LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

KRISTINA PALIULIONYTĖ

KASOS VĖŽINIŲ LĄSTELIŲ ENERGETINĖS BŪSENOS TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė Prof. Dr. Sonata Trumbeckaitė

KAUNAS, 2016

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis

KASOS VĖŽINIŲ LĄSTELIŲ ENERGETINĖS BŪSENOS TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė

Prof. Dr. Sonata Trumbeckaitė

Recenzentas Darbą atliko

Magistrantė

Kristina Paliulionytė

KAUNAS, 2016

3

TURINYS

SANTRAUKA ......................................................................................................................................... 5

SUMMARY ............................................................................................................................................. 6

SANTRUMPOS ...................................................................................................................................... 8

1. ĮVADAS ............................................................................................................................................... 9

2. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ............................................................................................ 11

3. LITERATŪROS APŽVALGA ....................................................................................................... 12

3.1. Kasos vėžys ................................................................................................................................ 12

3.2. Kasos vėžio patogenezė .............................................................................................................. 12

3.3. Kasos vėžio gydymas ................................................................................................................. 13

3.4. Gydymo metodai ........................................................................................................................ 13

3.5. Kasos vėžio atsparumas .............................................................................................................. 14

3.6. Tyrimams naudotos kasos vėžinių ląstelių linijos ...................................................................... 15

3.7. Gemzar (gemcitabinas) ............................................................................................................... 15

3.8. Gemcitabino (Gemzaro) poveikis mitochondrijoms .................................................................. 17

3.9. Mitochondrijų struktūra ir funkcija ............................................................................................ 17

3.10. Mitochondrijų oksidacinis fosforilinimas ................................................................................. 19

3.11. Pažeistų mitochondrijų atsakas kasos vėžinėms ląstelėms ....................................................... 22

4. METODIKA ..................................................................................................................................... 24

4.1. Aparatūra, indai .......................................................................................................................... 24

4.2. Medžiagos ................................................................................................................................... 24

4.3. Ląstelių linijos ir auginimo sąlygos ............................................................................................ 24

4.4. Ląstelių paveikimas GEM ir IC50 matavimai ............................................................................ 25

4.5. MTT gyvybingumo testas ........................................................................................................... 25

4.6. Kasos vėžinių ląstelių kvėpavimo greičio registravimas ............................................................ 26

4.7. Statistinė duomenų analizė ......................................................................................................... 27

5. REZULTATAI ................................................................................................................................. 28

4

5.1. Gemcitabino (Gemzaro) poveikis kasos vėžinių ląstelių gyvybingumui ................................... 28

5.2. Skirtingų kasos vėžio ląstelių linijų mitochondrijų endogeninio kvėpavimo palyginimas ........ 29

5.3. Gemcitabino (Gemzaro) poveikis kasos vėžio ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greičiui ....... 30

5.4. Gemcitabino poveikis mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientams kasos vėžinėse

ląstelėse .................................................................................................................................................. 37

6. REZULTATŲ APTARIMAS .......................................................................................................... 39

7. IŠVADOS .......................................................................................................................................... 41

8. LITERATŪROS SĄRAŠAS............................................................................................................ 42

SANTRAUKA

Kristinos Paliulionytės magistro baigiamasis darbas „Kasos vėžinių ląstelių energetinės

būsenos tyrimas“/ mokslinė vadovė prof. dr. S. Trumbeckaitė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto,

Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. – Kaunas.

Tyrimo tikslas. Ištirti kasos vėžinių ląstelių (paveiktų ir nepaveiktų chemoterapiniu vaistu –

gemcitabinu) energetinę būseną.

Uždaviniai. Ištirti ir palyginti skirtingų kasos vėžinių ląstelių linijų: Capan-1, Capan-2,

SU.86.86, MIAPaCa-2, paveiktų ir nepaveiktų gemcitabinu, endogeninio kvėpavimo greičius; Ištirti

gemcitabino poveikį kasos vėžinių ląstelių linijų mitochondrijų kvėpavimo funkcijoms; Ištirti

gemcitabino poveikį kasos vėžinių ląstelių linijų mitochondrijų vidinės ir išorinės membranos

pralaidumui.

Metodai. Kasos vėžinių ląstelių linijos buvo skirstomos į kontrolines grupes ir tiriamąsias,

paveiktas gemcitabinu. Kasos vėžinių ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greitis, oksiduojant

glutamatą/malatą ir sukcinatą, registruojamas oksigrafiniu metodu, kuris atliekamas su „Oroboros

Oxygraph-2k“ aparatu. Ląstelių gyvybingumas nustatytas MTT metodu.

Rezultatai. Gemcitabinas padidino endogeninį kvėpavimo greitį MIAPaCa-2 ir SU.86.86

ląstelių linijose apie 2,4 ir 1,5 kartus, lyginant su kontrole. Gemcitabinas apie 2 kartus padidino

mitochondrijų kvėpavimo greitį oksiduojant glutamatą/malatą ir sukcinatą MIAPaCa-2, Capan-1 ir

SU.86.86 kasos vėžinėse ląstelių linijose, tačiau slopino mitochondrijų kvėpavimo kontrolės

koeficientą (13-15 %). Gemcitabinas neturėjo poveikio mitochondrijų išorinės membranos laidumui,

bet padidino MIAPaCa-2 ir Capan-1 mitochondrijų vidinės membranos laidumą.

Išvados. Endogeninio ir mitochondrijų kvėpavimo greičio pokyčiai kasos vėžinėse ląstelėse

gali būti sąlygojami gemcitabino poveikio mitochondrijų biogenezei. Atspariausia gemcitabinui buvo

Capan-2 kasos vėžio ląstelių linija.

SUMMARY

Kristina Paliulionytė Master degree thesis „Investigation of energetic state of pancreatic

cancer cells“/ study supervisor prof. dr. S. Trumbeckaitė; Lithuanian university of health sciences,

Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacognosy, Kaunas.

The aim of the study. To investigate the energy state of the cancer cells (impacted and not

impacted by chemotherapic drug – gemcitabine) .

Tasks. To compare endogenous respiration rates of different pancreas cell lines: Capan-1,

Capan-2, SU.86.86, MIAPaCa-2, impacted and not impacted by gemcitabine, to study the impact of

gemcitabine on respiratory functions of mitochondria of pancreatic cancer cells lines; to study the

impact of gemcitabine on the permeability of inner and outer mitochondrial membrane of pancreatic

cancer cell lines.

Methods. Pancreatic cancer cell lines were divided into control and test groups, which were

impacted by gemcitabine. The respiration rate of pancreatic cancer cells with glutamate/ malate and

succinate as substrates was registered by oxygraphic method using „Oroboros Oxygraph-2k“ device.

Results. Gemcitabine increased (app. 2,4 and 1,5-folds) the endogenous respiration rate in

MIAPaCa-2 and SU.86.86 cell lines in comparison with control group. Gemcitabine increased (app. 2

– folds) the mitochondrial respiration rate in MIAPaCa-2, Capan-1 and SU.86.86 cancer cell lines,

respiring on glutamate/malate and succinate as substrates but suppressed the mitochondrial

respiratory control index by 13-15 %. Gemcitabine had no impact on the permeability of outer

mitochondric membrane, but increased the permeability of mitochondrial inner membrane in

MIAPaCa-2 ir Capan-1 cell line.

Conclusions. The revealed changes in endogenous and mitochondrial respiration rates in

pancreatic cancer cells could be due to gemcitabine impact on biogenesis of mitochondria. Capan-2

pancreatic cancer cell line was the most resistant to gemcitabine pre-treatment.

7

Padėka

Nuoširdžiai dėkoju šio darbo vadovei prof. dr. Sonatai Trumbeckaitei už labai vertingas

konsultacijas, kantrybę, visuomet suteiktą pagalbą ir paaiškinimus/patarimus rašant šį mokslinį darbą.

Taip pat dėkoju Neuromokslų Instituto Biochemijos laboratorijos, Virškinimo sistemos tyrimų

instituto Chirurginės gastroenterologijos laboratorijos darbuotojams ir ypač Aldonai Jakštaitei už

pagalbą vykdant tyrimus.

8

SANTRUMPOS

GEM – gemcitabinas

ADP – adenozino 5′ – difosfatas

ATP – adenozino 5′ – trifosfatas

FAD – flavinadenino dinukleotido oksiduota forma

FADH2 – flavino adenino dinukleotido redukuota forma

KoQ – kofermentas Q (ubichinonas)

KoQH2 – kofermento Q (ubichinono) redukuota forma

NAD – nikotinamido adenino dinukleotido oksiduota forma

NADH – nikotinamido adenino dinukleotido redukuota forma

KKK – mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas

9

1. ĮVADAS

Visame pasaulyje diagnozuojama labai daug vėžinių susirgimų. Dažniausiai pasireiškia

plaučių, gimdos, stemplės, krūties, stemplės vėžiai ir kt. Lietuva taip pat pasižymi pakankamai dideliu

vėžio sergamumu – kasmet registruojama daugiau nei 2000 vėžio atvejų. Neretai pasitaiko kasos

vėžys. Ši žmogaus vėžio forma yra labai agresyvi ir sunkiai pasiduoda chemoterapiniam ir

radioterapiniam gydymui. Kasos vėžys yra vienas iš pavojingiausių. Apie rizikos faktorių, kuris

sukelia kasos vėžį, nėra žinoma, tačiau kava, alkoholis, dietos, rūkymas yra vieni iš galimų kasos vėžio

atsiradimo rizikos faktorių. Manoma, kad epigenetiniai kasos vėžio pakitimai gali būti viena iš

priežasčių, dėl padidėjusio kasos vėžio atsparumo gydymui ir apoptozei [1, 2].

Dažniausiai chemoterapiniame kasos vėžio gydyme vartojamas gemcitabinas, kurio veikimo

mechanizmas remiasi tuo, kad slopina DNR sintezę ir vėžinių ląstelių dalijimąsi. Kai ląstelės nebegali

dalintis, jos žūsta ir tokiu būdu navikas yra slopinamas. Atlikus tris chemoterapijos kursus

gemcitabinu, 41 % pacientų po diagnozės išgyvena ilgiau negu 12 mėnesių [3].

Mitochondrijos yra ląstelės organelės, dalyvaujančios ne tik ATP sintezėje, bet ir ląstelės

žūties procesuose apaptozės ar nekrozės būdu.

Kasos vėžys patenka į penketuką mirtingiausių ligų Jungtinėse Amerikos Valstijose [2].

Mažiau nei 20 % ligonių išgyvena 2 metus po ligos diagnozavimo ir tik apie 5 % gyvena ilgiau nei 5-

erius metus. Išplitusio kasos vėžio tikimybės išgyventi mediana yra apie 6 mėnesius [2]. Norint

pagerinti gydymo rezultatus, reikia ieškoti naujų metodų, tinkamų kasos vėžio gydymui. Šia ligos

forma vis dažniau suserga jauni žmonės, o ir tikimybė išgyventi menka dėl blogo kasos vėžio atsako į

gydymą, todėl tai yra aktuali problema. Šiuo metu nėra pakankamai daug informacijos apie kasos

vėžinių ląstelių energetinę būklę bei jų atsparumo chemoterapijai mechanizmus, todėl mes ir atlikome

šį tyrimą, ištirdami kasos vėžinių ląstelių endogeninį kvėpavimą, mitochondrijų kvėpavimo greičius,

mitochondrijų vidinės ir išorinės membranos pralaidumus.

Šiame darbe išnagrinėta ir apibendrinta literatūra apie kasos vėžį, jo gydymą, kasos vėžines

ląsteles, bei įvertintas gydymui naudojamo chemoterapinio vaisto Gemzar (gemcitabino, slopinančio

DNR sintezę ir vėžinių ląstelių proliferaciją) poveikis kasos vėžinių ląstelių energetikai.

Eksperimentiniu būdu buvo ištirtos kasos vėžinių ląstelių: Capan-1 (kasos adenokarcinomos ląstelių

linija), Capan-2 (kasos adenokarcinomos ląstelių linija), SU.86.86 (kasos adenokarcinomos ląstelių

linija), MIAPaCa-2 (kasos adenokarcinomos ląstelių linija), kvėpavimo funkcijos (be vaisto ir su juo).

Kasos vėžinių ląstelių kvėpavimo registravimas (deguonies suvartojimo, mitochondrijų kvėpavimo

grandinės aktyvumo įvertinimas) – oksigrafinis metodas, atliekamas su „Oroboros Oxygraph-2k“

aparatu.

10

Darbe siekiama išsiaiškinti kasos vėžinių ląstelių atsparumą cheminio preparato Gemzar

poveikiui ir turimą įtaką ląstelių energetikai.

Darbo naujumas ir praktinė reikšmė

Šiuo metu nėra tyrimų apie kasos vėžinių ląstelių energetinę būklę (poveikį mitochondrijų

kvėpavimo greičiams, vidinės ir išorinės membranos pralaidumui) bei jų atsparumo chemoterapijai

mechanizmus. Šiame tyrime nustatėme, kad gemcitabino poveikyje didėja mitochondrijų kvėpavimo

greičiai okiduojant glutamatą/malatą ir sukcinatą MIAPaca-2, Capan-1 ir SU.86.86 kasos vėžinėse

ląstelių linijose, ir slopinamas mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas. Atspariausia

gemcitabino poveikiui buvo Capan-2 kasos vėžio ląstelių linija. Endogeninio ir mitochondrijų

kvėpavimo greičio pokyčiai kasos vėžinėse ląstelėse gali būti sąlygojami gemcitabino poveikio

mitochondrijų biogenezei. Šie tyrimai atskleidė naujų žinių apie gemcitabino poveikį skirtingų kasos

vėžinių ląstelių linijų mitochondrijoms ir apie galimus kasos vėžinių ląstelių atsparumo gemcitabinui

mechanizmus.

