Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng Oxy hóa của loài Địa y Dirinaria Applanata (FÉE) D. D. Awasthi

8/17/2019 Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng Oxy hóa của loài Địa y Dirinaria Applanata (FÉE) D. D. Awasthi

http://slidepdf.com/reader/full/khao-sat-thanh-phan-hoa-hoc-va-hoat-tinh-khang-oxy-hoa-cua 1/57

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠKHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BỘ MÔN HÓA

----- -----

LÂM VĨNH PHÚ

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀHOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA LOÀI ĐỊA Y DIRINARIA APPLANATA (FÉE) D. D. AWASTHI

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CHUYÊN NGÀNH: HÓA DƯỢC

Cần Thơ, 2014

WW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COMóng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú



TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠKHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BỘ MÔN HÓA

----- -----

LÂM VĨNH PHÚ

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ

HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA LOÀI ĐỊA Y DIRINARIA APPLANATA (FÉE) D. D. AWASTHI

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CHUYÊN NGÀNH: HÓA DƯỢC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

TS. NGUYỄN TRỌNG TUÂN

Cần Thơ, 2014





Luận văn tốt nghiệp

i

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt những năm đại học, em vô cùng biết ơn quý Thầy, Cô trườngĐại học Cần Thơ nói chung và Khoa Khoa Học Tự Nhiên nói riêng đã hếtlòng giảng dạy, truyền đạt cho em những kiến thức nghề nghiệp, nền tảng

cuộc sống vô giá, là hành trang để em vững bước trên con đường tương lai.Học kỳ cuối, em thực sự đã tiếp thu được thêm những kiến thức, kinh nghiệmthực tiễn vô cùng bổ ích từ những khó khăn vấp phải trong quá trình thực hiệnluận văn tốt nghiệp, những vấn đề này bổ sung và củng cố cho lý thuyết em đãđược học một cách trọn vẹn nhất.

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS. Nguyễn TrọngTuân đã tin tưởng giao đề tài cho em, cùng ThS. Nguyễn Thế Duy không ngạikhó khăn, bỏ thời gian và công sức tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em từ khi bắtđầu đến khi hoàn thiện luận văn. Nhờ sự chỉ bảo và những kinh nghiệm họchỏi từ các Thầy, em đã hoàn thành luận văn của mình.

Em cũng xin cảm ơn những người bạn ở lớp Hóa Dược K37 đã đồnghành và trải qua nhiều khó khăn cùng em trong suốt quãng đời sinh viên, cácanh, chị và các bạn cùng thực hiện luận văn ở phòng thí nghiệm Hóa Sinh 1 đã

hỗ trợ, giúp đỡ và mang lại nhiều niềm vui trong suốt thời gian cùng thực hiệnluận văn.

Cuối cùng, không thể dùng từ ngữ nào để thể hiện lòng biết ơn vô bờ củacon đối với gia đình, cha mẹ, người đã sinh thành, nuôi nấng, tạo mọi điềukiện tốt nhất để con được học hành đến nơi đến chốn, tiếp cận tri thức khoahọc, trở thành người có ích cho xã hội. Cảm ơn cha mẹ đã luôn bên con, là chỗdựa cho con về mọi mặt để con bước tiếp đến tương lai tốt đẹp.

Xin chân thành cảm ơn!






ii

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

Bộ Môn Hóa Học ------------

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1. Cán bộ hướng dẫn: TS. Nguyễn Trọng Tuân.

2. Đề tài: “Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa củaloài địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi”.

3. Sinh viên thực hiện: Lâm Vĩnh Phú MSSV: 2112069 Lớp: Hóa Dược – Khóa: 37.

4. Nội dung nhận xét:

a) Nhận xét về hình thức của LVTN:

..............................................................................................................................

..............................................................................................................................

b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

..............................................................................................................................

..............................................................................................................................

Những vấn đề còn hạn chế:............................................................................................................................................................................................................................................................

c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dungchính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

..............................................................................................................................

..............................................................................................................................

d) Kết luận, đề nghị và điểm:

............................................................................................................................................................................................................................................................

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2014

Cán bộ hướng dẫn

TS. Nguyễn Trọng Tuân






iii




NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

1. Cán bộ phản biện: ……………………………………………………………

2. Đề tài: “Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa củaloài địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi”.

3. Sinh viên thực hiện: Lâm Vĩnh Phú MSSV: 2112069 Lớp: Hóa Dược – Khóa: 37

4. Nội dung nhận xét:

a) Nhận xét về hình thức của LVTN:

..............................................................................................................................

..............................................................................................................................

b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

..............................................................................................................................

..............................................................................................................................

Những vấn đề còn hạn chế:............................................................................................................................................................................................................................................................

c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dungchính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

..............................................................................................................................

..............................................................................................................................

d) Kết luận, đề nghị và điểm:

............................................................................................................................................................................................................................................................

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2014

Cán bộ phản biện






iv

TÓM TẮT

Luận văn này được thực hiện với mục đích khảo sát thành phần hóa họctrong phân đoạn cao chiết petroleum ether từ loài địa y Dirinaria applanata(Fée) D. D. Awasthi, được thu mẫu ngay ở khuôn viên Đại học Cần Thơ. Tiếptheo là đánh giá khả năng kháng oxy hóa của cao tổng methanol, các phânđoạn cao với độ phân cực khác nhau như cao petroleum ether, cao ethylacetate và cao nước cùng các chất tinh khiết phân lập được từ loài địa y này.

Từ phân đoạn cao petroleum ether đã phân lập được 1 hợp chất tinh khiếtlà methyl haematommate (HP1). Cấu trúc của hợp chất này được xác định

bằng các phương pháp phổ hiện đại như 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC và đối chiếu với các tài liệu đã công bố.

Hoạt tính kháng oxy hóa của các loại cao chiết từ địa y Dirinariaapplanata (Fée) D. D. Awasthi được đánh giá bằng phương pháp sử dụng gốctự do DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) qua giá trị IC50.

Từ khóa: Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi, methylhaematommate, DPPH, IC50.






v

ABSTRACT

The aim of this thesis is to investigate chemical composition of petroleum ether extract of the lichen Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi,which is collected in Can Tho Universit y’s campus. Next, evaluate antioxidantability of methanol total extract; three different polarity extracts: petroleumether extract, ethyl acetate extract, water extract and pure compounds wereisolated from this lichen.

From petroleum ether extract, one pure compound were isolated: methylhaematommate (HP1). Its structures were determined by modernspectroscopic method: 1H-NMR, 13C-NMR , DEPT, HMBC , which werecompared with some of previously published data.

Antioxidant activitity of extracts of the lichen Dirinaria applanata (Fée)D. D. Awasthi were evaluated by DPPH free radical method (2,2-diphenyl-1-

picrylhydrazyl) through IC50 value.

Keywords: Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi, methylhaematommate, DPPH, IC50.






vi




ĐỀ TÀI

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ

HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA LOÀI ĐỊA Y DIRINARIA APPLANATA (FÉE) D. D. AWASTHI

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quảnghiên cứu của tôi, các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ

luận văn cùng cấp nào khác và đã được chỉnh sửa hoàn chỉnh theo ý kiến vàgóp ý của các Thầy, Cô phản biện và hội đồng chấm bảo vệ luận văn.

Cần Thơ, ngày …. tháng .… năm ……..

Lâm Vĩnh Phú

Luận văn tốt nghiệp đại học

Chuyên ngành: Cử Nhân Hóa Dược

Đã bảo vệ và được duyệt

Hiệu trưởng……………………………….....

Trưởng khoa………………………………....

Trưởng chuyên ngành Cán bộ hướng dẫn

……………………... TS. Nguyễn Trọng Tuân






vii

MỤC LỤC

Lời cảm ơn ……………………………………………………………………..i Nhận xét đánh giá của cán bộ hướng dẫn ……………………………………..ii

Nhận xét đánh giá của cán bộ phản biện ……………………………………..iiiTóm tắt ……………………………………………………………………….ivAbstract ………………………………………………………………………..vTrang cam kết kết quả ………………………………………………………..viMục lục ………………………………………………………………………vii

Danh sách bảng ……………………………………………………………….ixDanh sách hình ……………………………………………………………….x

Danh mục từ viết tắt ..………………………………………………………..xi

Chương 1: Giới thiệu ………………………………………………………..1 1.1 Đặt vấn đề ………………………………………………………………11.2 Mục tiêu nghiên cứu ……………………………………………………21.3 Nội dung nghiên cứu …..……………………………………………….2

Chương 2: Tổng quan tài liệu ………………………………………………3 2.1 Tổng quan về địa y .……………………………………………………3

2.1.1 Tên gọi ……………………………………………………………32.1.2 Đặc điểm sinh học …………………………………………………3

2.1.3 Công dụng …………………………………………………………42.1.4 Thành phần hóa học ………………………………………………5

2.2 Đại cương về địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi …………82.2.1 Tên gọi …………………………………………………………….92.2.2 Phân loại thực vật học …………………………………………….9

2.2.3 Đặc điểm hình thái thực vật ……………………………………….92.2.4 Phân bố …………………………………………………………..10

2.2.5 Thành ph ần hóa học ……………………………………………10

2.3 Cơ sở lý thuyết của một số phương pháp thực nghiệm ……………….102.3.1 Kỹ thuật chiết ngâm dầm (chiết rắn - lỏng) ………………………102.3.2 Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng ……………………………………….. 112.3.3 Phương pháp sắc ký cột (sắc ký cột hở) ………………………….11

2.3.3.1 Chọn chất hấp phụ và nhồi cột ………………………………112.3.3.2 Nạp mẫu chất cần phân tích vào cột ………………………...12

2.3.3.3 Chọn dung môi và giải ly cột ………………………………..122.3.3.4 Theo dõi quá trình giải ly cột ……………………………….13

2.3.4 Sắc ký lớp mỏng …………………………………………………132.3.4.1 Các kỹ thuật sắc ký lớp mỏng ………………………………14






viii

2.3.4.2 Cách hiện hình vết sau khi giải ly bản mỏng ………………..152.3.5 Kh ảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp thửnghiệm sử dụng gốc tự do DPPH ………………………………………16

2.3.5.1 Gi ới thiệu về gốc tự do ……………………………………..16

2.3.5.2 Gi ới thiệu về gốc tự do DPPH và nguyên tắc của thử nghiệm 162.3.5.3 Bi ểu diễn kết quả thử nghiệm DPPH ……………………….16

Chương 3: Phương pháp nghiên cứu ……………………………………..183.1 Địa điểm, thời gian và phương tiện …………………………………...18

3.1.1 Địa điểm và thời gian …………………………………………….183.1.2 Dụng cụ ………………………………………………………….183.1.3 Hóa chất …………………………………………………………18

3.2 Phương pháp nghiên cứu ……………………………………………..18

3.2.1 Phương pháp chiết tách hợp chất tự nhiên từ thực vật ...…………183.2.2 Phương pháp phân lập và tinh chế các hợp chất từ cao chiết ……18

3.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của hợp chất tinh khiết phân lập được ………………………………………………………….19

3.3 Thực nghiệm điều chế các loại cao ...…………………………………193.3.1 Thu hái và xử lí mẫu địa y……………………………………….. 193.3.2 Điều chế cao methanol tổng ……………………………………..193.3.3 Điều chế cao petroleum ether ……………………………………19

3.3.4 Điều chế cao ethyl acetate ……………………………………….203.3.5 Đi ều chế cao nước ……………………………………………….20

3.4 Khảo sát và phân tích cao petroleum ether ……………………………213.4.1 Sắc ký cột cao petroleum ether …………………………………..213.4.2 Khảo sát phân đoạn III …………………………………………...22

3.5 Kh ảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết địa y cùng hợp chất

HP1 bằng phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH ……………………….233.5.1 Cách ti ến hành tổng quát …………………………………………233.5.2 Chuẩn bị dung dịch DPPH ………………………………………233.5.3 Mẫu đối chứng dương ascorbic acid (vitamin C) ………………..243.5.4 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao tổng methanol .………24

3.5.5 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao PE và cao nước ...……253.5.6 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao EtOAc… …………….26

3.5.7 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất HP1 ……………26

Chương 4: Kết quả vả thảo luận ………………………………………….274.1 Kết quả khảo sát thành phần hóa học địa y Dirinaria applanata (Fée) D.

