T.C. SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ

SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

KANTARON OTUNDAN (HYPERİCUM PERFORATUM L.) ELDE EDİLEN HYPERİSİN MADDESİNİN İNSAN

LENFOSİT KÜLTÜRLERİNDE KARDEŞ KROMATİD DEĞİŞİMİ (KKD) ÜZERİNE ETKİSİ

Nezahat KAŞTAN YÜCEL

TIBBİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ

DANIŞMAN Doç. Dr. H. Ramazan YILMAZ

Bu Tez Süleyman Demirel Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından 746 no’lu proje ile desteklenmiştir.

TEZ NO: 33

2006-ISPARTA

i

KABUL VE ONAY

Sağlık Bilimleri Enstitüsü Müdürlüğüne;

Süleyman Demirel Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü

Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı Yüksek Lisans Programı

Çerçevesinde yürütülmüş olan bu çalışma, aşağıdaki jüri üyeleri tarafından yüksek

lisans tezi olarak kabul edilmiştir.

Tez savunma tarihi: 25/01/2006

Tez Danışmanı: Doç Dr. H. Ramazan YILMAZ

Üye :Doç. Dr. H.Ramazan YILMAZ

Süleyman Demirel Üniversitesi Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı

Üye :Prof. Dr. Nurten ÖZÇELİK Süleyman Demirel Üniversitesi Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı

Üye :Yrd.Doç.Dr.Ekrem ÇİÇEK Süleymen Demirel üniversitesi Farmakoloji Anabilim Dalı

ONAY: Bu tez Enstitü Yönetim Kurulunca belirlenen yukarıdaki jüri üyeleri tarafından

uygun görülmüş ve enstitü yönetim kurulu kararıyla kabul edilmiştir.

Prof. Dr. Halis KÖYLÜ Enstitü Müdürü

ii

TEŞEKKÜR

Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalında bana Yüksek lisans çalışmalarımı yapma

olanağı sağladığı için değerli hocam sayın Prof. Dr. Nurten ÖZÇELİK’e,

Tez çalışmalarım sırasında yardımları ve eleştirileri ile bana katkıda bulunan

tez danışman hocam sayın Doç. Dr. H. Ramazan YILMAZ’a,

Araştırmalarımda kullandığım yöntemleri öğrenmemde, laboratuar

çalışmalarımda ve tezimi yazmamda yardımlarını esirgemeyen Tıbbi Biyoloji A.D.

Öğretim Üyeleri Yrd. Doç.Dr. Efkan UZ’a, Yrd. Doç. Dr. Nilüfer CALAPOĞLU’na,

Araştırma Görevlileri: Arş. Gör. Pınar KOŞAR’a, Arş. Gör. Mustafa SOYÖZ’e,

Arş.Gör. Esin ÇETİN’e, Arş. Gör. Ayşe ALTUBAŞAK’a ve Arş. Gör. Barış

YAŞAR’a,

Her zaman destek olan iş arkadaşlarım Isparta Devlet Hastanesi Kan

Merkezi çalışanlarına,

Çalışmalarımda anlayışını ve desteğini esirgemeyen değerli eşim Bilal

Serdar YÜCEL’e, sevgili kızım R. Ahsen YÜCEL’e sonsuz teşekkür ediyorum.

Bu çalışmayı destekleyen Süleyman Demirel Üniversitesi Bilimsel

Araştırma Projeleri Yönetim Birimi (SDÜBAP)’ne teşekkür ederim.

iii

İÇİNDEKİLER

KABUL VE ONAY ...................................................................................................... i TEŞEKKÜR................................................................................................................. ii İÇİNDEKİLER ...........................................................................................................iii SİMGELER VE KISALTMALAR............................................................................. iv ŞEKİL, TABLO, GRAFİK ve RESİM LİSTESİ......................................................... v 1. GİRİŞ ....................................................................................................................... 1 2. GENEL BİLGİLER ................................................................................................. 4

2.1. Hypericum Perforatum L. Hakkında Genel Bilgiler ......................................... 4 2.1.1. Hypericum perforatum L.’nin Sistematiği ................................................. 4 2.1.2. Hypericum L.’nin Genel Özellikleri .......................................................... 4 2.1.3. Hypericum L. Genusunun Taşıdığı Maddeler............................................ 6 2.1.3.1. Hyperisin ................................................................................................ 7 2.1.3.2. Hyperforin ............................................................................................ 19

2.2. Kardeş Kromatid Değişimi (KKD) ................................................................. 20 2.2.1. KKD’nin Tarihçesi................................................................................... 21 2.2.2. KKD’nin Kullanım Alanları .................................................................... 21 2.2.3. KKD Mekanizmaları ................................................................................ 22 2.2.4. KKD Oluş Mekanizması ile İlgili İleri Sürülen Modeller ....................... 24 2.2.5. KKD Yöntemini Etkileyen Faktörler ....................................................... 29

3. MATERYAL VE METOD.................................................................................... 32 3.1. Materyal .......................................................................................................... 32

3.1.1. Kimyasallar .............................................................................................. 32 3.1.2. Diğer Malzemeler.................................................................................... 32 3.1.3. Deney Gruplarının Oluşturulması ............................................................ 32

3.2. Metod .............................................................................................................. 33 3.2.1. Hücre Kültürlerinin Kurulması ................................................................ 33 3.2.2. Kromozom Eldesi ....................................................................................34 3.2.3. KKD Boyama Tekniği .............................................................................35 3.2.4. KKD’nin Değerlendirilmesi..................................................................... 36 3.2.5. İstatistiksel İşlemler ................................................................................. 37 3.2.6. Fotografik İşlemler................................................................................... 37

4. BULGULAR.......................................................................................................... 38 5. TARTIŞMA VE SONUÇ ...................................................................................... 44 ÖZET ......................................................................................................................... 48 SUMMARY ............................................................................................................... 49 KAYNAKLAR .......................................................................................................... 50

iv

SİMGELER VE KISALTMALAR

KKD : Kardeş Kromatid Değişimi

KA : Kromozom Aberasyonu

PDT : Fotodinamik Tedavi

MAP kinaz : Mitoz Aktive Edici Protein Kinaz

PUFA : Poliansatüre Yağ Asidi

PKC : Protein Kinaz C

CDK : Siklin Depended Kinaz

ROS : Reaktif Oksijen Radikalleri

RT : Revers Transkriptaz

ATP : Adenozin Trifosfat

MHO : Monoamin Oksidaz

COMT : Katekolamin Metil Tranferaz

GABA : Gama Amino Bütirik Asit

FPG : Floresans ve Giemsa Yöntemi

3 HdTh : 3H-deoksi-timidin, Radyoaktif Timidin

BrdU : 5-Bromo-2 deoxyüridin

TNFR : Tümör Nekroz Faktör Reseptörü

TRAIL : TNF-releated apopitozis indused ligand

v

ŞEKİL, TABLO, GRAFİK VE RESİM LİSTESİ

Şekil 1: Hypericum perforatum L.’nin genel görünümü …………………….. 4

Şekil 2: Hyperisin’in aromatik formülü …………………………… ………… 9

Şekil 3: Hyperforini’n aromatik görünümü …………………………… ……... 19

Şekil 4: Kromozomlarda oluşabilecek KKD’lerin şematik gösterimi ………… 23

Şekil 5: KKD oluşum mekanizması …………….……………………………… 24

Şekil 6: Timinin ve BrdU’in halkasal yapısı ……………….…………………. 25

Şekil 7: BrdU varlığına bağlı spirilizasyon gecikmesi ………………….……... 26

Şekil 8: Evens isimli araştırıcının ileri sürdüğü KKD oluş mekanizması ...…… 27

Şekil 9: KKD oluş mekanizması …………….………………………………..... 29

Tablo 1: Hypericum perforatum metanol ekstraktının taşıdığı bileşikler ……..... 7

Tablo 2: Hypericum perforatum’um antidepresan etkisi kanıtlanmış extraktları ... 17

Tablo 3: Gruplar arasındaki KKD değerleri …….…………………………….… 38

Tablo 4: Kadın ve erkek KKD değerleri ……………………………………..... 41

Grafik 1: Grup I ve II’nin KKD değerlerinin karşılaştırılması …………….......... 39

Grafik 2: Grup I ve III’ün KKD değerlerinin karşılaştırılması ………………….. 40

Grafik 3: Grup II ve III’ün KKD değerlerinin karşılaştırması …………………. 40

Resim 1: Grup I’e ait bir metafaz örneği ………………………………………... 42

Resim 2: Grup II’e ait metafaz örneği ……………………………………….….. 42

Resim 3: Grup III’e ait bir metafaz örneği …………………………………….... 43

1

1. GİRİŞ

Bitkilerin tedavide kullanımları insanlık tarihi kadar eskiye dayanmaktadır.

İnsanoğlu ilk çağlarda, hastalıkları iyileştirebilmek için tabiata ve hayvanlara

özellikle de bitkilere yönelmiştir. Sınama yanılma yöntemi ile bazen etkili ilaçlar

bulup onlardan istifade etmiştir. Afyon bitkisinden saflaştırılmış olan morfin, kodein

gibi ilaçlarla, digoksin ve digitoksin gibi kalp glikozitleri de halkın ilaç olarak

kullandığı bitkilerden elde edilmiştir (1,2).

Tez konusu olarak seçtiğimiz halk arasında “sarı kantoran, binbirdelik otu”

olarak bilinen Hypericum perforatum, Türkiye’de ve Avrupa’da yaygın yetişen

yabani bir bitkidir. H. perforatum Hypericaceae (Guttiferae) familyasından olup bu

familyanın Türkiye’de 89 türü yetişmektedir. Bunların 43’ü ise endemiktir (3). H.

perforatum geleneksel folklorik ilaç olarak dahilen ağrı giderici, yatıştırıcı, parazit

düşürücü, ülser tedavi edici ve haricen de yara iyileştirici olarak ülkemizde

kullanılmaktadır (4).

Yapılan araştırmalarla bu tıbbi bitkinin antitümör (5), antiviral (6),

antidepresan (7), antibakteriyal (8), antiinflamatuar (9), analjezik (10) ve

hepatoprotektif (11) etkilerinin olduğu belirlenmiştir. Avrupada St. John Wort olarak

tanınan bu bitkinin en zengin hyperisin (Hy) ve türevleri (pseudohyperisin) kaynağı

olduğu bulunmuştur (12). Hy bilinen en güçlü doğal fotosensitizerdir (13). Son

yıllarda bu bileşikler tümöral ve viral hastalık tedavisinde, ayrıca ılımlı depresyon

yatıştırmada önem kazanmıştır.

1988’den beri antiviral etkisi araştırılmakta olup etki mekanizması henüz

açıklanamamıştır (14). Işığa duyarlaştırıcı olan ve lipitte çözünen Hy’nin tümör

hücreleri ve zarflı virüsler üzerine güçlü fotodinamik etkisi olduğu rapor edilmiş

fakat Hy’in tümör hücresi ölüm mekanizmasını nasıl teşvik ettiği çeşitli teoriler ileri

sürülmesine rağmen henüz tam olarak açığa kavuşturulamamıştır. Hy’nin bu

antitümör ve antiviral etkisinin fotosensitizer özelliğinden kaynaklandığı

bilinmektedir. Hy’nin düşük dozlarda antiproliferatif etki gösterdiği, yüksek dozlarda

ise hem apopitozis hem de nekroz yoluyla tümör hücrelerini yok ettiği

düşünülmektedir (15).

2

Hücre ve organellerin yıkımını ışık aracılığı ile katalize eden fotosensitizer

ajanların kullanılmasına fotodinamik terapi (FDT) denilmektedir. FDT kanser

tedavisi için kullanılan yeni ve umut verici yöntemlerden biridir. Antitümoral PDT

bir fotosensitizerin sistemik uygulamasını ve tümöral lezyona oksijen varlığında

görülebilir ışığın dağıtılmasını hedefler (16). Bu sağlandığı zaman tip I veya tip II

reaksiyonu vasıtasıyla reaktif oksijen radikallerinin lokal üretimi lipit membranlarda

zincirleme reaksiyonları gerçekleştirerek tümör harabiyetine sebep olur (17). FDT

virüslere uygulanırsa zarf yapısının bozulmasını sağlayarak virüsün infekte etme

özelliğinin kaybına neden olur (18). Son yapılan araştırmalarda ışıkla aktive edilen

Hy’nin intrinsik veya ekstrinsik apopitozis yollarından her ikisini de aktifleyebileceği

ileri sürülmüş kesin bir açıklama getirilememiştir (19).

Tarih boyunca insanlar H. perforatum’u ruhsal sıkıntı, hafif depresyon,

yorgunluk, bitkinlik tedavisi için kullanmışlardır. Günümüzde ise H. perforatum

eksraktları, depresyon yatıştırmada doğal teropatik ajanların en faydalı

olanlarındandır (20). Ayrıca diğer antidepresanların etki mekanizmalarından farklı

bir etki mekanizmasına sahip olduğu düşünülmektedir. Nörokimyasal etkisinin

santral sinir sisteminde H. perforatum’a ya bir çok düzenleyicinin cevap vermesi ya

da enzimatik aktivite mekanizmasının inhibisyonu şeklinde olduğu ileri sürülmüştür.

Antidepresan etkinin, H. perforatum’un içerdiği hyperisinler, hyperforinler,

pikosiyanidinler ve flavanoidlerin farklı etki şekilleriyle olduğu varsayılmaktadır

(21).

Çeşitli Hypericum türlerinin yapraklarından hazırlanan metanol ekstrakları

çeşitli tiplerdeki yaralara uygulanmış, standart yara iyileştirici merhemlerle

karşılaştırılabilir seviyede iyi sonuçlar elde edilmiştir (22). Türkiye’de geleneksel

olarak halk arasında zeytinyağı içerisine bu bitkinin çiçeklerinin katılarak güneşte

bekletilip elde edilen karışımın yara iyileştirici olarak haricen uygulandığı

bilinmektedir (23).

Kardeş Kromatid Değişimi (KKD) analizi, genotoksik ajanların

deoksiribonükleik asitte (DNA) oluşturduğu hasarın kromozom düzeyinde tespit

edilmesini sağlayan doğrudan metodlardan birisidir (24). KKD, DNA replikasyonu

3

sırasında kardeş kromatidler arasında özdeş segmentlerin karşılıklı simetrik yer

değiştirmesidir. Bu olay kromozomun her iki kromatidinin birden kırılması ile ortaya

çıkmaktadır. KKD’de yeni duplike olmuş kromatid ve eski kendi kardeş kromatidi

arasında, kromozom morfolojisi değişmeden simetrik olarak özdeş segmentlerin

değişimi söz konusudur (25). KKD, çoğalmakta olan hücrelerde spontan olarak

meydana gelir. Özellikle kromozom hasarı, instabilitesi ve DNA tamir bozukluğu

sendromlarında duyarlı bir parametre olarak kullanılmaktadır. KKD, DNA’daki çok

küçük harabiyetlerin bile hassas göstergesi olarak kabul edilir (25, 26).

Bu çalışmada, tümör hücrelerinde apopitozisi indüklediği bilimsel

çevrelerce kabul edilmiş fakat genotoksit etkisinden bahsedilmemiş olan Hy’nin

insan lenfosit hücrelerinde genotoksik etkisinin olup olmadığının araştırılması

amaçlanmaktadır.

4

2. GENEL BİLGİLER

2.1. Hypericum Perforatum L. Hakkında Genel Bilgiler

2.1.1. Hypericum perforatum L.’ nin Sistematiği

Divisio : Spermatophyta

Subdivisio: Angiospermae

Clasis : Dicotyledoneae

Subclasis : Magnolipsida

Ordo : Theales

Familya : Cluciaceae ( Hypericaceae, Guttiferae)

Genus : Hypericum perforatum (Kantaron otu, Binbirdelik otu) (3)

Şekil 1: Hypericum perforatum L.’nin genel görünümü (20)

Türkçe: Binbirdelik otu, Sarı kantaron, kan otu, yara otu, koyun kıran, kılıç

otu, püren (4,20,27,28).

