BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***000***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NUÔI TRỒNG VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẨN AMINO ACID

CỦA MỘT SỐ LOÀI NẤM BÀO NGƢ (Pleurotus spp.)

BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP

(High performance liquid chromatography - HPLC)

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Niên khóa: 2001-2005

Sinh viên thực hiện: ĐOÀN BẢO QUỐC

Thành phố Hồ Chí Minh

Tháng 9/2005

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***000***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NUÔI TRỒNG VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẨN AMINO ACID

CỦA MỘT SỐ LOÀI NẤM BÀO NGƢ (Pleurotus spp.)

BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP

(High performance liquid chromatography - HPLC)

Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:

TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN ĐOÀN BẢO QUỐC

Thành phố Hồ Chí Minh

Tháng 9/2005

ii

LỜI CẢM TẠ

CHÂN THÀNH CẢM ƠN:

Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.

Bộ môn Công Nghệ Sinh Học

Bộ môn Bảo vệ Thực vật

Quí thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho chúng tôi trong suốt quá trình học tại

trƣờng.

TRÂN TRỌNG BIẾT ƠN

Thầy Lê Đình Đôn đã tận tình hƣớng dẫn, tạo mọi điều kiện giúp đỡ chúng tôi

hoàn thành khóa luận này.

Thầy Bùi Cách Tuyến, Thầy Bùi Minh Trí đã tạo điều kiện cho tôi thực tập tại

Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh.

Cô Trần Thị Dung, Thầy Lƣu Phúc Lợi, Thầy Nguyễn Văn Cƣờng, Anh Mai

Huy Hoàng đã giúp tôi có trang thiết bị cũng nhƣ phòng thí nghiệm để hoàn thành

khóa luận.

Các anh chị ở Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Đại Học Nông

Lâm TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi hòan thành khóa luận.

Anh Lê Viết Ngọc Viện hạt nhân Đà Lạt, anh Hoàng trƣờng Đại học Khoa Học

Tự Nhiên Thành phố Hồ Chí Minh đã cung cấp giống nấm bào ngƣ cho tôi thực hiện

khóa luận.

Các thành viên lớp Công Nghệ Sinh Học 27 đã động viên, giúp đỡ tôi trong thời

gian thực tập.

iii

TÓM TẮT

Đoàn Bảo Quốc, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Phân tích amino

acid trên nấm bào ngƣ Pleurotus spp. bằng sắc ký lỏng cao áp - high performance

liqud chromatography (HPLC) thời gian từ 14/2/2005 đến 18/8/2005.

Hội đồng hƣớng dẫn:

TS. Lê Đình Đôn

Khóa luận đƣợc thực hiện trên đối tƣợng nấm bào ngƣ Pleurotus spp.. Đây là

loại nấm rất phổ biến trên thị trƣờng Việt Nam. Vì thế, thành phần dinh dƣỡng của

chúng, đặc biệt là thành phần amino acid rất đƣợc quan tâm.

Để thực hiện phân tích amino acid trên nấm, chúng tôi tiến hành trồng nấm tại

Trung tâm Công Nghệ Sinh Học và sử dụng thiết bị là sắc ký lỏng cao áp (HPLC) của

Trung tâm Hóa Lý đều thuộc Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

Những kết quả đạt đƣợc:

Nuôi trồng đƣợc 4 dòng nấm Pleurotus spp. trên cơ chất là mùn cƣa có

bổ sung thêm cám gạo, và một số chất khác.

Phân tích và định lƣợng đƣợc 17 amino acid trong 2 loài nấm Pleurotus

flabellatus và Pleurotus pulmonarius.

Từ đó chúng tôi tiến hành so sánh thành phần amino acid của chúng với một số

rau quả khác, với một số nấm khác và so sánh giữa chúng.

iv

MỤC LỤC

CHƢƠNG TRANG

Trang tựa

Lời cảm ta ................................................................................................................ i

Tóm tắt .................................................................................................................... ii

Mục lục .................................................................................................................. iii

Danh sách các chữ viết tắt ..................................................................................... vi

Danh sách các hình ............................................................................................... vii

Danh sách các bảng ............................................................................................. viii

1. MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1

1.1. Đặt vấn đề .......................................................................................... 1

1.2. Mục đích ............................................................................................ 2

1.3. Yêu cầu ................................................................................................

1.4. Nội dung thực hiện ............................................................................ 2

2. TỔNG QUAN ............................................................................................. 3

2.1. Nấm trồng .......................................................................................... 3

2.1.1. Khái niệm về nấm ........................................................................ 3

2.1.2. Sinh sản và chu trình sống ........................................................... 5

2.1.3.. Đặc điểm biến dƣỡng và sinh lý ................................................. 7

2.2. Nấm bào ngƣ ...................................................................................... 8

2.2.1. Giới thiệu ..................................................................................... 8

2.2.2. Một số loài nấm bào ngƣ đƣợc nuôi trồng ở VIệt Nam .............. 9

2.2.2.1. Nấm bào ngƣ Pleurotus florida ........................................ 10

2.2.2.2. Nấm bào ngƣ Pleurotus sajor-caju ................................... 10

2.2.2.3. Nấm bào ngƣ Pleurotus pulmonarius ............................... 11

2.2.2.4. Nấm bào ngƣ Pleurotus abalonus ..................................... 11

2.3. Phƣơng pháp sắc ký ......................................................................... 12

2.3.1. Đặc điểm chung của phƣơng pháp sắc ký ................................. 12

2.3.2. Cơ sở của phƣơng pháp sắc ký .................................................. 12

2.4. Một số phƣơng pháp sắc ký trong phân tich amino acid ................. 13

v

2.4.1. Sắc ký giấy (Paper chromatography) ......................................... 13

2.4.2. Sắc ký lớp mỏng ( Thin layer chromatography _TLC) ............. 14

2.4.3. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) ................ 15

2.4.3.1. Pha tĩnh .............................................................................. 15

2.4.3.2. Pha động ............................................................................ 16

2.4.3.3. Bộ dụng cụ HPLC ............................................................. 16

2.5. Các bƣớc phân tích amino acid ....................................................... 17

2.5.1. Quá trình thủy phân (Hydrolysis) .............................................. 17

2.5.2. Quá trình tạo dẫn xuất (Derivatisation) .................................... 19

2.5.3. Phân tách trên HPLC ................................................................. 20

2.5.4. Phân tích và tính toán dữ liệu .................................................... 21

2.4.4.1. Định tính ............................................................................ 21

2.4.4.2. Định lƣợng ......................................................................... 21

2.6. Phân tích amino acid trên nấm bào ngƣ .......................................... 23

3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................ 23

3.1.Thời gian và địa điểm thực hiện ....................................................... 23

3.1.1. Thời gian thực hiện ................................................................... 23

3.1.2 .Địa điểm ..................................................................................... 23

3.1.3.Vật liệu nghiên cứu ..................................................................... 23

3.2. Hóa chất và dụng cụ ........................................................................ 23

3.2.1. Hóa chất ..................................................................................... 23

3.2.2. Dụng cụ và thiết bị ..................................................................... 24

3.3. Phƣơng pháp nhân giống và trồng nấm ........................................... 24

3.3.1. Môi trƣờng ................................................................................. 24

3.3.2. Phƣơng pháp .............................................................................. 24

3.2.2.1. Chuẩn bị môi trƣờng PGA ............................................... 24

3.2.2.2. Chuẩn bị môi trƣờng hạt ................................................... 24

3.3.2.3. Chuẩn bị môi trƣờng giá môi ........................................... 25

3.2.2.4. Chuẩn bị môi trƣờng nuôi trồng ........................................ 25

3.2.2.5. Tóm tắt quy trình ............................................................... 26

3.3.3. Phân tích amino acid .................................................................. 26

3.3.3.1.Thủy phân mẫu ................................................................... 26

vi

3.3.3.2. Tạo dẫn xuất: ..................................................................... 27

3.3.3.3. Phân tích HPLC ................................................................. 28

3.3.3.4. Phân tích và tính toán kết quả ........................................... 28

4.. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 29

4.1. Kết quả ............................................................................................. 29

4.1.1. Kết quả trồng nấm ...................................................................... 29

4.1.1.1. Sự tăng trƣởng của hệ sợi trên các môi trƣờng ................. 29

4.1.1.2. Sự hình thành quả thể ........................................................ 30

4.1.2. Kết quả phân tích amino acid .................................................... 32

5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................... 35

5.1. Kết luận ............................................................................................ 35

5.2. Đề nghị............................................................................................. 35

6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................ 36

vii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACN:Acetonitril

HPLC: High performance liquid chromatography

TLC: Thin layer chromatography

PITC: phenylisothiocyanate

PTC: phenylisocarbamyl

TEA: Triethylamine.

viii

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH .......................................................................................................... TRANG

Hình 2.1. Cấc trúc tế bào nấm ................................................................................ 3

Hình 2.2. Chu kỳ sống của nấm đảm...................................................................... 6

Hình 2.3. Pleurotus pulmonarius ......................................................................... 11

Hình 2.4. Pleurotus abalonus ............................................................................... 11

Hình 2.5 Pleurotus sp .......................................................................................... 11

Hình 2.6. Pleurotus floridanus ............................................................................. 11

Hình 2.7. Mô hình sắc ký giấy ............................................................................. 14

Hình 2.8. Mô hình sắc ký lớp mỏng ..................................................................... 14

Hình 2.9. Bộ dụng cụ HPLC ................................................................................ 16

Hình 2.10. Thủy phân protein bằng HCl .............................................................. 18

Hình 2.11. Tạo dẫn xuất amino acid bằng PITC .................................................. 20

Hình 2.12. Kết quả phân tích amino acid trên Pleurotus sp bởi sắc ký giấy tròn ..... 22

Hình 4.1. Sinh trƣởng trên môi trƣờng hạt của Pleurotus floridanus, Pleurotus

flabellatus, Pleurotus flabellatus .......................................................................... 31

Hình 4.2. Pleurotus abalonus trên giá mô .................................................................. 31

Hình 4.3. Bào tử Pleurotus abalonus ................................................................... 31

Hình 4.4. Bào tử đảm Pleurotus floridanus ...................................................................................... 31

Hình 4 .5. Bào tử đảm Pleurotus abalonus ...................................................................................... 31

Hình 4.6. Quả thể nấm Pleurotus floridanus ........................................................ 32

Hình 4.7. Quả thể nấm Pleurotus abalonus ......................................................... 32

Hình 4.8 Quả thể nấm Pleurotus flabellatus ........................................................ 32

Hình 4.9 Quả thể nấm Pleurotus pulmonarius .................................................... 32

ix

DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG ......................................................................................................... TRANG

Bảng 2.1. Nhiệt độ thích hợp đối với một số nấm bào ngƣ .................................. 10

Bảng 2.2. Các dạng sắc ký cơ bản ........................................................................ 13

Bảng 4.1. Thời gian lan tơ đầy thiết bị của các dòng nấm ................................... 29

Bảng 4.2. Đặc tính quả thể của các dòng nấm ..................................................... 30

Bảng 4. 3. Thành phần amino acid trên Pleurotus pulmonaius, Pleurotus flabellatus .. 33

1

Phần 1. MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề

Hiện nay, nấm bào ngƣ đang dần trở thành một trong những khẩu phần chính

trong bữa ăn của ngƣời dân. Bên cạnh mùi vị thơm ngon, giàu dinh dƣỡng, rất dễ chế

biến, nấm còn đƣợc xem nhƣ là một loại “rau sạch” và có giá trị dƣợc liệu. Sản lƣợng

nấm bào ngƣ tăng lên rất nhanh trong vài thập kỷ qua. Theo thống kê của Chang và ctv

(1999) chỉ trong vòng 36 năm trở lại đây tổng sản lƣợng nấm trồng tăng gấp 21 lần từ

350.000 năm 1965 tăng lên 7,5 triệu tấn, trong đó nấm bào ngƣ Pleurotus spp. tăng từ

169000 tấn năm 1986 lên 876000 tấn năm1997.