D. Awasthi …………………………………………………………………..274.1.1 Bi ện luận cấu trúc hóa học của hợp chất HP1 ……………………27






ix

4.1.1.1 Phân tích phổ 1H-NMR c ủa HP1 ……………………………274.1.1.2 Phân tích phổ 13C-NMR và DEPT c ủa HP1…………….284.1.1.3 Phân tích phổ HMBC ………………………………………28

4.1.2 Kết luận ….……………………………………………………….29

4.2 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết địa y và HP1 đánh giá bằng phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH ………………………………………30

4.2.1 Hoạt tính kháng oxy hóa của ascorbic acid (vitamin C) ………….304.2.2 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao tổng …………………………..31

4.2.3 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao petroleum ether ……………….324.2.4 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao ethyl acetate …………………..33

4.2.5 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao nước ………………………….344.2.6 Hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất HP1: methyl

haematommate ………………………………………………………………35Chương 5: Kết luận và kiến nghị ………………………………………….36

5.1 Kết luận ………………………………………………………………365.2 Ki ến nghị ……………………………………………………………..36

Tài liệu tham khảo …………………………………………………………37Phụ lục ………………………………………………………………………39

Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR của hợpchất HP1 ………………………………39Phụ lục 2: Phổ DEPT của hợp chất HP1 ...……………………………….40Phụ lục 3: Phổ 13C-NMR của hợpchất HP1 ………………………………41Phụ lục 4: Phổ HMBC của hợp chất HP1 ...………………………………42






x

DANH SÁCH BẢNG

B ảng 2.1: Một vài thuốc thử hiện hình trong sắc ký lớp mỏng ………………14B ảng 3.1: Tổng hợp kết quả sắc ký cột cao petroleum ether…………………22

B ảng 3.2: Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của ascorbic acid… 24B ảng 3.3: Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của cao tổng………25B ảng 3.4: Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của cao PE và cao

nước …………………………………………………………………………25B ảng 3.5 : Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của cao EtOAc …...26B ảng 3.6 : Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của HP1 .………….26B ảng 4.1: Số liệu phổ1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) và 13C-NMR (CDCl3, 125MHz) của hợp chất HP1 ……………………………………………………..29

B ảng 4.2: So sánh số liệu phổ

1

H-NMR và

13

C-NMR c ủa hợp chất HP1 vàmethyl haematommate trong tài liệu [ 17] ……………………………………30B ảng 4.3: Phần trăm ức chế của ascorbic acid theo nồng độ trong từng mẫuthử …………………………………………………………………………...30B ảng 4.4: Phần trăm ức chế của cao tổng theo nồng độ trong từng mẫu thử ...31

B ảng 4.5 : Phần trăm ức chế của cao PE theo nồng độ trong từng mẫu thử ….32B ảng 4.6 : Phần trăm ức chế của cao EtOAc theo nồng độ trong từng mẫu

thử ……………………………………………………………………………33B ảng 4.7: Phần trăm ức chế của cao nước theo nồng độ trong từng mẫu thử ..34

B ảng 4.8 : Phần trăm ức chế của hợp chất HP1 theo nồng độ trong từng mẫuthử ……………………………………………………………………………35






xi

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1: Các hình thái phát triển của địa y …………………………………..3Hình 2.2: Địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi ……………………8

Hình 2.3: Cấu tạo địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi ……………9Hình 2.4: Minh họa cách tính R f …………………………………………….14Hình 2.5: Ph ản ứng trung hòa gốc tự do DPPH ..……………………………16

Hình 3.1: Quy trình điều chế các loại cao chiết ……………………………..20Hình 3.2: SKLM cao petroleum ether ………………………………………21Hình 3.3: SKLM khảo sát hợp chất HP1 …………………………………….23Hình 4.1: Tinh thể hợp chất tinh khiết HP1 …………………………………27Hình 4.2: Bi ểu đồ biểu diễn khả năng ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độ

ascorbic acid …………………………………………………………………31Hình 4.3: Bi ểu đồ biểu diễn khả năng ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độcao tổng ……………………………………………………………………..32Hình 4.4: Bi ểu đồ biểu diễn khả năng ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độcao PE ……………………………………………………………………….32

Hình 4.5 : Bi ểu đồ biểu diễn khả năng ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độcao EtOAc ..…………………………………………………………………33

Hình 4.6 : Bi ểu đồ biểu diễn khả năng ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độcao nước ……………………………………………………………………..34

Hình 4.7: Bi ểu đồ biểu diễn khả năng ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độHP1 ………………………………………………………………………….35






xii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

13C-NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance

DEPT Distortionless Enhancement by Polarization TransferHMBC Heteronuclear Multiple-Bond CorrelationR f Retention factor

DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazylIC50 Half maximal Inhibitory ConcentrationSKLM Sắc ký lớp mỏngPE Petroleum etherEtOAc Ethyl acetate

Dd Dung dịchs SingletC Carbon





Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG1: GI ỚI THIỆU

1

CHƯƠNG 1

GIỚI THIỆU

1.1

Đặt vấn đề Ngày nay, trên thế giới xuất hiện nhiều loại bệnh mới và nguy hiểm chưa

tìm được thuốc đặc trị như HIV, ung thư, tiểu đường, xơ vữa động mạch... với

số bệnh nhân ngày càng gia tăng đã thôi thúc các nhà khoa học không ngừngtìm kiếm, tổng hợp các loại thuốc mới trị liệu tốt hơn. Tuy nhiên, thuốc tổnghợp ít nhiều đều gây nên những tác dụng phụ không mong muốn, do vậy,những năm gần đây xu hướng sử dụng các hợp chất tự nhiên (dạng thô, caochiết hay hợp chất chiết xuất tinh khiết) có hoạt tính sinh học cao để điều trị

bệnh được các nhà khoa học đi sâu nghiên cứu và đã mang lại nhiều thànhquả. Điển hình như curcumin (từ nghệ), taxol (từ thông đỏ), viblastin,vincristin (từ cây dừa cạn) trị ung thư; quinin (từ cây canhkina) và artemisinin(từ cây thanh hao hoa vàng) điều trị sốt rét...

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên thiên nhiên đadạng, nguồn động thực vật phong phú dồi dào, vì vậy mà từ ngàn xưa nhândân đã biết sử dụng các phương thuốc từ thực vật để chữa nhiều bệnh như sốt,tiêu chảy, đau nhức, cảm ho... Đây là một lợi thế lớn để nghiên cứu hóa học

hợp chất thiên nhiên, tìm ra các loại dược liệu mới, trong đó địa y là loài thựcvật có tiềm năng. Đặc biệt, nước ta có nguồn địa y phong phú và dồi dào với275 loài , trong đó có 122 loài lần đầu tiên được báo cáo ở Việt Nam [ 1] .

Địa y là loài thực vật cộng sinh giữa tảo và nấm, có thể sống ở nhiều nơitrên đất, đá, thân cây và trong nhiều điều kiện môi trường khắc nghiệt, khôhạn hay giá lạnh, từ vùng thấp đến núi cao, cho thấy chúng có tính chống chịutốt. Các công trình khảo sát thành phần hóa học của địa y trên thế giới chothấy nó chứa một lượng lớn chất biến dưỡng sơ cấp (protein, amino acid,

polyol, carotenoid, polysaccharide và vitamin) và thứ cấp (depside, depsidone,dibenzofuran, steroid, terpene…, trong đó một số chất đặc thù chỉ có ở địa y)[ 2,3] . Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các chất từ địa y cũng cho thấykhả năng kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm, kháng oxy hóa, kháng ungthư, kháng virus HIV... [ 3,4] .

Đã có rất nhiều nghiên cứu về mặt hóa học, chuyển hóa và hoạt tính sinhhọc của địa y trên thế giới bắt đầu từ thế kỉ XIX. Trong khi đó, ở nước ta vớisự đa dạng về chủng loài nhưng mới chỉ có những nghiên cứu về mặt thực vật

học cùng rất ít nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của địa y. Vì





Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG1: GI ỚI THIỆU

2

vậy, đề tài “Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa củaloài địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi” được chọn là cần thiếtvà có ý nghĩa nhằm góp phần tìm hiểu thành phần hóa học, phát hiện các hoạttính sinh học đáng quý của địa y và đưa địa y vào sử dụng như một dược liệu

trong việc chữa bệnh.

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Trong phạm vi đề tài luận văn “Khảo sát thành phần hóa học và hoạt

tính kháng oxy hóa của loài địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D.Awasthi” gồm các mục tiêu sau:

- Tách chiết, phân lập các hợp chất tinh khiết từ cao petroleum ether củaloài địa y này.

- Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được.- Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của các phân đoạn cao chiết và các

hợp chất tinh khiết phân lập được bằng phương pháp sử dụng gốc tự doDPPH.

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Tìm hiểu, thu thập tài liệu về địa y nói chung và về loài địa y Dirinariaapplanata (Fée) D. D. Awasthi.

-

Thu mẫu địa y tươi, phơi khô, nghiền thành bột mịn.- Tiến hành chiết kiệt bột địa y với methanol thu cao tổng.- Tiến hành chiết lỏng-lỏng cao tổng với từng loại dung môi có độ phân

cực tăng dần: petroleum ether, ethyl acetate để thu được các phân đoạn cao cótính phân cực khác nhau.

- Sắc ký cột kết hợp sắc ký lớp mỏng để khảo sát, phân lập hợp chất tinhkhiết từ cao petroleum ether.

- Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được.- Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của các loại cao và các chất tinh khiết

bằng phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH.- Tổng hợp, đánh giá kết quả và viết báo cáo.





Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG2: T ỔNG QUAN T ÀI LIỆU

3

CHƯƠNG 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về địa y

2.1.1 Tên gọi

Tên khoa học: Lichene.Tên tiếng Việt: Địa y.Tên tiếng Anh: Lichen.

2.1.2 Đặc điểm sinh học

Địa y là nhóm thực vật bậc thấp hình thành do sự cộng sinh giữa hai

thành phần là nấm và một hay nhiều loài sinh vật có khả năng quang hợp,thường là tảo lục hoặc khuẩn lam. Thành phần quang hợp là tảo tạo ra chấthữu cơ cho chính nó và cho nấm, còn nấm có nhiệm vụ bảo vệ tảo khỏi các tácnhân vật lý có hại và cung cấp muối khoáng, nước từ môi trường cho tảo. Nhờsự cộng sinh này, địa y có thể thích ứng ở nhiều điều kiện môi trường khắcnghiệt như núi cao, vùng băng giá hay nhiệt đới và sống trên nhiều thể nền

khác nhau như đất, đá, lá cây, vỏ cây, kim loại… Địa y được phân chia thành ba dạng hình thái phát triển: dạng khảm (crustose) dính chặt vào giá thể, dạng

phiến (foliose) với nhiều thùy như lá cây và dạng sợi (fruticose) nhiều sợi như bụi cây [ 5] .

Địa y sinh trưởng chậm và sống lâu năm. Phần lớn các loài địa y vùng ônđới, cận nhiệt và nhiệt đới tăng trưởng vài milimét tới vài centimét trong mộtnăm và phát triển mạnh nhất ở vùng khí hậu ẩm ven biển và rừng mưa B ắcMỹ. Ở vùng rất lạnh và rất nóng, địa y phải mất hàng thế kỷ để đạt được kíchthước lớn. Địa y rất nhạy cảm với sự ô nhiễm không khí như chất oxy hóa,

SO2, HF…, đã xảy ra hiện tượng địa y biến mất ở các đô thị lớn; vì vậy mà nó

Địa y dạng khảm Địa y dạng phiến Địa y dạng sợi

Hình 2.1: Các hình thái phát triển của địa y.