İngilizce : St. John’s wort (4,20)

Almanca : Johanniskraut (4,20)

Fransızca : Millepertius (4,20)

2.1.2. Hypericum L.’nin Genel Özellikleri

Hypericum L. (Hypericaceae): Çok yıllık otsu çalımsıdır. Yapraklar

perfoliat (sarıcı) veya değil, nadiren aurikulat (kulaklı) olup sepaller ve petallar 5,

5

serbest, petallar genellikle sarı, stamenler 5 grup halinde ve petallerin önündedir.

Ovaryum 3-5 veya tek lokuluslu, 2-çok ovüllü. Meyvesi pestisid kapsula veya

nadiren bakka. Kapsulanın üzerinde boyuna çizgiler (vittae) veya enine kabartılar

(vesicle) bulunur. Avrupa ve Anadolu’da yaygın bir türdür. Dünyada sıcak ve ılıman

bölgelerde yayılış gösteren 400’ün üzerinde türü olup Avrupa’da 10, Türkiye’de 89

türü bulunur. Bunlardan 43’ü endemiktir. Hypericum L.’nin türkiyede en yaygın

temsil edilen türleri, Hypericum perforatum L., H. Trigqetrifolium, Hypericum

calycinum (Büyük çiçekli binbirdelik otu), H. empetrifolium Willd. (püren, sarı

püren), H. scabrum L (mayasıl otu, kepirotu), H. tedrapetum Fries’dir (3,4).

Hypericum perforatum L: Tarla yol orman kıyılarında, tepelerde ve

çayırlarda temmuzdan eylül ayına kadar çiçeklenen ve ülkemizde , sarı kantaron,

kanotu, kılıç otu mayasıl otu, kuzukıran, koyunkıran ve yara otu gibi yöresel adlara

da sahip olan şifalı bir bitkidir. Bitki 30-100 cm boyunda, çok senelik ve otsudur.

Yapraklar 10-35 mm uzunlukta, elips biçiminde ve hemen hemen sapsızdır.

Yapraklar ışığa karşı tutulduğunda yağ guddeleri, çok miktarda parlak noktacıklar

halinde kolaylıkla görülür. Bu özelliğinden dolayı binbirdelik otu denmiştir. Çiçek

beş parçalı petaller altın sarısı renkli, kenarları siyah benekli gudde tüyleri ile

çevrilidir. Stamenler çok adette ve 3 demet halinde toplanmış. Bütün Türkiye ve

Avrupada yabani olarak yetişir. Ülkemizde yetişen üç varyetesi vardır: H. perforatum

var. perforatum, H. Perforatum var. Angustifolium, H. perforatum var. microfhyllum

(3).

Hypericum türleri farklı salgısal yapı tiplerinin varlığı ile karakterize edilir:

Saydam bezler ya da oyuklar, siyah nodüller ve salgı kanalları (29).

Hıristiyan mistiziminde bu bitkinin önemli bir yeri vardır. Yaklaşık 1300

yıldan beri Hristiyan geleneğinin sembolik bir bitkisi olarak kabul görmektedir. Bitki

Avrupa Ülkelerinde çoğunlukla St. John Wort olarak bilinmektedir. Rivayetlere göre

bitkinin ismi Yahya (Johannas) peygamberden gelmektedir. İncil’de geçen bir

olaydan ötürü Yahya Peygamber, Hıristiyanlar için mucizevi bir bitki getirmiştir. Bu

bitki H. Perforatum’dur. Diğer bir rivayet ise haçlı seferleri sırasında yaralanan St.

John şövalyelerinin yaralarının tedavisi bu bitki ile yapıldığından bu ismi aldığı

şeklindedir (20).

6

Hazırlanan tentürleri orta şiddetteki depresif durumlarda, özellikle menepoz

sıkıntılarını giderici olarak kullanılır. Haricen bitkisel yağlar içinde hazırlanıp yara

ve yanık tedavi edici olarak kullanılır (9).

H. trigqetrifolium: Akdeniz Doğu Avrupa’da doğal olarak yetişir.

Türkiyenin hemen hemen bütün bölgelerinde yaygındır. Antalya; Akseki, Manavgat,

Muğla, Mersin, Tarsus’da bulunmaktadır. Geleneksel sedatif, antihelmintik

antiinflematuar ve antiseptik etkileri için kullanılır. Gastrointestinal hastalıklar ve

yanık tedavisinde kullanılır (3).

Hypericum calycinum (Büyük çiçekli binbirdelik otu): 20-60cm boyunda

büyük çiçekli bir türdür. Bilhassa Kuzey Anadolu’da yaygındır (22).

H. empetrifolium Willd. ( püren, sarı püren): 20-60 cm boyunda, dik, dallı

ve küçük çiçekli bir türdür. Bilhassa Batı Anadolu’da kumaşları sarıya boyamak için

kullanılır (22).

H. scabrum L (mayasıl otu, kepirotu): 15-45 cm yükseklikte gövdesi

genellikle pürtüklü olan bir türdür. Çiçekler genellikle gövdenin ucunda, birçoğu bir

arada bulunur. Anadoluda yaygın bir türdür. Kayseri-Yozgat yörelerinde çiçekli

dallarından hazırlanan infüzyon (%1), dahilen basura ve kabıza karşı

kullanılmaktadır (22).

H. tedrapetum Fries: 10-130 cm yükseklikte, gövdesi dört kanatlı ve küçük

çiçekli bir türdür. Kuzey ve Güney Anadolu’da yaygındır (22).

2.1.3. Hypericum L. Genusunun Taşıdığı Maddeler

H. perforatum bitkisinde naftodiantoronlar (hyperisin, pseudohypersin,

izohyperisin), flovonlar (hyperosit rutin, quarsetol, quersitin, Biflovanoit), uçucu

yağlar (carophyllene, α- pinene, seskiterpenler), protein, tanen, karoten, vitamin C,

resin, hyperforin bileşikler bulunmaktadır (Tablo 1).

7

Tablo 1: Hypericum perforatum metanol ekstraktının taşıdığı bileşikler (4,11).

Bileşik Türü Miktar Bulunduğu

yer

Naftodiantron

(% 0,1-0,3)

hypericin

pseudohypericine

izohypericine

95-4660 ppm

kök,gövde,

yaprak,çicek

tohum

Flovanlar

(%4-5)

hyperosit

rutin

quarsetol

biflovanoit

quercitin

117.100 ppm

çiçekte

Uçucu yağlar

(%0,1)

carophyllene

α- pinene

seskiterpenler

yaprak

çiçek

kök

Tanen (%10) çiçek

Karoten 165 ppm tohum

Vitamin C 395 ppm kök, tohum

Hyperforin

Protein 181.000-207.000 ppm

kök, tohum

Resin

2.1.3.1. Hyperisin

Hypericum perforatum’da hyperisin adı verilen bir diantron bulunmaktadır.

Hy, hegzahidroksi dimetil naftodiantron’dur (2). Hy hypericum genusunun en önemli

metabolitlerinden ikincisidir (30). Hy ve pseudohyperisin bitkiyi böcek ve zararlı

hayvanlara karşı koruyan allokimyasal fotosensitizer bileşiklerdir. Hyperisin ve

onun protoformu pseudhyperisin, bitkinin kökü, yaprakları, sepal, petal, stamen ve

taze ovüllerinde ışığa tutulunca görülen küçük koyu bezlerde lokalize granüller

olarak bulunur (31). Bitkide pseudohyperisin (protonaftodiontoron) / hyperisin

(naftodiantoron) oranının yüksek tutulması veya içinde bulundukları veziküllerin

geçirgen olmaması sayesinde bitki ışığa bağlı fotoharabiyetten korunmaktadır (15).

8

Hy fotosensibilizasyon meydana getiren bir maddedir. Bu bitkiyi yiyen

hayvanlardan, yalnız beyaz tüylü olanlarda, güneş ışığı tesiri ile, deri ve mukozada

yaralar ve genel metabolizma bozuklukları ile beliren özel bir hastalık

(hypericismus) meydana gelir. Hy küçük dozlarda mental depresyona karşı tonik ve

stimülan olarak kullanılmaktadır (2,4) Hy’nin tümor hücreleri ve viruslar üzerine

güçlü bir fotodinamik etkiye sahip olduğu tespit edilmiş fakat bu bileşiğin tümör

ölüm mekanizmasını nasıl teşvik ettiği henüz açığa kavuşturulamamıştır. Hy’nin

zarflı virüsleri inaktif hale getirdiği fakat zarfsız virüslere bir etkisinin olmadığı rapor

edilmiştir. Bu kabiliyetinin ışığa bağlı arttığı da belirtilmiştir (6). Hy’nin apopitozisi

uyardığı birkaç tümör: Glioma, hipofiz adenomu, retinal pigment epitel hücreleri

maling T lenfositler. Hyperisinin protein kinaz C’nin potansiyel inhibitörü olduğu

gösterilmiştir. Hy MAP kinaz ve EGF reseptör trozin kinaz inhibitörü olarak ve

usülüne uygun ışık ve uygun konsantrasyonda uygulanınca HeLa hücreleri içinde

mitokondriyal hekzokinaz inhibisyonuna da etkili olduğu belirtilmiştir (32, 33).

A) Hyperisin Molekülünün Genel Özellikleri

Hyperisin molekülünün 54 atom ve 260 elektronu olan polisiklik

naftodiontorondur. 7 ve 14 pozisyonundaki karbonil grupları ile çok sağlam bir yapı

oluşturur (34).

Kimyasal formülü: C30H16O8

Çözünürlüğü: DMSO, %100 etenol, metanol, aseton, etilmetilketon, pridin

ve diğer organik çözücüler.

Molekül ağırlığı: 504,4

Aromatik formülü (Şekil 2).

9

Şekil 2: Hyperisin’in aromatik formülü (35).

Hy molekülünün son derece dinamik bir yapısı vardır. Hy hücre membranı

lipid bileyerleri arasına girebilir. Çoğunlukla lipofilik özelliktedir. Sulu çözeltilerinde

nötral, anyonik ve katyonik halde bulunabilir (5).

Yanlarda bulunan iki hidroksi ve iki metil grup Hy’nin sekizli halkasal

yapısının her iki yanında kanat gibi durur ve Hy molekülü aynı düzlemde uzanmaz.

Hidroksi ve metil gruplar birbirini iter. Bunlar hyperisin molekülünün sabit durmayıp

burkulma hareketi yapmasını sağlar (36).

Hy bir yanı hidrofobik bir yanı hidrofilik olan eşsiz bir moleküler yapıya

sahiptir. Hidrofobik metil grupları içeren hyperisin molekülünün tepe alt ve yan

tarafı nonpolardır. Tahminen hidrofobik kısım yağ içine gömülür. Triplet oksijenden

daha az reaktif olan tekil oksijen iki elektronu çiftli bağ içeren hedeflere bağlar

(PUFA’da olduğu gibi). Hidrofilik kısım sulu ortamda hidrojen bağlayabilir (37).

Hy’nin antiviral ve antitumoral özellikleri tamamıyla olmasa da büyük

oranda onun hyperisin’nin fotodinamik özelliklerine bağlıdır. Hy’nin fotodinamik

reaksiyonlarının altında yatan mekanizma tam olarak anlaşılamamıştır. Onun hücre

membranına bağlanan sensitize bir pigment olarak ışık ve oksijen arasında

interaksiyonlar sağladığı bilinmektedir. Hy ile yapılan fotodinamik reaksiyonlarda

ana oksidant olarak tekil oksijen hizmet verir (37 ).

10

Hy absorbsiyon spectromu 600-700 nm arasındadır (36). Bu da kırmızı ve

yeşil ışığa tekabül eder. Teorik olarak ışık quantasını absorbe eder ve oksijen

bulunan ortamda tekil oksijen formuna çevirir. 650-700 nm ışığa maruz bırakılırsa

tekil oksijenin üretildiği tip II fotosensitizasyonuna uğrar (38). Hy eritrositlerin

fotohemolizi gibi hücresel komponentlerin fotooksidasyonunu tetikler (39 ).

Tekil oksijenin polisiklik dionlarda bulunan pi-elektron sistemine karşı

güçlü bir affinitesi vardır. Pi elektronlar hyperisin’nin fotoaktif özelliklerinden

sorumludur (37).

Hipotez olarak bu yapı pi elektronların enerji seviyesini düşürür ve tekil

oksijenin geçici olarak bağlanmasına neden olur. Daha sonraki bir noktada viral

replikasyon mekanizmasını bozmak için tekil oksijenleri salıverebilir (37).

B) Hyperisinin Fotodinamik Özellikleri

Son 10 yıl içersinde yapılan bir çok çalışma ile Hy fotodinamik aktiviteleri

açıklanmıştır. Bunlar:

1) Işıkla uyarılan Hy’nin protein kinaz C (PKC) ve diğer büyüme

faktörleri ile uyarılan protein kinazları inhibe ettiği (40),

2) Membran lipid peroksidasyonuna neden olduğu (41),

3) Hücresel glutatyon seviyelerinin düşürülmesine ve süperoksit dismutaz

yükselmesi (42,43),

4) Mitokondriyal fonksiyonun bozulmasına (43),

5) Asetil kolinesterazın erimiş globül formunda çapraz bağlanmaların

oluşmasına (44),

6) α-kristalin merceğin fotooksidasyonuna sebep olduğu gösterilmiştir

(45).

C) Hyperisinin Hücre İçinde Bulunduğu Yerler ve Hücresel Hedefleri

Fizyolojik şartlarda monobazik bir tuz olarak bulunan Hy’in hidroksil (OH)

gruplarını taşıdığı kısımlardan kaynaklanan asiditesi de vardır. Hy tuzları (F, Br, Cr)

11

hücresel lipit membran yapıları tarafından tutulur ve bu yüzden lipofilik iyon çifti

gibi davranır (29). Bu hidrofobik karakter sayesinde hyperisin sitoplazma içinde 2-4

saat kalabilir. Yapılan çalışmalar hyperisinin hücre içinde özellikle endoplazmik

retikülüm ve golgi kompleksinde biriktiğini mitokondrinin ise dışında kaldığı ortaya

çıkmıştır. Hyperisinin hücre içi dağılımının hücre tipinden de etkilendiği kolon Caco-

2 hücrelerinde nükleer membranda toplanmış halde bulunmasıyla anlaşılmıştır (15).

Hyperisin’in hücre içine girişinin enerji gerektirmemesi ve reseptör

bağlanmalarının olmamasından difüzyon veya çözünülürlükle olduğu

düşünülmektedir. Hücre içi lokalizasyonundan dolayı da esas hedeflerinin

membranlar olduğu kabul edilmektedir. Membranlar ışık bağlantılı reaktif oksijen

türleri (ROS) üretilen yerler veya hücresel hedeflerin yakın çevresidir (42,37,46).

Nöronlarla yapılan çalışmada, Hy’in çok yüksek konsantrasyonlarda (20

μM) uygulanması halinde nükleus içinde birkaç bölümde gözlenmiştir (47). Nükleer

lümen dışında izole DNA’da ve oligonükleotidlerle interaksiyona girmiş olduğu,

membran hasarına neden olan ROS üretimi ile DNA hasarına da neden olabileceği

belirtilmiştir (48-50).