Gần đây, Việt Nam cũng đang phát triển công nghệ trồng nấm trong nƣớc. Vì

thế, ngoài việc khai thác nấm hoang dại đem về trồng, nƣớc ta còn nhập khẩu nhiều

loại nấm bào ngƣ khác từ nƣớc ngoài nhƣ Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản. Trong số

đó, có một số loài đã đƣợc biết rất rõ về thành phần dinh dƣỡng, một số loài còn lại

thành phần này vẫn chƣa đƣợc công bố chính thức, đặc biệt là thành phần amino acid.

Vì thế, việc xác định thành phần amino acid trên nấm bào ngƣ đối với Việt Nam là

điều cần thiết để có thể đánh giá giá trị sinh học, cũng nhƣ so sánh sự khác nhau giữa

chúng. Từ xƣa đến nay, việc xác định amino acid đã đƣợc thực hiện trên rất nhiều

công cụ khác nhau nhƣ: sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng. Phân tích amino acid trên các

công cụ phân tích truyền thống này thì đòi hỏi nhiều thời gian và rất phức tạp.

Ngày nay, với sự phát triển của kỹ thuật phân tích, việc xác định thành phần

amino acid trong mẫu sinh hóa đã đƣợc đơn giản hơn rất nhiều, bởi hầu hết các công

cụ đã đƣợc tự động hóa và đƣợc nối trực tiếp bộ phận xử lý số liệu. Hiện nay, trên thị

trƣờng đang tồn tại rất nhiều kỹ thuật phân tích amino acid nhƣ: sắc ký lỏng cao áp,

HPLC (high performance liquid chromatography), sắc ký trao đổi ion (ion exchange

chromatography), điện di mao quản (capillary electrophoresis).

Trong phạm vi cho phép, chúng tôi chỉ thực hiện “Phân tích amino acid bằng

sắc ký lỏng cao áp” trên một số loài nấm đang có ở thị trƣờng Việt Nam. Từ đó, với

kết quả thu đƣợc chúng tôi sẽ tiến hành so sánh với các đối tƣợng khác cũng nhƣ sự

khác nhau giữa chúng và dữ liệu về thành phần amino acid của từng loài nấm bào ngƣ

sẽ đƣợc lƣu lại để làm cơ sở cho những nghiên cứu sau này.

2

1.2. Mục đích

So sánh sự thành phần amino acid giữa các loài nấm bào ngƣ đang có trên thị

trƣờng Việt Nam. Khi đó, chúng tôi sẽ chọn ra một loài phù hợp để so sánh thành phần

amino acid khi trồng trên các cơ chất khác nhau

1.3. Yêu cầu

Tạo đựợc mẫu có độ tinh sạch cao.

Tránh hiện tƣợng làm thay đổi tính chất mẫu nhƣ oxy hóa, halogen hóa, hay

làm mẫu bị hủy hoàn toàn trong quá trình thủy phân.

Sử dụng thiết bị HPLC (high performance liquid chromatography) của Trung

tâm Phân Tích Hóa Lý để phân tích thành phần amino acid của các loài nấm kể trên

1.4. Nội dung thực hiện

Thu thập và nhân giống các loài nấm đang có trên thị trƣờng.

Nuôi trồng các loài nấm này trên môi trƣờng mùn cƣa có bổ sung một số vi lƣợng.

Tiến hành thu quả thể

Xác định thành phần amino acid trên các loài nấm bào ngƣ bằng sắc ký lỏng

cao áp (HPLC).

3

Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Nấm trồng

2.1.1. Khái niệm về nấm

Hiện nay, số loài nấm trồng đƣợc chỉ chiếm một phần rất nhỏ trong số nấm ăn

thiên nhiên. Ngoài đặc điểm chung là quả thể hay tai nấm có kích thƣớc lớn (đa số

dạng tán dù), chúng còn ăn ngon và rất giàu dinh dƣỡng [5].

Nấm rất phong phú và đa dạng, bao gồm cả những loại ăn đƣợc và không ăn

đƣợc, những loài cho quả thể lớn có thể thấy bằng mắt thƣờng và những loài phải sử

dụng kính hiển vi mới quan sát đƣợc [5].

Ban đầu nấm đƣợc xếp vào giới thực vật. Tuy nhiên, quan điểm này ngày nay

không còn thuyết phục nữa và nhiều nhà phân loại học đã đề nghị xếp nấm vào một

giới riêng, gọi là giới nấm. Sở dĩ xếp Nấm thành một giới riêng mà không xếp vào giới

Thực vật vì nấm không có lục lạp, không có sắc tố quang hợp, không có đời sống tự

dƣỡng nhƣ thực vật, không có sự phân hóa thành rễ, thân, lá, không có hoa, phần lớn

không chứa cellulose trong thành tế bào [1].

Lysosome Thành tế bào Màng tế bào chất

Bộ máy golgi Nhân

Ti thể

Mạng lƣới nội chất Ribosome

Hình 2.1. Cấc trúc tế bào nấm (Nguyên Lân Dũng, 2001)

4

Nấm ăn có cấu tạo chủ yếu là hệ sợi nấm. Các sợi nấm ăn có dạng ống tròn.

Các ống này đều có vách ngăn. Sợi nấm còn gọi là khuẩn ty (hypha), hệ sợi nấm còn

gọi là khuẩn ty thể (mycelium). Khoảng cách giữa hai vách ngăn gọi là tế bào. Tế bào

nấm có những đặc trƣng riêng, khác biệt với tế bào động vật và thực vật. Trƣớc hết là

thành tế bào. Dƣới kính hiển vi điện tử có thể quan sát thấy thành tế bào cấu tạo bởi

nhiều lớp. Nếu nhƣ thành tế bào của thực vật cấu tạo chủ yếu bởi cellulose thì thành tế

bào của những nhóm nấm khác nhau lại có cấu tạo bởi những thành phần khác nhau.

Hầu hết các loài nấm đảm đều có thành tế bào cấu tạo chủ yếu bởi kitin- glucan. Thông

qua các lỗ trên vách ngăn, chất nguyên sinh có thể di chuyển dễ dàng trong sợi nấm.[1].

Trong tế bào sơi nấm khi quan sát dƣới kính hiển vi quang học phóng đại từ

1000 đến 1500 lần (Hình 2.1) có thể thấy

Màng tế bào

Nhân tế bào

Bộ máy golgi

Ribosome

Lysosome

Ti thể

Mạng lƣới nôi chất.

Sợi nấm có thể phát triển từ bào tử hay tử một đoạn sợi nấm. Bào tử nảy mầm

theo nhiều hƣớng khác nhau, sợi nấm phân nhánh nhiều lần, tạo nên một hệ sợi chằng

chịt và thƣờng có màu trắng.

Riêng ở nấm đảm nói chung thƣờng có tới 3 cấp sợi nấm. Sợi nấm cấp một (sơ

sinh), sợi nấm cấp hai (thứ sinh) và sợi nấm cấp ba (tam sinh). Sợi nấm cấp một lúc

đầu không có vách ngăn và có nhiều nhân, dần sẽ tạo thành vách ngăn và phân thành

nhiều tế bào đơn nhân trong sợi nấm. Sợi nấm cấp hai đƣợc tạo thành do sự phối trộn

của hai sợi nấm cấp một. Khi đó nguyên sinh chất trong hai sợi nấm sẽ phối trộn với

nhau. Hai nhân vẫn đứng riêng rẽ làm cho tế bào có hai nhân. Ngƣời ta còn gọi sợi

nấm loại này là sợi nấm song nhân (dycaryolic hyphae). Sợi nấm cấp ba là do sợi nấm

cấp hai phát tr iển thành. Các sợi nấm này liên kết chặt chẽ với nhau và

tạo thành quả thể [1].

5

2.1.2. Sinh sản và chu trình sống

Khả năng sinh sản là một đặc điểm quan trọng của nấm. Một tai nấm rơm

trƣởng thành có thể phóng hàng tỉ bào tử. Nhờ vậy, nấm phát triển rất nhanh và phân bố rộng.

Bào tử của nấm phổ biến có hai dạng: vô tính và hữu tính. Ở vi nấm, nấm mốc

lan truyền chủ yếu nhờ bào tử vô tính, chúng gây nhiễm khắp nơi dƣới dạng hạt bụi

nhỏ li ti, màu sắc khác nhau tùy loài. Riêng đối với nấm ăn, bào tử sinh ra bên dƣới

cấu trúc đặc bịêt gọi là mũ nấm hay tai nấm. Mũ nấm thƣờng có cuống nâng lên cao để

có thể nhờ gió đƣa bào tử đi xa. Bào tử nẩy mầm cho lại hệ sợi nấm mới [3].

Ngƣời ta quen gọi hệ sợi nấm ở giai đoạn tăng trƣởng (hay dinh dƣỡng) là tản

dinh dƣỡng, phân biệt với quả thể nấm (hay cơ quan sinh bào tử hữu tính của nấm) là

tản sinh sản.

Hầu hết nấm trồng là nấm đảm, cơ quan sinh sản có có cấu tạo đặc biệt là tai

nấm. Tai nấm chủ yếu gồm mũ và cuống nấm. Mũ thƣờng có dạng nón hay phễu, với

cuống đính ở giữa hay bên. Mặt dƣới mũ của nhóm này cấu tạo bởi các phiến mỏng

xếp sát vao nhau nhƣ hình nan quạt. Ở một số trƣờng hợp, phiến nấm còn kéo dài từ

mũ xuống cuống (chân nấm), nhƣ nấm bào ngƣ (Pleurotus) [3].

Bào tử đảm (basidiospore) tạo ra ở bề mặt phiến, trên cấu trúc đặc biệt gọi là

đảm (basidium). Riêng nấm đậu (Coprinus), khi tai nấm trƣởng thành mũ nấm sẽ chảy

thành dịch nƣớc đen mang theo các bào tử đảm; còn các bào tử khác sẽ rụng và bay

theo gió. Đảm đƣợc tạo thành từ các đầu ngọn sợi nấm. Tế bào này phồng to và bên

trong hai nhân đứng riêng lẻ, sẽ nhập lại thành một nhân. Quá trình này gọi là quá

trình thụ tinh [3].

Nhân thụ tinh sẽ phân chia và cuối cùng tạo ra 4 nhân con. Bình thƣờng mỗi

nhân sẽ đƣợc khối sinh chất đẩy vào một cái gai nhỏ (xuất hiện trên đảm) để tạo ra một

đảm bào tử, nhƣng đôi khi một đảm bào tử có thể cùng lúc hai nhân nhƣ nấm rơm (tỉ lệ

chiếm đến 1/4) hoặc đặc biệt ở nấm mỡ (Agaricus bisporus) chỉ sinh ra hai đảm tử,

mỗi bào tử chứa hai nhân.

Các tế bào đảm hợp lại thành lớp trên bề mặt của phiến, đƣợc gọi là lớp thụ

tầng (hymennium) và vì vậy đảm bào tử cũng thành lớp phủ trên trên bề mặt phiến.

Điều này thấy rõ nấm rơm, khi trƣởng thành phiến nấm chuyển sang màu đỏ là do màu

của bào tử.