4

phản ánh một phần mức độ ô nhiễm không khí. Nguyên nhân là do nguồn dinhdưỡng của địa y chủ yếu từ môi trường xung quanh, chẳng hạn như nguồnnước của địa y là từ sương có thể mang theo nhiều chất ô nhiễm và địa ykhông thể thải độc qua quá trình rụng lá như các loài thực vật bậc cao cũng

như không có lớp biểu bì nên các chất ô nhiễm có thể xâm nhập vào địa y [ 6] .

Mỗi loài địa y có màu sắc đặc trưng nhưng cũng khó phân biệt giữa mộtsố loài địa y với nhau: cam, vàng chanh tới lục nhạt, xanh vàng nhạt, xámtrắng, xám xanh, xám đen, nâu, đen… Màu sắc cũng là một yếu tố để nhậndạng loài địa y [ 7] .

2.1.3 Công dụng

Trên thế giới, địa y đã được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau, là

dược liệu trong các bài thuốc dân gian, nguyên liệu làm thuốc nhuộm và nướchoa. Về mặt dược liệu, Cetraria islandica (rêu Island) dùng trị bệnh phổi vàviêm chảy, thuốc từ nó vẫn còn được bán ở châu Âu. Peltigera canina dùng đểăn ở Ấn Độ là phương thuốc trị bệnh gan và chứa hàm lượng cao amino acidmethionine là tiềm năng cho việc trị bệnh. Về công nghiệp sản xuất nước hoa,đây là một ứng dụng quan trọng của địa y: Evernia prunastri (rêu oak) và

Pseudevernia furfuracea (rêu cây) được sử dụng ở Pháp với lượng 8000 -

10000 tấn mỗi năm. Về công nghiệp nhuộm, ngày nay địa y ít được sử dụng,

chỉ còn Parmelia omphalodes được dùng ở Scotland [ 8] .Một số hợp chất từ địa y đã được chứng minh có các hoạt tính sinh học

như [ 3] :- Kháng sinh: depsides, depsidones và usnic acid chống lại vi khuẩn gam

dương.

- Kháng ung thư và kháng đột biến gen: (–)-usnic acid, protolichesterinicvà nephrosteranic acid, polyporic và dẫn xuất, physodalic acid, các glucan và

các dẫn xuất lichenin.

- Kháng HIV: hợp chất muối sulfate của acetyl glucan từ loài địa yUmbilicaria esculenta (Miyoshi) Mink. ngăn chặn sự phá hoại tế bào của virusHIV trong ống nghiệm.

- Ngoài ra, một số hợp chất còn có tác dụng trợ tim (pulvinic acid

dilactone), giảm đau và hạ sốt (usnic và diffractaic acid), gây dị ứng(atranorin, barbatic, diffractaic…), ức chế enzyme (lecanoric acid, (-)-usnic

acid…) và ức chế sự phát triển của thực vật (psoromic acid, virensic acid, (-)-usnic acid…).






5

2.1.4 Thành phần hóa học

Địa y là một trong những nguồn cung cấp các hợp chất tự nhiên có hoạt

tính sinh học quan trọng, nó đã thu hút các nhà hóa học ngay từ giai đoạn đầucủa hóa học hữu cơ. Các khía cạnh hóa học của hợp chất từ địa y đã được

công bố bởi Zopf vào đầu thế kỷ XIX và cấu trúc của hầu hết các hợp chất nàyđã được biết đến bởi nghiên cứu của Asahina và Shibata vào đầu thế kỷ XX.

G ần đây, hơn 800 h ợp chất từ địa y được phân lập và chia thành nhóm:aliphatic acid, γ-, δ- và macrocyclic lactone, hợp chất thơm đơn vòng,

quinone, chromone, xanthone, dibenzofuran, depside, depsidone, depsone,terpenoid, steroid, carotenoid và diphenyl ether. Trong đó, depside, depsidone

và dibenzofuran ch ỉ có ở địa y [ 9 ] . Các chất chuyển hóa thứ cấp hiện diện vớilượng lớn trong địa y và thường dựa vào chúng để phân loại, do địa y khó

phân biệt về mặt hình thái học [ 3] . Một số nhóm hợp chất chính trong địa y:

2.1.4.1 Acid béo

Ngoài các acid béo thường thấy trong thực vật như caproic acid, caprylicacid, linoleic acid… địa y còn tích lũy các acid béo với mạch nhánh có 17, 19

hoặc 20 carbon. Các acid béo không bão hòa như arachidonic acid cũng hiệndiện trong địa y. Các monobasic acid đều khởi nguồn từ protolichesterinic acid

(1), một α-methylene butyrolactone. Protolichesterinic acid không bền, dễ

dàng sắp xếp lại tạo thành dạng tautomeric, gọi là lichesterinic acid (2) [ 10] .

2.1.4.2 Dẫn xuất pulvinic acid

Nhiều địa y chứa sắc tố vàng hoặc da cam cấu tạo bởi hai đơn vị phenylpropane, mà các đơn vị C3 của những acid từ địa y này là isopropyl hơnlà propyl. Vulpinic acid (4), một methyl ester của pulvinic acid (3) cho thấytác dụng kháng khuẩn chống lại sinh vật hiếu khí và kị khí [ 10] .

O

HOOC

O

1

O O

HOOC

2

CO2R

O

OH

O

3 R = H

4 R = Me






6

OH

OHC

HO Me

O

O

Me

Me

CO2Me

OH

OMe

Me

MeO Me

O

O

Me

Me

CO2H

OH

Ngoài ra còn có calycin (5), p ulvinamide (6) ,… [ 11] .

2.1.4.3 Dẫn xuất hydroxybenzoic acid

Ester của 4-hydroxybenzoic acid như methylparaben (7) được dùng làm

chất bảo quản trong dược phẩm, nhanh chóng bị thủy phân trong cơ thể thànhacid và bị đào thải nên độc tính thấp. Do đó, các hợp chất đơn vòng phenol từđịa y như methyl orsellinate (8 ), methyl β-orsellinate (9 ) và methylhematommate (10) thể hiện hoạt tính kháng sinh [ 10] .

2.1.4.4 Depside

Depside là nhóm hợp chất tạo thành do sự ngưng tụ của hai hoặc nhiềuhydroxybenzoic acid, trong đó nhóm carboxyl của phân tử thứ nhất ester hóavới nhóm hydroxyl phenol của phân tử thứ hai. Có hai loại depside, loại chứa

nhóm chức orcinol như orsellinic acid (11), confluentic acid (12)… và loạichứa nhóm chức β-orcinol như atranorin (13), diffractaic acid (14)… [ 10] .

OH

CO2Me

OH

HO Me

CO2Me

OH

HO Me

Me CO2Me

OH

HO Me

CO2MeOHC

7 8 9 10

Me

COOH

OHHO

OH

MeO

Me O

O

O

OMe

CO2H

Me

11

12

OO

OH

O

O

OH

OO

NH2O

5 6

13 14






7

2.1.4.5 Depsidone

Depsidone có thêm liên kết ether so với depside chỉ có liên kết ester, tạo

thành cấu trúc vòng cứng nhắc. Các depsidone đều dựa trên cấu trúc vòng11H-dibenzo[ b,e] [ 1,4] dioxepin-11-one. Depsidone cũng có hai loại như

depside: orcinol depsidone như physodic acid (15 ), norlobaric acid (16 )… vàβ-orcinol depsidone như salazinic acid (17), parellic acid (18) … [ 10] .

2.1.4.6 Dẫn xuất của dibenzofuran

Trong nhóm này, những hợp chất phân tử khối nhỏ có cấu trúc usnic acidđược nghiên cứu nhiều nhất. Usnic acid (19 ) là hợp chất thể hiện hoạt tínhkháng sinh có tiềm lực nhất trong các hợp chất từ địa y, có tác dụng trên rất

nhiều chủng vi khuẩn. Ngoài ra nó còn kháng ung thư, ngăn cản sự phân bào,

có tác dụng hạ sốt và giảm đau [ 10] .

2.1.4.7 Hợp chất anthraquinone, naphthoquinone và dẫn xuất

O

O

OH

CO2HHO

O

Me

Me

O

O

O

OMe

HO

OMe

CHO

Me

HO2C

O

O

OH

HO

OMe

CHO

OH

OO

HO

15 16

17 18

O

Me

O O

Me

OH

OH

Me

HO

Me O

19

O

O

OH

CO2HHO

O

Me

Me

O






8

Hình 2.2: Địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi.

Hợp chất chứa nhân anthraquinone (20) phân bố rộng trong tự nhiên,hiện diện nổi bật trong thực vật bậc cao và nấm nhưng cũng là thành phầnquan trọng trong địa y. Các hợp chất anthraquinone là tác nhân kháng virus, kểcả HIV, đặc biệt là hypericin (21) kháng virus phiên mã ngược [ 10] .

Napthoquinone là nhóm hợp chất có nguồn gốc từ naphthalene. Đángchú ý có naphthazarin (22) có hoạt tính gây độc đối với tế bào ung thư biểumô [ 10] .

2.1.4.8 Terpenoid, steroid và carotenoid [11]

Như những loài thực vật khác, địa y cũng chứa các hợp chất terpenoid,steroid và carotenoid quen thuộc trong hóa học hợp chất thiên nhiên.

Terpenoid gồm có monoterpenoid (camphor, limonene, pinene…),

diterpenoid (phytol, manool…), triterpenoid (amyrin, lupeol, pyxinol…).

Steroid như cholesterol, ergosterol, lichesterol…Carotenoid như carotene, lutein, neoxanthin…

2.2 Đại cương về địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi

OH

HO

OH

Me

O

MeHO

OH OHO20

21

22






9

2.2.1 Tên gọi

Tên khoa học: Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi.

Tên gọi khác: Parmelia applanata, Placodium flavostramineum,

Lecanora flavostraminea, Parmelia redacta.

2.2.2 Phân loại thực vật học

Gi ới: NấmPhân giới: Ascomycota

Ngành: PezizomycotinaLớp: Lecanoromycetes

Thứ: LecanoralesB ộ: Lecanorineae

Họ: Physciaceae

Chi: Dirinaria Loài: Dirinaria applanata

2.2.3 Đặc điểm hình thái thực vật [12]

Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi là loài địa y dạng phiến thuộcchi Dirinaria, một chi rất phổ biến và chiếm đa số ở vùng nhiệt đới và cậnnhiệt với 36 loài trên thế giới.

Loài địa y này phát triển với kích thước rộng khoảng 5 - 10 cm. Các thùyrộng 0,5 - 2 mm, dạng lông chim kế tiếp nhau, gấp nếp theo chiều dọc và tỏara ngoài. B ề mặt trên có màu xám, xám xanh, xám vàng hoặc trắng nhạt, cóthể có phủ phấn trắng, có các chồi vảy phát tán bào tử dạng bột. Mặt dưới có

màu đen ở giữa, rìa màu đen hoặc nâu. Đặc trưng của loài địa y này là sự hiện

diện của divaricatic acid.

(Nguồn: http://www.tropicallichens.net/?s=Dirinaria%20applanata)

Hình 2.3: Cấu tạo địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi.






10

2.2.4 Phân bố

Địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi phân bố ở vùng nhiệt

đới, cận nhiệt và mở rộng sang cả vùng ôn đới. Chúng phát triển trên thân cây,gỗ, đá, từ vùng duyên hải đến rừng núi, có mặt ở một số đảo của thái B ình

Dương, châu Úc, châu Mỹ, châu Á và châu Phi [ 12] .

2.2.5 Thành phần hóa học

Địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi có thành phần chính làdivaricatic acid (23). Ngoài ra, còn có atranorin (13), chloroatranorin, 3β-

acetoxyhopane-1β,22-diol, một số loại terpene… [ 12] và các thành phần cơ bản của địa y. Không tìm thấy tài liệu cụ thể về thành phần hóa học của loàiđịa y này.

2.3 Cơ sở lý thuyết của một số phương pháp thực nghiệm

2.3.1 Kỹ thuật chiết ngâm dầm (chiết rắn - lỏng)

Kỹ thuật chiết ngâm dầm d ùng để lấy các hợp chất tự nhiên ra khỏi thựcvật thô ban đầu.

Ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép khônggỉ có nắp đậy. Rót dung môi tinh khiết v ào bình cho đến xấp xấp bề mặt củalớp bột cây. Giữ y ên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để chodung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự

nhiên. Sau đó, dung dịch chiết được lọc qua một tờ giấy lọc, thu hồi dung môisẽ có cao chiết. Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chiết bột cây và tiếp tục

quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây. Có thể giatăng hiệu quả chiết bằng cách đảo trộn, xốc đều lớp bột cây hoặc gắn bình vào

máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bung ra làm dung dịch chiết trào ra ngoài).

Mỗi lần ngâm dung môi, chỉ cần 24 giờ là đủ vì với một lượng dung môicố định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi đến mức bão hòa,không thể hòa tan thêm được nhiều hơn. Chiết nhiều lần, mỗi lần một ít lượng

MeO OH

Me

O

O

OH

COOH

Me

23






11

dung môi. Dung môi sau khi thu hồi được làm khan nước bằng các chất làmkhan và được tiếp tục sử dụng để chiết các lần sau [ 13] .

2.3.2 Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng

Kỹ thuật chiết lỏn g – lỏng áp dụng để phân chia cao chiết thô ban đầu(thường là cao alcol thô) thành các phân đoạn cao có tính phân cực khác nhau.

Nguyên tắc: dung môi có tính phân cực khác nhau sẽ hòa tan tốt các hợp

chất có tính phân cực tương ứng với nó. Phương pháp này dựa trên sự phân bốcủa chất tan vào hai pha và hai pha lỏng này không hòa tan vào nhau, thực

hiện bằng bình lóng. Cao alcol thô ban đầu được hòa tan vào nước.

Việc chiết được thực hiện lần lượt bằng các dung môi hữu cơ có độ phâncực tăng dần. Chiết nhiều lần với mỗi loại dung môi, mỗi lần một lượng nhỏthể tích dung môi, đến khi chiết kiệt mới chuyển sang dung môi khác. Thu hồi

dung môi được các cao phân đoạn tương ứng [ 13] .

2.3.3 Phương pháp sắc ký cột (sắc ký cột hở)

Sắc ký cột dùng để phân đoạn cao ban đầu thành những phân đoạn caonhỏ hơn có độ phân cực khác nhau, hoặc cô lập hợp chất tinh khiết từ một

phân đoạn cao nhỏ.

Sắc ký cột được tiến hành ở áp suất khí quyển. Pha tĩnh là chất hấp phụđược nhồi trong cột thủy tinh. Mẫu chất cần phân tích được nạp lên đầu cột,

phía trên pha tĩnh. Pha động là dung môi hữu cơ hoặc hỗn hợp dung môi hữucơ với tỉ lệ xác định, di chuyển qua lớp chất hấp phụ dưới tác động của trọnglực, tùy theo ái lực với pha tĩnh và pha động mà mỗi chất sẽ giải ly ra khỏi cột

trước hoặc sau.

2.3.3.1 Chọn chất hấp phụ và nhồi cột

Thường sử dụng silica gel pha thường với cỡ hạt phù hợp cho phân đoạn

cao hay hỗn hợp chất cần tách, còn silica gel pha đảo dùng khi cần cô lập cáchợp chất phân cực mạnh. Muốn tách chất tốt thì trọng lượng chất hấp phụ phảilớn hơn 25 – 50 l ần trọng lượng của mẫu chất (tùy vào mục đích của cột) và tỷlệ chiều cao chất hấp thu : đường kính trong của cột vào khoảng 10 : 1 [ 13] .Cấu trúc mạng silica gel pha thường:

SiOO

O

O

SiO

SiO

O O

O O

H H H






12

Có hai cách nhồi cột: nhồi cột ướt (dùng cho các chất hấp phụ có khảnăng trương phình như silica gel, sephadex…) và nhồi cột khô (dùng cho cácchất hấp phụ không có khả năng trương nở như Al2O3, CaCO3…). Cột cần đặtthẳng đứng trên giá, dưới đáy có lớp bông gòn giữ chất hấp phụ. Cột nạp xong

phải đồng nhất, mặt cột bằng phẳng.

2.3.3.2 Nạp mẫu chất cần phân tích vào cột

Mẫu chất phải phân tán thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt cột và bằng phẳng thì việc phân tách mới hiệu quả. Có hai cách nạp mẫu chất:

- Nạp mẫu chất ở dạng dung dịch: hòa tan mẫu chất bằng một lượng tốithiểu dung môi khởi đầu giải ly nhưng phải hòa tan hoàn toàn. Khi toàn bộmẫu chất ngấm hết vào cột, mới cho tiếp dung môi mới.

- Nạp mẫu chất ở dạng bột khô: trộn mẫu chất với một lượng chất hấp phụthật đều, sấy hoặc cô quay cho đến khi khô tơi rồi cho vào cột bằng cách rảithành một lớp đều đặn trên mặt cột.

2.3.3.3 Chọn dung môi và giải ly cột [13]

Dùng sắc ký lớp mỏng dò tìm dung môi phù hợp để bắt đầu giải ly cột.

Đối với mẫu cao thô chiết từ cây cỏ, dung môi giải ly đầu tiên là dung môi đẩyvết ít phân cực nhất lên vị trí có R f = 0,5 và dung môi ch ấm dứt sắc ký cột là

dung môi đẩy vết phân cực nhất lên vị trí có R f = 0,2. Gi ải lytrước tiên bằngdung môi không phân cực và tăng dần độ phân cực cho dung môi giải ly một

cách từ từ để tránh gãy cột: thêm từ từ mỗi lần vài phần trăm dung môi mới cótính phân cực cao hơn vào dung môi cũ đang sử dụng. Dung môi sử dụng phảitinh khiết.

Với pha tĩnh là silica gel pha thường, hợp chất không phân cực được giải

ly ra khỏi cột trước, hợp chất càng phân cực giải ly ra càng sau, còn silica gel pha đảo thì ngược lại. Các loại hợp chất có tính phân cực tăng dần:hydrocarbon → alkene → ether → halocarbon → hợp chất thơm → ketone →aldehyde → ester → alcohol → amine → carboxylic acid → các hợp chấtkiềm mạnh.

Vận tốc dung môi giải ly không quá nhanh cũng không được quá chậm,thường ở khoảng 5 – 50 gi ọt/phút hoặc 1 – 2 cm/phút. Tùy theo chất hấp phụđã dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột, có thể tiến hành giải ly cột bằng ápsuất thường hoặc bằng áp suất nén:

- Gi ải ly cột bằng áp suất thường: có nhược điểm là chảy chậm, chỉ dùng

cho các chất hấp phụ có kích thước hạt lớn.






13

- Giải ly cột bằng áp suất nén: cho một dòng khí nén (khí nitơ hoặc khôngkhí) vào đầu cột với tốc độ dòng khí có thể điều chỉnh.

2.3.3.4 Theo dõi quá trình giải ly cột [13]

Với các chất cần phân tích có màu, quá trình giải ly bằng sắc ký cột cóthể được theo dõi bằng mắt thường. Tuy nhiên, đa số hợp chất hữu cơ tự nhiênđều không màu nên việc hứng và kiểm tra các phân đoạn giải ly ra khỏi cộtthường bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng.

2.3.4 Sắc ký lớp mỏng [13]

Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC) còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), chủ yếu dựa vào hiện tượng hấp phụ. Trong

đó, pha động là dung môi hoặc hỗn hợp dung môi di chuyển ngang qua phatĩnh là một lớp chất hấp phụ trơ như silica gel hoặc aluminium oxide đượctráng thành lớp mỏng, đều và phủ lên một nền phẳng như tấm kính, nhômhoặc plastic. Quá trình sắc ký diễn ra khi đặt bản mỏng trong bình sắc ký làhũ, lọ… bằng thủy tinh có nắp đậy kín để bão hòa hơi dung môi.

- Pha tĩnh với chất hấp phụ là silica gel hoặc Al2O3: hợp chất kém phân

cực sẽ di chuyển nhanh và hợp chất càng phân cực sẽ di chuyển càng chậmhoặc không di chuyển. Độ dày của pha tĩnh thường là 0,25 mm.

- Pha động: dung môi hoặc hỗn hợp dung môi di chuyển chậm dọc theotấm lớp mỏng nhờ vào lực mao quản và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Mỗi

thành phần của mẫu chất sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau sau mực dungmôi, tùy thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh níu giữ lại, ái lựcvới pha tĩnh, pha động và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi.

- Mẫu chất cần phân tích: thường là một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất vớiđộ phân cực khác nhau, dùng vi quản để chấm thành một điểm gọn nằm trên

pha tĩnh ở vị trí cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng (pha động)đang chứa trong bình sắc ký. Sau đó cho pha động di chuyển ngang qua. Vị trí

của mỗi thành phần cấu tử trên bản mỏng được tính bằng giá trị R f :

R =a

b =

khoảng cách di chuyển của chất

khoảng cách di chuyển của dung môi

Các chất khác nhau thường sẽ có giá trị R f khác nhau trong cùng điều

kiện thử. Một chất tinh khiết sẽ chỉ cho một vết tròn, có giá trị R f không đổitrong một hệ dung môi xác định.






Sắc ký lớp msơ bộ về tính chất chữu cơ, cô lập hợpgiống nhau hay khô

2.3.4.1 Các k

a. Sắc ký lớp mnhiều lần từ đầu dư

vết mẫu chấm trênký vì mẫu chất sẽ b

b. Sắc ký lớp msắc ký một chiều kchiều để kết quả tá20 cm, chấm mẫuthứ nhất, quay góc

c. Sắc ký lớp m

chất với lượng nhchiều với bản mỏng

Hỗn hợp cầnSau đó nhúng bảncác chất trong hỗnchạy phải sấy khôđèn UVho ặc phundung môi thích hợp

B ản mỏng chưa k

Hình

CHƯƠNG2: T Ổ

14

ng dùng để khảo sát hệ dung môi cho sủa mẫu chất, theo dõi diễn tiến của một pchất (sắc ký lớp mỏng điều chế), kiểm tng…

thuật sắc ký lớp mỏng

ỏng một chiều: dung môi chạy cùng mi lên đầu trên bản mỏng với một hay vài

bản mỏng không được ngập vào dungkhuếch tán ngay lập tức ra dung môi là

ỏng hai chiều: nếu mẫu chất có nhiều công thể thấy rõ sự tách, tiến hành thêmch rõ ràng hơn. Dùng bản mỏng hình vhất ở góc bản rồi cho vào bình sắc ký0o, tiếp tục cho vào bình sắc ký chạy hệ

ng điều chế (kỹ thuật sắc ký chế hóa):

và có R f xa nhau. Dùng kỹ thuật sắc20 x 20 cm, độ dày chất hấp phụ từ 0,5

tách được chấm lên bản mỏng thành mmỏng vào dung môi khai triển thích hợợp gần nhau có thể chạy lại nhiều lần nh

bản mỏng. Đánh dấu vùng muốn tách cthuốc thử hiện hình ở mép bản, cạo riênđể lấy riêng mẫu chất khỏi chất hấp phụ.

hai triển và đã khai triển sắc ký hoàn tất.

.4: Minh họa cách tính R f .

Vạch dưới: v

Vạch trên: v

G QUA N T ÀI LIỆU

c ký cột, tìm hiểuhản ứng tổng hợpa hai hợp chất có

ột chiều, một hayhệ dung môi. Các

ôi trong bình sắccác vết bị lem.

ấu tử thì kỹ thuậtỹ thuật sắc ký haiông cạnh khoảnghạy hệ dung môiung môi thứ hai.

dùng để tách các

ý lớp mỏng một1 mm.

t đường liên tục. p. Trường hợp R f ưng trước mỗi lầnất bằng cách soitừng vùng, dùng

ạch xuất phát

ch dung môi






15

2.3.4.2 Cách hiện hình vết sau khi giải ly bản mỏng [13]

Các vết trên bản mỏng có thể có màu hoặc không màu vì vậy cần áp

dụng các phương pháp hiện hình vết:

a. Phương pháp vật lý: thường dùng tia tử ngoại (UV). Các vết dưới tiaUV có màu tối sẫm.- Đèn chiếu tia UV 254 nm: ánh sáng này đ ể phát hiện các hợp chất có thể

hấp thu tia UV.- Đèn chiếu tia UV 365 nm: ánh sáng này dùng để phát hiện những hợp

chất có thể phát huỳnh quang. Các vết của mẫu chất có màu sáng trên nền bảnmỏng sẫm màu.

b. Phương pháp hóa học: phát hiện các vết bằng thuốc thử. Hòa thuốc thửvào dung môi thích hợp rồi phun xịt lên bản mỏng hoặc nhúng nhanh bảnmỏng vào dung dịch thuốc thử. Thuốc thử sẽ kết hợp với các hợp chất để tạora các dẫn xuất có màu.

