KALA ペプチドによる遺伝子発現向上 · 2019. 7. 19. · KALA ペプチドに ... Reagent 4 $% &'$ 1, 3, 5 2well 6well Step. Step / Step 0 Step 1 Step 2 Step GenomONE-GX

KALAペプチドはWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEAの30アミノ酸

から構成されており、その機能として、エンドソームに作用することで細胞質

に放出される遺伝子の量を増やすことが知られています。GenomONE-GX と組

み合わせて使用すると遺伝子発現が向上することが分かりました。

※KALAペプチドはGenomONE-GX kitには添付されていません。試薬メーカー

からご購入ください。

KALAペプチドによる遺伝子発現向上

KALAペプチドの効果（TurboGFP遺伝子発現）

KALAペプチドKALAペプチドの効果（ルシフェラーゼ遺伝子発現）

GenomONE-GX を用いてKALAペプチド有/無の条件でそれぞれトランスフェクションを行い、2日後、蛍光顕微鏡観察を行った。プロモーターはCAGを使用した。

GenomONE-GX を用いてKALAペプチド有/無の条件でそれぞれトランスフェクションを行い、

翌日、ルシフェラーゼの発現量を測定した。プロモーターはCAGを使用した。

GenomONE –GX

GenomONE –GX

+KALA peptide

Product L(competitor)

Ver.2 July 2019

Jurkat

JurkatJurkat

Jurkat K

KK

K-

--

-562

562562

562 RAW 264.7

RAW 264.7RAW 264.7

RAW 264.7 HEK

HEKHEK

HEK-

--

-293

293293

293 SH

SHSH

SH-

--

-SY5Y

SY5YSY5Y

SY5YRIN

RINRIN

RIN-

--

-5F

5F5F

5FA549

A549A549

A549 MCF

MCFMCF

MCF-

--

-7

77

73T3

3T33T3

3T3-

--

-L1

L1L1

L1 HeLa S3

HeLa S3HeLa S3

HeLa S3 L929

L929L929

L929 NIH/3T3

NIH/3T3NIH/3T3

NIH/3T3L6

L6L6

L6Hs68

Hs68Hs68

Hs68U

UU

U-

--

-937

937937

937

※0.02mg/mL KALAペプチド水溶液

ペプチド水溶液ペプチド水溶液

ペプチド水溶液を準備してください。

（

（（

（GenomONE-GX kitに添

に添に添

に添付されていません。

付されていません。付されていません。

付されていません。試薬メーカー

試薬メーカー試薬メーカー

試薬メーカーからご購入ください）

からご購入ください）からご購入ください）

からご購入ください）

※ トランスフェクション条件（Step⑥の氷上での静置時間、Step⑦で使用する

Enhancerの効果の確認）を検討するため、細胞を6well分用意してください。

下記表には6well分のベクターを調製するために必要な試薬量が記載されています。

※ Reagent 3 は、ベクターを調製する前に2, 3 秒ボルテックスミキサーで軽く混合して

ください。スピンダウンは行わないでください。

※使用する各試薬は事前に氷冷し、Step ①～⑥のベクターの調製に関わる操作は、

氷上

氷上氷上

氷上で行ってください。

Enhancerを細胞に添加（×3well）（Step⑥で1, 3, 5分間氷上で静置した試料を

添加したウェルそれぞれに1wellずつ）

Reagent 1（エタノール溶解後調製液）（エタノール溶解後調製液）（エタノール溶解後調製液）

（エタノール溶解後調製液）を

チューブに採取

Reagent 2を添加し、十分に混合

0.2mg/mL DNA TE溶液を添加し、十分に混合

Reagent 3あるいはReagent 5を添加し、十分に混合

Reagent 4を添加し、十分に混合、1, 3, 5分間氷上で静置した試料をそれぞれ2wellずつ

細胞に添加（×6well）

Step

⑦

Step

①

Step

②

Step

③

Step

④

Step

⑥

GenomONE-GXKALAペプチド使用時の調製プロトコル

2.5μL

（×3well）

1μL

6μL

6μL

6μL

Reagent 4：

6μL

細胞に添加：

5μL (×6well)