11

2. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: ištirti kasos vėžinių ląstelių (paveiktų ir nepaveiktų chemoterapiniu vaistu-

gemcitabinu) energetinę būseną.

Darbo uždaviniai:

1. Ištirti ir palyginti gemcitabino poveikį kasos vėžinių ląstelių linijų: Capan-1, Capan-2,

SU.86.86, MIAPaCa-2, endogeninio kvėpavimo greičiams.

2. Ištirti gemcitabino poveikį kasos vėžinių ląstelių: Capan-1, Capan-2, SU.86.86,

MIAPaCa-2, mitochondrijų kvėpavimo funkcijoms.

3. Ištirti gemcitabino poveikį kasos vėžinių ląstelių linijų: Capan-1, Capan-2, SU.86.86,

MIAPaCa-2, mitochondrijų vidinės ir išorinės membranos pralaidumui.

12

3. LITERATŪROS APŽVALGA

3.1. Kasos vėžys

Kasos adenokarcinoma – labai rimta, mirtina liga. Kol kas nėra veiksmingų, efektyvių

gydymo būdų arba jų yra labai mažai. Kasos vėžiu sergančių pacientų tikimybė išgyventi yra pati

prasčiausia, palyginus su kitų vėžinių formų ligomis sergančiais pacientais. Ligai progresavus, gyventi

lieka apie 6 mėnesius. Kasos vėžys yra ketvirtas pagal pacientų mirtingumą, tad yra tik 5 % tikimybė,

kad pacientas, sergantis kasos vėžiu, išgyvens 5-erius metus [2]. Nepaisant pažangios chirurgijos ir

medicinos terapijos, nuo kasos vėžio Jungtinėse Amerikos Valstijose per metus miršta 31 000 žmonių.

Situacija Lietuvoje yra tokia, jog paskutiniuosius 20 metų pacientų sergamumas kasos vėžiu auga – per

metus vyrų sergamumas padidėja 2 %, o moterų – 1,6 %. Nustatyta, kad Lietuvoje 2002–2005 m.

išgyveno 5,2 % pacientų, sergančių kasos vėžiu 5-erius metus. Vienas iš pagrindinių kasos vėžio

požymių – plati vietos naviko invazija ir ankstyva sisteminė sklaida [1, 2].

3.2. Kasos vėžio patogenezė

Pirmiausia, vardijami etiopatogenezės rizikos faktoriai, kurie gali nulemti kasos vėžio

atsiradimą ar aktyvėjimą. Tai gali būti aplinkos veiksniai, tokie kaip nesaikingas kavos bei alkoholio

vartojimas, įvairių dietų laikymasis bei diabeto požymiai [4]. Verta paminėti, kad rūkymas yra bene

vienas svarbiausių rizikos faktorių. Taip pat išskiriami ir demografiniai veiksniai, tokie kaip rasė, lytis,

amžius, gyvenamoji vietovė. Ligonių paveldimumas taip pat yra vienas iš rizikos faktorių, kuris gali

didinti tikimybę susirgti kasos vėžiu. Visi etiologiniai rizikos faktoriai gali būti skirstomi į

endogeninius ir egzogeninius [4]. Jie veikia DNR, todėl dar yra vadinami genotoksinais. Veikdami jie

sukelia tiesioginį ir netiesioginį poveikį ląstelei. Poveikio sistema prasideda tuo, jog jie pradžioje būna

prokancerogenais, vėliau virsta kancerogenais ir galiausiai jungiasi prie DNR, sudarydami toksiškus

junginius, dėl kurių atsiranda genų mutacijos [4].

Kasos vėžio onkogenezėje dalyvauja kelios genų grupės, kurios yra suskirstytos į onkogenus

bei naviką slopinančių genų grupes. Onkogenai: K-ras, c-erbB-2, c-c-eebB-3, c-myc, c-fos. Naviką

slopinantys genai: p53, p16, p15, DCC, DPC4, Rb, APC [4]. Onkogenai susidaro iš protoonkogenų,

taip sukeldami mutacijas. Ras genai: K-ras, N-ras, H-ras, yra vieni iš pagrindinių genų, kurių mutaciją

nustatant galime įtarti kasos vėžį. Konkrečiau kasos vėžio audinyje yra nustatoma K-ras geno 12

kodono mutacija. Pasitelkus PGR (polimerazės grandininės reakcijos) tyrimo metodą, nustatomos genų

mutacijos kasos vėžio audinyje, kasos sultyse, kraujo plazmoje, o šių genų koduojami pakitę baltymai

13

nustatomi imunohistochemiškai, imunologiškai bei molekulinės biologijos metodais [4]. Jeigu kartu

nustatomas ras mutavęs onkogenas su c-myc, tokiu atveju nustatoma piktybiškesnė kasos vėžio stadija.

Iš naviką slopinančių genų, svarbiausias yra p53, kuris randamas 17 chromosomos trumpajame petyje.

Šio geno koduojamas baltymas neigiamai veikia proliferaciją bei ląstelės augimą [4].

3.3. Kasos vėžio gydymas

Kasos vėžio, kaip ir daugelio kitos rūšies vėžių, gydymo efektyvumas priklauso nuo to,

kokioje stadijoje jis yra diagnozuojamas. Du trečdaliai kasos vėžio atvejų būna kasos galvoje ir vienas

trečdalis kasos kūne arba uodegoje. Didžiausią tikimybę išgyti turi tie pacientai, kurie savo sveikatą

tikrinasi dažniau ir vėžys yra diagnozuojamas ankstyvoje stadijoje [5]. Duomenys rodo, kad

dažniausiai kasos vėžys diagnozuojamas per vėlai. Tik 10-20 % pacientų turi galimybę išgyti po auglio

šalinimo operacijos. Dauguma pacientų išgirsta diagnozę, kad gyventi liko mažiau nei metai.

Mokslininkai stengiasi tobulėti šioje srityje, atlikdami įvairius bandymus ir tyrimus, kad pacientų,

sergančiu kasos vėžiu, mirtingumas būtų kuo mažesnis [6].

Kasos vėžio stadijos:

1. Ankstyvoji stadija. Netgi šioje stadijoje nustačius vėžį, prognozės nėra itin geros. Jeigu

vėžys nėra išplitęs į kitus organus ar audinius ir įmanoma atlikti operaciją, tik 7-25 % pacientų gyvens

5 metus ir ilgiau. Dažniausiai vėžio ląstelės būna jau išplitusios prieš operaciją. Ląstelės yra pernelyg

mažos, kad būtų pastebėtos tyrimų metu, tačiau palaipsniui išauga į kitos rūšies vėžius [7].

2. Pažengusi stadija – tai stadija, kai vėžys jau yra nebeoperuojamas ir tikimybės išgyventi

vidurkis siekia maždaug 6-11 mėnesių. Jeigu vėžys jau išplitęs, tikimybė išgyventi sumažėja iki 2-6

mėnesių. Tačiau tai priklauso nuo to, kiek stipriai vėžys yra išaugęs ir išplitęs [7].

3.4. Gydymo metodai

Gydymo metodas parenkamas priklausomai nuo ligos stadijos (kuo ankstyvesnė tuo geriau),

kasos vėžio tipo (cistiniai ir endokrininiai kasos vėžiai dažniau išoperuojami), nuo amžiaus ir bendros

sveikatos būklės (pacientas turi būti pakankamai lieknas, kad, prireikus, būtų galima lengviau pasiekti

auglį) [5].

1. Chirurginis (operacijos metu pašalinama visa ar dalis kasos ir šalia esantys audiniai)

metodas. Šis metodas atliekamas pacientams su 1 ir 2 stadijos kasos vėžiu. Chirurginis kasos vėžio

14

gydymas netaikomas, kai auglio neįmanoma rezekuoti arba yra metastazių, išplitusių į kitus organus ar

audinius. Dažniausiai pasirenkamos organą išsaugančios operacijos [5, 6].

2. Radioterapinis (vėžio ląstelės naikinamos lokalizuotoje vietoje) metodas. Šis gydymo

metodas neskiriamas taip dažnai, palyginus su navikų operacijomis ar chemoterapija, tačiau padeda

sumažinti ligos simptomus. Kai chirurginė operacija negalima, taikomas radioterapijos ir

chemoterapijos (kombinuotas) derinys. Radioterapijos metu naudojami stiprių bangų spinduliai, kurie

žudo vėžines ląsteles. Tačiau šis metodas nėra visiškai patikimas, todėl, kad jos metu gali žūti ir

sveikos ląstelės bei atsirasti šalutinių poveikių [5, 6].

3. Chemoterapinis (vėžio ląstelės naikinamos visame kūne) metodas. Šis metodas

paprastai skiriamas jau po chirurginės operacijos, užtikrinti, kad vėžys nepasikartos. Dažniausiai

skiriama gemcitabino arba 5-fluorouracilo chemoterapija. Jei kasos vėžys jau pažengęs, chemoterapija

padeda ne visada ir net nėra matomų akivaizdžių pagerėjimo požymių. Pažengusiam kasos vėžiui

gydyti būna paskiriama chemoterapinių vaistų kombinacija, tai sukelia daugiau šalutiniu poveikių negu

vartojant vieną vaistą, tačiau tai didina tikimybę išgyventi ilgiau [5, 6].

Kadangi kasos vėžys yra labai atsparus chemoterapiniam gydymui, yra ieškoma naujų,

efektyvių gydymo metodų ir galimybių, kurios padėtų padidinti gydymo veiksmingumą ir pagerinti

tikimybes išgyventi rezultatus.

3.5. Kasos vėžio atsparumas

Kasos vėžio sukeliami pokyčiai molekuliniame lygmenyje nėra visiškai išaiškinti ir

suprantami. Manoma, kad epigenetiniai pakitimai gali būti viena iš priežasčių, dėl padidėjusio kasos

vėžio atsparumo gydymui ir apoptozei [2]. Vienas jų – DNR metilinimas. Vėžinėse ląstelėse

aptinkamas padidintas Apaf-1 koduojančio geno metilinimo lygis. Šis genas dalyvauja apoptosomos

susidaryme, dėl to randama sumažėjusi jo raiška [8].

Ląstelių proliferacijai ir apoptozei reikalinga potranskripcinė genų reguliacija, kuri yra

siejama su kasos adenokarcinomos atsparumu chemoterapijai. „Žinoma, kad vėžinėse ląstelėse

potranskripcinė genų reguliacija keičiasi dėl RNR surišančių baltymų. HuR (ELAV1) yra RNR

surišantis baltymas, reguliuojantis daugelio molekulių ekspresiją, prisijungdamas jų iRNR ir

skatindamas baltymų sintezę nuo jų“ [9].

Kasos vėžinių ląstelių atsparumas tradiciniam gydymui, chemoterapijai priklauso nuo jų

sugebėjimo inicijuoti apoptozę. Todėl reikia suprasti kasos vėžinių ląstelių apoptozės mechanizmų

anomalijas, kad būtų sumažintas šių vėžinių ląstelių atsparumas chemoterapijai [10].

15

3.6. Tyrimams naudotos kasos vėžinių ląstelių linijos

Šiais laikais ląstelių ar audinių kultūros yra labai svarbios medicininiuose tyrimuose. Bene

kiekvieną diena ląstelių linijos naudojamos įvairiems tyrimams, pvz.: tiriant preparatų veiksmingumą,

norint persodinti gyvą audinį, esant odos nudegimams, kamieninių ląstelių naudojimas prieš

transplantaciją. Ląstelių linijos, užaugintos in vitro sąlygomis, leidžia išlaikyti joms būdingas

biologines savybes. Santykinai didelis skaičius labai gerai apibūdinamų žmogaus kasos vėžio ląstelių

linijų yra prieinamos naudoti ikiklinikiniams tyrimams [11].

Capan-1 – tai kasos adenokarcinomos ląstelių linija, išskirta iš žmogaus. Vėžio somatinių

mutacijų duomenų bazėse įrašyta, jog su šia ląstelių linija iš viso buvo atlikti 652 tyrimai ir nustatyta,

kad 380 genų turėjo mutacijas. Ši ląstelių linija tinkama transfekcijoms. Capan-1 išskiria skrandžio

tipo muciną ir išreiškia cistinės fibrozės transmembraninio laidumo reguliatorių.

SU.86.86 – kasos adenokarcinomos ląstelės išskirtos iš metastazės kepenyse. Pavienės,

adherentinės, tipas: epitelinės, dvigubėjimo trukmė – 28-48 h. Mutacijos: p53.

Capan-2 – tai žmogaus kasos adenokarcinomos ląstelių linija. Capan-2 pirma kartą buvo

išskirtos 1975m. iš pirminio naviko, kurį turėjo 56 metų kaukazietis vyras, sergantis kasos duktaline

adenokarcinoma. Šios ląstelės auga limpančių/adhezinių audinių kultūroje, kurios augdamos formuoja

vieną sluoksnį ir pasižymi epitelio sandara. Ši ląstelių linija suformuoja gerai diferencijuotus auglius,

kai šių ląstelių yra suleidžiama į imuninių pelių organizmus.

MIAPaCa-2 – kasos adenokarcinomos ląstelės išskirtos iš pirminio auglio. Pavienės,

adherentinės, tipas: epitelinės, dvigubėjimo trukmė - apie 26 h. Tai yra hypotriploidinė žmogaus

ląstelių linija. Modalinis chromosomų skaičius yra 61. Mutacijos: p53, p16, K-ras.