6

Ngƣời ta phân biệt nấm đồng đảm (homobasidiomycetidae) và nấm dị đảm

(hemibasidiomycetidae) là dựa vào cấu trúc của đảm. Nấm đồng đảm có đảm là một tế

bào đồng nhất, còn nấm dị đảm hay tiền đảm chia làm 4 phần, mỗi phần tạo ra một

đảm bào tử. Đảm bào tử là bào tử hữu tính, khi rụng sẽ bay đi khắp nơi. Khi gặp điều

kiện thuận lợi nẩy mầm và cho lại hệ sợi nấm. Hệ sợi nấm thƣờng chỉ có một nhân nên

đƣợc gọi là sợi nấm sơ cấp (primary mycelium). Đối với nấm dị tản (heterothallic),

phải có sự phối hợp giữa hai sợi nấm sơ cấp phát sinh từ hai bào tử có đặc tính di

truyền khác nhau mới hoàn thành sợi nấm thứ cấp (secondary mycelium).

Trong khi đó nấm đồng tản (homothallic) chỉ cần hệ sợi sơ cấp từ bào tử nẩy

mầm cũng có thể tự phối cho ra hệ sợi nấm thứ cấp. Từ hệ sợi nấm thứ cấp chứa hai

nhân, nấm phát triển thành mạng sợi, lan khắp nơi trên cơ chất để hút chất dinh dƣỡng.

Trong trƣờng hợp bị đứt khúc, các sợi nấm tự làm lành vết thƣơng và tái lập lại hệ sợi,

tƣơng tự nhƣ cây trồng trong giâm hay chiết cành. Ở những điều kiện nhất định, nhƣ

ẩm độ, nhiệt độ thích hợp, hệ sợi nấm sẽ bện lại và tạo thành hạch nấm. Hạch nấm sẽ

tiếp tục phát triển cho quả thể trƣởng thành.[3].

Quả thể Phiến nấm

Giảm phân hình

thành bào tử đảm

Bào tử đảm

Sợi nấm sơ cấp

(đơn nhân)

Hợp tử

Sợi âm

Sợi dƣơng

Quá trình

dung hợp

Sợi nấm thứ cấp

(song nhân)

Hình thành

quả thể

Sợi nấm

song nhân

Hình 2.2. Chu kỳ sống của nấm đảm ( Peter H. Raven

và ctv, 1992)

7

Ở nấm đảm, sự phối hợp nguyên sinh chất giữa hai sợi nấm cấp một xảy ra rất

sớm, sợi nấm song nhân là hình thái chủ yếu của sợi nấm. Quả thể là do các sợi nấm

song nhân liên kết lại tạo thành. Sợi nấm song nhân về mặt di truyền đuợc biểu thị là

(n+n) khác với sợi nấm đơn nhân là n và hợp tử là 2n [1].

Ở một số loài còn có một dạng bào tử khác gọi là hậu bào tử hay bào tử màng

dày (Chlamydospore), thí dụ nhƣ nấm rơm. Hậu bào tử giống nhƣ một bào tử thu nhỏ

với đầy đủ nguyên sinh chất và hai nhân nhƣng cô đặc hơn và có vách tƣơng đối dày

bao bọc. Có thể xem đây là một dạng sống tiềm sinh của nấm vì sau đó bào tử này có

thể nẩy mầm và cho lại hệ sợi nấm thứ cấp [3].

2.1.3. Đặc điểm biến dƣỡng và sinh lý

Nấm chủ yếu sống dị dƣỡng, lấy thức ăn từ các nguồn hữu cơ (động vật hoặc

thực vật). Ngoại trừ niêm khuẩn thay đổi hình dạng tế bào để nuốt lấy thức ăn (tƣơng

tự động vật), còn lại hầu hết các loài nấm đều nấm lấy dinh dƣỡng qua màng tế bào hệ

sợi (giống rễ cây thực vật). Nhiều loài nấm có hệ enzym phân giải tƣơng đối mạnh,

giúp chúng có thể sử dụng các dạng thức ăn phức tạp, bao gồm các đại phân tử nhƣ

(cellulose, hemicellulose), chất đạm (protein), chất bột (amidon, polysaccharide),

lignin.Với cấu trúc sợi, tơ nấm len lỏi sâu vào trong cơ chất (rơm, rạ, mạt cƣa và nhiều

cơ chất khác) rút lấy thức ăn đem nuôi toàn bộ cơ thể nấm (tản dinh dƣỡng hay tản

sinh sản) [3].

Dựa theo cách thức dinh dƣỡng của nấm có thể chia thành 3 nhóm:

Hoại sinh: Đặc tính chung của hầu hết các loài nấm, trong đó có nấm

trồng. Thức ăn của chúng là xác bã động thực vật. Nhóm nấm này có hệ enzym tiêu

hoá tƣơng đối mạnh, phân giải đƣợc nhiều loại cơ chất. Chúng có khả năng biến các

chất này thành những chất có thành phần đơn giản để có thể hấp thụ đƣợc. Tuy nhiên,

cũng có những trƣờng hợp nấm không thể phân giải cơ chất mà phải nhờ vào các vi

sinh vật khác (vi khuẩn, nâm mốc, xạ khuẩn) tiến hành trƣớc một bƣớc[3].

Ký sinh: Bao gồm chủ yếu các loại nấm gây bệnh. Chúng sống bám vào

các loài sinh vật khác (động vật, thực vật, các loài nấm khác). Thức ăn của chúng

chính là các chất lấy từ cơ thể ký chủ, làm suy yếu hoặc làm tổn thƣơng ký chủ. Một

số nấm ăn có thể sống trên cây còn tƣơi nhƣng đời sống thực sự vẫn là hoại sinh, nên

đƣợc xếp vào nhóm trung gian, gọi là nhóm bán ký sinh (trƣờng hợp nấm mèo).

8

Cộng sinh: Đây là nhóm đặc biệt, lấy thức ăn từ cơ thể chủ nhƣng không

làm chết hoặc gây tổn thƣơng ký chủ, ngƣợc lại còn giúp chúng phát triển tốt hơn. Vì

vậy các loài này đối với ký chủ có mối quan hệ mật thiết với nhau. Do đó, việc nuôi

trồng trở nên phức tạp hơn, thƣờng giống nấm đƣợc cấy cùng lúc với việc trồng cây

(thí dụ nấm Tuber hoặc Boletus).

2.2. Nấm bào ngƣ

2.2.1. Giới thiệu

Nấm bào ngƣ (còn gọi là nấm sò, nấm bình cô, oyster mushroom) gồm nhiều

loài thuộc:

Chi Pleurotus

Họ Pleurotaceae

Bộ Agaricales

Lớp phụ Hymenomycetidae

Lớp Hymenomycetes

Ngành phụ Basidiomycotina

Ngành nấm thật-Eumycota

Giới nấm Mycota hay Fungi

Nấm bào ngƣ có tới 50 loài khác nhau. Tuy nhiên, số loài đƣợc nuôi trồng đƣợc

không nhiều, khoảng 10 loài [2].

Nấm bào ngƣ đƣợc nuôi trồng rộng rãi trên thế giới. Ở châu Âu nấm bào ngƣ

đƣợc trồng ở Hungary, Đức, Ý, Pháp, Hà Lan. Ở Châu Á nấm bào ngƣ đƣợc trồng ở

Trung Quốc với sản lƣợng rất cao (khoảng 12 nghìn tấn mỗi năm) giá khoảng 2.2 triệu

đồng Việt Nam. Ngoài Trung Quốc, nấm này còn đƣợc trồng ở Nhật Bản, Việt Nam,

Hàn Quốc, Thái Lan Ấn Độ [2].

Nấm bào ngƣ không chỉ ăn ngon mà còn có giá trị dinh dƣỡng cao. Trong nấm

chứa đầy đủ các amino acid.

Ngoài giá trị dinh dƣỡng, nấm bào ngƣ còn có giá trị dƣợc liệu. Nhiều nghiên

cứu cho thấy nấm bào ngƣ cùng một số nấm ăn khác có tác dụng chống ung thƣ. Bằng

phƣơng pháp khuếch tán vào thạch nhóm nghiên cứu của Trƣờng Đại học Khoa Học

Tự Nhiên đã cho thấy nấm bào ngƣ Pleurotus sajor - caju ở dạng bán cầu lệch có tác

dụng ức chế 2 chủng Vi khuẩn Gran dƣơng S. aureus và B. subtilis và 2 chủng Gram

9

âm E. coli và Pseudomonas aeruginosa [5]. Ngoài ra, theo nghiên của nhà khoa học

Trung Quốc – Phó Liên Giang nấm bào ngƣ còn có khả năng làm giảm lƣợng

cholesterol trong máu [3].

Một trong những đặc điểm quan trọng của nấm là hệ enzym. Nhờ enzym

cellulase và một số enzym khác, nấm bào ngƣ khả năng chuyển hoá cellulose thành

nhƣng chất cơ bản góp phần giải quyết nạn ô nhiễm môi trƣờng do chất thải nông

nghiệp tạo ra nhƣ bã mía, rơm rạ. Ngoài ra, nấm còn có khả năng phân hủy thuốc trừ

cỏ Antrazin nhờ vào sự gia tăng các enzym P – 450 của hệ Cytochromeoxxygenase và

peroxydase (Sannia và ctv, 1990) [3] .

Nấm bào ngƣ có đặc điểm chung là tai nấm dạng phễu lệch, phiến nấm mang

bào tử kéo dài xuống chân. Cuống nấm gần gốc có lông mịn. Tai nấm còn non có màu

sắc tối, nhƣng khi trƣởng thành trở nên sáng hơn. Quả thể nấm bào ngƣ phát triển qua

nhiều giai đọan, dựa theo hình thái tai nấm mà tên gọi cho từng giai đoạn khác nhau.

Dạng san hô: quả thể mới tạo thành dạng sợi mãnh hình chùm.

Dạng dùi trống: mũ xuất hiện dƣới dạng khối tròn.

Dạng phễu: mũ mở rộng trong khi cuống còn ở giữa

Dạng bán cầu lệch: cuống lớn nhanh một bên so với vị trí trung bình.

Dạng lục bình: cuống ngừng tăng trƣởng, nhƣng mũ vẫn phát triển.

Nấm bào ngƣ có chu trình phát triển cũng nhƣ các loài nấm đảm khác, bắt đầu

đảm bào tử hữu tính, nẩy mầm cho hệ sợi tơ dinh dƣỡng (sơ cấp và thứ cấp) và “kết

thúc” bằng việc hình thành cơ quan sinh sản là tai nấm. Tai nấm sinh ra đảm bào tử và

chu trình lại tiếp tục [3] .

2.2.2. Một số loài nấm bào ngƣ đƣợc nuôi trồng ở VIệt Nam.

Hiện nay, nấm bào ngƣ đƣợc trồng rộng rãi ở Việt Nam cả miền Bắc lẫn miền

Nam vì khí hậu nƣớc ta rất thuận lợi cho việc phát triển loài nấm này. Hiện nay, nấm

bào ngƣ đƣợc trồng với nhiều chủng loại (khoảng 7 loại) tập trung nhiều ở Đà Lạt và

Thành phố Hồ Chí Minh. Hầu hết các dòng nấm đƣợc nuôi trồng ở nƣớc ta là các

giống đƣợc nhập từ nƣớc ngoài. Tuy nhiên vẫn có một số ít đƣợc khai thác ngay trên

địa lý của Việt Nam sau đó đêm về nuôi trồng trên điều kiện nhân tạo.