B ảng 2.1: Một vài thuốc thử hiện hình trong sắc ký lớp mỏng.

Thuốc thử Màu của vết Hợp chất

Hơi iod Vàng hoặc nâuHợp chất hữu cơ nói chung,hợp chất bất bão hòa.

2,7-Fluoresceine Lục - vàng Đa số các hợp chất hữu cơ.

Nihydrin Tím - hồng Amino acid, amine.2,4-

DinitrophenylhydrazineĐỏ - cam Aldehyde, ketone.

Antimony trichloride Màu đặc trưngSteroid, hợp chất chi hoàn.Vitamin, carotenoid.

Diphenyl carbazide Màu đặc trưng Kim loại.

Bromophenol blue;

Bromocresol greenVàng Carboxylic acid.

H2SO4 đậm đặc

Vàng đậm đếnda cam

Flavon, flavonol.

Màu đỏ hoặc xanh

dương - đỏChalcon, auron.

Màu cam đến đỏ Flavonoid.

FeCl3 Xanh lục đến xanhđen

Sesquiterpen.

Mayer Màu vàng nhạt Alkaloid.

Dragendorff Màu đỏ cam Alkaloid.






16

2.3.5 Sự kết tinh lại (Recrystallization)

Các hợp chất cô lập được sau quá trình sắc ký cột, khi quan sát bằng mắt

thường ta thấy chúng ở dạng bột trắng hay tinh thể không màu, khi sắc ký lớpmỏng với nhiều hệ dung môi khác nhau vẫn cho một vết tròn, gọn đẹp nhưng

thực ra độ tinh khiết của chúng cũng chỉ từ 90 - 95% mà thôi . Vì thế, việc xácđịnh cấu trúc bằng các phương pháp hóa lý sẽ kém hiệu quả. Do vậy, việc kếttinh lại hợp chất là rất cần thiết.

Một hợp chất có độ tinh khiết lớn hơn 95% m ới có thể khảo sát bằng các

phương pháp hoá lý.

2.3.6 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp thửnghiệm sử dụng gốc tự do DPPH

2.3.6.1 Giới thiệu về gốc tự do

G ốc tự do là những nguyên tử, phân tử hay ion có các điện tử độc thân ởlớp ngoài cùng, do đó chúng kém bền vững, thời gian tồn tại ngắn (1/1000giây) và hoạt tính cao. Vì vậy mà chúng dễ dàng tham gia phản ứng với các

phân tử khác bằng cách lấy đi một điện tử của phân tử đó nhằm bền vững hoálớp vỏ điện tử của mình nhưng đồng thời sinh ra một gốc tự do mới, gốc tự domới lại tiếp tục phản ứng với phân tử khác và tạo thành phản ứng dây chuyền.

Một số gốc tự do có vai trò quan trọng trong cơ thể, là những chấtchuyển hóa trung gian có hoạt tính mạnh, tuy nhiên khi số lượng vượt quá sựkiểm soát của cơ thể thì chúng sẽ tấn công vào hệ thống các mô, cơ quan, các

base trong nucleic acid, các amino acid trong chuỗi protein, các acid béo chưa bão hoà… và gây ra hàng loạt biến đổi có hại cho cơ thể.

2.3.6.2 Giới thiệu về gốc tự do DPPH và nguyên tắc của thử nghiệm

Phương pháp DPPH được giới thiệu lần đầu tiên bởi Marsden Blois v ào

năm 1958 . DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) là gốc tự do ổn định, bền ởnhiệt độ thường, dạng bột màu đen ở điều kiện thường, có màu tím đặc trưngtrong dung môi (thường dùng methanol, ethanol). G ốc DPPH có bước sónghấp thu cực đại ở 517 nm và độ hấp thu của nó giảm tương ứng khi nguyên tử

N mang một điện tử lẻ nhận một điện tử hoặc hydro từ các chất chống oxy hóa(dung dịch DPPH từ màu đen tím chuyển sang màu vàng). Do đó, DPPH đượcsử dụng rộng rãi và là thử nghiệm cơ bản để đánh giá hiệu quả hoạt động làmsạch gốc tự do của các chất chống oxy hóa dựa trên sự thay đổi độ hấp thu của

dung dịch DPPH ở 517 nm [ 14] .



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3551182/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3551182/




17

1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazine

Hình 2.5: Ph ản ứng trung hòa gốc tự do DPPH.

2.3.6.3 Biểu diễn kết quả thử nghiệm DPPH

Khả năng khử gốc tự do DPPH của một cao chiết (hoặc chất chống oxy

hóa) ở nồng độ xác định được biểu diễn thông qua phần trăm ức chế (I%)được tính theo công thức:

I% =A − A

A

x 100

Với Ac là giá trị mật độ quang của mẫu trắng (không có chất chống oxyhóa - control) và As là giá trị mật độ quang của mẫu thử (có chất chống oxy

hóa - sample).

Kết quả thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa của một chất bằng phương

pháp DPPH được báo cáo bằng IC50 (half maximal Inhibitory Concentration).IC50 được định nghĩa là nồng độ của chất mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốctự do, tế bào hoặc enzyme. IC50 là một giá trị dùng để đánh giá khả năng ứcchế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát, mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trịIC50 sẽ càng thấp. Cách tính IC50:

- Tiến hành khảo sát hoạt tính của mẫu ở nhiều nồng độ khác nhau và tínhI% của từng nồng độ. Với những mẫu có phần trăm ức chế I% biến thiêntuyến tính với nồng độ, vẽ đường thẳng y = ax + b biểu diễn mối liên hệ giữa

I% và nồng độ mẫu (với y là I% và x là nồng độ mẫu). Tìm phương trìnhtuyến tính, xác định hệ số a và b của phương trình.

- Thay y = 50 vào phương trình ta sẽ thu được giá trị x, đó chính là nồngđộ ức chế được 50% gốc tự do (IC50).

N

N

NO2O2N

NO2

+ RH

N

NH

NO2O2N

NO2

+ R





Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU

18

CHƯƠNG 3

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm, thời gian và phương tiện

3.1.1 Địa điểm và thời gian

Đề tài luận văn “Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxyhóa của loài địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi” được thực hiệntại phòng thí nghiệm Hóa Sinh 1, khoa Khoa Học Tự Nhiên, trường Đại họcCần Thơ. Đề tài được thực hiện từ tháng 06/2014 đến tháng 11/2014.

3.1.2 Dụng cụ

- Máy cô quay chân không.- Máy UV – Vis Jenway 6800.- Cột sắc ký, đèn soi UV, cân phân tích bốn số lẻ, tủ sấy, tủ hút, bếp điện,

hũ bi, ống đong, ống vi quản, bình định mức, bình lóng…

3.1.3 Hóa chất

- Các dung môi: petroleum ether, ethyl acetate, chloroform, methanol…- DPPH (Sigma-Aldrich) và các hóa chất khác.

- Silica gel Himedia (0,0610 – 0,0381 mm).- B ản mỏng tráng sẵn (Merck).- Na2SO4 dùng để làm khan dung môi.

- Thuốc thử H2SO4 20% chứa vanillin dùng để hiện hình bản mỏng.

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp chiết tách hợp chất tự nhiên từ thực vật

Địa y sau khi thu hái, phơi thật khô, nghiền thành bột mịn, sau đó ngâm

chiết đến kiệt với methanol. Cô quay dịch chiết thu được cao methanol tổng.

Từ cao methanol tổng ban đầu, sử dụng phương pháp chiết lỏng – lỏngvới các dung môi petroleum ether, ethyl acetate, cô quay thu hồi dung môiđược cao petroleum ether, cao ethyl acetate và cao nước.

3.2.2 Phương pháp phân lập và tinh chế các hợp chất từ cao chiết

Những phương pháp được sử dụng để phân lập hợp chất tinh khiết từ caochiết bao gồm:

- Phương pháp sắc ký cột: chủ yếu.






19

- Phương pháp sắc ký lớp mỏng: song song với sắc ký cột để khảo sát các phân đoạn, hợp chất được giải ly ra khỏi cột cũng như kiểm tra độ tinh khiếtcủa hợp chất phân lập được.

- Phương pháp kết tinh lại: để loại các chất bẩn, nâng cao độ tinh khiết của

hợp chất phân lập được.

3.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của hợp chất tinh

khiết phân lập được

Tiến hành đo phổ hợp chất tinh khiết phân lập được. Phổ 1H-NMR, 13C- NMR, DEPT, HMBC được đo tại trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đạihọc Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. Các dữ liệu phổ dùng để xác định cấu trúchóa học của hợp chất.

3.3 Thực nghiệm điều chế các loại cao

3.3.1 Thu hái và xử lí mẫu địa y

Mẫu địa y được thu tại khuôn viên trường Đại học Cần Thơ, TP. CầnThơ. Mẫu cây được định danh là Dirinaria Applanta (Fée) D. D. Awasthi bởiThS.Nguyễn Thị Kim Huê – bộ môn Sinh học, khoa Khoa Học Tự Nhiên,trường Đại học Cần Thơ. Mẫu cây hiện được lưu giữ tại phòng thí nghiệmHóa Sinh 1, khoa Khoa Học Tự Nhiên, trường Đại học Cần Thơ.

Mẫu sau khi thu hái, để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Sau đó nghiềnmịn, cho mẫu vào túi vải, buộc kỹ v à đặt vào lọ thủy tinh dung tích 10 L.

3.3.2 Điều chế cao methanol tổng

Cao methanol tổng được điều chế bằng kỹ thuật chiết ngâm dầm. Khốilượng bột địa y đem ngâm là 1,28 kg, sử dụng hết 20 L methanol để chiết kiệt.

Mỗi lần chiết với lượng methanol ngập túi vải trong 24 giờ. Lọc loại bỏ bã vàcô quay thu hồi dung môi dịch chiết thu cao tổng với khối lượng là 210 g.

Hiệu suất điều chế cao methanol tổng:

H =210

1280 x 100 = 16,4%

3.3.3 Điều chế cao petroleum ether

Hòa tan cao methanol tổng vào lượng tối thiểu nước cất, lọc qua giấy lọcđể loại cặn. Chiết lỏng - lỏng dịch cao methanol tổng với petroleum ether, mỗilần chiết dùng khoảng 200 - 300 mL dung môi, lắc nhẹ và đều trong 15 phút

rồi tách lấy lớp trên. Chiết nhiều lần bằng bình lóng đến khi lớp trên không






20

màu thì kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, nếu không còn vết thì ngưng. Gomdung dịch lớp trên cô quay thu được cao petroleum ether với khối lượng 88 g.

Hiệu suất điều chế cao petroleum ether:

H =

88

210 x 100 = 41,9%

3.3.4 Điều chế cao ethyl acetate

Phần lớp dưới khi trích với petroleum ether tiếp tục được chiết lỏng -lỏng với ethyl acetate. Tiến hành tương tự như chiết với petroleum ether vớilớp trên là dịch chiết của ethyl acetate. Vẫn chiết tới khi lớp trên không màu,kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng. Cô quay thu hồi dung môi được cao ethylacetate với khối lượng là 76 g.

Hiệu suất điều chế cao ethyl acetate:

H =76

210 x 100 = 36,2%

3.3.5 Điều chế cao nước

Phần lớp dưới sau khi chiết với ethyl acetate đem cô quay thu hết nước,

thu được cao nước. Khối lượng cao nước là 46 g.