3.7. Gemzar (gemcitabinas)

Gemzar (gemcitabinas) yra priešvėžinis chemoterapinis vaistas. Jis skiriamas kasos vėžio,

nesmulkialąsteliniam plaučių vėžio, šlapimo pūslės vėžio, minkštųjų audinių sarkomos, kiaušidžių

vėžio gydymui ir profilaktikai. Gemcitabinas yra antimetabolitas, purino antagonistas. Jo formulė

pateikta 1 paveiksle. Jis skiriamas kaip standartas kasos vėžiui gydyti, nors jo efektyvumas nėra

didelis.

16

1 pav. Gemcitabino hidrochlorido formulė [12]

Gemtabicino veikimo mechanizmas remiasi tuo, kad jis slopina DNR sintezę ir vėžinių

ląsteliu dalijimąsi. Kai ląstelės nebegali dalintis, jos žūsta ir tokiu būdu navikas yra slopinamas.

Antimetabolitai yra panašūs į įprastas medžiagas. Kai ląstelės įtraukia šias medžiagas į vidų, į

medžiagų apykaitą, ląstelės praranda galimybę dalintis [13]. Gemzar vaistas veikia ląsteles konkrečiu

ląstelės ciklo momentu – tik tuomet, kai ląstelės dalijasi.

Su Gemzar vaistu buvo atliktas tyrimas: „Kasos adenokarcinomos ląstelių in vitro atsakas į

chemoterapinį vaistą gemcitabiną, nuslopinus HuR geno raišką“ [6]. Tyrimas buvo atliekamas su

SU.86.86 ląstelių linija bei su Capan-2 ląstelių linija, kurios bus naudojamos ir šiame tyrime. Buvo

naudojamos tokios gemcitabino koncentracijos: 0, 3, 5, 7, 10, 50, 100, 500, 1 000, 2 000, 5 000 ng/ml,

tačiau nustatyta, kad inhibuojančioji gemcitabino dozė SU.86.86 ląstelių linijai yra 25 ng/ml, o Capan-

2 ląstelių linijai – 5 µg/ml. Po poveikio gemcitabinu, ląstelių gyvybingumas siekė SU.86.86 ląstelėse –

59,80 %, o Capan-2 ląstelėse – 79,64 %. Gauti rezultatai, naudojant MTT metodą gyvybingumui

nustatyti, parodė, kad mažiausias ląstelių gyvybingumas buvo toje ląstelių grupėje, kurios buvo

paveikiamos gemcitabinu dar prieš tai jose nuslopinus HuR geno raišką: SU.86.86 ląstelių

gyvybingumas siekė 25,64 %, o Capan-2 ląstelių gyvybingumas – 72,18 %. Autoriai daro išvadą, kad

sumažėjus baltymo HuR kiekiui, kasos vėžio ląstelės yra jautresnės chemoterapiniam vaistui, ką

parodo jų gyvybingumo sumažėjimas. SU.86.86 ląstelių linija buvo žymiai jautresnė gemcitabinui,

nutildžius HuR geno raišką [9].

Kiti autoriai teigia, kad kasos vėžio gydymas vienu gemcitabinu yra žymiai mažiau

veiksmingas, negu gydant kombinacijoje su KML001(natrio meta-arsenitu). Kartu jie stipriau slopina

17

ląstelių proliferaciją, invaziją ir žymiai sumažina epidermio augimo faktoriaus receptoriaus (EGFR) ir

matricos metiloproazės-2 (MMP2) išraišką [14].

Įvairiose kasos vėžio ląstelių linijose gemcitabino sukeltą ląstelių augimo slopinimą stiprina

P276-00 (nuo ciklinų priklausomas kinazės inhibitorius). Nukleozidų analogas gemcitabinas yra

dažniausiai naudojamas kasos vėžio gydymui, tačiau jis visiškai jo neišgydo, tik prailgina žmogaus,

sergančio kasos vėžiu, gyvenimą keliais mėnesiais [15].

Kadangi gemcitabinas yra vienas iš pagrindinių vaistų kasos vėžiui gydyti, tai su šiuo vaistu

buvo atliktas tyrimas ir žiūrėta, kiek prailgėja paciento gyvenimas, atlikus chemoterapiją šiais vaistais

[9]. Buvo tiriami 49 pacientai su pažengusiu kasos vėžiu ir buvo pastebėta, kad gemcitabinas prailgina

paciento gyvenimo trukmę. 41 % pacientų išgyvena ilgiau negu 12 mėnesių po diagnozės, atlikus tris

chemoterapijos kursus gemcitabinu. Pacientams, kurių kasos vėžio navikas yra mažas, o BUN

(kreatinino ir kraujo šlapalo azoto) serumo kiekis normalus, gemcitabinas gali būti efektyvus ir

prailginti tų pacientų gyvenimą [16].

Schniewind ir kt. parodė, kad kasos vėžio jautrumas gydymui gemcitabinu siejamas su nuo

mitochondrijų priklausomos apoptozės keliu. Buvo atlikti tyrimai, kaip nuo mitchondrijų 2 signalinio

transdukcinio kelio aktyvavimo priklauso apoptozės skatinimas bei kaip chemoterapinis vaistas

gemcitabinas indukuoja apoptozę [17]. Tyrimas buvo atliekamas su kasos vėžinių ląstelių linijomis:

Colo357, PancTu1 ir Panc1, tiriant jų jautrumą gemcitabinui. Jautriausia gemcitabinui buvo Colo357,

toliau Panc1, o visiškai atspari – PancTul ląstelių linija. Norint molekuliniame lygmenyje įvertinti

gemcitabino įtaka apoptozei, buvo tiriamas ir apoptozinų baltymų aktyvavimas. Nors skirtingas

jautrumas gemcitabinui skiriasi tarp kasos vėžio ląstelių linijų, nustatyta, kad gemcitabinas skatina

ląstelių apoptozės vyksmą nuo mitochondrijų priklausomu signaliniu keliu [17].

3.8. Gemcitabino (Gemzaro) poveikis mitochondrijoms

Tyrimų kaip gemcitabinas veikė kasos vėžio mitochondrijų funkcijas nėra. Todėl mūsų darbo

tikslas buvo ištirti ir aprašyti, kaip šis vaistas veikia mitochondrijų kvėpavimo greičius, ar turi poveikį

mitochondrijų oksidaciniam fosforilinimui.

3.9. Mitochondrijų struktūra ir funkcija

Mitochondrijų kiekis ląstelėse dažnai skiriasi ir priklauso nuo ląstelės tipo bei ląstelės

energijos poreikio. Aukštesniųjų augalų ląstelėse dažniausiai randama nuo 50 iki 2000 mitochondrijų.

18

Mitochondrijos – judrios, dinamiškos organelės, esančios ląstelėje, užtikrinančios ląstelės kvėpavimą,

kurio rezultatas – energija, organizmo panaudojama įvairių procesų vyksmui, atpalaiduojama arba

akumuliuojama adenozintrifosfato rūgšties (ATP) pavidale. Kitos mitochondrijų funkcijos: hemo,

lipidų, amino rūgščių ir nukleotidų sintezė, neorganinių jonų homeostazės palaikymas, ląstelės žūties

valdymas.

2 pav. Mitochondrijų struktūra [18]

Mitochondrija yra dvimembranė organelė. Tai reiškia, kad ji yra dukart apsupta membranos

sistemos, sudarytos iš vidinės ir išorinės mitochondrijų membranų, atskirtų tarpmembranine erdve.

Tarpmembraninė erdvė dažniausiai būna nuo 6 iki 8 nm storio. Mitochondrijos ilgis dažniausiai siekia

1-7 µm, o plotis 0,5-1 µm. Vidinė ir išorinė membranos skiriasi baltymų-lipidų santykiu pagal masę.

Vidinėje membranoje santykis 4:1, o išorinėje 1:1 [19]. Išorinė membrana yra pusiau pralaidi jonams ir

mažoms molekulėms. Ją sudaro 6 % visų mitochondrijos baltymų. Vidinė membrana yra nepralaidi,

todėl medžiagos patenka veikiant įvairioms specialioms pernašų sistemoms. Vidinę membraną sudaro

21 % baltymų, o tarpmembraninę erdvę 6 % visų mitochondrijos baltymų. Net iki 67 %, t.y. didžiausią

dalį, baltymų turi mitochondrijų užpildas.

19

Kiekviena iš mitochondrijos struktūros dalių atlieka skirtingas funkcijas (žr. 2 pav.). Vidinė

membrana matrikse išsidėsto sudarydama vingiuotas klostes, kurios vadinamos kristomis. Kristos

padidina vidinės membranos paviršiaus plotą, o tai leidžia aktyviau vykdyti oksidacinį fosforilinimą

[19]. Užpilde yra mitochondrijų genetinė sistema, taip pat kaip ir fermentai, atsakinga už pagrindines

oksidacinio metabolizmo reakcijas. Gliukozė ir riebalų rūgštys yra pagrindinis energijos šaltinis

ląstelėse. Piruvato ir riebalų rūgštys paverčiamos į acetil-KoA mitochondrijų užpilde.

Trikarboksirugščių ciklo metu acetil-KoA yra oksiduojamas į CO2. Acetyl-KoA pavertimas CO2 yra

siejamas su NAD+ ir FAD redukcija į NADH ir FADH2 atitinkamai, kuriuos oksiduojant

mitochondrijose oksidacinio fosforilinimo proceso metu sintetinama ATP [20].

Išorinė mitochondrijų membrana, priešingai nei vidinė, laisvai praleidžia mažas molekules.

Taip yra dėl baltymų, kurie sudaro kanalus ir leidžia medžiagoms, mažesnėms nei 600 daltonų, pro ją

praeiti. Vidinė mitochondrijų membrana palaiko protonų gradientą, kuris skatina oksidacinį

fosforilinimą [20].

Medžiagų oksidacija visuose organizmuose vyksta trijomis stadijomis [21]. Pirmoje stadijoje

išlaisvinama nedaug energijos, čia įvairūs substratai oksiduojami iki acetil-KoA. Antroje stadijoje

dviangliai fragmentai (acetil-KoA pavidale) matrikse oksiduojami Krebso cikle, tai susiję su didelių

energijos kiekių išlaisvinimu redukuotų kofermentų NADH ir FADH2 pavidale. Trečiojoje stadijoje

mitochondrijų kvėpavimo grandinėje oksiduojami redukuoti nikotinamidų ir flavino kofermentai, šiuo

metu susidaro vanduo ir išlaisvinama daugiausiai energijos, kuri panaudojama ATP sintezei [21].

3.10. Mitochondrijų oksidacinis fosforilinimas

Oksidacinis fosforilinimas – tai vidinėje mitochondrijų membranoje vykstantis procesas, kai

energija, kuri išsiskiria oksiduojantis NADH ir FADH2, yra panaudojama ATP sintezei.

Membraninio proceso metu (pernešant elektronus mitochondrijose) energija paverčiama į

elektrocheminį protonų gradientą, kuris panaudojamas ATP sintezei. Tokiu būdu elektronų pernaša

mitochondrijų kvėpavimo grandine (oksidacija) susijusi su ADP fosforilinimu, todėl tai vadinama

oksidaciniu fosforilinimu [21]. Galima išskirti keturis mitochondrijų kvėpavimo grandinės

kompleksus: I kompleksas – NADH dehidrogenazė, II kompleksas – sukcinato dehidrogenazė, III

kompleksas – citochromo bc1, IV kompleksas – citochromo c oksidazė. Mitochondrijų kvėpavimo

grandinės kompleksai pavaizduoti 3 paveiksle. Tarp šių kompleksų elektronus perneša mažesni,

judrūs elektronų nešikliai (KoQ ir citochromas c), kurie į kompleksų sudėtį neįeina (žr. 4 pav.) [21].

Kvėpavimo grandinė – tai vidinėje mitochondrijų membranoje esanti sudėtinga oksidacijos-

redukcijos sistema, kuri perneša elektronus deguoniui (susidarant vandeniui) [21]. Pagrindinė

20

kvėpavimo grandinės funkcija – laipsniškai išlaisvinti energiją iš kvėpavimo grandinės substratų

(redukuotų kofermentų (NADH ir FADH2)) [21].

3 pav. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksai [22]

Kompleksai turi vieną arba kelias prostetines grupes, kurios grįžtamai prijungia elektronus.

Labai svarbi elektronų pernašos kvėpavimo grandinėje savybė yra tai, jog ji susijusi su protonų

pernaša iš mitochondrijų užpildo į tarpmembraninę erdvę. Kvėpavimo grandinėje protonus išmeta

kompleksai I, III ir IV [47]. ADP fosforilinimas nėra savaiminis, šiam procesui būtina energija, kuri

gaunama skylant kitam makroerginiam junginiui. Todėl šis fosforilinimo būdas – substratinis

fosforilinimas. Oksidaciniu fosforilinimas – kai fosforilinimui reikalingą energiją teikia, vykstantys

oksidacijos-redukcijos procesai membranoje, veikiančioje kvėpavimo grandinėje [23].

Pirmasis mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksas sudarytas iš 46 baltymų subvienetų,

kurių masė siekia 1000 kDa. Antrasis sudarytas iš 4 baltymų subvienetų: A, B, C, D. Pirmieji du yra

hidrofiliniai, o C ir D yra transmembraniniai. Trečiajį kvėpavimo kompleksą sudaro du dimerai, kurie

turi po 11 subvienetų. Paskutinis ketvirtasis mitochondrijų kvėpavimo kompleksas sudarytas iš 13

subvienetų.