D) Hyperisinin bilinen etkileri:

1- Antikanser etkisi

2-Antivirütik etkisi

3- Antidepresant etkisi

1- Antikanser etkisi

Hyperisin bilinen en güçlü doğal fotosensitizerdir. Hyperisinin antikanser

etkisi de bu fotosensitizer özelliğinden kaynaklanmaktadır. Fotodinamik terapi

(PDT) kanser tedavisi için kullanılan yeni ve umut verici yöntemlerden biridir. Hücre

ve organellerin yıkımını ışık aracılığı ile katalizleyen fotosensitizer ajanların

kullanılmasına fotodinamik terapi (PDT) denilmektedir. PDT, tümör hücresi

tarafından tutulan bir fotosensitizer ajan ve bu ajanın absorbsiyon spektrumuna uyan

görülebilir bir ışık dalga boyunu gerektirmektedir. Genellikle fotosensitizerler

oksijenin hazır bulunması ve ışık stimülasyonunun olmasıyla peroksit ve hidroksil

radikallerine dönüşen süperoksit radikallerini üreten (tip I reaksiyonu) veya non-

12

radikal tekil oksijen moleküllerini üreten (tip II reaksiyonu) bileşikler olarak

tanımlanırlar (13, 51).

Antitümöral fotodinamik tedavi bir fotosensitizerin sistemik uygulanmasını

ve tümör lezyonuna görülebilir ışığın dağıtılmasını hedefler. Bunlar sağlandığı

zaman tip I veya tip II reaksiyonları vasıtasıyla reaktif oksijen radikallerinin lokal

üretimi lipid membranlarda zincirleme oksidasyon reaksiyonlarını gerçekleştirerek

tümör harabiyetine sebep olur (52).

Reaktif oksijen radikalleri, hücre metabolizması esnasında meydana gelen

biyokimyasal reaksiyonlarla ortaya çıkan, dış yörüngelerinde bir süre için bile olsa

ortaklanmamış elektron taşıyan atom veya moleküller olarak tanımlanırlar (53,54).

Başlıca oksijen radikelleri:

-Süperoksit anyon radikali (O2˙- ): Oksijen molekülüne bir elektron transfer

edilirse süperoksit anyon radikali (52).

-Hidrojen peroksit radikali (H2O2): İki elektron transfer edilirse hidrojen

peroksit radikali oluşur (52).

-Hidroksil radikali (OH.): Hidrojen peroksit radikali demir (Fe) gibi bir

geçiş metal iyonu ile reaksiyona girerse parçalanıp canlı dokular için daha zararlı

olan hidroksil radikaline dönüşür (52).

- Tekil oksijen (O21): Tekil oksijen gerçekte bir serbest radikal değildir,

ancak serbest radikal reaksiyonları sırasında üretilen bir reaktif oksijen türüdür (52).

Serbest oksjen radikallerinin başlıca endojen kaynakları:

1- NADPH oksidaz, lipooksijenaz, prostoglandin sentetaz gibi plazma

membranı enzimleri ve lipid peroksidasyonu,

2- İntoksikasyon, iskemi, travma gibi durumlara bağlı oksidatif stres,

3- Ksantin oksidaz, triptofan oksijenaz gibi enzimler ve hemoglobin,

4- Mitokondrideki ETS,

5- Nükleus ve ER’de bulunan ETS (sit p-450),

6- Peroksizomlarda bulunan enzimler,

7- Yaşlanma (53).

Eksojen serbest oksijen radikali oluşumuna neden olan kaynaklar:

13

1- İyonize ve non –iyonize radyasyon,

2- Isı, güneş ışığı,

3- Alkol uyuşturucu ve anestezik ilaçlar,

4- Stres: Stres ile kanda katekolamin seviyesi yükselmekte ve oksidasyona

uğraması ile de serbest radikal üretimi artmaktadır (54).

Meydana gelen serbest oksijen radikalleri (ROS) yine hücrede süperoksit

dismutaz (SOD), katalaz (KAT), glutatyon peroksidaz (GSH-Px) gibi antioksidan

enzimlerle veya C vit, E vit, transferin, beta- karoten, seruloplazmin, meletonin gibi

enzim olmayan antioksidan maddelerle reaksiyona girerek hücreye zararsız

bileşiklere dönüştürülmektedir. Eğer bir hücrede ROS üretimi yıkımından fazla ise

hücre hasarı var demektir. Hücrelerin membranalarında bulunan poliansetüre yağ

asitleri (PUFA) okside edici serbest radikaller tarafından kolaylıkla

etkilenebilmektedir. PUFA’nın oksidatif hasarı lipid peroksidasyonu olarak

adlandırılır. Lipid peroksidasyonu sonucu hücrede kendiliğinden devam eden zincir

reaksiyonları başlamaktadır (55). Zincir reaksiyonlarının en sonunda üretilen

hidroksialkenoller hücrenin farklı bölgelerine giderek hasar oluşturabilmektedir.

Nükleik asitler ve proteinler serbest radikallere karşı biraz daha dayanıklıdır. Ancak

serbest radikaller DNA’nın çok yakınında meydana gelirse bu molekülü de

kolaylıkla hasara uğratabilir (54).

İn vivo çalışmalarda PDT’yi takiben kan akışında tıkanma, damarsal

kollaps, damar dışına sızıntı gözlenmiştir. PDT, sitokinler ve diğer düzenleyicilerin

salıverilmesine neden olur ve bu da takiben inflamatif bir cevap ortaya çıkar. Çeşitli

tümör hücrelerinin PDT’ye cevabında doku tipi farklılığından ve fotosensitizerin

farklı tutulumundan kaynaklanan farklılıklar vardır (56).

1. PDT ile Hücre Ölüm Mekanizmaları

PDT’nin tümör hücrelerini iki şekilde etkileyip yok ettiği bilinmektedir.

Bunlar: Apipitozis ve nekrozis.

14

1-Apoptozis: Programlı hücre ölümüdür. Biyolojik görevini tamamlamış,

yaşlanmış veya DNA hasarı meydana gelmiş hücrelerin ortada bir iz bırakmadan

yok olmasıdır ( 57).

2-Nekrozis: Fiziksel veya kimyasal bir tahribat sonucu oluşur ve ortamda

bir inflamasyon bırakır (57).

Apopitozisin ekstrinsik veya intrinsik sinyal mekanizmasının işlemesi ile

gerçekleştiği bilinmektedir. Her iki sinyal yolunda da sistein içeren kaspas proteazlar

önemli rol oynamaktadır. Normal halde kaspaslar aktif hallerinden daha uzun bir

zincir içerirler, aktifleşince özel bölgelerinden iki alt birime ayrılırlar. Kaspaslar,

başlatıcılar (initatör) ve uygulayıcılar (efektör) olmak üzere ikiye ayrılmaktadırlar.

Başlatıcı kaspasların (kas-8,9,10) adaptör proteinlere bağlanabilen ölüm zinciri

içeren domainleri vardır. Efektör kaspasların (kas-3,6,7) özel ölüm domainleri yoktur

ve aktifleşince adaptör proteinlerle birleşmezler. Polipolimeraz (PARP), laminler,

topoizomeraz I gibi hücre içi vital substratları parçalarlar (58).

Ekstrinsik yolda mutlaka hücre zarında bulunan Fas, TNFR (tümör nekroz

faktör reseptörü) TRAIL (TNF-related apopitozis induced ligand) gibi ölüm

reseptörlerinin ligandlarınca uyarılması ile sinyal yolu aktiflenir. Uyarılan reseptörün

hücre içinde bulunan ölüm domainine hücre içinde özel adaptör proteinler

bağlanarak aktiflenir ve sonrasında başlatıcı kaspaslar aktifleşir, başlatıcı kaspaslar

efektör kaspasları aktifler ve efektör kaspaslar da vital substratları parçalayarak

apoptozisi gerçekleştirirler (59).

İntrinsik yolda sinyal ya hücrenin genomundan gelir ya da reseptöre

bağlanmaya ihtiyaç göstermeyen ilaç, ışın etkisi ile sağlanır. Eğer DNA hasarı oluştu

ise p53, p21 aracılığı ile siklin/CDK(siklin depended kinaz) inhibisyonu ve mitoz

bloğu sonrasında apopitozis gerçekleşir. İster DNA hasarı olsun ister ilaç etkisi ile

olsun intrinsink yolda proteaz aktivasyonunu başlatan ilk sinyaller mitokondri

üzerinden olmaktadır. Normalde proton ve diğer iyonlar mitokondri iç zarında

elektriksel bir gradient oluşturacak şekilde dağılmıştır. Katyonik lipofilik boyalar

kullanıldığında boya membran içine girerek, membran matriksi boyunca

yayılmaktadır. Apopitozise giden bir hücrede ise transmembran potansiyelinin

düşmesinden dolayı boya girişi azalmaktadır. Bu azalmaya permabiliti transisyon

15

(PT) denilmektedir. Spermin, Bcl-2 gibi proteinler ve Zn (çinko) PT inhibitörü olup

hücreyi apopitozisten korumaktadır (59).

2. Hyperisin’in Neden Olduğu Apoptozis

Hy nedenli apoptozis ilk olarak insan kötü huylu glioma hücrelerinde

tanımlanmıştır. Bu hücreler Hy ve ışığa maruz bırakıldığında DNA fragmentasyonu

ve hızlı bir apoptotik hücre ölümü olduğu gösterilmiştir. Bu olay diğer kanser hücre

türlerinde daha geç meydana gelmiştir. Bu tür Hy aracılı apoptoziste protein kinaz C

(PKC) inhibisyonunun tetikleyici olduğu ileri sürülmüştür (60). Daha sonraki

çalışmalarla Hy etkili apoptozisin sinyalizasyonunda PKC inhibisyonun yeterli

olmadığı ortaya çıkmıştır (61). Apoptozisin gerçekleşmesindeki ekstrinsik ve

intrinsik olmak üzere iki sinyal yolunun da etkili olabileceği, hatta ekstrinsik yol

intrinsik yol arasında bağlantı olan bir yolun da olduğu belirtilmiştir (62). Çeşitli

çevresel uyarılar veya DNA hasarından kaynaklanan uyarılar mitokondri seviyesinde

gelişim programlarını uyararak intrinsik yolu tetikler. Mitokondri iç zarında sit-c ve

diğer apoptotik proteinler sitosole salınır. Sit-c, apaf-1, prokaspas-9, dATP/ATP

apoptozom kompleksinin oluşumu ile kaspas-9 aktive olur. Aktive kaspas-9 da

efektör kaspasların (kas-3,6,7) aktivasyonunu neden olur. Bu kaspaslar da vital

proteinleri parçalayarak klasik apoptotik görünümlerin oluşması sağlar. Gerek

intrinsik gerekse ekstrinsik yolda kaspas proteazlarının aktivasyonu hücreyi

apoptozise sokmaktadır (63).

2- Antiviral Etkileri

Hyperisin ve kimyasal benzeri pseudohyperisin hem laboratuvar hem de

hayvan deneylerinde:

HIV-1 (64), sindbus virüs (18), murin sitomegalo virüs (MCMV) (18),

influenze A, herpes simplex I ve II (65) ve radyasyon lösemi virüsü (rad LV) (66)

gibi virüslerin replikasyonunu inhibe ettiği ve AZT (3-azido-3-deoksitimidin) ve

diğer nükleosid analoglarından farklı bir mekanizma ile bu antiviral etkiyi gösterdiği

ortaya çıkmıştır (18).

16

Hy HIV sinsitiyum oluşumunu bloke (67) etmesine rağmen revers

transkriptaz (RT) aktivitesinde direkt olarak bir değişiklik yapmaz (68).

Hy ile tedavi edilen hücrelerde immatür veya normal olmayan öz yapılar

oluşmaktadır. Bu gag (p24 geni) tarafından kodlanan öncü poliproteinlerin işleyişinin

bloke edildiğini gösterir. Hy’nin ister hücre içinde olsun ister hücre membranına

bağlanmış olsun protein sentezini engelleme yoluyla revers transkriptaz aktivitesini

düşürdüğü sanılmaktadır. gag geni tarafından kodlanan poliproteinlerin klevajı veya

sentezi engellendiğinde viral partiküller oluşamaz. Birleşmiş (assemble) virüs

özyapısı içinde revers transkriptaz muhtemelen proenzim veya inaktif bir enzim

formunu alır. Virüsler tarafından kodlanan proteazlar veya kinazların işe karıştığı

mekanizmalar RT’yi tekrar aktif hale getirebilir. Bu proteaz ve kinazlar

etkilendiğinde RT aktivitesi etkilenebilir. Hyperisin ve pseudohyperisin’nin proteaz

aktivitesini etkilediği sanılmaktadır. Sıra ile değişen proteaz aktivitesi gag tarafından

kodlanan poliproteinlerin sentezi ve klevajının bozulmasına sebep olabilir. Sonuç

olarak immatür viral özyapı oluşabilir (14,69).

Son bulgular bu bileşiğin hem RNA hem de DNA virüslerinden sadece

lipid zarfı olanlara etkili olduğu yönündedir (70,71).

Alternatif olarak Hy viral proteinlere seçici olarak bağlanarak virüs

birleşimi (assemble) için gerekli olan gag ve gag poliproteinlerinin işleyişine engel

olabilir. Bu yüzden Hy RNA’nın viral kapsid içine paketlenmesi sürecinde blok

yapabilir (14). Bazı araştırmacılar Hy’nin gag tarafından kodlanan prekürsör

poliproteinler veya diğer proteinleri bozmak yerine zarflı virüslerle direkt etkileşime

girerek infeksiyöz virüsü lize ettiğini savunmaktadırlar (72).

Özetle:

1- Zarflı virüslerin lipid olan zarf yapısı direkt olarak hyperisin tarafından

parçalanır, antijenik özelliğini kaybeden virüs inaktive olur (72).

2- Hyperisin proteaz aktivitesini etkileyerek gag tarafından poliproteinlerin

klevajlanması ve sentezine engel olarak veya bu ptoteinlere bağlanarak viral

nükleikasidin özyapı içine paketlenmesini engelleyip bozuk veya immatür özyapı

oluşumuna sebep olur (72).

17

3- Antidepresan Etkileri

Hypericum perforatum bitkisi antik çağlardan beri antidepresan özellikleri

için kullanılmaktadır. Eski Yunan kültüründe bu bitkinin özellikle kötü ruhları

kovduğuna inanılırmış (20).

Tarih boyunca insanlar H. perforatumu ruhsal sıkıntı, hafif depresyon,

yorgunluk, bitkinlik tedavisi için kullanmışlardır. Bu bitkinin günümüz tıbbında

bilinçli bir şekilde kullanılması tesadüf değildir. Geçmiş bugüne ışık tutmuştur (20).

Hypericum ekstrakları antidepresif etkilerinin bitkinin hangi bileşeni

tarafından gerçekleştiği tam olarak belli olmamakla birlikte hypersin’nin de bu etkide

önemli rol oynadığı sanılmaktadır (73,74).Hypericum ekstrakları son zamanlarda

dünyanın her yerinde özellikle de Almanya, diğer Avrupa ülkelerinde ve Amerika’da

antidepresan olarak doğal, güvenli ve daha az yan etkiye sahip olduğu için geleneksel

antidepresanlara tercih edilmektedir (75). H. perforatum’dan hazırlanan antidepresan

etkisi kanıtlanmış ekstraklar Tablo 2’de verilmiştir.

Tablo 2: Hypericum perforatum’un antidepresan etkisi kanıtlanmış extraktları.

Extraktlar Kaynaklar

Hyperisin (76)

Total ekstrakt (77)

Total ekstrakt fraksiyon II (77)

Total ekstrakt fraksiyon IIIc (77)

ZE117 (78)

LI160 (79)

Hyperiforce ® (80)

Jarsin 300 ® (81)

® işaretli olanlar ticari ürünlerdir.

