yang

lebih tinggi dibandingkan ekstrak metanol

dengan nilai IC50 32,50 g/mL.

Ucapan Terima kasihTerima kasih kepada DP2M, Direktorat

Jenderal Pendidikan Tinggi, Depdiknas,

yang telah mendanai penelitian ini.

DAFTAR PUSTAKA1. McLaughlin, J.L.and Rogers, L.L. The

use of biological assay to evaluate

botanicals.Drug Information Journal,

1998, 32:513-524.

2. Meyer BN. Brine shrimp: a convinientgeneral bioassay for active plant

constituent. Planta Medica. 1982., 45:

31-4


6/6


3. Aryanti. Isolasi senyawa anti kankerdari tanaman keladi tikus (Typhonium

divaricatum (L). Decne). Jurnal Bahan

Alam Indonesia 2002;1(1):188

4. Zheng G.Q. Cytotxic terpenoid andflavonoids Artemisia annua. Planta

Medica (1994) 60: 54-57.

5. Kamuhabwa,A, Nshima, C. & deWitte, P. Cytotoxicity of some

medicinal plant extracts used in

Tanzanian traditional medicine.

J.Ethnopharmacol. 2000. 70: 143-149.

6. Wilson, AP. Cytotoxicity and viabilityassays. In: Masters JRW, Editor.

Animal cell culture: A Parctical

Approach. 3rd

ed. Oxford University

Press, New York. 2000, 263-4; 272.

7. MTT cell proliferation assayinstruction catalog number 30-1010k,

ATCC[serial online] 2001; diambil dari

http//www.atcc.org.

8. McLaughlin, JL, Anderson JE. A blind

comparation of single benzsch-topbioassay and human tumor cell.

Cytotoxicities studies as Anti tumor

prescreens. Phytochemical Analysis.

Volume 2; 1991. 107-11

9. Sugianto. Aktivitas antikarsinogeniksenyawa yang berasal dari tumbuhan.

Majalah Farmasi Indonesia

2003;14(3):132.

10.Harborne JB. Metode Fitokimia.

Penuntun cara modern menganalisistumbuhan. Terbitan kedua. Terjemahan

Padmawinata K, Soediro I. Bandung:

ITB; 1987. hal. 47-61

11.Sugianto. Aktivitas antikarsinogeniksenyawa yang berasal dari tumbuhan.

Majalah Farmasi Indonesia,

2003;14(3):132.

12.Orech,et.al. Potential toxicity of sometraditional lefy vegetables consumed in

nyahoma division, western Kenya.

African Journal of Food andNutritional Sciences: 2005, Volume 5

No 1.

13.Tri Dewi, Yuliyanah. Uji aktivitaspenghambatan pertumbuhan sel lestari

tumor dari ekstrak etanol keladi tikus

(Typhonium flagelliforme (Lodd.) Bl.)

secara in vitro. 2003

14.Krishnaraju, A.V. et.al. Assestment ofbioactivity of Inddian medicinal plants

using brine shrimps (Artemia salina)

lethality assay, International Journal of

Applied Science and Engineering,

2005.3,2: 125-134.

15.Ayo, R.G, Audu, O.T, and Amupitan,J.O, Physico-chemical characterization

and cytotoxicity studies of seed

extracts Khaya senegalensis (Desr.)

AJuss. African Journal of

Biotechnology, 2007, Vol. 6 (7), pp.

894-896.

16.Krishnaraju, A.V. et.al. BiologicalScreening of Medicinal Plants

Collected from Eastern Ghats of India

Using Artemia salina(Brine Shrimp

Test), Int. J. Appl. Sci. Eng., 2006. 4,

2: 115-125

17.Choo, C.Y., Chan, K.L., Tayeka,K.,Itokawa, H., Cytotoxic Activity of

Typhonium flagelliforme (Araceae).

Phytother.Rea.2001;15(3):260-2

Documents

Jurnal Ion Exchange Chromatografi