Hiệu suất điều chế cao nước:

H = 46210

x 100 = 21,9%

Quy trình điều chế các loại cao chiết được tóm tắt trong sơ đồ:

Hình 3.1: Quy trình điều chế các loại cao chiết.

B ột địa y (1,28 kg)

Cao tổng methanol (210g)

Chiết kiệt với methanolCô quay thu hồi dung môi

Thêm nước cất để hòa tanChiết với petroleum ether (lớp trên)

Cô quay thu hồi dung môi

Cao petroleum ether (88 g) Dung dịch nước

Chiết với ethyl acetate (lớp trên)Cô quay thu hồi dung môi

Cao nước (46 g)Cao ethyl acetate (76 g)






21

3.4 Khảo sát và phân tích cao petroleum ether

3.4.1 Sắc ký cột cao petroleum ether

Đầu tiên, dùng sắc ký lớp mỏng để khảo sát tính phân cực của cao cũng

như dò tìm hệ dung môi để bắt đầu quá trình giải ly cột. Thử nghiệm với nhiềuhệ dung môi khác nhau, nhận thấy với hệ dung môi petroleum ether : ethyl

acetate (95:5) các v ết chính khá tách nhau và tròn đẹp, vì vậy petroleum ether(100%) được chọn là dung môi đầu tiên giải ly cột. Từ kết quả sắc ký bản

mỏng cho thấy cao petroleum ether có chứa các hợp chất có tính phân cực từthấp đến cao với một số vết khá rõ, tiếp tục khảo sát có thể phân lập được hợp

chất tinh khiết.

Tiến hành sắc ký cột cao petroleum ether (88 g) với pha tĩnh là 400gsilica gel Himedia (cỡ hạt 230 - 400 mesh, tương đương 0,063 - 0,037 mm).Cột có đường kính 5 cm . Dung môi giải ly cột là hệ dung môi petroleum ether: ethyl acetate (tỉ lệ từ 100:0 đến 50 :5 0) với độ phân cực tăng dần. Dung dịchra khỏi cột được hứng lại bằng các hũ bi có thể tích bằng nhau. Theo dõi quátrình sắc ký cột bằng sắc ký lớp mỏng để gom các hũ bi chứa dung dịch giốngnhau. Tổng cộng thu được 7 phân đoạn được trình bày ở bảng 3.1, trong đó

phân đoạn III có vết chính rõ, đậm và có ít vết tạp hơn so với các phân đoạnkhác nên được chọn tiếp tục khảo sát.

a bHình 3.2: SKLM cao petroleum ether với hệ dung môi

petroleum ether : ethyl acetate (95:5).

a: hiện hình dưới đèn UV λ = 254 nm. b: hiện hình bằng dung dịch H2SO4

20% có chứa vanillin.






22

B ảng 3.1: Tổng hợp kết quả sắc ký cột cao petroleum ether.

Phânđoạn

Khốilượng

Dung môigiải ly cột

SKLM (thuốc thử hiện hình là dd H2SO4 có vanillin, nướng trên bếp điện)

I 4,47 g PE Nhiều vết dính nhau, mờ.

II 5,93 gPE : EtOAc

(95:5)Vết kéo dài không có vết chính.

III 3,02 gPE : EtOAc

(9:1)Có vết chính màu vàng với lượng lớn cùngvài vết khác. Tiếp tục khảo sát.

IV 6 ,6 5 gPE : EtOAc

(8:2 )

Có 1 vết chính tròn rõ màu đỏ ở khoảng

giữa bản chiếm lượng lớn và có ít vếtkhác. Tiếp tục khảo sát.

V 27,48 g PE : EtOAc(7:3) Gần giống phân đoạn IV nhưng có thêmnhiều vết phân cực mạnh dính nhau hơn.

VI 14,19 gPE : EtOAc

(6:4 )Có vệt phân cực mạnh kéo dài cùng cácvết ít phân cực hơn nhưng không rõ.

VII 10,19 gPE : EtOAc

(5:5 ) Nhiều vết tạp kéo dài cả bản.

3.4.2 Khảo sát phân đoạn III

Phân đoạn III sau khi để bay hơi dung môi tự nhiên xuất hiện tinh thể kếttủa thành một lớp dưới đáy bình chứa, có màu trắng với dạng hình kim nhỏ.

Tinh thể còn hơi vàng do bẩn, tiến hành xử lý tinh thể này.

Đầu tiên, thử tính chất hòa tan của tinh thể trong các loại dung môi, nhậnthấy tinh thể tan rất tốt trong chloroform, rất khó tan trong các loại dung môihữu cơ khác. Đặc biệt với methanol, tinh thể không tan nhưng các chất tạp bẩn

bám trên tinh thể đều tan và bị rửa trôi. Vì vậy, rửa tinh thể thật nhiều lần vớimethanol thu được tinh thể màu trắng không còn dính bẩn màu vàng. Sau đó,

tiến hành kết tinh lại tinh thể trong chloroform để đảm bảo độ tinh khiết, thuđược lượng tinh thể trắng hình kim nhỏ với khối lượng 371 mg. Ký hiệu tinhthể thu được là hợp chất HP1.

Khảo sát mức độ tinh khiết của hợp chất bằng sắc ký lớp mỏng, kết quả

trình bày trong hình 3.3. Với dung môi phân cực yếu đến mạnh đều chỉ có 1vết tròn màu vàng trên bản, vậy có thể kết luận HP1 đã khá tinh khiết.






23

3.5 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết địa y cùnghợp chất HP1 bằng phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH

3.5.1 Cách tiến hành tổng quát

- Cao chiết (hay hợp chất) được hòa tan trong methanol ở nồng độ nhấtđịnh, lấy từng lượng thể tích tăng dần (ứng với nồng độ tăng dần trong mẫuthử) cho vào từng tuýp eppendorf, mỗi tuýp là một mẫu thử.

- Hòa tan DPPH bằng methanol ở nồng độ thích hợp. Cho vào mỗi mẫuthử một lượng thể tích dung dịch DPPH như nhau ở tất cả các mẫu thử.

- Làm đầy từng tuýp eppendorf bằng methanol đến 2 mL, lắc nhẹ. Ủ các

tuýp trong tối trong 30 phút ở nhiệt độ thường, không đổi.- Tiến hành đo độ hấp thu của mỗi mẫu thử trong tuýp eppendorf. Chú ý

rằng với dung dịch cao chiết (hay hợp chất) có độ hấp thu riêng, cần pha cácdung dịch cao cùng nồng độ với nồng độ của nó trong các mẫu thử nhưngkhông có DPPH và đo độ hấp thu, sau đó lấy độ hấp thu của mẫu thử trừ độhấp thu của dung dịch trên để tìm ra độ hấp thu chính xác của mẫu thử. Tính

phần trăm ức chế gốc tự do DPPH của từng mẫu thử, dựng đường thẳng tuyếntính theo phần trăm ức chế và nồng độ cao chiết, từ đó tính IC50 để đánh giákhả năng kháng oxy hóa.

3.5.2 Chuẩn bị dung dịch DPPH

DPPH dạng bột màu đen được pha trong methanol ở nồng độ 1000 µM(tương đương 0,4 mg/mL), trữ trong tối. Thể tích dung dịch DPPH ở nồng độ1000 µM được sử dụng trong các mẫu thử luôn là 0,1 mL, và thể tích của mỗi

mẫu thử luôn là 2 mL trong tuýp eppendorf. Vậy nồng độ DPPH trong các

1 2 3Hình 3.3: SKLM khảo sát hợp chất HP1

(hiện hình bằng dd H2SO4 20% có vanillin).

1: Dung môi giải ly là PE 100%,R f = 0,18.

2: Hệ dung môi giải ly là PE : EtOAc (95:5),R f = 0,57.

3: Dung môi giải ly là chloroform (100%),R f = 0,89.






24

mẫu thử trở thành 50 µM, nằm trong khoảng nồng độ đảm bảo độ chính xáccho việc đo độ hấp thu của máy quang phổ UV -Vis là 25 - 70 µM [ 15] .

3.5.3 Mẫu đối chứng dương ascorbic acid (vitamin C)

Để đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của các loại cao chiết địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi, so sánh với ascorbic acid là mộtchất chống oxy hóa mạnh. Khả năng kháng oxy hóa của ascorbic acid thể hiệnqua thí nghiệm sau. Ascorbic acid dạng bột trắng được pha trong methanol ởnồng độ 1000 µM (tương đương 0,18 mg/mL) đ ể dùng trong thí nghiệm. Thểtích dung dịch ascorbic acid dùng trong các mẫu thử tăng dần (ứng với nồngđộ tăng dần). Thí nghiệm được tiến hành như bảng 3.2.

B ảng 3.2: Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của ascorbic acid.

Mẫuthử

Thể tíchDPPH

(1000 µM)

Dd ascorbic acid (1000 µM)Thể tích

MeOH (mL)Thể tích (mL) Nồng độ tương ứngtrong mẫu thử (µM)

1

0,1 mL

0 0 1,90

2 0,01 5 1,893 0,02 10 1,884 0,03 15 1,87

5 0,04 20 1,866 0,05 25 1,85

3.5.4 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao tổng methanol

Thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao tổng được tiếnhành như sau: cân 0,1 g cao tổng, hòa tan trong 10 mL methanol được dungdịch cao tổng có nồng độ 104 µg/mL. Lấy 1 mL dung dịch này pha loãngthành 10 mL bằng methanol, được dung dịch cao tổng có nồng độ 1000

µg/mL. Thể tích dung dịch cao tổng dùng trong các mẫu thử tăng dần (ứng vớinồng độ tăng dần). Thí nghiệm được tiến hành như bảng 3.3.






25

B ảng 3.3: Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của cao tổng.

3.5.5 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao petroleum ether vàcao nước

Thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của 2 loại cao này tiếnhành như nhau: cân 0,1 g cao, hòa tan trong 10 mL methanol được dung dịchcao có nồng độ 104 µg/mL. Lấy 1 mL dung dịch này pha loãng thành 10 mL

bằng methanol, được dung dịch cao có nồng độ 1000 µg/mL. Thể tích dungdịch cao dùng trong các mẫu thử tăng dần (ứng với nồng độ tăng dần). Thí

nghiệm được tiến hành như bảng 3.4.B ảng 3.4: Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của cao PE và caonước.

Mẫuthử

Thể tíchDPPH

(1000 µM)

Dd cao tổng (1000 µg/mL)Thể tích

MeOH (mL)Thể tích (mL)

Nồng độ tương ứng

trong mẫu thử (µg/mL)

1

0,1 mL

0 0 1,92 0,1 50 1,8

3 0,2 100 1,74 0,3 150 1,65 0,4 200 1,56 0,5 250 1,47 0,6 300 1,3

Mẫuthử

Thể tíchDPPH

(1000 µM)

Dd cao (1000 µg/mL)Thể tích

MeOH (mL)Thể tích (mL) Nồng độ tương ứng


1

0,1 mL

0 0 1,9

2 0,2 100 1,73 0,4 200 1,5

4 0,6 300 1,35 0,8 400 1,1

6 1,0 500 0,97 1,2 600 0,7






26

3.5.6 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao ethyl acetate

Cân 0,1 g cao ethyl acetate, hòa tan trong 10 mL methanol được dung

dịch cao có nồng độ 104 µg/mL. Lấy 1 mL dung dịch này pha loãng thành 10mL bằng methanol, được dung dịch cao có nồng độ 1000 µg/mL. Thể tích

dung dịch cao dùng trong các mẫu thử tăng dần (ứng với nồng độ tăng dần).Thí nghiệm được tiến hành như bảng 3.5 .

B ảng 3.5 : Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của cao EtOAc.

3.5.7 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất HP1

Cân 10 mg hợp chất HP1, hòa tan trong 10 mL methanol được dung dịchHP1 có nồng độ 1000 µg/mL. Thể tích dung dịch HP1 dùng trong các mẫu thửtăng dần (ứng với nồng độ tăng dần). Thí nghiệm được tiến hành như bảng3.6.

B ảng 3.6 : Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của HP1.