21

4 pav. Mitochondrijų elektronų transporto grandinės kompleksų kodavimas dvejomis

genetinėmis sistemomis. Genetinės sistemos: mitochondrijų DNR (MtDNR) ir branduolio DNR

(nDNR). MtDNR koduoja 7 NADH dehidrogenazės subvienetus kompleksui I, citochromo B

kompleksui III, 3 citochromo c oksidazės (COX) subvienetus kompleksui IV ir 2 ATPazės kompleksui

V. Tik kompleksas II yra užkoduotas nDNR. Nepunktyrinės rodyklės žymi elektronų srautą kvėpavimo

grandinės kryptimi; punktyrinės rodyklės rodo genetinės informacijos iš MtDNR ar nDNR į RNR ir į

baltymą; skaičiai rodo faktinį skaičių baltymų subvienetų koduotų kiekvienos genetinės sistemos.

Specifiniai inhibitoriai RNR transkripcijos arba baltymų transliacijos nurodomi violetine spalva [24]

Pirmasis mitochondrijų kvėpavimo kompleksas, NADH dehidrogenazė, greitina elektronų

pernašą nuo NADH ant KoQ, kur vėliau KoQ tampa redukuotas – susidaro KoQH2. Ubichinonas

perneša elektronus į trečią kompleksą iš pirmojo. Pirmojo komplekso du elektronai bei protonai

pradžioje pernešami nuo NADH ant FMN, kol galiausiai pasiekia KoQ. Į tarpmembraninę erdvę

pernešami 4 protonai iš mitochondrijų užpildo [25].

Trikarboksirūgščių ciklo reakcijose, oksidacinio fosforilinimo reakcijose dalyvauja antrasis

mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksas – sukcinato dehidrogenazė, kuris jungiasi su vidine

mitochondrijų membrana. Antrasis mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksas katalizuoja

sukcinato oksidaciją ir KoQ redukciją, kurios metu susidaro produktas – fumaratas. Tokiu būdu

elektronai ir protonai patenka ant KoQ nuo sukcinato [26]. Elektronai ir protonai yra pernešami ant

FAD nuo sukcinato, galiausiai susidaro KoQH2. Šis kompleksas reguliuoja Krebso ciklo aktyvumą,

pernešdamas elektronus i kvėpavimo grandinę [26, 27].

Elektronai, nuo redukuoto KoQ (KoQH2) per trečiąjį kvėpavimo grandinės kompleksą

(citochromas bc1 kompleksą), pernešami citochromui c. Elektronų pernaša vykdoma nuo ubichinolio

22

iki citochromo b, vėliau jie pernašami Fe-S bei citochromui c1, kol galiausiai pasiekiamas citochromas

c ir jis redukuojamas. Šis kompleksas yra kaip protonų pompa, nes į citozolį per membraną iš užpildo

pernešami 4 protonai [25, 27, 28].

Paskutinis, ketvirtasis mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksas (citochromo c

oksidazė), prisijungęs prie vidinės mitochondrijų membranos išorinės pusės, perneša elektronus nuo

citochromo c molekuliniam deguoniui. IV kompleksas turi keturis redokso centrus: CuA, CuB ir du

hemus (a ir a3). Pradinis citochromo c elektronų akceptorius – CuA. Nuo CuA ant hemo a3 elektronus

perneša hemas a, o hemas a3, kartu su CuB, prijungia deguonį ir jį redukuoja susidarant vandeniui.

Prijungus keturis elektronus ir keturis protonus, susidarius dviem vandens molekulėms yra

redukuojamas deguonis. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės IV kompleksas, priešingai nei I ir III,

perneša du protonus iš mitochondrijų užpildo į tarpmembraninę erdvę [27, 28].

Yra išskiriamas ir penktasis kvėpavimo grandinės kompleksas, kuris katalizuoja ATP sintezę

iš ADP ir neorganinio fosfato, panaudojant elektrocheminį protonų gradientą. Jis vadinamas

mitochondrijų ATP sintaze [28].

3.11. Pažeistų mitochondrijų atsakas kasos vėžinėms ląstelėms

Vienas pirmųjų, teigusių, kad mitochondrijų defektai gali turėti poveikį vėžiui – O. Warburg.

Mitochondrijos vaidina svarbų vaidmenį ląstelių energijos apykaitos procese, laisvųjų radikalų

susidaryme ir apoptozėje [29]. Manoma, kad mitochondrijų disfunkcija prisideda prie vėžio vystymosi

ir progresavimo. Vėžinės ląstelės savo energetiniams poreikiams naudoja glikolizės metu, o ne

oksidacinio fosforilinimo metu gautą ATP, kas būdinga sveikoms ląstelėms. Mitochondrijų defektai

vėžinėse ląstelėse apima mitochondrijų kvėpavimo grandinės ir glikolizės fermentų pasikeitusią raišką

ir aktyvumą, sumažėjusią oksidaciją su NADH susijusiais substratais taip pat mitochondrijų DNR

(mtDNR) mutacijas. Vis dar nėra visiškai aišku, kas turi įtakos mitochondrijų DNR mutacijoms, kokie

mechanizmai yra atsakingi už tai, kaip tai veikia vėžio vystymąsi, vėžinių ląstelių atsparumą vaistams

ir ligos progresavimą [24].

Kai kurie mokslininkai mano, kad mitochondrijų disfunkcija yra susijusi su vėžinių ląstelių

atsparumu apoptozei. Manoma, kad stipriai sumažėjusi mitochondrijų funkcija sukelia svarbius vėžinių

ląstelių metabolinių funkcijų pakitimus [29, 30]. Deaktyvuojant mitochondrijų funkcijas, gali būti

skatinama specialiai užprogramuota vėžinių ląstelių mirtis, kad padėtų stabdyti vėžio plėtimąsi [31].

Vėžinių ląstelių proliferacija ir naviko agresyvumas koreliuoja su padidintu glikolizės naudojimu bei

sumažėjusia mitochondriju kvėpavimo grandinės veikla [32]. Atlikto tyrimo metu naudota krūties

vėžio ląstelių linija MDA-MB-231, kuri buvo užauginta ribojant gliukozės prieinamumą, bei kai

23

kuriuos inhibitorius, reikalingus normaliai mitochondrijų veiklai. Gauti rezultatai parodė, kad slopinant

gliukozės naudojimą mitochondrijų kvėpavimo grandinėje sukeliama vėžinių ląstelių mirtis. Toks pat

tyrimas buvo atliktas su kasos vėžinių ląstelių linija MIAPaCa-2. Rezultatai parodė, kad ir šiai vėžinių

ląstelių linijai sukėlus mitochondrijų funkcijos sutrikimus, padidėja ląstelių mirtis [32].

1990 metais, kuomet tapo prieinami eksperimentai su žinduolių ląstelių mtDNR, pasikeitė

supratimas apie vėžinių ląstelių ir mitochondrijų kvėpavimo funkcijų sasają. Buvo atlikti tyrimai,

kuriais buvo įrodytas ilgalaikis poveikis žmogaus ląstelėms. Nedidelėmis koncentracijomis

naudojamas etidijaus bromidas stipriai sumažina mitochondrijų DNR kiekį – taip nusilpnindamas

oksidacinio fosforilinimo veiklą [33]. Kai oksidacinio fosforilinimo veikla buvo slopinama, vėžinės

ląstelės pakeitė savo elgesį ir sutriko gebėjimas augti nepriklausomu būdu, pradėjo mažėti vėžio

piktybiškumo potencialas. Svarbu tai, kad auglio ląstelės, su pažeistu oksidaciniu fosforilinimu, tapo

itin jautrios citotoksiniams vaistams. Šie duomenys rodo, kad auglių atsiradimas dalinai priklauso nuo

pokyčių mitochondrijų kvėpavimo grandinėje [33].

Kadangi vėžio ląstelės ATP gamybai dažniausiai naudoja glikolizę, o ne oksidacinį

fosforilinimą, todėl jos yra jautresnės glikolizės slopinimui ir gliukozės netekimui [32]. Pastarųjų metų

tyrimai rodo, kad slopinant glikolizę ir naudojant mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksų

inhibitorius, vėžinės ląstelės pasidaro jautresnės oksidacinio fosforilinimo inhibitoriams. Taigi,

oksidacinio fosforilinimo inhibitoriais blokuojant oksidacinį fosforilinimą vėžinėse ląstelėse,

slopinamas kasos vėžio ląstelių augimas [32].

24

4. METODIKA

4.1. Aparatūra, indai

Oroboros Oxygraph-2k; magnetinė maišyklė (VARIOMAG); pH-metras (pH-Meter 766);

Analitinės svarstyklės (KERN ABJ-220-4M); vandeninis termostatas 37 C (GRANT GD120);

Hamilton mikrošvirkštai; automatinės pipetės; antgaliai; kolbos; kiuvetės; mėgintuvėliai; cilindrai;

stiklinėlės.

4.2. Medžiagos

Glutamatas (glutamato rūgštis) (SIGMA); malatas 99 % grynumo (L–obuolių rūgšties natrio

druska) (SIGMA); digitoninas (SIGMA); ADP 98 % grynumo (SIGMA); amitalis (SIGMA);

sukcinatas 99 % grynumo (SIGMA); citochromas c 99 % grynumo (SIGMA); atraktilozidas (Na–

druska) (SIGMA); dinitrofenolis (SIGMA); EDTA (SIGMA); EGTA 99 % grynumo (ROTH);

etanolis; HEPES 99,5 % grynumo (SIGMA); KCl 99,5 % grynumo (ROTH); KH2PO4 98 % grynumo

(ROTH); K–laktobionatas (ALDRICH); MgCl2∙6H2O (ROTH); sacharozė 99,5 % grynumo (ROTH);

taurinas (SIGMA).

4.3. Ląstelių linijos ir auginimo sąlygos

Tyrimams in vitro naudojamos kasos vėžio ląstelės ir linijos yra gautos komerciniu būdu.

Analizei buvo naudojamos žmogaus kasos vėžio ląstelių linijos: Capan-1, Capan-2, MIAPaCa-2 ir

SU.86.86. Ląstelės buvo auginamos vienasluoksnėse, steriliose, 75 cm2 talpos, lėkštelėse, RPMI

terpėje (5 ml) su 10 % FBS (fetalinis jaučio serumas). Lėkštelės su ląstelėmis buvo laikomos

inkubatoriuje. Capan-1, MIAPaCa-2, SU.86.86 ląstelių linijos buvo auginamos RPMI terpėje (Gibco/

Invitrogen) su 10 % FBS (fetalinis jaučio serumas) (Gibco/ Invitrogen) ir 1 % penicilino/

streptomicino tirpalu (Gibco/ Invitrogen). Capan-2 ląstelės buvo auginamos RPMI medium terpėje su

20 % FBS (fetalinis jaučio serumas) ir 1 % penicilino/ streptomicino tirpalu. Ląstelės buvo auginamos

palaikant drėgmę: oro temperatūra siekė apie 37 ˚C, o aplinka buvo prisotinta 5 % CO2.

Ląstelės augintos ir MTT testas atliktas Virškinimo sistemos tyrimų instituto Chirurginės

gastroenterologijos laboratorijoje.

25

4.4. Ląstelių paveikimas GEM ir IC50 matavimai

Ląstelės buvo pasodintos į specialias lėkšteles su 96 šulinėliais (3*103 ląstelių/ šulinėlyje),

ląstelių kultūroms auginti. Ląstelės buvo veikiamos chemoterapiniu vaistu gemcitabinu (Eli Lilly,

Indianapolis), į kiekvieną šulinėlį naudojant skirtingas koncentracijas: 0, 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000,

2000 ir 5000 ng/ml, tam, kad apskaičiuoti ir sužinoti vidutinę gemcitabino inhibuojančią koncentraciją

(IC50). Paveiktos ląstelių linijos gemcitabinu buvo laikomos 72 valandas 37 ˚C temperatūroje, o

aplinka buvo prisotinta 5 % CO2. Po 72 valandų inkubacijos, MTT metodas buvo naudojamas norint

nustatyti ląstelių gyvybingumą.

Nustatyta gemcitabino vidutinė inhibuojanti (slopinanti) koncentracija: IC50 MIAPaCa-2

ląstelių linijai buvo 50 ng/ml, SU.86.86– 25 ng/ml, Capan-1– 5 µg/ml. Capan - 2 ląstelėms IC50

nebuvo pasiekta, naudota dozė tebuvo IC40– 5 µg/ml.

4.5. MTT gyvybingumo testas

MTT metodas priklauso ląstelės funkcijų tyrimo metodų grupei, kurių metu tiriami ląstelių

augimui reikalingi metobolitai – tai ląstelių gyvybingumo nustatymas. Metodas grindžiamas tuo, jog

redukuotų piridino dinukleotidų NAD(P)H kiekis ląstelėje parodo viduląstelinių energetinių procesų

efektyvumą, o pažeistosios ląstelės nesugebės panaudoti redukuotų NAD(P)H metaboliniams

procesams ir augimui. Tetrazolio druska MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il-)-2,5-difeniltetrazolio

bromidas) redukuojama NAD(P)H susidarant chromoforui-formazanui. Susidariusio formazano kiekis

yra tiesiog proporcingas gyvoms/gyvybingoms ląstelėms. MTT vandeninis tirpalas yra gelsvas, o jį

redukavus, susidaro violetinės spalvos formazano druskos, kurių koncentracija išmatuojama

spektrofotometru.

