Karakteristike vrsta roda Karakteristike vrsta roda LeuconostocLeuconostoc

Slađana DavidovićSlađana Davidović

FENOTIPSKE KARAKTERISTIKE LEUKONOSTOKA

• Morfološke osobineMorfološke osobine• Nepokretne, asporogene koke • Ćelije su Gram-pozitivne, elipsoidnog

do sfernog oblika, često izdužene• obično rastu u parovima, mada mogu

biti i pojedinačne, a takođe formiraju lance kratke do srednje dužine

• Formiraju sitne, ravne kolonije, sive boje.

• Ne obrazuju prave ćelijske kapsule

• Fiziološke osobineFiziološke osobine• hemo-organotrofne, fakultativno

anaerobne, katalaza-negativne, nemaju citohrome

• neproteolitički i nehemolitički organizmi, ne redukuju nitrate

• Ne hidrolizuju arginin i obično ne zakišeljavaju i ne zgrušavaju mleko

• Mogu da rastu na pH 4.5, ali nema acidofilnih vrsta

• Optimalna temperatura za rast je između 20 i 30 oC

• Rastu u bogatom medijumu sa faktorima rasta i aminokiselinama

• Sve vrste za rast zahtevaju nikotinsku kiselinu, tiamin, biotin i pantotensku kiselinu ili njene derivate

EVOLUCIJA I TAKSONOMIJA

• nove molekularne tehnike omogućavaju pouzdanu i doslednu identifikaciju

• Na osnovu filogenetske analize 16S rRNA, rod Leuconostoc pripada porodici Leuconostocaceae, zajedno sa rodovima Oenococcus i Weissella, u okviru reda Lactobacillales

• Grupa Leuconostoc je podeljena u tri zasebne evolutivne linije: • Leuconostoc sensu stricto, • Leuconostoc paramesenteroides, i • Leuconostoc oenos.

• Leuconostoc paramesenteroides je reklasifikovan kao Weissella paramesenteroides, a Leuconostoc oenos kao Oenococcus oeni.

STANIŠTA LEUKONOSTOKA

• dele mnoga staništa sa drugim LAB, posebno sa laktobacilima, pediokokama i karnobakterijama

• poreklo sa zelene vegetacije koja predstavlja njihovu prirodnu ekološku nišu

• prisustvo u mleku i mlečnim proizvodima dešava se zbog kontaminacije tokom muže i/ili tokom proizvodnje (prerade), što je još i pojačano njihovom jedinstvenom osobinom da dugo vremena preživljavaju na površinama materijala kao što su drvene posude i kalupi, a preživljavaju i pasterizaciju

Zastupljenost u fermentisanim proizvodima

• važna uloga u fermentaciji različitih prehrambenih proizvoda• Izvor bakterija:

– sirovi materijal, kao npr. za proizvodnju sireva od sirovog mleka, ili za kiseli kupus i neke fermentisane kobasice

– komercijalne starter kulture

• Tokom fermentacije, krajnji proizvodi metabolizma ugljenih hidrata doprinose očuvanju kvaliteta proizvoda, daju aromu i teksturu proizvodu. Fermentacija takođe može da poveća nutritivnu vrednost hrane (povećava svarljivost, npr. fermentacija mleka do sira), ili smanjuje njenu toksičnost.

• Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc mesenteroides subsp. subsp. mesenteroidesmesenteroides igra značajnu ulogu u fermentaciji povrća, kao što su kiseli kupus i krastavci

• Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc mesenteroides subsp. subsp. mesenteroides mesenteroides i subsp. i subsp. dextranicumdextranicum su povezani sa fermentisanim proizvodima na bazi žitarica

• Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc mesenteroides subsp. subsp. dextranicumdextranicum ima ulogu u fermentaciji kiselog testa

• Leukonostok je prisutan u raznim oblicima fermentisanih mlečnih proizvoda. Takođe predstavlja komponentu kefirne kulture doprinoseći proizvodnji etanola i acetata

• Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc mesenteroides subspsubsp. cremoris . cremoris i Leuconostoc lactisLeuconostoc lactis se koriste kao starter kulture u proizvodnji pavlake, maslaca, krem-sira, tvrdih sireva (Gauda i Edam). Takođe, koriste se i u formulisanim starter kulturama za proizvodnju kefira

• Leuconostoc argentinumLeuconostoc argentinum je izolovan iz argentinskog sirovog mleka

Zastupljenost u mlečnim proizvodima

ZDRAVLJE, BOLEST I BEZBEDNOST

• leukonostok uzrokuje primarno bakterijska oboljenja, plućne infekcije, infekcije peritonealne tečnosti, endokarditis, meningitis, osteomijelitis, ventrikulitis, apsces i septikemiju

• Mnogi sojevi pripadaju vrsti Leuconostoc mesenteroidesLeuconostoc mesenteroides, izolat Leuconostoc lactis je redak, iako najveći broj vrsta izuzev Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris mogu da žive na 37 stepeni

• Poreklo ovih infekcija - nepoznato. Detektovane su da žive na koži čoveka kao normalna flora kože i odatle se čovek može i zaraziti.