18

H. perforatum ekstraktının beyinde etkilediği yerler:

Diensefalon (82)

Serebal korteks (82 )

Prefrontal kortex (83)

Lokus serulus (84)

Hipokappus (85)

Hipotalamus (85)

Etki mekanizması

H. perforatumun serotonin norepinefrin ve dopamin geri salımında blokaj;

serotonerjik ve dopaminerjik reseptörlerin yoğunluğunda bir artma; ayrıca MAO

inhibisyonu gibi geleneksel antidepresanların etkilerine benzer etkiler gösterdiği

düşünülmektedir (86,87).

Araştırılmakta olan birkaç teori olmasına rağmen bir çok depresyon çeşidini

tedavi kabiliyeti olan H. perforatum ’un nasıl işlev gördüğü açık değildir.

Bir teoriye göre H. perforatum monoaminoksidaz (MAO) ve katekolamin

metil transferaz (COMT) enzimlerini inhibe etmektedir (88). MAO kaynağı tiramin

oksidaz olan vücudun değişik yerlerinde ve beyinde sinaptik aralıkta dopamin,

noradrenalin, serotonin, gibi primer ve sekonder aminlerin terminal fazında

aminoalkol grubunun yıkımını sağlayarak nöromedyatör etkinliği baskı altında tutan

mitokondrial bir enzimdir (89).

Diğer bir teori serotonin ve norepinefrin nörotransimiterlerinin seviyesini

yükselmektedir. Bunu SSRI (selective serotonin re-uptake inhibitors)’lar ve SNRI

(selective norepinephrine re-uptake inhibitors)’lar serotonin ve norepinefrinin geri

salınımını engelleyerek sinaptik aralıktaki etki süresi ve sayısının artışını sağlayarak

yaptığı ileri sürülmüştür (90).

Bir diğerine göre ise H. perforatum ekstraktı stres hormonu kortizolün

seviyesini düşürür veya beyindeki gama amino bütirik asit (GABA) reseptörlerini

etkiler. GABA beyin ana inhibitör mediyatörüdür (91).

19

Bahsedilen teorilerden sonra bu etkileri yapan bileşiklerinin hangisi veya

hangileri olduğu sorusu akla gelmektedir ki bu konuda çelişkili raporlar mevcuttur

(92). Çalışmalar sürmektedir.

2.1.3.2. Hyperforin

Bir floroglusindir. Sedatif etkisi vardır. Hyperforinin antibiyotik etki

gösterdiği de savunulmuştur (12).

Şekil 3: Hyperforinin aromatik görünümü (35).

20

2.2. Kardeş Kromatid Değişimi (KKD)

Kardeş kromatid değişimi (KKD), DNA replikasyonu sırasında kardeş

kromatidler arasında özdeş segmentlerin karşılıklı simetrik yer değiştirmesidir (93).

Bu olay kromozomun her iki kromatidinin birden kırılması ile ortaya çıkmaktadır

(94). KKD’de yeni duplike olmuş kromatid ve eski kendi kardeş kromatidi arasında,

kromozom morfolojisi değişmeden simetrik olarak özdeş segmentlerin değişimi söz

konusudur. KKD memelilerde hücre bölünmesinin normal bir özelliği olarak spontan

meydana gelebilir (95). Her kırık sonrasında devreye giren tamir mekanizmaları,

zaman zaman iki homolog parçanın karşılıklı yer değiştirerek kardeş kromatide

yeniden bağlanması ile sonuçlanmaktadır. Bu değişim sonucunda kromatidlerin

morfolojisinde bir değişiklik ortaya çıkmamaktadır. Olayın moleküler mekanizması

ve biyolojik anlamı tam olarak bilinmemektedir (94).

Günümüzde artık insanların günlük yaşamlarında ve çalışma ortamlarında

genotoksik ajanlara mutajenik ve karsinojenik maddelere maruz kalmadan

yaşamaları mümkün olmamaktadır. Gelişen teknoloji ile üretilen yeni kimyasal

maddeler, ilaçlar, gıda katkı maddeleri, çevreye verilen atıklar, tarımda kullanılan

kimyasal maddeler ve manyetik alan oluşturan elektronik cihazlar, canlıların genetik

yapısında mutasyon oluşturma ihtimali taşımaktadırlar. DNA oluşan hasarı

kromozom düzeyinde tespit etmemizi sağlayan doğrudan metodların birisi de kardeş

kromatid değişimi (KKD) analizidir (24). KKD, DNA’daki çok küçük harabiyetlerin

bile hassas göstergesi olarak kabul edilir. DNA hasarının ve indüklenmiş DNA

tamirinin gösterilmesinde en basit, duyarlı ve kısa zamanda sonuç veren bir yöntem

olarak kullanılmaktadır (25). Vücuttaki total DNA’nın %1’inden daha az bir

bölümdeki kayıp bile KKD ile rahatlıkla tespit edilebilir (93).

Bir çok mitojen ve karsinojen çalışmasında KKD, güçlü bir indikatör tekniği

olarak hizmet etmektedir. Bazı kimyasallarda aynı çalışmada KKD ve KA

(kromozon aberasyon testi) yöntemleri birlikte yapıldığında, KKD yönteminin KA

yönteminden daha fazla hassas olduğu gösterilmiştir (93).

Yapılan çalışmlarda, Bloom sendromu, Ataksi telenjaktazi, Werner

sendromu, Kseroderme pigmentozum, Fanconi anemisi, Cockayne sendromu,

21

Duchenne ve Becker tipi kas distrofilerinde ve down sendromunda KKD değerleri

anlamlı derecede artmış olduğu rapor edilmiştir (96).

2.2.1. KKD’nin Tarihçesi

Mc Clintock 1938-1957 yılları arsında mısır bitkisinin monosentrik halka

kromozomlarının kaybolurken, disentrik halka kromozomlarının oluşumunun

arttığını gözlemiştir (97).

Kardeş kromatid değişimi ilk kez 1957 yılında Taylor ve arkadaşları bitki

mitotik kromozomlarında (Vicia faba ve Bellenalia romana) DNA replikasyonu ve

reğresyonu konusunda yaptığı otoradyografik çalışmalarla gözlemlemiştir (25).

Zakharov ve Egolina 1972’de Chinese Hamster hücrelerinde uzun süreli

kültür kurmuş timin analoğu olan 5-Bromo-2 deoxiuridine (BrdU) ile replike olan

kromozomların morfolojisini incelemiştir (98).

1973 yılında Latt DNA çift sarmalına BrdU bağlandığında, Bisbenzamid

(Hoecst 33258) boyasının fluoresansını azalttığını (99), Perry ve Wolf, 1974 yılında

BrdU’nin kromatin yapısına Giemsa boyasının girişini kısıtladığını göstermişlerdir.

Bu bulgular ışığında yeni bir teknik geliştirerek (Fluoresans boya + Giemsa tekniği=

FPG), otoradyografiye gerek kalmaksızın gösterilebilmişlerdir (97).

Latt’ın 1974’te mitomisin-C’nin KKD frekansında artışlara neden olduğu

(100) göstermesinden sonra günümüze kadar, KKD genotoksisitenin sensitif bir

indikatörü olarak kabul edilmekte ve çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır.

2.2.2. KKD’nin Kullanım Alanları

KKD analizi hem laboratuar hayvanlarında hem de insan populasyonlarında

çalışılabilir. KKD analizi, kültürde replikasyon yapabilen, filogenetik spektrumu

Drozofiladan insana kadar uzanan her hücre hattında yapılabilir. Çin Hamster

fibroblast hatları, Hela gibi insan hücre hatları, deri ve akciğerden alınmış insan

hücreleri, fare, sıçan, tavşan gibi laboratuar hayvanlarının ve insanların lenfosit

kültürleri yaygın olarak çalışılmaktadır. İnsan ve fare amniyotik sıvısında da

çalışılmıştır. Bitki, böcek, balık ve memelilere kadar in vivo KKD indüklenmesi hem

22

fiziksel hem de kimyasal ajanların değerlendirilmesinde kullanılmaktadır (96). KKD,

bireylerde somatik hücrelerde bilinen ya da potansiyel mutajen ve karsinojenlere

maruz kalmanın etkilerini saptamada da kullanılanır (25).

KKD analizi, daha çok çeşitli kimyasalların genotoksik etkilerini

araştırmakta kullanılmakla birlikte, kromozom instabilitesi ile seyreden Bloom

Sendromu ve Fankoni Aplastik Anemisi gibi bazı hastalıklarda da araştırma ve tanı

amaçlı olarak kullanılmaktadır. İn vivo kardeş kromatid değişiminin klinik açıdan

önemini belirten çalışmalarda dengesiz kardeş kromatid değişimi, Duchenne ve

Becker tipi kas distrofilerinin kalıtımında rol oynadığı ortaya çıkmıştır. Bu tür

değişikliklerin duplikasyonlara yol açarak bazı hastalıkların beklenenden farklı

kalıtım yolları izlemesine neden olabileceği bildirilmektedir (94).

2.2.3. KKD Mekanizmaları

Kardeş kromatid değişimi çoğalan hücrelerde spontan meydana gelebilir.

Çeşitli fiziksel ve kimyasal etkenlerle kromozom DNA’sında meydana gelen,

replikasyon esnasında onarılamayan hatalar KKD’nin ortaya çıkmasını ya da

artmasını sağlar. Yani DNA’nın hasarına neden olan pek çok ajanın KKD sıklığını

artırdığı bilinmektedir. Bu nedenle pek çok mutajenik yada karsinojenik etkileri

göstermede duyarlı bir parametre olarak kabul edilir (25).

KKD oluş mekanizması üzerine çeşitli modeller ileri sürülmekle birlikte

KKD’nin moleküler mekanizması henüz tam olarak bilinmemektedir. Şekil 4’de bir

kromozomda oluşabilecek KKD’ler görülmektedir.

23

Şekil 4: Kromozomlarda oluşabilecek KKD’lerin şematik gösterimi (24).

a) KKD oluşumu yok. BrdU iki tam döngü veya iki tam döngünün ilkinde

DNA sentezine girmiştir.

b) Tek KKD oluşumu (→)

c) İki KKD oluşumu

d) Üç KKD oluşumu

e) Sentromerde oluşan KKD

f) Boya kalıntısı veya BrdU’nun DNA ile tam birleşmemesi KKD olarak

sayılmaz.

g-h) DNA sentezi sırasında BrdU’nun iki replikasyon döngüsünden fazla

DNA’ya girmesi, KKD olarak değerlendirilmez.

i) Bir kromatin genişliğinden daha dar olan boyanma KKD olarak

değerlendirilebilir (24).

24

2.2.4. KKD Oluş Mekanizması ile İlgili İleri Sürülen Modeller

a) Taylor modeli: 1957’de Taylor’un çalışmalarında kromozomların

radyoaktif timidin (3 HdTh=3H-deoksi-timidin) varlığında bir defa kendilerini

eşlemelerine ve sonraki replikasyonda da izotopun yokluğunda da kendilerini

eşlemelerine izin verilmiştir. Otoradyografide DNA’nın semikonservatif eşlenmesi

sonucunda, her bir kromozomun sadece bir kromatidinin işaretlendiği görülmüştür.

Bu işaretleme sonucunda kardeş kromatidler arasında simetrik değişmeler gözlenmiş

ve Taylor bunları “kardeş kromatid değişimi”olarak adlandırmıştır (24)(Şekil 5).

Şekil 5: KKD oluşum mekanizması (24).

b) Zakharov-Egolina modeli: Zakharov ve Egolina adındaki araştırmacılar

Çin Hamster hücrelerinde, timinin analoğu olan 5- bromo-2 deoksi üridin kullanarak

kromozom yapısını incelemişler. BrdU’nin yeni sentez edilen DNA’ya girişi

uygulanışını takip eden ilk S sırasında olmaktadır. Replikasyon sırasında timinin

yerine BrdU’ni alan zincir, diğer DNA sırasında replike olur. Timinin analoğu olan

BrdU, replikasyon sırasında DNA’ya girer timinindeki metil grubunun yerini brom

atomunun almasıyla DNA molekülünde oluşan bir seri fiziko-kimyasal değişikler

sonucu, ikincil grupların şekillenmesinde güçlüklere sebep olur (98) (Şekil 6).

25

Şekil 6: Timinin ve BrdU’in halkasal yapısı (98).

Bu durum BrdU’nin çift sarmal DNA yapısına girmesinin kromozom

spirilizasyonunu geçiktirdiğini çok küçük morfolojik değişikliklere neden

olabileceğini göstermektedir. Zakharov ve Egolina tarafından spirilizasyon

gecikmesi olarak tanımlanan bu olayda, spirilizasyondaki bu gecikmenin, BrdU

varlığına ve yoğunluğuna, bu ajanın hangi fazda kromozom yapısına girdiğine ve

mitozlar arasındaki zaman süresine bağlı olduğunu bildirilmektedir (98).

Buna göre, eğer kromozom spirilizasyonundaki gecikme, gerçekten BrdU’in

DNA’ya girmesine bağlı ise, ikinci hücre siklusundaki tüm metafazlar giemsa ile

boyandıklarında, üç farklı morfolojik yapı görülecektir (98) (Şekil 7).

26

Şekil 7: BrdU varlığına bağlı spirilizasyon gecikmesi (98).

Her iki replikasyonda veya mitozda ortamda BrdU bulunması halinde

kromatidlerden birinin, her iki DNA zincirinde BrdU bulunur, diğer kromatidinin ise

yalnızca bir zincirinde BrdU, diğerinde timinin yer alır ve her iki kromatidde de

spirilizasyon gecikmesi gözlenir. Yalnız, iki DNA zincirinde de BrdU bulunduran

kromatidde spirilizasyon gecikmesi daha fazla olacağından diğerinden daha uzun ve

daha soluk boyanacaktır (Şekil 7a). Yalnız ikinci replikasyon ortamında BrdU

bulunması durumunda kromozomun her iki kromotidinde eş zamanlı spirilizasyon

gecikmesi olacak, ama kromozomlar aynı boyanacaktır (Şekil 7b). Her iki

replikasyon siklusunda ortamda BrdU bulunmaması veya sadece birinci replikasyon

siklusunda ortamda Brdu bulunması durumunda spirilizasyon gecikmesi görülmez,

morfolojik değişim oluşmaz ve normal boyanır (Şekil 7 d-e) (98,100).

Kromozom morfolojisindeki bu farklılıklar DNA replikasyonunda farklılığa

ve belki de genetik aktivitede değişikliklere neden olabilir (92). Kromatidlerdeki bu

uzunluk farkı, protein ile BrdU içeren DNA arasındaki etkileşimin farklı olması

nedeniyle ortaya çıkmaktadır. Proteinler kromozomların kondenzasyonda ve

spirilizasyonunda etkili olmaktadır. Proteinler BrdU içermeyen DNA’dan daha sıkı

bağlanmakta ve kromozomların spirilizasyonunu ve yoğunlaşmasını

27

zorlaştırmaktadır. BrdU’nin kromozomlardaki esas etkisinin paketlenme esansında

olabileceği de belirtilmiştir (101).

c) Evens isimli araştırıcının öne sürdüğü KKD oluş modeli: Yalnızca

replikasyon süresince mevcut etkenlerin KKD’leri ortaya çıkarabildiğini, bu nedenle

değiş tokuşun replikasyon çentiğinden başlaması gerektiği ileri sürülmüştür. KKD

oluşumunun bir kromatid üzerinden yeni sentezlenmiş zincir ile onun kardeşinin

atasal zinciri arasında değiş-tokuşu içerdiğini, bu esnada zincirlerden birinde veya

her ikisinde kırığın gerçekleştiğini öne süren bir modeldir (25)(Şekil 8).