Ląstelių gyvybingumo testas buvo atliekamas su MTT (3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5

difeniltetrazolio bromidu) (Invitrigen). Ląstelės buvo inkubuojamos su MTT (5 mg/ml) 4 valandas prie

37 ˚C temperatūros. Po 4 valandų inkubacijos, MTT tirpalas su terpe buvo pašalinamas, tuomet

violetinės formazano druskos buvo tirpinamos įpilant į šulinėlį 200 ml dimetilsulfoksido (DMSO)

(Carl ROth GmbH) ir švelniai purtant purtyklėje plokštelę 15 minučių. Absorbcija buvo matuojama

spektrofotometru (Tecan Sunrise) prie 550 nm ir 620 nm bangos ilgio ir apskaičiuojamas optinis

tankis. Duomenys apdorojami naudojant „Microsoft Offise Excel“ programą.

26

4.6. Kasos vėžinių ląstelių kvėpavimo greičio registravimas

Kasos vėžinių ląstelių kvėpavimo greičio registravimas atliktas LSMU Neuromokslų Institute.

Kasos vėžinių ląstelių kvėpavimo greičio matavimai atliekami naudojant poliarografinę sistemą

Oxygraph-2K (Oroboros, Austrija). Oksigrafiniu metodu galima įvertinti deguonies sunaudojimo greitį

per minutę bei kasos vėžinėse ląstelėse (kontrolinėse ir paveiktose chemoterapiniu vaistu gemcitabinu)

ištirti pokyčius patologijos metu, išanalizuoti endogeninio mitochondrijų kvėpavimo greičius.

Naudijant Oroboros oksigrafą matuojami deguonies srauto pokyčiai laike, nustatome jų kinetiką,

panaudojant atitinkamus mitochondrijų kvėpavimo grandinės substratus ir slopiklius.

Analizė buvo atliekama naudojant uždarą kiuvetę, kurios temperatūra buvo palaikoma apie 37

˚C. Joje įmontuotas Klark tipo deguonies elektrodas. Kadangi vėžinėms ląstelėms naudojant deguonį

kinta sunaudoto deguonies koncentracija terpėje, taip pat kinta ir jo redukcija ant platinos elektrodo bei

srovės stiprumas, einantis per tirpalą. Gautų poliarografinių kreivių pokyčiai, vėžinėms ląstelėms

naudojant deguonį, rodo srovės stiprumo pokytį, iš ko ir galime spręsti apie ląstelių (mitochondrijų)

sunaudoto deguonies koncentraciją laiko bėgyje. 5 paveiksle matoma originali kasos vėžinių ląstelių

kvėpavimo kreivė.

5 pav. Mitochondrijų kvėpavimo greičio registravimo kreivė. Dig – 8 µl digitonino, Glu+Mal – 5 mM

ir 2 mM atitinkamai, ADP – 1 mM adenozino difosfato, AMI – 2 mM amitalio, Succ – 15 mM

sukcinato, Cyt C – 32 µM citochromo c, ATR – 0,12 mM atraktilozido, DNF – 0,3 mM dinitrofenolio.

MiR06 terpės sudėtis: 0,5 mM EGTA, 3 mM MgCl2∙6H2O, 60 mM K–laktobionatas (pH 7,0,

25 ˚C temperatūroje), 20 mM taurinas, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM sacharozė; pH 7,1

(37 ˚C temperatūroje).

27

Kasos vėžinių ląstelių kvėpavimo greičio nustatymas pradedamas į termostuojamą kiuvetę

įpilant 2 ml terpės MiR06. Matavimai atliekami 37 °C termastatuojamoje kiuvetėje. Kiuvetė uždaroma

specialiu kamščiu ir ~40 minučių registruojamas deguonies sunaudojimo greitis. Įpylus terpę ir

neįdėjus ląstelių, deguonis nėra sunaudojamas, nes terpėje ląstelių nėra. Pridėjus ląstelių (1mln/1ml)

suspensijos, kurios yra paveiktos arba nepaveiktos chemoterapiniu vaistu gemcitabinu, stebimas

endogeninis deguonies sunaudojimo pokytis (kvėpavimo intensyvumas). Užregistravus deguonies

sunaudojimo pokytį, į terpę pridedama 5 µg/ml digitonino, 5 mM glutamato ir 5 mM malato –

matuojamas bazinis mitochondrijų kvėpavimo greitis (antroji mitochondrijų metabolinė būsena (V0)).

Kreivei nusistovėjus, pridedame 10 µl ADP. Pastebimas staigus kvėpavimo padidėjimas.

Mitochondrijos pereina į trečiąją metabolinę būseną (VADP(Glu/Mal)) ir tai reiškia, kad esant ADP ir

substratų pertekliui, mitochondrijų kvėpavimo greitis yra maksimalus. Mitochondrijų intensyvus

kvėpavimas vyksta dėl oksidacinio fosforilinimo ir ATP sintezės. Vėliau įdedama 2 mM amitalio,

užslopiname I mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksą, laukiame kol kvėpavimo greitis

nusistovės ir dedame 15 mM II mitochondrijų kvėpavimo grandinės komplekso substrato – sukcinato.

Tuomet pridedame 32 µM citochromo c (VCyt c) ir vertiname išorinę mitochondrijų membraną –

pažeista ar ne. Jeigu pastebimas mitochondrijų kvėpavimo greičio stimuliavimas (dėl citochromo c

trūkumo), tai rodo, kad išorinė mitochondrijų membrana yra pažeista, o jeigu kvėpavimo greitis nėra

stimuliuojamas, vadinasi membrana nėra pralaidi citochromui c ir tai reiškia, kad ji nėra pažeista.

Trečioji mitochondrijų metabolinė būsena pereina į ketvirtąją (VATR), pridėjus ADP/ATP nešiklio

inhibitoriaus 0,12 mM atraktilozido. Atraktilozidas blokuoja ADP patekimą, būtent tai turi įtakos

mitochondrijų kvėpavimo greičio sumažėjimui. Pabaigoje į mitochondrijas įdedama 0,3 mM DNF,

oksidacijos ir fosforilinimo procesų aktyvumui.

Skaičiavimams naudotos formulės: Citochromo C efektas= VADP(Succ)+cytc / VADP;

KKKGlu/Mal= V3 / V0; KKKSucc= VADP(Succ)+cytc / VATR

Duomenys apdorojami naudojant „Microsoft Offise Excel" programą. Ląstelių kvėpavimo

greitis išreiškiamas pmolO/s/mln ląstelių.

4.7. Statistinė duomenų analizė

Rezultatų vidurkiai pateikiami su vidutinėmis standartinėmis paklaidomis. Skirtumai tarp

vidurkių statistiškai reikšmingi, jeigu p < 0,05. Pateikti nemažiau keturių eksperimentinių tyrimų

vidurkiai su paklaidomis. Duomenų patikrinimui įvesti naudojamas „Student-t“ testas. Statistinė

analizė buvo atliekama naudojant „SigmaPlot“ 11.0 programą.

28

5. REZULTATAI

Tyrimą atlikus kruopščiai, sistemiškai ir tiksliai, gauti rezultatai, kurie parodo gemcitabino

poveikį kasos vėžinių ląstelių bei mitochondrijų kvėpavimo greičiams. Tyrimo metu įvertinome štai

tokius parametrus: kasos vėžinių ląstelių endogeninio kvėpavimo greitį, mitochondrijų kvėpavimo

greitį antroje (V0), trečioje (V3), ketvirtoje (VATR) metabolinėse būsenose. Apskaičiavome

mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientą, kuris padeda įvertinti mitochondrijų funkcinę kokybę.

Be to, nustatėme išorinės membranos pažeidimą pagal citochromo C efektą ir įvertinome vidinės

membranos pralaidumą.

5.1. Gemcitabino (Gemzaro) poveikis kasos vėžinių ląstelių gyvybingumui

Lyginant kontrolines ląstelių linijų grupes be gemcitabino, mažiausias kiekis negyvų ląstelių

buvo pastebimas MIAPaCa-2 ląstelių linijoje – 3,5 % (žr. 6 pav.). Didžiausias kiekis negyvų ląstelių

nustatytas Capan-2 ląstelių linijoje (14,2 ± 5,6 %).

6 pav. Gemcitabino (Gemzaro) įtaka kontrolinių ir tiriamųjų ląstelių linijų gyvybingumui.

* - statistiškai reikšmingas skirtumas, lyginant su kontroline grupe, p< 0,05; ** - statistiškai

reikšmingas skirtumas, lyginant su MIAPaCa-2 kontroline grupe, p< 0,05

29

Tyrimo rezultatai parodė, kad eksperimentuose naudotų kasos vėžinių ląstelių linijų paveiktų

gemcitabinu, gyvybingumas visose grupėse sumažėjo (žr. 6 pav.). MIAPaCa-2 ląstelių linijos

tiriamojoje grupėje negyvų ląstelių kiekis sudarė 9,8 %. Capan-1 kasos vėžio ląstelių liniją paveikus

gemcitabinu, negyvų ląstelių kiekis sudarė 11,5 %. Eksperimento rezultatai parodė, kad veikiant

Capan-2 ląstelių linija gemcitabinu, negyvų ląstelių kiekis sudarė 30,5 %, tačiau statistiškai patikimo

skirtumo tarp kontrolinių ir paveiktų gemcitabinu ląstelių, nebuvo. SU.86.86 kasos vėžinių ląstelių

linijoje gemcitabinas negyvų ląstelių skaičių padidino 1,5 karto ir sudarė 14,4 %.

Tiriamosiose grupėse, paveiktose gemcitabinu, labiausiai įtakos turėta Capan-2 ląstelių linijai.

Šioje grupėje negyvų ląstelių skaičius siekė 30,5 ± 12 %. Iš gautų rezultatų matome, kad atspariausia

gemcitabinui buvo Capan-1 kasos vėžio ląstelių linija.

5.2. Skirtingų kasos vėžio ląstelių linijų mitochondrijų endogeninio kvėpavimo

palyginimas

Kasos vėžio ląstelių endogeninio kvėpavimo greitis (deguonies sunaudojimas) matuotas

poliarografiniu metodu. Kadangi tokių tyrimų su kasos vėžio ląstelėmis nėra, atliekant tyrimą

nustatinėjome skirtingų kontrolinių grupių ląstelių linijų endogeninį kvėpavimą (žr. 7 pav.).

7 pav. Kasos vėžinių ląstelių mitochondrijų endogeninis kvėpavimas. * - statistiškai reikšmingas

skirtumas, lyginant su atitinkama kontroline grupe be gemcitabino, p< 0,05, ** - statistiškai

reikšmingas skirtumas, lyginant su MIAPaCa-2 kontroline grupe

30

Iš visų tiriamųjų kontrolinių grupių, mitochondrijų endogeninio kvėpavimo greitis buvo

mažiausias MIAPaCa-2 kontrolinėje ląstelių linijoje – jis siekė 28 pmolO/s/mln ląstelių. Kitose ląstelių

linijose (Capan-1, Capan-2 ir SU.86.86) mitochondrijų endogeninio kvėpavimo greitis buvo statistiškai

reikšmingai didesnis, lyginant su MIAPaCa-2 ląstelių linija. Capan-1 ląstelių linijos endogeninis

kvėpavimo greitis buvo 60,6 pmolO/s/mln ląstelių, SU.86.86 ląstelių linijoje (49 pmolO/s/mln ląstelių)

ir Capan-2 ląstelių linijos nustatytas endogeninio kvėpavimo greitis sudarė 51,1 pmolO/s/mln ląstelių.

Statistiškai reikšmingo skirtumo tarp Capan-1, Capan-2 ir SU.86.86 lyginant endogeninio kvėpavimo

greičius, nebuvo nustatyta.

Palyginus endogeninio kvėpavimo greičius, kasos vėžinėse ląstelėse, paveiktose gemcitabinu,

nustatytas statistiškai reikšmingas kvėpavimo greičio padidėjimas 2,4 karto MIAPaCa-2 ląstelių

linijoje, lyginant su kontrole. Tarp kitų ląstelių linijų (SU.86.86, Capan-1 ir Capan-2) statistiškai

reikšmingo gemcitabino poveikio endogeninio kvėpavimo greičiui nebuvo, nors SU.86.86 vėžinėse

ląstelėse buvo stebima tendencija didėti endogeniniam kvėpavimo greičiui (1,5 karto).

Taigi, rezultatai rodo, kad gemcitabinas neslopino endogeninio kvėpavimo greičio nei vienoje

kasos vėžio ląstelių linijoje, o MIAPaCa-2 ir SU.86.86 ląstelių linijose endogeninis kvėpavimo greitis

buvo netgi didesnis, lyginant su kontrolinėmis grupėmis. Tai gali būti susiję su mitochondrijų kiekio

padidėjimu kasos vėžinių ląstelių linijose, paveiktose gemcitabinu.

Tolimesniuose eksperimentuose įvertinome mitochondrijų kvėpavimo greitį kasos vėžinių

ląstelių linijose, paveiktose gemcitabinu. Dėl šios priežasties ląstelės buvo veikiamos digitoninu (1

µg/ml) 7 minutes. Tokiu būdu ląstelės membrana tampa laidi ir prieinama mitochondrijų substratams.

5.3. Gemcitabino (Gemzaro) poveikis kasos vėžio ląstelių mitochondrijų

kvėpavimo greičiui

Kasos vėžinių ląstelių, paveiktų gemcitabinu, tyrimai yra ypač svarbūs norint suprasti

procesus, vykstančius kasos vėžio ląstelėse, paveiktose gemcitabinu, ir surasti, kuo daugiau

informacijos apie kasos vėžio gydymą bei priežastis, kodėl kasos vėžinės ląstelės yra atsparios

gemcitabino poveikiui. Kadangi mitochondrijos yra svarbios ląstelės organelės, tyrėme gemcitabino

poveikį mitochondrijų kvėpavimo parametrams, joms oksiduojant I mitochondrijų kvėpavimo

grandinės komplekso substratus – glutamatą/malatą ir II mitochondrijų kvėpavimo grandinės

komplekso substratą – sukcinatą.