Mẫuthử

Thể tíchDPPH

(1000 µM)

Dd cao EtOAc (1000 µg/mL)Thể tích

MeOH (mL)Thể tích (mL) Nồng độ tương ứng


1

0,1 mL

0 0 1,9 02 0,04 20 1,8 6

3 0,08 40 1,824 0,12 60 1,785 0,16 80 1,746 0,20 100 1,707 0,24 120 1,66

Mẫuthử

Thể tíchDPPH

(1000 µM)

Dd HP1 (1000 µg/mL)Thể tích

MeOH (mL)Thể tích (mL)

Nồng độ tương ứngtrong mẫu thử (µg/mL)

1

0,1 mL

0 0 1,902 0,04 20 1,863 0,08 40 1,824 0,12 60 1,785 0,16 80 1,746 0,20 100 1,707 0,24 120 1,66





Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG4: K ẾT QUẢ V À THẢO LUẬN

27

CHƯƠNG 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả khảo sát thành phần hóa học địa y Dirinaria

applanata (Fée) D. D. Awasthi

Từ quá trình sắc ký cột cao petroleum ether của địa y Dirinariaapplanata (Fée) D. D. Awasthi, đã phân lập được 1 hợp chất tinh khiết, ký

hiệu là HP1. Tiến hành gửi mẫu, xác định cấu trúc bằng phổ 1H-NMR, 13C- NMR , DEPT và HMBC , đã xác định được hợp chất HP1 là methylhaematommate.

Hợp chất HP1 là chất rắn màu trắng hơi vàng nhẹ, tinh thể hình kim. Thu

được 371 mg hợp chất này. Tan tốt trong chloroform tạo dung dịch trong suốt,tan rất kém hoặc không tan trong các dung môi hữu cơ khác. Tuy nhiên, khi

tan trong chloroform, sau một thời gian ngắn nó thường bị phân hủy tạo thànhdung dịch màu vàng nhạt. Nhiệt độ nóng chảy: 146 -147 °C.

4.1.1 Biện luận cấu trúc hóa học của hợp chất HP1: methyl

haematommate

4.1.1.1 Phân tích phổ 1H-NMR của HP1 (500 MHz, CDCl3)

Dựa vào phổ 1H-NMR (phụ lục 1), phân tử hợp chất HP1 có 10 hydrovới 6 tín hiệu khác nhau.

- Hai tín hiệu ở vùng trường cao δH: 12,86 (1 H, s) và δH: 12,39 (1 H, s) đều

là mũi đơn, là của hydro nhóm –OH. Hai nhóm –OH này đều tạo liên kếthydro với oxy của nhóm carbonyl ở vị trí kế cận trên nhân thơm (liên kết

hydro nội phân tử) nên tín hiệu xuất hiện ở vùng trường δH > 12.

Hình 4.1: Tinh thể hợp chất tinh khiết HP1.






28

- Tín hiệu mũi đơn ở vùng trường cao δH: 10,32 (1H, s) là của hydro nhóm –CHO.

- Tín hiệu mũi đơn ở vùng trường δH: 6,27 (1H, s) là của hydro trên nhânthơm.

- Tín hiệu mũi đơn ở vùng trường thấp δH: 3,95 (3H, s) là của 3 hydronhóm –OCH3.

- Tín hiệu mũi đơn ở vùng trường thấp δH: 2,51 (3H, s) là của 3 hydronhóm –CH3 gắn trên nhân thơm. Nếu không gắn trên nhân thơm thì tín hiệu

này ở vùng trường δH < 1.

4.1.1.2 Phân tích phổ 13C-NMR và DEPT của HP1 (125 MHz,CDCl3)

Dựa vào phổ DEPT (phụ lục 2) và13

C-NMR (phụ lục 3): phân tử hợpchất HP1 có 10 carbon. Trong đó, có 2 tín hiệu của carbon loại =CH– (δC: 194và δC: 112,2), 2 tín hiệu của carbon loại –CH3 (δC: 52 ,4 và δC: 25,3 ), 6 tín hi ệu

của carbon tứ cấp (δC: 172,1; δC: 168,4; δC: 166,8; δC: 155, 5;δC: 108,6 và δC:104).

- Sáu tín hiệu trong vùng trường cao từ δC: 100 đến δC: 170 là của 6 carbonnhân thơm. Trong đó có 1 carbon loại =CH– và 5 carbon t ứ cấp, vậy đây làvòng benzene có 5 nhóm ch ức gắn trên vòng.

- Tín hiệu ở vùng trường cao δC: 194 là c ủa carbon nhóm –CHO .- Tín hiệu ở vùng trường cao δC: 172,1 là của carbon nhóm –COO –.- Tín hiệu ở vùng trường thấp δC: 52,4 là của carbon nhóm –OCH3.- Tín hiệu ở vùng trường thấp δC: 25,3 là của carbon nhóm –CH3.

4.1.1.3 Phân tích phổ HMBC (phụ lục 4)

- Tại δH: 12,86 (hydro nhóm –OH) và δH: 12,39 (hydro nhóm –OH) cùngcó tín hiệu giao nhau tại δC: 108,6 (carbon vòng benzene) mà không cùng cótín hiệu giao nhau tại δC nào khác chứng tỏ 2 nhóm –OH này ở vị trímeta với

nhau trên vòng benzene, carbon ở vùng trường δC: 108,6 ở giữa.- Tại δH: 12,86 (hydro nhóm –OH) có các tín hiệu giao nhau tại δC: 168,4;

δC: 108,6 ; δC: 104 và δH: 12,39 (hydro nhóm –OH) có tín hi ệu giao nhau tại δC:166,8 ;δC: 108,6; δC: 112,2 (các carbon vòng benzene). Do là nhóm đẩy điệntử mạnh nên 2 nhóm –OH gắn với 2 carbon ở vùng trường cao δC: 168,4 (kề

bên là carbon ở vùng trường δC: 104) và δC: 166,8 (kề bên là carbon ở vùngtrường δC: 112,2).






29

- Tại δH: 10,32 (hydro nhóm –CHO) có các tín hiệu giao nhau tại δC:168,4 ; δC: 166,8 (2 carbon vòng benzene gắn nhóm –OH) và δC: 108,6; nênnhóm –CHO g ắn với carbon ở vùng trường δC: 108,6 .

- Tại δH: 2,51 (hydro nhóm –CH3) có các tín hiệu giao nhau tại δC: 152, 5;

δC: 112,2 và δC: 104 (3 carbon kề nhau của vòng benzene). Carbon ở vùngtrường δC: 152,3 ở giữa 2 carbon kia nên nhóm –CH3 gắn với carbon này.

- Proton trên vòng benzene ở vùng trường δH: 6,27 ch ỉ có thể gắn với 1trong 2 carbon chưa có nhóm thế còn lại trên vòng ở vùng trường δ C: 112,2 và

δC: 104; nhưng do không có tín hiệu giao nhau tại δC: 112,2 nên proton gắnvới carbon ở vùng trường δC: 112,2.

- Tại δH: 3,95 (hydro nhóm –OCH3) có tín hiệu giao nhau duy nhất tại δC:172,1 (carbon nhóm –COO –) nên đây là nhóm ester –COOCH3. Nhóm

–COOCH3 gắn với carbon còn lại trên vòng ở vùng trường δC: 104.

4.1.2 Kết luận

Tổng hợp dữ liệu từ các phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBCc ủahợp chất HP1, công thức cấu tạo của hợp chất HP1 được xác định là methylhaematommate (methyl 3-formyl-2,4-dihydroxy-6 -methylbenzoate ), công thức

phân tử là C10H10O5. Methyl haematommate đã được báo cáo có hoạt tínhkháng một số loại nấm ngoài da và vi khuẩn [ 16] . So sánh số liệu phổ NMRcủa HP1 với hợp chất methyl haematommate trong tài liệu tham khảo [ 16,17]đều trùng khớp với nhau.

Vậy công thức cấu tạo của HP1 là:

B ảng 4.1: Số liệu phổ1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) và 13C-NMR (CDCl3, 125

MHz) của hợp chất HP1.

Vị trí C Loại carbon13C-NMRδC ppm

1H-NMRδH ppm

HMBC(1H → 13C)

1 =C< 104,0

2 =C< 168,4 12,86 (1H, s, –OH) H→C1,C2,C3

3 =C< 108, 6

4 =C< 166,8 12,39 (1H, s, –OH) H→C3,C4,C5

5 =CH– 112,2 6,27 (1H, s , =CH–) H5→C1,C3,C4,C8






30

6 =C< 152,5

–CHO 194,0 10,32 (1H, s, –CHO) H→ C2,C3,C4

–COO – 172,1

–OCH3 52,4 3,95 (3H, s , –OCH 3) H→C7

–CH3 25,3 2,51 ( 3H, s, –CH3) H→ C1,C5,C6

B ảng 4.2: So sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR c ủa hợp chất HP1 và

methyl haematommate trong tài liệu [ 17] .

Vị tríC

Loạicarbon

13C-NMR

(CDCl3)δC ppm

1H-NMR (CDCl3)δH ppm

HP1

(500MHz)

[ 17]

(400MHz)

HP1(125 MHz)

[ 17](100 MHz)

1 =C< 104,0 103,9

2 =C< 168,4 168,3 12,86 (1H, s, –OH) 12,89 (1H, s, –OH)

3 =C< 108, 6 108,4

4 =C< 166, 8 166,6 12,39 (1H, s, –OH) 12,41 (1H, s, –OH)

5 =CH– 112,2 111,2 6,27 (1H, s, =CH –) 6,29 (1H, s, =CH –)

6 =C< 152, 5 152,3

–CHO 194, 0 194,0 10,32 (1H, s, –CHO) 10,34 (1H, s, –CHO) –COO – 172,1 172,0

–OCH3 52,4 52,3 3,95 (3H, s, –OCH 3) 3,96 (3H, s, –OCH 3)

–CH3 25,3 25,2 2,51 (3H, s, –CH3) 2,53 (3H, s, –CH3)

4.2 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết địa y và hợp chấtHP1 đánh giá bằng phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH

Nồng độ DPPH trong mẫu thử luôn là 50 µM.4.2.1 Hoạt tính kháng oxy hóa của ascorbic acid (vitamin C)

B ảng 4.3: Phần trăm ức chế của ascorbic acid theo nồng độ trong từng mẫuthử.

Nồng độ ascorbic acid trong mẫu thử

(µM)Độ hấp thu mẫu thử % Ức chế (I%)

0 0,2190 0,00

5 0,2109 3,70





Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT QU Ả VÀ THẢO LU ẬN

31

10 0,18 45 15 ,7515 0,15 9 5 27,1720 0,1230 43,8 425 0,08 9 7 5 9 ,04

Từ phương trình tuyến tính, ta có IC5 0 của ascorbic acid là:

IC = 50 + 11,73

2,775 = 22,25 μM t ươ ng đươ ng IC = 3,92 μg/mL

4.2.2 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao tổng

B ảng 4.4: Phần trăm ức chế của cao tổng theo nồng độ trong từng mẫu thử.

Nồng độ cao tổng

trong mẫu thử(µg/mL)

Độ hấp thu

mẫu thử

Độ hấp thu dd

cao cùng nồngđộ mẫu thử

Độ hấp thu đã

trừ độ hấp thucủa cao

% Ức chế(I%)

0 0,219 3 0 0,219 3 0

5 0 0,1743 0,001 0,1733 20,9 8100 0,146 2 0,005 0,1412 35 ,6 1

15 0 0,128 7 0,008 0,1207 44,9 6

200 0,108 2 0,011 0,09 72 5 5 ,6 825 0 0,08 37 0,013 0,0707 6 7,76300 0,06 71 0,017 0,05 01 77,15

y = 2,775 x - 11,73R ² = 0,99 3

0

10

20

30

40

5 0

6 0

70

0 5 10 15 20 25 30

I%

Nồng độ ascorbic acid (µM)

Hình 4.2: Bi ểu đồ biểu diễn khả năng ức chế gốc tự do DPPHtheo nồng độ ascorbic acid.