10

Bảng 2.1. Nhiệt độ thích hợp đối với một số nấm bào ngƣ (Lê Duy Thắng, 1999)

Loài nấm

Nhiệt độ thích

hợp cho tơ tăng

trƣởng ( 0C)

Nhiệt độ thích hợp

cho ra nấm ( 0C)

Pleurotus floridanus

Pleurotus sajor - caju

Pleurotus pulmonarius

Pleurotus abalonus

Pleurotus flabellatus

25-30

25-30

22-28

27-32

20-28

25

25

25

25

20-25

2.2.2.1. Nấm bào ngƣ Pleurotus floridanus (Hình 2.6)

Đây là loài thích nghi với nhiệt độ khá rộng từ 8 - 30oC. Quả thể màu trắng

sữa. Có tính kháng tạp nấm, tạp khuẩn cao. Sợi nấm có họat tính mạnh đối với việc

phân giải cellulose. Sản lƣợng trên đơn vị nguyên liệu tƣơng đối cao. Nấm này có thể

thích nghi với nhiều loại cơ chất khác nhau: bã mía, mùn cƣa, rơm, trấu. Khi trồng

trên trấu, năng suất có thể đạt đƣợc đợt ra quả thể đầu tiên là 114g nấm tƣơi trên 360 g

nguyên liệu khi có bổ sung ure, KH2PO4, cám gạo [4].

2.2.2.2. Nấm bào ngƣ Pleurotus sajor - caju (nấm sò phƣợng vỹ hay nấm sò

dạng phễu)

Quả thể đƣợc hình thành ở nhiệt độ tƣơng đối cao so với các loài nấm khác.

Gần đây, nấm này đang dần chiếm thị trƣờng vì quả thể chắc, ăn ngon và rất thích hợp

đối với khí hậu Việt Nam. Ngoài ra, dịch chiết từ nấm này có thể ức chế một số loài vi

khuẩn: S. aureus và B. subtilis, E. coli và Pseudomonas aeruginosa [5]. Ngoài các cơ

chất thông thƣờng, gần đây nấm này còn đƣợc trồng trên cơ chất là cây mai dƣơng để

chống sự xâm lấn của chúng góp phần giải quyết nạn môi trƣờng. Loài nấm này đƣợc

nhập từ Nhật Bản và đƣợc nuôi trồng thành công trên mùn cƣa đầu tiên ở Thành phố

Hồ Chí Minh.

11

2.2.2.3. Nấm bào ngư Pleurotus pulmonarius

Phần lớn đƣợc nhập từ nƣớc ngoài (Hình 2.3). Nhƣng gần đây, GS. Lê Xuân

Thám và cộng sự (1999) phát hiện đƣợc một loại khác ở Daklak - Tây Nguyên, sau đó

đƣa về Đà Lạt và đã hoàn thiện quy trình trồng trên mùn cƣa [7] .

2.2.2.4. Nấm bào ngƣ Pleurotus abalonus

Nấm này có nguồn gốc từ Đài Loan. Là một loài nấm ƣa nóng nên rất thuận lợi

để phát triển nuôi trồng trong điều kiện khí hậu của Việt Nam [1]. Nấm này có đặc

điểm là quả thể rất to (Hình 2.4), đƣờng kính mũ nấm có thể đạt đến 35 cm [2].

Ngoài ra còn một loài khác cũng đang đƣợc trồng ở Việt Nam nhƣ Pleurotus

eryngii, Pleurotus flabellatus. Và mới đây (2005) Thạc sĩ Cổ Đức Trọng đã trồng

thành công 2 loài nấm bào ngƣ mới: Pleurotus citrinopileatus Singer Pleurotus (quả

thể màu vàng) và Pleurotus djamor (quả thể có màu hồng)[7].

Hình 2.6. Pleurotus floridanus

Hình 2.3. Pleurotus pulmonarius Hình 2.4. Pleurotus abalonus

Hình 2.5 Pleurotus sp.

12

2.3. Phƣơng pháp sắc ký - Phân tích amino acid

2.3.1. Đặc điểm chung của phƣơng pháp sắc ký

Phƣơng pháp sắc ký đƣợc phát triển vào đầu tiên bởi Mikhail Semyonovich Tsvet

(1901) trong quá trình nghiên cứu về chlorophyll. Đến năm 1952, Archer John Porter

Martin and Richard Laurence Millington Synge đã đoạt giải Nobel hóa học về sắc ký

phân tách. Từ đó kỹ thuật sắc ký ngày vàng đƣợc phát triển cao hơn cho đến ngày nay [24].

Sắc ký là phƣơng pháp phân tách, phân li, phân tích các chất dựa vào sự phân

bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và pha tĩnh.

Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha tĩnh và

pha động tƣơng ứng với tính chất của chúng (tính hấp phụ, tính tan). Trong các hệ

thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ sắc ký. Các

chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha tĩnh và pha động. Trong quá trình pha

động chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ

lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ. Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha

tính sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tƣơng tác yếu hơn

với pha này. Nhờ vậy mà ngƣời ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký [10].

2.3.2. Cơ sở của phƣơng pháp sắc ký

Phƣơng pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha động

và pha tĩnh. Có nhiều nguyên nhân đƣa đến sự phân bố khác nhau giữa nhau của các

chất, nhƣng chính sự lặp đi lặp lại hiện tƣợng hấp phụ - phản hấp phụ của các chất khi

dòng pha động chuyển động qua pha tĩnh là nguyên nhân chủ yếu của việc tách sắc ký.

Hầu hết các phƣơng pháp sắc lý đều đƣợc dựa theo nguyên lý trên, và hiệu quả

của từng phƣơng pháp phụ vào sự chọn lựa giữa pha động pha tĩnh [8].

2.3.3. Phân loại quá trình sắc ký

Trong phƣơng pháp sắc ký pha động phải là các lƣu thể còn pha tĩnh là các chất

ở trạng thái lỏng hoặc rắn. Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, ngƣời ta chia sắc

ký thành hai nhóm sắc ký khí và sắc ký lỏng. Dựa vào cơ chế trao đổi của các chất

giữa pha động và pha tĩnh mà ngƣời ta lại chia các phƣơng pháp sắc ký thành nhóm

nhỏ hơn.

13

Tùy theo trạng thái tập hợp của các pha, loại tƣơng tác và sự hình thành sắc ký

mà ngƣời ta phân biệt các loại sắc ký nhƣ bảng 2.2.

Bảng 2.2. Các dạng sắc ký cơ bản [9]

Dạng sắc ký

Pha động

Pha tĩnh

Cách bố trí

pha tĩnh

Cơ chế trao

đổi chất

Khí

Khí- hấp phụ

Khí -lỏng

Lỏng

Lỏng - rắn

Lỏng - lỏng

Lỏng - nhựa trao đổi

Lớp mỏng

Rây (sắc ký gel)

Khí

Khí

Lỏng

Lỏng

Lỏng

Lỏng

Lỏng

Rắn

Lỏng

Rắn

Lỏng

Rắn

Rắn

Lỏng

Cột

Cột

Cột

Cột

Cột

Lớp mỏng

Cột

Hấp phụ

Phân bố

Hấp phụ

Phân bố

Trao đổi ion

Hấp phụ

Theo kích thƣớc

phân tử

2.4.. Một số phƣơng pháp sắc ký trong phân tích amino acid

Phân tích amino acid là phƣơng pháp xác định thành phần amino acid cũng nhƣ

định lƣợng chúng trong mẫu protein hay peptide. Phân tích amino acid có thể sử dụng

sắc ký giấy (paper chromatography), sắc ký lớp mỏng (thin layer chomatography-

TLC), sắc ký khí (gas chromatography), sắc ký trao đổi ion (ion exchange

chromatography), sắc ký lỏng cao áp (high performance liquid chromatography), điện

di mao quản (capillary electrophoresis) [15].

2.4.1. Sắc ký giấy (Paper chromatograhhy)

- Quá trình phân tách đƣợc thực hiện trên giấy sắc ký hoặc giấy lọc (Hình 2.7).

- Dùng viết chì, vẽ một đƣờng mảnh trên gốc của giấy (1,5 - 2 cm). đánh

những dấu nhỏ dọc theo đƣờng vừa kẻ.

- Dùng pipett hút lƣợng mẫu với thể tích nhất định cho vào những dấu vừa

mới đánh. Để khô, tiếp tục cho vào mẫu thứ 2 trên đầu tube khác nhau. Làm khô.

- Đặt chúng vào bồn sắc ký (cho dung môi ngập khoảng 1cm giấy sắc ký).

- Để bồn ở nơi mát tránh ánh sáng trực tiếp, khoảng 1 giờ.

14

- Lấy ra, dùng viết chì kẻ đƣờng đánh dấu nơi mà dung môi di chuyển. Làm khô.

- Phun ninhydrin vào toàn bộ mặt giấy. Để khô. Tính giá trị Rf. [24]

- Đối với sắc ký giấy dùng cho phân tích amino acid, các nhà phân tích

còn dùng sắc ký cuộn tròn và sắc ký giấy tròn.

2.4.2. Sắc ký lớp mỏng ( Thin layer chromatography _TLC)

Trong phƣơng pháp này, pha tĩnh là một lớp mỏng chất hấp phụ đƣợc gắn vào

một giá mang thƣờng là bản thủy tinh và pha động đi qua lớp mỏng này bằng lực mao dẫn.

Trong TLC một chiều, các thành phần trong mẫu đƣợc tách rời nhau bằng một

lần chạy sắc ký với một dung môi nào đó, còn TLC hai chiều là một kỹ thuật sắc ký có

khả năng tách mạnh bằng hai lần chạy sắc ký với hai chiều vuông góc nhau và với hai

hệ dung môi khác nhau [7].

Quy trình phân tích amino acid trên TLC [23]

- Lấy tấm TLC, dùng viết chì vẽ một đƣờng mảnh cách mép dƣới của tấm

TLC khoảng 2 cm, đánh „dấu‟ trên đƣờng bút chì vừa đƣợc vẽ. Chú ý đánh dấu từng

vết đều nhau và dán nhãn trƣớc để có thể không nhần lẫn khi phát hiện.

- Nhỏ trên mỗi đánh dấu một giọt dung dịch amino acid mẫu, làm khô tấm TLC.

- Thêm dung môi cho vào một beaker rộng điều chỉnh lƣợng dung môi để có

thể phủ toàn bộ chiều ngang của tấm TLC ( chú ý phủ khoảng 1cm chiều cao của lớp mỏng).

15

- Cho tấm TLC vào beaker, mẫu đƣợc đặt phía dƣới.

- Khi dung môi di chuyển đƣợc khoảng 85 % của tấm mỏng thì lấy tấm

mỏng ra dùng viết chì vẽ một đƣờng mảnh ngang với đƣờng dung môi vừa di chuiyển

đến. Để chúng khô hoàn toàn.

- Cho bảng mỏng vào tủ hút, nhỏ ninhydrin vào để có thể thấy màu. Làm

khô. .Khi đó amino acid sẽ xuất hiện màu trên bảng mỏng. Đánh dấu từng vết bằng bút

chì ngay ở tâm. Tính giá trị Rf ( retardation factor).

- Lƣu giá trị Rf để tính toán những amino acid chƣa biết.

Ngoài ra, amino acid cò đƣợc phân tích trên sắc ký trao đổi ion thông qua phát

hiện sau khi bị tách qua cột, sắc ký khí,, điện di mao quản, HPLC. Tuy nhiên, đối với

phân tích amino acid, sắc ký lỏng cao áp (HPLC) thƣờng đƣợc sử dụng nhất bởi vì nó

có nhiều ƣu điểm hơn nhƣ: thời gian ngắn. độ phân tách cao, dẫn xuất ổn định và có

thể phát hiện thông qua UV (Ultraviolet).

2.4.3. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

HPLC đƣợc ra đời vào đầu những năm1970 là một trong những công cụ phân

tích đầu tay của các nhà phân tích.