Pirmiausia, parinkome eksperimentines sąlygas, ištyrėme mitochondrijų kvėpavimo greitį

kontrolinėse ląstelių linijose (nepaveiktose chemoterapiniu vaistu gemcitabinu).

31

8 pav. Kasos vėžinių ląstelių linijų mitochondrijų kvėpavimo greičiai. V0 – mitochondrijų

kvėpavimo greitis antroje metabolinėje būsenoje, pridėjus 8 µl digitonino, 5 mM glutamato ir 2 mM

malato. V3 – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, pridėjus 1 mM ADP.

VADP(Succ)- mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, pridėjus 2 mM amitalio ir

15 mM substrato sukcinato. VADP(Succ)+cyt C – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje

būsenoje, pridėjus 32 µM citochromo c. VATR – mitochondrijų kvėpavimo greitis ketvirtoje

metabolinėje būsenoje, pridėjus 0,12 mM atraktilozido. * - statistiškai reikšmingas skirtumas, lyginant

su MIAPaCa-2 ląstelių linija, p<0,05.

Mitochondrijų kvėpavimo grečiai įvairiose metabolinėse būsenose (žr. 8 pav.), rodo, jog

tirtomis sąlygomis visos ląstelių linijos geba naudoti ADP ir sintetinti ATP. Pridėjus ADP pradinis

(V3) kvėpavimo greitis buvo stimuliuojamas ir vykstant oksidaciniam fosforilinimui, maksimalus

kvėpavimo greitis MIAPaCa-2 ląstelių linijoje pasiekė 44,1 ± 4,6 pmolO/s/mln ląstelių, Capan-1

ląstelių linijoje – 59,9 ± 5,9 pmolO/s/mln ląstelių. Kitose ląstelių linijose ADP taip pat stimuliavo:

Capan-2 ląstelių linijoje mitochondrijų kvėpavimo greitis nustatytas 51,2 ± 9,4 pmolO/s/mln ląstelių,

SU.86.86 ląstelių linijoje – 68,3 ± 6,0 pmolO/s/mln ląstelių. Tai rodo oksidacinio fosforilinimo

procesų apjungimą ir mitochondrijų gebėjimą sintezuoti ATP. Didžiausias sukcinato oksidacijos greitis

buvo pasiektas SU.86.86 ląstelių linijoje (96,0 ± 9,8 pmolO/s/mln ląstelių), o, lyginant su kitomis

ląstelių grupėmis, statistiškai reikšmingo skirtumo nebuvo, išskyrus su MIAPaCa-2 ląstelių linija:

SU.86.86 ląstelių linijoje kvėpavimo greitis, oksiduojant sukcinatą, buvo 2 kartus didesnis už

MIAPaCa-2 ląstelių linijos kvėpavimo greitį. Pridėjus citochromo c į ląstelių kvėpavimo terpę,

pagreitėjimo nebuvo. Taigi, mitochondrijų išorinės membranos buvo nepažeistos – tai parodo

kontrolinių ląstelių kokybę. Pridėjus atraktilozido, ADP/ATP inhibitoriaus, buvo slopinamas ADP

patekimas į mitochondrijas ir ATP sintezė. Taigi, buvo stebimas kvėpavimo greičio sumažėjimas.

32

Statistiškai reikšmingo skirtumo mitochondrijų kvėpavimo greičio VATR tarp kasos vėžinių ląstelių

linijų grupių nebuvo.

Kituose eksperimentuose tirtas gemcitabino poveikis kasos vėžinėms ląstelėms. Tam tikslui

ląstelės paveikiamos gemcitabinu, o vėliau matuojami mitochondrijų kvėpavimo greičiai.

1 lentelė. MIAPaCa-2 kontrolinės ląstelių linijos ir tiriamosios grupės mitochondrijų kvėpavimo

greičiai

Mitochondrijų kvėpavimo

greičio parametrai

MIAPaCa-2 MIAPaCa-2+Gem

V0 (Glu/mal) 29,2 ± 8,1 72,2 ± 12,7*

VADP(Glu/Mal) 44,1 ± 4,6 82,52 ± 10,1*

VADP (Succ) 47,9 ± 4,4 82,5 ± 15,9*

VADP (Succ)+Cyt c 47,7 ± 4,4 79,5 ± 17,8

VATR 27,1 ± 4,3 60,5 ± 8,1*

VDNF max 45,3 ± 4,3 87,7 ± 15,4*

Cyt C efektas 1,0 ± 0,1 1,0 ± 0,1

KKK (succ) 1,9 ±0,3 1,3 ± 0,1

* – statistiškai reikšmingas skirtumas, lyginant su kontroline grupe, p<0,05. Mitochondrijų

kvėpavimo greitis išreikštas pmolO/s/mln ląstelių. V0(Glu/Mal) – mitochondrijų kvėpavimo greitis antroje

metabolinėje būsenoje, pridėjus 8 µl digitonino, 5 mM glutamato ir 2 mM malato. VADP(Glu/Mal) –

mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, pridėjus 1 mM ADP. VADP(Succ) –

mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, pridėjus 2 mM amitalio ir 15 mM

substrato sukcinato. VADP(Succ)+Cyt c – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje,

pridėjus 32 mM citochromo c. VATR – mitochondrijų kvėpavimo greitis ketvirtoje metabolinėje

būsenoje, pridėjus 0,12 mM atraktilozido. VDNF max – mitochondrijų kvėpavimo greitis ketvirtoje

metabolinėje būsenoje, pridėjus 0,3 mM dinitrofenolio.

Rezultatai pateikti 1-oje lentelėje. MIAPaCa-2 ląstelių linijoje, po inkubacijos su

gemcitabinu, stebimas statistiškai reikšmingas mitochondrijų kvėpavimo greičio padidėjimas 2,5 karto

antroje metabolinėje būsenoje (V0), oksiduojant mitochondrijų I komplekso substratus

33

glutamatą/malatą, lyginant su kontroline grupe. Trečioje metabolinėje būsenoje, kuomet į inkubacijos

terpę buvo pridedama ADP, mitochondrijų kvėpavimo greitis buvo taip pat statistiškai reikšmingai

(p<0,05) didesnis 1,9 karto, lyginant su kontrolinėmis mitochondrijomis. Pridėjus sukcinato,

mitochondrijų kvėpavimo greitis išliko toks pat (žr. 1 lentelė). Veikiant gemcitabinu, mitochondrijų

kvėpavimo greitis padidėjo 1,7 karto. Citochromo c pridėjimas į inkubacijos terpę nepadidino

kvėpavimo greičio trečioje metabolinėje būsenoje. Tai rodo, jog išorinė mitochondrijų membrana

išliko intaktiška. Mitochondrijų kvėpavimo greitis, pridėjus atraktilozido (VATR), kuris yra ADP/ATP

nešiklio inhibitorius, statistiškai reikšmingai padidėjo 1,3 karto (VATR=60,5 ± 8,1), lyginant su

kontroline grupe. Todėl galima manyti, jog gemcitabinas padidino mitochondrijų vidinės membranos

laidumą. Dinitrofenoliu atskirtas mitochondrijų kvėpavimo greitis buvo panašaus dydžio kaip ir

VADP(succ). Taigi, gemcitabinas poveikio mitochondrijų kvėpavimo grandinei neturėjo. Mitochondrijų

kvėpavimo kontrolės koeficientas (KKK), rodantis mitochondrijų kokybę, nuo gemcitabino statistiškai

reikšmingai sumažėjo 35 % (Glu/Mal) ir 32 % (Succ) – tai rodo mitochondrijų funkcijos slopinimą.

Kadangi kvėpavimo greičiai, veikiant gemcitabinui, nebuvo slopinami, priešingai, jie netgi padidėję,

lyginant su kontroline grupe, todėl tai gali būti siejama su mitochondrijų biogeneze.

Mitochondrijų kvėpavimo greičių pokyčiai vėžinių ląstelių linijoje – Capan-1 ląstelėse,

oksiduojant substratą glutamatą/malatą, pateikti 2 lentelėje. Čia taip pat nustatytas mitochondrijų

kvėpavimo greičių padidėjimas skirtingose metabolinėse būsenose.

Capan-1 kasos vėžio ląstelių linijos mitochondrijų kvėpavimo greitis antroje metabolinėje

būsenoje padidėjo 38 %, t.y. nuo 49,4 iki 68 pmolO/s/mln ląstelių, lyginant su kontroline grupe (žr. 2

lentelė). Mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje (VADP(Glu/mal)) padidėjo nuo

59,9 iki 93,3 pmolO/s/mln ląstelių, t.y. net 56 %, lyginant su kontroline grupe. Oksiduojant II

mitochondrijų kvėpavimo grandinės komplekso substratą – sukcinatą, Capan-1 tiriamosiose ląstelėse

mitochondrijų kvėpavimo greitis padidėjo 43 %. Citochromo c pridėjimas stimuliavo mitochondrijų

kvėpavimą nežymiai (6,4 %) ir statistiškai nereikšmingai. Tai įrodo, kad mitochondrijų išorinė

membrana nebuvo pažeista (žr. 2 lentelė). Kontrolinėje grupėje citochromo c pridėjimas taip pat

nesukėlė reikšmingų pokyčių. Atraktilozidas slopino mitochondrijų kvėpavimo greitį, tačiau grupėje,

paveiktoje gemcitabinu, buvo statistiškai reikšmingas padidėjimas (97 %), lyginant su kontroline

grupe. Tai parodo, kad gemcitabinas padidina Capan-1 ląstelių linijos mitochondrijų vidinės

membranos pralaidumą (~1,3 kartus). Mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas KKK(Succ)

oksiduojant sukcinatą sumažėja 32 %, o oksiduojant glutamatą/malatą 14%.

34

2 lentelė. Capan-1 kontrolinės ląstelių linijos ir tiriamosios grupės mitochondrijų kvėpavimo

greičiai

Mitochondrijų kvėpavimo

greičio parametrai

Capan-1 Capan-1+Gem

V0 (Glu/mal) 49,4 ± 12,9 68,0 ± 32,0

VADP(Glu/mal) 59,9 ± 5,9 93,3 ± 28,2

VADP (Succ) 72,0 ± 5,9 102,7 ± 29,7

VADP (Succ)+Cyt c 73,0 ± 6,5 109,3 ± 32,0

VATR 42,7 ± 6,0 84,0 ± 22,3

VDNF max 80,3 ± 6,5 102,7 ± 29,7

Citochromo C efektas 1,0 ± 0,1 1,0 ± 0,1

KKK(succ) 1,9 ± 0,5 1,3 ± 0,1

Mitochondrijų kvėpavimo greitis išreikštas pmolO/s/mln ląstelių. V0 – mitochondrijų kvėpavimo

greitis antroje metabolinėje būsenoje, pridėjus 8 µl digitonino, 5 mM glutamato ir 2 mM malato.

VADP(Glu/Mal) – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, pridėjus 1 mM ADP.

VADP(Succ) – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, pridėjus 2 mM amitalio ir

15 mM substrato sukcinato. VADP(Succ)+Cyt c – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje

būsenoje, pridėjus 32 µM citochromo c. VATR – mitochondrijų kvėpavimo greitis ketvirtoje

metabolinėje būsenoje, pridėjus 0,12 mM atraktilozido. VDNF max – mitochondrijų kvėpavimo greitis

ketvirtoje metabolinėje būsenoje, pridėjus 0,3 mM dinitrofenolio.

Capan-2 kasos vėžio ląstelių mitochondrijų kvėpavimo pokyčiai, veikiant gemcitabinui,

pavaizduoti 3 lentelėje. Skirtingose metabolinėse būsenose, mitochondrijų kvėpavimo greitis vėžinėse

ląstelių linijose, paveiktose gemcitabinu, statistiškai reikšmingai nesiskyrė nuo kontrolės. Priešingai,

netgi turėjo tendenciją mažėti. Oksiduojant glutamatą/malatą mitochondrijų kvėpavimo greitis,

veikiant gemcitabinui, buvo slopinamas 20 % (nuo 51,2 iki 41 pmolO/s/mln ląstelių), nors statistiškai

reikšmingo skirtumo nebuvo. Lyginant kvėpavimo greičius, oksiduojant sukcinatą, matyti, kad grupės,

paveiktos gemcitabinu, mitochondrijų kvėpavimo greitis 3 metabolinėje būsenoje buvo 23 %

mažesnis, lyginant su kontroline grupe, tačiau pokytis nebuvo statistiškai reikšmingas. Papildomas

citochromo c pridėjimas į inkubacinę terpę neturėjo poveikio mitochondrijų kvėpavimo greičiui

35

trečioje metabolinėje būsenoje. Tai įrodo, kad mitochondrijų išorinė membrana nuo gemcitabino šiose

ląstelėse buvo nepažeista. Mitochondrijų kvėpavimo greitis nei antroje metabolinėje būsenoje (V0), nei

pridėjus atraktilozido (VATR) nesikeitė (p>0,05). Tai rodo, jog šių vėžinių ląstelių linijų mitochondrijų

vidinės membranos intaktiškumas nuo gemcitabino nesikeitė.