Şekil 8: Evens isimli araştırıcının ileri sürdüğü KKD oluş mekanizması (25).

1- G1 evresinde timin yerine BrdU içeren DNA ve S evresinde sentezlenen

DNA’da herhangi bir etkenle hata oluşması.

2- 3- BrdU varlığında S evresinde ikinci replikasyon devam ederken hatalı

bölgeye gelindiğinde bir veya her iki zincirde kırılmalar meydana gelmektedir.

4- Hatanın çıkarılması, ancak kırık zincirlerin birbiri ile değil, kardeşleri ile

birleşmeleri sonucunda zincirler arasında değiş tokuş meydana gelmesi.

5- Replikasyon tamamlandığında molekülde, her iki zincirde de timin ve

BrdU içeren bölgeler ortaya çıkması.

6- Her iki zincirde de BrdU içeren bölgelerin soluk, timin içeren bölgelerin

koyu boyanması ve oluşan KKD’lerin gözlenmesi (102).

28

d) Loveday ve Latt isimli araştırmacıların ileri sürdüğü model: 1981

yılında Loveday ve Latt isimli araştrıcılar Potter ve Dressler’in önerdiği modelden

yola çıkarak yeni bir model öne sürmüşlerdir. Bu modele göre kalıp DNA’dan

komplementer olarak timin yerine BrdU’in girdiği tamamlayıcı DNA zinciri

sentezlenir. Her bir çift sarmalda tek zincir kırığı oluşur ve bir dupleksteki bir zincir

ile diğer dupleksteki DNA’nın tamamlayıcısı, kardeş zinciri arasında krosingover

gerçekleşir. Rekombinasyon sonucu hem timin, hem de BrdU’in yer aldığı

heterodupleks zincirler oluşur. DNA’nın krosingover noktası etrafındaki rotasyonu

ile X formu meydana gelirken, kırıklar oluşur ve kırılan zincirler birbiri ile değil,

kardeş zincirlerin parçaları ile DNA ligaz ile birleştirilerek her iki zincirde BrdU ve

her iki zincirde timinin içeren 2 rekombinant yapı oluşur. Her iki zincirde BrdU

içeren bölgeler soluk, her iki zincirin de timin veya bir zincirinde BrdU, diğerinde

timin içeren bölgelerin koyu boyanması ile KKD değerlendirilir (99) (Şekil 9).

29

Şekil 9: KKD oluş mekanizması (99).

2.2.5. KKD Yöntemini Etkileyen Faktörler

1- Biyolojik Faktörler

Başta genetik faktörler olmak üzere yaş, cinsiyet, hastalıklar, diyet, ilaç

kullanımı, alkol ve sigara alışkanlığının KKD sıklığını etkilediği belirtilmektedir

(101-103). Sigara kullanımının KKD sıklığını artırdığı yapılan bir çok çalışmayla

kanıtlanmıştır (104).

30

2- Kültür Koşulları ile İlgili Faktörler

a) BrdU konsantrasyonu: BrdU toksik sınırlar dışında yüksek dozda hücre

kültürüne eklenirse, mitotik indekste azalmalara ve KKD frekansında umulandan

fazla artışlara neden olmaktadır. BrdU konsantrasyonu %10 artırıldığında KKD

frekansının %50 artığı gösterilmiştir (102).

b) Sıcaklık: Kültür ortamının optimum sıcaklık 37 oC olup 36-38 oC

aralığına tekabül eder. Sıcaklığın geçiçi düşmesi hücreleri öldürmez gelişimlerini

duraklatıp hasat zamanını geçiktirirken sıcaklık 39 oC’nin üzerine çıkarsa hücreler

ölür (94).

c) Besiyeri: Farklı besiyerinde üretilen insan lenfositlerinin KKD sıklığının

farklı olduğu gözlenmiştir (102).

d) Antibiyotik: Kültür ortamında antibiyotik kullanılması KKD sıklığını

azaltır (102).

e) Serum: Besiyerine konulan serumun konsantrasyonu KKD oluşumunu

etkiler (102).

f) Mitoz Uyarıcı: Günümüzde in vitro koşullarda kullanılan mitotik ajanla,

TTP (tüberkülin pürifiye protein), tetenoz ekstresi, konkavanalin A, PWM

(prokeweed mitojen) ve PHA (fitohemaglutinin)’dır. PHA, barbunya fasulyesi

(phaseolus vrilganis) ekstrası olan bir mukopolisakkarittir. En çok kullanılan

PHA’nın işlergesi bilinmemekte olup indüksiyon sürecinin ilk 24 saatinde gereklidir.

Kültürde ilk 24 saatten sonra RNA sentezini artırır. İkinci 24 saat süresince çekirdek

genişlemekte ve DNA sentezi başlamaktadır (94).

g) Kültür Süresi: İlk mitoz 48 saatte gözlenir. Her 24 saatte bir mitoz dalgası

gerçekleşir. Bu nedenle hasat 72. saatte veye 96. saatte yapılır. Rutin amaçlı

kültürlerde önerilen süre 72 saattir (94).

h) Karanlık Ortam: Hücrelerin kültüre edildiği sürece flourans ışığa maruz

kalmaları BrdU içeren DNA’nın fotolizine neden olarak hareketli alkali gruplarının

oluşumuna neden olur. Bu oluşum guanin ile reaksiyona girerek DNA’nın depürine

olmasına ve bu da tek sarmalda kırılmalara neden olarak KKD’nin oluşumunu

31

indükler. Bu neden KKD analizi için kullanılacak kültürlerin ışıktan koruması

gerekir. (94)

i) Kolşisin Konsantrasyonu: Mitozu metafazda durdurmak için mekik

inhibitörleri kullanılır. Kolşisin de bunlardan biridir ve 10 μg/ml olacak şekilde

hazırlanır. Kolşisinde bırakma süresi ile metafaz indeksinin sayısı birbiri ile

orantılıdır. Fakat uzun süre bırakmalarda kromozom boylarında kısalma gözlenir. Bu

nedenle süre iyi ayarlanmalıdır (94).

j) Hipotonik solüsyon: Hipotonik çözeltilerin yoğunluğu hücre plazma

yoğunluğundan az olduğundan hücreler içine su alır, şişer ve eritrositlerin çoğu

patlar. Hipotonik uygulaması kritik bir zamanı gerektirir. Kolşisinin etkisini

sonlandırıp kromozomların dağılmasını sağlar. Hipotonik çözelti olarak % 1’lik

sodyum sitrat veya 0,075 M KCl kullanılabilir. Kromozomda en az hasar yaptığından

en çok kullanılan hipotonik çözelti KCl’dir (94).

k) Fiksasyon: Fiksasyonda 3:1 alkol ve glasiyal asetik asit oranı önemlidir.

Asetik asitin fazla olması hücrelerin erken yırtılmasına neden olur. Bu da kromozom

kayıplarına yol açar. Kan kültürlerinde ilk fiksasyonda karıştırma çok önemlidir,

kalan eritrositler hemoliz olur. Kırmızı renkli hemoglobin koyu kahve renkli

hematine dönüşür. Yeterli karıştırma yapılmazsa koyu kahve renkli çökeltiler

gözlenirken mitotik indeks düşer ve kalitesiz preperatlar elde edilir (94).

32

3. MATERYAL VE METOD

3.1. Materyal

3.1.1. Kimyasallar

Fitohemaglutinin (Biologcal Industries BI12-006-1H), Fetal calf serum

(Biologcal Industries BI04-001-1B), Leguamine 25.000IU (Roche HEP-5), RPMI

1640 Medium (Biologcal IndustriesB101-106-1B), Bis Benzimide 15090 (Serva

II33258), Giemsa (Merck 109204), Potasyum dihydrogen phosphate (KH2PO4,

Merck 104873), Di-sodium hydrogen phosphate anhydrous (Na2HPO4.2H2O,

Merck 106586), Colchicine (Serva), Penisilin/Streptomisin (Irvine Scientific), L-

Glutamin (Irvine Scientific ), 5-Bromo-2 deoxyuridine (Sigma), Asetic asit glacial

(Merck), Methanol (Merck), Potasyum chloride (KCl) (Merck), PBS tablets

(phosphate buffered saline, amresco E404-100TABS), Hypericin 1 mg (Sigma),

Dimetilsülfoksit (Sigma).

3.1.2. Diğer Malzemeler

Kapaklı falkon tüp (greiner), cam pastör pipeti 3 ml (Isolab), lam (rodajlı

Superior marienfeld ), plastik pastör pipet 3ml’lik (disposebl), 5cc’lik enjektör,

plastik pipet, şale, balon joje, beher, etüv, benmari, santrifüj, vortex.

3.1.3. Deney Gruplarının Oluşturulması

Deney, Süleyman Demirel Üniversitesi Tıbbi Biyoloji Sitogenetik

laboratuvarında yürütülmüştür. Kan örnekleri 10 (5 bayan ve 5 bay) gönüllü, sağlıklı,

sigara kullanmayan bireyden alındı. Birbirine bağlı üç grup oluşturuldu: Grup 1

(kontrol grubu), grup 2 (5μM hyperisin), grup 3 (10 μM hyperisin) (33). Her bireye

ait kan örneğinden 3 ekim yapıldı.

33

3.2. Metod

3.2.1. Hücre Kültürlerinin Kurulması

5 cc’lik heparinli enjektörlere yaklaşık 5 cc periferel kan örnekleri alındı.

Besiyeri hazırlanması:

100 ml RPMI 1640 Medium (Biological Industries,BİO1-106-1B)

2 ml L-glutamin (Biological Industries,BİO4-001-1B)

2 ml penisilin-streptomisin (Biological Industries,BİO12-006-1H)

3,3 ml fitohemaglutinin (Biological Industries,BİO3-031-1B)

30 ml fetal bovin serum (Biological Industries,BİO3-020-1B) karıştırılır.

Fitohemaglutinin hazırlanması:

Ticari olarak 5 ml gelen fitohemaglutinin 5 ml RPMI 1640 Medium ile

sulandırıldı.

Fetal bovin serumun hazırlanması:

Fetal bovin serum çözdürüldükten sonra 65 oC’de 1 saat inaktive edildi.

Hyperisinin çözülmesi:

1 mg’lık toz Hyperisin (Sigma), 2 ml DMSO (dimetilsülfoksit) ile ışık

geçirmeyen kendi ambalajında çözüldü (105). Sonra distile-noniyonize su ile 10

ml’ye tamamlandı. Işık geçirmeyen cam şişe içersinde –20 oC’de saklandı.

5-Bromo-2 deoxyuridine (BrdU) solüsyonunun hazırlanması:

15,37 mg BrdU (Sigma, B5002) 10 ml distile su ile çözüldü, filtre edildi.

Steril ağzı kapaklı bir tüp içersinde üzeri aluminyum folyo il sarılıp +4 oC’de stok

olarak saklandı.

34

İşlemler:

Hazırlanan besiyerinden plastik ağzı kapaklı konik santrifüj tüpüne kontrol

için 9 ml üzerine 1 ml kan ilave edildi. Deney grularında da aynı işlem yapılıp

hyperisin dozlarının da eklenmesi ile toplam hacim 10 ml’ye tamamlandı.

Bütün tüpler alt-üst edildikten sonra 0,1 ml 5-Bromo-2 deoxyuridine (BrdU)

stok solüsyonu eklendi. Tüplerin üzeri aliminyum folyo ile kapatıldı. Tüpler yavaş

vortekslendi. Tüpler 37 oC’ye ayarlanmış etüve 45 derecelik açı ile kondu. Her gün

sabah tüpler alt üst edildi. 70. saatte tüpler etüvde çıkarılıp 2 damla kolşisin (2’lik

enjektörle) damlatıldı. 1 saat 10 dakika 37 oC ye ayarlanmış etüvde bekletildi.

3.2.2. Kromozom Eldesi

Hipotonik solüsyonun hazırlanması:

0,075 M KCl (Merck 4935) olacak şekilde 0,56 gr tartılır distile su ile 100

ml’ye tamamlanır. Kullanımdan en az 1 saat önce hazırlanır ve 37 oC de bekletilir.

Fiksatifin hazırlanması:

Bir kısım glasial asetik asit 3 kısım metanol (30 ml GAA+90 ml metanol)

karıştırıldı.

Lamların hazırlanışı:

Lamlar önce distile sudan geçirilip şaleye yerleştirilir, yarıya kadar distile su

ile doldurulup üstüne alkol ile tamamlanır. Kullanılacağı gün sabah alkol boşaltılıp

distile su konur. Uygulama sırasında buzlu şale içersinden alınarak kullanılır.

İşlemler:

Kromozom preperasyonu için modifiye Moorheard ve arkadaşlarının tekniği

uygulandı (105). Süre bitiminde tüpler 1200 rpm de 10 dak. santrifüj edildi.

Süpernatan kısım atıldı. Sonra tüpler bir taraftan vortekslenirken bir yandan da

hipotonik yavaş yavaş 6 ml çigisine kadar üzerine ilave edildi. Biraz daha

vortekslenip 37 oC ye ayarlanmış etüvde 1 saat bekletildi.

Süre sonunda tüpler 1200 rpm de 10 dak. santrüfüj edildi, süpernatan kısmı

1,5-2 ml kalıncaya kadar atıldıktan sonra tüpler vortekslendi ve vortekslenirken

fiksatif pipet ile tüpün kenarından ilave edildi. İlk uygulamada tüpte bir renk

35

değişimi gözlendi (eritrositler patlayıp hemoglobin açığa çıktığı için) koyu

kahverengi siyah bir görümün aldı. Fiksatif 6 çizgisine kadar ilave edildi. İlk fiksatif

uygulamasından sonra tüpler –18 oC de bekletildi. Diğer fiksatif uygulamalarında

bekletmeye gerek yoktur. Tüplerdeki renk berrak oluncaya kadar önce santrifüj sonra

fiksatif uygulandı. Genellikle 3 –4 uygulamadan sonra istenilen renk elde edildi. Son

fiksasyondan sonra santrifüj edilip süpernatan kısım atılarak 1,5-2 ml bırakıldı ve

cam pastör pipetlerle birkaç kez pipetaj yapıldı. En az bir gün önceden şale içine

hazırlanıp -18 oC’ye konulan lamlar buzlu şale içersinden çıkarıldı (lamların soğuk

olması gerekir). Pipetlere çekilen homojenat önce 45 derece eğimli tutulan lama

mümkün olan en yüksek mesafeden damlatıldı. 15 damladan sonra bu eğim kaldırıldı

lam düz tutularak 15 damla daha damlatıldı. Aynı şekilde her bir örnekten paralel

ikinci lam da yayıldı. Yayılan lamlara isim ve tarih yazılarak ya 24 saat 65 oC’de ya

da 3 gün 37 oC’de bekletilerek yaşlandırıldı.

3.2.3. Kardeş Kromatid Değişimi Boyama Tekniği

Korenberg ve arkadaşlarının önerdikleri modifiye boyama yöntemi

kullanıldı (106).

Kullanılan Solüsyonlar:

2xSSC solüsyonu:

0,87 gr sodyum sitrat (0,03 M Mecrk,104873) ve 0,44 gr sodyum klorür

(0,3 M Merck,106404) 100 ml bidistile suda çözüldü .

PBS solüsyonu:

5 adet PBS tablet ( amresco AIE 404-100)) 500 ml distile suda çözüldü. 100

ml ,100 ml ve 99 ml şeklinde şalelere hazırlandı geri kalan da balon jojede bırakıldı

(UV’de kullanmak için).

Bis Benzimide (hoechst) stok solüsyonu: 0,5 mg Bis Benzimide (Serva,

15090) tartıldı ve 20 ml deiyonize suda çözüldü +4 oC’de saklandı.