0.02mg/mL KALAペプチド水溶液ペプチド水溶液ペプチド水溶液

ペプチド水溶液を添加し、

十分に混合

Step

⑤

6μL

96-well

plate

下記表を参考に添加量を決めてください。

※Corning 社のcell culture vesselsの場合

大阪市西区江戸堀1丁目3番15号

石原産業株式会社

●

●

●

●

●

●

●

細胞毒性が強く現れた場合は、細胞数を増やす、

あるいは、Step⑥の氷上での静置時間を短くして

ください。

十分な細胞数（6well分）が準備できない場合は、Step⑥の氷上での静置時間は3分でご検討ください。

Reagent 3の代わりにReagent 5 を使用した方が高い遺伝子発現が得られる細胞もあります。

弊社ウェブサイトを参考にしてください。

細胞毒性が現れない場合は、Step⑥で調製したベクターを最大3倍量まで

倍量まで倍量まで

倍量まで増やして細胞に添加する

ことができます。

具体的な添加量は上記の表をご参照下さい。

調製の際は、左記「KALAペプチド使用時の調製

プロトコル」に記載の各試薬の混合比が変わらない

ように、必要量のベクターを調製してください。

KALAペプチドに遺伝子発現を向上させる効果があるか確認する場合は、Step⑤においてKALAペプチド水溶液の代わりに滅菌水を使用して調製

したベクターを対照にして比較してください。

Enhancer による効果が弱い場合は、上記の表に

記載の範囲で細胞への添加量を増やしてください。

Enhancer による効果が現れない場合は、Step⑦を省略してください。

Step

StepStep

Step⑥

⑥⑥

⑥

氷上静置時間

氷上静置時間氷上静置時間

氷上静置時間

1分 3分 5分

S

t

e

p

S

t

e

p

S

t

e

p

S

t

e

p

⑦

⑦⑦

⑦

E

n

h

a

n

c

e

r

E

n

h

a

n

c

e

r

E

n

h

a

n

c

e

r

E

n

h

a

n

c

e

r

の

使

用

の

使

用

の

使

用

の

使

用

(

-

)

(

+

)

×6well

12.5μL

（×3well）

5μL

30μL

30μL

30μL

Reagent 4：

30μL

細胞に添加：

25μL (×6well)

30μL

24-well

plate

50μL

（×3well）

20μL

120μL

120μL

120μL

Reagent 4：

120μL

細胞に添加：

100μL (×6well)

120μL

6-well

plate

×2well

氷上

氷上氷上

氷上

1min 3min 5min

×2well ×2well

×3well

96-well 0.1 0.32 1 5-15 2.5-3

48-well 0.2 0.95 3 10-30 5-6

24-well 0.5 1.9 6 25-75 12.5-15

12-well 1 3.8 12 50-150 25-30

6-well 2 9.5 30 100-300 50-60

プレートサイズ

培養液量

(mL)

培養面積/well

※

(cm2)

培養面積

（相対値）

細胞への添加量/well

Step⑥

調製ベクター

(μL)

Step⑦

Enhancer

(μL)

フリーダイヤル

フリーダイヤルフリーダイヤル

フリーダイヤル 0120-409-816E-mail: [email protected] URL: https://www.iskweb.co.jp/products/hvj-e/

Step⑥ 氷上での静置時間の検討

GenomONE-GXにKALAペプチドを組み合わせて使用した場合は、Step⑥ 氷上での静置

時間3分で高い遺伝子発現量が得られる場合が多かった。HEK-293細胞では、 Step⑥

氷上での静置時間を短くすると細胞毒性が軽減され、遺伝子発現が改善した。

参考参考参考参考資料資料資料資料））））

細胞

細胞細胞

細胞

細胞数

細胞数細胞数

細胞数

(96

(96(96

(96-

--

-well plate)

well plate)well plate)

well plate)