3 lentelė. Capan-2 kontrolinės ląstelių linijos ir tiriamosios grupės mitochondrijų kvėpavimo

greičiai

Mitochondrijų kvėpavimo

greičio parametrai

Capan-2 Capan-2+Gem

V0(Glu/mal) 39,2 +/-15,8 26,0 +/-6,0

VADP(Glu/mal) 51,2 +/-9,4 41,0 +/-9,0

VADP(Succ) 59,3 +/-16,5 45,0 +/-7,0

VADP(Succ)+Cyt c 59,0 +/-16,5 45,5 +/-6,5

VATR 38,3 +/-8,7 26,5 +/-7,5

VDNFmax 57,7 +/-14,2 45,0 +/-9,0

Citachromo C efektas 1,0 ± 3,3 1,0 ± 5,0

KKK(Succ) 1,5 ± 0,1 1,8 ± 0,2

Mitochondrijų kvėpavimo greitis išreikštas pmolO/s/mln ląstelių. V0 – mitochondrijų kvėpavimo

greitis antroje metabolinėje būsenoje, pridėjus 8 µl digitonino, 5 mM glutamato ir 2 mM malato.

VADP(Glu/Mal) – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, pridėjus 1 mM ADP.

VADP(Succ) – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, pridėjus 2 mM amitalio ir

15 mM substrato sukcinato. VADP(Succ)+Cyt c – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje

būsenoje, pridėjus 32 mM citochromo c. VATR – mitochondrijų kvėpavimo greitis ketvirtoje

metabolinėje būsenoje, pridėjus 0,12 mM atraktilozido. VDNF max – mitochondrijų kvėpavimo greitis

ketvirtoje metabolinėje būsenoje, pridėjus 0,3 mM dinitrofenolio.

Palyginome gemcitabino poveikį mitochondrijų funkcinei būklei SU.86.86 kasos vėžio

ląstelių linijoje (žr. 4 lentelė).

36

4 lentelė. SU.86.86 kontrolinės ląstelių linijos ir tiriamosios grupės mitochondrijų kvėpavimo

greičiai

Mitochondrijų kvėpavimo

greičio parametrai

SU.86.86 SU.86.86+Gem

V0(Glu/mal) 52,5 ± 12,5 92,0 ± 25,0

VADP(Glu/mal) 68,3 ± 6,0 115,3 ± 29,2

VADP(Succ) 96,0 ± 9,8 170,0 ± 51,3

VADP(Succ)+Cyt c 93,1 ± 9,3 167,3 ± 50,5

VATR 48,3 ± 5,8

86,0 ± 19,6

VDNF max 112,3 ± 9,8 182,3 ± 55,5

Citochromo C efektas 1,0 ± 3,3 1,0 ± 8,8

KKK(Succ) 2,0 ± 0,2

1,9 ± 0,1

Mitochondrijų kvėpavimo greitis išreikštas pmolO/s/mln ląstelių. V0 – mitochondrijų kvėpavimo

greitis antroje metabolinėje būsenoje, pridėjus 8 µl digitonino, 5 mM glutamato ir 2 mM malato.

VADP(Glu/Mal) – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, pridėjus 1 mM ADP.

VADP(Succ) – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, pridėjus 2 mM amitalio ir

15 mM substrato sukcinato. VADP(Succ)+Cyt c – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje

būsenoje, pridėjus 32 µM citochromo c. VATR – mitochondrijų kvėpavimo greitis ketvirtoje

metabolinėje būsenoje, pridėjus 0,12 mM atraktilozido. VDNF max – mitochondrijų kvėpavimo greitis

ketvirtoje metabolinėje būsenoje, pridėjus 0,3 mM dinitrofenolio.

Kontrolinės grupės kvėpavimo greitis antroje metabolinėje būsenoje (V0) nustatytas 52,5

pmolO/s/mln ląstelių, o paveikus gemcitabinu, kvėpavimo greitis V0 būsenoje buvo 92 pmolO/s/mln

ląstelių, t.y. padidėjo 1,75 karto. Mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje (t.y.

pridėjus ADP), oksiduojant glutamatą/malatą, veikiant gemcitabinui, padidėjo net 69 %, lyginant su

kontrolinėmis mitochondrijomis. Oksiduojant sukcinatą mitochondrijų kvėpavimo greitis padidėjo nuo

115,3 iki 170 pmolO/s/mln ląstelių, t.y. 47 %, lyginant su kontroline grupe. Pridėjus citochromo c

kvėpavimo greitis nesikeitė. Tai įrodo, kad mitochondrijų išorinė membrana ir šiose ląstelių linijose

išlieka nepažeista. Į terpę pridėjus atraktilozido ir užslopinus ADP patekimą į mitochondrijas,

mitochondrijos perėjo į ketvirtą metabolinę būseną (VATR). Šioje būsenoje mitochondrijų kvėpavimo

37

greitis suletėja iki 86 pmolO/s/mln ląstelių, t. y. 1,9 karto. Kontrolinėse mitochondrijose atraktilozido

pridėjimas taip pat sulėtino mitochondrijų kvėpavimo greitį 1,9 karto. Tai rodo, kad paveikus ląstelės

gemcitabinu, mitochondrijų vidinė membrana išlieka intaktiška.

5.4. Gemcitabino poveikis mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientams kasos

vėžinėse ląstelėse

Kadangi trijose kasos vėžio ląstelių linijose (MIAPaCa-2, Capan-1 ir SU.86.86), veikiant

gemcitabinui, mitochondrijų kvėpavimo greitis (VADP) nustatytas padidėjęs, buvo svarbu įvertinti

mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientą (KKK), oksiduojant mitochondrijų kvėpavimo

grandinės I komplekso substratus glutamatą/malatą, kuris parodo ATP sintezės mitochondrijose

aktyvumą. Kuo šis koeficientas didesnis, tuo geresnė mitochondrijų fukcija, oksidacijos ir

fosforilinimo procesų apjungimas. KKK nustatomas pagal greičių V3 ir V0 santykį (KKK= V3/ V0).

Gauti rezultatai pateikti 5–oje lentelėje.

5 lentelė. Mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientai kasos vėžinių ląstelių linijose oksiduojant

glutamatą/malatą KKK

MIAPaCa-2 1,7 +/-0,4

MIAPaCa-2+Gem 1,1 +/-0.1*

Capan-1 1,3 +/-0,2

Capan-1+Gem 1,1 +/-0,1

Capan-2 1,2 +/-0,1

Capan-2+Gem 1,6 +/-0,1

SU.86.86 1,5 +/-0,1

SU.86.86+Gem 1,3 +/-0,1

* – statistiškai reikšmingas skirtumas, lyginant su kontroline grupe, p<0,05.

Kai mitochondrijos oksiduoja glutamatą/malatą, tiek MIAPaCa-2, tiek Capan-1 ir SU.86.86

kasos vėžio ląstelių linijų mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas sumažėja 35 %, 15 % ir 13

% atitinkamai. Statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0.05) nustatytas tik MIAPaCa-2 ląstelių linijoje,

38

lyginant su grupe nepaveikta gemcitabinu. Tai rodo gemcitabino sukeltą mitochondrijų oksidacinio

fosforilinimo slopinimą šiose ląstelių linijose. Capan-2 ląstelių linijos mitochondrijų kvėpavimo

kontrolės koeficientas gemcitabino poveikyje nesikeitė, priešingai, netgi padidėjo, lyginant su

kontroline grupe, nors ir statistiškai nereikšmingai. Tai rodo, kad Capan-2 ląstelių linijų

mitochondrijos yra atsparios gemcitabino poveikiui. Atsižvelgdami į šiuos rezultatus, galime spręsti

apie gemcitabino poveikį mitochondrijoms MIAPaCa-2, Capan-1 bei iš dalies SU.86.86 ląstelių

linijoms. Tai parodo, kad paveikus gemcitabinu, mitochondrijose vyksta pokyčiai, pablogėja

mitochondrijų funkcinė būklė, silpniau sintetinamas ATP, nors kvėpavimo greičiai ir nesumažėja,

priešingai, jie netgi padidėja. Tai gali būti susiję su mitochondrijų biogeneze – mitochondrijų fermentų

persitvarkymu ar jų kiekio padidėjimu. Gemcitabinu nepaveiktose mitochondrijose oksidacijos ir

fosforilinimo procesai visiškai apjungti ir ATP sintezė vyksta pilnai. Mitochondrijų pokyčiai, veikiant

gemcitabinui, gali būti dėl mitochondrijų vidinės membranos pralaidumo padidėjimo arba pokyčių

mitochondrijų kvėpavimo grandinėje. Mechanizmo išsiaiškinimui reikalingi tolimesni tyrimai.

39

6. REZULTATŲ APTARIMAS

Chemoterapinio vaisto gemcitabino įtaka kasos vėžiui yra tyrinėjama jau seniai, daugelis

mokslininkų yra nustatę jo terapinį poveikį kasos vėžiui [34], aprašę kasos vėžinių ląstelių atsparumą

gemcitabinui [35], taip pat atlikę tyrimus, kas turi įtakos kasos vėžio jautrumui gemcitabinui [36].

Tačiau dar niekas nėra nustatęs, kokį poveikį gemcitabinas turi vežinių ląstelių energetikai – kaip

gemcitabinas veikia kasos vėžinių ląstelių linijų mitochondrijų endogeninį kvėpavimą, mitochondrijų

kvėpavimo greičius skirtingose metabolinėse būsenose, ar turi poveikį mitochondrijų vidinės ir

išorinės membranos pralaidumui. Todėl šio darbo tikslas ir buvo ištirti gemcitabino poveikį kasos

vėžinių ląstelių linijų mitochondrijų funkcijoms.

Nors gemcitabinu gydomas kasos vėžys, tačiau vis tiek pacientų mirtingumas, po diagnozės

nustatymo ir gydymo, išlieka didelis (dauguma neišgyvena ilgiau 1-erių metų) [37]. Mokslininkų

nustatyta, kad gemcitabino poveikis jaučiamas tik 20 % pacientų [38]. Tyrimai rodo, jog kasos vėžinės

ląstelės yra pakankamai atsparios gemcitabino poveikiui. Jautrausios buvo SU.86.86. Nustatyta IC50

šioje vėžinių ląstelių linijoje 25 µg/ml, tuo tarpu kai MIAPaCa-2 ląstelių linijoje ji buvo dvigubai

didesnė (50 µg/ml). Capan-1 ir Capan-2 buvo atspariausios gemcitabino poveikiui. Capan-1 ląstelių

linijai, kad pasiekti IC50, reikėjo panaudoti gemcitabiną mikrograminės koncentracijos, o Capan-2

ląstelių linijai IC50 pasiekti nepavyko, pasiekta tik IC40. Lyginant kontrolinių (be gemcitabino) ląstelių

gyvybingumą, mažiausiai negyvų ląstelių nustatyta MIAPaCa-2 ir SU.86.86 vėžinių ląstelių linijose.

Veikiant gemcitabinui, tirtomis sąlygomis jų gyvybingumas sumažėjo apie 2,1 – 2,8 karto, o Capan-1

ląstelių linijos gyvybingumas sumažėjo tik 1,2 karto.

Mūsų atlikto tyrimo metu, gemcitabinas neslopino endogeninio kvėpavimo greičio nei vienoje

kasos vėžio ląstelių linijoje, o MIAPaCa-2 ir SU.86.86 endogeninis kvėpavimo greitis buvo netgi

didesnis, lyginant su kontrolinėmis grupėmis. Tai gali būti susiję su mitochondrijų dydžio, tūrio ar

kiekio padidėjimu kasos vėžinių ląstelių linijose, jas paveikus gemcitabinu. Tokias pat prielaidas kelia

ir kiti mokslininkai atlikę tyrimus su kitomis vėžinėmis ląstelėmis, paveiktomis gemcitabinu [39].

Reikalingi tolimesni tyrimai, nustatyti, kasos vėžinių ląstelių linijų mitochondrijų dydžio ar kiekio

pasikeitimus, šias paveikus gemcitabinu.

Nustatėme, kad mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas (KKK), rodantis

mitochondrijų kokybę, veikiant gemcitabinui ir oksiduojant glutamatą/malatą sumažėjo visose ląstelių

linijose (13-35 %), išskyrus Capan-2, tai rodo mitochondrijų funkcijos slopinimą MIAPaCa-2, Capan-

1 ir SU.86.86 ląstelių linijose. Oksiduojant sukcinatą, buvo slopinamas mitochondrijų kvėpavimo

kontrolės koeficientas MIAPaCa-2 ir Capan-1 vėžinėse ląstelių linijose apie 32 %. Tačiau visi

kvėpavimo greičiai, veikiant gemcitabinui, nebuvo slopinami, o priešingai, jie nustatyti netgi padidėję,

lyginant su kontrolinėmis grupėmis. Tai leidžia manyti, kad tai gali būti siejama su mitochondrijų

40

biogeneze. Kitų mokslinių tyrimų autoriai nustatė, kad gemcitabinas kombinacijoje su siRNR ir TK2

smažina mitochondrijų membranos potencialą, slopina funkcijas ir aktyvumą [40].

Gemcitabino poveikio išorinei mitochondrijų membranai įtakos neturėjo. Nei vienoje ląstelių

linijoje nebuvo pastebėtas išorinės membranos pažeidimas, kadangi citochromo c pridėjimas nedidino

mitochondrijų kvėpavimo greičio. Taigi, išorinė membrana liko intaktiška. Kiti tyrėjai patvirtina mūsų

gautus rezultatus. Jie nustatė, kad citochromo c testas, naudojamas ištirti išorinės membranos

intaktiškumui leukemijos ląstelėse, parodė, kad, veikiant gemcitabinui, išorinė membrana išlieka

nepažeista [39].