36

Söranson tamponu:

A solüsyonu: Potasyum dihydrogen phosphate (KH2PO4, Merck 104873) 4,

537 gr 500 ml distile suda çözüldü.

B solüsyonu: Di-sodium hydrogen phosphate anhydrous (Na2HPO4.2H2O,

Merck 106586) 5,936 gr 500 ml distile suda çözüldü. Balon jojeye A solüsyonundan

alınarak pH 6,8’e gelinceye kadar B solüsyonu eklendi.

Giemza boya solüsyonu:

3 ml Giemsa (Merck 109204) + 97 ml Söranson tamponu 100 ml’ye

tamamlandı.

İşlemler:

Preperatlar,

- 100 ml PBS solüsyonunda 5 dakika bekletildi.

- 9 ml PBS solüsyonu + 1 ml Bis Benzimide’de 20 dakika bekletildi.

- 100 ml PBS solüsyonunda çalkalandı.

- preperatlar tepsiye dizildi geri kalan PBS üzerine döküldü ve UV altıda 25

dakika bekletildi.

- Distile suda çalkalandı.

- 2xSSC solüsyonunda (benmaride) 15 dakika bekletildi.

- Distile suda çalkalandı.

- Giemza boya solüsyonunda 20 dakika bekletilerek boyandı.

- Distile suda çalkalandı.

- Son olarak preperatlar kurutma kağıdı ile kurutuldu. Mikroskopta

immersiyon yağı ile 100’lük objektifle incelendi.

3.2.4. KKD’nin Değerlendirilmesi

Her birey için iyi dağılmış 20 metafazdaki KKD oranları 100X’lik

mikroskop (Olimpus) altında incelendi. Birli, ikili, üçlü ve dörtlü değişimlerdeki

37

kırık noktaları gözlendi, her bir metafazdaki toplam değişim değeri belirlendi ve her

birey için 20 metafaz değerlendirilerek değişimlerin ortalaması alındı.

3.2.5. İstatistiksel İşlemler

Kontrol grubu ve vaka gruplarının her bir bireyi için KKD ortalamaları

alındı. Kontrol grubu ile vaka grupları KKD değerleri Paired-t Testi kullanılarak,

istatistik açıdan değerlendirildi. İstatistik analizler SPSS for Windows istatistik

programı ile bilgisayarda yapıldı. İstatistik analizlerde p<0,05 anlamlı kabul edildi.

Değerler, ortalama ± standart sapma olarak verildi.

3.2.6. Fotoğrafik İşlemler

Tezde üç gruba ait önreklerden kaliteli olan birkaç mefazın 100X objektifle

immersiyon yağı altında Zeis marka mikroskop ve Canon marka digital fotograf

makinesi kullanılarak fotografları çekildi.

38

4. BULGULAR

Türkiye genelinde yaygın olarak yetişen özellikle de Isparta yöresinde

kantaron otu olarak tanınan bu bitkinin çiçeğinin zeytinyağı içerisine katılarak

güneşte bekletilip elde edilen karışımın folklorik olarak haricen yara iyileştirici,

dahilen sindirim sistemi hastalıkları için kullanıldığı bilinmektedir. Bu çalışmamızda,

H. perforatum bitkisinin aktif maddesi olan hyperisinin insan lenfosit kültürlerinde

KKD sıklığına olan etkisi araştırıldı.

Gönüllü ve sağlıklı (son 6 ay içinde radyasyon almamış, herhangi bir

sistemik hastalığı olmayan, herhangi bir ilaç, sigara ve alkol kullanmayan) yaşları

23-30 arasında kadınlarda ortalama 26.8 ± 2.9, erkeklerde 25.4 ± 2.5 olan 5 erkek

5 kadın toplam 10 kişiden alınan kan örnekleri her grup için bir adet olmak üzere 3

ekim yapıldı. Birici grup kontrol grubu olarak seçildi. İkinci ve üçüncü gruba

hyperisinin’nin farklı iki dozu (5 μM/L ve 10 μM/L) uygulanarak KKD sıklığı

değişimi araştırıldı.

Çalışılan gruplara ait preperatlarda ortalama 20 metafazda sayım

yapılmıştır. Her olgu için metafazlarda 1’li, 2’li, 3’lü ve 4’lü kırıklar sayılmış KKD

değeri olarak kaydedilmiştir.

Grup I için KKD ortalama 6.5 ± 1.2 , grup II ortalaması 7.2 ± 0.9 grup III

için 8.2 ± 0.4 bulunmuştur (Tablo 3). Grup I ile grup II arasındaki fark istatistiksel

olarak anlamsız bulunurken grup I ile grup III arasındaki arasındaki fark Paired-t

testine göre anlamlı bulunmuştur (p<0,05).

Tablo 3: Gruplar arasındaki KKD değerleri

Gruplar

N KKD ortalama ±ss

Grup I (kntrol grubu) 10 6.5 ± 1.2 Grup II (5 μM/L Hy) 10 7.2 ± 0.9 Grup III (10 μM/L Hy) 10 8.2 ±0.4

ss: standart sapma N: Birey sayısı

Ayrıca grup I ve II KKD karşılaştırması grafik 1’de, grup I ve grup III KKD

karşılaştırması grafik 2’de, grup II ve III karşılaştırması da grafik 3’te gösterilmiştir.

39

Grup I ve II

6

8,37,76

7,2

6,15,8

7,35

8,25

6,056,5 6,4

5,95,85

4,47

7,65

6,46,61

8,98,3

7,83

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Bireyler

KK

D o

rtal

aması

Grup I

Grup II

Grafik 1: Grup I ve II’nin KKD değerlerinin karşılaştırılması.

40

Grup I ve III

7,65

4,47

5,85 6 5,9

8,25 8,3

6,056,5 6,4

7,768,4 8,6

7,9

8,95

7,66 7,88,37,83

8,45

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Bireyler

KK

D o

rtal

aması

Grup I

Grup III

Grafik 2: Grup I ve III’ün KKD değerlerinin karşılaştırılması.

Grup II ve III

7,2

6,15,8

8,3

8,9

8,4 8,6

7,9 7,8

8,3

7,83 7,767,35

6,61

6,4

7,83 7,76

8,45

8,95

7,66

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Bireyler

KK

D o

rtal

aması

Grup IIGrup III

Grafik 3: Grup II ve III’ün KKD değerlerinin karşılaştırması.

41

Tüm gruplarda kadın ve erkek KKD ortalamalarını karşılaştırıldığında grup

I, grup II, grup III’de erkeklerin KKD oranları kadınlardan yüksek bulunmuştur

(Tablo 4). Grup I ve II’deki fark istatisitksel olarak anlamlı (p<0,05) iken grup

III’deki fark anlamsız bulunmuştur.

Tablo 4: Kadın ve erkek KKD değerleri

CİNSİYET

Grup I

KKD

ortalaması ± ss

Grup II

KKD

ortalaması ± ss

Grup III

KKD

ortalaması ± ss

Kadın (N:5) 5.9 ± 1.1 6.9 ± 0.9 8.1 ± 0.4

Erkek (N:5) 7.1 ± 1.1 7.5 ± 1.1 8.2 ± 0.5

ss: standart sapma N: Birey sayısı

42

Resim 1: Grup I’e ait bir metafaz örneği.

Resim 2: Grup II’e ait metafaz örneği.

43

Resim 3: Grup III’e ait bir metafaz örneği.

44

5. TARTIŞMA VE SONUÇ

H. perforatum bitkisinin en önemli bileşeni hyperisinin antitümör, antiviral

etkileri bilimsel bir gerçektir. Hy’nin bu özellikleri fotosensitizer özelliklerinden

kaynaklandığı yapılan çalışmalarla ortaya çıkarılmıştır (107). PDT kanser

tedavisinde son zamanlarda sık kullanılan bir yöntemdir. PDT’de doğal fotosensitizer

olarak Hyperisin tercih edilmektedir (52). Hy’nin antitümör etkisi in vivo ve in

vitroda meme (46), kolon (115), glioma (60), prostat (5), tiroid (33), nazofarenks

(18,108,17), özafagus (18) kanserlerinde çalışılıp etki mekanizması araştırılmıştır.

Antiviral etkileri 1988’den sonra çok çalışılmış ve Hy’nin sadece zarflı virüsler ve

retrovirüslere etki ettiği ve bu etkinin ışık uygulandığı zaman ortaya çıktığı

belirtilmiştir (14). HIV tedavisi için kullanılabilirliği için çeşitli araştırmalar

yapılmıştır. Etki mekanizmasının tam açıklanamaması, AIDS hastalarına sistemik

uygulamasında görülen fototoksititeden (109) ve klinik uygulama azlığından dolayı

tedavide kullanım için daha çok erken gözükmektedir.

Hy ışıkla aktive olduktan sonra tümör hücrelerinde apopitozis ve nekrozise

yol açmaktadır. Apopitozisin ekstrinsik veya intrinsik sinyal mekanizmasının

işlemesi ile gerçekleştiği bilinmektedir. Her iki sinyal yolunda da sistein içeren

kaspas proteazlar önemli rol oynamaktadır (19). Ekstrinsik yolda mutlaka hücre

zarında bulunan Fas, TNFR (tümör nekroz faktör) gibi ölüm reseptörlerinin

ligandlarınca uyarılması ile sinyal yolu aktiflenir. Hy aracılı apoptoziste protein

kinaz C (PKC) inhibisyonunun tetikleyici olduğu görüşü extrinsik sinyal yolunun

etkili olabileceği fikrini desteklemektedir. İntrinsik yolda sinyal ya hücrenin

genomundan gelir ya da reseptöre bağlanmaya ihtiyaç göstermeyen ilaç, ışın etkisi

ile sağlanır (15,19). Hyperisinin hücre kültürlerine eklendiğinde 3,5 saatte nükleus

içinde biriktiği, hatta hücre DNA’sının pürinlerinin 7. azotu ile etkileşime girdiği

belirlenmiştir (110). Bu da Hyperisinin genom üzerinden mitoz bloğu oluşturduğu

ve apopitotik sinyallerin genomdan gelebileceği fikrini desteklemektedir. Nitekim

son yapılan bir çalışmada topoizomerz IIα’nın Hyperisin tarafından inhibe edilerek

transkripsiyon ve DNA replikasyon bloğu oluşturduğu ileri sürülmüştür (111).

Hyperisinin düşük dozlarda antiproliferatif etki yüksek dozlarda apopitozisi

indükleyici etki gösterdiği yapılan çalışmalarla ortaya konmuştur (35). Marekova ve

45

arkadaşlarını yaptığı bir çalışmada hipofiz kanserinde At20 / D16v-F2 hücrelerinin

büyümesinin fotoaktif hyperisine bağlı inhibisyonunu araştırılmıştır. Işıkla uyarılarak

aktif hale getirilen hyperisin 4-8 μmol/1 konsantrasyonunda HL-60 hücrelerinin

büyümesini büyük oranda inhibe ettiği, ışığa maruz bırakılmadan uygulandığı zaman

ise inhibisyonun önemsiz derecede gerçekleştiği bulunmuştur. Işıkla aktive edilen

hyperisinin 32 μmol/1 konsantrasyonunda At20/D16v-F2 hücrelerinin

proliferasyonun durduğu, 16 μmol/1 konsantrasyonda bu hücrelerin büyümesinin

inhibe olduğu, 1-8 μmol/1 konsantrasyonunda ışık uygulanması halinde apoptozis

görülmüş, apopitoziste protein kinaz C inhibisyonun rolu olduğu fikri üzerinde

durulmuştur (33).

Hypericum perforatum ekstraklarının Avrupa ve Kuzey Amerikada

menepoz sıkıntıları, ılımlı depresyon belirtileri, premenstüral sıkıntılar, anksiyete,

uykusuzluk tedavisi için kullanımı her geçen gün artmaktadır (20). Antidepresan etki

mekanizması henüz tam açıklığa kavuşturulamamış olan H. perforatum

ekstraklarının serotonin, norepinefrin, dopamin, gama amino bitürik asit (GABA), L-

glutamatın sinoptosomal geri salımını inhibe ederek etki gösterdiği ileri sürülmüştür

(112). Bu konuda araştırmalar devam etmekte olup, antidepresan etkiyi, önceleri

hyperisin bileşiğinin gerçekleştirdiği sanılmış daha sonra bu etkiyi hyperisin,

hyperforin ve flovonoitlerin birlikte yaptığı düşünülmüştür (21). Son yapılan

çalışmalarla antidepresan etkiden hyperisinden çok hyperforin bileşiğinin sorumlu

olduğu fikri ağırlık kazanmıştır (113). Klinik çalışmalar H. perforatum ekstraklarını

günde üç kez, her doz 300 mg (%0.3 hypericin) olmak üzere toplam 900 mg’lık dozu

ılımlı depresyon tedavisi için kullanımı önerilmektedir. Bu dozlarda yan etki ve

fotosensitizasyon görülmediği belirtilmektedir (114).

Hunt ve arkadaşalarının yaptığı çalışmada sebest radikal üretimi ölçülmüş

bir serbest hücre kültürü, bir de insan damar doku hücre kültürü H. perforatum

metanol extraktının farklı konsantrasyonları uygulanmış. 1:1 konsantrasyonda

hücrelerde bir prooksidan etki görülmüş olmasına rağmen 1:10 ve 1:20 gibi düşük

konsantrasyonda uygulanan hücrelerde ise yüksek antioksidan özellik gösterdiği

saptanmıştır. 1:1’in üstündeki bütün dilüsyonlarda süperoksit inhibisyonu ile ilişkili

olan antioksidan özelliklere sahip olduğu ileri sürülmüştür. Bu antioksidan etkinin

hangi bileşenden kaynaklandığı ise anlaşılamamıştır (115).

46

Yapılan literatür araştırmalarında hyperisin maddesinin karanlıkta düşük

toksik etkili olduğu rapor edilmiş (116-118) fakat genotoksik etkisi için hiç çalışma

yapılmadığı belirlenmiştir. Bu çalışmamızda KKD sıklığı analizi kullanıldı. KKD

analizi, DNA’daki çok küçük harabiyetlerin bile hassas göstergesi olarak kabul

edildiği, DNA hasarının ve indüklenmiş DNA tamirinin gösterilmesinde en basit,

duyarlı ve kısa zamanda sonuç veren bir yöntem (26) olduğu için tercih edildi.

Küçük yaşalarda KKD oranı düşük, ergenlik çağında ve ileri yaşlarda normalden

yüksek olduğu bildirilmiş (93), sigara içenlerde içmeyenlerden, alkol kullananlarda

kullanmayanlardan daha yüksek bulunmuştur (103,104). Ayrıca Ataksi Telenjektazi,

Bloom Sendromu, Fankoni Anemisi gibi genetik hastalıklarda KKD oranı normalin

10-13 katı artmaktadır (96).

Çalışmamızda birbirine bağlı üç grup oluşturuldu. Çocuk, adolesan çağında,

yaşlı, hamile veya emziren, sürekli ilaç kullanan ve 6 ay içinde röntgen ışığına maruz

kalmış olan bireylerin KKD ortalamaları değişebileceğinden grup bireylerini sağlıklı

yetişkin bay ve bayanlardan seçildi. KKD sıklığını etkileyecek etmenleri minimalize

etmek için tüm grupların ekimleri aynı anda yapıp değerlendirme işlemi için aynı

mikroskop kullanıldı.

Çalışmamızda birinci grup (kontrol grubu) KKD ortalaması bayanlarda

5,9±1,1, erkeklerde 7,1±1,1 olarak bulunmuştur. Bu sonuçlar birey sayısı az

olmasına rağmen, Akbaş’ın yaş ortalaması 27,9 olan, sigara içmeyen, sağlıklı 25 bay

ve 25 bayanın katıldığı çalışmasındaki (104) bay ve bayan KKD ortalamaları ile

uyumludur.