HPLC dựa vào pha động (dạng lỏng) để phân tách các thành phần trộn lẫn vào

nhau. Những thành phần này đầu tiên đƣợc hòa tan vào trong dung môi và sau đó dƣới

tác dụng của áp suất cao , chúng sẽ bị lôi kéo di chuyển qua cột sắc ký. Trong cột, hỗn

hợp sẽ đƣợc phân tách thành những cấu tử của chúng.

Sự tƣơng tác giữa chất tan với pha động và pha tĩnh có thể phụ thuộc vào sự

chọn lựa khác nhau cả dung môi và pha tĩnh. Kết quả HPLC sẽ thu đƣợc nhiều cấu tử

khác nhau mà các kỹ thuật sắc ký khác không thực hiện đƣợc và nó dễ dàng phân tách

số lƣợng lớn các chất hoá học trộn lẫn vào nhau.

2.4.3.1. Pha tĩnh

Tùy theo mẫu phân tích mà ta có có mô hình pha tĩnh khác nhau.

Liquid - Solid Dựa trên độ phân cực. Những cấu tử nào có độ phân cực mạnh

sẽ liên kết chặ với pha tĩnh hơn những chất có độ phân cực yếu hơn. Vì thế những chất

ít phân cực sẽ bị lôi cuốn ra khỏi cột nhanh hơn.

16

Size - Exclusion Dựa trên kích thuớc phân tử của thành phần đƣợc phân tích.

Pha tĩnh chứa các hạt xốp bên trong có nhiều lỗ nhỏ. Những thành phần có kích thƣớc

lớn hơn hạt sẽ bị loại ra ngoài và đƣợc tách rửa đầu tiên. Những cấu tử có kích thƣớc

phù hợp sẽ bị hấp thu và lỗ và đƣợc tách rửa sau.

Normal phase (pha bình thƣờng) Pha tĩnh phân cực cao hơn độ phân cực của

dung môi pha động .

Reverse Phase (ngƣợc pha) pha tĩnh có độ phân cực thấp, pha động có độ phân

cực cao hơn.

Ion-Exchange đƣợc tiến hành dựa trên sự thay thế những ion trong mẫu với

những ion trái dấu trong pha tĩnh. Khi đó pha tĩnh sẽ giữ lại mẫu và pha động di

chuyển qua cột sẽ thế chỗ cho ion mẫu và đẩy mẫu ra khỏi cột.

2.4.3.2. Pha động

Tùy thuộc vào mô hình của HPLC mà pha động có thể thay đổi. Đối với pha

bình thƣờng, thì dung môi thƣờng là không phân cực còn đối với mô hình ngƣợc pha

thì thì thƣờng sử dụng có sự pha trộn giữa nƣớc và một vài dung môi hữu cơ phân cực

nhƣ acetonitrile.

Đối với mô hình size - exclusion, yêu cầu đối với pha động là ngăn cản mẫu

gắn kết trên bề mặt của pha tĩnh.

17

2.4.3.3. Bộ dụng cụ HPLC

Bơm: Bơm trong HPLC đuợc xem là một trong những thành phần rất

quan trọng trong hệ thống sắc ký lỏng. Bởi vì hệ thống sắc ký lỏng đòi hỏi phải có tỉ lệ

dòng ổn định liên tục gắn liền với injector, cột và detector. Có hai loại bơm cơ bản

- Bơm áp suất liên tục.

- Bơm dòng liên tục.

Cột: Hiện nay có rất nhiều loại cột đang đƣợc sử dụng. Tuy nhiên tùy

thuộc vào loại mẫu, tính chất của mẫu mà ta có loại cột và kích thƣớc cột khác nhau.

Đối với sắc ký ngƣợc pha thì cột C-18 và Pico-Tag column, 3.9 mm x 15 cm thƣờng

đƣợc sử dụng nhất.

Detector: Một số detector thƣờng đƣợc sử dụng:

- Detector Ultraviolet/visible: thƣờng đƣợc sử dụng để phát hiện các chất hữu cơ.

- Detector chuỗi diode.

- Detector huỳnh quang.

Và một số detector khác nhƣ detector điện hóa học,detector dẫn điện…

Hệ thống dữ liệu. Để chuyển dữ liệu phân tích, detector thƣờng đƣợc nối

trực tiếp với một máy vi tính. Khi đó dữ liệu đƣợc chuyển thành những peak trên sắc

ký đồ và đƣợc tính toán.

2.5. Các bƣớc phân tích amino acid

Phân tích amino acid đƣợc thực hiện thông qua các bƣớc sau đây [17].

- Chuẩn bị mẫu

- Thủy phân protein thành những amino acid đơn.

- Tạo dẫn xuất.

- Phân tách amino acid trên hệ thống sắc ký

- Phân tích dữ liệu và tính toán.

Trƣớc khi tiến hành phân tích amino acid, quá trình chuẩn bị mẫu cũng đóng vai

trò rất quan trọng vì nếu không chuẩn bị kỹ sẽ rất dễ bị nhiễm trong quá trình phân tích.

- Mẫu đƣợc đặt trong một tube sạch.

- Tất cả mẫu đƣợc làm khô trƣớc khi phân tích.

Trong quá trình tiến hành phải đeo găng tay , tuy nhiên tránh các bụi trên găng

tay bám vào mẫu.

18

2.5.1. Quá trình thủy phân (Hydrolysis)

Để phân tích amino acid trong mẫu protein, mẫu phải đƣợc thủy phân tạo thành

những amino acid đơn.

Thủy phân bằng acid là phƣơng pháp thông thƣờng nhất để thủy phân protein

trƣớc khi tiến hành pnân tích amino acid. Phƣơng pháp thủy phân bằng acid có thể tạo

ra sự phân cắt khác nhau đối với một vài amino acid- phá hủy hoàn toàn hoặc một

phần. Một số khó khăn khi thủy phân bằng acid.

- Trytophan bị phá hủy hoàn toàn

- Serine và threonine bị phá hủy một phần

- Methionine có thể bị oxy hóa

- Cysteine thƣờng đƣợc phát hiện nhƣ là cystine (nhƣng cystine thƣờng

đƣợc phát hiện rất kém bởi vì chúng bị phân hủy một phần).

- Asparagine và glutamine tƣơng ứng bị chuyển thành acid aspartic và

acid glutamic.

Nhƣ vậy, nếu kỹ thuật thủy phân không tốt có thể gây ra nhiều kết quả không chính xác.

Một số phƣơng pháp thủy phân thƣờng đƣợc sử dụng trong HPLC.

Phƣơng pháp 1: Dùng HCl 6N và phenol (từ 0.1- 1 %)

Phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng nhất là dùng HCl có chứa phenol. Thêm

phenol vào để ngăn cản phản ứng halogen hóa tyrosine.Dung dịch thủy phân: HCl 6N

chứa từ 0,1 đến 1 % phenol.

Phƣơng pháp tiến hành:

- Cho mẫu vào tube thủy phân và làm khô (mẫu đƣợc làm khô để nƣớc

không pha loãng acid).

Hình 2.10. Thủy phân protein bằng HCl [17]

19

- Thêm dung dịch thủy phân vào mẫu với tỷ lệ nhất định.

- Làm lạnh tube chứa mẫu.

- Mẫu thƣờng đƣợc thủy phân ở 110oC, trong 24h trong chân không hoặc

trong khí trơ để ngăn cản quá trình oxy hóa. Thời gian thủy phân có thể thay đổi tùy

theo mục đích phân tích.

- Sau khi thủy phân làm khô mẫu trong chân không để loại bỏ acid thừa.

Phƣơng pháp 2: Dùng Mercaptoathanesulfonic (MESA) 2.5M.

- Mẫu đƣợc làm khô trong một tube trƣớc khi thủy phân.

- Tube chứa mẫu này cho vào một tube lớn hơn đã chứa dung dịch thủy phân.

- Tube thủy phân này đƣợc tiến hành trong chân không để làm bay hơi

dung dịch thủy phân. Tube thủy phân đƣợc gia nhiệt từ 170oC đến 185

oC khoảng 12 phút.

- Sau khi thủy phân tube đƣợc làm khô trong chân không để loại bỏ acid

dung dịch thừa [17].

2.5.2. Quá trình tạo dẫn xuất (Derivatisation) [17]

Những amino acid sẽ không đƣợc phát hiện nếu chúng không đƣợc tạo dẫn xuất.

Hiện nay có rất nhiều phƣơng pháp tạo dẫn xuất, sự chọn lựa bất kỳ một kỹ

thuật nào phụ thuộc vào độ nhạy, thời gian phân tích và độ chính xác của phƣơng pháp.

Nói chung một nữa trong số kỹ thuật phân tách amino acid là kỹ thuật sắc ký

trao đổi ion kèm theo postcolumn (ninhydrin hay o – phthaladehyde). Kỹ thuật phát

hiện bằng postcolumn chỉ yêu cầu với lƣợng mẫu nhỏ (khoảng 5-10 µg protein trong

một lần phân tích).

Kỹ thuật phân tích amino acid liên quan đến tạo dẫn xuất precolumn cũng đƣợc

ứng dụng rất rộng rãi và yêu cầu là HPLC ngƣợc pha. Kỹ thuật này rất nhạy nên đòi

hỏi lƣợng mẫu phân tích rất nhỏ chỉ khoảng 0.5-1 µg.

Phƣơng pháp phát hiện bằng ninhydrin postcolumn

Phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion với ninhydrin postcolumn là một trong những

phƣơng pháp đƣợc ứng dụng nhiều nhất trong kỹ thuật định lƣợng amino acid.

Sau khi amino acid đƣợc phân tách trên sắc ký sẽ đƣợc phát hiện thông qua

phản ứng của chúng với ninhydrin sẽ tạo màu vàng hay màu tím. Những amino acid

thƣờng cho màu tím sẽ đƣợc phát hiện ở bƣớc sóng hấp thụ là 570 nm. Những amino

acid cho màu nhƣ là proline thƣờng đƣợc phát hiện ở bƣớc sóng 440 nm. Ngoài

20

ninhydrin, o – phthalaldehyde (OPA) cũng đƣợc sử dụng trong phân tích postcolumn.

Bƣớc sóng phát hiện của phƣơng pháp này thƣờng vào khoảng 348 - 450 nm.

Đối với phƣơng pháp precolumn thì tác nhân tạo dẫn xuất thƣờng đƣợc sử dụng

là phenylisothiocyanate (PITC). PITC phản ứng với amino acid ở nhiệt độ phòng trong

vòng 5-10 phút (Pierce Chemical company, 1999) tạo thành phenylisocarbamyl (PTC)

và có thể đƣợc phát hiện ở bƣớc sóng 254 nm. Vì thế tạo dẫn xuất amin acid với PITC

thông qua sắc ký ngƣợc pha (reversed-phase HPLC) có thể đƣợc sử dụng để phân tích

định lƣợng amino acid với detector UV.

Với phƣơng pháp này, giới hạn phát hiện cho phần lớn những amino acid là

khoảng 1pmol. Độ tuyến tính tƣơng ứng (response linearity) thu đƣợc từ 20 đến 500

pmol. Để thu đƣợc kết quả tốt, lƣợng mẫu lớn hơn 500 ng trƣớc khi thủy phân là tốt nhất.

Ngoài sử dụng các thành phần phản ứng nêu trên, các hợp chất sau đây cũng đƣợc

sử dụng để phát hiện amino acid trong các mẫu sinh hóa.

o - phthaladehyde (OPA).(dẫn xuất sau khi qua cột)

Hydroxysuccinimidyl carbamate (AQC) (dẫn xuất tiền cột)

Dimethylaminoazobenzenesulfonyl chloride (DABS-Cl) (dẫn xuất tiền cột)

9-Fluornylmethyl choloformate (FMOC-Cl) (dẫn xuất tiền cột)

7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole (NBD-F) (dẫn xuất tiền cột)

2.5.3. Phân tách trên HPLC [17]

Đầu tiên, chuẩn amino acid đƣợc phân tách trƣớc với các nồng độ khác nhau để

làm dữ liệu cho công việc tính toán sau này.