Veikiant gemcitabinui, galimą vidinės mitochondrijų membranos pralaidumo padidėjimą rodo

mitochondrijų kvėpavimo greičio ketvirtoje metabolinėje būsenoje padidėjimas, užslopinus ADP

patekimą atraktilozidu, tai stebima MIAPaCa-2 ir Capan-1 ląstelių linijose (~30 % padidėjimas). Tuo

metu SU.86.86 ir Capan-2 vėžinių ląstelių linijose vidinės mitochondrijų membranos, veikiant

gemcitabinui, išlieka intaktiškos. Taigi, atlikti tyrimai rodo, jog gemcitabino poveikiui atspariausios

yra Capan-2 ir SU.86.86 ląstelės, tuo metu MIAPaCa-2 ir Capan-1 ląstelėse stebimas (iki 30 %)

mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientų slopinimas.

Nustatyta, kad veikiant gemcitabinui, mitochondrijų kvėpavimo greitis nei oksiduojant

glutamatą/malatą, nei sukcinatą, neslopinamas. Priešingai, MIAPaCa-2, Capan-1 ir SU.86.86 ląstelėse

jis yra netgi ~2 kartus didesnis nei kontrolinėje (be gemcitabino) grupėje. Mitochondrijų kvėpavimo

greičio padidėjimas gali būti siejamas su mitochondrijų kiekio vėžinėse ląstelėse padidėjimu bei

mitochondrijų biogeneze: mitochondrijų DNR koduojamų baltymų pokyčiais mitochondrijose,

replikacija, mitochondrijų kiekio, dydžio ir tūrio pasikeitimais. Tyrimai su leukeminių ląstelių

linijomis [39], taip pat rodo, kad gemcitabinas veikia mitochondrijų biogenezę (didina mitochondrijų

endogeninį kvėpavimą), dėl pokyčių ląstelių dydyje ar mitochondrijų kiekyje. Tai gali sąlygoti ląstelės

fermentų kiekio ir/ar aktyvumo pokyčius, veikiant gemcitabinui. Detalesniam mechanizmo

išsiaiškinimui reikalingi tolimesni tyrimai.

41

7. IŠVADOS

1. Tiriant kasos vėžinių ląstelių (Capan-1, Capan-2, SU.86.86, MIAPaCa-2) linijas

nustatyta, kad gemcitabinas neslopino endogeninio kvėpavimo greičio nei vienoje tirtoje kasos vėžio

ląstelių linijoje, o MIAPaCa-2 ir SU.86.86 ląstelėse endogeninis kvėpavimo greitis buvo didesnis 2,4 ir

1,5 karto, lyginant su kontrolinėmis (nepaveiktomis gemcitabinu) grupėmis.

2. Gemcitabinas apie 2 kartus padidino mitochondrijų kvėpavimo greitį MIAPaCa-2,

Capan-1 ir SU.86.86 ląstelėse oksiduojant glutamatą/malatą ir sukcinatą, galimai dėl poveikio

mitochondrijų biogenezei. Gemcitabinas turėjo slopinamąjį poveikį MIAPaCa-2, Capan-1 bei

SU.86.86 kasos vėžinių ląstelių linijų mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientams (nuo 35 % iki

14 %), oksiduojant glutamatą/malatą ir 32 % oksiduojant sukcinatą. Atspariausios gemcitabino

poveikiui buvo Capan-2 kasos vėžinės ląstelės.

3. Mitochondrijų išorinė membrana buvo intaktiška tiek kontrolinių (be gemcitabino)

vėžinių ląstelių linijose, tiek paveikus gemcitabinu. Mitochondrijų vidinės membranos pralaidumo

padidėjimas, veikiant gemcitabinui, nustatytas šiose ląstelių linijose: MIAPaCa-2, Capan-1.

Gemcitabinas nedidino mitochondrijų vidinės membranos pralaidumo SU.86.86 ir Capan-2 vėžinių

ląstelių linijose.

42

8. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Li C., Heidt D. G., Dalerba P., Burant C. F., Zhang L., Adsay V., Wicha M., Clarke M. F.,

Simeone D. M. Identification of Pancreatic Cancer Stem Cells. Cancer Res. 2007; 67: (3).

2. Neureiter M., Jäger D., Ocker T., Kiesslich M.T. Epigenetics and pancreatic cancer:

Pathophysiology and novel treatment aspects. World J Gastroenterol, 2014 June 28, 20(24): p. 7830 –

7848.

3. An S.G, Kim D.U, Song G.A, Jang A.L. Prognostic Factors in Patients with Advanced

Pancreatic Cancer Treated with Gemcitabine Chemotherapy: Clinical Characteristics of Long-term

Survivors. Korean J Gastroenterol. 2014 Dec 25;64(6):356 – 63.

4. Brasiūnienė B., Brasiūnas V., Barauskas G., Juozaitytė E. Molekuliniai kasos vėžio

patogenezės ir prognozės faktoriai. Medicina (2003) 39 tomas, Nr. 7. p. 631 – 636.

5. U.S. department of health and human services. National Institutes of Health. National

Cancer Institute. What You Need To Know About Cancer of the Pancreas. NIH Publication No.10 -

1560, May 2010.

6. Cascinu S., Falconi M., Valentini V., Jelic S. Pancreatic cancer: ESMO Clinical Practice

Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology 21 (Supplement 5), 2010, p. 55

– 58.

7. American cancer society. Pancreatic cancer survival rates, by stage. 2016. [žiūrėta 2015 -

10 - 15] Prieiga per internetą: http://www.cancer.org/cancer/pancreaticcancer/detailedguide/pancreatic-

cancer-survival-rates

8. Ashraf Q. M., Mishra O. P., Delivoria-Papadopoulos M. Mechanisms of Expression of

Apoptotic Protease ActivatingFactor – 1 (Apaf – 1) in Nuclear, Mitochondrial and Cytosolic Fractions

of the Cerebral Cortex of Newborn Piglets. NeurosciLett., 2007 March 30, 415(3): p. 253 – 258.

9. Gataveckaitė D., Jakštaitė A., Dambrauskas Ž. Kasos adenokarcinomos ląstelių in vitro

atsakas į chemoterapinį vaistą gemcitabiną, nuslopinus HuR geno raišką. Studentų mokslinė praktika.

Mokslininkų ir kitų tyrėjų kvalifikacijos tobulinimas, mobilumo ir studentų mokslinių darbų

skatinimas, 2014, p. 27.

10. Lopes R. B., Gangeswaran R., McNeish I. A., Yaohe Wang and Nick R. Lemoine.

Expression of the IAP protein family is dysregulated in pancreatic cancer cells and is important for

resistance to chemotherapy. Int J Cancer. 2007 Jun 1;120(11):2344 – 52.

11. McConkey D. J., Choi W., Fournier K., Marquis L., Ramachandran V., Armugam T.

Molecular Characterization of Pancreatic Cancer Cell Lines Pancreatic Cancer , 2010. p. 458 – 466.

12. European Pharmacopoeia. 7th edition. Strasbourg: EuropeanCommission; 2010, p. 2088

– 2089.

43

13. Mini E., Nobili S., Caciagli B., Landini I., Mazzei T. Cellular pharmacology of

gemcitabine. Annals of Oncology 17 (Supplement 5): 2006, p. 7 – 12.

14. Yang M. H., Lee K. T., Yang S., Lee J.K., Lee K.H., Rhee J.C. KML001 Enhances

Anticancer Activity of Gemcitabine Against Pancreatic Cancer Cells. Anticancer Res. 2015 Jan;35(1):

p. 183-9.

15. Rathos M. J., Joshi K., Khanwalkar H., Manohar S. M., Joshi K. S. Molecular evidence

for increased antitumor activity of gemcitabine in combination with a cyclin-dependent kinase

inhibitor, P276-00 in pancreatic cancers. J Transl Med. 2012 Aug 8;10:161.

16. An S. G., Kim D. U., Song G.A., Jang A. L. Prognostic Factors in Patients with

Advanced Pancreatic Cancer Treated with Gemcitabine Chemotherapy: Clinical Characteristics of

Long-term Survivors. Korean J Gastroenterol. 2014 Dec 25;64(6):356-63.

17. Schniewind B., Christgen M., Kurdow R., Haye S., Kremer B., Kalthoff H., Ungefroren

H. Resistance of pancreatic cancer to gemcitabine treatment is dependent on mitochondria-mediated

apoptosis. International Journal of Cancer , Volume 109, Issue 2, 20 March 2004, p.182 – 188.

18. Freya T. G., Mannellab C. A. The internal structure of mitochondria.Volume 25, Issue 7,

1 July 2000, p. 319 – 324.

19. Djafarzadeh R., Wainer G., Mussivand T. DEVS Modeling and Simulation of the

Cellular Metabolism by Mitochondria. Molecular Simulation. Volume 36, Issue 12, 2010.

20. Cooper G. M. Mitochondria, The Cell, 2nd edition. A Molecular Approach, 2000.

21. Prieiga per intenetą: http://gamta.vdu.lt/bakalaurai/lab_darbai/biochemija/Bioch3.pdf

22. Prieiga per internetą: http://www.namrata.co/category/biological-oxidation/

23. Naučienė Z., Žūkienė R., Mildažienė V. Mitochondrijų biochemijos laboratoriniai darbai.

Mokymo priemonė studentams Prieiga per internetą:

<http://www.bchi.lt/LBD/saitas/files/mkitoch.pdf>

24. Carew J. S., Huang P. Mitochondrial defects in cancer. Mol Cancer. 2002 Dec 9;1:9.

25. Cooper G. M., Hausman R. E. The Cell: Molecular Aprroach: Fourth Edition.

Washington: ASM Press; 2007. p. 457 – 495.

26. Sun F., Huo X., Zhai Y. Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein

complex II. Cell 2005;121:1043 – 57.

27. Schultz B. E., Chan S. I. Structures and proton-pumping strategies of mitochondrial

respiratory enzymes. Annual review of biophysics and biomolecular structure 2001;30:23-65.

28. Kadziauskas J. Biochemijos pagrindai. Vilnius: Vilniaus universiteto leidiniai; 2012. p.

322-323; 417-440.

44

29. DeBerardini R. J., Lum J. J., Hatzivassiliou G., Thompson C. B.,The biology of

cancer:metabolic reprogramming fuels cell growth and proliferation, Cell Metabolism, vol. 7, no. 1,

2008, p. 11 – 20.

30. Chiaradonna F., Moresco R. M., Airoldi C., Gaglio D., Palorini R., Nicotra F.

Fromcancer metabolism to new biomarkers and drug targets, Biotechnology Advances, vol. 30, no.1,

2012.p. 30 – 51.

31. Bonnet S., Archer S. L., Allalunis – Turner J. A mitochondria-K+ channel axis is

suppressed in cancer and its normalization promotes apoptosis and inhibits cancer growth, Cancer

Cell, vol. 11, no. 1, 2007, p. 37–51.

32. Palorini R., Simonetto T., Cirulli C., Chiaradonna F. Mitochondrial Complex I Inhibitors

and Forced Oxidative Phosphorylation Synergize in Inducing Cancer Cell Death, International Journal

of Cell Biology. Volume 2013, Article ID 243876, p. 14. Prieiga per internetą:

http://dx.doi.org/10.1155/2013/243876

33. Viale A., Corti D., Draetta G. F. Tumors and Mitochondrial Respiration: A Neglected

Connection, Cancer Research September 3, 2015 p.1 – 5.

34. Andrew D., Jacobs M. D. Gemcitabine-based therapy in pancreas cancer, Cancer,

Volume 95, Issue Supplement 4, 15 August 2002, p. 923–927.

35. Li1 Y., Timothy G., Boom V., Kong1 D., Wang Z., Ali S., Philip P. A., Sarkar F.H. Up-

regulation of miR-200 and let-7 by Natural Agents Leads to the Reversal of Epithelial-to-

Mesenchymal Transition in Gemcitabine-Resistant Pancreatic Cancer Cells. Cancer Reasearch. August

4, 2009. P. 6704-6712.

36. Ali S., Ahmad A., Banerjee S., Padhye S., Dominiak K., Schaffert J. M., Wang Z., Philip

P. A., Fazlul H. Sarkan F. H. Gemcitabine Sensitivity Can Be Induced in Pancreatic Cancer Cells

through Modulation of miR-200 and miR-21 Expression by Curcumin or Its Analogue CDF. Cancer

Reasearch. April 13, 2010.

37. Simon S. Abraxane plus Gemzar Combination Improves Pancreatic Cancer Survival.

Pancreatic Cancer. November 4, 2013.

38. Sylvia S. W. Ng., Tsao M. S., Chow S., Hedley D. W. Inhibition of Phosphatidylinositide

3-Kinase Enhances Gemcitabine-induced Apoptosis in Human Pancreatic Cancer Cells. Cancer

reasearch. 60, 5451–5455, October 1, 2000.

39. Rennera K., Ambergera A., Konwalinkab G., Koflera R., Gnaiger E. Changes of

mitochondrial respiration, mitochondrial content and cell size after induction of apoptosis in leukemia

cells“. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. Volume 1642, Issues 1–2, 23

September 2003, p. 115 – 123.

45

40. Cresce C. D., Figueredo R., Rytelewski M., Vareki S. V., Colin Way C., Ferguson P.

J., Vincent M. D., Koropatnick J. siRNA knockdown of mitochondrial thymidine kinase 2 (TK2)

sensitizes human tumor cells to gemcitabine. Oncotarget. 2015 Sep 8; 6(26): 22397 – 22409.