Hy uygulanan gruplar ve Hy uygulanmayan grup arasındaki KKD oranı

farklılığının hücre kültürüne uygulanan Hy miktarına bağlı olduğu sonucuna varıldı.

Çünkü düşük dozda (5 μM) Hy uygulanan grup ile kontrol grubu KKD oranında

anlamlı bir değişiklik yok iken ve yüksek doz (10 μM) uygulanan grubun KKD

oranında anlamlı bir artış söz konusudur. Bu sonuçlarla, doza bağlı olarak insan

lenfosit kültürlerine Hy uygulamasının ışık uyaranı kullanmadan da genotoksik etki

gösterebileceği gözlenmiştir. Kanser tedavisi için kullanılan Hy dozu çok iyi

ayarlanmalı ve yan etkileri yönünden denekler veya normal hücre kültürleri iyi

47

gözlenmelidir. Bu konuda kesin bir sonuca ulaşmak için daha detaylı moleküler

çalışmaların yapılması gerekmektedir.

H. perforatum yurdumuz Isparta yöresinde geleneksel olarak bir çok

hastalık için tedavi edici olarak kullanılmaktadır. Hazırlanan zeytinyağı

ekstraklarında Hy bileşiğinin standardize edilmeme ihtimali yüksek olduğundan

fototoksik etkileri açısından tehlikeli olabilir. Hy maddesi ve dolayısı ile H.

perforatum ekstraklarının dozunun iyi ayarlanması gerekmektedir. Gelişi güzel

kullanımlar zararlı olabilir.

48

Kantaron Otundan (Hypericum perforatum) Elde Edilen Hyperisin Maddesinin

İnsan Lenfosit Kültürlerinde Kardeş Kromatid Değişimi (KKD) Üzerine Etkisi

ÖZET

Hypericin (Hy) kanser tedavisinde son zamanlarda umut verici bir madde

olarak bilimsel çevrelerce ilgi görmektedir. Bu madde hypericum perforatum

bitkisinden elde edilen doğal fotsensitizer olup fotodinamik terapi ile kanser

tedavisine yönelik çalışmalarda kullanılmaktadır. Bu çalışmada, Hy molekülünün

karanlıkta genotoksik etkisinin olup olmadığı araştırıldı. Bunun için sağlıklı ve

gönüllü 10 kişiden (5 bay ve 5 bayan) periferal kan örnekleri alındı. Biri kontrol ve

ikisi deney olmak üzere üç grup oluşturuldu. İlk gruba kardeş kromatid değişimi

(KKD) prosedürü diğer iki gruba düşük doz (5 μM/L) ve yüksek doz (10μM/L) Hy

10 ml’lik insan lenfosit kültürlerine ekleyip KKD prosedürü uygulandı. Elde edilen

KKD ortalamalarını karşılaştırıldı. Birinci grup (kontrol) ile ikinci grup KKD oranı

karşılaştırıldığında anlamlı bir değişiklik gözlenmedi. Birinci grup ile üçüncü grup

karşılaştırıldığında fark istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0,05). Bu çalışmada,

düşük dozlarda genotoksik etkisi olmayan Hy’nin yüksek dozlarda genotoksik

olabileceği gösterildi.

Anahtar kelimeler: Kardeş Kromatid Değişimi, Hyperisin, Sarı kantaron

49

The efficacy of hypericin derived from Hypericum perforatum on Sister

Chromatid Exchange (SCE) in human lymphocyte culture

SUMMARY

Hypericin is throught to be a promising material in cancer treatment. It is

natural sensitizer extracted from Hypericum perforatum plant and used for the cancer

treatment studies with photodynamic therapy. In this study, we aimed to search

genotoxic effect of hypericin in the darkness peripheral blood samples were obtained

from ten (5 male, 5 Famale) healthy volunteers. Three groups were performed (1

control, 2 test groups). Sister Chromatid Exchange (SCE) procerdure were performed

for control groups and low dose (5 µM/L) and high dose (10 µM/L) of hypericin

were added to human lymphocyte cultures and the SCE procedure was performed

also there two groups. And the mean SCE values were compered. No diffrence as

found between control group and the 5 µM/L hypericin added group. The mean SCE

values between controls and the 10µM/L hypericin added group was found

statistically significant (p<0,05). Our results showed that hypericin may have

genotoxic effect in high doses, in contrast no genotoxic effect shown in low doses.

Keywords: Sister Chromatid Exchange (SCE), Hypericum perforatum, Hypericin

50

KAYNAKLAR

1. Kırbay S. Hypericum perforatum L.’un değişik ekstratlarının antimikrobiyal etkileri.

Journal of Qafgaz University (2 ):121-136.1999.

2. Tanker M, Tanker N. Farmakopnazi cilt 1 S:114 –115 İstanbul,1973.

3. Davis P.H. Flora of Turkey and the East Aegean Islands II. p:355 and P:400 (1978-

1988) Edinburg University Press, Edinburg.

4. Baytop T. Farmakognazi ders kitabı İst.Ünv.Yay.No:2003. Ecz.Fak.No:19 İstanbul,

1974.

5. Colasanti A, Kisslinger A, Liuzzi R, Quarto M, Riccio P, Roberti G, Tramontano D,

Villani F. Hypericin photosensitization of tumor and metastatic cell lines of human

prostate. J Photochem Photobiol B. 54(2-3):103-7, 2000.

6. Tang J, Colacino J.M, Larsen S.H. Virusidal activity of hypericin against envoloped

and non-enveloped DNA and RNA viruse. Antiviral Res. 13 (6): 313-325, 1990.

7. Thiele B, Brink L, Ploch M. Modülasyon of sitokine expression by hypericum extract.

J.Ger.Psychiatry and Neurology 7:60-62, 1993.

8. Reichling J, Weseler A, Saller R.A current review of the antimicrobial activity of

Hypericum perforatum L.Pharmacopsychiatry. 34 Suppl 1:S116-8, 2001.

9. Çubuklu B, Meriçli A.H, Mar A, Sarıyar G, Sütlüpınar N, Meriçli F, İst.Üni.Yayını.

Fitoterapi Yard.Ders Kitabı İst. Üni.Yay No:4311 Ezc.Fak.Yay No:79 İstanbul, 2002.

10. Önder S. Hypericum perforatum L. Bitkisinin Annaljezik Etkisinin Mekanizması.

Anadolu Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enst. Yüsek Lisans Tezi. Eskişehir,1995.

11. Herakman T. Hypericum perforatum fraksiyonlarının hepatoprotektif etkilerinin

araştırılması. Anadolu Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enst. Yüksek Lisans Tezi.

Eskişehir, 1996.

12. Potacka J. The chemistry, pharmacology and toxicology of the biologicallyactive

constituens of the herb Hypericum perforatum L. J.Appl.Biomed.1,61-73, 2003.

13. Betty R.C, Trikojus V.M, Hypericin and non- flourescent photosensitive pigment from

St. John Wort. J.Exp.Biol.Med.Sci. 21:175-182, 1943.

51

14. Meruelo D, Lavie G, Lavie D. Therapeutic agents with dramatic antiretroviral activity

and little toxicity at effective doses: aromatic polycyclic diones hypericin and

pseudohypericin. Proc Natl Acad Sci. U S A. 85(14):5230-4, 1988.

15. Agostinis P, Vantieghem A, Merlevede W, de Witte PA. Hypericin in cancer treatment:

more light on the way. Int J Biochem Cell Biol. 34(3):221-41,2002.

16. Seyed M.A, Malini O, Gan Y.Y, Bn Soo K.C, İnduction of apoptosis by Hypericin

through activation of caspase-3 in human carcinoma cells. Int. J Mol. Med. 8:521-530,

2001.

17. Du H.Y, Olivo M, Tan B.K, Bay B.H. Hypericin-mediated photodynamic therapy

induces lipid peroxidation and necrosis in nasopharyngeal cancer. Int. J Oncol.

23(5):1401-5, 2003.

18. Hudson J.B, Lopez-Bazzocchi I, Towers G.H. Antiviral activities of hypericin.

Antiviral Research.15:101-112,1991.

19. Fadeel B, Zhivotovsky B, Orrenius S.All along the watchtower: on the regulation of

apoptosis regulators.FASEB J. 13(13):1647-57, 1999.

19. Vantieghem A, Xu Y, Declercq W, Vandenabeele P, Vandenheede J.R, et al. Different

pathways mediate cytochrome c release after photodynamic therapy with hypericin,

Photochem. Photobiol. 74 133–142, 2001.

20. Üstün Ç. Santral sinir sistemi üzerine etkili tıbbi bitkilerin tarihsel süreç içinde ve

günümüzde tedavideki yeri. Ege Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enst. Doktora Tezi. İzmir

1998.

21. Wirz A, Simmen V, Herlmann J, Calis I, Meier B, Sticher D. Bisanthraguinone

plycosides of Hypericum perforatum with binding inhibition to CRH-I receptors.

Phytochemistry; 55:941-947, 2000.

22. Baytop T. Farmakognazi ders kitabı İst.Ünv.Yay.No:2003. Ecz.Fak.No:19 İstanbul,

1988.

23. Mukherjee P.K, Verpoorte R, Suresh B. Evalution of in-vivo wound healing activity of

Hypericum patulum (Family:Hypericaceae) leaf extract on different wound model in

rats. J of Ethnopharm; 70:315-321, 2000.

24. Soysal Y. Mitomicin C ile indüklenmiş lenfosit hücre kültürlerinde melotonin ve

karotenin in vitro sistemde kardeş kromatid değişimi oranları ve mitotik indeks

52

değerleri üzerine olan etkilerinin karşılaştırılması. Gazi Üniversitesi Sağlık Bilimleri

Enst. Yüksek Lisans Tezi, 1999.

25. Koşar Aslan P. Mesane kanserli olguların lenfosit hücrelerinde kardeş kromatid

değişim sıklığı. Süleyman Demirel Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Tıbbi

Biyoloi.Yüksek Lisans Tezi. Isparta, 1999.

26. Acar A. Ferrokrom fabrikasında çalışan işçilerde sitogetik çalışmalar. Akdeniz

Üniversitesi Tıbbi Biyoloji. Doktora Tezi, 1985.

27. Baytop T. Türkçe Bitki Adları Sözlüğü. Türk Tarih Kurumu basımevi s 130-131.

Ankara, 1994.

28. Çubukçu B, Oğuzoğlu Ş.A. Günümüz Uygur geleneksel bitkisel drogları. Geleneksel ve

Folklorik Droglar Dergisi. cilt:3 sayı 2 s.11 İstanbul, 1996.

29. Guedes R.C, Eriksson L.A. Effects of halogen substitution on the photochemical

properties of hypericin. J Photochem and photobiol. ChemistryA. 246 851-563, 2005.

30. Kitanov G.M. Hypericin and pseudohypericin in some Hy-pericums pecies, Biochem.

Syst. Ecol. 29 171–178,2001.

31. Falk H, Schmitzherger. On The Nature of soluble hypericin Hypericum Speicies.

Momatsh.Chem.123 731-739, 1999.

32. Delaey E.M, Kamuhabwa A.R, Vandenbogaerde A.L, de Witte P.A. Photocytotoxicity

of protohypericin after photoconversion to hypericin. Planta Med. 65(8):719-22, 1999.

33. Marekova M, Vavrova J, Vokurkova D, Cerman J. Light-induced photoactivation of

hypericin inhibits cellular growth in pituitary adenoma cell line At 20/D16v-f2

(Hypericin inhibits cellular growth of AtT20/d16v-F2). Acta Medica 44(1):7-13, 2001.

34. Guedes R.C, Eriksson L.A. Theoretical study of hypericin. J of Photochem and

PhotobilA.Chemistry 172; 293-299, 2005.

35. Crnolatac I, Huygens A, van Aerschot A, Busson R, Rozenski J, de Witte PA.

Synthesis, in vitro cellular uptake and photo-induced antiproliferative effects of

lipophilic hypericin acid derivatives. Bioorg Med Chem. 1;13(23):6347-53, 2005.

36. Mazur Y, Meruelo D. Ion pairs of hypericin compounds having antiviral activity, WO

93/15607,1993.

37. Gerhardt J.J, fowkes S.W. Hypericin Forefront Palo Alto. MegaHealty society 6(6)1-5,

1991.

53

38. Duran N, Song P.S. Hypericin and its photodynamic action. Photochem Photobiol. 198.

43(6):677-80, 1998.

39. Lavie G, Mazur Y, Lavie D, Prince A.M, Pascual D, Liebes L, Levin B, Meruelo D.

Hypericin as an inactivator of infectious viruses in blood components. Transfusion.

35(5):392-400, 1995.

40. Agostinis P, Vandenbogaerde A, Donella-Deana A, Pinna L.A, Lee K.T, Goris J,

Merlevede W, Vandenheede J.R, De Witte P. Photosensitized inhibition of growth

factor-regulated protein kinases by hypericin. Biochem Pharmacol. 49(11):1615-22,

1995.

41. Chaloupka R, Obsil T, Plasek J, Sureau F. The effect of hypericin and hypocrellin-A on

lipid membranes and membrane potential of 3T3 fibroblasts. Biochim Biophys Acta.

1418(1):39-45, 1999.

42. Hadjur C, Richard M.J, Parat M.O, Jardon P, Favier A. Photodynamic effects of

hypericin on lipid peroxidation and antioxidant status in melanoma cells. Photochem

Photobiol. 64(2):375-81, 1996.

43. Miccoli L, Beurdeley-Thomas A, De Pinieux G, Sureau F, Oudard S, Dutrillaux B,

Poupon M.F. Light-induced photoactivation of hypericin affects the energy metabolism

of human glioma cells by inhibiting hexokinase bound to mitochondria. Cancer Res.

58(24):5777-86, 1998.

44. Weiner L, Roth E, Mazur Y, Silman I. Targeted cross-linking of a molten globule form

of acetylcholinesterase by the virucidal agent hypericin. Biochemistry.

31;38(35):11401-5, 1999.

45. Schey K.L, Patat S, Chignell C, Datillo M, Wang R.H, Roberts J.E. Photooxidation of

lens alpha-crystallin by hypericin (active ingredient in St. John's Wort). Photochem

Photobiol. 72(2):200-203, 2000.

46. Thomas C, Pardini R.S. Oxygen dependence of hypericin-induced phototoxicity to

EMT6 mouse mammary carcinoma cells. Photochem Photobiol. 55(6):831-7, 1992.

47. English D.S, Doyle R.T, Petrich J.W, Haydon P.G. Subcellular distributions and

excited-state processes of hypericin in neurons. Photochem Photobiol. 69(3):301-5,

1999.

54

48. Kocisova E, Chinsky L, Miskovsky P, Sequence specificinteraction of the

antiretrovirally active drug hypericin with5_ ATGGCAGGATAT3_ oligonucleotide: a

resonance Ramanspectroscopy study. J. Biomol. Struct. Dyn. 15 1147–1154, 1998.

49. Kocisova E, Chinsky L, Miskovsky P, Sequence specificinteraction of the photoactive

drug hypericin depends on the structural arrangement and the stability of the

structurecontaining its specific 5AG3 target: a resonance Ramanspectroscopy study. J.

Biomol. Struct. Dyn. 17 51–59, 1999.

50. Oleinick N.L , Evans H.H , The photobiology of photo-dynamictherapy: cellular targets

and mechanisms. Rad.Res. 150 S146–S156, 1998.

51. Vandenbogaerde A.L, Delaey E.M, Vantieghem A.M, Himpens B.E, Merlevede W.J,

de Witte P.A. Cytotoxicity and antiproliferative effect of hypericin and derivatives after

photosensitization. Photochem Photobiol. 67(1):119-25, 1998.