• Tretman vankomicinom može dati leukonostoku selektivnu prednost u određenoj ekološkoj niši jer će vankomicin uništiti bakterije koje bi normalno inhibirale njegov rast, što omogućava leukonostoku da se deli i uzrokuje bolest.

• uglavnom odrasli ljudi sa ugroženim imunitetom. Podložnost ovoj bakteriji veoma pokazuju ljudi koji koriste venske katetere i druge invazivne naprave koje ulaze u telo (kod traheotomije, gastrostomije ili endotrahealne cevi) kao i ljudi koji su uzimali antibiotike.

Uzgajanje, održavanje i čuvanje kultura

• Gajenje leukonostoka se može ostvariti korišćenjem bogatih tečnih podloga i selektivnih ili neselektivnih medijuma, u zavisnosti od toga šta je potrebno – da li treba izolovati pojedinačan rod iz smeše mikroorganizama ili treba održavati izolate u kulturi.

• Uobičajena podloga za uzgoj čistih sojeva Leuconostoc jeste klasična MRS podloga

• Većina selektivnih podloga se baziraju na sposobnosti organizma da metaboliše citrat, takođe je uzeta u obzir njihova sklonost ka kiselom kao i preferiranje mikroaerofilnih do anaerobnih uslova za život, kao i otpornost na antibiotik vankomicin

Industrijska proizvodnja

• složene laboratorijske podloge preskupe za industrijsku proizvodnju

• Zato se druge podloge koriste u industriji i njihov sastav često nije dostupan (vlasničke procedure). Koriste se podloge zasnovane na papain-hidrolizovanom kazeinu ili mleku ili surutki. Pogodan je takođe i medijum koji se upotrebljava za Lactococcus (1,4% ekstrakt kvasca, 4% tripton, 9% laktoza).

• Upotrebom laktoze umesto glukoze izbegava se razvoj laktoza-negativnih mikroorganizama

Rast i metabolizam leukonostoka u kulturama mešanih sojeva

• Sojevi Leuconostoc rastu asocijativno sa laktokokama koje proizvode kiselinu i taj njihov asocijativni rast je proučavan u odnosu na metabolizam citrata i stvaranje arome. Ovaj asocijativni rast je opisan kao sinergistički funkcionalni odnos (veza). Leukonostok metaboliše citrat u pH opsegu od 6.3 do 4.5, a diacetil i acetoin se proizvode samo pri kiselom pH. Stoga, da bi se inicirao metabolizam citrata i da bi nastala jedinjenja koja daju aromu, neophodno je da Lactococcus lactis proizvede dovoljno kiseline da bi se spustila pH vrednost mleka.

• Razlike u šemi rasta različitih sojeva koji čine strartere sa mešanim sojevima mogu dovesti do neizbežnih i značajnih promena u njegovom sastavu u prilično kratkom periodu kultivacije. Dalje, u komercijalnim koncentratima mešanih kultura koje sadrže bakterije-proizvođače kiseline i Leuconostoc koji proizvodi aromu, zastupljenost leukonostoka kreće se između 5% i 10% ukupne kulture. Tako da se upotrebom koncentrata sa sojem Leuconostoc može izbeći nebalansiranost populacije i brza predominacija Lactococcus lactis nad Leuconostoc.

Krajnji proizvodi metabolizma i njihov uticaj na bakterijski rast

• Mehanizam pomoću koga Leuconostoc inhibira bakterijski rast LAB-a, kao i patogenih sojeva, pripisuje se degradacionim proizvodima metabolizma ugljenih hidrata i citrata. Antimikrobni efekti organskih kiselina, uključujući mlečnu i sirćetnu kiselinu, se ispoljavaju dejstvom na ćelisku membranu, menjajući njene osobine kao što su membranski potencijal i ćelijski integritet.

• Antibakterijske osobine diacetila i etanola takođe su opisane, iako su njihovi efekti blagi kod običnih mlečnih fermentacija. U prisustvu kiseonika Leuconostoc akumulira vodonik peroksid koji može biti inhibitoran za neke mikroorganizme.

METABOLIZAM

• heterofermentativne LAB• Pod mikroaerofilnim uslovima glukoza se konvertuje u ekvimolarne

količine D-laktata, etanola i CO2, kombinacijom heksozo-monofosfatnog i pentozo-fosfatnog puta

• Ključni enzimi: glukozo-6-fosfat-dehidrogenaza i ksilulozo-5-fosfoketolaza

• Fermentacijom fruktoze umesto etanola nastaje manitol. Fruktozu fermentišu sve vrste roda Leuconostoc, osim Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris i nekih sojeva Leuconostoc argentinum.