Step

StepStep

Step④

④④

④

使用する試薬

使用する試薬使用する試薬

使用する試薬

Step

StepStep

Step⑤

⑤⑤

⑤

KALA

KALAKALA

KALAペプチド

ペプチドペプチド

ペプチド

の使用

の使用の使用

の使用

Step

StepStep

Step⑥

⑥⑥

⑥

氷上静置時間

氷上静置時間氷上静置時間

氷上静置時間

Step

StepStep

Step⑥

⑥⑥

⑥

調製ベクターの

調製ベクターの調製ベクターの

調製ベクターの

細胞への

細胞への細胞への

細胞への

添加量

添加量添加量

添加量

Step

StepStep

Step⑦

⑦⑦

⑦

Enhancer

EnhancerEnhancer

Enhancer

の使用

の使用の使用

の使用

A549 5×10

3

cells Reagent 3 + 3分 5μL -

CHO-K1 5×10

3


HEK-293 1.5×10

4

cells

Reagent 3

Reagent 3

-

+

5分

1分

5μL

5μL

-

-

HeLa

5×10

3

cells

1×10

4

cells

Reagent 5

Reagent 5

-

+

3分

1分

5μL

5μL

-

-

HeLa S3 1×10

4

cells

Reagent 3

Reagent 3

-

+

3分

1分

5μL

5μL

+

+

Hep G2 1.5×10

4

cells Reagent 5 + 5分

5μL

+

Hs68 1×10

4

cells Reagent 5 + 3分 5μL +

HuH-7 5×10

3


Jurkat 4×10

4


K-562 2×10

4


L6 5×10

3


L929 5×10

3


MCF-7 2×10

4


NIH/3T3 5×10

3


P3X63Ag8.653 4×10

4


RAW 264.7 2×10

4

cells

Reagent 5

Reagent 5

+

+

3分

1分

5μL

10μL

+

+

RIN-5F 4×10

4


SH-SY5Y 5×10

4


THP-1 4×10

4

cells Reagent 3 - 5分 5μL +

U-937 2×10

4

cells

Reagent 3

Reagent 5

+

+

3分

1分

5μL

15μL

+

+

3T3-L1 5×10

3


A549, CHO-K1, HEK-293, HeLa, HeLa S3, Hep G2, Hs68, HuH-7, L6, L929, MCF-7, NIH/3T3, RAW 264.7,

RIN-5F, SH-SY5Y, 3T3-L1細胞はトランスフェクション前日に、Jurkat, K-562,P3X63Ag8.653, THP-1, U-937

細胞はトランスフェクション当日に96-well plateに播種した。

Step⑤でKALAペプチドを使用しない場合は、KALAペプチド水溶液の代わりに水を使用して調製した。

最適なトランスフェクション条件

最適なトランスフェクション条件最適なトランスフェクション条件

最適なトランスフェクション条件は、細胞の継代数、培養に使用する血清のロット等に影響を受けるため、

は、細胞の継代数、培養に使用する血清のロット等に影響を受けるため、は、細胞の継代数、培養に使用する血清のロット等に影響を受けるため、

は、細胞の継代数、培養に使用する血清のロット等に影響を受けるため、

上記条件と必ずしも一致しない可能性があります。上記条件を参考に条件検討してください。

上記条件と必ずしも一致しない可能性があります。上記条件を参考に条件検討してください。上記条件と必ずしも一致しない可能性があります。上記条件を参考に条件検討してください。

上記条件と必ずしも一致しない可能性があります。上記条件を参考に条件検討してください。

推奨するトランスフェクション条件様々なプロモーターにおけるKALAペプチドの効果

トランスフェクションベクターはStep④でReagent 3、Step⑤でKALAペプチドを使用し調

製した。 RAW 264.7, Jurkat細胞において、CMV, EF1α, CAGの何れのプロモーター

においてもKALAペプチドによりルシフェラーゼ遺伝子の発現が向上した。

大阪市西区江戸堀1丁目3番15号

石原産業株式会社フリーダイヤル

フリーダイヤルフリーダイヤル

フリーダイヤル 0120-409-816

E-mail: [email protected]

URL: https://www.iskweb.co.jp/products/hvj-e/

0.0E+00

5.0E+05

1.0E+06

1.5E+06

2.0E+06

2.5E+06

3.0E+06

3.5E+06

KALApeptide

(-)

KALApeptide

(+)

KALApeptide

(-)

KALApeptide

(+)

KALApeptide

(-)

KALApeptide

(+)

KALApeptide

(-)

KALApeptide

(+)

HEK-293 Hep G2 RAW 264.7 K-562

Luci

fera

se e

xpre

ssio

n (R

LU)

1 min 3 min 5 min 7 minStep ⑥ settling time on ice

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KALA ペプチドによる遺伝子発現向上 · 2019. 7. 19. · KALA ペプチドに ... Reagent 4 $% &'$ 1, 3, 5 2well 6well Step. Step / Step 0 Step 1 Step 2 Step GenomONE-GX