52. Du H.Y, Olivo M, Tan B.K, Bay B.H. Photoactivation of hypericin down-regulates

glutathione S-transferase activity in nasopharyngeal cancer cells. Cancer Lett.

30;207(2):175-81, 2004.

53. Halliwel B, Gutteridge J.M.C. Free radicals in biology and medicine.Second editio,

Claren Pres. Oxford, 1989.

54. Mollaoğlu H. GSM 900 MHz Telefonlarının oluşturduğu manyetik alanın etkisiyle

ratlarda meydana gelen oksidatif değişiklikler üzerine melatoninin etkisi. Süleyman

Demirel Üniveristesi Tıp fakültesi fizyoloji AB. Uzmanlık Tezi. Isparta, 2003.

55. Akkuş İ. Serbest Radikaller ve Fizyopatolojik Etkiler. Mimoza Yayınları. s,1-132.

Konya, 1995.

56. Dougherty T.J, Gomer C.J, Henderson B.W, Jori G, Kessel D, Korbelik M, Moan J,

Peng Q. Photodynamic therapy. J Natl Cancer Inst. 17;90(12):889-905, 1998.

57. Fiers W, Beyaert R, Declercq W, Vandenabeele P. More than one way to die:

apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage, Oncogene 18 7719–7730, 1999.

58. Ashkenazi A,. Dixit V.M. Apoptosis Control by Death Anddecoy Receptors, Curr.

Opin. Cell Biol. 11, 255–260, 1999.

59. Ustaçelebi Ş, Mutlu G, İmir T, Cengiz T, Tümbay E, Mete Ö. Temel ve klinik

mikrobiyoloji. Güneş Kitapevi. Ankara 1999.

55

60. Couldwell W.T, Gopalakrishna R, Hinton D.R, He S, Weiss M.H, Law R.E, Apuzzo

M.L, Law R.E. Hypericin:a potential antiglioma therapy. Neurosurgery 35 705–710,

1994.

61. Weller M, Trepel M, Grimmel C, Schabet M, Bremen D, Krajewski S, Reed J.C.

Hypericin induced apoptosisof human malignant glioma cells is light-dependent,

independent of Bcl-2 expression, and does not requirewild-type p53, Neurol. Res. 19,

459–470, 1997.

62. Fadeel B, Zhivotovsky B, Orrenius S. All along the watchtower: on the regulation of

apoptosis regulators, FASEB J. 13 1647–1657, 1999.

63. Green D.R, Reed J.C. Mitochondria and apoptosis. Science. 281 (1309–1312, 1998.

64. Hudson JB, Harris L, Towers GH. The importance of light in the anti-HIV effect of

hypericin.Antiviral Res. 20(2):173-8, 1993.

65. Zheng M.S. An experimental study of the anti-HSV-II action of 500 herbal drugs J

Tradit Chin Med. 9(2):113-6, 1989.

66. Degar S, Lavie G, Meruelo D. Photodynamic inactivation of radiation leukemia virus

produced from hypericin-treated cells. Virology. 197(2):796-80, 1993.

67. Lenard J, Rabson A, Vanderoef R. Photodynamic inactivation of infectivity of

humanimmunodeficiency virus and other enveloped viruses using hypericin and rose

bengal: inhibition of fusion and syncytia formation. Proc Natl Acad Sci U S A.

1;90(1):158-62, 1993.

68. Schinazi R.F, Chu C.K, Babu J.R, Oswald B.J, Saalmann V, Cannon D.L, Eriksson

B.F, Nasr M. Anthraquinones as a new class of antiviral agents against human

immunodeficiency virus. Antiviral Res. 13(5):265-72, 1990.

69. Lavie G, Valentine F, Levin B, Mazur Y, Gallo G, Lavie D, Weiner D, Meruelo D.

Studies of the mechanisms of action of the antiretroviral agents hypericin and

pseudohypericin. Proc Natl Acad Sci U S A. 86(15):5963-7, 1989.

70. Tang J, Colacino J.M, Larsen L.H, Spitzer W. Virucidalactivity of hypericin against

enveloped and non-enveloped DNA and RNA viruses, Antiviral Res. 13 313–325,

1990.

71. Prince A.M, Pascual D, Meruelo D, Liebes L, Mazur Y, Dubovi E, Mandel M, Lavie

G., Strategies for evaluation of enveloped virus inactivation in red cell concentrates

using hypericin, Photochem. Photobiol. 71 188–195, 2000.

56

72. Liebes L, Mazur Y, Freeman D, Lavie D, Lavie G, Kudler N, Mendoza S, Levin B,

Hochster H, Meruelo D. A method for the quantitation of hypericin, an antiviral agent,

in biological fluids by high-performance liquid chromatography. Anal Biochem.

15;195(1):77-85, 1991.

73. Chatterjee S.S, Bhattacharya S.K, Wonnemann M, Singer A & Muller W.E. Hyperforin

as a possible antidepressant component of Hypericum extracts. Life Sciences 63 (6):

499-510, 1998.

74. Linde K, Ramirez G, Mulrow C, Pauls DçA, Weidenhammer W, & Melchart D. St.

John's wort for depression- an overview and meta-analysis of randomized clinical trials.

BMJ 313 (7052): 253-258, 1996.

75. Butterweck V, Petereit F, Winterhoff H, Nahrstedt A. Solubilized hypericin and

pseudohypericin from Hypericum perforatum exert antidepressant activity in the forced

swimming test. Planta Med. 64(4):291-4, 1998.

76. Tucker J.D, Auletta A, Cimino M.C, Dearfield K.L. Jacobson- Kram D, Tice R.R,

Carrona A.V. Sister-chromatid Exchange: second report of the Gene-Tox program.

Mutation Research,1993: 101-180.

77. Butterweck V, Wall A, Lieflander-Wulf U, Winterhoff H, Nahrstedt A. Effects of the

total extract and fractions of Hypericum perforatum in animal assays for antidepressant

activity. Pharmacopsychiatry. 30 Suppl 2:117-24, 1997.

78. De Vry J, Maurel S, Schreiber R, de Beun R, Jentzsch K.R. Comparison of hypericum

extracts with imipramine and fluoxetine in animal models of depression and

alcoholism. Eur Neuropsychopharmacol. 9(6):461-8, 1999.

79. Vorbach E.U, Arnoldt K.H, Hubner W.D. Efficacy and tolerability of St. John's wort

extract LI 160 versus imipramine in patients with severe depressive episodes according

to ICD-10. Pharmacopsychiatry.30 Suppl 2:81-5, 1997.

80. Lenoir S, Degenring F.H, Saller R. A double-blind randomised trial to investigate three

different concentrations of a standardised fresh plant extract obtained from the shoot

tips of Hypericum perforatum L. Phytomedicine. 6(3):141-6, 1999.

81. Franklin M, Chi J, McGavin C, Hockney R, Reed A, Campling G, Whale R.W, Cowen

PJ. Neuroendocrine evidence for dopaminergic actions of hypericum extract (LI 160) in

healthy volunteers. Biol Psychiatry. 15;46(4):581-4, 1999.

57

82. Calapai G, Crupi A, Firenzuoli F, Costantino G, Inferrera G, Campo G.M, Caputi AP.

Effects of Hypericum perforatum on levels of 5-hydroxytryptamine, noradrenaline and

dopamine in the cortex, diencephalon and brainstem of the rat. J Pharm Pharmacol.

51(6):723-8, 1999

83. Muller W.E, Rolli M, Schafer C, Hafner U. Effects of hypericum extract (LI 160) in

biochemical models of antidepressant activity. Pharmacopsychiatry. 30 l 2:102-7, 1997.

84. Kaehler S.T, Sinner C, Chatterjee S.S, Philippu A. Hyperforin enhances the

extracellular concentrations of catecholamines, serotonin and glutamate in the rat locus

coeruleus. Neurosci Lett. 12;262(3):199-202, 1999.

85. Butterweck V, Bockers T, Korte B, Wittkowski W, Winterhoff H. Long-term effects of

St. John's wort and hypericin on monoamine levels in rat hypothalamus and

hippocampus. Brain Res. 15;930(1-2):21-9, 2002.

86. Rodriquez Landa J, Contresas F. A Rewiev of Clinical and Experimental Observations

About Antidepressant Actions and Site Effects Prodused by Hypericum Perforatum

Extrakts. Pyhtomedicine 10:688-699, 2003.

87. Chatterjee S.S, Noldner M,koch E,erdelmeier C. Antidepresant activity of hypericum

perforatum and hyperforin: the negleted possibility. Pharmacopsychiatr.31;7-15, 1998.

88. Thiede H.M and A. Walper. Inhibition of MAO and COMT by Hypericum Extracts and

Hypericin. J Geriatr Psychiatry Neurol 7(suppl 1): S54-S56, 1994.

89. Tuğlular I. Klinik Uygulamalı Farmakoloji Cilt:1 Psikofarmakoloji. MAS Ambalaj

Sanayi, İzmir 1985.

90. Neary J. T, & Bu Y. Hypericum LI 160 inhibits uptake of serotonin and norepinephrine

in astrocytes. Brain Research 816 (2): 358-363, 1999.

91. Öztürk M.O. Ruh Sağlığı ve Bozuklukları. Hacettepe Üniversitesi AB. Emekli Öğretim

Üyesi. 7. Baskı.s(25). Ankara 1997.

92. Mennini T, Gobbi M. The antidepressant mechanism of Hypericum perforatum. Life

Sci. 16;75(9):1021-7, 2004.

93. Tanrıverdi N. Kardeş Kromatid Değişimi. Çukurova Üniversitesi Sağlık Bilimleri

Enstitüsü Fiz. AB. Bilim Uzmanlığı Tezi, 1991.

58

94. Ceylaner Başkaya G. Şizofrenili olgularda kardeş kromatid değişimlerinin (Sister

Chromatid Exchange-SCE) araştırılması. Cumhuriyet Üniversitesi Sağlık Bilimleri

Enst. Doktora Tezi, 1997.

95. Paralı F. Ethidum bromidin (EtBr) in vitro insan lenfositlerine ekisisnin SCE yöntemi

ile gösterilmesi. Dokuz Eylül Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enst.Yüksek Lisans Tezi,

1994.

96. Bal F, Şahin F.İ, Yirmibeş M, Balcı A, Menevşe S. The in vitro effect of beta-carotene

and mitomycin C on SCE frequency in Down’s Syndrome lymphocyte cultures.

Tohoku. J. Exp. Med. 184 (4): 295-300, 1998.

97. Perry P, Wolff S. New Giemsa method for the differential staining of sister chromatids.

Nature. 13;251(5471):156-8, 1974.

98. Zakharov ve Egolina N.A. Differantial spirilization along mammalian mitotic

chromosomes. Chromosoma; 38: 341-365. (Berl) 1972.

99. Lovadey K.S, Latt S.A. A high buyant density fraction in mammalian DNA.

Experimental Cell Res. 141: 127-137,1982.

100. Latt S.A. Sister chromatid exchanges, indices of human chromosome damage and

repair: detection by fluorescence and induction by mitomycin C. Proc Natl Acad Sci U

S A. 71(8):3162-6, 1974.

101. Sakallı Çetin E. Ökse Otunun Kardeş Kromatid Değişimi Üzerine Etkisi. Süleyman

Demirel Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enst. Tıbbi Tiyoloji ve Genetik AB. Yüksek

Tisans Tezi. Isparta 2005.

102. Erdem N. Kontraplak ve yonga-levha fabrikalrında çalışan işçilarde formaldehit ve

odun tozuna maruziyetin solunum fonksiyonları üzreine etkisi ve genotoksik hasarın

araştırılması. Gazi Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enst. Doktara Tezi, 1997.

103. Başaran Gönlüşen F. Alkolik bireylerdeki alkolve sigara tüketimine bağlı oluşan SCE

oranlarının sigara içen ve sigara içmeyen bireylerdeki SCE oranları ile karşılaştırılması.

Yüksek Lisans Tezi, 1998.

104. Akbaş E. Sigara Kullanımının Lenfosit Yaşam Süresi ve Genotoksik Etkilerinin

İncelenmesi. Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji ve Genetik AB. Geriatri

4(1):15-18, 2001.

59

105. Moorhead P, Nowell P.C, Mellman W.J, Batips D.M, and Hungerford D.A.

Chromosome preparations of leukocytes cultured from human peripheral blood. Exp.

Cell Res. 20; 613-616, 1960.

106. Korenberg J, Feedlender E.F. Giemsa technique for the detection of sister chromatid

exchanges. Chromosome (Berl). 48: 355-360, 1974.

107. Hostanska K, Reichling J, Bommer S, Weber M, Saller R. Hyperforin a constituent of

St John's wort (Hypericum perforatum L.) extract induces apoptosis by triggering

activation of caspases and with hypericin synergistically exerts cytotoxicity towards

human malignant cell lines. Eur J Pharm Biopharm. 56(1):121-32, 2003.

108. Johnson S.A, Dalton A.E, Pardini R.S. Time-course of hypericin phototoxicity and

effect on mitochondrial energies in EMT6 mouse mammary carcinoma cells. Free

Radic Biol Med. 15;25(2):144-52, 1998.

109. Gulick R.M, Mc Auliffe V, Holden-Wiltse J, Crumpacker C, Liebes L, Stein D.S,

Meehan P, Hussey S, Forcht J, Valentine F.T. Phase I studies of hypericin, the active

compound in St. John's Wort, as an antiretroviral agent in HIV-infected adults. AIDS

Clinical Trials Group Protocols 150 and 258. Ann Intern Med. 16;130(6):510, 1999.

110. Miskovsky P, Sureau F, Chinsky L, Turpin P.Y. Subcellular distribution of hypericin in

human cancer cells. Photochem Photobiol. 62(3):546-9. 1995.

111. Peebles K.A, Baker R.K, Kurz E.U, Schneider B.J, Kroll D.J. atalytic inhibition of

human DNA topoisomerase IIalpha by hypericin, a naphthodianthrone from St. John's

wort (Hypericum perforatum). Biochem Pharmacol. 15;62(8):1059-70, 2001.

112. Barnes J, Anderson L.A, Phillipson J.D. St. John's wort (Hypericum perforatum L.): a

review of its chemistry, pharmacology and clinical properties. J Pharm Pharmacol.

53(5):583-600, 2001.

113. Raffa R.B. Screen of receptor and uptake-site activity of hypericin component of St.

John's wort reveals sigma receptor binding. Life Sci. 62(16):PL265-70, 1998.

114. Biber A, Fischer H, Romer A, Chatterje S.S. Oral bioavailability of hyperforin from

hypericum extakts in rat and human volunteers. Pharmacopschiatry.31;36-43,1998.

115. Hunt E.J, Lester C.E, Lester E.A, Tackett R.L. Effect of St. John's wort on free radical

production. Life Sci. 1;69 (2):181-90, 2001.

60

116. Siboni G, Amit-Patito I, Weizman E, Waintraub-Porat M, Weitman H, Ehrenberg B,

Malik Z. Specificity of photosensitizer accumulation in undifferentiated versus

differentiated colon carcinoma cells. Cancer Lett. 30;196(1):57-64, 2003.

117. Jacobson J.M, Feinman L, Liebes L, Ostrow N, Koslowski V. Et al. Pharmacokinetics,

safety, and antiviral effects of hypericin, a derivative of St. John’s wort plant, in

patientswith chronichepatitis C virus infection, Antimicrob. Agents Chemother. 45;

517–524, 2001.

118. Fox E, Murphy R.F, McCully C.L, Adamson P.C. Plasmapharmacokinetics and

cerebrospinal fluid penetration ofhypericin in non-human primates, Cancer Chemother.

Pharmacol. 47; 41–44, 2001.