Mẫu thƣờng đƣợc bơm với thể tích nhất định.

Hình 2.11. Tạo dẫn xuất amino acid bằng PITC [10].

21

Tùy theo phƣơng pháp precolumn hay postcolumn mà ta có thể sử dụng pha

động, pha tĩnh, cột cũng nhƣ điều chỉnh bƣớc sóng phát hiện và detector phù hợp. Khi

đó thời gian phát hiện cũng khác nhau.

Nếu là PTC-aa thƣờng đƣợc phân tách trên cột cilica C18, hoặc Pico -Tag của sắc ký

ngƣợc pha; pha động thƣờng là acetonitrile; bƣớc sóng phát hiện ở 254nm và tất cả các

aa thƣờng đƣợc phát hiện khoảng 12 phút.không kể thời gian rửa cột hay thời gian

thêm để tạo cho đƣờng nền trở lại.

2.5.4. Phân tích và tính toán dữ liệu [10]

2.5.4.1. Định tính

Để phát hiện đƣợc các amino acid, phƣơng pháp thông thƣờng là dựa vào thời

gian lƣu của chuẩn đã đƣợc thực hiện chạy sắc ký trƣớc. sau đó, thời gian lƣu của mẫu

đƣợc so sánh với chuẩn này và từ đo xác định từng amino acid tƣơng ứng với từng

diện tích peak để định lƣợng.

2.5.4.2. Định lƣợng

Thành phần của từng amino acid đƣợc thể hiện bằng phần trăm về số mol

(mol%) so với tất cả những phần khác trong mẫu protein hay peptide. Chẳng hạn nhƣ

nếu protein có 5 nmol Ala tổng số tất cả các amino acid trong protein là 200 nmol kể

cả Ala thì phần trăm số mol của Ala là 2.5. Kết quả thu đƣợc sẽ tạo nên một profile

riêng biệt đối với tất cả các amino acid trong một protein hay peptide cụ thể.

2.6. Phân tích amino acid trên nấm bào ngƣ

Thành phần amino acid trên nấm bào ngƣ đã đƣợc tiến hành phân tích từ rất lâu,

nhất là khi kỹ thuật sắc ký ra đời.

.Năm 1962, Zakia Bano và cộng sự, viện nghiên cứu công nghệ thực phẩm

Mysore, Ấn Độ đã tiến hành phân tích trên sắc ký giấy tròn. Và ông đã phát hiện trong

nấm này chứa đến 17 amino acid. Trong đó hiện hiện đầy đủ 10 amino acid cần thiết [15].

22

L: lycine

IL:Isoleucine

Ph Al: Phenylalanine

Glu: Glutamic acid

Thr: Threonine

Ser: Serine

Gly: Glycine

Asp: Aspartic acid

Arg: Agrinine,

Pep: Peptide

Lys:Lysine,

His: Histidine

Cys: Cysteine

Hình 2.12. Kết quả phân tích amino acid trên Pleurotus sp bằng sắc

ký giấy tròn (Zakia Bano, 1962)

23

PHẦN 3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1.Thời gian, địa điểm thực hiện và vật liệu nghiên cứu

3.1.1. Thời gian thực hiện

Khóa luận đƣợc thực hiện từ ngày 14/2/2005 đến ngày18/8/2005.

3.1.2. Địa điểm

Trung tâm Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.

Phòng Hóa Lý, Trung tâm Phân Tích Thí nghiệm Hóa Sinh, Đại học Nông Lâm

Thành phố Hồ Chí Minh.

3.1.3. Vật liệu nghiên cứu

Giống nấm

Pleurotus floridanus

Pleurotus sajor – caju

Pleurtus abalonus

Pleurotus pulmonarius

Pleurotus flabellatus

Nguồn cung cấp

Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP Hồ Chí Minh

Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP Hồ Chí Minh

Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP Hồ Chí Minh

Viện hạt nhân Đà Lạt (Lê Viết Ngọc)

Viện hạt nhân Đà Lạt (Lê Viết Ngọc)

3.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị

3.2.1. Hóa chất

HCl 6N

Phenol

PITC (phenylisothiocyanate).

Methanol

Ethanol

Nƣớc khử ion

TEA (Triethylamine)

Chuẩn hỗn hợp 17 amino acid

ACN (Acetonitril).

Glucose

Saccharose

KH2PO4

MgSO4

Sodium acetate

HNO3 đậm đặc

EDTA

24

3.2.2. Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị

Tủ cấy vô trùng

Tủ sấy

Tủ mát

Nồi hấp khử trùng

Máy HPLC

Thiết bị thổi khí trơ

Cột Pico-Tag

Dụng cụ

Ống nghiệm

Đĩa petri Φ 9 cm

Bình tam giác

Bình quả lê

Pipett 0.1-10 µl

Pipett 10-100 µl

Filter Φ 0.20 µm

3.3. Phƣơng pháp nhân giống và trồng nấm

3.3.1. Môi trƣờng

Môi trƣờng

thạch (PGA)

Khoai tây

Glucose

Agar

Môi trƣờng hạt

Cám gạo

CaCO3

Lúa

Môi trƣờng giá môi

Khoai mì

Cám gạo

KH2PO4

MgSO4

CaCO3

Môi trƣờng giá thể

Mùn cƣa

Cám gạo

KH2PO4

MgSO4

25

3.3.2. Phƣơng pháp

3.2.2.1. Chuẩn bị môi trƣờng PGA

- Khoai tây bóc vỏ, rửa sạch. Cân 200 g, đun sôi, lọc lấy nuớc.

- Thêm 20 g agar, cho thêm nƣớc cất để đủ 1 lít, đun tan agar.

- Cho vào ống nghiệm (khoảng 1/5 so với chiều cao ống nghiệm), đậy nút bông.

- Hấp khử trùng ở 121oC, 1.2 atm, trong 20 phút.

- Lấy ra, để nghiêng chuẩn bị cho cấy chuyền.

- 5 dòng nấm bào ngƣ sau khi đem về phòng thí nghiệm, đƣợc tiến hành cấy

chuyền sang môi trƣờng thạch nghiêng PGA..

3.2.2.2. Chuẩn bị môi trƣờng hạt

- Lúa đƣợc đun sôi, nứt nanh, trộn với CaCO3 (2%) , cám gạo (10%).

- Cho vào bình tam giác, hoăc bình thủy tinh, hấp khử trùng ở 121oC, 1,2 atm,

trong 90 phút.

- Khi tơ nấm phát triển đầy ống nghiệm, chúng sẽ đƣợc cấy sang môi trƣờng hạt.

đem để trong bóng tối. Tùy theo mỗi loài mà thời gian phát triển đầy bình sẽ khác nhau.

Trong quá trình đó, chuẩn bị môi trƣờng giá môi.

3.3.2.3. Chuẩn bị môi trƣờng giá môi

- Cọng mì đƣợc cắt khoảng 15 – 20 cm, tùy theo kích thƣớc của túi ny lông,

ngâm khoảng 24 giờ, trộn với một số hóa chất khác nhƣ KH2PO4, MgSO4 với tỉ lệ nhất

định ( 2% đối với MgSO4 và 1 % đối với KH2PO4).

- Hấp khử trùng ở 121oC , 1,2 atm trong 90 phút.

- Khi tơ nấm phát triển đầy bình tam giác, tạo ra màu trắng mịn trong bình, cấy

sang môi trƣờng giá môi.

3.2.2.4. Chuẩn bị môi trƣờng nuôi trồng

- Mùn cƣa đƣợc sàn lọc loại bỏ rác và những mảnh có kích thƣớc lớn.

- Ngâm trong nƣớc vôi 5% trong 24 giờ

- Bổ sung cám gạo, bột bắp, cho vào túi ny lông hoặc bình thủy tinh.

- Hấp khử trùng trong 90 phút, 1atm, 121oC để 2 ngày sau hấp khử trùng tiếp nhƣ

lần thứ nhất.

26

- Cấy giống từ môi trƣờng giá môi sang.

- Ủ trong tối, khi nào thấy tơ phát triển đầy trắng , phủ kín bịt phôi, có những giọt

nƣớc li ti trên thành túi thì tiến hành cắt túi bằng dụng cụ đã khử trùng.

- Đem ra nhà nuôi trồng, tƣới và đón nấm

- Nấm sau khi hái, đƣợc cân tính trọng lƣợng tƣơi, sau đó đem sấy khô, bảo quản

trong tủ lạnh, để chuẩn bị cho phân tích amino acid.

- Tiếp tục tƣới và đón nấm.

- Sau khi hái nấm lần hai, nấm lƣợng nấm cũng đƣợc đem cân trọng lƣợng tƣơi,

cơ chất đem sấy khô, tính trọng lƣợng của chúng.

- Tính năng suất sản phẩm.

- Tất cả nấm hái đƣợc đem đo đƣờng kính để tính trung bình.

3.2.2.5. Tóm tắt quy trình [1, 2]

Tƣới đón nấm

Thu quả thể

Môi trƣờng hạt

- Lúa nấu (88 %)

- CaCO3 (2%)

- Cám gạo (10%)

Môi trƣờng giá môi

- Cọng mì (87 %)

- MgSO4 ( 2%)

- KH2PO4 (1 %)

- Cám gạo (10 %)

- Mùn cƣa (84 %)

- Cám gạo (10 %)

- Bột bắp (5,5 %)

- KH2PO4 (0,5 %)

Giá thể trồng

Giống nấm

- Khoai tây 200 g / lít

- Glucose 20 g / lít

- Agar 20 g / lít

Cấy sang

môi trƣờng

giá môi

ủ trong

tối

27

3.3.3. Phân tích amino acid

Mẫu nấm sau khi thu hoạch đƣợc đem phân tích thành phần amino acid.

Chúng tôi tiến hành phân tích 2 trên 4 mẫu: Pleurotus pulmonarius, Pleurotus flabellatus.

Quá trình phân tích thành phần amino acid trong 2 loại nấm trên đƣợc thực hiện theo

quy trình Thomas T. Andersen và cộng sự.

3.3.3.1.Thủy phân mẫu

- Cho 2 g mẫu đã đƣợc cắt nhỏ vào tube chịu nhiệt và làm khô.

- Thêm vào 10 ml dung dịch HCl 6N.

- Loại bỏ không khí bằng cách thổi khí trơ vào khoảng không của tube đựng

dung dịch mẫu.

- Thủy phân ở 152oC trong 1h.

- Lấy ra, để nguội, lọc qua giấy lọc.

- Cho vào lọ, dán nhãn và để trong tủ mát.

Với nhiệt độ cao và trong điều kiện acid có nồng độ cao (HCl 6N), các protein sê

đƣợc phân cắt thành những amino acid đơn (Hình 2.10).

3.3.3.2. Tạo dẫn xuất

Khi phân tích thành phần amino acid trên HPLC, mẫu phải đƣợc tạo dẫn xuất

với PITC để có thể phát hiện thông qua detector. Quá trình tạo dẫn xuất đƣợc thực

hiện nhƣ sau:

- Hút 2µl mẫu cho vào bình quả lê có đáy nhọn.

- Làm khô bằng hỗn hợp dung dịch ethanol, nƣớc và TEA với tỷ lệ tƣơng ứng

2:2:1. Quá trình này đƣợc thực hiện trong điều kiện có thổi khí trơ để loại bỏ những

acid còn thừa lại trong quá trình thủy phân cũng nhƣ giúp cho PITC có thể bắt với

từng amino acid dễ dàng hơn. Bởi vì dƣới tác động của phức hợp này đăc biệt là TEA

giúp cho những amino sẽ bị khử 1 proton, khi đó PITC sẽ gắn vào.