32

Từ phương trình tuyến tính, ta có IC5 0 của cao tổng là:

IC = 50 − 11,55

0,221 = 173,98 µg/mL

IC5 0 của cao tổng gấp 44 lần so với ascorbic acid, hay khả năng khử gốctự do DPPH của ascorbic acid mạnh hơn cao tổng khoảng 44 lần.

4.2.3 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao petroleum ether

B ảng 4.5 : Phần trăm ức chế của cao PE theo nồng độ trong từng mẫu thử.

Nồng độ cao PEtrong mẫu thử

(µg/mL)

Độ hấp thu

mẫu thử

Độ hấp thu dd

cao cùng nồng

độ mẫu thử


trừ độ hấp thu

của cao

% Ức chế

(I%)

0 0,218 4 0 0,218 4 0,00100 0,178 0,0021 0,175 9 19 ,46

200 0,15 3 0,0040 0,149 31,78300 0,130 0,005 8 0,1242 43,13

400 0,109 0,0076 0,1014 5 3,5 75 00 0,09 2 0,009 0 0,08 3 6 2,006 00 0,072 0,0109 0,06 11 72,02

y = 0,221x + 11,5 5R ² = 0,9 9 6

0

20

40

6 0

8 0

100

0 100 200 300 400

I%

Nồng độ cao tổng (µg/mL)

Hình 4.3: Bi ểu đồ biểu diễnkhả năng ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độ cao tổng.

Hình 4.4: B iểu đồ biểu diễn khả năng ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độ cao PE.

y = 0,104x + 10,60R ² = 0,99 6

0

20

40

6 0

8 0

0 100 200 300 400 5 00 6 00 700

I%

Nồng độ cao PE (µg/mL)






33

Từ phương trình tuyến tính, ta có IC5 0 của cao petroleum ether là:

IC = 50 − 10,60

0,104 = 378,85 µg/mL

IC5 0 của cao PE gấp 97 lần so với ascorbic acid, hay khả năng khử gốc tự

do DPPH của ascorbic acid mạnh hơn cao PE khoảng 9 7 lần.

4.2.4 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao ethyl acetate

B ảng 4.6 : Phần trăm ức chế của cao EtO Ac theo nồng độ trong từng mẫu thử.

Từ phương trình tuyến tính, ta có IC5 0 của cao ethyl acetate là:

IC = 50 + 0,843

0,641 = 79,32 µg/mL

IC5 0 của cao EtO Ac gấp 20 lần so với ascorbic acid, hay khả năng khửgốc tự do DPPH của ascorbic acid mạnh hơn cao EtO Ac khoảng 20 lần. CaoEtO Ac có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh nhất trong các loại cao chiết từ địa y

Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi.

Nồng độ caoEtO Ac trong

mẫu thử (µg/mL)

Độ hấp thu

mẫu thử

Độ hấp thu ddcao cùng nồng

độ mẫu thử

Độ hấp thu đãtrừ độ hấp thu

của cao

% Ức chế(I%)

0 0,215 1 0 0,215 1 0,0020 0,19 5 3 0,0034 0,19 19 10,7940 0,16 8 0 0,0103 0,15 77 26 ,66 0 0,149 0 0,0147 0,1343 37,58 0 0,128 3 0,0215 0,106 8 5 0,3

100 0,1073 0,0257 0,0816 62,0120 0,0819 0,0319 0,0500 76 ,7

y = 0,6 41x - 0,8 43R ² = 0,9 97

0

20

40

6 0

8 0

100

0 5 0 100 15 0

I%

Nồng độ cao EtOAc (µg/mL)

Hình 4.5 : B iểu đồ biểu diễn khả năng ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độ cao EtO Ac.






34

4.2.5 Hoạt tính kháng oxy hóa của cao nước

B ảng 4.7: Phần trăm ức chế của cao nước theo nồng độ trong từng mẫu thử.

Từ phương trình tuyến tính, ta có IC5 0 của cao nước là:

IC = 50 + 1,651

0,105 = 491,91 μg/mL

IC5 0 của cao nước gấp 125 lần so với ascorbic acid, hay khả năng khử

gốc tự do DPPH của ascorbic acid mạnh hơn cao nước khoảng 125 lần.

Nồng độ cao

nước trongmẫu thử (µg/mL)

Độ hấp thu

mẫu thử

Độ hấp thu dd

cao cùng nồngđộ mẫu thử


trừ độ hấp thucủa cao

% Ức chế(I%)

0 0,218 8 0 0,218 8 0,00100 0,2037 0,004 0,19 9 7 8 ,73200 0,1822 0,008 5 0,1737 20,6 1300 0,16 79 0,0125 0,15 5 4 28 ,9 8400 0,148 6 0,015 1 0,1335 38 ,9 95 0 0,1239 0,019 5 0,1044 5 2,29

6 0 0,1079 0,0233 0,08 46 6 1,33

Hình 4.6 : B iểu đồ biểu diễn khả năng ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độ cao nước.

y = 0,105x - 1,6 5 1R ² = 0,99 6

010

2030

405 0

6 0

70

0 100 200 300 400 5 00 6 00 700

I%

Nồng độ cao nước (µg/mL)






35

4.2.6 Hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất HP1: methylhaematommate

B ảng 4.8 : Phần trăm ức chế của hợp chất HP1 theo nồng độ trong từngmẫu thử.

Từ phương trình tuyến tính, ta có IC5 0 của hợp chất methyl

haematommate là:

IC = 50 − 2,311

0,123 = 387,72 μg/mL

IC5 0 của methyl haematommate gấp 9 9 lần so với ascorbic acid, hay khảnăng khử gốc tự do DPPH của ascorbic acid mạnh hơn HP1 khoảng 9 9 lần.

Nồng độ HP1 trongmẫu thử (µg/mL)

Độ hấp thumẫu thử

% Ức chế (I%)

0 0,219 8 0,0020 0,208 8 5 ,040 0,2044 7,016 0 0,19 9 1 9 ,48 0 0,19 19 12,6

100 0,18 74 14,74120 0,18 23 17,06

Hình 4.7: B iểu đồ biểu diễn khả năng ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độ HP1.

y = 0,123x + 2,311R ² = 0,9 9 5

0

5

10

15

20

0 20 40 6 0 8 0 100 120 140

I%

Nồng độ HP1 (µg/mL)





Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 5 : KẾT LU ẬN VÀ KIẾN NG HỊ

36

CHƯƠNG 5

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1 Kết luận

Sau thời gian thực hiện đề tài “Khảo sát thành phần hóa học và hoạt

tính kháng oxy hóa của loài địa y Dirinaria applanata (Fée) D. D.Awasthi”, đã đạt được một số kết quả sau:

- Từ lượng địa y thu được đã điều chế được các loại cao có độ phân cựckhác nhau: cao tổng, cao petroleum ether, cao ethyl acetate, cao nước.

- Từ cao petroleum ether, đã phân lập được 1 hợp chất tinh khiết, ký hiệu làHP1. Xác định cấu trúc hóa học của nó bằng phổ 1H-NMR ,13C-NMR , DEPT,HMB C, đã xác định được đây là hợp chất methyl 3-formyl-2,4-dihydroxy-6 -

methylbenzoate (methyl haematommate) (24).

- Khảo sát khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp sử dụng gốc tự doDPPH: cao tổng, cao petroleum ether, cao ethyl acetate, cao nước và hợp chất

tinh khiết HP1. Kết quả cho thấy không có cao hay hợp chất nào kháng oxyhóa mạnh hơn ascorbic acid (vitamin C), chỉ có cao ethyl acetate có hoạt tính

kháng oxy hóa khá với IC5 0 = 79 ,32µg/mL (tốt nhất trong các loại cao) so với

IC5 0 = 3,9 2 µg/mL của vitamin C.

5.2 Kiến nghị

- Tiếp tục khảo sát thành phần hóa học các phân đoạn còn lại của cao petroleum ether và cao ethyl acetate, cao nước từ địa y Dirinaria applanata

(Fée) D. D. Awasthi.- Tiến hành khảo sát các hoạt tính sinh học khác như kháng khuẩn, kháng

nấm, kháng ung thư… của các loại cao chiết cũng như các hợp chất phân lậpđược.

24





Luận văn tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO

37

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[ 1] . Aptroot, A. and Sparrius, B .L. (2006). Additions to the Lichen

Flora of Vietnam, with an annotated checklist and bibliography. The

B ryologist , 109 (3): 358 -371.[ 2] . Karunaratne, V., B ombuwela, K., Kathirgamanathar, S. and

Thadhani, V. (2005 ). Lichens: A Chemically Important B iota. Journal of the National Science Foundation of Sri Lanka , 33(3): 16 9 .

[ 3] . Huneck, S. and Yoshimura, I. (19 9 6 ). Identification of LichenSubstances. Springer. Verlag B erlin Heidelberg, G ermany. pp. 1-9 .

[ 4] . Mitrović, T., Stamenković, S., Cvetković, V., Nikolić, M., Tošić,S. and Stojičić, D. (2011). Lichens as source of versatile bioactive compounds.

B iologica Nyssana, 2(1): 1-5 .[ 5 ] . Le Hoang Duy (2012). Chemical study of common lichens in theSouth of Vietnam. Doctoral thesis. Kobe Pharmaceutical U niversity. Kobe,

Japan. pp. 1.[ 6 ] . Nash, H. T. III. (2008 ). Lichen B iology. 2nd. Cambrigde

U niversity Press. New york, U nited States of America. pp. 88 -9 3, 29 9 -300.[ 7] . Hale, E. M. (19 79 ). How to know the lichens. 2nd. Wm. C. B rown

Company. U nited States of America. pp. 2.[ 8 ] . Nash, H. T. III. (2008 ). Lichen B iology. 2nd. Cambrigde

U niversity Press. New york, U nited States of America. pp. 130-133.[ 9 ] . Le Hoang Duy (2012). Chemical study of common lichens in the

South of Vietnam. Doctoral thesis. Kobe Pharmaceutical U niversity. Kobe,Japan. pp. 2.

[ 10] . Müller, K. (2001). Pharmaceutically relevant metabolites fromlichens. Appl Microbiol B iotechnol, 5 6 : 9 -16 .

[ 11] . Huneck, S. and Yoshimura, I. (19 9 6 ). Identification of LichenSubstances. Springer. Verlag B erlin Heidelberg, G ermany.

[ 12] . Elix, J. A. (2009 ). Dirinaria. Fl. Australia, 5 7: 5 09 -5 17.[ 13] . Nguyễn Kim Phi Phụng (2007). Phương pháp cô lập hợp chất hữu

cơ. Nhà xuất bản Đại Học Quốc G ia TP.Hồ Chí Minh. TP.Hồ Chí Minh, Việt

Nam.[ 14] . Kedare, B . S. and Singh, P. R . (2011). G enesis and development

of DPPH method of antioxidant assay. J Food Sci Technol, 48(4): 412–422.[ 15 ] . Sharma, P. O . and B hat, K. T. (2009 ). DPPH antioxidant assay

revisited. Food Chemistry, 113: 1202-1205 .





Luận văn tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO

38

[ 16 ] . Hickey, B . J., Lumsden, A. J., Cole, A. L. J. and Walker, J. R . L.(19 9 0). Antibiotic compounds from New Zealand plants: Methylhaematommate, an anti-fungal agent from Stereocaulon ramulosum. NewZealand Natural Sciences, 17: 49 -5 3.

[ 17] . Seo, C., HanYim, J., Lee, H. K. and O h, H. (2011). PTP1Binhibitory secondary metabolites from the Antarctic lichen Lecidellacarpathica. Mycology, 2(1): 18 -23.






Phụ lục 1: Phổ 1H-

39

PHỤ LỤC

MR của hợp chất HP1.

PHỤ LỤC





Luận văn tốt nghiệp PHỤ LỤC

40

Phụ lục 2: Phổ DEPT của hợp chất HP1.






41

Phụ lục 3: Phổ 13C-NMR của hợp chất HP1.






42

Phụ lục 4: Phổ HMB C của hợp chất HP1.







Documents

Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng Oxy hóa của loài Địa y Dirinaria Applanata (FÉE) D. D. Awasthi