• Laktozu fermentišu svi sojevi Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum, Leuconostoc lactis i Leuconostoc argentinum.

• Od organskih kiselina najčešće fermentišu limunsku i jabučnu.

Uloge u tehnologiji mlečnih proizvodaUloge u tehnologiji mlečnih proizvoda

Formiranje rupa u siru•leukonostok proizvodi CO2 od citrata i stvara šupljine unutar sira

•selektuju se sojevi koji produkuju umerene količine CO2 da bi se sprečila preterana šupljikavost•U proizvodnji Rokfor sira, minimalna koncentracija leukonostoka je 106 ćelija/ml mleka. Optimalni rezultati su postignuti sa odabranim sojevima vrste Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides•U nekoliko slučajeva, populacija leukonostoka prirodno prisutnih u mleku stvara željene rupe. S druge strane, dodatak leukonostoka je obavezan pasterizovanom mleku•Maksimalna koncentracija nastalog CO2 je 16 mmol/kg sira, što odgovara iskorišćenju 8 mmol/l citrata prisutnog u mleku, pri čemu se razlike u aktivnosti javljaju u zavisnosti od vrste i soja

Proizvodnja arome

• Glavno jedinjenje povezano sa upotrebom leukonostoka u polju mlekarstva je diacetil

• acetat i etanol doprinose takođe obrazovanju arome• intenzivnija aroma proizvoda se dobija kada se u mleko doda

citrat• Leukonostok može dalje da transformiše diacetil u acetoin i

2,3-butandiol, koji ne daju aromu. Ova nepoželjna transformacija može biti umanjena ako se proizvodi ohlade nakon nastanka arome. Inkorporacija kiseonika u fermentisane mlečne proizvode favorizuje produkciju diacetila.

Uloge u funkcionalnoj hrani• Pod funkcionalnom hranom smatra se hrana koja osim uobičajenih hranljivih

sastojaka, sadrži komponente koje unapređuju zdravlje i sprečavaju pojavu bolesti.Leuconostoc kao potencijalni probiotik• Leuconostoc nema sposobnost kolonizacije intestinalnog trakta. U skladu sa tim,

njegov efekat na domaćina će biti mali, osim u slučaju da se uzme u velikim ćelijskim koncentracijama. U jednoj studiji, međutim, pokazano je da konzumiranje indijskog fermentisanog mlečnog proizvoda koji je sadržao 108 g-1 Lactococcus lactis i Leuconostoc mesenteroides skraćuje trajanje diareje kod dece.

Proizvodnja polisaharida• Obrazovanje dekstrana od saharoze zabeleženo je kod sledećih vrsta: Leuconostoc

mesenteroides subsp. mesenteroides i subsp. dextranicum, Leuconostoc carnosum, Leuconostoc citreum, Leuconostoc gelidum i Leuconostoc gasicomitatum.

• U tehnologiji mlečnih proizvoda, dekstrani, kao i drugi EPS, se koriste kao aditivi, imaju ulogu u poboljšanju teksture povećavajući viskoznost, a takođe služe i kao stabilizatori.

• Osim tehnoloških koristi, određeni EPS imaju i delotvorne fiziološke efekte na konzumente. Pretpostavlja se da povećana viskoznost hrane koja sadrži EPS može da produži vreme zadržavanja fermentisanog mlečnog proizvoda u gastrointestinalnom traktu i samim tim omogući kolonizaciju probiotskim bakterijama.

Proizvodnja manitola•Manitol je nisko-kalorični šećer koji može da zameni saharozu, laktozu, glukozu ili fruktozu u prehrambenim proizvodima. Metaboliše se nezavisno od insulina, pa se može koristiti u proizvodima koji su namenjeni dijabetičarima. Leuconostoc pseudomesenteroides i Leuconostoc mesenteroides poznati su po proizvodnji manitola tokom fermentacije fruktoze. Hidroliza α-galaktozida•Ljudi i životinje ne mogu da metabolišu α-galaktozide uobičajeno prisutne u biljkama, kao što su stahioza i rafinoza, usled nedostatka enzima α-galaktozidaze u intestinalnoj mukozi, pa dolazi do naduvenosti. Leuconostoc ima sposobnost fermentacije α-galaktozida; α-galaktozidaza iz Leuconostoc mesenteroides bi mogla da se koristi kao biotehnološki pristup za uklanjanje α-galaktozidaProizvodnja vitamina•Sojevi Leuconostoc mesenteroides koji produkuju značajne količine menahinona su okarakterisani i bili bi korisni kao starter kulture mlečnim (i drugim) fermentisanim proizvodima, ili pak kao dijetetski suplementi za prevenciju bolesti uzrokovanih nedostatkom vitamina K.•Dokumentovana je takođe proizvodnja folata od strane sojeva Leuconostoc lactis i Leuconostoc paramesenteroides.