- Mẫu đƣợc tạo dẫn xuất với dung dịch ethanol: nƣớc: TEA: PITC = 7:1:1:1

khoảng 5 đến 10 phút ở trong tối. Khi đó PITC sẽ gắn vào đầu amin của các amino

acid (Hình 2.11), Theo Molnar-Perl, (1994), phản ứng gắn này rất bền, nếu bảo quản

trong điều kiện lạnh chúng sẽ ổn định ít nhất 6 tháng).

28

- Mẫu phân tích đƣợc đem đi thổi khô với khí trơ. Bƣớc quan trọng nhất trong

quá trình tạo dẫn xuất là loại bỏ những tác nhân sau khi dẫn xuất. Điều này đƣợc thực

hiện trong điều kiện chân không thổi khí trơ hoặc trích với heptane (Thomas

T. Andersen, 1995). Với điều kiện phòng thí nghiệm chúng tôi tiến hành bằng phƣơng

pháp thổi khô với khí trơ. Nếu PITC không đƣợc loại thải tốt thì nó sẽ làm hƣ cũng

nhƣ phá hủy cột HPLC.

- Mẫu đƣợc pha loãng trong 2 ml dung dịch pha loãng trong mẫu và đƣợc lọc qua

bộ phận lọc đƣờng kính 20 µm để chuẩn bị cho phân tích HPLC.

3.3.3.3. Phân tích HPLC

Quá trình thực hiện phân tách trên HPLC đƣợc thực hiện với:

Buffer A: sodium acetate và TEA, pH 6,8.

Buffer B: 60% acetonitile, nƣớc 40% (v/v).

Cột: Pico- Tag, 3.9 mm x 15 cm.

Detector: Ultra-violet (UV).

Tốc độ dòng: 1 ml / phút.

Bƣớc sóng: 254 nm.

Quá trình thực hiện:

- Hút 20 µl dung dịch chuẩn 17 amino acid, bơm và theo dõi.

- Lƣu lại các thông số cần thiết để tiến hành định tính cũng nhƣ

định lƣợng (thời gian lƣu, diện tích peak,…)

- Hút 20 µl mẫu, tiến hành tƣơng tự nhƣ đối với chuẩn.

3.3.3.4. Phân tích và tính toán kết quả

Sau khi bơm chuẩn, ta sẽ có những dữ liệu thu từ máy tính nhƣ là thời gian phát

hiện peak, diện tích của từng peak thể hiện trên sắc ký đồ. Các thông số này đƣợc lƣu

lại để tính hay để định lƣợng cho mẫu phân tích. Có rất nhiều cách để định lƣợng

amino acid đơn:

Dùng chuẩn với các nồng độ khác nhau, sau đó lập phƣơng trình hồi quy giữa

diện tích peak và nồng độ với hệ số tƣơng quan xác định. Từ diện tích peak của mẫu

đã biết qua quá trình chạy ta có thể tính nồng độ tƣơng ứng cho từng amino acid. Đây

là phƣơng pháp chính xác nhất để tính nồng độ các amino acid.

29

Chỉ bơm chuẩn 1 lần, ghi lại các diện tích peak thu đƣợc trên sắc ký đồ sau khi

phân tích kết thúc. Sau đó lặp tỷ lệ giữa diện tích peak và nồng độ của chuẩn và mẫu,

từ đó tính đƣợc nồng độ từng amino acid trong mẫu.

30

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Kết quả trồng nấm

4.1.1. Sự tăng trƣởng của hệ sợi trên các môi trƣờng

Sau khi chúng tôi thực hiện nuôi trồng theo quy trình ở mục 3.2.2.5, chúng tôi đạt

đƣợc một số kết quả trình bày ở bảng 4.1.

Nhận xét:

Tất cả các loài nấm đều đƣợc thực hiện đều đƣợc tiến hành trên các thiết bị

giống nhau tƣơng ứng với từng môi trƣờng (môi trƣờng lúa trong bình tam giác, môi

trƣờng cọng mì trên túi ny lông) khi chuyển sang môi trƣờng nuôi trồng, chúng tôi

thực hiện Pleurotus floridanus, Pleurotus abalonus trên túi ny lông, đồng thời với hai

loại Pleurotus flabellatus, Pleurotus pulmonarius chúng tôi thực hiện trên những lọ

bằng thủy tinh. Vì thế, chúng tôi chỉ so sánh trên hai môi trƣờng đầu với 4 dòng nấm

còn môi trƣờng nuôi trồng chúng tôi phân ra từng cặp để so sánh.

Với kết quả thu đƣợc (Bảng 4.1), chúng tôi nhận thấy rằng:

Thời gian tăng trƣởng trên môi trƣờng hạt của Pleurotus abalonus là chậm

nhất, kế đến là Pleurotus floridanus; Pleurotus flabellatus và Pleurotus pulmonarius

có thời gian tăng trƣởng tƣơng đƣơng nhau. Cả 3 dòng nấm Pleurotus floridanus;

Pleurotus flabellatus và Pleurotus pulmonarius đều có hệ sợi tơ trắng nhƣng Pleurotus

floridanus thì trắng hơn và hệ sợi không thƣa nhƣ hai dòng còn lại (Hình 4.1)

Khi cấy sang môi truờng giá môi, thì kết quả cũng giống nhƣ trên môi trƣờng

hạt, thời gian sinh trƣởng của Pleurotus abalonus vẫn là chậm nhất. Và trên môi

trƣờng này, thì nấm này vẫn khác so với các nấm còn lại là trên đầu mỗi sợi nấm có

màu đen, trong đó chứa các bào tử.( Hình 4.2 và Hình 4.3).

Bảng 4.1. Thời gian lan tơ đầy của các dòng nấm

Dòng nấm Môi trƣờng

lúa

Môi trƣờng

giá môi

Môi trƣờng nuôi

trồng

Pleurotus pulmonarius

Pleurotus flabellatus

Pleurotus floridanus

Pleurotus abalonus

15 ngày

15 ngày

18 ngày

30 ngày

17 ngày

18 ngày

20 ngày

40 ngày

25 ngày

27 ngày

30 ngày

40 ngày

31

4.1.2. Sự hình thành quả thể

Năng suất sản phẩm = Trọng lƣợng nấm tƣơi / Trọng lƣợng cơ chất khô

Về hình thái

Sau khi đem ra nhà trồng, tuới đón nấm, chúng tôi đã thu đƣợc hình thái

của 4 dòng nấm nhƣ sau

- Pleurotus floridanus (Hình 4.1) quả thể màu trắng, hơi phủ lông

mịn ở gốc. các quả thể mọc thành từng chùm. Khi đem quan sát duới kính hiển vi có

thể thấy đƣợc bào tử đảm (Hình 4.4)

- Pleurotus abalonus (Hình 4.2) quả thể có màu trắng đục, rất dày,

chắc, trên bề mặt có những vảy nhỏ. Cuống nấm cũng rất to. Đem quan sát dƣới kính

hiển vi quang học, chúng tôi cũng thấy đƣợc bào tử đảm tuơng đối lớn hơn so với

Pleurotus floridanus (Hình 4.5)

- Pleurotus pulmonarius (Hình 4.3) Phiến nấm mỏng, có màu

trắng hơi ngả xám, hơi xẻ thùy ở mặt ngoài của phiến

- Pleurotus flabellatus (Hình 4.4) phiến nấm có màu xám đậm,

cánh mỏng, rất giống với Pleurotus pulmonarius.

Nhƣ vậy , về hình thái 4 dòng nấn này hoàn toàn khác nhau. Pleurotus abalonus

có quả thể to và dày nhất, kế đến là Pleurotus floridanus; hai loài còn lại về mặt hình

thái tƣơng đối giống nhau, chỉ khác nhầumu sắc trên mặt phiến nấm.

Về năng suất sản phẩm: năng suất sản phẩm đƣợc tính bằng trọng lƣợng

nấm tƣơi/trọng ƣợng cơ chất khô. Theo bảng 4.2 thì năng suất của Pleurotus

floridanus cao nhất. Các dòng còn lại năng suất cũng tƣơng đối cao.

Bảng 4.2. Đặc tính quả thể của các loài nấm

Loài nấm Đƣờng kính trung

bình quả thể

Năng suất sản phẩm

(%)

Pleurotus floridanus

Pleurotus abalonus

Pleurotus pulmonarius

Pleurotus flabellatus.

8 cm

13 cm

11 cm

10 cm

70

62

60

56

32

Bào tử

đơn

Hình 4.1. Sinh trƣởng tơ nấm trên môi trƣờng lúa của

Pleurotus floridanus, Pleurotus flabellatus, Pleurotus flabellatus

Hình 4.3. Bào tử Pleurotus abalonus

quan sát trên hệ sợi tơ (bào tử đơn)

Hình 4.2. Pleurotus abalonus trên môi trƣờng

thân cây mì bổ sung MgSO4 ( 2%),

KH2PO4 (1 %), Cám gạo (10 %)

Thân cây mì

Bào tử đảm

Hình 4.4. Bào tử đảm quan sát trên quả

thể của nấm Pleurotus floridanus

Bào tử đảm

Hình 4 .5. Bào tử đảm quan sát trên quả

thể nấm Pleurotus abalonus

33

4.2. Kết quả phân tích amino acid

Sau khi tiến hành phân tích, trên 2 dòng nấm Pleurotus pulmonaius, Pleurotus

flabellatus trên HPLC, chúng tôi đã thu đƣợc thành phần của từng amino acid đƣợc

liệt kê trong bảng 4.3.

Hình 4.6. Quả thể nấm Pleurotus floridanus

trên túi ny lông chứa mùn cƣa có bổ sung:

Cám gạo (10 %) Bột bắp (5,5 %)

KH2PO4 (0,5 %)

Quả thể

Hình 4.7. Quả thể nấm Pleurotus abalonus

trên túi ny lông chứa mùn cƣa có bổ sung:

Cám gạo (10 %) Bột bắp (5,5 %)

KH2PO4 (0,5%) )

Quả thể

Hình 4.8 Quả thể nấm Pleurotus flabellatus

trên bình thủy tinh chứa mùn cƣa có bổ sung

Cám gạo (10 %) Bột bắp (5,5 %)

KH2PO4 (0,5%)

Quả thể

Hình 4.9 Quả thể nấm Pleurotus pulmonarius

trên bình thủy tinh chứa mùn cƣa có bổ sung:

Cám gạo (10 %) Bột bắp (5,5 %)

KH2PO4 (0,5%)

Quả thể

34

Hình 4.9. Sắc ký đồ chuẩn amin acid

ASP: Aspartic acid; GLU Glutamate; SER: Serine; GLY: Glycine ; HIS: Histidine ARG:

Arginine; THR: Threonine; ALA :Alanine; PRO: Proline; TYR: Tyrosine ; VAL: Valine ; MET:

Methionine; CYS: Cysteine; ILEU: Isoleucine; LEU: Leucine; PHE : Phenylalanine; LYS: lysine

Hình 4.10. Sắc ký đồ của mẫu nấm Pleurotus flabellatus

ASP: Aspartic acid; GLU Glucine; SER: Serine; GLY: Glycine ; HIS: Histidine ARG: Arginine;

THR: Threonine; ALA :Alanine; PRO: Proline; TYR: Tyrosine ; VAL: Valine ; MET: Methionine;

CYS: Cysteine; ILEU: Isoleucine; LEU: Leucine; PHE : Phenylalanine; LYS: lysine

35

Theo bảng này, thì cả trong 2 dòng đều chứa đầy đủ 17 amino acid.

Trong nấm Pleurotus pulmonaius hàm lƣợng Leu chiếm với tỷ lệ cao nhất,

trong khi đó thì các amino acid nhƣ Val, Asp, Cys, Met, Ileu, Lys, Glu chiếm với tỷ lệ

rất thấp, đặc biệt là Glu chiếm tỷ trọng thấp nhất trong 17 amino acid đƣợc phát hiện.

Với nấm Pleurotus flabellatus cũng tƣơng tự nhƣ Pleurotus pulmonaius , Leu chiếm

tỷ lệ cao nhất trong 17 amino acid; Val chiếm tỷ lệ thấp nhất.

Trong 17 amino acid này, chứa đến 7 trong 8 amino acid thiết yếu (đƣợc in

nghiêng trong bản) đối với ngƣời, ngoại trừ Tryp chƣa đƣợc xác định. Những amino

acid này cơ thể con ngƣời không thể tổng hợp đƣợc mà phải đƣợc cung cấp từ bên

ngoài. Các amino acid thiết yếu này chiếm đến 42 % trong tổng số amino acid đối với

Pleurotus pulmonaius và 44 % trong tổng số amino acid của nấm Pleurotus

flabellatus. Tỷ lệ này cao hơn so với nấm rơm (38,2 %) và nấm mỡ (38,4 %) [Nguyễn

Lân Dũng, 2002]. Khi đƣợc so sánh với thành phần amino acid với thực vật nhƣ bắp,

đậu nành thì thành phần amino acid của nấm bào ngƣ vẫn cao hơn.

Hình 4.11. Sắc ký đồ của mẫu nấm Pleurotus pulmonarius

ASP: Aspartic acid; GLU Gluatamate; SER: Serine; GLY: Glycine ; HIS: Histidine ARG:

Arginine; THR: Threonine; ALA :Alanine; PRO: Proline; TYR: Tyrosine ; VAL: Valine ;

MET: Methionine; CYS: Cysteine; ILEU: Isoleucine; LEU: Leucine; PHE : Phenylalanine;

LYS: lysine

36

Bảng 4. 3. Thành phần amino acid trên Pleurotus pulmonaius, Pleurotus flabellatus

Nhƣ vậy, nấm bào ngƣ có thể đƣợc xem nhƣ là một thực phẩm giàu dinh dƣỡng

chứa gần nhƣ đầy đủ các amino acid thiết yếu. Thành phần amin acid của nó cao hơn

hầu hết các loại rau quả.

Khi so sánh giữa 2 loài nấm, thành phần amino acid (aa) giữa chúng tƣơng

đƣơng nhau (đều chứa 17aa). Nhƣng khi xét riêng từng amino acid, thì giữa chúng có

sự khác biệt. Glu của nấm Pleurotus flabellatus cao gấp 8 lần so với Glu (chỉ phát hiện

ở dạng vết: 0,25 mg) của Pleurotus pulmonaius, và Ileu cũng cao hơn gấp 10 lần. Tất

cả các aa còn lại có sự khác biệt không lớn lắm.

Số thứ tự Amino acid Pleurotus pulmonarius

(mg/g)

Pleurotus flabellatus

(mg/g)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

Leucine

Glycine

Serine

Arginine

Alanine

Proline

Histidine

Tyrosine

Threonine

Phenylalanine

Valine

Asparagine

Cysteine

Methionine

Isoleucine

Lysine

Glutamate

21, 15

8, 92

7, 74

6, 49

5, 93

4, 50

4, 42

3, 75

3, 67

2, 21

1, 88

1, 88

1, 79

1, 77

1, 31

1, 15

0, 25

17, 15

11, 39

7, 85

5, 26

4, 95

3, 08

5, 48

6, 78

2, 68

0, 97

0, 91

1, 63

2, 59

4, 49

13, 19

0, 89

2, 04

37

PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1. Kết luận.

Đã trồng đƣợc 4 loại nấm bào ngƣ. Trong đó, có hai loài chƣa đƣợc trồng ở

Thành Phố Hồ Chí Minh: Pleurotus pulmonarius và Pleurotus flabellatus. Với năng

suất sản phẩm đạt đƣợc khoảng 55- 70%, trong điều kiện nhiệt độ 28

20C, ẩm độ 70%.

Bằng sắc ký lỏng cao áp HPLC, chúng tôi đã phát hiện và định lƣợng đƣợc

thành phần amino acid trên 2 loài nấm Pleurotus pulmonarius và Pleurotus flabellatus.

Hai loài này chứa đầy đủ 17 amino acid, trong đó leucine chiếm tỷ lệ cao nhất 21,15%

đối với Pleurotus pulmonarius và 17,15% đối với Pleurotus flabellatus. Trong nấm

Pleurotus pulmonarius thì Glutamate chiếm tỷ lệ thấp nhất, nhƣng đối với nấm

Pleurotus flabellatus (0,25%), Valine chiếm tỷ lệ thấp nhất (0,91%).

5.2. Đề nghị

Sau khi phân tích amino acid, nên tiến hành trồng trên các loại cơ chất khác

nhau sau đó phân tích tiếp amino acid để xem sự khác biệt do ảnh hƣởng của cơ chất .

38

PHẦN 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Nguyễn Lân Dũng, 2002. Công nghệ nuôi trồng nấm, tập 1. Nhà xuất bản nông

nghiệp Hà Nội. 200 trang.

2. Nguyễn Lân Dũng, 2002. Công nghệ nuôi trồng nấm, tập 2. Nhà xuất bản nông

nghiệp Hà Nội. 244 trang.

3. Lê Duy Thắng, 2001. Kỹ thuật trồng nấm, tập 1. Nhà xuất bản Nông Nghiệp.

4. Nguyễn Lê Chung Sơn, 2004, Sử dụng sinh khối cấy mai dương làm nguyên

liệu trồng nấm bào ngư (Pleurotus sajor- caju ) góp phần kiểm soát sự xâm lấn

của loài thực vật ngoại lai. Khóa luận tốt nghiệp cử nhân công nghệ sinh học,

Trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên Thành phố Hồ Chí Minh.

5. Huỳnh Hữu Tín, 2004, nghiên cứu sử dụng trấu làm nguyên liệu trồng nấm bào

ngư (Pleurotus florida). Khóa luận tốt nghiệp cử nhân sinh học, Trƣờng Đại

học Khoa Học Tự Nhiên Thành phố Hồ Chí Minh.

6. Hoàng Trâm Anh, Đinh Hoàng Anh Khoa, Lê Thúy Anh, Lê Duy Thắng, 2003.

Nghiên cứ kháng khuẩn của nấm bào ngư (Pleurotus sajor- caju). Tạp chí y

dƣợc học. tr 201-204.

7. Lâm Thị Nhạn, 2001. Cải tiến kỹ thuật định lượng aflatoxin trong thực phẩm.

Luận án thạc sĩ khoa học chuyên ngành hóa phân tích, Trƣờng Đại học Khoa

Học Tự Nhiên Thành phố Hồ Chí Minh. tr 16-19

8. Nam Phƣơng, 2005. Trồng thành công hai loài nấm bào ngư mới tại Việt Nam.

Báo khoa học phổ thông số 25: tr 14. Tòa soạn báo khoa học phổ thông, Thành

phố Hồ Chí Minh.

TIẾNG NƢỚC NGOÀI

9. Archer J.P. Martin 1952. The development of partition chromatography. Nobel

lecture, December

10. Alexander Efimov, 2005. HPLC introduction.

11. Hans Neurath. The Protein - Composition, Structure, Function. 2nd

edition.

Volume 1. Academic Press, New York and London p. 2-39.

12. Royer Y. Stainer, Michael Doudoroff, and Edward A. Adelberg. The

Microbial World. Prentice-Hall, Inc. p.88-90.

39

13. Thomas D. Brock. Biology of microorganism. Pretice-Hall, Inc. p.684-681.

14. Arthur T. Henrici, M.D. A handbook for students of Bacteriology. Molds,

Yeast, And Actinomycetes. John Wiley & Sons, Inc, New York. p.7-9.

15. Zakia Bano, K.S. Srinivasan, and H.C. Srivastava, 1963. Amino acid

composition of the Protein from a Mushroom (Pleurotus sp.). Appl. Microbiol.

11. p.184-187

16. Bernard Wathelet, 1999. Nutritional analyses for proteins and amino acids

in beans (Phaseolus sp.). Biotechnol. Agron. Soc. Environ, p 197–200

17. <www.nihs.go.jp/dbcb/amino.pdf

18. <www.dekker.com/sdek/81410433-13447283/ abstract~content>

19. <www.mriokc001.ouhsc.edu/amino.htm>

20. <www.biotech.iastate.edu/facilities/protein/aaa.html ->

21. <www.abrf.org/ABRFNews/1995/ December1995/dec95aaawkshp.html>

22. <http://www.hort.purdue.edu/newcrop/proceeding1996/v3-464.htm>

23. <http://www2.bioch.ox.ac.uk/immunoch/PCFWebsite/Acideffects.htm>

24. http://lims.uni-duisburg.de/Lehre/Material/PrAnalytik/TLC.pdf.

25. http://www.answers.com/main/ntquery/

26. <http://www.agroviet.gov.vn/stories/rd.asp>

40

PHỤ LỤC 1

KẾT QUẢ THU HOẠCH CÁC NẤM BÀO NGƢ

Nấm Pleurotus flabellatus

Trọng lƣợng cơ chất khô (g) 75 85 83 75 85 79

Trọng lƣợng nấm tƣơi (g) 44 45 50 43,5 42 45,6

Nấm Pleurotus floridanus

Trọng lƣợng cơ chất khô (g) 341 370 360 380 350

Trọng lƣợng nấm tƣơi (g) 250,3 260 255 254 240

Nấm pleurotus pulmonarius

Trọng lƣợng cơ chất khô (g) 80 82 80 79 75

Trọng lƣợng nấm tƣơi (g) 43,7 49,2 50,4 42,5 51,8

Nấm Pleurotus abalonus

Trọng lƣợng cơ chất khô (g) 350 364 352 380 370

Trọng lƣợng nấm tƣơi (g) 220,9 230,5 223,4 230 222

PHỤ LỤC 2

41

Bảng. Thành phần amino acid trên một số thực phẩm, nấm

I: Nấm rơm (volvariella volvacea)

II: Nấm mỡ (Agaricus bisropus)

III: Bắp (maize)

IV: Nấm bào ngƣ Pleurotus pulmonarius

V: Nấm bào ngƣ Pleurotus flabellatus

KPH: Không phát hiện

-

Số thứ

tự

Amino acid I II III IV V

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

Leucine

Glycine

Serine

Arginine

Alanine

Proline

Histidine

Tyrosine

Threonine

Phenylalanine

Valine

Asparagine

Cysteine

Methionine

Isoleucine

Lysine

Glutamate

5,5

4,5

4,3

5.3

6,3

5,5

4,1

KPH

4,7

4,1

6,5

5,3

Vết

1,6

4,2

9,8

17,6

7,2

5,1

3,2

5,5

9,6

6,1

2,2

2,2

4,2

4,4

5,3

10,7

Vết

Vết

4,3

10,0

17,2

0,98

0,46

0,40

0,52

0,69

0,97

0,49

0,45

0,34

0,39

0,43

0,78

0,18

0,18

0,30

0,45

0,79

21,15

8,92

7,74

6,49

5,93

4,50

4,42

3,75

3,67

2,21

1,88

1,88

1,79

1,77

1,31

1,15

0,25

17,15

11,39

7,85

5,26

4,95

3,08

5,48

6,78

2,68

0,97

0,91

1,63

2,59

4,49

13,19

0,89

2,04